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Universidade Federal Rural de Pernambuco – UFRPE Programa de Pós-Graduação em Ciências do Solo - Seminários III - BPCPs - RIZÓBIO - Leguminosa: avaliação da atividade enzimática e performance simbiótica Discente: Artenisa Cerqueira Rodrigues Orientadora: Drª. Márcia do Vale Barreto Figueiredo Co-orientadores: Prof. Dr. Joaquim Albenísio G. da Silveira (UFC) Dr. Hélio Almeida Burity (IPA) Recife – PE Dezembro/2009 Introdução Cultura do feijoeiro; No Brasil, o feijão é largamente consumido, participando com 20 a 28% das proteínas ingeridas; 3,8 milhões de hectares, produtividade média baixa (915 kg/ha) 2008); (IBGE Particularmente o N e o P, é um dos fatores limitantes à obtenção de maiores rendimentos no Brasil; Os teores de N (Brasil): 0,05% a 0,3%. FBN: alternativa de baixo custo, protetora do meio ambiente e com grande contribuição para o tipo de manejo buscado mundialmente, resultando em uma agricultura sustentável. FBN em leguminosas Continuação: Introdução Importância fundamental, pode ser tão limitante quanto a H2O; Complexo nitrogenase Assimilação se dá por reações bioquímicas complexas; +] [NN 16 ATP + 8e- + 8H 79% do atmosfera, que aparece na [2NH forma ADP N≡N + 16(N Pi2+) H deve ser 2 + na 3 + 16de 2] transformado, ou seja, reduzido; N molecular Plantas obtém o N através da associação simbiótica com bactérias ou Amônia pela adubação nitrogenada; Reações de fixação do N: processos industriais ou naturais; Natural: grupo deprotéicas: microrganismos que possuem o complexo 2 subunidades Fe - proteína e MoFe-proteína nitrogenase. Continuação: Introdução EPSs microbianos - EPS; Efeito rizosfera - Lipopolissacarídeos; Polissacarídeos de origem microbianos, também conhecidos como - Polissacarídeos capsulares. gomas ou exopolissacarídeos (EPS); Os microrganismos da família Rhizobiaceae são produtores de EPSs; Encurvamento do pelo radicular Gênero Rhizobium: succnoglicanas e galactoglucanas Estes polissacarídeos bacterianos são necessários para uma funcional simbiose x Rhizobium; Formaçãoleguminosa do nódulo Papel essencial na formação do cordão de infecção e desenvolvimento dos nódulos Continuação: Introdução Bactérias Promotoras de Crescimento em Plantas (BPCPs) Por definição: são bactérias que colonizam raízes e que exercem um efeito benéfico no desenvolvimento ou sanidade da planta; Aumento da taxa de germinação; Dentre as características importantes para o sucesso, na aplicação de BPCPs, estão Crescimento a capacidadedasderaízes; colonização e a sobrevivência no hospedeiro; Crescimento de colmos ou caules; Aumento do número de folhas e área foliar; Podem aplicadas separadamente ou em misturas; Crescimento de tubérculos; Aumento doestratégia número dena flores e rendimento. Misturas: importante promoção de crescimento (PC), dependendo da combinação e compatibilidade dos isolados envolvidos tanto na PC quanto no biocontrole. Continuação: Introdução Enzimas São catalisadores muito potentes e eficazes, quimicamente definidos como proteínas; Enzima reage com determinados constituintes das células (substratos), formando complexos – atividade enzimática; Variação de velocidade dessas reações; [ ] da enzima ou de substrato, pH e temperatura Especificidade. Produto Substrato Sítio ativo enzima Enzima Complexo enzima substrato Complexo enzima produto Produto deixando o sítio ativo da enzima Figura 1. Representação geral da ligação enzima-substrato. Objetivos Estudar a interação sinérgica entre rizóbio e BPCPs que resulte em maiores nodulações e FBN no feijoeiro; Verificar o papel de EPSs na sobrevivência da bactéria e na colonização da raiz do feijoeiro para nodulação e fixação de N2; Determinar os grupamentos piruvato e acetila presentes nas moléculas das gomas produzidas por EPSs e quantificar RMN1H; Continuação: Objetivos Determinar as atividades das enzimas chaves na FBN e das enzimas envolvidas na senescência dos nódulos em feijão, atividades das enzimas indicadoras de estresse oxidativo durante a após o estabelecimento da simbiose; Avaliar o efeito dos veículos de inoculação formulados sobre a emergência, nodulação, performance simbiótica e desenvolvimento das plantas de feijão. Material e Métodos Mecanismos de ação das BPCPs serão avaliados : 1 - Estirpes de Bactérias (BPCPs) Produção do ácido indol acético (AIA); Bacillus , Paenibacillus, Brevibacillus β-1,3-glucanase; e Methylobacterium UFPE, UFRJ e DSMZ HCN. Repicadas para tubos de cultivo com Padrão positivo: os seus respectivos meios de cultura. AIA (Pantoea aglomerans (601). Já purificadas: repicadas para o meio Manitol Extrato de Levedura (YEM), Trypticase Soy Broth (TSB) BPCPs o meio TSA e para o Rhizobium tropici o meio YEMA. Incubação: 32 °C para BPCPs e 28° C para o rizóbio. Serão avaliadas quanto à capacidade de fixar N2 em meio NFb sem fonte de nitrogênio. sementes serão incubadas em 2- As Colonização e sobrevivência decâmara BPCPs nas raízes e folhas do feijão úmida 24 horas 2.1 - Inoculação depor BPCPs em plantas hospedeiras - Delineamento cv. “Princesa” experimental: Colocadas em suspensão bacteriana (106 IC comem 44 tampão tratamentos –- Blocos 107 UFC/mL) fosfato e agitadas a 150rpm por 18 horas. Desinfestação Câmara úmida germinarem. Álcool 70% por 1’ 43 BPCPs + 1 testemunha Amostras absoluta serão preparadas para a MEV por 24 horas, para 2% de hipoclorito de sódio 3 repetições por 1’ - A análise estatística será conduzida utilizando SAS; Álcool 70% As ser etransferidas - Asementes análise dedevem variância teste de comparação de médias, para A colheita será os para tubos contendo meio MS (Murashige & efetuada aos 15 dias efeitos fixos e variáveis. Skoong, 1962). Lavadas 7 vezes em água destilada esterilizada Experimento será conduzido em câmara de crescimento a uma temperatura de 28° C. 3 - Avaliação da co-inoculação do feijão com Rhizobium x BPCPs no fenótipo da raiz Deformação da raiz principal; Aumento no número de pêlos radiculares; Desinfectadas conforme metodologia de Vincent, (1970) e pré-germinadas em câmara de germinação, a 25ºC por 3 dias. Pêlos radiculares deformados; Pêlos encurvados. As plântulas serão transplantadas para frascos de vidro (15 x 8 cm). Avaliar através de microscopia. Contendo meio com 8g/L de agar e solução nutritiva isenta de N com pH 6,8. O experimento será conduzido em câmara de crescimento (já descrito no item anterior). Zaat et al., 1987; Vasse & Truchet, 1984. Após 15 dias serão feitas as avaliações A4 colheita será realizada após oem plantio - Co-inoculação BPCPs35edias rizobio feijão: sinergismo entre microrganismos Altura de planta; Instituto Agronômico de Pernambuco – IPA Comprimentoexperimental: da raiz; - Delineamento Matéria da tratamentos parte aérea (MSPA); - Blocos IC seca com entre 46 Selecionar 43 estirpes BPCPs X estirpe padrão (CIAT 899) Serãode selecionadas: ( promoção Matéria seca da raiz (MSR);de crescimento do feijão) Relação 43 BPCPs MSPA/MSR; +Substrato 1 estirpe CIAT + 2 testemunhas (absoluta e nitrogenada) cv. "Princesa" areia 899 + vermiculita ( 2:1) - vasos de Teor de nitrogênio; 3 Leonard repetições As sementes serão desinfectadas segundo e tamanho dos - ANúmero análise estatística seránódulos; conduzida utilizando SAS;Vincent (1970). (autoclavado) específica; - ANodulação análise de variância e teste de comparação de médias, para os 7 As concentrações de BPCPs: 10 células/semente Rizóbio: 108e células/semente. Eficiência eficácia; efeitos fixos variáveis. Teor de leghemoglobina (LHb) Durante o desenvolvimento da planta : solução nutritiva de Hoagland & Arnon modificada conforme Silveira et al. (1998). Bremner (1965); (Gulden & Vessey, 1998); (Farias & Franco, 2002); Wilson & Reisenauer (1963). 5 - Extração de Polissacarídeos extracelulares (EPSs) Melhores pares simbióticos obtidos do experimento anterior. Remoção das células bacterianas por centrifugação (32306,3 g por 40’ a 4º C). Purificação: metodologia de Giavasis et al., (2000). Viscosidade aparente Análise reológica Taxa de cisalhamento Tensão de cisalhamento Teor de acetil e piruvato Qualidade e quantidade de goma como suporte para veículos formulados. 6 - Experimento em casa de vegetação com substrato esterilizado Casa de vegetação Avaliada a eficiência da fixação do N2 no feijão Vasos de Leonard (areia + vermiculita esterilizadas - 2:1) Inoculantes formulados Inoculação nos simbióticos veículos 3 melhores pares (rizóbio (CIAT 899) + 2Inoculação melhores BPCPs) nos formulados (EPSs) e na turfa: Inoculação na semente: técnica veículos recomendada para os inoculantes formulados (EPSs) e na turfa: Separadamente (108 células/mL Mistura (melhor par simbiótico: CIAT Quantidade e Qualidade da avaliada reologia da estirpe padrão - CIAT 899) +goma BPCPs) obtidopela do experimento anterior Durante o desenvolvimento: Solução nutritiva isenta de N de Hoagland & Arnon modificada por Silveira et al. (1998). As plantas serão colhidas em dois períodos: Pico da fixação de N2; Inicio da senescência. Serão avaliados os parâmetros relacionados aos diferentes indicadores para as atividades das enzimas. 7 - Avaliação das atividades enzimáticas do feijoeiro 7.1 - Indicadores de eficiência de FBN a) Atividades enzimáticas: b) Nível de metabólitos: Glutamina sintetase; Ureídeos; Glutamato sintase; N-total; Sacarose sintetase; Leghemoglobina; Aspartato amino transferase; Sacarose; Glutamato desidrogenase aminante; Proteínas. Uricase; Alcaline invertase. 7.2 - Indicadores de senescência: a) Atividade enzimática: Atividades proteolíticas (in vitro e géis); Proteases cisteínicas; Proteases de asparto e proteases serinicas; Glutamato desidrogenase deaminante. b) Metabólitos indicadores de senescência: Amônia; N-amino livre; Peróxido de hidrogênio. relação à planta: 7.3Em - Indicadores de estresse/proteção oxidativo: a) Atividade enzimática (defesa): Teor de N total da parte aérea; Clorofila total; Peróxidase; Matéria seca da parte aérea; Catalase; b) Indicadores de estresse oxidativo: Peroxidação de lipídios; Oxidação de proteínas; Peróxido de hidrogênio. Raiz e nódulo; Peróxidase de ascorbato; Os materiais selecionados como mais promissores serão Número e tamanho de nódulos; Fenilalanina amônia liase; avaliadas também, em experimentos com vasos contendo solo Comprimento não esterilizado. Lipoxigenase;da raiz; Relação matéria seca/raiz; Glutation reductase; Altura da planta; Superóxido desmutase. Eficiência da fixação de N2; Nodulação específica. Será avaliado: Colonização e sobrevivência de BPCPs nas raízes e folhas do feijão; Por MEV. 8 - Experimento em casa de vegetação com solo não-esterilizado Argissolo Vermelho-Amarelo (5 kg/vaso) Determinada a população nativa de rizóbio do solo Mesmos tratamentos solo não esterilizado Correção do pH para 6,3 Desenvolvimento da planta: solução nutritiva isenta de N (Hoagland & Arnon modificada conforme Silveira et al. (1998). Considerações Finais Redução na aplicação de fertilizantes nitrogenados, diminuindo os riscos de contaminação de rios e águas subterrâneas por nitratos; A inoculação de microrganismos promotores de crescimento, visando à sustentabilidade das produções agrícolas e utilização racional dos recursos naturais; Interação planta-microrganismo benéfico, gerando novos insumos microbiológicos capazes de promover grandes saltos qualitativos na agricultura; Esclarecer a atividades de enzimas, no feijoeiro, como indicadores de eficiência, senescência e de estresse/proteção oxidativo durante e após o estabelecimento da simbiose, visto que os nódulos de raízes de leguminosas, são caracterizados por uma senescência precoce. [email protected]
