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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ CURSO DE AGRONOMIA FABIANA CHIAMULERA BORSATTI PRODUÇÃO DE SEMENTES DE ALHO (Allium sativum L.) LIVRE DE VÍRUS ESTÁGIO CURRICULAR SUPERVISIONADO PATO BRANCO 2011 FABIANA CHIAMULERA BORSATTI PRODUÇÃO DE SEMENTES DE ALHO (Allium sativum L.) LIVRE DE VÍRUS Relatório de Estágio apresentado à disciplina de Estágio Curricular Supervisionado, do Curso Superior de Agronomia da Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR, como requisito parcial para obtenção do título de Engenheira Agrônoma. Orientador: Prof. Dr. Wilson Itamar Godoy Supervisor: Dr. Anderson Luiz Feltrim PATO BRANCO 2011 DEDICATÓRIA Aos meus pais, Ildo e Cleci Borsatti AGRADECIMENTOS Primeiramente, agradeço a Deus pelas oportunidades que me são dadas na vida, principalmente por ter conhecido pessoas e lugares interessantes, mas também por ter vivido fases difíceis, que foram matérias-primas de aprendizado. Também, agradeço aos meus pais, Cleci e Ildo Borsatti, sem os quais não estaria aqui, por todo apoio e confiança, e por terem me fornecido condições para me tornar a pessoa que sou. As minhas irmãs, Fernanda, Flávia, Ângela e Alice que, apesar de algumas brigas bobas, sempre me deram apoio e me incentivaram nas horas mais difíceis. Á todos da minha família, tios, tias, avós e cunhados, que de alguma forma contribuíram para a minha formação. Ao meu orientador, Professor Dr. Wilson Itamar Godoy, pela amizade, pelas oportunidades e colaboração com críticas e sugestões que muito contribuíram na minha formação acadêmica. Agradeço aos demais professores do curso de Agronomia, da UTFPR, pelos ensinamentos que foram passados ao longo do curso. Ao meu supervisor de estágio, Dr. Anderson Luiz Feltrim, e também ao Dr. Renato Vieira, por todo ensinamento, acompanhamento e tempo disponibilizado durante o período de estágio. Aos colegas e amigos, Flávia Chiamulera Borsatti, Vanessa Siega, Heloísa Thomazi, Elias Kleina, Luciane Balzan, Adauto Cruz, Elouize Xavier, Caroline Amadori e Renan Funguetto, por toda ajuda, amizade, alegrias e pelos momentos compartilhados durante os anos de faculdade. Agradeço as novas amizades conquistadas nos últimos meses, que tornaram às 400 horas de estágio, longe de casa e da família, muito curtas. Silmara, Gentil, Marcos, Danielle, Solange, Neusa, Margarete, Amazine e em especial a amiga Poliana Francescatto pelo companheirismo e alegria contagiosa. A meu namorado, Diego Luiz Bertinato, por todos estes anos de amizade, compreensão, paciência e principalmente, confiança. Enfim, a todas as pessoas, que de uma forma ou outra colaboraram para a conclusão deste curso, meu sincero Obrigado! EPÍGRAFE "A principal meta da educação é criar homens que sejam capazes de fazer coisas novas, não simplesmente repetir o que outras gerações já fizeram. Homens que sejam criadores, inventores, descobridores. A segunda meta da educação é formar mentes que estejam em condições de criticar, verificar e não aceitar tudo que a elas se propõe." (PIAGET, Jean) LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 - Sede da Estação Experimental de Caçador. ........................................... 13 Figura 2 - Folhas de alhos infectado e sadio ............................................................ 15 Figura 3 - Meristema de alho.................................................................................... 16 Figura 4 - Sala de limpeza e preparo ....................................................................... 17 Figura 5 - Sala de transferência ............................................................................... 18 Figura 6 - Sala de crescimento................................................................................. 18 Figura 7 - Autoclave ................................................................................................. 19 Figura 8 - Micro-ondas ............................................................................................. 19 Figura 9 - Balança de precisão................................................................................. 20 Figura 10 - Capela de fluxo laminar e lamparina de álcool ....................................... 21 Figura 11 - Microscópio estereoscópio ...................................................................... 21 Figura 12 - Cabine de fluxo laminar .......................................................................... 23 Figura 13 - Bulbo livre de vírus à esquerda e Bulbo infectado à direita .................... 31 Figura 14 - Bulbos selecionados ............................................................................... 33 Figura 15 - Pré-limpeza e tratamento com NaClO .................................................... 33 Figura 16 - Bulbilhos em termoterapia ...................................................................... 33 Figura 17- Pré-assepsia dos bulbilhos ...................................................................... 34 Figura 18 - Meristema ............................................................................................... 34 Figura 19 - Extração do meristema ........................................................................... 35 Figura 20 - Meristema isolado ................................................................................... 35 Figura 21 - Meristema com 30 dias de desenvolvimento .......................................... 36 Figura 22- Transferência para outro meio ................................................................. 36 Figura 23 - Limpeza do bulbilho ................................................................................ 37 Figura 24 - Bulbilho curado ....................................................................................... 37 Figura 25 - Telado antiafídico .................................................................................... 38 Figura 26 - Lavoura de alho livre de vírus em Fraiburgo - SC ................................... 38 Figura 27 - Problemas com erosão ........................................................................... 40 Figura 28 - Canteiros ................................................................................................. 41 Figura 29 - Plantio de alho semente .......................................................................... 44 Figura 30 - Índice visual de dormência ...................................................................... 45 Figura 31 - Espaçamento de plantio.......................................................................... 46 Figura 32 - Superbulbilhamento ................................................................................ 47 Figura 33 - Superbulbilhamento do alho ................................................................... 47 Figura 34 - 1 - Euphorbia heterophylla; 2 - Rumex obtusifolius L; 3 - Phoradendron affine; 4 - Bidens pilosa L.; ................................................................................. 48 Figura 35 - Mão-de-obra na cultura do alho .............................................................. 49 Figura 36 - Ácaro e pulgões ...................................................................................... 50 Figura 37 - 1- Fusarium oxysporum; 2- Sclerotium rolfsii Sacc.; 3 - Puccinia allii Rud.; 4 - Alternaria porri ................................................................................... 51 Figura 38 - Colheita ................................................................................................... 52 Figura 39 - Cura ........................................................................................................ 53 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Preparação de soluções estoque do meio de Murashige & Skoog (1962)........... 29 Tabela 2 - Classificação de bulbos de alho segundo o maior diâmetro transversal. ............. 45 LISTA DE SIGLAS ABA Ácido abscísico AIA Ácido indolacético AIB Ácido indolbutírico ANA Ácido naftaleno acético ATP Adenosina Trifosfato BA Benziladenina BOD Biochemical Oxygen Demand CIN Cinetina EDTA Ácido Etilenodiamino Tetra-acético ELISA Enzyme – Linkd Immunosorbent Assay EPAGRI Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina GARCLV Garlic common latente vírus GA3 Ácido giberélico IVD Índice visual de dormência LYSV Leek yellow stripe vírus OYDV Onion yellow dwarf vírus pH Potencial Hidrogeniônico SC Santa Catarina TDZ Thidiazuron UTFPR Universidade Tecnológica Federal do Paraná ZEA Zeatina 2 ip Isopentenil adenina 2,4 – D Ácido 2-4 diclorofenóxiacético LISTA DE SÍMBOLOS cm centímetro ºC graus Celcius g grama g/l grama por litro ha hectares kg quilograma kg/N/ha quilograma de nitrogênio por hectare kg/cm2 quilogramas por centímetro quadrado l litro l/ha litros/hectare m metro mg miligrama ml mililitro mm milímetro mM miliMol t toneladas t/ha toneladas por hectare R$/kg reais por quilo % porcentagem SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11 2 DESENVOLVIMENTO ........................................................................................... 12 2.1 Descrições da empresa .................................................................................... 12 2.2 Região de atuação ............................................................................................. 13 2.3 Atividades desenvolvidas ................................................................................. 13 2.3.1 Alho livre de vírus .......................................................................................... 14 2.3.2 Cultura de tecidos .......................................................................................... 15 2.3.2.1 Limpeza viral dos tecidos meristemáticos ................................................ 16 2.3.3 Laboratório ..................................................................................................... 16 2.3.3.1 Preparo da cabine de fluxo laminar ........................................................... 22 2.4 Meios de cultura ................................................................................................ 23 2.4.1 Água ................................................................................................................ 24 2.4.2 Macronutrientes ............................................................................................. 24 2.4.3 Micronutrientes .............................................................................................. 25 2.4.4 Carboidratos ................................................................................................... 25 2.4.5 Vitaminas ........................................................................................................ 26 2.4.6 Reguladores do crescimento vegetal ou hormônios .................................. 26 2.4.7 Materiais de suporte....................................................................................... 28 2.4.8 pH .................................................................................................................... 28 2.4.9 Preparação dos meios ................................................................................... 28 2.5 Cultura de meristema de alho livre de vírus ................................................... 30 2.6 Procedimentos para plantio, termoterapia e preparo do alho para retirar o meristema ................................................................................................................ 33 2.7 Lavoura do produtor de sementes, Volni Maciel ............................................ 39 2.7.1 Escolha do terreno ......................................................................................... 39 2.7.2 Preparo do solo .............................................................................................. 39 2.7.3 Encanteiramento ............................................................................................ 40 2.7.4 Rotação de culturas ....................................................................................... 41 2.7.5 Adubação ........................................................................................................ 42 2.7.5.1 Correção da acidez do solo ........................................................................ 42 2.7.5.2 Adubação química e orgânica .................................................................... 42 2.7.6 Cultivares ........................................................................................................ 43 2.7.7 Plantio de alho-semente ................................................................................ 43 2.7.8 Escolha da semente ....................................................................................... 44 2.7.9 Classificação da semente .............................................................................. 44 2.7.10 Época de plantio ........................................................................................... 45 2.7.11 Espaçamento de plantio .............................................................................. 46 2.7.12 Superbubilhamento ...................................................................................... 46 2.7.13 Plantas daninhas .......................................................................................... 48 2.7.14 Principais pragas.......................................................................................... 49 2.7.15 Principais doenças ....................................................................................... 50 2.7 15 Colheita ......................................................................................................... 51 2.7.16 Cura ............................................................................................................... 52 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................... 54 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 55 11 1 INTRODUÇÃO O alho (Allium Sativum) é uma planta apomítica pertencente a família Alliaceae (a mesma da cebola e da cebolinha), que se propaga através do plantio dos bulbilhos aéreos formados na inflorescência ou dentes subterrâneos, que também servem para o armazenamento de substâncias de reserva. É cultivado na maioria dos países do mundo sendo uma cultura que possui expressão mundial. Se reproduz através de bulbilhos aéreos formados na inflorescência e através de dentes subterrâneos. A ausência de órgãos reprodutivos viáveis não permite a produção de sementes botânicas verdadeiras e nem a utilização de métodos convencionais de melhoramento genético. Essa cultura é adaptada às regiões mais frias de Santa Catarina, principalmente as cultivares de alho nobre, ou seja, as de ciclo tardio. Porém, estas mesmas também podem ser cultivadas em regiões subtropicais, preferentemente acima de 200m do nível do mar, desde que o alho-semente para estas seja submetido a um tratamento de frio antes do plantio. No entanto, as cultivares de ciclo precoce podem ser cultivadas em todo o Estado sem tratamento de frio. As regiões de cultivo de cebola e batata-semente não são indicadas para o cultivo do alho, devido a problemas ligados a aspectos fitossanitários (EPAGRI, 2002). É uma cultura que apresenta um elevado custo de produção para o agricultor, principalmente com a aquisição das sementes, com os insumos e mão-de-obra. Porém tem se mostrado uma ótima alternativa de fonte de renda para os produtores da região. O maior entrave desta cultura em todo o território nacional são os problemas causados pelo vírus, que enfraquecem as plantas prejudicando seu crescimento e produtividade. Uma alternativa que vem sendo usada para resolver este problema, é a propagação de plantas livre de vírus através do meristema apical caulinar. Considerando todas as características da cultura do alho apresentadas acima, optou-se por trabalhar com esta cultura durante o estágio final do curso. Como a EPAGRI – estação experimental de Caçador é uma empresa que possui um trabalho voltado para a pesquisa, e principalmente na área de hortaliças e pequenas culturas, foi escolhida esta empresa para realizar o estágio curricular obrigatório. 12 2 DESENVOLVIMENTO 2.1 Descrições da empresa A Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina S/A - EPAGRI foi criada em 1991 e atualmente está presente em todas as cidades do estado com o objetivo de promover a recuperação, preservação, e utilização sustentável dos recursos naturais, tornar competitiva a agricultura catarinense, e também buscar o bem estar do meio agrícola (EPAGRI, 2011). Esta empresa de importância indiscutível para o estado de Santa Catarina consegue promover uma maior interação dos pesquisadores com os produtores agrícolas, fomentando a transmissão de conhecimento entre as partes envolvidas, resultando em benefícios mútuos. Dentre as maiores estações destacam-se a de Chapecó que visa produzir tecnologia para as pequenas propriedades, estação de Lages dedicada à produção animal, Estação de Itajaí que trabalha com arroz irrigado e frutífero tropical, Estação de Videira que trabalha com pesquisa em uvas e frutas de caroço, Estação de São Joaquim que pesquisa maçã e uva e Estação de Caçador que trabalha com pesquisa em maçãs, pêra, tomate, alho e piscicultura. A estação experimental da EPAGRI de Caçador –SC, se destaca pelos trabalhos com a produção integrada de tomateiro, manejo da cultura da macieira, produção de mudas de hortaliças, análise de tecido foliar e cultura de tecidos. 13 Figura 1 - Sede da Estação Experimental de Caçador. Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. 2.2 Região de atuação As atividades referentes ao estágio curricular obrigatório foram desenvolvidas durante o período de 01º de Agosto de 2011 a 14 de Outubro de 2011 na Empresa de Pesquisa Agropecuária e Extensão Rural de Santa Catarina - Estação Experimental de Caçador, sob orientação do pesquisador Anderson Luiz Feltrim. 2.3 Atividades desenvolvidas Durante o período de estágio foi acompanhada a produção de sementes de alho livre de vírus, sendo o vírus um dos principais entraves da cultura. Estas sementes são produzidas no laboratório de cultura de tecidos da EPAGRI, e após passarem por um processo de verificação da existência ou não do vírus, elas são levadas a um produtor conveniado com a empresa, que multiplica e comercializa as 14 sementes. Todo o processo da produção da semente, desde sua entrada no laboratório até a colheita a campo, será descritos abaixo. 2.3.1 Alho livre de vírus Doenças de plantas são causadas por fungos, bactérias, nematoides, vírus, micoplasmas, viróides e rickétsias. Medidas efetivas de controle químico são aplicadas para a maioria das doenças, exceto por aquelas causadas por vírus. Geralmente esses patógenos não são transmitidos pela semente, mas tendem a se acumular em plantas que são propagadas vegetativamente, tais como batata (Solanum tuberosum), batata-doce (Ipomoea batatas), alho (Allium sativum) e mandioca (Manihot esculenta) (TORRES et al,1998). Devido ao fato de não existirem produtos químicos capazes de eliminar vírus, tem-se utilizado a cultura de tecidos com o objetivo de se obter plantas de alta qualidade fitossanitária. Todo o alho nobre cultivado no Brasil está infectado por um complexo viral transmitido através de insetos durante o desenvolvimento da cultura na lavoura e por ser uma cultura de multiplicação vegetativa a infecção por virose assume papel determinante na qualidade do material propagativo, o que culmina na drástica redução do rendimento da cultura. Dentre os vírus relatados em alho, destacam-se os seguintes Potyvirus: Onion yellow dwarf vírus (OYDV) e Leek yellow stripe vírus (LYSV). Além desses, o Garlic common latente vírus (GarCLV, Carlavirus) e Allexivírus têm sua ocorrência relatada no Brasil (FAJARDO, 1998). Com a eliminação dos vírus, estima-se que a produtividade do alho possa ter incremento de até 35%, sem aumento de custos. Hoje, a produtividade média do alho em Santa Catarina é de aproximadamente 7,8t/ha – acima da média brasileira, que é de 6,2t/ha. No entanto, a expectativa dos técnicos da Epagri com as novas sementes é de que esse índice chegue a 12 t de bulbos por hectare no Estado. 15 Figura 2 - Folhas de alhos infectado e sadio Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. 2.3.2 Cultura de tecidos A cultura de tecidos vegetais é uma ferramenta com alto potencial de aplicação no melhoramento vegetal. Ela pode ser utilizada desde a multiplicação de material genético, para a troca e a avaliação de germoplasma, até a produção de mudas livres de vírus. Para a multiplicação de material genético, pequenos fragmentos de tecido vivo, chamados explantes, são isolados de um organismo vegetal, desinfestados e cultivados assepticamente por períodos indefinidos em um meio de cultura apropriado. O objetivo é obter nova planta idêntica à original, ou seja, realizar uma clonagem vegetal de modo a obter um novo indivíduo, mantendose o genótipo idêntico ao do ancestral comum (ALVES et al, 2008). O processo de limpeza de vírus consiste em cultivar meristemas e induzir a formação de material propagativo geneticamente idênticos aos parentais. propagação, como por exemplo, algumas espécies nativas do Cerrado. Outro exemplo de grande importância é a limpeza clonal, por meio da qual é possível, em algumas espécies, como abacaxi, morango, citrus, batata e outros, a produção de mudas livres de vírus (TORRES et al, 1998). 16 2.3.2.1 Limpeza viral dos tecidos meristemático Meristemas são tecidos compostos de células não diferenciadas, envolvido com síntese protoplasmática e formação de novas células por divisão mitótica. Sem especificação, o termo refere-se normalmente ao meristema apical do caule (região localizada numa depressão central que dá origem aos mais novos primórdios foliares de tamanho variável entre espécies vegetais, normalmente formado por uma porção de 60 a 100 células isodiamétricas indiferenciadas, que mantém permanentemente as características embrionárias primárias e não possuem plasmodesmas (GUERRA & NODARI, 2006). Os vírus se translocam pela planta através de duas maneiras, pelo sistema vascular e pelos plasmodesmas. Sendo assim, como o meristema não possui estas estruturas, ele se mantem sadio. Figura 3 - Meristema de alho Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. 2.3.3 Laboratório O laboratório de cultura de tecidos da EPAGRI – Estação experimental de Caçador – SC, possui instalações com características apropriadas, bem como equipamentos e normas de trabalhos que possibilitam a criação de um ambiente com elevado nível de assepsia. As atividades realizadas dentro do laboratório são 17 limpeza e esterilização do material que será utilizado (no caso o alho), preparo de material e meio de cultura, manipulação asséptica e incubação das culturas. Este laboratório se divide da seguinte forma: Sala de recepção - aonde ocorre à primeira limpeza do alho (remoção de raízes, folhas e casca); Sala de limpeza e de preparo - onde ficam os equipamentos, como autoclave, geladeira, micro-ondas, destilador, pias, esterilizador, armários, reagentes, e bancada aonde são preparados os meios de cultura (Figura 4); Figura 4 - Sala de limpeza e preparo Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. Sala de transferência – aonde se manipula assepticamente o material vegetal, sendo um local exclusivo para a capela de fluxo laminar e as estantes para a estocagem temporária dos meios de cultura já autoclavados, além de outros materiais esterilizados destinados ao uso imediato (TORRES et al, 1998). Nesta sala é realizada a extração do meristema do alho, não sendo, assim, permitida a circulação de pessoas (Figura 5). 18 Figura 5 - Sala de transferência Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. Sala de crescimento – é a área aonde as culturas são mantidas até o momento de serem retiradas dos frascos. É dotada de estantes iluminadas, com prateleiras de 1 m de largura e distanciadas entre si de 40 – 45 cm, num total de 5 prateleiras cada estante. A temperatura dessa sala é mantida a 25 Cº (Figura 6). O alho permanece nesta sala em torno de 90 dias, e após este período é levado para um telado onde passa pelo processo de aclimatação. Figura 6 - Sala de crescimento Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. Os equipamentos utilizados dentro do laboratório são os seguintes: 19 Autoclave – utilizada para esterilização de meios de cultura, vidrarias, água e outros materiais. Este aparelho pode produzir calor seco ou úmido, que é mais eficiente para esterilização, e já vem regulado para trabalhar a uma pressão de 1,05 kg/cm 2, o que resulta numa temperatura de 121 ºC, que é a ideal (Figura 7). Figura 7 - Autoclave Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. Destilador e deionizador – são aparelhos utilizados para eliminação de sais minerais da água. Micro-ondas – aparelho de ampla utilização pois possui elevada rapidez de operação, podendo ser utilizado para fusão de ágar ou de outros agentes geleificantes (Figura 8). Figura 8 - Micro-ondas Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. 20 Estufa de secagem – aparelho elétrico eficiente para secagem de vidrarias e outros materiais não líquidos. Aquecedor de água – utilizado para lavagem eficiente de frascos contendo meio de cultura sólidos. Refrigerador doméstico – usado para manutenção de solução estoque e reagentes diversos. Freezer – usado para estocagem de reagentes que exigem temperatura abaixo de zero grau centígrado, e produz temperatura de até 10 graus centígrados negativos. Balança de precisão – aparelho de alto custo imprescindível para a pesagem de quantidades mínimas de fitorreguladores, possui precisão de 0,1 mg e capacidade de até 200 g (Figura 9). Figura 9 - Balança de precisão Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. Medidor de pH – aparelho necessário para determinação e ajuste do pH de meios de cultura. Agitador magnético - útil como auxiliar na dissolução de reagentes e determinação de pH, muitas vezes é utilizado junto com aquecimento do meio. Capela de fluxo laminar – imprescindível para os trabalhos de manipulação asséptica. É mantida na sala de transferência, com elevado nível de assepsia. Esse equipamento força a passagem de ar por meio de um filtro bacteriológico, de modo que seja criado um ambiente estéril com pressão positiva, que evita a entrada de ar externo contaminado. Essa capela possui uma lâmpada ultravioleta, que é ligada 15 minutos antes de iniciar o trabalho, para esterilização do ambiente (Figura 10). 21 Figura 10 - Capela de fluxo laminar e lamparina de álcool Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. Lamparina de álcool – é utilizada na esterilização dos instrumentos cirúrgicos e flambagem de boca de frascos, por meio de chama produzida pela queima de álcool puro (Figura 10). Microscópio estereoscópico – utilizado para facilitar na extração do meristema (Figura 11). Figura 11 - Microscópio estereoscópio Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. Suporte para tubo de ensaios – são utensílios feitos de plástico que podem ser autoclavados. Destinam-se a manter os tubos de ensaio na sala de cultura, para que recebam luz adequada. Termômetros – para monitorar a temperatura da sala de culturas são utilizados termômetro e máxima e de mínima, para outras determinações de temperatura, são empregados termômetros comuns de laboratórios. 22 Frascos para regentes – são frascos de 250 a 500 ml, de boca estreita, com tampa de pressão, de material plástico utilizados para armazenar solução estoque. Vidrarias de laboratório – inclui-se aqui vidraria típica de laboratório, como béqueres, erlenmeyers, provetas, buretas, pipetas e placas de Petri. Os béqueres e erlenmeyers são usados normalmente para o preparo de soluções, sendo que suas medidas variam de 25 a 2.000 ml. As provetas são usadas para medições mais precisas de volumes, sendo, assim, graduadas. As buretas de 250 ml são utilizadas para dispensar meios nutritivos nos frascos de culturas. As pipetas são utilizadas para dosar pequenos volumes de reagentes, dispondo-se de um conjunto que varia de 1 a 10 ml. As placas de Petri autoclavadas constituem a base estéril sobra a qual o operador, na capela de fluxo laminar, mantém o material vegetal a ser preparado para entrar nos frascos de culturas, ou para ser subdividido e transferido para outros frascos, nas fases de multiplicação e enraizamento (TORRES et al, 1998). Pissetas – são frascos plásticos, que, quando pressionados, liberam um fino jato de água; usados para lavação de eletrodos de peagâmetros, remoção delicada de precipitados e outro afins semelhantes (TORRES et al, 1998). 2.3.3.1 Preparo da cabine de fluxo laminar Ligar a cabine e fazer assepsia com álcool puro; Levar todos os utensílios para o interior da cabine ligada, de preferência já esterilizados em autoclave; Manter as portas sempre fechadas, usar máscara e álcool 70% para esterilizar as mãos durante o trabalho; 23 Figura 12 - Cabine de fluxo laminar Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. 2.4 Meios de cultura Meios de cultivo são combinações de sais minerais (macro e micronutrientes), carboidratos, vitaminas e reguladores de crescimento. Podem ser sólidos (adicionando-se ágar ou outro agente para geleificação) ou líquidos, de acordo com o protocolo para o sistema de cultivo. Os meios nutritivos utilizados para as culturas fornecem as substâncias essenciais para o desenvolvimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão do desenvolvimento in vitro (TORRES, 1998). A constituição do meio é baseada nas exigências das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificações para atender em necessidades específicas. Um dos primeiros meios de cultura desenvolvidos foi o de White (1942). Esse meio apresenta baixo nível de nitrogênio e de potássio, restringindo o seu uso para muitas células; entretanto, esta formulação com baixa concentração em sais, é usada em muitas situações. O meio MS (MURASHIGE E SKOOG, 1962) foi uma das primeiras formulações melhoradas usadas em cultura de tecidos de plantas, apresentando altos níveis de nitrato, potássio e amônio (GUERRA & NODARI, 2006). De acordo com Caldas et al. (1990) apud Torres (1998) os principais componentes de uso mais frequente nos meios de cultura são: 24 2.4.1 Água É o componente em maior quantidade do meio de cultura. Pode ser uma fonte potencial de impurezas que pode afetar crescimento de tecidos in vitro. Para melhor controle deve-se usar água destilada, bidestilada e deionizada. A utilização de água de torneira pode comprometer o desenvolvimento da cultura. 2.4.2 Macronutrientes a) Nitrogênio – nutriente que difere dos demais pelo fato de apresentar-se na forma de cátion (amônio) e ânion (nitrito e nitrato). b) Fósforo - Necessário para a síntese do ATP e na organogênese o fósforo está envolvido na diferenciação da parte aérea, pois reverte o efeito das auxinas. c) Potássio – entra como íon acompanhante do nitrato, fosfato ou cloreto. Ativador de várias enzimas do metabolismo de carboidratos e proteínas. d) Enxofre - utilizado na forma de sulfato ou na forma de aminoácidos (cistina, cisteína e metionina). Envolvido no metabolismo energético na formação do fosfosulfato de adenosina, constituinte da tiamina, biotina e coenzima A. Sua absorção é relacionada à assimilação do nitrogênio e, independentemente, do pH (SANTIAGO, 2001). e) Cálcio – apresenta limitações na sua translocação na planta intacta, que, às vezes, são observadas também in vitro. Como esse nutriente depende da transpiração da planta para seu transporte no xilema, às condições de alta umidade do ar que se estabelecem in vitro podem induzir deficiência de cálcio em partes aéreas em micropopagação. f) Magnésio - usado na forma de sulfato de magnésio. É um dos componentes importante de vias metabólicas que utilizam ATP, mesmo em tecidos de calos e de raízes que não são fotossintetizantes, e portanto, não sintetizam clorofila. 25 2.4.3 Micronutrientes a) Ferro - É adicionado ao meio na forma de quelato de ferro com EDTA (etilenodiamino tetra-acetato). Envolvido nas reações de oxi-redução nos organismos vivos. b) Molibdênio - é adicionado na forma de molibidato de sódio (Na2MoO4.2H2O). c) Cobre - é usado como sulfato de cobre. É um cátion que em dose acima do normal é fitotóxico às culturas. Constituinte da enzima plastocianina que é importante componente do transporte de elétrons. d) Cloro - é essencial para a fotossíntese, sendo utilizado como íon acompanhante do potássio. e) Zinco - é adicionado ao meio como sulfato de zinco (ZnSO4.7H2O). Importante nas reações de oxi-redução das plantas. f) Manganês – utilizado como sulfato de manganês (MnSO4.H2O). Essencial no metabolismo para a reação de Hill na fotossíntese, quando a molécula de água é quebrada produzindo elétrons e oxigênio. g) Cobalto - é usado como cloreto de cobalto e está envolvido na expansão foliar. h) Boro – é adicionado ao meio como ácido bórico (H3BO3). i) Sódio – pode entrar na composição de meios nutritivos, em concentrações muito variáveis, como íon acompanhante de algum elemento essencial. 2.4.4 Carboidratos As células, tecidos e plântulas cultivadas in vitro não encontram condições adequadas de iluminação e concentração de CO2 e, às vezes, não apresentam teores de clorofila suficientes para realizar fotossíntese. A sacarose é o carboidrato mais usado nos meios de cultura, sendo que esse açúcar suporta as mais altas taxas de crescimento na maioria das espécies. A concentração de 3% é a mais usada (CALDAS et al, 1998). 26 2.4.5 Vitaminas Vitaminas são compostos orgânicos que, em baixas concentrações, desempenham funções reguladoras catalíticas no metabolismo celular. A vitamina mais comumente usada em cultura de tecidos é a tiamina. A concentração de tiamina no meio MS é de 0,1 mg.l-1, sendo aumentada de 0,4 a 10 mg.l-1 para culturas específicas (LINSMAIER & SKOOG, 1965). A outras vitaminas utilizadas incluem ácido nicotínico (B3) e piridoxina (B6), nas concentrações de 0,5 mg.l-1 cada (CALDAS et al, 1998). Embora as vitaminas sejam adicionadas ao meio antes da autoclavagem, a esterilização a frio é recomendada. A tiamina, na forma de tiamina – pirofosfato, é um co-fator essencial para reações críticas da respiração aeróbica, a fotossíntese e a biossíntese de alguns aminoácidos e terpenóides em planta. A piroxidina está envolvida na biossíntese de aminoácidos aromáticos que formam a auxina AIA endógena, e na biossíntese de alcaloides. Embora tenha sido verificado que essas vitaminas desempenham funções essenciais na planta, outras vitaminas também exercem papéis importantes. Portanto, o efeito benéfico da inclusão de determinada vitamina no meio nutritivo dependerá, em grande parte, da capacidade de biossíntese de cada um nos tecidos ou órgãos cultivados (CALDAS et al, 1998). O Mio-inositol é um componente do meio MS e da maioria de outros meios em uso atualmente. A concentração mais usada desse composto é de 100 mg.l -1. Em comparação com as concentrações dos hormônios e das vitaminas (0,1 a 10 mg.l-1). A do mio-inositol usada nos meios de cultura é elevada (CALDAS et al, 1998). 2.4.6 Reguladores do crescimento vegetal ou hormônios As auxinas e as citocininas são as classes de reguladores de crescimento mais utilizadas na cultura de tecidos. A formação de raiz, parte aérea e calo em culturas de tecidos é regulada pela disponibilidade e interação dessas duas classes de reguladores de crescimento (SKOOG & MILLER, 1980). 27 As várias auxinas (AIA, AIB, ANA, 2,4 – D, e picloran) dão respostas diferentes in vitro. As auxinas são termo-estáveis, não decompondo quando autoclavadas. AIA (ácido indol-3-acético) é uma auxina instável, que se degrada facilmente pela luz ou pela atividade microbiana que a transforma em triptofano. A auxina 2,4-D é bastante usada para a indução de calos e tem o efeito de supressão da morfogênese. As auxinas 2,4-D e ANA são sintéticas e têm efeitos semelhantes às auxinas de ocorrências naturais, sendo mais estáveis à degradação (GUERRA & NODARI, 2006). As citocininas são derivadas da adenina (aminopurina) e têm um papel fundamental na diferenciação e regeneração de plantas na maioria das espécies (SANTIAGO, 2001). Induzem a divisão celular, proliferação e morfogênese da parte aérea. As citocininas mais usadas em cultura de tecidos são a cinetina (CIN), benziladenina (BA), zeatina (Zea), isopentenil adenina (2ip) e thidiazuron (TDZ) (GUERRA & NODARI, 2006). O ácido giberélico (GA3) é usado, algumas vezes, em cultura de meristemas, na recuperação de plantas livres de vírus. O GA 3 deve ser dissolvido em água com pH ajustado a 5,7 ou em base (NaOH 1N). As soluções estoques devem ser preparadas na hora (GUERRA & NODARI, 2006). O ácido abscísico (ABA) está envolvido na dormência e abscisão de folhas e frutos. Na cultura de tecidos o papel deste composto está envolvido principalmente na maturação de embriões obtidos na embriogênese somática (GUERRA & NODARI, 2006). Soluções estoque de hormônios, com exceção do AIA, podem ser mantidas no congelador por alguns meses sem perda das suas atividades. Quase todos os hormônios são pouco solúveis em água. Recomenda-se dissolver as auxinas (ácidos orgânicos) em base (KOH ou NaOH 0,1 N), na proporção de 3 gotas da base para cada 10 mg de auxina. As citocininas (bases orgânicas) devem ser dissolvidas em ácido (HCl 0,1N) na mesma proporção usada para as auxinas. No entanto as citocininas se dissolvem em bases com certa facilidade (CALDAS et al, 1998). 28 2.4.7 Materiais de suporte Os meios de cultura podem ser líquidos ou sólidos, sendo que a cultura em meio líquido normalmente exige algum tipo de suporte ou agitação para fornecer o oxigênio necessário para a respiração do explante. Os meios sólidos ou semi-sólidos são solidificados com ágar, um polissacarídeo obtido pela purificação de algas marinhas. A concentração usada varia de 0,6% a 1% (de 6 a 10 g/L). O ágar impuro é constituído de polissacarídeos, aminoácidos, sais, açúcar, etc., devendo ser lavado em água destilada antes de ser usado. O ágar é alcalino, líquido à temperatura de 80°C e se solidifica à 40°C. É necessária a aquisição de ágar de boa qualidade, pois podem ser tóxicos em algumas condições de cultivo (TORRES, 1998). 2.4.8 pH O pH dos meios nutritivos em culturas de células vegetais é normalmente ajustado com HCl ou NaOH, depois de adicionar todos os componentes para um valor ligeiramente ácido, entre 5 e 6 (TORRES, 1998). Recomenda-se este valor para formulações líquidas. Em meios gelificados com ágar, o pH deve ser ajustado em 5,7, pois em pH 5,0, ocorre a hidrólise de polissacarídeos, enquanto que em pH 6,0-6,2 verifica-se a precipitação de sais (GEORGE, 1996). 2.4.9 Preparação dos meios No laboratório de cultura de tecidos da EPAGRI, as soluções estoque para o meio MS ficam prontas e armazenadas na geladeira. As concentrações de cada componente estão apresentadas na Tabela 1. As soluções estoque dos hormônios utilizados também ficam prontas e armazenadas no congelador, por no máximo um 29 mês. A sacarose e o mio-inositol, que são utilizados em quantidades elevadas, são pesados cada vez que se prepara um meio nutritivo. Tabela 1 - Preparação de soluções estoque do meio de Murashige & Skoog (1962). Solução Composto [ ] Sol. Estoque (g/l) MACRO Preparar Preparar 1L (g) 500 mL (g) NH4NO3 33 33 16,5 (Usar 50 KNO3 38 38 19,0 mL/L de CaCl2.2 H2O 8,8 8,8 4,4 meio de KH2PO4 3,4 3,4 1,7 MgSO4.7 H2O 7,4 7,4 3,7 1L (g) 500 mL (g) cultura Ferro (10 mL/L) Na2EDTA.2 H2O 3,720 3,72 1,86 FeSO4.7 H2O 2,780 2,78 1,39 1L (g) 500 mL (g) MICRO MNSO4.H2O 3,380 3,380 1,690 ZNSO4.7 H2O 1,720 1,720 0,860 (Usar 5 H3BO3 1,240 1,240 0,620 mL/L de KI 0,166 0,166 0,083 meio de CuSO4.5 H2O 0,005 0,005 0,0025 Na2MoO4.2 H2O 0,050 0,050 0,025 CoCl2.6 H2O 0,005 0,005 0,0025 200 mL (g) 100 mL (g) cultura Vitaminas Tiamina. HCl 0,02 0,0040 0,0020 (Usar 5 Ácido nicotínico 0,1 0,0200 0,0100 mL/L de Piridoxina.HCl 0,1 0,0200 0,0100 meio de Glicina 0,4 0,0800 0,0400 Mio-Inositol 20 4,000 2,000 cultura FONTE: Murashige, T.; Skoog, F. A.; (1962). Os meios são esterilizados, após distribuídos nos frascos ou vasilhames de cultura, por autoclavagem a 121 ºC (1 Kg.cm-2) por 15 a 20 minutos (CALDAS et al., 1990). 30 2.5 Cultura de meristema de alho livre de vírus O cultivo de meristemas, ápices caulinares (MARGARA, 1988), e gemas axilares (PIERIK, 1990), resultam nos métodos de multiplicação in vitro mais facilmente utilizados e mais seguros para obtenção de “cópias uniformes ou semelhantes”, isentas de variações indesejáveis (MARGARA, 1988). Estes métodos também têm sido utilizados com êxito na superação de contaminação patogênica (CALDAS et al., 1990), na recuperação de plantas livres de vírus ou na conservação e intercâmbio de germoplasmas. Em resumo, o ápice meristemático é uma estrutura organizada, que pode desenvolver-se diretamente da parte aérea em meio de cultura adequado, sem passar pela fase de calo (TORRES et al., 1998). A cultura de ápices caulinares uma estratégia para o estabelecimento de estoque de plantas matrizes livres de vírus. Esse método baseia-se na premissa de que a concentração desse patógeno distribui-se não uniformemente na planta infectada. Basicamente, a metodologia consiste na excisão da cúpula meristemática apical com um ou dois primórdios foliares (onde ainda não se observa conexão vascular com os tecidos das plantas), podendo ser cultivada em meio nutritivo adequado para diferenciação e desenvolvimento dos sistemas caulinar e radicular (TORRES et al, 1998). Na EPAGRI – estação experimental de Caçador – SC, plantas de alho livre de vírus apresentam desenvolvimento vegetativo superior do que as plantas não livre de vírus, e também se destacam em relação ao aumento da produtividade e qualidade dos bulbos, conforme pode ser observado na Figura 13. 31 Figura 13 - Bulbo livre de vírus à esquerda e Bulbo infectado à direita Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. Segundo Torres et al (1998), os fatores mais importantes na recuperação de plantas livre de vírus são: as condições de desenvolvimento da planta – matriz, tipo e tamanho do explante, influência sazonal, termoterapia, eletroterapia, meio e condições de cultura. a) Condições de desenvolvimento da planta matriz O estado fitossanitário, fisiológico e nutricional da planta doadora de explante influencia o sucesso de obtenção de plantas livres de vírus. A planta doadora de explantes deve ser desenvolvida em condições de casa de vegetação ou câmara de crescimento, sem nenhum estresse biótico ou abiótico, devendo estar em fase de crescimento ativo. As influências sazonais devem ser observadas. Em condições ambientais adversas, as plantas apresentam uma paralisação temporária de crescimento, num estado conhecido por dormência. Nessa condição, as exigências de termo de fotoperíodo para superar a dormência devem ser satisfeitas antes de utilizar a planta como fonte de explantes (TORRES et al, 1998). b) Explantes A probabilidade de se isolar tecidos livres de vírus e outros agentes causadores de doenças está inversamente relacionada ao tamanho do explante (MURASHIGE, 1977). 32 c) Termoterapia A termoterapia consiste na exposição do bulbilho do alho temperatura de 38 ºC por um período de 10 dias. A associação de altas temperaturas com a cultura de tecidos tem aumentado à eficiência da recuperação de plantas livres de vírus de alho. Após esse tratamento, o explante é excisado e cultivado in vitro (TORRES et al, 1998). A termoterapia pode ser feita de duas maneiras: a seco, ou úmido. A termoterapia a seco consiste em deixar o alho exposto a 38 ºC por um período de 30 dias na BOD. Já na termoterapia úmida, o alho é plantado em bandejas que possuam areia e vermiculita e permanece a uma temperatura de 38 ºC por 10 dias, sendo que esta areia Essa diferença de tempo ocorre porque, quando o alho está em altas temperaturas e em condições de umidade, as chances de ocorrer à proliferação de agente fitopatógenos são elevadas. Por isso, as sementes são retiradas antes da BOD. Durante o período de estágio, a EPAGRI estava realizando a termoterapia úmida, porém a ocorrência de fungos era bastante grande, estragando mais de 70% das sementes. Por este motivo, de acordo com o pesquisador da estação, Renato Vieira, as próximas sementes que serão trabalhadas, passarão por um processo de termoterapia a seco, tentando, desta maneira, diminuir a incidência de fungos. d) Indexação de vírus em plantas A indexação se refere aos testes realizados para demonstrar se a planta está ou não infectada por vírus. As técnicas adotadas variam de acordo com as condições de cada laboratório, com os vírus testados e com o número de amostras analisadas. No laboratório de culturas de tecidos da EPAGRI, é adotado um método sorológico chamado ELISA (Enzyme – Linkd Immunosorbent Assay), que é eficiente, rápido e com ele pode ser testada um grande número de amostras por vez. Uma desvantagem desse método é a necessidade de ter anti-soro específico para cada vírus a ser testado. 33 2.6 Procedimentos para plantio, termoterapia e preparo do alho para retirar o meristema a) Adquirir alho não livre de vírus de produtores da região; Figura 14 - Bulbos selecionados Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. b) Vernalizar os bulbos de alho durante 60 dias (4 a 7 ºC); c) Fazer o tratamento dos bulbilhos em hipoclorito 1,5% (20 minutos); Figura 15 - Pré-limpeza e tratamento com NaClO Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. d) Plantar os bulbilhos em bandejas com areia e vermiculita autoclavadas e colocar na BOD (10 dias a 39ºC); Figura 16 - Bulbilhos em termoterapia Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. 34 e) Colher as plantas de alho da bandeja (após a termoterapia); Figura 17- Pré-assepsia dos bulbilhos Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. f)Lavar bem, descascar os bulbilhos, retirar o excesso de raízes e cortar as folhas; g) No laboratório, lavar mais uma vez com H2O destilada; h) Na cabine colocar as sementes em álcool 70% por 30 segundos; i) Drenar o álcool e em seguida adicionar sobre o alho em recipiente hipoclorito 1,5%, 2 gotas de tween e deixar durante 20 minutos; j) Drenar o hipoclorito e efetuar 3 lavagens com H2O destilada; k) Localizar o meristema; Figura 18 - Meristema Fonte: Lucini (2003) l) Fazer e excisão do meristema com bisturi e microscópio estereoscópio; 35 Figura 19 - Extração do meristema Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. Figura 20 - Meristema isolado Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. m) Colocar em tubo de ensaio com meio de cultura; n) Levar para sala de crescimento por aproximadamente 30 dias, aonde receba 16 horas de luz diariamente, com temperatura controlada; 36 Figura 21 - Meristema com 30 dias de desenvolvimento Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. o) Fazer a transferência para outro meio de cultura com hormônios de bulbificação; Figura 22 - Transferência para outro meio Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. p) Deixar nesse meio por aproximadamente 60 dias; q) Tirar as plântulas do meio de cultura; r) Lavar os bulbilhos em água corrente e deixa-los em cima de papel toalha, dentro do laboratório para secar; 37 Figura 23 - Limpeza do bulbilho Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. Figura 24 - Bulbilho curado Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. s) Bulbilhos são levados para o telado, por onde permanecerão por dois anos, sendo que no primeiro ano somente aumentarão de tamanho, formando um bulbilho maior, e no segundo ano será formado o bulbo. 38 . Figura 25 - Telado antiafídico Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. t) Levar bulbilhos para o campo; Figura 26 - Lavoura de alho livre de vírus em Fraiburgo - SC Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. No campo, os bulbilhos-semente serão plantados e no primeiro ano servirão somente para multiplicação. Sendo que o produtor não irá comercializa-los. Já no 39 segundo ano uma parte dos bulbilhos será comercializada para produtores comerciais e outra parte, permanecerá na propriedade para que sejam novamente multiplicados. A EPAGRI fornece semente livre de vírus todos os anos para um produtor conveniado, Sr. Volni Maciel, da cidade de Fraiburgo, que possui 34 ha plantados com alho. O Sr. Volni se compromete em multiplicar estas sementes e vender para os produtores comerciais. A EPAGRI disponibiliza assistência técnica para este produtor, porém, ele conta com o acompanhamento de um responsável técnico, que trabalha com ele há 16 anos, sempre buscando se manter informado sobre as novas tecnologias de produção de alho. 2.7 Lavoura do produtor de sementes, Volni Maciel 2.7.1 Escolha do terreno Os terrenos para o plantio do alho devem ser bem drenados, de meia encosta, já cultivados e corrigidos. Evitar terrenos úmidos e/ou sombreados. Dar preferência a solos soltos, de elevada fertilidade. (EPAGRI, 2002). No terreno escolhido para o plantio de alho da lavoura do Sr. Volni Maciel, foram realizadas amostragem de solo em diversos pontos, e então enviadas a um laboratório de análise de solo, para então serem efetuadas as devidas correções, de acordo com os resultados mostrados na análise. 2.7.2 Preparo do solo O preparo antecipado do solo – 35 a 45 dias antes do plantio – é importante, pois deixara o canteiro totalmente destorroado, facilitando dessa maneira o plantio. Nessa fase o tratorista tem uma importância muito grande, já que o encanteiramento 40 deve ser uniforme, com a mesma largura nos entre canteiros e bem destorroado (LUCINI, 2011) O solo aonde será plantado o alho é bastante revolvido, sendo que são realizadas diversas operações, visando o destorroamento completo deste solo. No solo do Sr. Volni primeiramente foi realizada uma sobsolagem, seguida de uma subsolagem cruzada, duas gradagens, um riscador e uma enxada rotativa para o encanteiramento. Devido a todas essas operações realizadas no solo, e por este ser um solo nu (completamente sem cobertura), é importante que seja um solo com menor declividade possível, para evitar problemas com erosão, o que trará muitas perdas para o produtor. A lavoura do Sr. Volni possui uma declividade baixa, porém devido ao excesso de chuva, ele teve problema com erosão (Figura 27). Figura 27 - Problemas com erosão Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. 2.7.3 Encanteiramento Essa operação é realizada com enxada rotativa de 1,58 m de largura. Com isso se tem um canteiro de 1,30 m de mesa. O intervalo entre-canteiros é de 0,40 m em média. A altura do canteiro deve ser baixa em solos de lombadas e alto em solos baixos, onde se acumula mais água (LUCINI, 2011). 41 Figura 28 -: Canteiros Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. 2.7.4 Rotação de culturas A rotação de culturas é uma prática recomendável para o alho, adotando esta prática de manejo, fica mais fácil prevenir a cultura de agentes nocivos, como fitopatógenos. Porém não é qualquer cultura que é recomendada para que seja feita a rotação de culturas com o alho. Por exemplo, para evitar problemas com a doença Fusariose (Fusarium solani), que ataca o alho, não se deve utilizar feijão ou soja para a rotação, pois ambos aumentariam a contaminação deste patógeno no solo. Neste caso a rotação deve ser efetuada com gramíneas, ou outras culturas não suscetíveis. Segundo o responsável técnico da lavoura do Sr. Volni, é possível utilizar a mesma área para o plantio do alho durante, no máximo, 3 anos, sem problemas com doenças. Porém, após estes 3 anos, só deve retornar a plantar a cultura na mesma área após 12 anos. 42 2.7.5 Adubação 2.7.5.1 Correção da acidez do solo A correção da acidez do solo deve ser realizada, no mínimo, de quatro a seis meses antes do plantio, utilizando calcário dolomítico com PRNT superior a 80% ou associação de calcário dolomítico com calcítico. A quantidade a ser aplicada deve seguir a “Recomendação de Adubação e Calagem para os Estados do Rio Grande do Sul e Santa Catarina” com base no índice SMP, para elevar o pH do solo de 6,0 a 6,5. Esta correção deve ser efetuada a cada quatro anos, de acordo com a análise de solo (EPAGRI, 2002) 2.7.5.2 Adubação química e orgânica No momento da adubação da cultura do alho, são utilizadas fontes químicas e/ou orgânicas, fornecendo basicamente nitrogênio, fósforo, potássio, zinco e boro. Este ano, na lavoura do Sr. Volni foi utilizada 3 t/ha de esterco de frango e mais 2t/ha de adubo químico na base. A adubação de cobertura do nitrogênio foi efetuada em duas épocas. A primeira adubação foi feita aos 30 dias após o plantio, época em que normalmente terminam as reservas do bulbilho-semente e as folhas tornam-se verde-amareladas, antecipando a senescência das folhas mais velhas que, por sua vez, favorece a entrada de bacterioses, para esta etapa foi utilizado 70 Kg/N/ha. A segunda adubação de cobertura foi efetuada 12 dias após a diferenciação dos bulbilhos, onde foi aplicado 100 Kg/N/ha. 43 2.7.6 Cultivares Existe inúmeras cultivares de alho sendo comercializadas no mercado brasileiro, porém a maioria destas não são devidamente classificadas e separadas, o que faz com que, muitas vezes, os agricultores adquiram materiais de baixa qualidade e produtividade. Por isso é importante que se conheça o material que está comprando e suas características agronômicas. As diferentes cultivares de alho são classificadas conforme a duração do ciclo, exigências de fotoperíodo e temperatura, sendo elas: Cultivares precoces (Comuns) – possuem ciclo em torno de 120 a 130 dias, é menos exigente em fotoperíodo e frio, tem larga adaptação em regiões brasileiras de temperaturas diferenciadas, possui grande número de bulbilhos (20 – 25), de cor branca ou arroxeadas, e tem um menor valor comercial, se comparada com as demais cultivares. Dentre as cultivares precoces destacam-se: Cará e Gigante de Curitibanos (BORTOLOSSI, 2011). Cultivares de ciclo tardio (Nobres) - possuem ciclo de 160 a 210 dias, são mais exigente em fotoperíodo (13 horas) e em frio, apresenta bulbo graúdos com menor número de bulbilhos (8 – 10) , de cor externa esbranquiçada, tem alta capacidade de conservação e alta cotação comercial. Dentre as cultivares de ciclo tardio destacamse: Chonan, Quitéria, Esmeralda e Jonas, Ito. (BORTOLOSSI, 2011). Na lavoura de Fraiburgo foram plantadas as cultivares Ito, Caçador, Quitéria, Esmeralda e Jonas, sendo as 3 primeiras livre de vírus. 2.7.7 Plantio de alho-semente O plantio manual do alho é o melhor modo, pois permite que todos os bulbilhos – sementes sejam plantados com o ápice para cima (Figura 29), formando, assim, uma lavoura uniforme e com mais probabilidade de brotação (EPAGRI, 2002). Se gasta na faixa dos 12 a 15 dias/homens por hectare, que são remunerados por dia, sendo pago 15 centavos por metro. A marcação onde será feito o plantio deve ser bem visível e sem torrão, assim, consequentemente, o 44 rendimento da mão de obra será superior. O rendimento médio de plantio varia de 200 a 400 metros de canteiro por dia por trabalhador (LUCINI, 2003). Figura 29 - Plantio de alho semente Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. 2.7.8 Escolha da semente O alho responde em produtividade de acordo com a qualidade do bulbilho – semente, sendo que este fator representa um custo total de produção de até 50 %. Por isso é importante que, para a lavoura a qual se destina para sementes, sejam dispensadas excelentes condições nutricionais, de manejo e fotossanitárias (EPAGRI, 2002). O lote de alho que manifestar problemas com nematóide, fusarium e podridão branca deve ser descartado (LUCINI, 2003) O fator que pode ser considerado de maior importância para o plantio do alho é a escolha da semente, aonde deve ser considerado o tamanho, época de escolha e sanidade das mesmas. 2.7.9 Classificação da semente O bulbilho é classificado por tamanho após a debulha, já que se planta de maneira distinta cada grupo de peso de bulbilho. Essa classificação é realizada no rolo de classificar com cilindro e malhas. Os bulbilhos que caem na primeira peneira 45 são descartados (menores que 1,5 gramas/bulbilho) e comercializados para a indústria, já os demais são plantados. Normalmente a segunda e terceira peneira é repassada visando uma melhor classificação dos bulbilhos (1,5 a 3,0 gramas/bulbilho) (LUCINI, 2003). O tamanho da semente considerado ideal é o das peneiras 5, 6 e 7 (Tabela ), que apresentam maior reserva de energia e melhores condições para seu desenvolvimento a campo. Tabela 2 - Classificação de bulbos de alho segundo o maior diâmetro transversal. TAMANHOS DIÂMETRO HORIZONTAL (mm) PREÇO (R$/Kg) 7 > 55 3,0 6 47 - 54 2,7 5 42 - 46 2,2 4 37 - 41 1,8 3 32 - 36 1,5 Fonte: Ministério da Agricultura – Portaria nº 242 de 17 de setembro de 1992. 2.7.10 Época de plantio A época de plantio depende da variedade a ser plantada. Essa época é determinada pela brotação do bulbilho que varia de acordo com as condições de armazenamento do alho-semente. A brotação é de fácil visualização, basta cortar o bulbilho longitudinalmente. O ideal é plantar o alho quando o mesmo apresenta 90% de IVD (Figura 30). Recomendam-se as seguintes épocas de plantio, de acordo com as cultivares: Caçador, Jonas e Ito no mês de junho; Chonan de 10 de junho a 10 de julho; Quitéria, São Valentin e/ou Esmeralda final de junho a final de julho (LUCINI, 2003); Figura 30 - Índice visual de dormência Fonte: Lucini (2003) 46 2.7.11 Espaçamento de plantio O ideal é que as perdas nos entre canteiros sejam pequenas. O espaço nos entre canteiros deve ser de 0,40 m. A “mesa” do canteiro deve ser de 1,20 a 1,30 metros. O plantio deve ser longitudinal, com 4, 5 ou 6 fileiras em cima do canteiro. No sistema de plantio de 5 linhas, a distância entre as mesmas é de 25 cm, variando apenas dentro da linha de 10 a 12 cm., de acordo com o peso dos bulbilhos LUCINI, 2003). No sistema de plantio de 6 linhas, que é o utilizado na lavoura do Sr. Volni, recomenda-se usar 3 linhas duplas, no espaçamento de (10 X 38 X 10 X 38 X 10 ) nas fileiras e de 12 cm entre plantas (Figura 31) dentre das linhas de acordo com o peso dos bulbilhos, época de plantio e variedade. O stand por ocasião da colheita é de 300-330.000 plantas/hectare para bulbilhos graúdos e de 330-360.000 plantas/hectare para bulbilhos médios. Quanto maior o stand, maior será a produtividade, mas menor será o tamanho do alho colhido (LUCINI, 2003). Figura 31 - Espaçamento de plantio Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. 2.7.12 Superbubilhamento O superbulbilhamento (Figura 32) ou pseudoperfilhamento constitui um dos maiores problemas na cultura do alho, principalmente nas cultivares que produzem o 47 chamado “alho nobre”. É uma anomalia genético-fisiológica que se caracteriza pela brotação dos bulbilhos antes da colheita. Os brotos novos crescem através do pseudocaule e emergem nas axilas das folhas, dando a planta o aspecto de uma ramificação abundante (LUCINI, 2003). Vários fatores têm sido relacionados como influentes no superbrotamento como: fotoperíodo, temperatura, cultivares, nitrogênio e irrigação (LUCINI, 2003). Apesar dos cuidados, na lavoura do Sr. Volni ainda teve problemas com superbulbilhamento, como pode ser observado na figura 33. Figura 32 - Superbulbilhamento Fonte: Lucini (2003) Figura 33 - Superbulbilhamento do alho Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. 48 2.7.13 Plantas daninhas Sério problema par a cultura do alho que possui desenvolvimento inicial lento. As folhas de alho, por serem eretas, cobrem imperfeitamente o solo até a diferenciação, permitindo germinação de plantas daninhas. O período crítico de competição vai dos 20 dias após o plantio até a diferenciação. As principais plantas daninhas são: Euphorbia heterophylla, Rumex obtusifolius L., Phoradendron affine e Bidens pilosa L. (LUCINI, 2003). Figura 34 - 1 - Euphorbia heterophylla; 2 - Rumex obtusifolius L; 3 - Phoradendron affine; 4 Bidens pilosa L.; Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. Nos primeiros 60 dias da lavoura do Sr. Volni, começaram a surgir a erva Phoradendron affine, que é popularmente conhecida como erva de passarinho e é de difícil controle.O Sr. Volni estava aplicando o herbicida Totril que é um herbicida de contato, absorvido pelas folhas e cujo princípio ativo é o ioxinil. A dose utilizada pelo produtor é de 300 ml/ha, porém, por ser uma dose muito baixa (já que o recomendado é de 1,5 l/ha), não estava surgindo efeito. O Sr. Volni ficou receoso em aumentar a dose, pois acredita que pode acarretar em fitotoxidez para as plantas 49 de alho. Desta maneira, ele contratou mão- de-obra, e esta erva foi controlada manualmente. Figura 35 - Mão-de-obra na cultura do alho Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. 2.7.14 Principais pragas O principal inseto que ataca a cultura do alho é o Tripes spp. Um inseto pequeno, cerca de 1 mm, que raspa as folhas, suga a seiva das plantas deixando manchas prateadas nas folhas, que amarelecem e secam. O controle dessa praga se da através de rotação de culturas, ou inimigo natural, sendo um deles a tesourinha (LUCINI, 2003). Outra praga que afeta a cultura do alho são os ácaro dos bulbos, que vivem nas dobras das folhas e sobre os bulbilhos. No campo causa deformação das folhas. Já no armazém provoca o chochamento bulbilhos. O controle dessa praga se da com pulverização de acaricidas (LUCINI, 2003). Para o controle de Tripes, o produtor utiliza o inseticida Engeo Pleno, na dose de 250 ml/ha. Este inseticida é sistêmico, de contato e ingestão, do grupo químico neonicotinóide e piretróide 50 Figura 36 - Ácaro e pulgões Fonte: Lucini (2003) 2.7.15 Principais doenças Inúmeras doenças atacam a cultura do alho. Um dos problemas que mais contribuem para o agravamento da severidade das doenças nessa cultura é a falta de variedades resistentes. Entre as doenças que mais causam prejuízo para a cultura do alho destacam-se: Ferrugem (Puccinia allii Rud), Alternária (Alternaria porri,) Podridão branca (Sclerotium cepivorum Berkeley) e Podridão de esclerócio (Sclerotium rolfsii Sacc). 51 y x Figura 37 - 1- Fusarium oxysporum; 2- Sclerotium rolfsii Sacc.; 3 - Puccinia allii Rud.; 4 Alternaria porri Fonte: Estágio supervisionado. Caçador, SC. Out. 2011. Para o controle de Ferrugem, o produtor utiliza o fungicida Cabrio Top (Pyraclostrobin + Metiram), na dose de 600 l/ha. Cabrio Top é um produto que apresenta duplo modo de ação, atuando como inibidor do transporte de elétrons nas mitocôndrias das células dos fungos, inibindo a formação de ATP, essencial nos processos metabólicos dos fungos. Cabrio Top apresenta excelente ação protetiva, devido a sua atuação na inibição da germinação dos esporos, desenvolvimento e penetração dos tubos germinativos (BASF, 2011) 2.7 16 Colheita A colheita do alho é manual, sendo passada uma lâmina, para cortar as raízes e facilitar o arranquio do solo. Depois de arrancado o alho é deixado em cima dos canteiros para o processo de pré-cura, aonde permanece de 2 a 4 dias. Após a précura, o alho é amarrado, colocado em carretas agrícolas e transportado até o 52 barracão onde será pendurado para secar. O trabalhador com prática consegue arrancar 300 m/homem/dia (LUCINI, 2003). Figura 38 - Colheita Fonte: Lucini (2003) A colheita na lavoura do Sr. Volni sempre foi manual, porém este ano, o produtor importou duas máquinas de colher alho. Como a colheita iniciou nos primeiros dias do mês de novembro, não foi possível acompanha-la durante o período de estágio. O produtor afirmou que ainda tem dúvidas sobre a colheita mecanizada, pois, como nunca trabalhou com ela, não sabe quais serão os resultados. 2.7.17 Cura A cura do alho é realizada nos barracões destinados a esse fim. É quando há perda do excesso de umidade pela planta e a continuação da transferência de substâncias orgânicas das folhas para o bulbo. Assim há a cicatrização dos ápices dos bulbilhos que favorece o armazenamento. O barracão deve ser ventilado para evitar mofo, e o alho vai permanecer lá em torno de 30 dias (LUCINI, 2003). 53 Figura 39 - Cura Fonte: Lucini (2003) 54 3 CONSIDERAÇÕES FINAIS Durante o período de estágio, foi possível conhecer e estudar a cultura do alho, suas principais características, meio de produção, dificuldades encontradas e resultado estimado da cultura. Também, foi bastante trabalhado com a produção de sementes de alho livre de vírus, uma tecnologia de mais de 40 anos, que vem sendo desenvolvida há uns 10 anos pela EPAGRI, e ultimamente, tem mostrado resultados positivos. Proporcionando, assim, aos produtores da região, um alho mais sadio e consequentemente, mais produtivo. Com o final do estágio, foi possível concluir que a cultura do alho, se bem manejada, e contando com um pouco de sorte nas condições climáticas importantes para seu pleno desenvolvimento, pode ser uma cultura de altíssima fonte de renda para pequenos produtores, pois apesar do elevado custo de produção por área, apresenta uma renda líquida bastante alta. 55 REFERÊNCIAS ALVES, C.; OLIVEIRA, J. R.; REIS, É.; CORRÊA, R. M.; SOUZA, J.; SILVA, J. C. O.; PAULA, J. C. R.; RODRIGUES, L. H. F.; SOUZA. M. A.; MENDONÇA, M. R.; A Cultura de Tecidos na Agricultura. I Jornada Científica e VI FIPA do CEFET Bambuí. Bambuí/MG – 2008. BASF, Cabrio Top – fungicida. Disponível em: http://br.viarural.com/agricultura/defensivosagricolas/basf/cabrio-top.htm. Acesso em 23/10/11. BORTOLOSSI, J. L.; Cultivo do alho. FAG – Agronomia, Olericultura. Disponível em: http://www.fag.edu.br/professores/jlbortolossi/OLERICULTURA/CULTIVO%20DO%20ALHO. pdf. Acesso: 04 Set. 2011. CALDAS, L.S.; HARIDASAN, P.; FERREIRA, M.E. 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