Avaliação da viabilidade embrionária na reprodução humana
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Rita de Cássia Savio Figueira AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE EMBRIONÁRIA NA REPRODUÇÃO HUMANA ASSISTIDA: VALOR PREDITIVO DE PARÂMETROS MORFOLÓGICOS Tese apresentada ao curso de PósGraduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. São Paulo 2015 Rita de Cássia Savio Figueira AVALIAÇÃO DA VIABILIDADE EMBRIONÁRIA NA REPRODUÇÃO HUMANA ASSISTIDA: VALOR PREDITIVO DE PARÂMETROS MORFOLÓGICOS Tese apresentada ao curso de PósGraduação da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências da Saúde. ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: Ciências da Saúde ORIENTADOR: Prof. Dr. Tsutomu Aoki CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Edson Borges Jr. São Paulo 2015 Versão Corrigida FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pela Biblioteca Central da Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo Figueira, Rita de Cássia Savio Avaliação da viabilidade embrionária na reprodução humana assistida: valor preditivo de parâmetros morfológicos./ Rita de Cássia Savio Figueira. São Paulo, 2015. Tese de Doutorado. Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo – Curso de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. Área de Concentração: Ciências da Saúde Orientador: Tsutomu Aoki Co-Orientador: Edson Borges Júnior 1. Infertilidade 2. Fertilização in vitro 3. Desenvolvimento embrionário 4. Transferência embrionária BC-FCMSCSP/12-15 DEDICATÓRIA Aos meus pais, eternos exemplos de dedicação. Ao meu irmão e amigo para toda a vida, Cezar. Ao Murilo, meu amor verdadeiro e companheiro. Ninguém pode tirar de você... ... A disposição de tentar mais uma vez. ... A vontade de enfrentar desafios. ... A sensação de dever bem cumprido. ... A coragem de ser simplesmente você. AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Tsutomu Aoki pela orientação e pelo exemplo de determinação. Ao Dr. Edson Borges Jr., pela orientação e não só pelo incentivo, mas também pelo exemplo na busca incansável por conhecimento. Obrigada por tudo. Ao Dr. Edson Borges Jr. e ao Dr. Assumpto Iaconelli Jr., diretores clínicos do Fertility Medical Group, pela oportunidade e por toda a confiança em mim depositada ao longo desses 10 anos de trabalho árduo e de bons momentos compartilhados. À Gloria Calderon, diretora da empresa EmbryoTools, por ser a principal responsável pela minha paixão pela morfologia embrionária e pelo seu apoio sempre. A todos os membros da equipe de embriologistas dos Laboratórios de Fertilização in vitro e Andrologia do Centro de Fertilização Assistida - Fertility: Livia Vingris, Matheus Azevedo, Renata Ferreira, Rodrigo Provenza e Thais Serzedello, pelo verdadeiro significado de EQUIPE resultando em muitos bebês em casa e pelos inúmeros bons momentos compartilhados. Amigos, obrigada pela dedicação e por todo o carinho. Aos novos membros desse time: Caroline Brogliato e Jéssica Rocha pelo interesse notório em serem realmente parte desta EQUIPE. A todos os funcionários do Centro de Fertilização Assistida - Fertility e do Instituto Sapientiae pelo convívio, em especial à Carla Mercante, à Margaret Meira, à Daniela Braga e à Amanda Setti pelo profissionalismo associado a boas risadas. Aos meus pais Jorge e Maria José e ao meu irmão Cezar pelo amor incondicional, pelo apoio, pelo incentivo constante e por estarem ao meu lado em todos os momentos, independente da distância. Obrigada por tudo. À Elvira, ao Ivaldir e à Nola, minha segunda família, por todo apoio e carinho sempre presentes. Ao meu esposo Murilo, pelo companheirismo, compreensão, admiração e pelo amor sempre tão presente. Obrigada pelo alicerce intelectual e emocional na finalização deste trabalho e por tudo que “construímos” neste período. À Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo e À Irmandade da Santa Casa de Misericórdia de São Paulo por proporcionarem a efetivação desta tese. Ao Centro de Fertilização Assistida - Fertility e às pacientes submetidas ao tratamento pela disponibilização dos dados utilizados para elaboração desta tese. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro. LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS μL - Microlitro UI - Unidades internacionais ASRM - do inglês American Society for Reproductive Medicine (Sociedade Americana de Medicina Reprodutiva) CDC - do inglês Centers for Disease Control and Prevention (Centros de Controle e Prevenção de Doenças) CFM - Conselho Federal de Medicina CNS - Conselho Nacional de Saúde CGH - do inglês Comparative Genomic Hybridization (Hibridização Genômica Comparativa) CO2 - Dióxido de carbono CP - Corpúsculo polar CPN - Corpos Precursores de Nucléolos DNA - do inglês Deoxyribonucleic Acid (Ácido desoxirribonucléico) DP - Desvio padrão E2 - Estradiol EC - Extracitoplasmático EOC - Estímulo Ovariano Controlado EPV - Espaço perivitelineo ESHRE - do inglês European Society of Human Reproduction and Embryology (Sociedade Européia de Reprodução Humana e Embriologia) FISH - do inglês Fluorescent In Situ Hybridization (Hibridização in situ fluorescente) FIV - Fertilização in vitro FSH - do inglês Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante) r-FSH - do inglês recombinant Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante recombinante) HP-u-FSH - do inglês Highly Purified urinary Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante urinário altamente purificado) GnRH - do inglês Gonadotropin Releasing Hormone (Hormônio Liberador das Gonadotrofinas) hCG - do inglês human Chorionicgonadotropin (Gonadotrofina Coriônica Humana) r-hCG - do inglês recombinant human Chorionicgonadotropin (Gonadotrofina Coriônica Humana recombinante) β-hCG - do inglês human Chorionicgonadotropin beta subunit (subunidade beta da Gonadotrofina Coriônica Humana) HEPES - (N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfônico) HSA - do inglês Human Serum Albumin (Albumina Sérica Humana) IC - Intracitoplasmático ICSI - do inglês Intracytoplasmic Sperm Injection (Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóides) MCI - Massa Celular Interna NSFG - do inglês National Survey of Family Growth (Pesquisa Nacional de Crescimento Familiar) OMS - Organização Mundial da Saúde OMICS - Conjunto de ferramentas de análise genômica, transcriptômica e proteômica OR - do inglês Odds ratio (Razão de Chance) PN – Pronúcleo(s) POP – Procedimento Operacional Padrão PVP - Polivinilpirrolidona RE - Retículo endoplasmático REDLARA - Rede Latinoamericana de Reprodução Assistida REL - Retículo endoplasmático liso RHA - Reprodução Humana Assistida RLA - Registro Latinoamericano RNA - do inglês Ribonucleic Acid (Ácido ribonucleico) mRNA - do inglês messenger Ribonucleic Acid (Ácido ribonucleico mensageiro) rRNA - do inglês ribosomal Ribonucleic Acid (Ácido ribonucleico ribossomal) RON - Regiões Organizadoras de Nucléolos SART CORS - do inglês Society for Assisted Reproductive Technology Clinic Outcome Reporting System (Sistema de Relato dos Resultados Clínicos da Sociedade Nacional Americana para Tecnologia Reprodutiva Assistida) SPTZ - Espermatozoides TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TRF - Trofoectoderma VAC - Vacúolo ZP - Zona pelúcida LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: Esquema didático para avaliação da simetria de blastômeros nos dias 2 e 3 do desenvolvimento embrionário........................................................................................................26 FIGURA 2: Modelo de categorização das variáveis número de células / ritmo de clivagem e simetria de blastômeros para os dias 2 e 3 do desenvolvimento utilizados para submissão dos dados à análise estatística...............................................................................................................34 FIGURA 3: Curva ROC para o modelo taxa de formação de blastocistos...................................62 LISTA DE TABELAS TABELA 1: Modelo de classificação da fragmentação embrionária humana segundo Alikani, 1999..................................................................................................................................14 TABELA 2: Modelo de classificação de blastocistos humanos cultivados in vitro segundo Gardner and Schoolcraft, 1999.........................................................................................17 TABELA 3: Intervalos de horas em relação ao horário de realização do procedimentode ICSI utilizados para avaliação regular dos embriões quanto aos critérios morfológicos de interesse.....................................................................................................................................31 TABELA 4: Descrição das características dos casais inseridos no presente estudo e de seus ciclos de tratamento de RHA..........................................................................................39 TABELA 5: Descrição das características clínicas da população estudada e dos ciclos de tratamento de RHA. ......................................................................................................................40 TABELA 6: Descrição das variáveis de resposta folicular das pacientes submetidas ao EOC...........................................................................................................................................41 TABELA 7: Descrição dos parâmetros seminais pré-processamento das amostras submetidas à ICSI..............................................................................................................................................42 TABELA 8: Perfil laboratorial das variáveis de sucesso após submissão dos oócitos à ICSI.................................................................................................................................................42 TABELA 9: Taxas de sucesso do tratamento de RHA para as pacientes avaliadas no estudo.....43 TABELA 10: Descrição das características e do perfil de resposta clínica e laboratorial dos casais submetidos ao tratamento de RHA de acordo com a classificação do embrião no dia 5 do desenvolvimento............................................................................................................................44 TABELA 11: Taxa de blastocistos obtidos no dia 5 do desenvolvimento de acordo com as características dos casais e de seus ciclos de tratamento de RHA..................................................45 TABELA 12: Descrição da incidência dos dismorfismos oocitários avaliados no dia 0 do desenvolvimento.............................................................................................................................47 TABELA 13: Taxa de formação de blastocisto de acordo com o dismorfismo oocitário detectado no oócito submetido à ICSI............................................................................................................48 TABELA 14: Descrição da incidência das alterações do padrão de morfologia pronuclear avaliadas no presente estudo...........................................................................................................49 TABELA 15: Taxa de formação de blastocisto de acordo com a alteração do padrão de morfologia pronuclear detectado nos zigotos obtidos após a ICSI................................................50 TABELA 16: Descrição das características dos embriões de acordo com os critérios de morfologia embrionária avaliados para o dia 2 do desenvolvimento.............................................52 TABELA 17: Taxa de formação de blastocisto de acordo com os critérios morfológicos avaliados nos embriões em dia 2 do desenvolvimento..................................................................53 TABELA 18: Descrição das características correspondentes aos padrões de morfologia embrionária do dia 2 do desenvolvimento, de acordo com a classificação do embrião no dia 5 do desenvolvimento............................................................................................................................55 TABELA 19: Descrição das características dos embriões de acordo com os critérios de morfologia embrionária avaliados para o dia 3 do desenvolvimento.............................................56 TABELA 20: Taxa de formação de blastocisto de acordo com os critérios morfológicos avaliados nos embriões em dia 3 do desenvolvimento...................................................................58 TABELA 21: Descrição das características correspondentes aos padrões de morfologia embrionária do dia 3 do desenvolvimento, de acordo com a classificação do embrião no dia 5 do desenvolvimento.............................................................................................................................59 TABELA 22: Critérios selecionados pelo modelo de regressão logística binária múltipla como preditores da obtenção de embriões em estágio de blastocisto quando cultivados até o dia 5 do desenvolvimento.............................................................................................................................60 TABELA 23: Descrição das características dos casais e de seus ciclos de tratamento de RHA de acordo com a taxa de implantação dos embriões transferidos em estágio de blastocisto...............64 TABELA 24: Taxa de implantação dos blastocistos transferidos de acordo com as características dos casais e de seus ciclos de tratamento de RHA.........................................................................65 TABELA 25: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com o dismorfismo oocitário detectado no oócito submetido à ICSI.......................................................66 TABELA 26: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com a alteração do padrão de morfologia pronuclear detectado nos zigotos obtidos após a ICSI...........68 TABELA 27: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com os critérios morfológicos detectados nos embriões em dia 2 do desenvolvimento.............................70 TABELA 28: Descrição das características correspondentes aos padrões de morfologia embrionária do dia 2 do desenvolvimento, de acordo com a taxa de implantação dos embriões transferidos em estágio de blastocisto............................................................................................71 TABELA 29: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com os critérios morfológicos detectados nos embriões em dia 3 do desenvolvimento.............................72 TABELA 30: Descrição das características correspondentes aos padrões de morfologia embrionária do dia 3 do desenvolvimento, de acordo com a taxa de implantação dos embriões transferidos em estágio de blastocisto............................................................................................73 TABELA 31: Critérios selecionados pelo modelo de regressão logística binária múltipla como preditores do potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto após transferência embrionária.....................................................................................................................................74 SUMÁRIO 1) INTRODUÇÃO .................................................................................................... 1 1.1) REPRODUÇÃO HUMANA ASSISTIDA (RHA) ........................................................... 1 1.2) MORFOLOGIA OOCITÁRIA......................................................................................... 3 1.2.1) Dismorfismos intracitoplasmáticos ............................................................................ 5 1.2.1.1) Granulação ............................................................................................................ 5 1.2.1.2) Inclusões ................................................................................................................. 5 1.2.2) Dismorfismos extracitoplasmáticos ........................................................................... 6 1.2.2.1) Zona pelúcida ......................................................................................................... 6 1.2.2.2) Espaço perivitelineo ............................................................................................... 6 1.2.2.3) Corpúsculo polar ................................................................................................... 7 1.2.2.4) Forma ..................................................................................................................... 7 1.3) MORFOLOGIA EMBRIONÁRIA .................................................................................. 8 1.3.1) Morfologia pronuclear .............................................................................................. 10 1.3.1.1) Pronúcleo ............................................................................................................. 10 1.3.1.2) Corpos Precursores de Nucléolos (CPN) ............................................................ 11 1.3.1.3) Halo Citoplasmático ............................................................................................ 12 1.3.2) Classificação embrionária nos dias 2 e 3 do desenvolvimento .............................. 12 1.3.2.1) Número de células e ritmo de clivagem ............................................................... 13 1.3.2.2) Simetria de blastômeros ....................................................................................... 13 1.3.2.3) Fragmentação citoplasmática .............................................................................. 14 1.3.2.4) Multinucleação ..................................................................................................... 16 1.3.3) Classificação embrionária nos dias 5 e 6 do desenvolvimento .............................. 17 1.4) JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA DO ESTUDO..................................................... 19 2) OBJETIVO GERAL .......................................................................................... 21 2.1) OBJETIVOS ESPECÍFICOS ......................................................................................... 21 3) CASUÍSTICA E MÉTODO .............................................................................. 22 3.1) REVISÃO DE LITERATURA ....................................................................................... 22 3.2) REVISÃO DOS PRONTUÁRIOS LABORATORIAIS ............................................... 26 3.3) TREINAMENTO DA EQUIPE E ELABORAÇÃO DE ESQUEMAS DIDÁTICOS 30 3.4) PACIENTES ..................................................................................................................... 22 3.5) ESTÍMULO OVARIANO CONTROLADO (EOC)..................................................... 23 3.6) RECUPERAÇÃO OOCITÁRIA .................................................................................... 23 3.7) OBTENÇÃO DE ESPERMATOZOIDES, ANÁLISE E PROCESSAMENTO SEMINAL ................................................................................................................................ 24 3.8) INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI) ............. 25 3.9) AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA E SELEÇÃO EMBRIONÁRIA ............................ 32 3.10) COLETA DE DADOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS ........................................ 33 3.11) CATEGORIZAÇÃO DAS VARIÁVEIS DE ESTUDO ............................................. 34 3.12) SEGUIMENTO CLÍNICO............................................................................................ 36 3.13) CONCEITOS E VARIÁVEIS ....................................................................................... 36 3.14) ANÁLISE E ESTATÍSTICA DOS DADOS ................................................................ 38 4) RESULTADOS .................................................................................................. 40 4.1) Dados descritivos – Perfil da população estudada .................................................... 40 4.2) Objetivo 1 – Valor preditivo de critérios morfológicos oocitários e embrionários avaliados nos dias 1, 2 e 3 do desenvolvimento na obtenção de embriões em estágio de blastocisto. ............................................................................................................................ 44 4.2.1) Dados descritivos .................................................................................................... 44 4.2.2) Morfologia oocitária ............................................................................................... 47 4.2.3) Morfologia pronuclear ............................................................................................ 50 4.2.4) Morfologia do dia 2 do desenvolvimento embrionário ........................................... 52 4.2.5) Morfologia do dia 3 do desenvolvimento embrionário ........................................... 56 4.2.6) Obtenção de um modelo de regressão logística binária ......................................... 60 4.3) Objetivo 2 – Valor preditivo de critérios morfológicos oocitários e embrionários avaliados nos dias 1, 2 e 3 do desenvolvimento no potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto. .................................................................................................... 64 4.3.1) Dados descritivos .................................................................................................... 64 4.3.2) Morfologia oocitária ............................................................................................... 67 4.3.3) Morfologia pronuclear ............................................................................................ 68 4.3.4) Morfologia do dia 2 do desenvolvimento embrionário ........................................... 70 4.3.5) Morfologia do dia 3 do desenvolvimento embrionário ........................................... 72 4.3.6) Obtenção de um modelo de regressão logística binária ......................................... 75 5) DISCUSSÃO ....................................................................................................... 77 Dados descritivos .............................................................................................................. 77 Idade .................................................................................................................................. 77 Estímulo ovariano controlado ........................................................................................... 79 Amostra seminal ................................................................................................................ 81 Morfologia oocitária ......................................................................................................... 82 Morfologia do dia 1 do desenvolvimento .......................................................................... 85 Morfologia dos dias 2 e 3 do desenvolvimento ................................................................. 89 Modelos preditivos ............................................................................................................ 97 6) CONCLUSÕES ................................................................................................ 100 7) ANEXO ............................................................................................................. 103 8) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 131 FONTES CONSULTADAS................................................................................. 145 RESUMO .............................................................................................................. 146 ABSTRACT .......................................................................................................... 147 LISTAS E APÊNDICE ........................................................................................ 148 1) INTRODUÇÃO 1.1) REPRODUÇÃO HUMANA ASSISTIDA (RHA) A infertilidade conjugal é definida como a incapacidade de conceber após um ano de relações sexuais regulares sem o uso de métodos contraceptivos (Schmidt 2006). Evidências epidemiológicas sugerem que a infertilidade acomete por volta de 15% dos casais em idade reprodutiva (Templeton 1995). Segundo o mais recente registro do Centro de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) dos EUA, a partir de dados compilados pela Pesquisa Nacional de Crescimento Familiar (NSFG), dentre aproximadamente 62 milhões de mulheres com idade entre 15 e 44 anos em 2010, cerca de 7,4 milhões, ou 12%, receberam tratamento para infertilidade em algum momento de suas vidas. Dentre as mulheres casadas de mesma faixa etária estima-se que 1,5 milhões sejam inférteis (CDC 2006-2010). Em registro publicado em 2014, referente às taxas de sucesso obtidas por centros de fertilização assistida em 2012, o CDC divulgou a realização de 176.247 procedimentos de RHA por 456 clínicas, que seriam representativas de 98% dos tratamentos realizados no país (CDC 2012). Segundo o último registro da Sociedade Européia de Reprodução Humana e Embriologia (ESHRE), 550.296 procedimentos de RHA foram relatados por 991 clínicas de 31 países em 2010. Estima-se que tenham sido realizados 1221 ciclos por milhão de habitantes (Kupka et al. 2014). Considerando-se o contexto no qual o Brasil encontrase inserido, segundo o último Registro Latinoamericano (RLA), órgão da Rede Latinoamericana de Reprodução Assistida (REDLARA), foram reportados 47.326 procedimentos de RHA realizados em 2012 por 155 centros de 14 países. Os dados relatados representam um aumento de 12,9% no número de ciclos realizados quando comparado ao ano de 2011 (Zegers-Hochschild et al. 2015). Dentre as técnicas de RHA utilizadas para o tratamento de infertilidade, destacam-se a Fertilização in vitro (FIV) clássica e a Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóides (ICSI). A ICSI foi introduzida em 1992 (Palermo et al. 1992), sendo utilizada exclusivamente em casos de fator masculino de infertilidade, incluindo alterações de concentração, motilidade e morfologia espermática. De fato, por meio da utilização desta técnica é possível obter taxas satisfatórias de fertilização e gestação em casos que envolvem recuperação cirúrgica de espermatozoides (Semião-Francisco et al. 2010). Relatos atuais indicam que atualmente a técnica representa 72,6% dos procedimentos realizados nos EUA, sendo de 36,4% o número obtido para o ano de 2 1996 (CDC, ART, 2012). O aumento do uso da técnica está associado a sua aplicação para o tratamento de casais inférteis na ausência de fator masculino (Boulet et al. 2015). Segundo registro da RLA, a ICSI representou 85% dos procedimentos de RHA realizados na América Latina, proporção que permanece sem alteração desde 2008 (Zegers-Hochschild et al. 2015). O sucesso da técnica de ICSI pode ser associado, dentre outros fatores, à quantidade e à qualidade de gametas e embriões obtidos (Varghese, Goldberg, and Agarwal 2007). Para que um número adequado de oócitos seja recuperado, as pacientes são submetidas a protocolos de estímulo ovariano controlado (EOC). Tendo como objetivo o bloqueio hipofisário, na grande maioria dos casos as pacientes são tratadas com agonistas ou antagonistas do hormônio liberador das gonadotrofinas (GnRH). O estímulo ovariano envolve a administração de gonadotrofinas, o hormônio folículo estimulante (FSH) recombinante na maioria dos casos, as quais induzem o desenvolvimento folicular sendo a maturação final dos múltiplos folículos induzida pela administração da gonadotrofina coriônica humana (hCG) (Lopes, Iaconelli Jr, and Iaconelli 2011). Ao final do EOC, os folículos ovarianos são aspirados por punção guiada por ultrassom e os oócitos recuperados a partir do fluido folicular. Após serem submetidos às técnicas de RHA os oócitos fertilizados são incubados na maioria das vezes por 3 a 5 dias até que os embriões em desenvolvimento sejam transferidos para o útero materno (Setti, Braga, and Figueira 2011, Braga, Figueira, and Setti 2011, Maldonado and Iaconelli Jr 2011). No início da aplicação das técnicas de RHA, baixas taxas de sucesso foram obtidas por embrião transferido. Naquele momento, o aumento do número de embriões transferidos foi uma estratégia aplicada com o objetivo de se obter um aumento significativo no valor destas taxas (Edwards and Steptoe 1983). Ao longo dos anos, maiores taxas de implantação embrionária foram obtidas, porém, acompanhadas de taxas elevadas de gestação múltipla relatadas até os dias de hoje (Kupka et al. 2014, Zegers-Hochschild et al. 2015, CDC 2012). Com o objetivo de diminuição dos índices de multiparidade algumas políticas de redução do número de embriões a serem transferidos foram sugeridas (CFM 2010). Desta forma, a seleção do embrião com maior probabilidade de implantação tornou-se um dos principais objetivos da RHA e foco de numerosos estudos que serão abordados posteriormente de acordo com o dia de desenvolvimento embrionário. 3 1.2) MORFOLOGIA OOCITÁRIA Na rotina da maioria dos laboratórios de FIV a avaliação morfológica oocitária inicia-se com classificação do grau de expansão das células do complexo cumulus-corona em estereomicroscópio. Em oócitos maduros, o complexo apresenta-se expandido formando uma camada gelatinosa ao redor do oócito, resultado da secreção de ácido hialurônico compondo uma matriz que se interpõe às células, separando-as e conferindo a aparência descrita. Considerandose a remoção destas células em oócitos que serão submetidos à ICSI, a avaliação mais acurada em microscópio invertido fornece informações a respeito do grau de maturação nuclear, sendo o 1 o corpúsculo polar (CP) marcador de maturidade em oócitos MII (Rienzi et al. 2012). Posteriormente, todos os oócitos MII são submetidos à ICSI sendo o potencial de desenvolvimento embrionário estimado exclusivamente com base na morfologia embrionária, independente da qualidade do oócito a partir do qual este foi derivado. No entanto, a qualidade oocitária pode ser considerada um fator limitante da fertilidade feminina, refletindo o potencial de desenvolvimento intrínseco de um oócito, além de apresentar um papel crucial não apenas na fertilização, mas também no desenvolvimento subsequente (Gilchrist, Lane, and Thompson 2008, Figueira et al. 2010). Uma complexa cascata de eventos de maturação que ocorrem durante o desenvolvimento folicular confere ao oócito a capacidade de fertilização e o subsequente desenvolvimento embrionário (Gougeon 1996, Gandolfi and Gandolfi 2001). A maturação oocitária envolve não apenas alterações relacionadas a eventos nucleares, mas também alterações citoplasmáticas que ocorrem de maneira coordenada, sendo que a maturidade nuclear não pode ser considerada sinônimo de competência oocitária por não refletir a maturidade citoplasmática (Ebner, Moser, and Tews 2006). A maturação citoplasmática envolve inúmeros processos moleculares e estruturais responsáveis pela preparação do oócito para os eventos ligados à fertilização. As mudanças estruturais do citoplasma são caracterizadas por uma extensa reorganização de organelas intracelulares, destacando a reorganização de mitocôndrias visando o fornecimento de um suprimento local de energia, a migração de grânulos corticais para a periferia do oolema para bloqueio da polispermia e a movimentação do retículo endoplasmático (RE) antecipando a liberação de Ca2+ que ocorre durante a fertilização (Eppig 1996, Krisher 2004). Desta forma, deficiências no processo de maturação citoplasmática podem comprometer todos os processos que preparam o oócito para ativação, adequada fertilização e desenvolvimento embrionário. Além 4 das deficiências do processo, a assincronia nos eventos de maturação nuclear e citoplasmática foi associada à ocorrência de dismorfismos oocitários (Van Blerkom and Henry 1992). Oócitos considerados morfologicamente normais devem apresentar: forma esférica; citoplasma transparente moderadamente granular e livre de inclusões; pequeno espaço perivitelineo (EPV), livre de granulações, contendo um único CP redondo e intacto e uma zona pelúcida (ZP) clara e de espessura apropriada (Swain and Pool 2008). Usualmente, os dismorfismos oocitários podem ser divididos em intra (IC) e extracitoplasmáticos (EC). Os dismorfismos IC envolvem a presença de granulações e/ou inclusões citoplasmáticas como corpos refráteis, vacúolos (VAC) e/ou agregados do retículo endoplasmático liso (REL). Os dismorfismos EC envolvem anormalidades na forma do oócito, anormalidades no EPV como a presença de grânulos corticais, anormalidades na ZP incluindo espessura e coloração e/ou anormalidades no CP como alteração do seu tamanho (Veeck 1988). Apesar de identificadas as alterações que podem comprometer a competência oocitária, pouco se sabe em relação às suas origens, a quando e como estas alterações podem afetar processos do desenvolvimento normal e ao fato da possibilidade de seus efeitos envolverem a alteração da expressão de vias de sinalização regulatórias (Embryology 2011). As variações morfológicas oocitárias podem ser resultado de fatores intrínsecos como a idade da paciente, e/ou de fatores extrínsecos associados, por exemplo, aos protocolos de EOC e a resposta da paciente ao tratamento (Figueira et al. 2010). A maioria dos oócitos recuperados após EOC apresentam uma ou mais variações dos critérios morfológicos (Balaban and Urman 2006, Ebner, Moser, and Tews 2006, Rienzi et al. 2008), sendo o mesmo observado para pacientes férteis doadoras de oócitos (Ten et al. 2007). Relatos do consenso de Istambul de avaliação embrionária (Embryology 2011) sugerem que dismorfismos EC são variações fenotípicas na maioria das vezes relacionadas às condições de cultivo ou à idade da paciente. Por outro lado, a presença de agregados de REL foi associada ao comprometimento da competência oocitária e relacionada a perdas fetais e distúrbios de imprinting (Otsuki et al. 2004, Ebner, Moser, et al. 2008). De modo geral, a presença dos dismorfismos IC e EC e sua associação com a competência oocitária e com o comprometimento do desenvolvimento embrionário é controversa, conforme apontado em estudos recentes de revisão sistemática e metanálise (Rienzi, Vajta, and Ubaldi 2011, Setti et al. 2011). 5 1.2.1) Dismorfismos intracitoplasmáticos 1.2.1.1) Granulação O aumento da granulação do citoplasma pode ocorrer de forma homogênea, afetando todo o citoplasma do gameta, ou de localização centralizada, sendo esta última associada a um pior prognóstico (Kahraman et al. 2000, Meriano et al. 2004). Além da granulação, alterações na viscosidade e fluidez do citoplasma também foram descritas (Ebner et al. 2001). A fluidez do citoplasma pode ser avaliada de acordo com a persistência do cone de injeção formado no citoplasma do oócito decorrente entrada da micropipeta de ICSI no momento da injeção, reflexo da deficiência na textura do citoplasmática. 1.2.1.2) Inclusões Numerosos tipos de inclusões citoplasmáticas podem ser observados no citoplasma de oócitos avaliados em microscopia de luz. Os corpos refráteis, assim chamados devido sua aparência quando identificados em microscopia de luz, são estruturas de aproximadamente 10μm de diâmetro, compostas de material lipídico e grânulos densos. Os vacúolos (VAC) são inclusões citoplasmáticas rodeadas por membrana, podendo variar em número e tamanho. Acredita-se que estes possam surgir espontaneamente ou por fusão de vesículas derivadas do REL e/ou do complexo de Golgi (Van Blerkom 1990, El Shafie et al. 2000). Por outro lado, os mecanismos associados com o surgimento dos agregados de REL são desconhecidos. A distinção entre estas estruturas é dada pelo fato de que os agregados de REL são estruturas translúcidas não delimitadas por membrana (Otsuki et al. 2004, Ebner, Moser, and Tews 2006, Rienzi et al. 2012). Estudos sugerem que a presença de algumas inclusões citoplasmáticas, como os corpos refráteis, não exerce impacto na qualidade do oócito. Por outro lado, a presença de VAC e agregados do REL foram associados ao comprometimento da competência de oócitos humanos (Balaban et al. 1998, Ebner et al. 2001, Ebner, Moser, and Tews 2006). Ainda não foi elucidado de que modo as inclusões citoplasmáticas ou deficiências na fluidez do citoplasma afetariam a viabilidade oocitária. Estudos sugerem que os efeitos estariam relacionados à função do citoesqueleto e a estrutura do fuso meiótico (Van Blerkom 1990, Collas 6 and Poccia 1998, Ebner et al. 2001). Desta forma, defeitos no citoplasma oocitário afetariam a formação e o posicionamento dos PN, dado que o citoesqueleto poderia não se organizar perfeitamente, comprometendo o posicionamento correto do fuso meiótico durante a retomada da meiose. Além disso, a cascata de eventos da fertilização envolve a liberação de cálcio e grânulos corticais, síntese de proteína e alterações do citoesqueleto (Dozortsev et al. 1995). Assim, considerando a importância dos fatores presentes no ooplasma neste processo, fica clara a possibilidade de comprometimento da fertilização por anormalidades oocitárias citoplasmáticas. Por outro lado, relatos sugerem que as perdas fetais e as desordens de imprinting associadas à presença dos agregados de REL estão associadas aos altos níveis de cálcio observados durante a ativação oocitária, além do fato de os níveis serem mantidos elevados por maior período de tempo (Otsuki et al. 2004, Akarsu et al. 2009). 1.2.2) Dismorfismos extracitoplasmáticos 1.2.2.1) Zona pelúcida (ZP) A ZP é uma matriz multi-laminar composta por glicoproteínas, polissacarídeos e proteínas específicas, com aproxidamente 15-20 µm de espessura, que envolve o oócito e o embrião no início do desenvolvimento (Pelletier, Keefe, and Trimarchi 2004). A estrutura da zona pelúcida é formada durante a maturação folicular pelo oócito (Nikas et al. 1994) e, em parte, pelas células da granulosa (Gook et al. 2004). A formação e organização das proteínas específicas da ZP durante a maturação oocitária pode refletir a competência oocitária (Shen et al. 2005, Madaschi et al. 2009, Montag et al. 2011). Segundo consenso, não há benefício na determinação da espessura da zona pelúcida em microscopia de luz. Porém, considerando-se a possibilidade de efeitos pacienteespecífico sugere-se o registro de alterações na espessura ou coloração dessa estrutura (Embryology 2011). 1.2.2.2) Espaço perivitelineo (EPV) O EPV é uma estrutura fluida que se encontra entre a membrana plasmática do oócito, chamada oolema, e a ZP. O EPV pode variar em tamanho e conteúdo, sendo o tamanho do EPV 7 associado à fase de maturação oocitária. Nos oócitos maduros o EPV apresenta seu maior grau de expansão quando comparado aos oócitos imaturos (Mikkelsen and Lindenberg 2001). Duas hipóteses foram propostas para explicar a presença de grânulos no EPV. A primeira hipótese é derivada de dados de microscopia eletrônica indicando a presença de uma matriz extracelular formada por grânulos e filamentos no espaço entre o oolema e a ZP (Dandekar and Talbot 1992). A segunda baseia-se na existência de processos das células da corona que atravessam a ZP do oócito em PI. Acredita-se que após a remoção desses processos, alguns resquícios permaneçam no EPV (Sathananthan 1997). A presença de grânulos parece estar também associada à dose de gonadotrofina administrada durante o EOC (Hassan-Ali et al. 1998, Farhi et al. 2002). 1.2.2.3) Corpúsculo polar (CP) O 1o CP é uma célula filha, contendo 23 cromossomos e 46 cromátides, gerada após a telófase da primeira divisão meiótica. Alguns critérios morfológicos do 1o CP, como a forma, o tamanho e a integridade podem ser utilizados na predição da qualidade do oócito (Ebner, Moser, and Tews 2006). Considerando-se a dependência do fator tempo, postula-se que a morfologia do 1o CP possa fornecer informações a respeito da idade pós-ovulatória do oócito. Apesar de alguns CP permanecerem intactos por mais de 20h após a ovulação, em geral após este intervalo estas estruturas apresentam sinais de fragmentação e degeneração (Ortiz, Lucero, and Croxatto 1983). O aumento de tamanho do 1o CP pode ser considerado o mais importante dismorfismos associados ao CP, estando relacionado ao aumento da incidência de aneuploidiais no oócitos (Veeck 1988, Fancsovits et al. 2006). 1.2.2.4) Forma Alterações na forma dos oócitos são acompanhadas de irregularidades na forma e composição da ZP. Dois possíveis mecanismos foram sugeridos para a ocorrência de oócitos com alteração de forma: o estresse mecânico durante o processo da punção folicular e/ou denudação (Shen et al. 2005), deformando tanto o citoplasma quanto a ZP do oócito (com possível recuperação de forma em 24h) e uma anomalia pré-existente gerada durante a maturação 8 intrafolicular (Ebner, Shebl, et al. 2008). A diminuição dos pontos de contato célula-célula em embriões alongados, requisito essencial para o desenvolvimento embrionário e formação da blastocele, justificaria o impacto negativo deste dismorfismo na competência oocitária (Suzuki et al. 1995, Ebner, Moser, and Tews 2004). 1.3) MORFOLOGIA EMBRIONÁRIA Apesar dos avanços tecnológicos significativos da medicina reprodutiva baseados no advento da era do “OMICS” (conjunto de ferramentas de análise genômica, transcriptômica e proteômica) e do estudo da cinética embrionária por meio da tecnologia de time-lapse, a maioria dos laboratórios de Fertilização in vitro de todo o mundo selecionam para transferência embriões humanos cultivados in vitro baseados em parâmetros morfológicos avaliados pontualmente em microscopia de luz. Registros de imagem em time-lapse foram rapidamente integrados a laboratórios de FIV nos últimos cinco anos (Herrero and Meseguer 2013). Os sistemas de monitoramento time-lapse registram imagens digitais dos embriões em cultivo em intervalos de tempo pré-determinados. Os sistemas podem ser instalados em incubadoras convencionais de cultivo embrionário ou podem ser adquiridos sistemas combinados de incubadoras time-lapse. As imagens obtidas são compiladas por sistemas computacionais especializados que fornecem uma sequência em timelapse de todo o desenvolvimento embrionário, desta forma excluindo a necessidade de retirada do embrião da incubadora pelo embriologista para avaliação de sua morfologia. A aquisição desta tecnologia envolve investimento significativo sendo três as principais tecnologias disponibilizadas no mercado: Embryoscope® (Fertilitech), Primo Vision (Vitrolife) e Eeva (Auxogyn, Inc.) (Kovacs 2014). As vantagens propostas como, por exemplo, a possibilidade de cultivo ininterrupto, a otimização da documentação dos procedimentos, o controle de qualidade e, especialmente, a introdução de novos marcadores de qualidade embrionária, tem estimulado o interesse pela tecnologia (Wong et al. 2013). Um grande número de publicações tem sugerido que o intervalo de tempo no desenvolvimento difere entre embriões viáveis e não viáveis (Herrero and Meseguer 2013), porém poucos relatos disponibilizam modelos aplicáveis de seleção embrionária (Conaghan et al. 2013, Meseguer et al. 2011). Além disso, estudos multicêntricos têm demonstrado as limitações destes modelos quando aplicados por diferentes 9 clínicas (Kirkegaard et al. 2014). Desta forma, evidências a respeito do aumento significativo das taxas de nascidos vivos e da efetividade de custo da implementação desta tecnologia em laboratórios de FIV tem sido questionada (Armstrong et al. 2015, Kirkegaard et al. 2015). A metabolômica e a proteômica são, dentre as tecnologias “OMICS”, as plataformas mais promissoras dado seu caráter não invasivo de avaliação da qualidade embrionária. Na metabolômica é possível mensurar o consumo e a produção de múltiplos substratos pelo embrião analisando o meio de cultivo ao qual o embrião foi exposto durante o cultivo in vitro (Tachibana 2014). O proteoma representa todas as proteínas responsáveis pelas funções celulares, traduzidas a partir do transcriptoma das células, sendo diretamente influenciado pelo estado fisiológico da célula em determinado momento (Dominguez, Lopes, and Torres 2007). A busca por marcadores de viabilidade embrionária tem como foco o secretoma proteômico, definido pelas proteínas produzidas pelo embrião e secretadas para o meio de cultivo (Katz-Jaffe et al. 2009). Desta forma, a caracterização do metaboloma e do proteoma embrionário permite um maior entendimento dos estágios iniciais da embriogênese, além da possibilidade de refletir a competência embrionária resultando em aumento das taxas de sucesso de tratamentos de RHA (Cortezzi et al. 2011, Cortezzi et al. 2013). No entanto, apesar dos resultados no campo da pesquisa, a aplicação clínica e a disponibilização de técnicas rotineiramente aplicáveis ainda estão sob investigação e requerem validação (Krisher, Schoolcraft, and Katz-Jaffe 2015). Diversos aspectos morfológicos avaliados em microscopia de luz têm sido apontados como preditivos do potencial de implantação embrionária incluindo aqueles relacionados às etapas iniciais do desenvolvimento como, por exemplo, a morfologia pronuclear e as primeiras clivagens embrionárias. De modo geral, independente do dia da transferência, tais critérios parecem apresentar valor preditivo de viabilidade embrionária quando avaliados individualmente ou coletivamente (Embryology 2011). Aspectos morfológicos avaliados no dia da transferência embrionária têm sido priorizados, seja esta realizada em dia 3 ou 5 do desenvolvimento in vitro (Racowsky et al. 2009, Racowsky et al. 2011, Van Royen et al. 2001, Vernon et al. 2009). A seleção embrionária em dia 3 envolve basicamente a avaliação do número de células e ritmo de clivagem, a avaliação quantitativa e qualitativa da fragmentação citoplasmática quando presente, a avaliação da simetria entre os blastômeros resultantes das primeiras clivagens e a avaliação da incidência de blastômeros multinucleados e anucleados. Por outro lado, os principais parâmetros avaliados na seleção de embriões em estágio de blastocisto (dia 5 ou 6 do desenvolvimento) 10 incluem grau de expansão da blastocele e padrão de organização da massa celular interna (MCI) e do trofoectoderma (TRF) (Embryology 2011). 1.3.1) Morfologia pronuclear A morfologia pronuclear está diretamente relacionada à qualidade dos gametas, sendo a etapa inicial na qual a normalidade destes pode ser avaliada fornecendo informações complementares para a seleção embrionária nos estágios iniciais da clivagem. Um número significativo de modelos tem sido proposto para classificação de embriões em estágio de pronúcleo. Principalmente devido sua clareza e objetividade, os critérios de classificação pronuclear descritos previamente por Tesarik & Greco (1999) e Scott et al. (2000) são os mais utilizados até os dias de hoje. Os parâmetros morfológicos avaliados neste momento estão relacionados às inúmeras transformações observadas durante a nucleogênese em humanos. A avaliação da fertilização costuma ser direta, sendo um oócito considerado fertilizado aquele que apresenta dois pronúcleos (PN) e dois corpúsculos polares (CP). No entanto, esta definição de fertilização é um registro pontual de uma continuidade de eventos previamente ilustrados por meio de time-lapse (Payne et al. 1997). Além disso, a definição de fertilização associada à presença de dois corpúsculos polares é questionável dados que estes podem fragmentar e desintegrar antes do intervalo de avaliação da fertilização (Embryology 2011). 1.3.1.1) Pronúcleo O padrão normal para os PN feminino e masculino durante a avaliação do zigoto inclui semelhança de tamanho, justaposição e posicionamento central em relação ao citoplasma (Payne et al. 1997). O tamanho dos PN pode diferir, sendo o masculino o de maior diâmetro. Porém, diferenças de 4 μm estão associadas ao comprometimento do desenvolvimento embrionário e a maior incidência de aneuploidias (Munné & Cohen 1998, Sadowy et al. 1998, Gámiz et al. 2003). A posição periférica dos PN ou a não justaposição pode indicar falha nos mecanismos do processo de fertilização como, por exemplo, a formação do áster e dos microtúbulos (Simerly et al. 1995, Gianaroli et al. 2003, Barroso et al. 2009). 11 1.3.1.2) Corpos Precursores de Nucléolos (CPN) Presentes nos núcleos de todas as células em atividade mitótica, os nucléolos são sítios nos quais os genes ribossomais são transcritos sendo, portanto, essenciais para síntese protéica. O desenvolvimento dos nucléolos ocorre em áreas denominadas regiões organizadoras de nucléolos (RON), localizadas em pontos específicos dos cromossomos nos quais estão localizados os genes que codificam para os RNA ribossomais (rRNA). Os nucléolos são caracterizados por um componente fibrilar denso, um centro fibrilar e um componente granular (Goessens 1984). Oócitos de folículos antrais possuem nucléolos em atividade de síntese de rRNA e proteínas para o crescimento oocitário. Durante a maturação oocitária, a síntese é interrompida e o nucléolo desaparece. Desta forma, oócitos em Metafáse II (MII) e no estágio pronuclear estão caraterizados apenas pela porção do centro fibrilar, sendo denominados corpos precursores de nucléolos (CPN) (Tesarik & Kopecny 1989). A nucleogênese inclui o crescimento, organização e fusão dos corpos precursores de nucléolos (CPN), eventos dependentes da atividade transcricional pronuclear e da presença de fatores do ooplasma relacionados à maturação oocitária. De modo geral, a fase inicial do desenvolvimento pronuclear é caracterizada por um número elevado de corpos precursores de nucléolos (CPN) de tamanho relativamente pequeno, distribuídos randomicamente em cada um dos PN. Por outro lado, a fase mais tardia do desenvolvimento pronuclear é caracterizada por um pequeno número de CPN de tamanho relativamente maior com distribuição polarizada sendo observado acúmulo próximo ao local onde o PN faz contato com o outro. Tais considerações apontam o desenvolvimento dos CPN um marcador potencial numa avaliação morfológica não invasiva da qualidade do zigoto (Payne et al. 1997, Tesarik & Kopecny 1989, 1990). Alterações do padrão dos CPN de embriões em estágio de PN resultam em efeitos significativos no desenvolvimento embrionário dado que a falta de polarização, fusão e o restabelecimento de um nucléolo funcional apresenta um efeito negativo na habilidade de crescimento e função celular (Sadowy et al. 1998, Scott et al. 2000, Scott 2003, Zollner et al. 2002). 12 1.3.1.3) Halo Citoplasmático Após a fertilização é possível observar um padrão diferencial de distribuição do citoplasma no zigoto. A reorganização do citoplasma é dependente de processos da fertilização que resultam em oscilações de cálcio caracterizadas por ondas coordenadas temporalmente e espacialmente no citoplasma do oócito. A densa área observada próxima aos PN está associada com a rotação e movimento do citoplasma bem como com a distribuição diferencial de organelas e mitocôndrias, resultando na formação de um halo menos denso na periferia (Payne et al. 1997, Bavister & Squirrell 2000). A distribuição diferencial das mitocôndrias por sua vez está relacionada à concentração diferencial de cálcio no citoplasma afetando a produção de ATP e a necessidade diferencial de energia pelo zigoto (Motta, Nottola, & Makabe 1997). Anormalidades no processo de fertilização podem resultar na não formação do halo citoplasmático com consequências para o desenvolvimento embrionário (Scott & Smith 1998, Scott 2003). A localização das mitocôndrias em uma região diferente da periferia pronuclear pode implicar na distribuição desigual destas para as células-filha de embriões em estágio de clivagem, resultando em depleção da produção de ATP em alguns blastômeros. A ausência de rotação do PN paterno, diretamente relacionada com a formação do halo citoplasmático, implica no alinhamento anormal da cromatina e/ou no posicionamento inadequado dos centrossomos, resultando em desenvolvimento embrionário anormal. Além disso, a ausência de rotação e o resultado da não polarização do citoplasma podem implicar em distribuição incorreta de produtos gênicos ao longo das sucessivas clivagens (Van Blerkom, Davis, & Alexander 2000). 1.3.2) Classificação embrionária nos dias 2 e 3 do desenvolvimento Os critérios mais utilizados na seleção de embriões a serem transferidos estão baseados na morfologia embrionária nos dias 2 e 3 do desenvolvimento. De modo geral, a avaliação inclui número de células e ritmo de clivagem, simetria de blastômeros, fragmentação citoplasmática, multinucleação e ausência de núcleo nos blastômeros. 13 1.3.2.1) Número de células e ritmo de clivagem A ocorrência de divisão celular pode ser considerada o mais importante indicador de viabilidade embrionária. Espera-se observar embriões com 4 células em dia 2 (44h+1) e com 8 células em dia 3 (68h+1), considerando-se o intervalo de tempo após a ICSI sugerido para avaliação dos embriões (Embryology 2011). Além da importância do número de células, relatos prévios demonstraram a existência de ritmos de clivagem ideais. Diversos estudos concluíram que tanto o ritmo lento quanto o acelerado de clivagem resultam em comprometimento significativo do desenvolvimento (Giorgetti et al. 1995, Ziebe et al. 1997, Van Royen et al. 1999). Nestes estudos, quando considerado como ritmo de clivagem ideal a ocorrência de embriões com 8 células no dia 3 provenientes de embriões com 4 células no dia 2, a transferência resultou em taxas de implantação significativamente maiores. Segundo o consenso, embriões com ritmo de clivagem lento ou rápido apresentam reduzido potencial de implantação (Embryology 2011). A correlação entre o ritmo de clivagem e a constituição cromossômica do embrião foi previamente investigada (Almeida & Bolton 1996, Magli et al. 2007). O ritmo lento bem como acelerado de clivagem tem sido relacionado ao aumento da incidência de anormalidades cromossômicas, incluindo aneuploidias, mosaicismo e poliploidias. 1.3.2.2) Simetria de blastômeros Devemos destacar que para embriões em estágio de 2, 4 e 8 células a simetria de blastômeros é representada pela observação de blastômeros de tamanho idêntico. Por outro lado, para embriões em estágio de 3, 5, 6 e 7 células espera-se observar diferentes tamanhos celulares como indicativo de clivagem normal. Por exemplo, um embrião de 7 células de clivagem normal deve apresentar 1 célula de maior tamanho e 6 menores, sendo que apenas após a divisão da célula de maior tamanho devem ser observados 8 blastômeros de tamanho semelhante. Neste caso, a diferença de tamanho entre os blastômeros é apenas indicativa de assincronia no processo de clivagem das células (a célula maior de um embrião de 7 células encontra-se em ritmo de clivagem mais lento que as demais) (Puissant et al. 1987). 14 Apesar de subestimada, a ocorrência de irregularidades na clivagem celular é considerada indicador clássico de qualidade embrionária e capacidade de desenvolvimento, afetando negativamente o potencial de implantação embrionário (Ziebe et al. 1997, Hardarson et al. 2001). Além da possível distribuição desigual de proteínas, mRNA, mitocôndrias e outras organelas celulares entre as duas células-filha a clivagem desigual pode também estar relacionada à distribuição desigual de material genético (Antczak & Van Blerkom 1999). Um aumento significativo na incidência de anomalias cromossômicas foi observado em embriões que apresentaram blastômeros assimétricos quando comparado a embriões de blastômeros simétricos ou semelhantes (Hardarson et al. 2001). 1.3.2.3) Fragmentação citoplasmática A fragmentação pode ser definida como uma estrutura extracelular, anuclear, de conteúdo citoplasmático delimitado por membrana (Alikani et al. 1999). A incidência da fragmentação é difícil de ser avaliada dado que é necessário inicialmente diferenciar os fragmentos das células, e então estimar a proporção relativa do embrião ocupada por estes fragmentos (Embryology 2011). Johansson, Hardarson, & Lundin 2003 definiram os fragmentos como sendo <45 μm em diâmetro para embriões em dia 2, e <40 μm em diâmetro para embriões em dia 3. Apesar das causas exatas da fragmentação não estarem estabelecidas, alguns processos celulares parecem estar envolvidos como apoptose, deficiência de ATP no embrião, perda de blastômero por apoptose devido alteração cromossômica, ou meramente fragmentos anucleados resultantes da clivagem que serão posteriormente reabsorvidos (Hardy 1999, Chavez et al. 2012, Stensen et al. 2015). A classificação quantitativa da porcentagem do volume do embrião que é ocupada por fragmentos citoplasmáticos anucleados pode ser associada a uma classificação qualitativa dos fragmentos em cinco grupos (I a V) de acordo com seu tamanho e distribuição (Tab. 1) (Alikani et al. 1999). 15 TABELA 1: Modelo de classificação da fragmentação embrionária humana segundo Alikani, 1999. Tipo I Volume mínimo, fragmentos associados a um blastômero Tipo II Fragmentos localizados e predominantemente no espaço perivitelínico Tipo III Fragmentos pequenos dispersos entre os blastômeros, no espaço perivitelínico ou em ambos Tipo IV Fragmentos grandes semelhantes a blastômeros, distribuídos randomicamente, associados a blastômeros desiguais Tipo V Fragmentos necróticos, granulosidade e contração citoplasmática característica Considerando embriões com baixa porcentagem de fragmentação, a avaliação do tamanho e organização dos fragmentos passa a ser um parâmetro crítico a ser considerado. No entanto, o padrão de fragmentação não pode ser considerado de fácil avaliação dado a natureza não estática de tais estruturas, além da possibilidade de serem reabsorvidas ou sofrerem lise durante o desenvolvimento embrionário (Embryology 2011). Independente do mecanismo ou da causa, a fragmentação embrionária parece estar diretamente relacionada com o comprometimento da viabilidade embrionária sendo que a fragmentação tipo IV apresenta um efeito negativo mesmo quando compromete um volume restrito do embrião (Alikani et al. 1999). Atualmente, o valor da porcentagem do volume do embrião comprometido pela fragmentação a partir do qual se observa uma importância clínica varia entre os estudos (10-20%) (Alikani et al. 2000, Van Royen et al. 2001). A relação positiva da ocorrência de fragmentação com a incidência de mosaicismo foi previamente observada (Munné & Cohen 1998, Ziebe et al. 2003, Munné 2006, Magli et al. 2007), sugerindo que os fragmentos possam conter pedaços cromossômicos resultados de erros no funcionamento dos fusos. 16 1.3.2.4) Multinucleação Um blastômero contendo mais de um único núcleo em interfase é definido como multinucleado (Embryology 2011). Os relatos da incidência da multinucleação variam consideravelmente. Estudos relatam que a multinucleação incide em cerca de 30% dos embriões produzidos in vitro, sendo que 17% a 87% dos ciclos apresentam pelo menos um embrião multinucleado (Balakier & Cadesky 1997, Jackson et al. 1998, Van Royen et al. 2003, Rienzi et al. 2005). Apesar de a literatura que descreve a multinucleação em embriões ser bastante extensa, a razão da sua ocorrência ainda não foi esclarecida. Os possíveis mecanismos descritos para a ocorrência de multinucleação incluem a cariocinese na ausência da citocinese, a fragmentação parcial do núcleo ou a migração anormal dos cromossomos durante a anáfase da mitose (Pickering et al. 1995, Staessen & Van Steirteghem 1998, Munné & Cohen 1993). Especula-se ainda que a multinucleação possa ser induzida pelo protocolo de estimulação ovariana controlada e por condições adversas de cultivo embrionário. A utilização de altas doses de gonadotrofina implica em rápido crescimento folicular na ausência de vascularização adequada resultando em hipóxia, ou seja, suprimento inadequado de oxigênio para o oócito em processo de maturação (Van Blerkom, Antczak, & Schrader 1997). Além disso, esse tipo de protocolo de estímulo está associado ao recrutamento de uma população heterogênea de folículos aumentando a possibilidade da recuperação de oócitos de competência comprometida (Jackson et al. 1998, Figueira et al. 2010). Estudos em humanos demonstraram que os fusos meióticos e mitóticos são estruturas sensíveis a oscilações de temperatura sendo que os microtúbulos sofrem despolimerização quando em situação de estresse provocada por baixas temperaturas, podendo resultar em embriões cromossomicamente anormais (Pickering et al. 1990). Considerando-se a fragilidade das estruturas essenciais para a correta divisão celular, sugere-se que as causas da multinucleação possam estar associadas a oscilações de temperatura e pH durante o cultivo de gametas e embriões (Pickering et al. 1990, Pickering et al. 1995, Munné & Cohen 1993). O potencial negativo da ocorrência de multinucleação no desenvolvimento embrionário pode ser relacionado a erros na replicação e segregação cromossômica, resultando em redução significativa das taxas de sucesso após transferência de embriões multinucleados (Jackson et al. 1998, Pelinck et al. 1998, Van Royen et al. 2003). Considerando os núcleos de um blastômero multinucleado como entidades separadas, espera-se que a replicação e o condensamento da 17 cromatina ocorram de forma independente, resultando em duas estruturas cromossômicas em um único fuso mitótico e na distribuição cromossômica anormal nas células-filha (Hardarson et al. 2001, Meriano et al. 2004). 1.3.3) Classificação embrionária nos dias 5 e 6 do desenvolvimento A significância da avaliação de embriões no estágio pós-compactação relaciona-se ao fato de ser realizada após ativação do genoma embrionário. Neste estágio, o alto grau de diferenciação celular e a ativação do genoma embrionário podem fornecer informações importantes referentes à viabilidade embrionária (Embryology 2011). As variações morfológicas observadas em cultivos prolongados envolvem estágios de compactação e blastulação, sendo considerado como padrão de normalidade a compactação completa no dia 4 de desenvolvimento e a blastulação, rompimento da zona pelúcida e a eclosão do blastocisto entre os dias 5 e 6. Após 120h (+3) do momento do procedimento de ICSI, o blastocisto deve apresentar uma blastocele definida ocupando pelo menos metade do volume do embrião, uma distinta massa celular interna (MCI) destacando-se como uma saliência na cavidade e um anel formado por células do trofoectoderme (TRF) de tamanho similar distribuídas uniformemente de modo a formar um epitélio coesivo (Gardner DK 1999, Gardner & Schoolcraft 1999). A relação entre a morfologia do blastocisto e o subseqüente potencial de implantação tem sido investigada de acordo com critérios variados. Dois principais sistemas de classificação morfológica de blastocistos considerando expansão da blastocele e características da MCI e do TRF foram desenvolvidos com o objetivo de predizer o potencial de implantação (Gardner & Schoolcraft 1999, Dokras, Sargent, & Barlow 1993). O sistema de classificação de blastocisto descrito por Gardner é o mais utilizado até os dias de hoje (Tab. 2). 18 TABELA 2: Modelo de classificação de blastocistos humanos cultivados in vitro segundo Gardner & Schoolcraft, 1999. CLASSIFICAÇÃO DO BLASTOCISTO CLASSIFICAÇÃO DO BLASTOCISTO Grau de expansão da blastocele Grau 1 Blastocisto Blastocsito jovem, blastocele ocupa menos de 50% do volume do embrião Grau 2 Blastocele ocupa metade ou mais do volume do embrião Grau 3 Blastocisto completo, blastocele ocupa todo o volume do embrião Grau 4 Blastocisto expandido, zona pelúcida de espessura fina Grau 5 Blastocisto com parte do trofoectoderme eclodindo da zona pelúcida Grau 6 Blastocisto com eclosão completa da zona pelúcida CLASSIFICAÇÃO DADA MASSA CELULAR INTERNA (MCI) CLASSIFICAÇÃO MASSA CELULAR INTERNA (para embriões de 3-6)3-6 Para blastocistos degrau GRAU Grau A Muitas células fortemente agrupadas Grau B Algumas células dispersas Grau C Células escassas CLASSIFICAÇÃO DODO TROFOECTODERMA (TRF) CLASSIFICAÇÃO TROFOECTODERME (para embriões de 3-6)3-6 Para blastocistos degrau GRAU Grau A Muitas células formando um epitélio coesivo Grau B Poucas células formando um frouxo epitélio Grau C Células escassas e grandes 19 1.4) JUSTIFICATIVA E RELEVÂNCIA DO ESTUDO A subjetividade da avaliação morfológica, bem como a ampla diversidade de sistemas de classificação embrionária aplicados por diferentes clínicas, implica em resultados contraditórios tornando extremamente difícil a implementação de um consenso do valor preditivo dos diferentes parâmetros morfológicos avaliados (Rienzi et al. 2005, Racowsky et al. 2010, Racowsky et al. 2011). A otimização dos critérios morfológicos a serem avaliados, bem como a determinação do valor preditivo de cada um destes critérios, representa um grande potencial de aumento significativo das taxas de sucesso do tratamento além de possibilitar a redução da incidência de gestações múltiplas por assegurar que as taxas de gestação não estariam comprometidas pela transferência de um menor número de embriões. A importância da necessidade de padronização da avaliação morfológica embrionária é atualmente foco da comunidade internacional. O recente encontro de membros da associação internacional de embriologistas ALPHA e do grupo de embriologia da ESHRE teve como objetivo o estabelecimentos de critérios e terminologias a serem utilizados na classificação de oócitos, zigotos e embriões que pudessem ser facilmente aplicados na rotina (Embryology 2011). No entanto, a implementação dos pontos abordados neste consenso por laboratórios de FIV em todo o mundo ainda é opcional, não sendo abrangida nos relatos de dados anuais da sociedade na qual o laboratório está inserido. Em 2007, dados de morfologia embrionária foram inseridos nos bancos de dados do Sistema de Relato dos Resultados Clínicos da Sociedade Nacional Americana para Tecnologia Reprodutiva Assistida (SART CORS) após estabelecimento de um sistema de avaliação embrionária. Os dados foram coletados por laboratórios de forma voluntária e avaliados de forma retrospectiva para validação do sistema com resultados promissores (Racowsky et al. 2011). Porém, dados de morfologia embrionária ainda não fazem parte dos bancos de dados do SART. No Brasil, centros de fertilização assistida acreditados pela REDLARA relatam anualmente dados de todos os procedimentos realizados, porém nenhum dado de morfologia embrionária é incluído ou abordado pelo RLA. Com relação ao estabelecimento do valor preditivo dos critérios, muitos têm sido correlacionados com o desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto e com o potencial de implantação dos blastocisto obtidos, conforme abordado no tópico Introdução. O cultivo embrionário até o estágio de blastocisto ofereceria algumas destas vantagens quando comparado à transferência de embriões em estágio de clivagem incluindo: (i) maiores taxas de 20 implantação, (ii) oportunidade de melhor seleção de embriões viáveis para transferência, (iii) redução potencial do número de embriões transferidos, (iv) melhor sincronização temporal entre o embrião e o endométrio no momento da transferência embrionária (Alper et al. 2001, Gardner, Lane, & Schoolcraft 2000, Gardner & Balaban 2006, Technology 2013). Porém, o desafio atual seria determinar de forma prospectiva, para cada paciente, se este tipo de estratégia implicaria em uma maior chance de gestação em comparação com a transferência de embriões em estágio de clivagem. Tal desafio torna-se complicado ao considerarmos nossa inabilidade em predizer se (ou quais) embriões em estágio de clivagem irão formar blastocistos viáveis. Na tentativa de estabelecimento dos valores preditivos dos critérios de morfologia embrionária poucos estudos tiveram como foco determinar a interdependência dos parâmetros avaliados ou determinar o peso relativo destes parâmetros em predizer o potencial de desenvolvimento ou implantação (Embryology 2011). Do mesmo modo, modelos preditivos previamente estabelecidos com o objetivo de classificar os embriões de acordo com seu potencial de implantação foram baseados em um número limitado de critérios avaliados e de dados disponíveis, sendo ainda necessários estudos de validação (Giorgetti et al. 1995, Holte et al. 2007, Racowsky et al. 2009, Racowsky et al. 2011, Steer et al. 1992, Van Royen et al. 1999, Ziebe et al. 1997). Desta forma, a determinação de quais critérios morfológicos avaliados no início do desenvolvimento embrionário seriam capazes de predizer qual a probabilidade de embriões em estágio de clivagem formarem blastocistos viáveis e, ainda, a determinação de quais destes critérios seriam capazes de auxiliar na seleção do blastocisto a ser transferido seriam ferramentas importantes a serem aplicadas com o objetivo de definir quais os ciclos se beneficiariam do cultivo prolongado com a obtenção de maiores chances de implantação. 21 2) OBJETIVO GERAL Avaliar o valor preditivo de parâmetros morfológicos oocitários e embrionários na determinação da viabilidade de embriões humanos cultivados in vitro provenientes de casais inférteis submetidos a tratamentos de RHA. 2.1) OBJETIVOS ESPECÍFICOS Determinar o valor preditivo de parâmetros morfológicos oocitários e embrionários, avaliados nos dias 0, 1, 2 e 3 do desenvolvimento, na obtenção de embriões em estágio de blastocisto quando cultivados até o dia 5 do desenvolvimento. Determinar o valor preditivo de parâmetros morfológicos oocitários e embrionários, avaliados nos dias 0, 1, 2 e 3 do desenvolvimento, no potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto após transferência embrionária. 22 3) CASUÍSTICA E MÉTODO 3.1) PACIENTES O estudo transversal incluiu dados de ciclos 1521 pacientes submetidas a procedimentos de RHA no Centro de Fertilização Assistida – Fertility no período de Julho/2011 a Junho/2014. Critérios de inclusão Foram incluídos no estudo ciclos de pacientes que iniciaram o tratamento neste período e que apresentaram os seguintes critérios: Todos os embriões foram mantidos em cultivo até o dia 5 do desenvolvimento; A transferência embrionária foi realizada no ciclo no qual a paciente foi submetida ao EOC; Os embriões foram transferidos em dia 5 do desenvolvimento. Critérios de exclusão Os seguintes critérios foram considerados para a exclusão dos ciclos do estudo: Utilização de oócitos descongelados e/ou aquecidos; Utilização de oócitos doados; Utilização de espermatozoides provenientes de recuperação cirúrgica; Utilização de espermatozoides com ausência de motilidade progressiva; Transferência de embriões descongelados e/ou aquecidos; Transferência de embriões doados; Realização do diagnóstico genético pré-implantacional dos embriões obtidos. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE): Todas as pacientes submetidas a tratamento no Centro de Fertilização Assistida - Fertility assinam, previamente ao início do tratamento proposto, o TCLE concordando com os procedimentos a serem realizados, conforme estabelecido pelas normas éticas para utilização das técnicas de reprodução assistida (CFM 1992, CNS 1996). 23 3.2) ESTÍMULO OVARIANO CONTROLADO (EOC) As pacientes foram submetidas ao bloqueio hipofisário realizado por meio da administração do análogo agonista do Hormônio Liberador de Gonadotrofinas (Gonadotrophin Releasing Hormone agonist – GnRH, Lupron Kit™, Abbott S.A Societé Française des Laboratoires, Paris, França) ou antagonista (Gonadotrophin Releasing Hormone antagonist – Cetrotide©, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha ou Orgalutran®, Merck Sharp & Dohme (MSD) and Schering-Plough, New Jersey, EUA) seguido por EOC, com administração do Hormônio Folículo Estimulante recombinante (Recombinant Follicular Stimulating Hormone – r-FSH, Gonal-F®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha) ou altamente purificado (Highly purified Follicular Stimulating Hormone – HP-u-FSH, Menopur® ou Bravelle®, Ferring, New Jersey, EUA). A estimulação ovariana foi acompanhada por dosagens séricas de estradiol (E2, pg/mL) e ultrassonografias pélvicas por via endovaginal seriadas, sendo os dados obtidos utilizados para definir o dia de administração da Gonadotrofina Coriônica humana recombinante (Recombinant Human Corionic Gonadotrophin – r-hCG, Ovidrel®, Merck KGaA, Darmstadt, Alemanha), utilizada para induzir a maturação folicular final e a luteinização, após a estimulação do desenvolvimento folicular. 3.3) RECUPERAÇÃO OOCITÁRIA A recuperação oocitária foi realizada 34 a 36 horas após a administração do r-hCG por meio de aspiração folicular transvaginal guiada por ultrassom, sendo a paciente submetida à sedação. Após a recuperação, os oócitos foram incubados em meio de cultura (Global® for Fertilization, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) suplementado em 10% (Protein supplement, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) e coberto por óleo mineral (Parafin Oil, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) por 4 horas em atmosfera controlada a 37 ºC e 7,5% de CO2. As células do complexo cúmulus-corona foram removidas por exposição durante 30 seg ao meio tamponado com HEPES contendo 80 UI/mL da enzima hialuronidase (Hyaluronidase, Irvine Scientific, California, EUA). Posteriormente, as células restantes foram cuidadosamente removidas por denudação mecânica usando pipetas Pasteur de vidro manualmente afiladas. Os oócitos denudados foram então avaliados em estereomicroscópio quanto ao seu grau de 24 maturação nuclear. Oócitos que apresentaram a extrusão do primeiro corpúsculo polar foram classificados em Metáfase II (MII) e submetidos à ICSI. 3.4) OBTENÇÃO DE ESPERMATOZOIDES, ANÁLISE E PROCESSAMENTO SEMINAL As amostras de sêmen ejaculado foram obtidas por masturbação, após dois a cinco dias de abstinência ejaculatória, coletadas em frasco plástico e estéril e enviadas para análise e processamento seminal. Primeiramente as amostras foram submetidas à análise seminal, de acordo com protocolos estabelecidos pela Organização Mundial da Saúde (OMS 2010). Foram obtidas, então, a concentração de espermatozoides, a porcentagem de espermatozoides móveis progressivos, não progressivos e imóveis e a morfologia seminal segundo critério de Kruger (Kruger et al. 1986). Após análise seminal, foi realizado protocolo de processamento seminal pelas técnicas de gradiente descontínuo de densidade ou migração ascendente de espermatozoides, conforme indicações estabelecidas no II Consenso de Infertilidade Masculina (Rhoden 2003) para recuperação de espermatozoides com motilidade progressiva a serem utilizados na técnica de ICSI. Gradiente descontínuo de densidade Para a realização do gradiente descontínuo de densidade, foram utilizadas duas camadas de Isolate (Irvine Scientific, California, EUA) nas densidades de 90% e 50%. Utilizando uma pipeta estéril, 1 mL da camada inferior (90%, Isolate) foi transferida para um tubo cônico, sendo 1 mL da camada superior (50%, Isolate) depositada gentilmente sobre a camada inferior. Foi adicionado 1 mL da amostra seminal liquefeita sobre as camadas de Isolate seguido de centrifugação por 10 min a 300g. As camadas do reagente Isolate foram cuidadosamente retiradas por aspiração e o precipitado contendo os espermatozoides foi ressuspendido em 1 mL de meio de cultura tamponado com HEPES ((N-(2-hidroxietil)piperazina-N'-(2-ácido etanosulfônico), Global® w/HEPES, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) seguido de centrifugação por 8 min a 300g para lavagem. O sobrenadante foi, então, removido e o precipitado final ressuspendido em 0,5 mL de meio de cultivo com HEPES (Global® w/HEPES, LifeGlobal Group, Connecticut, 25 EUA). A amostra recuperada foi analisada com relação aos parâmetros descritos acima e encaminhada ao laboratório de FIV para utilização na técnica de ICSI. Migração ascendente de espermatozoides Para a técnica de migração ascendente de espermatozoides, 0,5 mL da amostra seminal após liquefação foi depositada em um tubo cônico, sendo 1 mL de meio de cultura com HEPES (Global® w/HEPES, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) cuidadosamente adicionado, de forma a obtermos uma camada de meio de cultivo sobre a amostra seminal. Após um período de incubação de uma hora a 37 ºC, mantendo-se o tubo inclinado a 45o, parte do sobrenadante foi aspirado e transferido para outro tubo cônico. A amostra recuperada foi analisada com relação aos parâmetros descritos acima e encaminhada ao laboratório de FIV para utilização na técnica de ICSI. 3.5) INJEÇÃO INTRACITOPLASMÁTICA DE ESPERMATOZÓIDE (ICSI) A técnica de fertilização in vitro utilizada para todos os casos incluídos neste estudo foi a injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), realizada de acordo com a técnica-padrão descrita por Palermo et al. (1992). Para a ICSI, os oócitos foram dispostos individualmente em gotas de 4 µL de meio tamponado (Global® w/HEPES, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA), e a amostra seminal adequadamente processada foi adicionada em gotas centrais de solução de 10% polivinilpirrolidona (PVP) em meio tamponado com HEPES contendo albumina sérica humana (HSA) (Polyvinylpyrrolidone (PVP) Solution with HSA, Irvine Scientific, California, EUA), cobertas com óleo mineral (Parafin Oil, LifeGlobal, Connecticut, EUA). Após a injeção, os oócitos foram cultivados individualmente em microgotas de 50 µL de meio de cultivo embrionário (Global®, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) suplementado em 10% (Protein supplement, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) e coberto por óleo mineral (Parafin Oil, LifeGlobal Group, Connecticut, EUA) em atmosfera controlada a 37 ºC e 7,5% de CO2 até o dia 3 do desenvolvimento embrionário. Neste dia, após avaliação da morfologia embrionária, o meio de cultivo foi renovado e os embriões foram mantidos atmosfera controlada a 37 ºC, 7,5% de 26 CO2 e 7% de O2 até o momento da transferência embrionária, realizada no dia 5 do desenvolvimento. 3.6) REVISÃO DE LITERATURA A seleção dos parâmetros morfológicos embrionários que seriam avaliados para cada dia do desenvolvimento foi baseada em levantamento bibliográfico em base de dados MEDLINE. O levantamento incluiu manuscritos disponíveis escritos em inglês e publicados em ou após Janeiro de 1992. Para a busca utilizamos uma adequada combinação dos seguintes termos: fertilização in vitro (in vitro fertilization), embrião humano (human embryo), morfologia embrionária (embryo morphology), valor preditivo (predictive value), viabilidade embrionária (embryo viability), taxa de blastocisto (blastocyst rate), potencial de implantação (implantation potential), morfologia oocitária (oocyte morphology), morfologia pronuclear (pronuclear morphology), número de células em dia 2 (day 2 cell number), número de células em dia 3 (day 3 cell number), simetria de blastômeros (blastomere symmetry), fragmentação de blastômeros (blastomere fragmentation), multinucleação (multinucleation), morfologia embrionária de dia 3 (day 3 embryo morphology), morfologia embrionária de dia 5 (day 5 embryo morphology), classificação de blastocisto (blastocyst grading). Os manuscritos obtidos foram então submetidos a processos de seleção a partir da análise do título, resumo e do manuscrito completo, obrigatoriamente nesta ordem. Foram incluídos na revisão manuscritos nos quais parâmetros morfológicos de avaliação oocitária e embrionária para os dias 1, 2 e 3 do desenvolvimento haviam apresentado uma correlação significativa com o potencial de formação de blastocisto e/ou com o potencial de implantação do blastocisto. 3.7) REVISÃO DOS PRONTUÁRIOS LABORATORIAIS Todos os parâmetros abordados como preditivos de viabilidade embrionária, segundo manuscritos selecionados durante a revisão bibliográfica, foram listados e incluídos nos prontuários laboratoriais de acordo com o dia de desenvolvimento embrionário para o qual este seria devidamente avaliado. Os prontuários laboratoriais foram então revisados e adequados à rotina laboratorial. 27 Os critérios incluídos, bem como seu respectivo dia de análise com relação ao desenvolvimento embrionário, estão listados abaixo. O termo descrito entre parênteses representa a forma abreviada utilizada nos prontuários laboratoriais. Os itens descrevem as alterações possíveis de serem detectadas. Com a finalidade de otimizar a coleta de dados os parâmetros aferidos foram inseridos de forma a serem facilmente localizados e registrados no prontuário. Caso a alteração estivesse presente, a identificação foi registrada por meio da marcação de um (X) na coluna correspondente, evitando a exposição prolongada do embrião ao microscópio óptico durante a avaliação. Cabe ressaltar que os critérios de normalidade foram enumerados no manual de Procedimento Operacional Padrão (POP) do Centro de Fertilização Assistida Fertility, atualizado segundo levantamento do presente estudo (Anexo 1). Dia 0, Morfologia oocitária: Parâmetros intracitoplasmáticos: Granulosidade citoplasmática excessiva (CG); Granulosidade citoplasmática em cluster (CL); Citoplasma enegrecido (CE); Presença de vacúolos (PV); Retículo endoplasmático liso agregado (RE); Presença de inclusões citoplasmáticas (IN); Parâmetros extracitoplasmáticos: 1º corpúsculo polar fragmentado (CF); Granulações no espaço perivitelineo (DP); Espaço perivitelineo aumentado (EP); Alteração de forma e/ou espessura e/ou coloração da zona pelúcida (ZP); Alteração de forma do oócito (AF); Membrana plasmática oocitária resistente no momento da ICSI (MR); Membrana plasmática oocitária sem resistência no momento da ICSI (MSR). 28 Dia 1, Morfologia pronuclear: Número de pronúcleos (No PN); Número de corpúsculos polares (No CP); PN - Alteração de tamanho (Tamanho); PN – Posição não central em relação ao citoplasma (Periféricos); PN – Não justapostos (Afastados); Nucléolo – Número de nucléolos em pelo menos um dos PN menor do que 3 (número (0, 1 e 2)); Nucléolo – Tamanho não correspondente ao estágio da nucleogênese (Tamanho); Nucléolo – Assincronismo da organização dos nucléolos durante a nucleogênese (Polarização); Ausência ou irregularidade na formação do halo citoplasmático (Halo); Detecção de vacúolos no citoplasma (Vac); Granulosidade excessiva no citoplasma (CG); Detecção de irregularidade da membrana plasmática (Memb. Irreg.). Dia 2: Embrião - No de células (Algarismos decimais); Embrião - Simetria de blastômeros (Simétrico (Si), Semelhante (Se) ou Assimétrico (As)); Embrião - Fragmentação em % (Porcentagem do volume do embrião ocupado por fragmentos anucleados); Embrião - Tipo de fragmentação (Posição dos fragmentos de acordo coma classificação de Alikani, 1999); Presença de fragmentos grandes (Frag gdes, número decimal); Granulosidade excessiva no citoplasma (CG); Detecção de vacúolos no citoplasma de pelo menos um dos blastômeros (Vac); Alteração de forma do embrião (Forma); Alteração na zona pelúcida do embrião (ZP); 29 Presença de blastômeros sem núcleo (BL s/ N, número decimal); Presença de blastômeros multinucleados (Multinucleação, número de blastômeros comprometidos e número de núcleos detectados). Dia 3: Embrião - No de células (Algarismos decimais) e/ou grau de compactação; Embrião - Simetria de blastômeros (Simétrico (Si), Semelhante (Se) ou Assimétrico (As)); Embrião - Fragmentação em % (Porcentagem do volume do embrião ocupado por fragmentos anucleados); Embrião - Tipo de fragmentação (Posição dos fragmentos de acordo coma classificação de Alikani, 1999); Presença de fragmentos grandes (Frag gdes, número decimal); Granulosidade excessiva no citoplasma (CG); Detecção de vacúolos no citoplasma de pelo menos um dos blastômeros (Vac); Alteração de forma do embrião (Forma); Alteração na zona pelúcida do embrião (ZP); Presença de blastômeros sem núcleo (BL s/ N, número decimal); Presença de blastômeros multinucleados (Multinucleação, número de blastômeros comprometidos e número de núcleos detectados); Presença de blastômero apresentando diferença de tamanho maior ou igual a 50% em relação ao menor blastômero do embrião - Blastômero dominante (BD). 30 Dias 5 e 6: MCI (massa celular interna): MCI - Ausente, caso não detectada durante avaliação; MCI - Não compacta, caso não detectada formação de protuberância na blastocele; MCI - Granulosidade excessiva no citoplasma das células que compõem a MCI (CG); MCI - Detecção de células degeneradas na MCI (Cel Deg); TRF (trofoectoderma): TRF – Detecção de formação de TRF irregular, não observação da formação de epitélio coesivo (Irreg); TRF – Presença de poucas células na formação do TRF (Poucas cel); TRF – Granulosidade excessiva no citoplasma das células que compõem o TRF (CG); TRF – Detecção de células degeneradas no TRF (Cel Deg); Os prontuários revisados para os dias 1, 2, 3 e 5 do desenvolvimento embrionário e que foram utilizados na rotina laboratorial encontram-se anexos (Anexo 2). 3.8) TREINAMENTO DA EQUIPE E ELABORAÇÃO DE ESQUEMAS DIDÁTICOS Com o objetivo de reduzir variações intra e interobservador a equipe de embriologistas do Centro de Fertilização Assistida - Fertility recebeu treinamento para avaliação da morfologia embrionária incluindo todos os parâmetros apontados no presente estudo. Ainda com o objetivo de tornar essa avaliação menos subjetiva, esquemas didáticos foram desenvolvidos e incorporados aos POPs do laboratório. Abaixo um exemplo de esquema didático desenvolvido para abordagem do parâmetro simetria de blastômero para os dias 2 e 3 do desenvolvimento (Fig. 1). Os esquemas foram utilizados neste caso para uma clara diferenciação entre a assimetria do tamanho dos blastômeros e a assincronia de clivagem, conforme detalhado previamente no tópico Introdução. 31 Fig. 1a No de células Blastômeros de mesmo tamanho Blastômeros de tamanho diferente 3 células 4 células 5 células 6 células 7 células 8 células Fig. 1b CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - SIMETRIA O DE NNo DECÉLULAS CÉLULAS SIMETRIA ESPERADA 2 2 CEL = 3 1 CEL GDE 2 CEL MENORES = 4 4 CEL = 5 3 CEL GDE 2 CEL MENORES = 6 2 CEL GDE 4 CEL MENORES = 7 1 CEL GDE 6 CEL MENORES = 8 8 CEL = FIGURA 1: Esquema didático para avaliação da simetria de blastômeros nos dias 2 e 3 do desenvolvimento embrionário. Embriões apresentando a simetria esperada para cada dia do desenvolvimento estão destacados na Fig. 1a e demonstrados na Fig. 1b. 32 3.9) AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA E SELEÇÃO EMBRIONÁRIA A avaliação dos critérios de morfologia oocitária foi realizada no momento da ICSI. O oócito classificado na linha de número “1” foi identificado como embrião “1” da placa de cultivo de forma que as características oocitárias de cada um dos embriões resultantes estivessem disponíveis para utilização como parâmetro de seleção para transferência. Os embriões foram avaliados em intervalos regulares quanto aos critérios morfológicos de interesse, sendo o intervalo de tempo correspondente ao número de horas após a realização da ICSI: dia 1 ou checagem da fertilização (17h+1), classificação do dia 2 do desenvolvimento (44h+1), dia 3 (68h+1) e dia 5 (116h+2) (Tab. 3). TABELA 3: Intervalos de horas em relação ao horário de realização do procedimento de ICSI utilizados para avaliação regular dos embriões quanto aos critérios morfológicos de interesse. OBSERVAÇÃO Fertilização (±1) Dia 2 (±1) Dia 3 (±1) Dia 5 (±2) INTERVALO (horas) 17 44 68 116 PADRÃO ESPERADO Estágio pronuclear Estágio de 4-cel Estágio de 8-cel Blastocisto A seleção dos embriões a serem transferidos foi baseada em critérios discutidos recentemente pelas Sociedades Americana de Medicina Reprodutiva (ASRM) e Européia de Reprodução Humana e Embriologia (ESHRE) (Racowsky et al. 2011, Embryology 2011). Cabe ressaltar que a idade da mulher não foi considerada critério de exclusão para o estudo, sendo até 4 embriões transferidos em alguns ciclos cujas pacientes apresentavam idade igual ou superior a 40 anos, conforme sugerido pelo Conselho Federal de Medicina (CFM 2010). 33 3.10) COLETA DE DADOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS Os prontuários das pacientes inseridas neste estudo foram arquivados no Centro de Fertilização Assistida – Fertility, além de estarem disponíveis para consulta em formato digitalizado. Todos os dados clínico-laboratoriais referentes a cada um dos procedimentos realizados foram inseridos em banco de dados eletrônico formato Access. Para cada ciclo a partir do qual foram incluídos embriões para este estudo foram também coletadas as seguintes informações listadas abaixo, além de todos os critérios de morfologia oocitária e embrionária descritos previamente: Dados pessoais do casal (Nome, idade); Data da punção folicular; Fator de infertilidade; Protocolo de indução (Unidades e tipo de gonadotrofina / Bloqueio hipofisário); Dosagem de estradiol no dia do hCG (E2); Tipo de coleta da amostra seminal (Ejaculado / Punção aspirativa epididimária ou testicular); Parâmetros seminais pré e pós-processamento, sendo os critérios de normalidade definidos de acordo com a OMS (2010); Motilidade dos espermatozoides utilizados para ICSI (Motilidade progressiva, não progressiva, imóvel); No de folículos puncionados; No de oócitos obtidos; Grau de maturação nuclear dos oócitos após denudação (PI, MII ou MII) No de oócitos injetados e grau de maturação nuclear; Morfologia oocitária (Dia 0, para cada um dos oócitos injetados); Morfologia embrionária (Dias 1, 2, 3 e 5, parâmetros descritos previamente – para cada um dos embriões obtidos); No de embriões obtidos; No de embriões transferidos; No de embriões criopreservados; 34 Dia de desenvolvimento embrionário na transferência; Espessura endometrial (mm) no dia da administração do hCG; Resultado de gestação (Dosagem sérica de β-hCG); No de sacos gestacionais com batimento cardíaco. A disponibilidade destas informações torna-se relevante dado que devemos considerar a possível influência de outros fatores, além dos critérios morfológicos oocitários e embrionários focos deste estudo, na chance de sucesso do tratamento como, por exemplo, o fator idade materna. 3.11) CATEGORIZAÇÃO DAS VARIÁVEIS DE ESTUDO Após tabulação, tornou-se necessária a organização dos dados para possibilitar a submissão dos mesmos para as análises estatísticas, incluindo o modelo de regressão logística. Alguns exemplos do agrupamento das variáveis em categorias para avaliação dos parâmetros número de células, ritmo de clivagem e simetria de blastômeros para os dias 2 e 3 do desenvolvimento estão na Figura abaixo (Fig. 2). Foram considerados para este estudo embriões com ritmo de clivagem normal aqueles que apresentaram de 3 a 5 células em dia 2 e 7 ou 8 células em dia 3 do desenvolvimento. Embriões com 2 células em dia 2 ou com um número menor ou igual a 6 células em dia 3 foram classificados como ritmo lento de clivagem. Por outro lado, embriões apresentando 6 ou mais células em dia 2 ou 9 ou mais células em dia 3 foram considerados como ritmo de clivagem rápido. Quanto ao ritmo de clivagem avaliamos ainda para o dia 2 do desenvolvimento a não ocorrência de clivagem ou a compactação precoce. Para o dia 3 do desenvolvimento os embriões foram classificados como parada de clivagem ou clivagem anormal quando não houve ocorrência de clivagem no intervalo entre a avaliação do dia 2 e do dia 3 ou quando foi detectada clivagem de apenas uma célula neste intervalo, respectivamente. Além disso, realizou-se o agrupamento de algumas destas categoriais para análise dos dados como a inserção dos ritmos lento e rápido de clivagem em uma mesma categoria, ou ainda a inserção de todas as categoriais que representam uma variação do ritmo de clivagem normal na categoria “anormal”. Com relação ao parâmetro 35 simetria de blastômeros, embriões classificados como simétricos (Si) ou semelhantes (Se) foram agrupados em uma mesma categoria e assimétricos (As) inseridos em outra categoria. No DE CÉLULAS E RITMO DE CLIVAGEM ESTATÍSTICA 1 DIA 2 ESTATÍSTICA 1 DIA 3 Ritmo de clivagem No células Categorias GRUPOS LENTA 2 1 33 a NORMAL a 45 2 >6 RÁPIDA >5 3 Não clivado PARADO NC 4 COMPACTAÇÃO PRECOCE 5 Ritmo de clivagem LENTA NORMAL RÁPIDA PARADO CLIVAGEM 1CEL ESTATÍSTICA 2 DIA 2 ESTATÍSTICA 2 DIA 3 Ritmo de clivagem LENTA/RÁPIDA NORMAL PARADO Categorias GRUPOS 1 0 2 Ritmo de clivagem LENTA/RÁPIDA NORMAL PARADO CLIVAGEM 1CEL No células Categorias GRUPOS <6 1 7a8 2 >9 3 4 5 Categorias GRUPOS 1 0 2 3 ESTATÍSTICA 3 DIAS 2 E 3 Ritmo de clivagem ANORMAL NORMAL Categorias GRUPOS 1 0 DIAS SIMETRIA DE BLASTÔMEROS Dia 2 e 23 E 3 Categorias Si ou Se As 0 1 FIGURA 2: Modelo de categorização das variáveis número de células / ritmo de clivagem e simetria de blastômeros para os dias 2 e 3 do desenvolvimento utilizados para submissão dos dados à análise estatística. Si= Simétrico, Se= Semelhante, As= Assimétrico 36 Outros parâmetros não exemplificados acima foram categorizados para análise como a presença de fragmentos anucleados, de blastômeros multinucleados e de blastômeros anucleados. O parâmetro fragmentação embrionária foi categorizado de acordo com o tipo (II, III ou IV) e grau (ausente, comprometendo até 10 ou 20% do volume do embrião), além da combinação de ambos os critérios. A presença ou ausência de blastômeros multinucleados e de blastômeros anucleados foi registrada, bem como a porcentagem de blastômeros comprometidos (> ou < 25%). Ainda para o parâmetro multinucleação, o maior número de núcleos visualizados em pelo menos um dos blastômeros comprometidos foi considerado (> ou < 2 núcleos), de forma independente do número de blastômeros comprometidos. 3.12) SEGUIMENTO CLÍNICO No intervalo de 10 dias após a transferência embrionária foi realizada a dosagem quantitativa dos níveis séricos da subunidade beta da gonadotrofina coriônica humana (β-hCG), indicativo de gestação positiva. A gestação clínica foi definida por meio da detecção de saco gestacional e de batimento cardíaco fetal em ultrassonografia pélvica transvaginal realizada de 3 a 4 semanas após a transferência embrionária. 3.13) CONCEITOS E VARIÁVEIS Oócito PI Oócito em grau de maturação nuclear Prófase I da Meiose I, caracterizado pela presença de vesícula germinativa. Oócito MI Oócito em grau de maturação nuclear Metáfase I da Meiose I, caracterizado pela ausência de vesícula germinativa e de corpúsculo polar. Oócito MII Oócito em grau de maturação nuclear Metáfase II da Meiose II, caracterizado pela presença do 1o corpúsculo polar. 37 Taxa de oócitos recuperados A taxa de oócitos recuperados foi definida pelo número de oócitos recuperados após punção folicular dividido pelo número de folículos puncionados. Taxa de oócitos MII A taxa de oócitos MII foi definida pelo número de oócitos classificados como MII quanto ao grau de maturação nuclear dividido pelo número de oócitos recuperados após punção folicular. Taxa de oócitos injetados A taxa de oócitos injetados foi definida pelo número de oócitos submetidos à ICSI dividido pelo número de oócitos recuperados após punção folicular. Taxa de 2PN A taxa de 2PN foi definida pelo número de zigotos com fertilização normal (2PN) obtidos dividido pelo número de oócitos submetidos à ICSI. Taxa de blastocistos A taxa de blastocistos foi definida como o número de embriões que atingiram o estágio de blastocisto, independente do grau de expansão da blastocele, dividido pelo número de embriões que foram mantidos em cultivo até o dia 5 do desenvolvimento. Viabilidade embrionária No presente estudo optamos por definir a viabilidade embrionária como sendo o potencial de o embrião atingir o estágio de blastocisto quando cultivado até o dia 5 do desenvolvimento e, ainda, o potencial de implantação deste embrião quando selecionado para a transferência. Taxa de gestação clínica A taxa de gestação clínica foi definida pelo número de pacientes que apresentaram dosagem positiva de β-hCG, detecção de saco gestacional e de batimento cardíaco fetal dividido pelo número de pacientes que realizaram transferência embrionária. Taxa de implantação 38 A taxa de implantação foi definida pelo número de sacos gestacionais que apresentaram batimento cardíaco dividido pelo número de embriões transferidos. Taxa de aborto A taxa de aborto foi definida pelo número de pacientes que apresentaram perda gestacional dividido pelo número de pacientes com gestação clínica detectada. 3.14) ANÁLISE E ESTATÍSTICA DOS DADOS Os dados de morfologia obtidos para todos os dias do desenvolvimento (desde o dia 0 – morfologia oocitária até o dia 3 – 68h após a fertilização) dos embriões obtidos foram associados aos dados obtidos para o dia 5 do desenvolvimento, ou seja, o sucesso na obtenção do embrião em estágio de blastocisto (Blastocisto (S)) ou a falha na formação do blastocisto (Blastocisto (N)), com o objetivo de identificarmos possíveis parâmetros preditivos de formação de blastocistos. Da mesma forma, os dados de ocorrência (Implantação 100%) ou não (Implantação 0%) de implantação embrionária foram avaliados juntamente com os dados de morfologia obtidos para todos os dias do desenvolvimento, com o objetivo de identificação de possíveis parâmetros preditivos do sucesso da implantação embrionária. Cabe ressaltar que para alcançar tal objetivo foram utilizados apenas dados de embriões provenientes dos ciclos que apresentaram 0% ou 100% de implantação, de forma que pudéssemos afirmar o sucesso ou a falha de implantação do embrião estudado. O fato de não podermos afirmar qual foi o embrião implantado em um ciclo cuja taxa de implantação foi de, por exemplo, 50% implicou na não inclusão destes dados. A associação entre a normalidade/anormalidade dos critérios morfológicos e a viabilidade embrionária foram avaliadas com o auxílio dos programas computacionais Minitab 17, GraphPad Prism 5.0 e SPSS 20.0. Inicialmente, foi realizada a análise bivariada centrada nos testes de associação entre as variáveis independentes e a variável resposta (Blastocisto e/ou Implantação) para a identificação das principais variáveis associadas à viabilidade embrionária. Para variáveis quantitativas os valores foram expressos em média + desvio padrão. Para avaliação de duas populações de dados as variáveis quantitativas foram submetidas ao teste paramétrico t de Student ou ao teste não-paramétrico de Mann-Whitney, de acordo com o resultado obtido após 39 submissão destas variáveis ao teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov. Nas análises de associação de variáveis qualitativas foram aplicados os testes Qui-Quadrado ou o Teste Exato de Fisher, conforme apropriado. Finalmente, foi construído um modelo de regressão, através do programa SPSS, visando a ajustar as variáveis preditoras da variável resposta. Sendo a variável resposta de ambos os objetivos deste estudo uma variável dicotômica, análises de regressão logística binária foram aplicadas e os resultados foram expressos como Odds ratio (OR) ou Razão de Chance (calculado em relação ao critério de normalidade para cada um dos parâmetros), Intervalo de Confiança a 95% (IC) e valor de P. O método Foward foi utilizado, deste modo as variáveis preditivas foram adicionadas ao modelo de acordo com a força da associação. Foram incluídas na determinação do modelo todas as variáveis que apresentaram um nível descritivo de significância menor ou igual a 0,20 na análise bivariada. Os resultados foram considerados ao nível crítico de 5% de significância (P<0,05). 40 4) RESULTADOS 4.1) Dados descritivos – Perfil da população estudada Considerando o período proposto para este estudo foram realizados 2155 ciclos de aspiração folicular e fertilização in vitro com injeção intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI), resultado do tratamento de 1521 pacientes. Considerando-se os critérios de inclusão do presente estudo como inicialmente o fato de que houvesse transferência embrionária (80,0% dos ciclos iniciados) e de que a transferência fosse realizada em dia 5 do desenvolvimento em estágio de blastocisto (53,7% dos ciclos transferidos) poderíamos incluir 926 ciclos de 699 pacientes submetidas ao tratamento. Após considerarmos todos os critérios de exclusão do estudo conforme descrito em Método, foram incluídos no presente estudo os dados de morfologia oocitária e embrionária de 743 ciclos de 583 pacientes submetidas ao tratamento. Os dados descritos na tabela abaixo (Tab. 4) representam o perfil clínico dos casais e dos ciclos de tratamento inseridos no presente estudo, incluindo dados relacionados ao EOC. TABELA 4: Descrição das características dos casais inseridos no presente estudo e de seus ciclos de tratamento de RHA. Variáveis do EOC N Média Intervalo Desvio padrão Pacientes 583 - - - Punções foliculares 743 - - - Idade Mulher (anos) - 34,3 21-45 4,1 Idade Homem (anos) - 37,2 25-63 5,6 Unidades de FSH (UI) administrada - 2279 600-4950 605 Dosagem do E2 no dia da administração do hCG (pg/mL) - 2124 125-10000 1538 Espessura endometrial (mm) no dia de administração do hCG - 10,8 5,0-18,6 2,1 A média de idade das pacientes submetidas ao tratamento, cujos embriões foram avaliados no presente estudo, foi de 34,3 anos sendo a idade mínima e a máxima observada de 21 e de 45 anos, respectivamente. A média de idade foi de 37,2 anos para os respectivos parceiros, 41 com mínima de 25 e máxima de 63 anos. Em média, foram aplicadas 2279 UI de FSH para EOC, sendo de 2124 pg/mL o valor médio de E2 no dia da administração do hCG. A espessura endometrial obtida para o mesmo dia de avaliação foi em média 10,8 mm. Buscando uma melhor caracterização da população estudada, bem como o estudo de todos os possíveis fatores clínicos que pudessem interferir nas variáveis de resposta objetivo deste estudo, as variáveis cujas incidências estão descritas na tabela abaixo (Tab. 5) foram levantadas e analisadas para as pacientes incluídas no estudo. TABELA 5: Descrição das características clínicas da população estudada e dos ciclos de tratamento de RHA. Variáveis de perfil clínico Incidência (%) Pacientes (mulher) com idade ≥ a 38 anos 21,9 Pacientes (homem) com idade ≥ a 38 anos 43,0 Ciclos com uso de FSH recombinante 94,8 Ciclos com bloqueio hipofisário por antagonista 92,2 Ciclos com fator masculino de infertilidade 47,4 Ciclos com fator feminino de infertilidade 61,4 Ciclos com fator masculino e feminino de infertilidade associados 19,2 Ciclos com indicação de endometriose 15,7 Ciclos com concentração seminal normal pré-processamento 68,9 Ciclos com motilidade total normal pré-processamento 81,3 Ciclos com motilidade progressiva normal pré-processamento 70,5 Mais de 20% das pacientes submetidas ao tratamento apresentaram idade igual ou superior a 38 anos, sendo esta proporção ainda maior (43%) considerando-se a idade do homem. O bloqueio hipofisário foi obtido em 92,2% dos casos com o uso de antagonista do GnRH e o EOC foi induzido em 94,8% dos casos pelo uso de r-FSH. O fator masculino de infertilidade isolado ou associado a outros fatores de infertilidade estava presente em cerca de 50% dos casos sendo esta proporção maior para o fator feminino de infertilidade, 61,4% dos casos. A presença de ambos foi relatada para 19,2% dos casos. Cerca de 15% das pacientes incluídas no estudo 42 apresentavam diagnóstico clínico de endometriose. Os parâmetros seminais pré-processamento incluindo Concentração, Motilidade total e Motilidade progressiva estavam dentro do critério de normalidade para a maioria dos ciclos de tratamento, sendo de 68,9%, 81,3% e de 70,5% a incidência de normalidade para estes critérios, respectivamente. As variáveis de resposta folicular após submissão ao EOC estão resumidas na Tab. 6 para as pacientes incluídas no estudo. TABELA 6: Descrição das variáveis de resposta folicular das pacientes submetidas ao EOC. Variáveis de resposta folicular N Média Intervalo Desvio padrão o 14905 20,1 2,0-64 10,6 o 10868 14,6 1,0-50 8,1 - 73,7 12-100 18,0 N de oócitos em grau de maturação nuclear MII Taxa média de MII (%) 8072 10,9 1,0-41 6,0 - 77,0 12-100 15,8 No de oócitos injetados 7609 10,2 1,0-36 5,0 - 75,3 12-100 18,6 N de folículos puncionados N de oócitos recuperados Taxa média de oócitos recuperados (%) o Taxa média de oócitos injetados (%) Os valores médios obtidos para as pacientes submetidas ao EOC foram de 20,1 folículos puncionados; 14,6 oócitos recuperados com taxa média de recuperação oocitária de 73,7%; 10,9 oócitos em MII com taxa média de MII de 77,0%; 10,2 oócitos injetados com taxa média de oócitos injetados de 75,3%. Os dados de parâmetros seminais macroscópicos e microscópicos avaliados préprocessamento, para todas as amostras utilizadas nos ciclos estudados, encontram-se resumidos na tabela abaixo (Tab. 7). 43 TABELA 7: Descrição dos parâmetros seminais pré-processamento das amostras submetidas à ICSI. Características seminais Média Intervalo Desvio padrão 3,1 0,2-11,5 1,6 Concentração de sptz na amostra pré-processamento (x10 /mL) 37,8 0,0002-207,5 34,9 Motilidade total (%) 54,8 6,0-95,0 17,5 Motilidade progressiva (%) 40,3 3,0-85,0 16,7 Volume seminal (mL) 6 SPTZ= Espermatozoide Em média, as amostras submetidas ao processamento seminal para ICSI apresentaram na avaliação pré-processamento um volume ejaculado de 3,1mL, Concentração de 37,8x106/mL, Motilidade total de 54,8% e Motilidade progressiva de 40,3%. Algumas variáveis de sucesso laboratorial, após submissão dos oócitos à ICSI, estão descritas na tabela abaixo (Tab.8). Dentre estas podemos destacar a taxa de oócitos que apresentaram fertilização normal após serem submetidos à ICSI (Taxa média de 2PN, 82,0%) e a taxa de blastocistos formados após cultivo dos embriões obtidos até o dia 5 do desenvolvimento (Taxa de blastocistos, 53,8%). O número médio de embriões transferidos foi de 2,2 com um intervalo de 1 a 4 embriões transferidos, sendo que em 40,4% dos ciclos houve criopreservação dos embriões excedentes. TABELA 8: Perfil laboratorial das variáveis de sucesso após submissão dos oócitos à ICSI. Variáveis de sucesso laboratorial o N de oócitos com fertilização normal (2PN) Taxa média de 2PN (%) N Média Intervalo Desvio padrão 5850 7,9 1,0-28 4,1 - 82,0 11-100 14,9 o 1639 2,2 1,0-4,0 0,6 o N de embriões congelados 1295 4,3 1,0-14 2,2 Taxa de blastocistos (%) 3147 53,8 - - % de ciclos com criopreservação de embrião 300 40,4 - - N de embriões transferidos Os resultados clínicos obtidos após transferência embrionária estão descritas na Tab. 9. 44 TABELA 9: Taxas de sucesso do tratamento de RHA para as pacientes avaliadas no estudo. Variáveis de sucesso clínico (%) Taxa de gestação clínica 41,5 (308/743) Taxa de aborto 15,6 (48/308) Taxa de implantação 24,8 (407/1639) Dos 743 ciclos de ICSI iniciados e nos quais houve transferência embrionária, obtivemos 308 ocorrências de gestação clínica positiva, resultando em 41,5% de taxa de gestação. A taxa de implantação embrionária foi de 24,8% sendo resultado de um total de 1639 embriões transferidos e da obtenção de 407 sacos gestacionais com batimento cardíaco detectado. Foram relatadas 48 ocorrências de aborto, resultando em uma taxa de 15,6% de abortamento. 4.2) Objetivo 1 – Valor preditivo de critérios morfológicos oocitários e embrionários avaliados nos dias 1, 2 e 3 do desenvolvimento na obtenção de embriões em estágio de blastocisto. 4.2.1) Dados descritivos Variáveis quantitativas (Tab. 10) e qualitativas (Tab. 11) correspondentes ao perfil das pacientes submetidas ao tratamento e ao perfil de resposta clínica e laboratorial foram avaliadas quanto ao possível valor preditivo na taxa de obtenção de blastocistos. Dentre as diferenças significativas observadas para as variáveis quantitativas, os seguintes parâmetros apresentaram um valor médio menor para o grupo de embriões que atingiram o estágio de blastocisto no dia 5 do desenvolvimento: média de idade da mulher (33,6+4,0 vs 34,2+3,9; p<0,001); número médio de UI de FSH administradas (2205+632 vs 2274+605; p<0,001); número médio de oócitos recuperados após punção folicular (17,1+8,3 vs 17,7+8,6; p=0,015), taxa média de oócitos recuperados (74,3%+16,9 vs 76,9%+16,1; p<0,001) e motilidade seminal total (54,2%+17,3 vs 55,1%+17,6, p=0,023). Por outro lados as variáveis taxa média de MII (78,6%+14,3 vs 76,9%+14,7; p<0,001), taxa média de oócitos injetados (75,6%+18,1 vs 45 74,8%+17,3; p=0,022) e taxa média de 2PN (81,4%+14,1 vs 80,4%+14,3; p=0,011) apresentaram um valor médio maior para o grupo de embriões que atingiram o estágio de blastocisto no dia 5 do desenvolvimento. Não houve associação estatística significativa para as seguintes variáveis quantitativas na taxa de formação de blastocistos: idade do homem, nível de E2, concentração e motilidade progressiva da amostra seminal, número de folículos puncionados, número de oócitos MII, número de oócitos submetidos à ICSI e número de oócitos com fertilização normal. TABELA 10: Descrição das características e do perfil de resposta clínica e laboratorial dos casais submetidos ao tratamento de RHA de acordo com a classificação do embrião no dia 5 do desenvolvimento. Média (+DP) Variáveis quantitativas - Perfil geral dos ciclos de ICSI Grupo A Blastocisto (N) Grupo B Blastocisto (S) Valor de P Idade mulher 34,2 (3,9) 33,6 (4,0) <0,001 Idade homem 37,0 (5,5) 36,9 (5,5) 0,561 FSH (UI) 2274 (605) 2205 (632) <0,001 E2 (pg/mL) 2429 (1708) 2443 (1719) 0,823 Concentração seminal (10 /mL) 37,1 (34,5) 36,6 (33,9) 0,646 Motilidade total (%) 55,1 (17,6) 54,2 (17,3) 0,023 Motilidade progressiva (%) 40,4 (16,7) 40,0 (16,7) 0,272 No de folículos puncionados 23,4 (10,8) 23,7 (11,7) 0,891 No de oócitos recuperados 17,7 (8,6) 17,1 (8,3) 0,015 Taxa média de oócitos recuperados (%) 76,9 (16,1) 74,3 (16,9) <0,001 No de oócitos em grau de maturação nuclear MII 13,3 (6,5) 13,1 (6,4) 0,486 Taxa média de MII (%) 76,9 (14,7) 78,6 (14,3) <0,001 No de oócitos injetados 12,5 (5,6) 12,2 (5,3) 0,058 Taxa média de oócitos injetados (%) 74,8 (17,3) 75,6 (18,1) 0,022 9,9 (4,6) 9,8 (4,4) 0,482 80,4 (14,3) 81,4 (14,1) 0,011 6 o N de oócitos com fertilização normal (2PN) Taxa média de 2PN (%) Nota: Teste estatístico aplicado – Mann-Whitney. 46 TABELA 11: Taxa de blastocistos obtidos no dia 5 do desenvolvimento de acordo com as características dos casais e de seus ciclos de tratamento de RHA. Variáveis qualitativas - Perfil geral dos ciclos de ICSI Taxa de blastocistos obtidos (%) Valor de P Idade da mulher <37a >38a 39,2 34,1 0,002 Idade do homem <37a >38a 38,5 38,5 0,982 Bloqueio hipofisário GnRH agonista GnRH antagonista 41,7 38,2 0,147 Estímulo ovariano controlado FSH urinário FSH recombinante 42,0 38,3 0,230 Fator de infertilidade Endometriose (N) Endometriose (S) 38,7 36,5 0,236 Perfil seminal Concentração inicial >15 (106 /mL) 37,8 <15 (106 /mL) Motilidade total >40% <40% Motilidade progressiva >32% <32% 40,6 Nota: Teste estatístico aplicado – Qui-quadrado. 0,059 38,2 41,2 0,084 37,9 40,9 0,044 47 Utilizando a classificação de variáveis qualitativas que caracterizam a população do estudo, a variável idade da mulher aparece novamente como possível interferente do potencial de formação de blastocistos. Pacientes com idade menor ou igual a 37 anos apresentaram uma taxa de formação de blastocistos de 39,2%, significativamente maior do que a observada para pacientes com idade igual ou superior a 38 anos, que foi de 34,1% (p=0,002). Para a variável motilidade seminal, a taxa de blastocistos formados foi maior para o grupo que apresentou motilidade progressiva de padrão anormal, ou seja, <32% (37,9% vs 40,9%; p=0,044). As seguintes variáveis avaliadas de forma qualitativa: idade do homem, estratégia de bloqueio hipofisário, tipo de gonadotrofina aplicada para EOC, diagnóstico clínico de endometriose, concentração e motilidade seminal total não apresentaram associação estatística significativa com a taxa de formação de blastocistos. 4.2.2) Morfologia oocitária Parâmetros de morfologia oocitária avaliados no dia 0 do desenvolvimento, previamente ao procedimento de ICSI, foram avaliados e registrados para todos os 7609 oócitos submetidos à injeção. A incidência dos dismorfismos intracitoplasmáticos e extracitoplasmáticos foi descrita para os 5850 oócitos que resultaram em embriões após a ICSI e que foram incluídos no estudo para avaliação do possível valor preditivo destes parâmetros na taxa de formação de blastocistos (Tab. 12). A granulação citoplasmática em padrões superiores ao considerado normal foi relatada para 96,4% dos oócitos avaliados. Por outro lado, alterações nos outros parâmetros intracitoplasmáticos de morfologia oocitária foram observadas em menos de 10% dos oócitos, com destaque para o acúmulo de REL cuja incidência foi de 2,2%. Apesar de nenhum dos dismorfismos extracitoplasmáticos apresentarem incidência maior que 50%, a ocorrência de alteração de pelo menos um destes parâmetros foi detectada em 65,5% dos oócitos estudados. De modo geral, 98,3% dos oócitos apresentaram ao menos a presença de um dismorfismo intra ou extracitoplasmático. 48 TABELA 12: Descrição da incidência dos dismorfismos oocitários avaliados no dia 0 do desenvolvimento. Dismorfismos oocitários intracitoplasmáticos Incidência (%) CG - Granulação citoplasmática 96,4 CL - Granulação citoplasmática centralizada 7,1 REL - Acúmulo de Retículo endoplasmático liso 2,2 VAC - Presença de vacúolos 4,8 Alteração de pelo menos um parâmetro intracitoplasmático 96,6 Dismorfismos oocitários extracitoplasmáticos DB - Presença de debris no espaço perivitelíneo 42,9 ZP - Alteração de zona pelúcida 4,3 EP - Espaço perivitelíneo aumentado 15,2 CP frag - Corpúsculo polar fragmentado 33,8 FORMA - Alteração de forma 1,9 Alteração de pelo menos um parâmetro extracitoplasmático 65,5 Dismorfismos oocitários intra ou extracitoplasmáticos Alteração de pelo menos um parâmetro intra ou extracitoplasmático 98,3 Os dados de detecção ou a ausência dos dismorfismos oocitários avaliados foram submetidos à análise estatística para estudo do possível valor preditivo destes parâmetros na taxa de obtenção de blastocistos. Os resultados obtidos foram resumidos na Tab. 13. As taxas de formação de blastocisto descritas correspondem àquelas observadas para oócitos nos quais as alterações foram detectadas. Nos casos em que houve uma diferença significativa (p<0,05) para a taxa de formação de blastocisto entre embriões provenientes de oócitos nos quais as alterações estavam ou não presentes foram relatadas também as taxas de formação de blastocisto para oócitos nos quais as alterações não foram detectadas. 49 TABELA 13: Taxa de formação de blastocisto de acordo com o dismorfismo oocitário detectado no oócito submetido à ICSI. Taxa de blastocistos obtidos (%) Valor de P CG - Granulação citoplasmática 38,4 0,996 CL - Granulação citoplasmática centralizada 38,1 0,891 RE - Acúmulo de Retículo endoplasmático liso 48,8 0,017 Variáveis qualitativas - Dismorfismos oocitários alteração ausente 38,2 VAC - Presença de vacúolos 33,5 0,083 Alteração de pelo menos um parâmetro intracitoplasmático 38,4 0,830 DB - Presença de debris no espaço perivitelíneo 40,5 0,005 alteração ausente 36,9 ZP - Alteração de zona pelúcida 38,1 0,915 EP - Espaço perivitelíneo aumentado 33,5 0,001 alteração ausente CP frag - Corpúsculo polar fragmentado 39,3 40,5 alteração ausente 0,019 37,4 FORMA - Alteração de forma 33,6 0,296 Alteração de pelo menos um parâmetro extracitoplasmático 39,7 0,006 alteração ausente Alteração de pelo menos um parâmetro intra ou extracitoplasmático 36,0 38,5 0,747 Nota: Teste estatístico aplicado – Qui-quadrado. Foram observadas taxas de formação de blastocistos significativamente maiores para embriões provenientes de oócitos cujas seguintes alterações de morfologia oocitária estavam presentes: acúmulo de REL (48,8% vs 38,2%, p=0,017), presença de debris no EPV (40,5% vs 36,9%, p=0,005), fragmentação do 1o CP (40,5% vs 37,4%, p=0,019) e detecção de alteração de pelo menos um dos parâmetros extracitoplasmáticos (39,7% vs 36,0%, p=0,006). Por outro lado, para o parâmetro extracitoplasmático aumento do EPV uma menor taxa de blastocistos foi observada para oócitos cuja alteração estava presente (33,5% vs 39,3%, p=0,001). Não houve associação estatística significativa entre a presença dos seguintes dismorfismos e a taxa de formação de blastocistos: granulação citoplasmática, granulação citoplasmática centralizada, 50 presença de VAC, alteração de ZP, alteração de forma, presença de pelo menos um parâmetro intracitoplasmático ou presença de pelo menos um parâmetro intra ou extracitoplasmático. 4.2.3) Morfologia pronuclear Parâmetros de morfologia pronuclear avaliados no dia 1 do desenvolvimento foram avaliados e registrados para todos os 5850 zigotos obtidos após a ICSI. As incidências das possíveis alterações do padrão normal de morfologia pronuclear foram descritas na tabela abaixo (Tab. 14). TABELA 14: Descrição da incidência das alterações do padrão de morfologia pronuclear avaliadas no presente estudo. Morfologia pronuclear Incidência (%) Alteração de tamanho de PN 7,6 Ocorrência de PN periféricos 5,2 Ocorrência de PN afastados 4,3 Ocorrência de alteração de número de CPN 3,9 Ocorrência de alteração de polarização de CPN 22,5 Alteração na formação do halo citoplasmático 20,4 Detecção de vacúolos em estágio de 2PN 16,4 Padrão anormal de morfologia pronuclear 37,4 PN= Pronúcleo(s), CPN= Corpos precursores de nucléolos Alterações do padrão de morfologia do PN propriamente dito, incluindo a alteração no tamanho ou na disposição (periféricos ou afastados) dessa organela não apresentaram incidência superior a 10% dos zigotos obtidos. Por outro lado, alterações na organização dos CPN durante a nucleogênese foram observadas em 22,5% dos embriões em estágio de 2PN. Cabe ressaltar que a detecção de alteração no padrão normal de morfologia pronuclear estava presente em 37,4% dos embriões avaliados. 51 Os dados de presença ou ausência de alterações no padrão normal de morfologia pronuclear foram submetidos à análise estatística para estudo do possível valor preditivo destes parâmetros na taxa de obtenção de blastocistos. Os resultados obtidos foram resumidos na Tab. 15. As taxas de formação de blastocisto descritas correspondem àquelas observadas para zigotos nos quais as alterações foram detectadas. Nos casos em que houve uma diferença significativa (p<0,05) para a taxa de formação de blastocisto ou ainda para aqueles casos em que o valor de p foi não significante, porém <0,2, foram apresentadas também as taxas de formação de blastocisto para zigotos nos quais as alterações não foram detectadas. TABELA 15: Taxa de formação de blastocisto de acordo com a alteração do padrão de morfologia pronuclear detectado nos zigotos obtidos após a ICSI. Variáveis qualitativas - Morfologia pronuclear Taxa de blastocistos obtidos (%) Valor de P 31,8 0,003 Alteração de tamanho de PN alteração ausente Ocorrência de PN periféricos 39,0 31,9 alteração ausente Ocorrência de PN afastados 38,8 33,3 alteração ausente Ocorrência de alteração de número de CPN alteração ausente 0,017 0,092 38,7 27,9 0,154 38,5 Ocorrência de alteração de polarização de CPN 39,5 0,368 Alteração na formação do halo citoplasmático 42,5 0,002 alteração ausente 37,4 Incidência de vacúolos em estágio de 2PN 38,5 0,943 Incidência do padrão anormal de morfologia pronuclear 36,8 0,050 alteração ausente Nota: Teste estatístico aplicado – Qui-quadrado. PN= Pronúcleo(s), CPN= Corpos precursores de nucléolos 39,4 52 Dentre as diferenças significativas observadas, os seguintes parâmetros apresentaram uma menor taxa de blastocistos obtidos quando detectados nos zigotos avaliados: alteração de tamanho de PN (31,8% vs 39,0%, p=0,003); detecção de PN periféricos no momento da avaliação (31,9% vs 38,8%, p=0,017) e detecção de padrão pronuclear anormal (36,8% vs 39,4%, p=0,050). A alteração do parâmetro formação do halo citoplasmático resultou na obtenção de uma maior taxa de blastocistos formados (39,4% vs 36,8%, p=0,002). A detecção de PN afastados (33,3% vs 38,7%, p=0,092) e de alteração no número de CPN (27,9% vs 38,5%, p=0,154) também resultaram em menor taxa de formação de blastocisto, porém não houve diferença significativa. As variáveis alteração da polarização dos CPN e presença de vacúolos também não demonstraram associação estatística significativa com a taxa de formação de blastocistos. 4.2.4) Morfologia do dia 2 do desenvolvimento embrionário Parâmetros de morfologia embrionária avaliados no dia 2 do desenvolvimento foram avaliados e registrados para todos os 5850 embriões obtidos após a ICSI. O perfil dos embriões obtidos, de acordo com os parâmetros avaliados, pode ser observado na tabela abaixo (Tab. 16). Os dados correspondem à incidência de embriões observados para os diferentes padrões descritos para os critérios: ritmo de clivagem; simetria de tamanho de blastômeros, fragmentação citoplasmática; multinucleação e ausência de núcleo. 53 TABELA 16: Descrição das características dos embriões de acordo com os critérios de morfologia embrionária avaliados para o dia 2 do desenvolvimento. Morfologia embrionária - Parâmetros dia 2 Incidência (%) Ritmo de clivagem Ritmo normal de clivagem 71,2 Ritmo lento de clivagem 15,3 Ritmo rápido de clivagem 13,5 Ausência de clivagem 1,1 Compactação precoce 0,1 Simetria de tamanho de blastômeros Blastômeros simétricos ou semelhantes 46,6 Fragmentação citoplasmática Ocorrência de fragmentação comprometendo até 10% do volume do embrião (≠ de tipo IV) 95,3 Multinucleação / Ausência de núcleo Multinucleação presente 22,9 Multinucleação comprometendo mais de 25% dos blastômeros do embrião 61,8 Ausência de núcleo 22,7 Núcleo ausente em mais de 25% dos blastômeros do embrião 70,5 Ritmo normal de clivagem, presença de blastômeros simétricos ou semelhantes e detecção de fragmentos anucleados comprometendo até 10% do volume do embrião foram observados em, respectivamente, 71,2%, 46,6% e 95,3% dos embriões. Considerando-se os critérios discutidos podemos afirmar que, de modo geral, mais de 50% dos embriões obtidos poderiam ser classificados como embriões de boa qualidade para o dia 2 do desenvolvimento. A detecção de blastômeros multinucleados ou de blastômeros com ausência de núcleo no momento da observação correspondeu a 22,9% e 22,7% dos embriões avaliados. Por outro lado, dentre os embriões que apresentaram a alterações destes critérios, a multinucleação e a ausência de núcleo foi detectada em mais de 25% dos blastômeros do embrião em 61,8% e em 70,5% dos casos, respectivamente. Variáveis qualitativas (Tab. 17) e quantitativas (Tab. 18) correspondentes aos padrões de morfologia embrionária do dia 2 do desenvolvimento foram avaliadas quanto ao possível valor preditivo na taxa de obtenção de blastocistos. 54 TABELA 17: Taxa de formação de blastocisto de acordo com os critérios morfológicos avaliados nos embriões em dia 2 do desenvolvimento. Variáveis qualitativas - Morfologia do dia 2 do desenvolvimento Taxa de blastocistos obtidos (%) Valor de P Ritmo de clivagem Ritmo lento de clivagem 16,9 Ritmo normal de clivagem 47,3 Ritmo rápido de clivagem 20,8 Ritmo lento ou rápido de clivagem 18,7 Ritmo normal de clivagem 47,3 <0,001 <0,001 Simetria de tamanho de blastômeros Blastômeros assimétricos 30,8 Blastômeros simétricos ou semelhantes 48,6 <0,001 Fragmentação citoplasmática Ausência de fragmentação 43,2 Ocorrência de fragmentação de tipo II 37,0 Ocorrência de fragmentação de tipo III 36,2 Ocorrência de fragmentação de tipo IV 5,4 Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 10% do volume do embrião (≠ de tipo IV) 40,5 Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo de 10% a 35% do volume do embrião (≠ de tipo IV) 16,2 Ocorrência de fragmentação de tipo IV 5,4 <0,001 <0,001 Multinucleação Multinucleação presente em pelo menos um dos blastômeros do embrião 22,1 Multinucleação ausente 43,9 Multinucleação presente, porém mais de 2 núcleos detectados em um mesmo blastômero 15,0 Multinucleação presente, porém até 2 núcleos detectados em um mesmo blastômero 28,8 Multinucleação comprometendo mais de 25% dos blastômeros do embrião 13,9 Multinucleação comprometendo até 25% dos blastômeros do embrião 35,5 <0,001 <0,001 <0,001 Ausência de núcleo Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião 28,6 Núcleo presente em todos os blastômeros do embrião 41,3 Núcleo ausente em mais de 25% dos blastômeros do embrião 25,5 Núcleo ausente em até de 25% dos blastômeros do embrião 36,1 Nota: Teste estatístico aplicado – Qui-quadrado. <0,001 <0,001 55 Podemos observar que para todos os critérios avaliados no dia 2 do desenvolvimento embrionário houve uma diferença significativa (p<0,001) entre a taxa de formação de blastocistos quando detectados padrões de normalidade ou anormalidade para as categorias previamente definidas. Em todos os casos observamos uma queda significativa na formação de blastocistos para embriões de dia 2 nos quais os padrões observados foram de anormalidade do critério avaliado como: ritmo anormal de clivagem; assimetria de blastômeros; detecção de fragmentos anucleados; presença de multinucleação e presença de blastômeros anucleados. Além disso, o agravamento do padrão de anormalidade como, por exemplo, um maior comprometimento do volume embrionário pela presença de fragmentos anucleados, uma maior incidência de blastômeros multinucleados e/ou anucleados foram determinantes para uma queda significativa da taxa de obtenção de blastocistos dentre os embriões nos quais tais alterações estavam presentes. Corroborando os dados obtidos na avaliação qualitativa dos critérios divididos em categorias, a avaliação de variáveis quantitativas demonstrou uma diferença significativa para o número de células do embrião em dia 2, o número de blastômeros multinucleados e a porcentagem de blastômeros comprometidos pela multinucleação. O grupo de embriões que atingiu a classificação de blastocisto quando cultivado até o dia 5 do desenvolvimento apresentou no dia 2 do seu desenvolvimento em sua maioria 4 células em média, um menor número de blastômeros multinucleados e uma menor porcentagem de blastômeros comprometidos pela multinucleação quando presente (Tab. 18). A avaliação quantitativa dos critérios número e porcentagem de blastômeros anucleados não apresentou diferença significativa entre os grupos Blastocisto (N) ou (S), sendo este último menor para o grupo de embriões que atingiram o estágio de blastocisto (49,6% vs 50,3%, p=0,1036). 56 TABELA 18: Descrição das características correspondentes aos padrões de morfologia embrionária do dia 2 do desenvolvimento, de acordo com a classificação do embrião no dia 5 do desenvolvimento. Média (+DP) Variáveis quantitativas - Morfologia do dia 2 do desenvolvimento Grupo A Blastocisto (N) Grupo B Blastocisto (S) Valor de P No de células 4,1 (1,7) 4,1 (0,9) 0,0053 No de blastômeros multinucleados 1,4 (0,6) 1,3 (0,6) 0,0017 % de blastômeros multinucleados 47,5 (26,5) 37,5 (23,5) <0,001 No de blastômeros sem núcleo 1,7 (0,8) 1,7 (0,8) 0,7553 % de blastômeros sem núcleo 50,3 (27,3) 49,6 (30,2) 0,1063 Nota: Teste estatístico aplicado – Mann-Whitney. 4.2.5) Morfologia do dia 3 do desenvolvimento embrionário Parâmetros de morfologia embrionária avaliados no dia 3 do desenvolvimento foram avaliados e registrados para todos os 5850 embriões obtidos após a ICSI. O perfil dos embriões obtidos, de acordo com os parâmetros avaliados, pode ser observado na tabela abaixo (Tab. 19). Os dados correspondem à incidência de embriões observados para os diferentes padrões descritos para os critérios: ritmo de clivagem; simetria de tamanho de blastômeros, fragmentação citoplasmática; multinucleação e ausência de núcleo. 57 TABELA 19: Descrição das características dos embriões de acordo com os critérios de morfologia embrionária avaliados para o dia 3 do desenvolvimento. Morfologia embrionária - Parâmetros dia 3 Incidência (%) Ritmo de clivagem Ritmo normal de clivagem 57,4 Ritmo lento de clivagem 22,9 Ritmo rápido de clivagem 12,5 Parada de clivagem ou Clivagem de 1 célula em 24 horas 6,2 Embrião compacto 1,0 Simetria de tamanho de blastômeros Blastômeros simétricos ou semelhantes 30,7 Fragmentação citoplasmática Ocorrência de fragmentação até 10% do volume do embrião (≠ de tipo IV) 92,9 Multinucleação / Ausência de núcleo Multinucleação presente 11,2 Multinucleação comprometendo mais de 25% dos blastômeros do embrião 23,5 Ausência de núcleo 16,8 Núcleo ausente mais de 25% dos blastômeros do embrião 34,6 Ritmo normal de clivagem, presença de blastômeros simétricos ou semelhantes e detecção de fragmentos anucleados comprometendo até 10% do volume do embrião foram observados em, respectivamente, 57,4%, 30,7% e 92,9% dos embriões. Considerando-se os critérios discutidos podemos afirmar que, de modo geral, menos de 50% dos embriões obtidos poderiam ser classificados como embriões de boa qualidade para o dia 3 do desenvolvimento, diferente do previamente observado para o dia 2 do desenvolvimento. A detecção de blastômeros multinucleados ou de blastômeros com ausência de núcleo no momento da observação correspondeu a 11,2% e 16,8% dos embriões avaliados. Por outro lado, dentre os embriões que apresentaram a alterações destes critérios, a multinucleação e a ausência de núcleo foi detectada em mais de 25% dos blastômeros do embrião em 23,5% e em 34,6% dos casos, respectivamente. 58 Variávies qualitativas (Tab. 20) e quantitativas (Tab. 21) correspondentes aos padrões de morfologia embrionária do dia 3 do desenvolvimento foram avaliadas quanto ao possível valor preditivo na taxa de obtenção de blastocistos. Da mesma forma que o observado anteriormente para a classificação do dia 2, houve uma diferença significativa (p<0,001) entre a taxa de formação de blastocistos para todos os critérios avaliados no dia 3 do desenvolvimento embrionário (Tab. 20). Em todos os casos observamos uma queda significativa na formação de blastocistos para embriões de dia 3 nos quais os padrões observados foram de anormalidade do critério avaliado como: ritmo anormal de clivagem; assimetria de blastômeros; detecção de fragmentos anucleados; presença de multinucleação e presença de blastômeros anucleados. Além disso, mais uma vez o agravamento do padrão de anormalidade como, por exemplo, um maior comprometimento do volume embrionário pela presença de fragmentos anucleados, uma maior incidência de blastômeros multinucleados e/ou anucleados foram determinantes para uma queda significativa da taxa de obtenção de blastocistos dentre os embriões nos quais tais alterações estavam presentes. 59 TABELA 20: Taxa de formação de blastocisto de acordo com os critérios morfológicos avaliados nos embriões em dia 3 do desenvolvimento. Variáveis qualitativas - Morfologia do dia 3 do desenvolvimento Taxa de blastocistos obtidos (%) Valor de P Ritmo de clivagem Ritmo lento de clivagem 14,8 Ritmo normal de clivagem 51,1 Ritmo rápido de clivagem 37,8 Parada de clivagem ou Clivagem de 1 célula em 24 horas 6,6 Embrião compacto 65,5 Ritmo lento ou rápido de clivagem 22,9 Ritmo normal de clivagem 51,1 Parada de clivagem ou Clivagem de 1 célula em 24 horas 6,6 Embrião compacto 65,5 <0,001 <0,001 Simetria de tamanho de blastômeros Blastômeros assimétricos 32,2 Blastômeros simétricos ou semelhantes 52,9 <0,001 Fragmentação citoplasmática Ausência de fragmentação 43,5 Ocorrência de fragmentação de tipo II 33,4 Ocorrência de fragmentação de tipo III 37,1 Ocorrência de fragmentação de tipo IV 9,4 Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 10% do volume do embrião (≠ de tipo IV) Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo de 10% a 35% do volume do embrião (≠ de tipo IV) Ocorrência de fragmentação de tipo IV <0,001 40,3 18,2 <0,001 9,4 Multinucleação Multinucleação presente em pelo menos um dos blastômeros do embrião 22,6 Multinucleação ausente 40,6 Multinucleação presente, porém mais de 2 núcleos detectados em um mesmo blastômero 14,9 Multinucleação presente, porém até 2 núcleos detectados em um mesmo blastômero 26,8 Multinucleação comprometendo mais de 25% dos blastômeros do embrião 11,1 Multinucleação comprometendo até 25% dos blastômeros do embrião 26,2 <0,001 <0,001 <0,001 Ausência de núcleo Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião 30,8 Núcleo presente em todos os blastômeros do embrião 40,0 Núcleo ausente em mais de 25% dos blastômeros do embrião 22,5 Núcleo ausente em até de 25% dos blastômeros do embrião 35,5 Nota: Teste estatístico aplicado – Qui-quadrado. <0,001 <0,001 60 Corroborando os dados obtidos na avaliação qualitativa dos critérios divididos em categorias, a avaliação de variáveis quantitativas demonstrou uma diferença significativa para o número de células do embrião em dia 3, o número de blastômeros multinucleados e a porcentagem de blastômeros comprometidos pela multinucleação. O grupo de embriões que atingiu a classificação de blastocisto quando cultivado até o dia 5 do desenvolvimento apresentou no dia 3 do seu desenvolvimento em sua maioria 8 células em média, um menor número de blastômeros multinucleados e uma menor porcentagem de blastômeros comprometidos pela multinucleação quando presente, bem como um menor número de blastômeros anucleados e uma menor porcentagem de blastômeros com ausência de núcleo (Tab. 21). TABELA 21: Descrição das características correspondentes aos padrões de morfologia embrionária do dia 3 do desenvolvimento, de acordo com a classificação do embrião no dia 5 do desenvolvimento. Média (+DP) Variáveis quantitativas - Morfologia do dia 3 do desenvolvimento Grupo A Blastocisto (N) Grupo B Blastocisto (S) Valor de P No de células 7,2 (2,2) 8,1 (1,5) <0,001 No de blastômeros multinucleados 1,4 (0,6) 1,2 (0,5) 0,0313 % de blastômeros multinucleados 25,5 (18,1) 17,4 (7,7) <0,001 No de blastômeros sem núcleo 1,8 (1,0) 1,6 (0,8) 0,0453 % de blastômeros sem núcleo 27,8 (15,8) 21,6 (13,1) <0,001 Nota: Teste estatístico aplicado – Mann-Whitney. 4.2.6) Obtenção de um modelo de regressão logística binária Com o objetivo de determinar a influência dos parâmetros morfológicos na determinação da viabilidade embrionária, avaliada neste caso como a formação de blastocisto no dia 5 do desenvolvimento, análises de regressão logística binária múltipla foram realizadas. Considerando-se os resultados obtidos na análise bivariada, 43 possíveis fatores preditivos foram inseridos na determinação do modelo. 61 Encontram-se na Tab. 22 as 14 variáveis definidas como preditoras da formação de blastocisto com o uso da regressão logística binária múltipla. TABELA 22: Critérios selecionados pelo modelo de regressão logística binária múltipla como preditores da obtenção de embriões em estágio de blastocisto quando cultivados até o dia 5 do desenvolvimento. Ordem de entrada da variável no modelo Variáveis selecionadas pelo modelo 8 Idade da mulher 11 10 Coeficiente da Razão de chance Intervalo de confiança variável na Valor de P (OR) (IC 95%) equação -0.042 0,959 0,943-0,975 Taxa média de oócitos recuperados (%) -0.006 0,994 0,990-0,998 0,003 EP - Espaço perivitelíneo aumentado -0.403 0,668 0,556-0,804 <0,001 Ritmo lento de clivagem (dia 2) -0.497 0,608 0,474-0,780 <0,001 Ritmo rápido de clivagem (dia 2) -1.048 0,351 0,271-0,453 <0,001 3 Blastômeros assimétricos (dia 2) -0.412 0,663 0,568-0,773 <0,001 14 Multinucleação presente, porém mais de 2 núcleos detectados em um mesmo blastômero (dia 2) -0.415 0,660 0,464-0,939 0,021 4 Multinucleação comprometendo mais de 25% dos blastômeros do embrião (dia 2) -0.579 0,560 0,392-0,801 0,001 5 Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião (dia 2) -0.479 0,619 0,525-0,730 <0,001 N de células (dia 3) 0.218 1,244 1,145-1,351 <0,001 Ritmo lento de clivagem (dia 3) -0.765 0,465 0,351-0,616 <0,001 Ritmo rápido de clivagem (dia 3) -0.685 0,504 0,370-0,687 <0,001 Blastômeros assimétricos (dia 3) -0.392 0,676 0,575-0,795 <0,001 Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 10% do volume do embrião (≠ de tipo IV) (dia 3) -0.844 0,430 0,261-0,709 0,001 Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 20% do volume do embrião (≠ de tipo IV) (dia 3) -1.264 0,283 0,155-0,514 <0,001 2 6 1 7 9 o o <0,001 12 N de blastômeros multinucleados (dia 3) -0.24 0,786 0,663-0,933 0,006 13 No de blastômeros sem núcleo (dia 3) -0.116 0,891 0,815-0,973 0,010 62 A razão de chance ou probabilidade de formação de blastocistos encontra-se listada na tabela acima para cada variável definida como preditora independente. Além disso, estão listados acima os coeficientes de cada uma destas variáveis na equação matemática definida pelo modelo, a qual permite que para cada embrião seja obtida uma probabilidade de formação de blastocisto com base na soma de valores obtida para os critérios avaliados: = 0,882 (Constante) + (-0,042 x Idade da mulher) + (-0,006 x Taxa média de oócitos recuperados) + (-0,403 x Espaço Perivitelineo aumentado (Sim=1 e Não=0)) + (-0,497 x Ritmo lento de clivagem em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-1,048 x Ritmo rápido de clivagem em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,412 x Blastômeros assimétricos em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,415 x Multinucleação presente, porém mais de 2 núcleos detectados em pelo menos um dos blastômeros do embrião em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,579 x Multinucleação presente, comprometendo mais de 25% dos blastômeros do embrião em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,479 x Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (0,218 x Número de células em dia 3 do desenvolvimento) + (-0,765 x Ritmo lento de clivagem em dia 3 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0.685 x Ritmo rápido de clivagem em dia 3 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,392 x Blastômeros assimétricos em dia 3 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,844 x Ausência ou Presença de Fragmentos anucleados comprometendo até 10% do volume do embrião em dia 3 (Sim=1 e Não=0)) + (-1,264 x Ausência ou Presença de Fragmentos anucleados comprometendo até 20% do volume do embrião em dia 3 (Sim=1 e Não=0)) + (-0,240 x Multinucleação presente em pelo menos um dos blastômeros do embrião em dia 3 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (0,116 x Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião em dia 3 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)). A predição do modelo obteve uma taxa de acerto de 71,7%. Além disso, considerando-se um ponto de corte de 50% na chance de formação ou não do blastocisto o modelo obteve uma sensibilidade de 63,8% e especificidade de 76,9% (Fig. 3). 63 Figura 3: Curva ROC para o modelo taxa de formação de blastocistos. A área sob a curva foi 0,780. 64 4.3) Objetivo 2 – Valor preditivo de critérios morfológicos oocitários e embrionários avaliados nos dias 1, 2 e 3 do desenvolvimento no potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto. Dentre os 1639 embriões transferidos foram incluídos nesta análise 767 embriões sendo 618 embriões provenientes de ciclos com 0% de implantação e 149 embriões provenientes de ciclos com 100% de implantação. 4.3.1) Dados descritivos Variáveis quantitativas (Tab. 23) e qualitativas (Tab. 24) correspondentes ao perfil das pacientes submetidas ao tratamento e ao perfil de resposta clínica e laboratorial foram avaliadas quanto ao possível valor preditivo no potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto. Dentre as diferenças significativas observadas, os seguintes parâmetros apresentaram um valor médio menor para o grupo de embriões que implantaram após transferência: média de idade da mulher (32,3+4,1 vs 34,4+3,9; p<0,001); média de idade do homem (35,3+5,4 vs 37,3+5,4; p<0,001) e número médio de UI de FSH administradas (2179+614 vs 2279+642; p=0,031) (Tab. 23). Para nenhuma outra variável quantitativa descrita na Tabela houve associação estatística significativa com a ocorrência ou não de implantação embrionária 65 TABELA 23: Descrição das características dos casais e de seus ciclos de tratamento de RHA de acordo com a taxa de implantação dos embriões transferidos em estágio de blastocisto. Média (+DP) Variáveis quantitativas - Perfil geral dos ciclos de ICSI Grupo A Implantação 0% Grupo B Implantação 100% Valor de P Idade mulher 34,4 (3,9) 32,3 (4,1) <0,001 Idade homem 37,3 (5,4) 35,3 (5,4) <0,001 FSH (UI) 2279 (642) 2179 (614) 0,031 E2 (pg/mL) 2319 (1593) 2717 (1942) 0,108 Concentração seminal (10 /mL) 40,8 (37,8) 33,3 (27,3) 0,252 Motilidade total (%) 55,5 (17,7) 53,6 (17,5) 0,090 Motilidade progressiva (%) 41,8 (17,2) 39,3 (15,9) 0,114 No de folículos puncionados 22,1 (11,3) 21,6 (9,8) 0,809 No de oócitos recuperados 15,8 (8,1) 15,9 (7,5) 0,591 Taxa média de oócitos recuperados (%) 73,4 (17,4) 75,5 (17,7) 0,151 No de oócitos em grau de maturação nuclear MII 11,9 (6,1) 12,0 (6,0) 0,758 Taxa média de MII (%) 77,1 (15,7) 76,3 (13,8) 0,474 No de oócitos injetados 11,2 (5,2) 10,9 (4,8) 0,730 Taxa média de oócitos injetados (%) 75,1 (18,4) 72,4 (18,9) 0,146 8,8 (4,3) 8,6 (4,1) 0,845 79,6 (15,6) 79,9 (17,8) 0,318 6 o N de oócitos com fertilização normal (2PN) Taxa média de 2PN (%) Nota: Teste estatístico aplicado – Mann-Whitney. Utilizando a classificação de variáveis qualitativas que caracterizam a população do estudo, as variáveis idade da mulher e idade do homem destacam-se novamente como possíveis interferentes do potencial de implantação de blastocistos. Mulheres com idade menor ou igual a 37 anos apresentaram uma taxa de implantação dos blastocistos transferidos de 22,5%, significativamente maior do que a observada para pacientes com idade igual ou superior a 38 anos, que foi de 9,1% (p<0,001), para os homens as taxas obtidas foram de 22,4% e 15,6%, respectivamente, com p=0,023 (Tab. 24). A estratégia de bloqueio hipofisário, o tipo de gonadotrofina aplicada para EOC, o diagnóstico clínico de endometriose, a concentração e 66 motilidade seminal total não apresentaram associação estatística significativa com a taxa de implantação embrionária. TABELA 24: Taxa de implantação dos blastocistos transferidos de acordo com as características dos casais e de seus ciclos de tratamento de RHA. Variáveis qualitativas - Perfil geral dos ciclos de ICSI Taxa de implantação embrionária (%) Valor de P Idade da mulher <37a >38a 22,5 9,1 <0,001 Idade do homem <37a >38a 22,4 15,6 0,023 Bloqueio hipofisário GnRH agonista GnRH antagonista 16,9 19,7 0,587 Estímulo ovariano controlado FSH urinário FSH recombinante 16,0 19,8 0,515 Fator de infertilidade Endometriose (N) Endometriose (S) 19,4 19,4 0,998 Perfil seminal Concentração inicial >15 (106 /mL) 19,6 <15 (106 /mL) Motilidade total >40% <40% Motilidade progressiva >32% <32% 18,7 Nota: Teste estatístico aplicado – Qui-quadrado. 0,783 18,5 22,5 0,309 19,6 18,0 0,638 67 4.3.2) Morfologia oocitária Os dados de presença ou a ausência dos dismorfismos oocitários avaliados foram submetidos à análise estatística para estudo do possível valor preditivo destes parâmetros no potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto. Os resultados obtidos foram resumidos na Tab. 25. As taxas de implantação embrionária descritas correspondem àquelas observadas para embriões provenientes de oócitos nos quais as alterações foram detectadas. Nos casos em que houve uma diferença significativa (p<0,05) para a taxa de implantação entre oócitos nos quais as alterações estavam ou não presentes foram relatadas também as taxas de implantação obtidas na ausência das alterações. TABELA 25: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com o dismorfismo oocitário detectado no oócito submetido à ICSI. Taxa de implantação embrionária (%) Valor de P CG - Granulação citoplasmática 19,0 0,204* CL - Granulação citoplasmática centralizada 25,4 0,226* RE - Acúmulo de Retículo endoplasmático liso 0,0 0,012 + Variáveis qualitativas - Dismorfismos oocitários alteração ausente 20,0 VAC - Presença de vacúolos 19,2 0,326* Alteração de pelo menos um parâmetro intracitoplasmático 19,0 0,168* DB - Presença de debris no espaço perivitelíneo 20,5 0,448* ZP - Alteração de zona pelúcida 7,4 0,108* alteração ausente 19,9 EP - Espaço perivitelíneo aumentado 18,1 0,711* CP frag - Corpúsculo polar fragmentado 18,1 0,469* FORMA - Alteração de forma 22,2 0,689+ Alteração de pelo menos um parâmetro extracitoplasmático 19,5 0,963* Alteração de pelo menos um parâmetro intra ou extracitoplasmático 19,5 1,0+ Nota: Teste estatístico aplicado – *Qui-quadrado ou +Exato de Fisher. A transferência de embriões em estágio de blastocisto provenientes de oócitos nos quais foi detectada a presença de agregados de REL resultou em falha total de implantação (taxa de 68 implantação de 0%), sendo de 20% a taxa de implantação obtida na ausência de detecção desta alteração no dia 0 do desenvolvimento embrionário (p=0,012). A detecção de nenhum outro dismorfismo oocitário apresentou associação estatística significativa com a taxa de implantação embrionária. Apesar da reduzida taxa de implantação de blastocistos provenientes de oócitos com alteração de zona pelúcida (7,4%), não houve diferença significativa quando comparada a taxa de implantação (19,9%) obtida na ausência desta alteração oocitária (p=0,108). 4.3.3) Morfologia pronuclear Os dados de detecção ou ausência de alterações no padrão normal de morfologia pronuclear foram submetidos à análise estatística para estudo do possível valor preditivo destes parâmetros no potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto. Os resultados obtidos foram resumidos na Tab. 26. As taxas de implantação embrionária descritas correspondem àquelas observadas para zigotos nos quais as alterações foram detectadas. Nos casos em que o valor de p foi não significante, porém a diferença entre as taxas foi considerada relevante, foram apresentadas também as taxas de implantação para blastocistos provenientes de zigotos nos quais as alterações não foram detectadas. 69 TABELA 26: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com a alteração do padrão de morfologia pronuclear detectado nos zigotos obtidos após a ICSI. Variáveis qualitativas - Morfologia pronuclear Taxa de implantação embrionária (%) Valor de P 10,0 0,183* Alteração de tamanho de PN alteração ausente Ocorrência de PN periféricos 19,8 14,3 alteração ausente Ocorrência de PN afastados 19,6 15,4 alteração ausente Ocorrência de alteração de número de CPN alteração ausente 0,484* 0,596* 19,6 0,0 1,0+ 19,5 Ocorrência de alteração de polarização de CPN 16,9 0,107* Alteração na formação do halo citoplasmático 16,5 0,232* alteração ausente 20,4 Incidência de vacúolos em estágio de 2PN 20,0 0,863* Incidência do padrão anormal de morfologia pronuclear 21,8 0,272* Nota: Teste estatístico aplicado – *Qui-quadrado ou +Exato de Fisher. PN= Pronúcleo(s), CPN= Corpos precursores de nucléolos Nenhuma das variáveis apresentou diferença significativa para a taxa de implantação de blastocistos provenientes de zigotos nos quais alterações nos parâmetros de morfologia pronuclear haviam ou não sido detectados, apesar de terem sido observadas diferenças relevantes nos valores obtidos. Cabe destacar a queda da taxa de implantação de blastocistos provenientes de zigotos nos quais havia sido detectada alteração de tamanho de PN (10,0% vs 19,8%, p=0,183). Dada à relevância desta informação, bem como o fato de o nível de significância ser <0,2, o valor preditivo da variável poderá ser avaliado no ajuste do modelo de regressão logística. 70 4.3.4) Morfologia do dia 2 do desenvolvimento embrionário Variáveis qualitativas (Tab. 27) e quantitativas (Tab. 28) correspondentes aos padrões de morfologia embrionária do dia 2 do desenvolvimento foram avaliadas quanto ao possível valor preditivo no potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto. Podemos observar que houve uma diferença significativa para a taxa de implantação de blastocistos quando detectados padrões de normalidade ou anormalidade, segundo as categorias previamente definidas, para os seguintes critérios do dia 2 do desenvolvimento embrionário: ritmo de clivagem, detecção de fragmentos anucleados; presença de multinucleação e presença de blastômeros anucleados. Apesar da redução observada para implantação de blastocistos que apresentaram blastômeros assimétricos em dia 2 (16,1% vs 21,2%, p=0,084), não houve diferença estatística significativa (Tab. 27). No entanto, dada a relevância desta informação, bem como o fato de o nível de significância ser <0,2, o valor preditivo da variável poderá ser avaliado no ajuste do modelo de regressão logística. O agravamento do padrão de anormalidade com relação ao número de núcleos detectados e a incidência de blastômeros multinucleados não foi determinante de uma queda significativa na taxa de implantação de blastocistos para os quais a multinucleação havia sido detectada. No entanto, as diferenças observadas podem ser consideradas relevantes sendo de 8,5% a taxa de implantação para embriões multinucleados nos quais foram detectados até 2 núcleos em um mesmo blastômero e de 0% para os quais houve detecção de mais de 2 núcleos (p=0,291). Observamos ainda uma taxa de implantação de 7,0% para embriões multinucleados nos quais até 25% dos blastômeros estavam comprometidos e de 3,4% para os quais houve comprometimento de mais de 25% dos blastômeros (p=0,644). 71 TABELA 27: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com os critérios morfológicos detectados nos embriões em dia 2 do desenvolvimento. Variáveis qualitativas - Morfologia do dia 2 do desenvolvimento Taxa de implantação embrionária (%) Valor de P Ritmo de clivagem Ritmo lento de clivagem 8,7 Ritmo normal de clivagem 20,5 Ritmo rápido de clivagem 4,0 Ritmo lento ou rápido de clivagem 7,0 Ritmo normal de clivagem 20,5 0,021 * 0,006 * Simetria de tamanho de blastômeros Blastômeros assimétricos 16,1 Blastômeros simétricos ou semelhantes 21,2 0,084* Fragmentação citoplasmática Ausência de fragmentação 22,2 Ocorrência de fragmentação de tipo II 14,5 Ocorrência de fragmentação de tipo III 16,9 Ocorrência de fragmentação de tipo IV - Ausência de fragmentação 22,2 Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 10% do volume do embrião (≠ de tipo IV) 15,5 Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 20% do volume do embrião (≠ de tipo IV) 15,7 0,064* 0,022 * Multinucleação Multinucleação presente em pelo menos um dos blastômeros do embrião 5,6 Multinucleação ausente 20,9 Multinucleação presente, porém mais de 2 núcleos detectados em um mesmo blastômero 0,0 Multinucleação presente, porém até 2 núcleos detectados em um mesmo blastômero 8,5 Multinucleação comprometendo mais de 25% dos blastômeros do embrião 3,4 Multinucleação comprometendo até 25% dos blastômeros do embrião 7,0 0,002 * 0,291+ 0,644 + 0,029 * Ausência de núcleo Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião 11,5 Núcleo presente em todos os blastômeros do embrião 20,7 Núcleo ausente em mais de 25% dos blastômeros do embrião 13,8 Núcleo ausente em até de 25% dos blastômeros do embrião 7,7 Nota: Teste estatístico aplicado – *Qui-quadrado ou +Exato de Fisher. 0,528+ 72 Não houve diferença significativa para as variáveis quantitativas de classificação dos embriões no dia 2 do desenvolvimento entre o grupo de embriões que implantaram com relação àqueles que não implantaram (Tab.28). TABELA 28: Descrição das características correspondentes aos padrões de morfologia embrionária do dia 2 do desenvolvimento, de acordo com a taxa de implantação dos embriões transferidos em estágio de blastocisto. Média (+DP) Variáveis quantitativas - Morfologia do dia 2 do desenvolvimento Grupo A Implantação 0% Grupo B Implantação 100% Valor de P No de células 4,0 (0,8) 4,0 (0,5) 0,9242 No de blastômeros multinucleados 1,3 (0,6) 1,2 (0,5) 0,9510 % de blastômeros multinucleados 39,5 (24,8) 35,4 (20,8) 0,8634 No de blastômeros sem núcleo 1,5 (0,7) 2,0 (0,7) 0,0571 % de blastômeros sem núcleo 49,1 (30,5) 55,4 (26,7) 0,2545 Nota: Teste estatístico aplicado – Mann-Whitney. 4.3.5) Morfologia do dia 3 do desenvolvimento embrionário Variáveis qualitativas (Tab. 29) e quantitativas (Tab. 30) correspondentes aos padrões de morfologia embrionária do dia 3 do desenvolvimento foram avaliadas quanto ao possível valor preditivo no potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto. 73 TABELA 29: Taxa de implantação embrionária dos blastocistos transferidos de acordo com os critérios morfológicos detectados nos embriões em dia 3 do desenvolvimento. Variáveis qualitativas - Morfologia do dia 3 do desenvolvimento Taxa de implantação embrionária (%) Valor de P Ritmo de clivagem Ritmo lento de clivagem 11,5 Ritmo normal de clivagem 20,7 Ritmo rápido de clivagem 15,5 Ritmo lento ou rápido de clivagem 12,1 Ritmo normal de clivagem 20,7 0,096* 0,031 * Simetria de tamanho de blastômeros Blastômeros assimétricos 16,0 Blastômeros simétricos ou semelhantes 23,2 0,015 * Fragmentação citoplasmática Ausência de fragmentação 22,0 Ocorrência de fragmentação de tipo II 16,9 Ocorrência de fragmentação de tipo III 16,7 Ocorrência de fragmentação de tipo IV - Ausência de fragmentação Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 10% do volume do embrião (≠ de tipo IV) Ausência ou ocorrência de fragmentação comprometendo até 20% do volume do embrião (≠ de tipo IV) 0,204* 22,0 16,8 0,075* 16,7 Multinucleação Multinucleação presente em pelo menos um dos blastômeros do embrião 10,8 Multinucleação ausente 20,0 Multinucleação presente, porém mais de 2 núcleos detectados em um mesmo blastômero 25,0 Multinucleação presente, porém até 2 núcleos detectados em um mesmo blastômero 6,9 Multinucleação comprometendo mais de 25% dos blastômeros do embrião 0,0 Multinucleação comprometendo até 25% dos blastômeros do embrião 11,4 0,168* 0,198+ + 1,0 Ausência de núcleo Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião 12,8 Núcleo presente em todos os blastômeros do embrião 20,4 Núcleo ausente em mais de 25% dos blastômeros do embrião 9,5 Núcleo ausente em até de 25% dos blastômeros do embrião 13,7 Nota: Teste estatístico aplicado – *Qui-quadrado ou +Exato de Fisher. 0,081* + 1,0 74 Podemos observar que houve uma diferença significativa para a taxa de implantação de blastocistos quando detectados padrões de normalidade ou anormalidade, segundo as categorias previamente definidas, para os seguintes critérios do dia 3 do desenvolvimento embrionário: ritmo de clivagem e simetria de blastômeros. Apesar da redução observada para implantação de blastocistos que apresentaram em dia 3 presença de fragmentos anucleados, presença de multinucleação e presença de blastômeros anucleados, não houve diferença estatística significativa (Tab. 29). No entanto, dada a relevância destas informações, bem como o fato de o nível de significância ser <0,2, o valor preditivo das variáveis poderá ser avaliado no ajuste do modelo de regressão logística. O agravamento do padrão de anormalidade com relação à incidência de blastômeros multinucleados e/ou anucleados não foi determinante para uma queda significativa na taxa de implantação de blastocistos para os quais havia sido detectada a presença destas alterações. Não houve diferença significativa para as variáveis quantitativas de classificação dos embriões no dia 3 do desenvolvimento entre o grupo de embriões que implantaram com relação àqueles que não implantaram. TABELA 30: Descrição das características correspondentes aos padrões de morfologia embrionária do dia 3 do desenvolvimento, de acordo com a taxa de implantação dos embriões transferidos em estágio de blastocisto. Média (+DP) Variáveis quantitativas - Morfologia do dia 3 do desenvolvimento Grupo A Implantação 0% Grupo B Implantação 100% Valor de P No de células 8,0 (1,3) 7,9 (0,9) 0,9380 No de blastômeros multinucleados 1,1 (0,3) 1,0 (0,0) 1,0 % de blastômeros multinucleados 16,1 (5,3) 12,9 (0,9) 0,2711 No de blastômeros sem núcleo 1,5 (0,6) 1,6 (0,5) 0,4050 % de blastômeros sem núcleo 20,8 (10,6) 20,6 (7,1) 0,6751 Nota: Teste estatístico aplicado – Mann-Whitney. 75 4.3.6) Obtenção de um modelo de regressão logística binária Com o objetivo de determinar a influência dos parâmetros morfológicos na determinação da viabilidade embrionária, avaliada neste caso como o potencial de implantação de blastocistos transferidos no dia 5 do desenvolvimento, análises de regressão logística binária múltipla foram realizadas. Considerando-se os resultados obtidos na análise bivariada, 20 possíveis fatores preditivos foram inseridos na determinação do modelo. Encontram-se na Tab. 31 as 4 variáveis definidas como preditoras do potencial de implantação dos blastocistos transferidos com o uso da regressão logística binária múltipla. TABELA 31: Critérios selecionados pelo modelo de regressão logística binária múltipla como preditores do potencial de implantação de embriões em estágio de blastocisto após transferência embrionária. Variáveis selecionadas pelo modelo Coeficiente da variável na Razão de chance Intervalo de confiança Valor de P equação (OR) (IC 95%) Idade da mulher -0.131 0,878 0,833-0,925 <0,001 Blastômeros assimétricos (dia 2) -0.471 0,624 0,393-0,992 0,046 Multinucleação presente em pelo menos um dos blastômeros do embrião (dia 2) -1.369 0,254 0,088-0,732 0,011 Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião (dia 2) -0.796 0,451 0,221-0,923 0,029 76 A razão de chance ou probabilidade de implantação dos blastocistos transferidos encontrase listada na tabela acima para cada variável definida como preditora independente. Além disso, estão listados acima os coeficientes de cada uma destas variáveis na equação matemática definida pelo modelo, a qual permite que para cada embrião seja obtida uma probabilidade de implantação com base na soma de valores obtida para os critérios avaliados: = 3,34 (Constante) + (-0,131 x Idade da mulher) + (-0,471 x Blastômeros assimétricos em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-1,369 x Multinucleação presente em pelo menos um dos blastômeros do embrião em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)) + (-0,796 x Ausência de núcleo em pelo menos um dos blastômeros do embrião em dia 2 do desenvolvimento (Sim=1 e Não=0)). A predição do modelo obteve uma taxa de acerto de 80,1%. Além disso, considerando-se um ponto de corte de 50% na chance de implantação ou não do blastocisto o modelo obteve uma sensibilidade de 3,2% e especificidade de 99,4%. 77 5) DISCUSSÃO Dados descritivos A qualidade de oócitos e embriões pode ser afetada de modo negativo por fatores diversos, incluindo idade materna (de Bruin et al. 2004, te Velde & Pearson 2002, Keefe, Marquard, & Liu 2006), idade paterna (Simon et al. 2014, Robertshaw et al. 2014, Ferreira et al. 2010), dose de FSH e resposta ao EOC (Figueira et al. 2010, Figueira et al. 2011, Greb, Behre, & Simoni 2005), dentre outros. No presente estudo, pudemos observar um amplo intervalo para a variável idade dos casais submetidos ao tratamento cujos dados laboratoriais foram avaliados, sendo de 21 a 45 anos para as mulheres e de 25 a 63 anos para os homens. O mesmo foi observado para as variáveis (i) dose total de FSH administrada durante EOC que variou de 600 a 4950 UI e (ii) nível sérico de E2 com resultados de 125 a 10000 pg/mL, sendo este último associado aos intervalos observados para o número de folículos puncionados (de 2 a 64 folículos) e para o número de oócitos recuperados (de 1 a 50 oócitos). Cabe ressaltar que nenhum critério de exclusão foi aplicado para as variáveis em questão dado que estas foram avaliadas quanto ao possível valor preditivo frente à taxa de formação de blastocistos e a taxa de implantação embrionária, variáveis de resposta deste estudo. Idade A queda da fertilidade, definida como a capacidade biológica de reprodução, com o aumento da idade da mulher tem sido foco de estudos epidemiológicos e demográficos há décadas, os quais consistentemente demonstram que o início da queda ocorre por volta dos 35 anos (Menken, Trussell, & Larsen 1986, te Velde & Pearson 2002, Leridon 2004, Weinstein, Wood, & Greenfield 1993). O estudo de Piette et al. (1990) sugere 37 anos como valor de corte na idade da mulher para uma redução significativa das chances de gravidez. As bases biológicas para o declínio da fecundidade com o aumento da idade parecem estar relacionadas com o declínio da quantidade e qualidade dos oócitos da coorte folicular. A qualidade oocitária diminui em paralelo à diminuição progressiva do número de folículos (Faddy et al. 1992, te Velde & Pearson 2002). A incidência de aneuploidia parece ser a maior causa de declínio da qualidade 78 oocitária, sendo o principal mecanismo relacionado a este fato a ocorrência da não-disjunção cromossômica durante a meiose destes oócitos (Battaglia et al. 1996, Jones 2008). De fato, embriões provenientes de mulheres com idade superior a 37 anos submetidas à FIV apresentam, em sua maioria, anormalidades cromossômicas incluindo inúmeras combinações de monossomias e trissomias (Munné et al. 1995, Gianaroli et al. 1999, Wells & Delhanty 2000, Munné 2006). Segundo Wells e Delhanty (2000) a ocorrência da não-disjunção cromossômica nos eventos de mitose durante o desenvolvimento embrionário também estaria associado ao comprometimento oocitário com o avanço da idade. No presente estudo, a variável idade da mulher apresentou um valor médio menor para o grupo de embriões que atingiram o estágio de blastocisto no dia 5 do desenvolvimento. Além disso, pacientes com idade igual ou superior a 38 anos apresentaram uma taxa de formação de blastocistos significativamente menor do que a observada para pacientes com idade inferior a 37 anos. Resultados similares foram obtidos por outros estudos, demonstrando uma associação da queda de desenvolvimento embrionário até o estágio de blastocisto com a idade da paciente (Janny & Menezo 1996, Shapiro et al. 2002, Braga et al. 2012). O estágio de blastocisto não pode ser considerado indicador de normalidade cromossômica embrionária. Porém, embriões aneuplóides apresentam maior taxa de parada de desenvolvimento entre o dia 3 e os dias 5-6 do desenvolvimento, quando comparados àqueles diagnosticados como euplóides (Magli et al. 2000). Desta forma, podemos sugerir que a maior incidência de embriões cromossomicamente anormais justifica a menor taxa de formação de blastocistos para pacientes de maior faixa etária. Além disso, postula-se que os embriões obtidos de pacientes com idade avançada apresentam uma capacidade diminuída de implantação (Navot et al. 1991, Shapiro et al. 2002). Os dados obtidos no presente estudo corroboram estas observações dado que a média de idade da mulher apresentou-se como fator interferente da capacidade de implantação dos blastocistos formados, sendo esta menor para o grupo de embriões implantados após transferência. Além disso, mulheres com idade menor ou igual a 37 anos apresentaram uma taxa de implantação dos blastocistos transferidos significativamente maior do que a observada para pacientes com idade igual ou superior a 38 anos. Da mesma forma, observamos um menor potencial de implantação para blastocistos provenientes de oócitos injetados com espermatozoides de pacientes com idade igual ou superior a 38 anos. Blastocistos com maior taxa de implantação foram observados para homens com 79 menor média de idade. Diferente do observado para a idade materna, os efeitos do avanço da idade paterna nos resultados dos tratamentos de RHA são controversos. Alguns autores associaram o declínio das taxas de gestação com o avanço da idade paterna (Ford et al. 2000, Klonoff-Cohen & Natarajan 2004, Ferreira et al. 2010). Outros estudos sugerem que não há associação da idade paterna com a qualidade embrionária e com as taxas de sucesso do tratamento (Braga et al. 2012, Spandorfer et al. 1998). A função reprodutiva masculina não sofre uma mudança abrupta com a idade, porém alguns fatores importantes podem ser afetados com o avanço da idade. O declínio dos parâmetros seminais como volume, concentração, motilidade e morfologia foram observados com o aumento da idade do homem (Aboulghar et al. 2007, Plas et al. 2000, Kühnert & Nieschlag 2004). Além disso, a fragmentação de DNA do espermatozoide, fator que pode ser um importante preditor das taxas de sucesso, foi previamente associado com a idade paterna (Larson-Cook et al. 2003). Uma maior porcentagem de fragmentação foi observada em pacientes de idade avançada (Moskovtsev, Willis, & Mullen 2006). Tesarik, Greco, & Mendoza (2004) sugerem que a fragmentação de DNA do espermatozoide apresenta um efeito adverso tardio no desenvolvimento embrionário, sem efeito negativo aparente na morfologia dos embriões transferidos. O presente estudo corrobora com tais informações uma vez que apesar de nenhum efeito ter sido observado para a taxa de blastocistos formados, foi observado um efeito negativo da idade paterna no potencial de implantação dos blastocistos obtidos. Além disso, um estudo do nosso grupo já havia demonstrado a ausência de influência da idade paterna na qualidade morfológica dos blastocistos obtidos (Braga et al. 2012). A idade paterna também foi associada a uma maior frequência de alterações cromossômicas (Martin 2008). Assim, alterações genéticas podem também ser associadas com o prejuízo da implantação dos embriões obtidos. Estímulo ovariano controlado De modo geral pudemos observar que um EOC que resulte não apenas em menor resposta folicular (uso de menor quantidade de FSH e obtenção de um menor número de oócitos), mas que também resulte em um melhor aproveitamento dos oócitos obtidos (maiores taxas de oócitos em MII, aptos para ICSI, e de melhor qualidade que resultem em maior taxa de 2PN) implicaria em maior chance de obtenção de embriões em estágio de blastocisto no dia 5. Estudos anteriores 80 demonstraram que de fato o aproveitamento do ciclo de tratamento pode ser menor para aqueles nos quais o EOC resulta em um grande número de oócitos recuperados. A fertilização, primeiro evento de possível perda oocitária durante um ciclo de FIV parace não ser afetada pelo número de oócitos recuperados (Figueira et al. 2011, De Sutter et al. 1996). Por outro lado, a porcentagem de embriões de boa qualidade decresce significativamente de acordo com a taxa de recuperação oocitária (Figueira et al. 2011, Klinkert et al. 2005). Protocolos agressivos de estimulação podem ser responsáveis pela baixa taxa de embriões de boa qualidade (Baart et al. 2007) e, portanto, pelas taxas significativamente menores de formação de blastocistos observadas no presente estudo para pacientes que apresentaram valores médios maiores para o número de unidades de FSH administradas, o número médio de oócitos recuperados após punção folicular e para a taxa média de oócitos recuperados. Além disso, taxas significativamente menores de implantação foram obtidas após transferência de blastocistos provenientes de ciclos nos quais uma maior dose de FSH havia sido utilizada. Em um ciclo natural, geralmente apenas um folículo antral torna-se dominante enquanto o restante dos folículos em desenvolvimento será destinado à atresia. Por outro lado, durante um EOC estes folículos serão resgatados e os oócitos obtidos poderão estar intrinsicamente comprometidos (Kovalevsky & Patrizio 2005, Patrizio et al. 2007). Desta forma, oócitos de diferentes qualidades são recuperados após punção folicular de pacientes submetidas ao EOC, principalmente resultado da falta de sincronização dos eventos de maturação citoplasmática e nuclear na maturação oocitária (Ebner, Moser, & Tews 2006). Além disso, a habilidade de retomada da meiose e a competência para o desenvolvimento pré-implantacional é progressivamente determinada durante a fase antral (Bukovsky et al. 2005). Tais modificações envolvem ambos os compartimentos nuclear e citoplasmático e eventos intracelulares que podem ser afetados por uma hiperestimulação ovariana. Estudos de Plachot & Crozet (1992), Haaf et al. (2009) sugerem que o desenvolvimento de uma menor coorte oocitária pode representar uma resposta mais apropriada à estimulacão ovariana, permitindo apenas que os mais competentes folículos e oócitos se desenvolvam, aumentando a qualidade e maturidade oocitária. De fato, pacientes que apresentaram um melhor aproveitamento oocitário com valores maiores de taxa média de oóciots MII, taxa média de oócitos injetados e taxa média de oócitos com fertilização normal apresentaram uma maior taxa de blastocistos formados. 81 Protocolos de estimulação mínima devem ser considerados como alternativa válida expondo a paciente a menores níveis hormonais, mantendo um ambiente hormonal melhor balanceado para o endométrio e limitando o risco de hiperestimulação ovariana (Hurst, Tucker, & Schlaff 2002, Edwards 2007, Nygren 2007). Além disso, estudos prévios demonstraram que uma estimulação ovariana leve, levando a uma menor recuperação oocitária, está associada a uma menor proporção de embriões aneuplóides (Baart, Macklon, & Fauser 2009). Amostra seminal No presente estudo, observamos um valor médio menor da variável motilidade seminal total para o grupo de embriões que atingiram o estágio de blastocisto no dia 5 do desenvolvimento. Além disso, observamos uma taxa de blastocistos formados maior para o grupo que apresentou motilidade progressiva de padrão anormal sendo segundo a OMS (OMS 2010). Apesar de as taxas de sucesso da ICSI terem sido previamente consideradas não dependentes de parâmetros seminais básicos (Nagy et al. 1995), relatos mais recentes sugerem que falhas repetidas após ICSI podem ser relacionadas a fatores derivados do espermatozoide e seu papel no desenvolvimento embrionário pré-implantacional (Tesarik 2005, Barroso et al. 2009, Tesarik, Mendoza-Tesarik, & Mendoza 2006). Apesar da correlação negativa observada entre a qualidade seminal e o desenvolvimento embrionário (Verza & Esteves 2008), o parâmetro motilidade não foi associado ao comprometimento do potencial de implantação de blastocistos (Braga, Setti, Vingris, et al. 2013). O uso da técnica de ICSI e a seleção artificial do espermatozoide a ser injetado pelo embriologista podem implicar na perda do possível papel preditivo da variável motilidade. O potencial da variável em questão talvez pudesse ser melhor avaliado em ciclos de FIV convencional no qual ocorre a seleção natural do espermatozoide capaz de atingir e fecundar o óvulo ou em caso de ausência total de espermatozoides movéis disponíveis para ICSI (Liu et al. 1995, Tesarik 2005). 82 Morfologia oocitária A qualidade oocitária pode ser considerada um fator chave na fertilidade feminina sendo previamente reportado que o desenvolvimento de anomalias intra e extracitoplasmáticas durante o processo de maturação podem resultar em falha de fertilização (Rienzi et al. 2008, Ebner et al. 2005), aneuploidia cromossômica (Van Blerkom & Henry 1992) e alteração do desenvolvimento embrionário (Ebner, Moser, & Tews 2006). Espaço perivitelineo aumentado No presente estudo observamos um efeito negativo da presença de EP aumentado na taxa de formação de blastocistos provenientes de oócitos nos quais este dismorfismo havia sido detectado no momento da ICSI. Estudos anteriores demonstraram uma menor probabilidade de fertilização em oócitos que apresentaram EP aumentado (Figueira et al. 2010, Rienzi, Vajta, & Ubaldi 2011, Setti et al. 2011). Segundo revisão sistemática (Rienzi, Vajta, & Ubaldi 2011), a alteração de tamanho do EP foi previamente avaliada de modo individual em 8 publicações, além de ser incluído em sistemas de avaliação da morfologia oocitária em outros 3 relatos. Balaban et al. (1998), Rienzi et al. (2008), De Sutter et al. (1996), Balaban et al. (2008) não observaram uma correlação significativa entre a presença deste dismorfismo e o desenvolvimento embrionário. No entanto, os resultados deste estudo corroboram com os dados de Ten et al. (2007) e Chamayou et al. (2006), os quais encontraram uma correlação entre o tamanho do EP e a qualidade embrionária. Além disso, a influência negativa da presença de EP aumentado na qualidade dos blastocistos obtidos, incluindo grau de expansão e qualidade da MCI e do TE foi previamente descrita (Braga, Setti, Figueira, Machado, et al. 2013). A falta de consenso pode ser associada a diversos fatores. Segundo Balaban & Urman (2006), defeitos EC devem ser considerados variações fenotípicas resultante da heterogeneidade dos oócitos recuperados, sem implicação clínica. Além disso, segundo conclusão do consenso, a alteração do tamanho do EP deve ser registrada apenas nos casos nos quais o mesmo apresentarse excepcionalmente aumentado (Embryology 2011). 83 Não houve associação com os índices de gestação e implantação e a presença de EP aumentado em nenhum dos relatos anteriores. Da mesma forma, não houve associação da presença deste dismorfismo com o potencial de implantação dos blastocistos transferidos no presente estudo. Retículo endoplasmático liso Os resultados do presente estudo demonstraram uma influência negativa da presença de agregados de REL no potencial de implantação de blastocistos provenientes de oócitos nos quais este dismorfismo estava presente. A frequência relativamente baixa de ocorrência deste dismorfismo pode ser apontada como motivo do efeito deste critério não ter sido avaliado individualmente. Assim, a maioria dos estudos não avalia a ocorrência de vacúolos e agregados de REL como critérios individuais (Xia 1997, Ebner et al. 2001, De Sutter et al. 1996, Wilding et al. 2007, Serhal et al. 1997, Loutradis et al. 1999), sendo estes classificados como inclusões citoplasmáticas. De acordo com estes estudos, inclusões citoplasmáticas não apresentam correlação com fertilização, qualidade embrionária e taxas de implantação (Balaban et al. 1998, De Sutter et al. 1996). Por outro lado, alguns estudos associaram a presença do aglomerado de REL com reduzidas taxas de fertilização e comprometimento da qualidade embrionária (Xia 1997, Otsuki et al. 2004). Ebner, Moser, et al. (2008) demonstraram não haver limitação do desenvolvimento embrionário até os dia 3 e 4 uma vez fertilizado com sucesso o oócito no qual a alteração estava presente. No entanto, um número significativamente menor de blastocistos foi observado para embriões derivados destes oócitos. Otsuki et al. (2004) relataram uma taxa de apenas 18,2% de gametas afetados que atingem o estágio de blastocisto no dia 5 do desenvolvimento. Além disso, Braga, Setti, Figueira, Machado, et al. (2013) demonstraram que a presença deste dismorfismo influencia de modo negativo o grau de expansão e a qualidade da MCI dos blastocistos obtidos. Em outros dois estudos prévios nos quais a presença de agregados de REL foi individualmente registrada, resultados controversos foram relatados sendo observadas menores chances de sucesso de fertilização e gestação (Sá et al. 2011) ou a ausência de influência deste dismosfirmo nas taxas de sucesso (Rienzi et al. 2008). De acordo com Otsuki et al. (2004), a presença deste dismorfismo está associada com uma menor chance de gestação, até mesmo para oócitos não portadores desta alteração, porém 84 provenientes de uma coorte oocitária na qual o agregado de REL foi detectado. Ciclos nos quais oócitos portadores de aglomerados de REL foram identificados apresentaram taxas significativamente maiores de gestação bioquímica (22,2% vs 3,5%) e reduzidas taxas de gestação clínica (28,2% vs 5,6%). Apenas uma gestação positiva foi relatada neste estudo, sendo o bebê nascido diagnosticado com a Síndrome Beckwith-Wiedemann. No presente estudo, a transferência de embriões em estágio de blastocisto provenientes de oócitos nos quais foi detectada a presença de agregados de REL resultou em falha total de implantação. Além das chances reduzidas de sucesso, a presença de agregados de REL foi associada com anomalias fetais (Akarsu et al. 2009). Apesar de a presença deste dismorfismo estar associada com uma maior taxa de aneuploidia oocitária (18-37%), a organização do fuso meiótico não foi afetada pela presença mesmo de grandes aglomerados de REL (Chamayou et al. 2006). Dados os riscos do desenvolvimento de embriões derivados de gametas alterados sugerese que gametas portadores deste dismorfismo não sejam inseminados (Embryology 2011). No entanto, em publicações recentes Mateizel et al. (2013), Ebner, Shebl, & Oppelt (2013) demonstraram que bebês saudáveis poderiam ser obtidos a partir destes gametas. Em um estudo de revisão sistemática, Shaw-Jackson et al. (2014) relataram o nascimento de 183 bebês provenientes de oócitos portadores de agregados de REL, sendo 171 bebês saudáveis, 8 nascidos portadores de malformação, 3 mortes neonatais, 1 natimorto e 4 abortamentos. Os resultados sugerem uma revisão da opinião do consenso, bem como a necessidade de um maior número de estudos de forma que possamos melhor compreender a origem deste dismorfismo e evitar sua ocorrência. Assim, uma análise da literatura demonstra que o efeito de alterações da morfologia oocitária nas taxas de sucesso após ICSI permanece controverso, fazendo com que exista uma tendência de não se considerar a morfologia oocitária no processo de decisão durante a seleção de embriões ou blastocistos para transferência. No presente estudo resultados diferente do esperado foram observados para muitos dos dismorfismos sendo que o acúmulo de REL, a presença de debris no espaço perivitelineo, o espaço perivitelineo aumentado, a fragmentação do 1o corpúsculo polar e a detecção de alteração de pelo menos um dos parâmetros extracitoplasmáticos foram fatores de influência positiva na taxa de obtenção de blastocistos. Considerando-se que muitos dismorfirmos oocitários são avaliados em conjunto, e não 85 individualmente, ou não são avaliados em muitos destes estudos, o papel negativo das alterações de morfologia oocitária na competência embrionária ainda não foi elucidado. Além disso, o impacto da qualidade oocitária no desenvolvimento embrionário pré-implantacional parece estar relacionado ao número e grau de extensão dos dismorfismos, dificultando a realização de estudos comparativos (Embryology 2011). Em contraste com os processos in vivo, nos quais a maturação ocorre como resultado de um longo e meticuloso processo de seleção natural (Van Soom et al. 2007), procedimentos de estimulação ovariana suprimem este mecanismo de seleção permitindo a maturação de oócitos de qualidade comprometida de forma inerente, destinados à falha de fertilização e desenvolvimento embrionário comprometido (Swain & Pool 2008). A qualidade oocitária é determinada não apenas pelo genoma nuclear e mitocondrial, mas também pelo microambiente do ovário e do folículo pré-ovulatório capaz de modificar a transcrição gênica e a tradução de proteínas. Avaliando este complexo cenário, torna-se difícil acreditar que um simples fator, característica ou mecanismo possa de forma adequada indicar a competência oocitária. Uma análise complexa baseada em sistemas de pontuação parece ser uma estratégia promissora, porém resultados contraditórios também foram observados nestes estudos dadas variações nos sistemas de pontuação (Rienzi et al. 2008, La Sala et al. 2009). Morfologia do dia 1 do desenvolvimento O valor preditivo da morfologia pronuclear tem sido foco de estudos nos últimos anos. O efeito prognóstico foi abordado (Scott & Smith 1998, Tesarik & Greco 1999, Scott et al. 2000, Scott 2003, Braga, Setti, Figueira, Iaconelli, et al. 2013, Balaban et al. 2001, Tesarik et al. 2000, Nagy et al. 2003), bem como a correlação com aneuploidia (Sadowy et al. 1998, Gianaroli et al. 2003). Por outro lado, alguns autores não observaram o valor preditivo deste critério (Salumets et al. 2001, James et al. 2006, Weitzman et al. 2010). As alterações mais frequentes observadas em zigotos incluem o tamanho e posição dos PN, o número e distribuição dos CPN e o halo citoplasmático. Conforme sugestão do consenso, alterações de tamanho ou localização nuclear devem sem registradas, bem como alterações do número de CPN. PN apresentando nenhum ou apenas um CPN devem ser associados ao desenvolvimento anormal (Embryology 2011). 86 Morfologia pronuclear Scott et al. (2000) demonstraram a ocorrência de uma forte correlação entre a classificação da morfologia pronuclear com a morfologia dos embriões no dia 3 do desenvolvimento e com a capacidade de formação de blastocisto no dia 5. Braga, Setti, Figueira, Iaconelli, et al. (2013) e Balaban et al. (2001) demonstraram que o padrão pronuclear do zigoto está diretamente correlacionado com a formação e a qualidade dos blastocistos. De modo geral, segundo estudos prévios a normalidade do padrão nuclear em zigotos está associada a melhor classificação morfológica em estágio de clivagem, a maior taxa de formação de blastocistos e a obtenção de blastocistos de melhor qualidade. De fato, no presente estudo observamos uma taxa significativamente menor de formação de blastocistos para zigotos que apresentaram alteração de tamanho de PN, localização pronuclear periférica ou padrão geral de morfologia pronuclear alterado, sendo o maior impacto observado para a observação de alteração do tamanho dos PN. A alteração do tamanho dos PN foi previamente sugerida como o principal critério avaliado no dia 1 do desenvolvimento capaz de comprometer o desenvolvimento embrionário nos estágios de clivagem e na formação de blastocistos (Gámiz et al. 2003, Scott 2003). Além disso, a detecção de PN afastados e a alteração do número de CPN também resultaram em menor taxa de formação de blastocistos, porém não foi observada diferença estatística significativa. Sendo estas as alterações detectadas com menor incidência, houve provavelmente uma limitação do número de eventos no grupo “alteração presente” não permitindo que fosse observada uma diferença significativa. Cabe ressaltar que muitos estudos baseiam-se apenas na distribuição dos CPN para classificação da morfologia pronuclear (Balaban et al. 2001, Fisch et al. 2001). Além disso, o afastamento dos PN foi previamente associado com pior qualidade embrionária e reduzido potencial de desenvolvimento (Scott et al. 2000, Scott 2003, Zollner et al. 2002). O estabelecimento dos critérios preditivos de seleção embrionária em dia 1 do desenvolvimento torna-se relevante em alguns países cuja legislação exige que a seleção embrionária seja realizada no estágio de zigoto, eliminando ainda neste estágio embriões com potencial de implantação comprometido (Montag, van der Ven, & Group 2001). Por outro lado, considerando-se o cultivo prolongado de embriões, a avaliação embrionária nos dias 2 e 3 seria capaz de fornecer informações indiretas a respeito da qualidade dos gametas, dado que gametas anormais não produziriam embriões de desenvolvimento normal, além de um maior número de 87 informações referentes a qualidade embrionária. Além disso, o desenvolvimento embrionário tardio (dia 5) reflete a expressão gênica e diferenciação embrionária, tendo um importante papel na determinação do potencial de implantação dos embriões avaliados. Assim, o valor preditivo da morfologia pronuclear torna-se questionável em casos nos quais a transferência será realizada em dia 5 do desenvolvimento. No entanto, o potencial de implantação de blastocistos foi avaliado de acordo com o padrão de morfologia pronuclear dos zigotos dos quais estes haviam sido derivados, ressaltando a importância dos critérios avaliados ainda no dia 1 do desenvolvimento (Braga, Setti, Figueira, Iaconelli, et al. 2013, Balaban et al. 2001). Blastocistos de boa qualidade derivados de zigotos de morfologia pronuclear normal apresentam maiores taxas de implantação. No entanto, blastocistos de boa qualidade derivados de zigotos de morfologia pronuclear anormal ainda apresentam potencial de implantação, porém com taxas abaixo daquelas esperadas considerando-se apenas a qualidade dos blastocistos obtidos. Scott et al. (2000) utilizando o sistema de classificação pronuclear sugerido pelo próprio autor observaram que embriões em estágio de clivagem selecionados inicialmente pela morfologia pronuclear e secundariamente pela morfologia do dia 3 do desenvolvimento apresentaram taxas significativamente maiores de implantação. Além disso, transferências realizadas em dia 5 do desenvolvimento embrionário para embriões que haviam sido classificados quanto à morfologia pronuclear apresentaram maiores taxas de implantação quando comparados a blastocistos selecionados para transferência para os quais os critérios de morfologia do zigoto não haviam sido considerados. No presente estudo, nenhuma das variáveis apresentou diferença significativa para a taxa de implantação de blastocistos provenientes de zigotos nos quais alterações nos parâmetros de morfologia pronuclear haviam ou não sido detectados. Uma queda da taxa de implantação de blastocistos provenientes de zigotos nos quais havia sido detectada alteração de tamanho de PN foi observada, porém sem significância estatística. O reduzido número de blastocistos selecionados para transferência provenientes de zigotos portadores de alterações da morfologia pronuclear pode ter sido limitante para a significância estatística. Cabe ressaltar que estudos recentes derivados de observação de embriões em sistema time-lapse demonstraram que a morfologia pronuclear sofre alterações significativas em curto intervalo de tempo, sugerindo que uma simples observação pontual em microscopia de luz seria deficiente (Azzarello, Hoest, & Mikkelsen 2012). Além disso, dentre os estudos que avaliaram o comportamento dos PN em time-lapse (Chamayou et al. 2013, Kirkegaard et al. 2013) apenas um 88 demonstrou seu potencial como preditor de implantação (Azzarello, Hoest, & Mikkelsen 2012). Além disso, Azzarello, Hoest, & Mikkelsen (2012) demonstraram que apenas o intervalo de tempo de desaparecimento dos PN foi associado com o potencial de implantação dos embriões obtidos, sendo os critérios morfológicos avaliados, incluindo o padrão de normalidade descrito por Scott et al. (2000), o número e distribuição dos CPN não preditivos do potencial de implantação destes embriões. Halo citoplasmático Diferente do esperado, a alteração do parâmetro formação do halo citoplasmático resultou na obtenção de uma maior taxa de blastocistos formados. A ausência ou a detecção de um padrão não homogêneo de formação do halo citoplasmático têm sido associadas a alterações na localização de organelas, parâmetro importante para o correto desenvolvimento embrionário e implantação. Muitos estudos confirmaram a importância do halo citoplasmático demonstrando um aumento nas taxas de implantação de embriões para os quais o halo estava presente em estágio de zigoto (Zollner et al. 2002, Salumets et al. 2002, Henkel et al. 2004). Por outro lado, o efeito deste parâmetro no desenvolvimento embrionário não foi elucidado por outros autores (Balaban et al. 2001, Demirel et al. 2001). Além disso, não existem evidências suficientes que suportam o valor preditivo da observação do halo citoplasmático (Embryology 2011). No presente estudo, a ausência ou o padrão anormal de formação do halo foram agrupados, considerando-se como alteração presente quaisquer dos dois parâmetros. Uma melhor avaliação deste parâmetro poderia resultar na ausência de correlação deste parâmetro com a taxa de formação de blastocistos, conforme previamente relatada (Braga, Setti, Figueira, Iaconelli, et al. 2013). 89 Morfologia dos dias 2 e 3 do desenvolvimento Número de células No presente estudo, o ritmo de clivagem normal caracterizado pela presença de 3 a 5 células no dia 2 do desenvolvimento e 7 a 8 células no dia 3 do desenvolvimento foi significativamente associado à taxa de formação de blastocistos e ao potencial de implantação destes após transferência embrionária. Além disso, segundo análise quantitativa do número de células, embriões com maior potencial de formação de blastocistos apresentam, em média, 4 células no dia 2 do desenvolvimento e 8 células nos dia 3 do desenvolvimento. Segundo consenso, são estes os números de células que devem ser observados seguindo-se o intervalo de tempo sugerido para avaliação após ICSI (Embryology 2011). O comprometimento dos resultados clínicos derivado da transferência de embriões de ritmos de clivagem lento ou rápido foi previamente reportado por diversos autores. De acordo com Alikani et al. (2000), apenas 13,8% dos embriões com número de células menor do que 7 no dia 3, 41,9% dos embriões com 7 a 9 células, e 27,5% dos embriões com número de células maior do que 9 apresentam potencial para formação de blastocistos quando submetidos ao cultivo prolongado. Avaliando retrospectivamente os resultados de transferências realizadas em dia 3 ou 5 do desenvolvimento embrionário, Racowsky et al. (2000) demonstraram que a presença de embriões com 8 células em dia 3 é um forte critério preditivo das taxas de sucesso. Nenhum dos embriões que apresentaram número de células menor que 8 em dia 3 implantaram quando transferidos em dia 5 do desenvolvimento. Considerando apenas número de células, outro estudo de Racowsky et al. (2003) demonstraram que embriões de 8 células em dia 3 apresentam maior potencial de implantação (25%) quando comparados a outros embriões. Em ordem decrescente de viabilidade foram classificados os embriões de mais de 8 células (18,1%), seguidos de embriões com 7 células (10,2%) e embriões com menos de 7 células (3,0%). O comprometimento do desenvolvimento embrionário de acordo com seu ritmo de clivagem tem sido associado a maior ocorrência de anormalidades cromossômicas em embriões que apresentam alteração em seu ritmo de clivagem (Magli et al. 2007, Kroener et al. 2014). Magli et al. (2007) avaliaram o status cromossômico dos estágios de clivagem observados no dia 3 do desenvolvimento embrionário. A incidência de anormalidades cromossômicas foi 90 significativamente menor para o estágio de 7-8 células (50%) quando comparado a todos os outros estágios. Os índices mais elevados de anomalias cromossômicas foram observados para embriões que apresentaram 2 ou 3 células na manhã do dia 3 (94%) e para aqueles de 4 células que apresentaram divisão de apenas um blastômero em relação ao dia 2 (85%). Proporções similares de anormalidades cromossômicas foram observadas para embriões de clivagem lenta (4 células que apresentaram 2 células no dia 2), embriões moderadamente lentos (5 ou 6 células) e embriões de clivagem rápida (≥9 células): 74%, 73% e 78%, respectivamente. Além disso, os resultados demonstraram uma taxa de anormalidade de 97% para embriões que apresentam parada de clivagem do dia 2 para o dia 3 e de 91% para embriões que apresentam clivagem de apenas 1 blastômero do dia 2 para o dia 3. Este e outros estudos prévios que demonstraram uma associação entre a incidência de aneuploidia e o número de células de embriões em ritmo de clivagem determinaram o status cromossômico por meio da técnica de hibridização in situ por fluorescência (FISH), técnica com falhas descrita na identificação de 20 a 50% de embriões anormais quando comparado à técnica de hibridização genômica comparativa (CGH) (Fragouli et al. 2010). Um estudo recente de Kroener et al. (2014) é apontado com o primeiro estudo que teve como objetivo correlacionar parâmetros embrionários e o status cromossômico de embriões determinado pela técnica de CGH. O índice de aneuploidia foi avaliado em função do número de células em dia 3, demonstrando maior chance de aneuploidia para embriões com mais de 9 células (OD= 1.39; p=0,0294). A taxa de formação de blastocistos também foi avaliada neste estudo em função do número de células e da constituição cromossômica embrionária. Embriões com ritmo de clivagem acelerado (>9 células) apresentaram maior chance de formação de blastocistos, independente da constituição cromossômica. No entanto, dentre os embriões que atingiram o estágio de blastocisto, aqueles com ritmo de clivagem normal (6 a 9 células) apresentaram uma menor incidência de aneuploidia (54% vs 62%, p=0,096). Desta forma, o estudo aponta a seleção de blastocistos provenientes de embriões de 6 a 9 células em dia 3 como relacionada a melhores taxas de sucesso quando comparada a seleção de blastocistos provenientes de embriões com >9 células em dia 3. No entanto, apesar da maior sensibilidade e da menor incidência de erros da técnica de CGH em relação ao FISH, o estudo foi baseado na biópsia embrionária em dia 3 do desenvolvimento. A alta incidência de mosaicismo observada em embriões de dia 3 (Taylor et al. 2014), bem como a possibilidade de comprometimento do desenvolvimento embrionário decorrente da biópsia quando realizada neste dia do 91 desenvolvimento embrionário (Scott et al. 2013), sugerem ainda a necessidade de novos estudos a fim de que se estabeleça a associação entre o ritmo de clivagem a e incidência de aneuploidias. Além da maior chance de alteração cromossômica, o ritmo rápido de clivagem foi recentemente correlacionado com perturbações no padrão de imprinting e no metabolismo em modelo de embriões de camundongo (Market Velker, Denomme, & Mann 2012). Simetria de blastômeros A presença de blastômeros assimétricos foi significativamente associada à menor taxa de formação de blastocistos quando presente nos dias 2 e/ou 3 do desenvolvimento. Além disso, a assimetria de blastômeros em dia 3 do desenvolvimento teve efeito negativo significante na taxa de implantação dos blastocistos transferidos. Apesar da redução do potencial de implantação, a assimetria em dia 2 do desenvolvimento não apresentou efeito significante. A possibilidade da distribuição irregular de material celular e/ou genético resultando em efeito negativo na viabilidade embrionária tem sido pouco estudada. A maioria dos estudos considera o número de células e a presença de fragmentação como sendo os principais critérios a serem abordados. Porém, alguns autores demonstraram previamente o impacto negativo da assimetria de blastômeros nos resultados obtidos (Giorgetti et al. 1995, Ziebe et al. 1997, Hardarson et al. 2001). Giorgetti et al. (1995) verificaram uma associação entre a assimetria e menores taxas de implantação, porém não diferindo entre irregularidades da forma e do tamanho dos blastômeros. Ziebe et al. (1997) e Hardarson et al. (2001) observaram uma queda significativa do potencial de implantação dos embriões de acordo com alterações do padrão de simetria de blastômeros, considerando-se o tamanho esperado a cada ciclo de divisão celular. O comprometimento do desenvolvimento embrionário de embriões assimétricos estaria relacionado à ocorrência de alterações na distribuição de material genético, sendo blastômeros originados de embriões assimétricos mais afetados por alterações cromossômicas numéricas (29,4%) quando comparados a blastômeros derivados de embriões simétricos (8,5%) (Hardarson et al. 2001). Além disso, Hardarson et al. (2001) demonstraram que não apenas um maior número de blastômeros destes embriões eram aneuplóides, mas também que a gravidade da aneuploidia era maior. Além disso, especula-se que a divisão desigual de um blastômero resulte na distribuição inadequada de proteínas, mRNA e organelas para as células-filha. Considerando a 92 ocorrência de polarização de algumas proteínas e produtos gênicos no embrião, o efeito negativo de uma divisão celular desigual seria ainda amplificado. Fragmentos anucleados Alikani et al. (1999) demonstraram pela primeira vez que o grau e o padrão de fragmentação do embrião estavam associados com as taxas de implantação embrionária. Baseados na classificação embrionária do dia 3 de desenvolvimento, os autores relataram que as taxas de implantação para os tipos I e IV de fragmentação diferem de 37.9% para 18.2%. A fragmentação tipo IV apresentou um efeito negativo mesmo quando comprometido um volume restrito do embrião, como demonstrado pelo autor em transferências nas quais apenas embriões apresentando esse tipo de fragmentação foram transferidos. Em outro estudo do mesmo grupo, os autores avaliaram a correlação entre as anormalidades morfológicas de embriões em estágio de clivagem e a habilidade de formação de blastocistos (Alikani et al. 2000). A fragmentação excessiva (>15%) apresentou um impacto negativo na chance de formação de blastocistos. O presente estudo demonstrou o efeito negativo do tipo e do grau de fragmentação de embriões em dia 2 e 3 do desenvolvimento na taxa de formação de blastocistos. Do mesmo modo que o sugerido por estudos anteriores, o maior impacto negativo da ocorrência de fragmentação foi observado para embriões apresentando fragmentação tipo IV ou >10% do volume do embrião comprometido pela fragmentação. A ocorrência de fragmentação em dia 2 do desenvolvimento apresentou um efeito negativo no potencial de implantação de blastocistos derivados destes embriões. Apesar do menor potencial de implantação observado para blastocistos que apresentaram fragmentação em dia 3 do desenvolvimento, não houve significância estatística. A associação da ocorrência de fragmentação com outros critérios de classificação embrionária em dia 3 do desenvolvimento poderia demonstrar o valor preditivo deste critério. Ainda que associação entre fragmentação e a incidência de aneuploidia não tenha sido verificada, sua relação positiva com a ocorrência de mosaicismo foi previamente observada (Munné & Cohen 1998) sugerindo que os fragmentos pudessem conter pedaços cromossômicos resultados de erros no funcionamento dos fusos. Estudos recentes demonstraram que a ocorrência de fragmentação nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário correlaciona com a 93 ocorrência de erros mitóticos (Chavez et al. 2012, Wong et al. 2010, Stensen et al. 2015). Estas observações justificariam o impacto deste critério no potencial de desenvolvimento embrionário. Magli et al. (2007) avaliaram a incidência de anormalidades cromossômicas de acordo com a porcentagem e o tipo de fragmentação, considerando o número de células do embrião no dia 3. Os resultados demonstraram que para embriões sem fragmentação ou para aqueles apresentando fragmentação localizada, a incidência de anomalias cromossômicas varia de acordo com o número de células, independente do volume do embrião comprometido pela fragmentação. De modo contrário, na presença de fragmentos não localizados, a incidência de anormalidades cromossômicas é significativamente maior para embriões de 7-8 células comparados aqueles de mesmo estágio celular que apresentam fragmentação localizada. Para embriões de clivagem lenta (4 a 6 células em dia 3) não foi observada correlação entre fragmentação e anormalidade cromossômica. Possivelmente, nestes casos, o atraso no ritmo de clivagem é o principal fator relacionado às desordens cromossômicas, conforme previamente discutido. Desta forma, o estudo sugere que a transferência de embriões de 8 células no dia 3 deve ser priorizada, mesmo na presença de fragmentação e especialmente se esta estiver localizada e não distribuída por todo o espaço perivitelínico. Estes resultados corroboram com os dados do presente estudo, sendo os embriões de 8 células com ausência de fragmentação, ou fragmentação de tipo II ocupando menos de 10% do volume embrionário os de maior chance de formação de blastocisto e implantação. Multinucleação e ausência de núcleos A detecção de blastômeros multinucleados no momento da observação correspondeu a 22,9% e 11,2% dos embriões avaliados em dia 2 e 3 do desenvolvimento, respectivamente. Apesar da variação considerável dentre os relatos da literatura, a incidência de blastômeros multinucleados parece estar em cerca de 30% dos embriões obtidos. A avaliação deste parâmetro é mais facilmente realizada no dia 2 do desenvolvimento devido à maior dimensão das células e a melhor acessibilidade destas devido ao seu número reduzido. Segundo o consenso, a ocorrência de multinucleação deve ser registrada para o dia 2 do desenvolvimento, dado o caráter mais informativo deste critério para o dia 2 quando comparado ao dia 3 do desenvolvimento 94 (Embryology 2011). As variações na incidência de embriões multinucleados podem estar relacionadas não apenas ao dia de desenvolvimento avaliado, mas também ao momento da observação dado que apenas blastômeros em interfase apresentam núcleo visível subestimando as taxas de multinucleação. A ocorrência de multinucleação apresentou efeito negativo significante na taxa de formação de blastocistos quando detectada em embriões de dia 2 ou 3 do desenvolvimento. O efeito negativo deste parâmetro no potencial de implantação dos blastocistos transferidos foi verificado apenas quando detectado em embriões de dia 2 do desenvolvimento. Apesar da redução significativa da taxa de implantação para blastocistos provenientes de embriões multinucleados em dia 3 (10,8% vs 20,0%, p=0,168) não houve diferença estatística, possivelmente devido ao número reduzido de embriões multinucleados em dia 3 serem selecionados para transferência em dia 5, até mesmo pelo fato de um número reduzido atingir o estágio de blastocisto (22,6% vs 40,6%, p<0,001). De fato, parece existir uma correlação entre a multinucleação e o padrão de clivagem de embriões. Van Royen et al. (2001) demonstraram que embriões com padrão de clivagem normal, caracterizado por 4 células em dia 2 e 8 células em dia 3 apresentam os menores índices de multinucleação quando comparados a embriões com ritmo lento ou rápido de clivagem para estes dias do desenvolvimento. Os embriões portadores de multinucleação, associado ao padrão alterado de clivagem, apresentariam menores chances de formação de blastocisto conforme já discutido. O impacto da multinucleção no potencial de implantação foi demonstrado previamente (Pickering et al. 1995, Van Royen et al. 2001, Van Royen et al. 2003, Moriwaki et al. 2004). Van Royen et al. (2003) observaram uma queda de 4,3 vezes no potencial de implantação de embriões portadores de multinucleação, quando comparados ao potencial de implantação de embriões mononucleados sugerindo o alto valor preditivo deste critério. O significativo potencial negativo da ocorrência de multinucleação no desenvolvimento embrionário pode ser explicado pelo estudo genético desses embriões, dado que a multinucleação parece estar relacionada a erros na replicação e segregação cromossômica. De fato, embriões multinucleados quando avaliados apresentaram aumento da incidência de aneuploidia, anormalidades cromossômicas e defeitos na síntese de DNA conforme relatado inicialmente por Kligman et al. (1996) e mais recentemente por Hardarson et al. (2001). A análise da constituição cromossômica de embriões portadores de blastômeros multinucleados demonstrou que 85% destes apresentavam anormalidades cromossômicas em mais de 50% dos seus blastômeros. O 95 número de blastômeros cromossomicamente anormais excedia em ambos os estudos o número de blastômeros comprometidos pela multinucleação, indicando comprometimento genético de todo o embrião. Por outro lado, alguns estudos demonstraram que nem todos os embriões multinucleados apresentam comprometimento de sua constituição cromossômica (Staessen & Van Steirteghem 1998). A ocorrência de blastômeros binucleados apresenta um menor impacto no comprometimento do desenvolvimento embrionário dado que uma maior porcentagem destes embriões é caracterizada como euplóide quando comparado com embriões apresentando 3 ou mais núcleos em um dos blastômeros (Meriano et al. 2004). O estudo de Meriano et al. (2004) considerou para avaliação do impacto da multinucleação na competência embrionária dois fenótipos mais comumente encontrados: blastômeros binucleados e multinucleados. Os resultados obtidos demonstraram que embriões mononucleados provenientes de uma coorte comprometida por embriões binucleados não apresentam potencial de desenvolvimento comprometido, diferente do observado para embriões mononucleados provenientes de uma coorte comprometida pela multinucleação. O estudo sugere que a ocorrência de blastômeros binucleados deve ser considerada uma variável independente restrita ao embrião no qual é detectada. Por outro lado, a multinucleação deve ser indicativa de comprometimento da competência de toda a coorte. Além disso, análise de FISH para 5 cromossomos demonstrou que embriões binucleados apresentam maior incidência de blastômeros normais para os cromossomos testados quando comparados com embriões multinucleados. Dentre os embriões binucleados avaliados 32% foram considerados normais e dentre os multinucleados apenas 3,7%. De fato, no presente estudo observamos que o agravamento do padrão de anormalidade com relação ao número de núcleos detectados e a incidência de blastômeros multinucleados em embriões de dia 2 e 3 foi determinante em uma queda significativa na taxa de formação de blastocistos para embriões nos quais a multinucleação havia sido detectada. O mesmo efeito não foi observado para o potencial de implantação dos embriões, porém as diferenças observadas podem ser consideradas relevantes sendo de 8,5% a taxa de implantação para embriões de dia 2 multinucleados nos quais foram detectados até 2 núcleos em um mesmo blastômero e de 0% para os quais houve detecção de mais de 2 núcleos (p=0,291). Observamos ainda uma taxa de implantação de 7,0% para embriões multinucleados em dia 2 nos quais até 25% dos blastômeros estavam comprometidos e de 3,4% para os quais houve comprometimento de mais de 25% dos 96 blastômeros (p=0,644). Novamente, o número amostral reduzido de embriões portadores destas alterações e que foram selecionados para transferência pode ser apontado como fator limitante. O impacto da observação de blastômeros sem núcleo nos dias 2 e 3 do desenvolvimento foi significante para o potencial de formação de blastocistos, sendo este significante também para o potencial de implantação dos blastocistos transferidos quando observado em blastômeros de embriões em dia 2 do desenvolvimento. O estudo de Moriwaki et al. (2004) havia relatado uma menor chance de implantação para embriões com blastômeros sem núcleo visível no momento da observação. Porém, a significância clínica de blastômeros anucleados ainda não foi elucidada. Segundo Palmstierna et al. (1998), considerando o fato de que o desenvolvimento do núcleo de blastômeros envolve fases distintas nas quais este torna-se mais ou menos visível e considerandose a observação deste critério em intervalos de tempo pré-estabelecidos, o fato de o núcleo não ser observado caracteriza um blastômero anucleado. Assim, o impacto deste critério no desenvolvimento embrionário deve estar associado a uma assincronia do ciclo celular entre blastômeros mononucleados e blastômeros anucleados. Desta forma, um maior comprometimento do embrião por estes critério poderia agravar o efeito observado. De fato, os resultados do presente estudo demonstraram uma menor chance de obtenção de blastocistos para embriões portadores de blastômeros sem núcleos nos dias 2 e 3 do desenvolvimento, sendo este efeito significativamente agravado com o maior comprometimento do embrião (núcleo ausente em >25% dos blastômeros do embrião). O presente trabalho demonstrou que os critérios de morfologia oocitária e de morfologia embrionária avaliados isoladamente foram significativamente associados ao potencial de formação e de implantação de blastocistos. O valor preditivo de critérios avaliados no início do desenvolvimento embrionário em ciclos com transferência em estágio de blastocistos não foi observado em estudo prévio (Guerif et al. 2010). Após avaliação de 2617 embriões de 511 casais submetidos a tratamento de RHA que realizaram transferência de embrião único em dia 5 do desenvolvimento, o autor concluiu que não houve nenhuma associação significativa entre os critérios de morfologia dos dias 1 e 2 do desenvolvimento embrionário e o potencial de implantação dos blastocistos. Conforme comentado previamente, a falta de consenso na forma de avaliação dos critérios e na determinação da interdependência ou de seu peso relativo em 97 sistemas de avaliação, associada à subjetividade na avaliação, às variações inter e intraobservadores, aos diferentes protocolos e meios de cultivo utilizados podem ser a causa da obtenção de resultados controversos ressaltando a importância de realização de um maior número de estudos. Modelos preditivos Faltam estudos na literatura sugerindo de que forma classificar e selecionar embriões apresentando diferentes tipos e graus de variações do padrão ideal de morfologia. Desta forma, podemos afirmar que não está claro, por exemplo, se um blastocisto que apresentou ritmo de clivagem lenta ou rápida e ausência de fragmentação nos estágios iniciais de clivagem deve ser selecionado para transferência em detrimento de outro que apresentou ritmo de clivagem normal porém com presença de fragmentação moderada. Ou ainda, se uma variação no tamanho dos blastômeros pode inferir um prognóstico pior do que a ausência de núcleo visível em determinada proporção de blastômeros do embrião. Devemos ressaltar que algumas variáveis podem ser caracterizadas como preditoras independentes do potencial de formação e implantação de blastocistos, porém outras poderão apresentar significância apenas em uma avaliação univariada, perdendo sua significância em modelos multifatoriais. Algumas variáveis sem significância biológica podem demonstrar associação com outras variáveis de real importância resultando em uma falsa impressão de seu valor preditivo. Um modelo baseado em análises estatísticas multifatoriais nas quais as variáveis relevantes irão competir é apontado como a melhor maneira de se evitar uma classificação subjetiva dos embriões. O modelo irá incluir apenas os fatores que apresentarem de forma independente um impacto nas variáveis de sucesso, além de fornecer o correto peso de cada critério. Conforme abordado, poucos estudos optam por uma estratégia de avaliação multi-dimensional apesar da necessidade crescente de classificação de embriões baseada em observações diárias pontuais (Scott 2003, Holte et al. 2007, Racowsky et al. 2009, Sjöblom et al. 2006, Guerif et al. 2007, Rehman et al. 2007, Ahlström et al. 2011, Fauque et al. 2013). Tendo como base os resultados da análise bivariada de todos os critérios avaliados no presente estudo, 43 potenciais fatores preditivos para obtenção de blastocisto no dia 5 do desenvolvimento e 20 potenciais fatores preditivos de potencial de implantação embrionária 98 foram selecionados para obtenção de um modelo de predição utilizando regressão logística binária múltipla. No modelo final de predição de formação de blastocisto foram incluídos 14 fatores: idade da mulher, taxa média de oócitos recuperados, presença de espaço perivitelineo aumentado no oócito, ritmo de clivagem em dia 2 e 3, número de células em dia 3, simetria de blastômeros em dia 2 e 3, ocorrência de fragmentação em dia 3, número de núcleos presentes nos blastômeros multinucleados em dia 2, porcentagem de blastômeros comprometidos pela multinucleação em dia 2, ocorrência de blastômeros anucleados em dia 2, número de blastômeros multinucleados e número de blastômeros anucleados em dia 3. O modelo ajustado poderá ser utilizado na rotina laboratorial para determinação da chance de formação de blastocistos para embriões em dia 3 do desenvolvimento, com taxa de acerto de 71,1%. A determinação da probabilidade de obtenção de embriões em estágio de blastocisto para cada um dos embriões de uma paciente poderá auxiliar de forma significativa a troca de informações entre a equipe clínica e laboratorial no que se refere à definição do momento mais indicado para realização da transferência embrionária. Para o modelo de predição de implantação destes embriões quando selecionados para transferência 4 fatores foram incluídos: idade da mulher, simetria de blastômeros em dia 2, ocorrência de multinucleação e/ou ausência de núcleo em blastômeros de embriões em dia 2. A predição do modelo obteve uma taxa de acerto de 80,1%, porém alta probabilidade de acerto está associada à baixa probabilidade de implantação embrionária pré-teste de aproximadamente 25%. Ou seja, sendo a taxa de implantação embrionária baixa existe boa possibilidade de acerto daqueles embriões que não irão implantar após a transferência. A capacidade do método em identificar embriões com potencial de implantação foi de apenas 3,2% (sensibilidade). Dessa forma, os critérios apontados poderão ser utilizados na seleção embrionária dadas as significâncias estatísticas obtidas nas análises de associação, porém novos estudos com uma maior casuística deverão ser realizados para determinação do modelo de implantação embrionária. Dois estudos recentes incluindo mais de 6000 embriões transferidos tiveram como objetivo a obtenção de um modelo de classificação de embriões de acordo com seu potencial de implantação (van Loendersloot et al. 2014, Rhenman et al. 2015). No entanto, apesar da grande casuística algumas limitações podem ser apontadas. O estudo de Rhenman et al. (2015) incluiu apenas transferências realizadas em dia 2 do desenvolvimento, sendo que o cultivo prolongado 99 até o estágio de blastocisto teria fornecido maior acurácia na seleção embrionária. Por outro lado, o estudo de van Loendersloot et al. (2014) incluiu apenas parâmetros de morfologia embrionária do dia 3 do desenvolvimento. No entanto, modelos de implantação que incluem variáveis de ambos os dias 2 e 3 têm demonstrado melhor valor preditivo (Racowsky et al. 2009). Além disso, o objetivo do estudo de van Loendersloot et al. (2014) foi classificar embriões obtidos no ciclo de tratamento de um casal de acordo com seu potencial de implantação, e não determinar o potencial de implantação de um embrião de modo individual. Desta forma, as características dos pacientes seriam todas idênticas para estes embriões que eram provenientes de um mesmo casal, excluindo a inclusão de parâmetros como idade no modelo. Os resultados obtidos neste e em outros estudos devem ser de modo geral aplicados com cautela principalmente pelo fato de serem obtidos e validados a partir de um mesmo banco de dados. O poder estatístico do estudo parece não ser afetado se aplicados testes estatísticos adequados, porém os modelos devem ser validados em populações independentes (Steyerberg, Harrell, et al. 2001, Steyerberg, Eijkemans, et al. 2001, te Velde et al. 2014). A validação externa resulta em um refinamento do modelo a partir de um reajuste do peso de cada variável. As variáveis caracterizadas no presente estudo como tendo poder preditivo independente poderão ser utilizadas por embriologistas como ferramenta para a classificação de embriões de acordo com o potencial de formação de blastocisto, bem como de acordo com o potencial de implantação do blastocisto obtido, auxiliando na seleção de embriões para transferência. A otimização da seleção embrionária por meio da utilização dos algoritmos nos quais tais variáveis foram incorporadas representa um grande potencial de aumento das taxas de sucesso do tratamento, além de possibilitar a realização da transferência de um número reduzido de embriões, minimizando os riscos derivados de gestações múltiplas. Além disso, o melhor entendimento do valor preditivo dos critérios de avaliação embrionária poderá auxiliar no estabelecimento de uma estratégia mais uniforme de seleção embrionária entre os diferentes laboratórios. 100 6) CONCLUSÕES Considerando-se a análise do valor preditivo de critérios morfológicos na obtenção de embriões em estágio de blastocisto podemos concluir que: Variáveis do perfil populacional e da resposta do EOC estão associadas ao potencial de formação de blastocistos; O perfil dos casais submetidos ao tratamento que apresentam maior taxa de formação de blastocistos é caracterizado por: menor média de idade da mulher, menor número médio de UI de FSH administradas, menor número médio de oócitos recuperados, menor taxa média de oócitos recuperados, maior taxa média de oócitos MII, maior taxa média de oócitos injetados e maior taxa média de 2PN; A presença de dismorfismos oocitários está associada com o potencial de formação de blastocistos; O aumento do EP está associado a uma chance significativamente menor de formação de blastocisto para embriões derivados de oócitos portadores deste dismorfismo; Critérios avaliados nos dias 1, 2 e 3 do desenvolvimento estão associados com o potencial de formação de blastocistos; A alteração do tamanho dos PN, a detecção de PN periféricos ou mesmo a detecção de um padrão anormal de morfologia pronuclear estão associados a uma chance significativamente menor de formação de blastocisto; Alteracões no ritmo de clivagem ou no padrão de simetria de blastômeros em embriões em dia 2 e/ou 3 do desenvolvimento estão associadas a uma chance significativamente menor de formação de blastocistos; A ocorrência de fragmentos anucleados, blastômeros multinucleados ou anucleados em embriões de dia 2 e/ou 3 do desenvolvimento estão associadas a uma chance significativamente menor de formação de blastocistos; Embriões multinucleados em dia 2 e/ou 3 do desenvolvimento com até 2 núcleos detectados em um mesmo blastômeros apresentam maior chance de formação de blastocisto quando comparados àqueles nos quais mais de 2 núcleos forem detectados em um mesmo blastômero; 101 Embriões em dia 2 e/ou 3 do desenvolvimento nos quais a ocorrência de multinucleação compromete até 25% dos blastômeros apresentam maior chance de formação de blastocisto quando comparados àqueles nos quais a multinucleação for detectada em mais de 25% dos blastômeros; Embriões em dia 2 e/ou 3 do desenvolvimento nos quais a não visualização de núcleo compromete até 25% dos blastômeros apresentam maior chance de formação de blastocisto quando comparados àqueles nos quais a ausência de núcleo for detectada em mais de 25% dos blastômeros; Os critérios independentes preditivos de formação de blastocisto são: idade da mulher, taxa média de oócitos recuperados, presença de EP aumentado no oócito, ritmo de clivagem em dia 2 e 3, número de células em dia 3, simetria de blastômeros em dia 2 e 3, ocorrência de fragmentação em dia 3, número de núcleos presentes nos blastômeros multinucleados em dia 2, porcentagem de blastômeros comprometidos pela multinucleação em dia 2, ocorrência de blastômeros anucleados em dia 2, número de blastômeros multinucleados e número de blastômeros anucleados em dia 3. A aplicação dos critérios preditivos em modelo de regressão multifatorial resulta em uma taxa de acerto de 71,7% na chance do embrião atingir o estágio de blastocisto quando submetido ao cultivo prolongado. Considerando-se a análise do valor preditivo de critérios morfológicos no potencial de implantação dos blastocistos transferidos podemos concluir que: Variáveis do perfil populacional e da resposta do EOC estão associadas ao potencial de implantação de blastocistos; O perfil dos casais submetidos ao tratamento que apresentam maior potencial de implantação de blastocistos é caracterizado por: menor média de idade da mulher, menor média de idade do homem; menor número médio de UI de FSH administradas; A presença de dismorfismos oocitários está associada com o potencial de implantação de blastocistos; 102 A presença de aglomerados de REL está associada a uma chance significativamente menor de implantação para blastocistos derivados de oócitos portadores deste dismorfismo; Critérios avaliados no dia 1 do desenvolvimento não estão significativamente associados com o potencial de implantação dos blastocistos derivados destes zigotos; Critérios avaliados nos dias 2 e 3 do desenvolvimento estão associados com o potencial de implantação de blastocistos; Alteracões no ritmo de clivagem em embriões em dia 2 e/ou 3 do desenvolvimento estão associadas a uma chance significativamente menor de implantação dos blastocistos obtidos; Alterações no padrão de simetria de blastômeros em embriões em dia 3 do desenvolvimento estão associadas a uma chance significativamente menor de implantação dos blastocistos obtidos; A ocorrência de fragmentos anucleados em embriões em dia 2 do desenvolvimento está associada a uma chance significativamente menor de implantação dos blastocistos obtidos; A ocorrência de blastômeros multinucleados ou anucleados em embriões de dia 2 do desenvolvimento estão associadas a uma chance significativamente menor de implantação dos blastocistos obtidos; Os critérios independentes preditivos do potencial de implantação dos blastocistos obtidos são: idade da mulher, simetria de blastômeros em dia 2, ocorrência de multinucleação e/ou ausência de núcleo em blastômeros de embriões em dia 2, porém apresentando baixo valor de sensibilidade. 103 7) ANEXO Anexo 1 - Manual de Procedimentos Operacionais Padrão (POP) do Centro de Fertilização Assistida - Fertility AVALIAÇÃO DA MORFOLOGIA OOCITÁRIA OBJETIVOS Identificar as alterações morfológicas intracitoplasmáticas e extracitoplasmáticas de oócitos submetidos à ICSI com o objetivo de selecionar os gametas que poderão originar embriões com alto potencial de implantação. AMOSTRAS Oócitos maduros (MII) submetidos à ICSI obtidos após estímulo ovariano controlado e punção folicular aspirativa. PROCEDIMENTO Avaliação da morfologia oocitária em microscópio de luz invertido e identificação de alterações morfológicas intracitoplasmáticas e extracitoplasmáticas. Registrar a detecção de cada uma das alterações no respectivo prontuário de classificação oocitária imediatamente após o procedimento de ICSI, evitando a exposição prolongada dos gametas. MORFOLOGIA OOCITÁRIA NORMAL • Forma esférica • Corpúsculo polar único e intacto • Espaço perivitelínico pequeno e ausência de granulações • Zona pelúcida clara e intacta 104 • Citoplasma translúcido de coloração homogênea, livre de inclusões DISMORFISMOS OOCITÁRIOS Os dismorfismos oocitários possíveis de serem detectados na avaliação morfológica em microscópio de luz invertido estão descritos abaixo exemplificados através de fotomicrografias. EXTRACITOPLASMÁTICOS AZ – Alteração de forma e/ou espessura e/ou coloração da zona pelúcida AF – Alteração de forma do oócito 105 EP - Espaço perivitelineo aumentado e/ou DP - Granulações no espaço perivitelineo CF – 1º corpúsculo polar fragmentado e/ou de tamanho aumentado 106 INTRACITOPLASMÁTICOS CG – Granulosidade citoplasmática excessiva CL – Granulosidade citoplasmática em cluster 107 CE – Citoplasma enegrecido IN – Inclusões citoplasmáticas PV – Presença de vacúolos 108 RE - Retículo endoplasmático liso agregado MR – Membrana resistente Necessidade de aspiração para rompimento do oolema após formação do cone de injeção. MSR – Membrana sem resistência Não formação do cone de injeção e rompimento imediato do oolema. 109 Esquema representativo da avaliação da morfologia oocitária. (a) Normal, (b) 1o CP aumentado, (c) 1o CP fragmentado, (d) 1o CP diminuído, (e) Granulação citoplasmática homogênea, (f) Granulação citoplasmática centralizada, (g) VAC, (h) Corpo refrátil, (i) Agregado de REL, (j) EPV aumentado, (k) EPV com granulações e (l) Alteração de forma. 110 REGISTRO DAS ALTERAÇÕES – PRONTUÁRIO DIA +1 CLASSIFICAÇÃO OOCITÁRIA INTRA Injeção CG CL CE PV EXTRA RE IN CF DP EP AZ AF MR MSR OBSERVAÇÃO Inserir marcação (X) para cada alteração observada nos oócitos submetidos à ICSI. Legenda: CG CE PV RE CL IN CF MORFOLOGIA OOCITÁRIA DP Debris no espaço perivitelino Citoplasma enegrecido EP Espaço perivitelíneo aumentado Presença vacúolos AZ Alteração em zona pelúcida Retículo endoplasmatico agregado AF Alteração de Forma Granulação em cluster MSR Menbrana sem resistência Inclusões citoplasmáticas MR Membrana resistente Citoplasma Granular Corpúsculo fragmentado Observação: O oócito classificado na linha de número 1 deve corresponder ao número 1 da placa de cultivo na qual estes serão mantidos em cultivo após a ICSI e avaliados após intervalo de cerca de 17h para checagem da fertilização. Desta forma, as características oocitárias de cada um dos embriões resultantes estarão disponíveis para utilização como parâmetro de seleção embrionária para transferência. 111 CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA OBJETIVOS Avaliar parâmetros da morfologia embrionária durante cultivo in vitro com o objetivo de selecionar embriões com alto potencial de implantação. AMOSTRAS Embriões humanos obtidos a partir da fertilização de oócitos maduros (MII) através das técnicas de Fertilização in vitro clássica ou ICSI. PROCEDIMENTO Avaliação da morfologia embrionária em microscópio de luz invertido e registro de cada uma das alterações no respectivo prontuário de classificação embrionária, evitando a exposição prolongada dos embriões. CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - DIA+ 1 Fase de pronúcleo (2PN, 2CP). Avaliação realizada de16-18h após inseminação ou ICSI. Parâmetros avaliados: Número de pronúcleos visualizados (No PN) Critério de normalidade = 2PN (fertilização normal) Alterações observadas 1PN, >3PN (fertilização anormal) Número de corpúsculos polares visualizados (No CP) Critério de normalidade = 2 112 Morfologia dos pronúcleos Tamanho Critério de normalidade = diâmetro de 15-25µm Identificar caso seja detectada alteração de tamanho de um ou ambos os pronúcleos. Localização Critério de normalidade = centralizados Identificar caso seja detectada localização periférica em relação ao ooplasma. Justaposição Critério de normalidade = pronúcleos justapostos Identificar caso seja detectada distância entre os centros dos pronúcleos maior que 25µm. Morfologia dos nucléolos (corpos precursores de nucléolos) Distribuição Critério de normalidade = polarizados ou dispersos em ambos os pronúcleos (Z1, Z2 – Scott, 2000). Identificar caso seja detectada assincronia de posição dos corpos precursores de nucléolos entre os pronúcleos. Número Critério de normalidade = de 4 a 11 corpos precursores de nucléolos em cada um dos pronúcleos. Identificar caso seja detectado número de corpos precursores de nucléolos fora do intervalo de normalidade. Além disso, a diferença entre o número de corpos precursores de nucléolos entre os pronúcleos deve ser menor que 3. 113 Halo citoplasmático periférico Critério de normalidade = presente Identificar caso não seja detectado. Vacúolos Critério de normalidade = ausência de vacúolos. Prontuário para registro das abservações: CLASSIFICAÇÃO DIA + 1 PN Nº PN Nº CP TAMANHO PERIFERICOS NUCLÉOLO NÚMERO (0, AFASTADOS 1 e 2) TAMANHO POLARIZAÇÃO HALO VAC FORMA Inserir marcação (X) para cada alteração observada nos embriões em estágio de pronúcleo. Fotomicrografia exemplificando embrião de Dia 1 apresentando todos os critérios de normalidade. ZP OBSERVAÇÃO 114 CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - DIA+ 2 Avaliação realizada de 43-45h após inseminação ou ICSI. Parâmetros avaliados: Número de blastômeros detectados Simetria entre os blastômeros Classificação para embriões de 2, 4 ou 8 células: A simetria é representada pela observação de blastômeros de tamanho idêntico. Simétricos (Si) – blastômeros de tamanho idêntico; Assimétricos (As) – diferença maior que 20% entre o blastômero de menor e o de maior tamanho; Semelhantes (Se) – existe diferença de tamanho entre os blastômeros, porém a diferença entre o menor e o maior blastômero não excede 20%. Classificação para embriões de 3, 5 6 ou 7células: Diferença de tamanho entre os blastômeros é representativa de assincronia no processo de clivagem. 115 CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - SIMETRIA O DE NNo DECÉLULAS CÉLULAS SIMETRIA ESPERADA 2 2 CEL = 3 1 CEL GDE 2 CEL MENORES = 4 4 CEL = 5 3 CEL GDE 2 CEL MENORES = 6 2 CEL GDE 4 CEL MENORES = 7 1 CEL GDE 6 CEL MENORES = 8 8 CEL = 116 Fragmentação Quantitativo Estimar a porcentagem do volume do embrião comprometida pela fragmentação. A porcentagem deve ser equivalente ao tamanho do blastômero. (Exemplo: embrião de 4 células, 25% de fragmentação deve equivaler ao volume de um blastômero). Valores utilizados: 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, >50% Qualitativo Classificar o tipo de fragmentação segundo Alikani, 1999. Tipo I Volume mínimo, fragmentos associados a um blastômero Tipo II Fragmentos localizados e predominantemente no espaço perivitelínico Tipo III Fragmentos pequenos dispersos entre os blastômeros, no espaço perivitelínico ou em ambos Tipo IV Fragmentos grandes semelhantes a blastômeros, distribuídos randomicamente, associados a blastômeros desiguais Tipo V Fragmentos necróticos, granulosidade e contração citoplasmática característica Presença de núcleo Critério de normalidade = (1) núcleo / blastômero Verificar a presença de núcleo em cada um dos blastômeros. Identificar número de blastômeros nos quais o núcleo não foi visualizado. Multinucleação Critério de normalidade = (1) núcleo / blastômero 117 Verificar a presença de núcleo em cada um dos blastômeros. Identificar número de blastômeros comprometidos e número de núcleos visualizados em cada um dos blastômeros comprometidos. Outras alterações Granulosidade citoplasmática excessiva. Presença de vacúolo. Alteração da zona pelúcida resultando em alteração do formato esférico do embrião. Alteração de coloração e/ou espessura da zona pelúcida. Prontuário para registro das abservações: CLASSIFICAÇÃO DIA+2 Nº EMBRIÃO Frag gdes CG VAC FORMA ZP BL s/ N MULTINUCLEAÇÃO OBSERVAÇÃO Inserir marcação (X) para cada alteração observada nos embriões no dia 2 do desenvolvimento. Legenda: EMBRIÃO: Descrever no de blastômeros e classificação quanto à simetria e fragmentação embrionária. Frag. gdes: Descrever no de fragmentos anucleados grandes (tipo IV) observados. CG: Granulosidade excessiva no citoplasma. VAC: Presença de vacúolos. FORMA: Alteração da forma esférica do embrião. ZP: Alteração de coloração e/ou espessura da zona pelúcida. BL s/ N: Número de blastômeros sem núcleo. MULTINUCLEAÇÃO: Descrever número de blastômeros que apresentam mais de um núcleo e o número de núcleos detectados. 118 Fotomicrografia exemplificando embrião de Dia 2 de boa qualidade, apresentando 4 blastômeros semelhantes, ausência de fragmentos anucleados, presença de um núcleo visível em cada um dos blastômeros e ausência de alterações citoplasmáticas. CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - DIA+ 3 Avaliação realizada de 67-69h após inseminação ou ICSI. Parâmetros avaliados: Número de blastômeros detectados Simetria entre os blastômeros Classificação para embriões de 2, 4 ou 8 células: A simetria é representada pela observação de blastômeros de tamanho idêntico. Simétricos (Si) – blastômeros de tamanho idêntico; 119 Assimétricos (As) – diferença maior que 20% entre o blastômero de menor e o de maior tamanho; Semelhantes (Se) – existe diferença de tamanho entre os blastômeros, porém a diferença entre o menor e o maior blastômero não excede 20%. Classificação para embriões de 3, 5 6 ou 7células: Diferença de tamanho entre os blastômeros é representativa de assincronia no processo de clivagem. CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - SIMETRIA O DE NNo DECÉLULAS CÉLULAS Fragmentação Quantitativo SIMETRIA ESPERADA 2 2 CEL = 3 1 CEL GDE 2 CEL MENORES = 4 4 CEL = 5 3 CEL GDE 2 CEL MENORES = 6 2 CEL GDE 4 CEL MENORES = 7 1 CEL GDE 6 CEL MENORES = 8 8 CEL = 120 Estimar a porcentagem do volume do embrião comprometida pela fragmentação. A porcentagem deve ser equivalente ao tamanho do blastômero. (Exemplo: embrião de 4 células, 25% de fragmentação deve equivaler ao volume de um blastômero). Valores utilizados: 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 35%, >50% Qualitativo Classificar o tipo de fragmentação segundo Alikani, 1999. Tipo I Volume mínimo, fragmentos associados a um blastômero Tipo II Fragmentos localizados e predominantemente no espaço perivitelínico Tipo III Fragmentos pequenos dispersos entre os blastômeros, no espaço perivitelínico ou em ambos Tipo IV Fragmentos grandes semelhantes a blastômeros, distribuídos randomicamente, associados a blastômeros desiguais Tipo V Fragmentos necróticos, granulosidade e contração citoplasmática característica Presença de núcleo Critério de normalidade = (1) núcleo / blastômero Verificar a presença de núcleo em cada um dos blastômeros. Identificar número de blastômeros nos quais o núcleo não foi visualizado. Multinucleação Critério de normalidade = (1) núcleo / blastômero Verificar a presença de núcleo em cada um dos blastômeros. Identificar número de blastômeros comprometidos e número de núcleos visualizados em cada um dos blastômeros comprometidos. 121 Outras alterações Granulosidade citoplasmática excessiva. Presença de vacúolo. Alteração da zona pelúcida resultando em alteração do formato esférico do embrião. Alteração de coloração e/ou espessura da zona pelúcida. Blastômero dominante, presença de blastômero de maior tamanho que apresenta diferença maior que 50% em relação ao menor blastômero do embrião. Prontuário para registro das abservações: CLASSIFICAÇÃO DIA + 3 EMBRIÃO Frag gdes CG VAC FORMA ZP BL s/ N MULTINUCLEAÇÃO BD Inserir marcação (X) para cada alteração observada nos embriões no dia 3 do desenvolvimento. Legenda: EMBRIÃO: Descrever no de blastômeros e classificação quanto à simetria e fragmentação embrionária. Frag. gdes: Descrever no de fragmentos anucleados grandes (tipo IV) observados. CG: Granulosidade excessiva no citoplasma VAC: Presença de vacúolos FORMA: Alteração da forma esférica do embrião. ZP: Alteração de coloração e/ou espessura da zona pelúcida. BL s/ N: Número de blastômeros sem núcleo. MULTINUCLEAÇÃO: Descrever número de blastômeros que apresentam mais de um núcleo e o número de núcleos detectados. BD: Blastômero dominante. 122 Fotomicrografia exemplificando embrião de Dia 3 de boa qualidade, apresentando 8 blastômeros semelhantes, ausência de fragmentos anucleados, presença de um núcleo visível em cada um dos blastômeros e ausência de alterações citoplasmáticas. CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - DIA+ 4 Avaliação realizada de 90-94h após inseminação ou ICSI. Parâmetros avaliados: Número de blastômeros detectados Critério de normalidade = 4º ciclo de clivagem Evidência de compactação Morfologia Regular Difícil identificação dos limites celulares. 123 Irregular Possível distinção de limites celulares. Compromete apenas parte dos blastômeros do embrião. Prontuário para registro das abservações: CLASSIFICAÇÃO DIA+4 Nº EMBRIÃO CG VAC FORMA ZP BL s/ N MULTINUCLEAÇÃO DESTINO 1 Inserir marcação (X) para cada alteração observada nos embriões no dia 3 do desenvolvimento. Legenda: EMBRIÃO: Descrever evidência de compactação e/ou no de blastômeros e classificação quanto à simetria e fragmentação embrionária. CG: Granulosidade excessiva no citoplasma VAC: Presença de vacúolos FORMA: Alteração da forma esférica do embrião. ZP: Alteração de coloração e/ou espessura da zona pelúcida. BL s/ N: Número de blastômeros sem núcleo. MULTINUCLEAÇÃO: Descrever número de blastômeros que apresentam mais de um núcleo e o número de núcleos detectados. AH Nº 1 124 Fotomicrografia exemplificando embrião de Dia 4 de boa qualidade, apresentando evidência de compactação regular e ausência de alterações citoplasmáticas. CLASSIFICAÇÃO EMBRIONÁRIA - DIA+ 5 E DIA +6 Parâmetros avaliados (Gardner & Schoolcraft, 1999): Grau de expansão da blastocele BLASTOCISTO JOVEM Início de cavitação. Cavidade ocupando menos de 50% do volume. BLASTOCISTO Cavidade ocupando mais de 50% do volume do embrião. BLASTOCISTO COMPLETO Cavidade ocupa 100% do volume do embrião. BLASTOCISTO EXPANDIDO Aumento significativo do volume embrionário. Diminuição da espessura da zona pelúcida. BLASTOCISTO EM HATCHING Início da saída do trofoectodema através da zona pelúcida. BLASTOCISTO COM HATCHING COMPLETO Blastocisto completamente fora da zona pelúcida. 125 Massa celular interna (MCI) Critério de normalidade: proeminente, facilmente discernível, consistindo de muitas células compactadas e fortemente aderidas. Identificar caso esteja ausente, não compacta e/ou presença de células degeneradas. Trofoectoderma (TRF) Critério de normalidade: muitas células formando um epitélio coesivo. Identificar presença de poucas células, irregularidade na formação do epitélio coesivo e/ou presença de células degeneradas. Prontuário para registro das abservações: CLASSIFICAÇÃO DIA+5 MCI EMBRIÃO NÃO AUSENTE COMPACTA TRF CG CEL POUCAS IRREG DEG CEL CG CEL DEG Inserir marcação (X) para cada alteração observada nos embriões no dia 5 ou 6 do desenvolvimento. Legenda: EMBRIÃO: Descrever o grau de expansão da blastocele. MCI: Massa celular interna. TRF: Trofoectoderma. 126 Fotomicrografias exemplificando blastocistos de dia 5 apresentando diferentes grau de expansão da cavidade e critérios de normalidade para MCI e TRF. 127 Anexo 2 - Prontuários laboratoriais do Centro de Fertilização Assistida - Fertility 20 20 Corpúsculo fragmentado 19 19 □ ICSI ALTA MAGNIFICAÇÃO 18 18 OBSERVAÇÃO: 17 17 CG CE PV RE CL IN CF 16 16 INDICAÇÃO: 15 15 Nº 14 OBSERVAÇÃO 13 MEMB IRREG 14 CG 13 ZP 12 FORMA 12 VAC 11 POLARIZAÇÃO HALO 10 TAMANHO NUCLÉOLO 11 NÚMERO (0, 1 e 2) 10 MORFOLOGIA OOCITÁRIA Citoplasma Granular DP Debris no espaço perivitelino Citoplasma enegrecido EP Espaço perivitelíneo aumentado Presença vacúolos AZ Alteração em zona pelúcida Retículo endoplasmatico agregado AF Alteração de Forma Granulação em cluster MSRMenbrana sem resistência Inclusões citoplasmáticas MR Membrana resistente PN PERIFERICOS AFASTADOS 9 TAMANHO 8 Nº CP 9 Nº PN 8 OBSERVAÇÃO 7 MSR 6 MR 7 AF 6 AZ 5 EP EXTRA DP INCUBADORA: 4 CF CLASSIFICAÇÃO DIA + 1 )_______ 5 IN EMBRIOLOGISTA CHECAGEM: ( 4 RE )Roto 3 PV ( 2 CE INTRA )NF 3 CL ( 2 CG )3PN HORÁRIO DA CHECAGEM: ( DATA DA CHECAGEM: )2PN Roto/2N: 1 Injeção CLASSIFICAÇÃO OOCITÁRIA MÉDICO: ( OBS: Hialino: Nº Oócitos: TÉRMINO INJEÇÃO: )1PN Intactos: PI: HORÁRIO INJEÇÃO: ( MI: CRIO: INTERVALO INJEÇÃO: )Injetados ICSI: HORÁRIO PUNÇÃO: ( Injetados: Grau Maturação MII: Nº Folículos: DEN: 1 Nº EMBRIOLOGISTA ICSI: ETIQUETA MARIDO ETIQUETA ESPOSA FORMULÁRIO DE ICSI 128 15 16 17 18 19 20 15 16 17 18 19 20 OBSERVAÇÃO: □ Criopreservação □ dia +3 □ dia +5 □ Outro: □ Transferência □ dia +3 □ dia +5 14 14 Motivo: 13 13 □ SIM □ NÃO □ SIM □ NÃO 12 12 AUTORIZA DOAÇÃO DE EMBRIÃO 11 11 AUTORIZA CONGELAMENTO 9 10 9 8 10 7 8 Nº 6 AH 7 DESTINO 6 OBSERVAÇÃO 5 BD 4 MULTINUCLEAÇÃO 5 BL s/ N 3 ZP CLASSIFICAÇÃO DIA + 3 CG VAC FORMA 4 EMBRIÃO Frag gdes 3 OBSERVAÇÃO INCUBADORA: TOTAL DE FERTILIZADOS: 2 BL s/ N OBS: 1 ZP TOTAL DE INJETADOS: 2 EMBRIÃO CG VAC FORMA HORÁRIO DA CHECAGEM: EMBRIOLOGISTA: DATA DA CHECAGEM: TOTAL DE OÓCITOS: 1 Nº INDICAÇÃO: D1 Frag gdes MULTINUCLEAÇÃO EMBRIOLOGISTA: HORÁRIO DA CHECAGEM: CLASSIFICAÇÃO DIA+2 MÉDICO: DATA DA CHECAGEM: ETIQUETA MARIDO ETIQUETA ESPOSA FORMULÁRIO DE ICSI 129 OBS DESTINO AH Nº 13 14 15 16 17 18 19 20 12 13 14 15 16 17 18 19 20 OBSERVAÇÃO: □ Criopreservação dia +5/6 □ Outro: □ Transferência dia +5 12 11 AUTORIZA DOAÇÃO DE EMBRIÃO 11 10 INDICAÇÃO: 9 10 9 8 CEL DEG 8 CG 7 □ SIM □ NÃO □ SIM □ NÃO TRF CEL POUCAS IRREG DEG CEL 6 CG 7 AUTORIZA CONGELAMENTO MCI NÃO COMPACTA 6 AUSENTE 5 EMBRIÃO 5 OBS 4 CEL DEG 3 CG 4 CEL POUCAS IRREG DEG CEL 3 CG INCUBADORA: TOTAL DE FERTILIZADOS: 2 NÃO COMPACTA CLASSIFICAÇÃO DIA + 6 OBS: 1 AUSENTE TRF TOTAL DE INJETADOS: 2 EMBRIÃO MCI HORÁRIO DA CHECAGEM: EMBRIOLOGISTA: DATA DA CHECAGEM: TOTAL DE OÓCITOS: 1 D1 D2 D3 Nº EMBRIOLOGISTA: HORÁRIO DA CHECAGEM: CLASSIFICAÇÃO DIA+5 MÉDICO: DATA DA CHECAGEM: ETIQUETA MARIDO ETIQUETA ESPOSA FORMULÁRIO DE ICSI 130 131 8) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Aboulghar, M., R. 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Hum Reprod 17 (5):132733. 145 FONTES CONSULTADAS Normatização para apresentação de dissertações e teses – Pós-graduação – Faculdade de Ciências Médicas da Santa Casa de São Paulo, São Paulo, 2013. 146 RESUMO Com o objetivo de aumentar as taxas de sucesso das pacientes que são submetidas a técnicas de RHA, numerosos estudos apresentam como foco a identificação do embrião com maior potencial de implantação. Apesar dos avanços tecnológicos significativos da medicina reprodutiva baseados no advento da era da genômica, proteômica e metabolômica (OMICS), técnicas rotineiramente aplicáveis ainda não estão disponíveis. Desta forma, laboratórios de Fertilização in vitro de todo o mundo selecionam para transferência embriões humanos cultivados in vitro baseados em parâmetros morfológicos avaliados em microscopia de luz. Diversos parâmetros morfológicos podem ser avaliados desde o estágio pronuclear até o estágio de blastocisto para embriões humanos cultivados in vitro. De modo geral, independente do dia da transferência, tais critérios parecem apresentar valor preditivo de viabilidade embrionária quando avaliados individualmente ou coletivamente. No entanto, a subjetividade da avaliação morfológica, bem como a ampla diversidade de sistemas de classificação embrionária aplicados por diferentes clínicas, implica em resultados contraditórios tornando extremamente difícil a implementação de um consenso do valor preditivo dos diferentes parâmetros morfológicos avaliados. O presente estudo teve como objetivo a determinação do valor preditivo dos critérios morfológicos utilizados para seleção de embriões humanos cultivados in vitro de pacientes submetidas a procedimentos de RHA no Centro de Fertilização Assistida - Fertility no período de Julho 2011 a Junho de 2014. Tendo como base os resultados da análise bivariada de todos os critérios avaliados, 43 potenciais fatores preditivos para obtenção de blastocisto no dia 5 do desenvolvimento e 20 potenciais fatores preditivos de potencial de implantação embrionária foram selecionados para obtenção de um modelo de predição utilizando regressão logística binária múltipla. No modelo final de predição de formação de blastocisto foram incluídos 14 fatores, sendo 4 o número de fatores incluídos no modelo de predição de implantação destes embriões quando selecionados para transferência. O modelo poderá ser utilizado por embriologistas como ferramenta para a classificação de embriões de acordo com o potencial de formação de blastocisto, bem como de acordo com o potencial de implantação do blastocisto obtido, auxiliando na seleção de embriões para transferência. A otimização da seleção embrionária representa um grande potencial de aumento das taxas de sucesso do tratamento além de possibilitar a realização da transferência de um número reduzido de embriões, minimizando os riscos derivados de gestações múltiplas. 147 ABSTRACT In order to increase the success rate of in vitro Fertilization cycles, several studies have focused on the identification of the embryo with higher implantation potential. Despite recent advances in the reproductive medicine, based on the OMICs technology, routinely applicable methodologies are still needed. Thus, in most Fertilization Centers embryo selection for transfer is still based on morphological parameters evaluated under light microscopy. Several morphological parameters may be evaluated, ranging from the pronuclear to blastocyst stage. In general, despite the day of transfer, some criteria are suggested to present a predictive value for embryo viability when analyzed independently or combined. However, the subjectivity of morphological evaluation, as well as the wide diversity of embryo classification systems used by different fertilization centers show contrasting results, making the implementation of a consensus regarding different morphological criteria and their predictive value a difficult task. The present study aimed to determine the predictive value of morphological criteria used for selection of embryos derived from patients submitted to infertility treatment in the Fertility - Assisted Fertilization Center from July 2011 to June 2014. Based on the bivariate analysis of all selected criteria, 43 potential predictive factors for the achievement of blastocyst (day 5) and 20 potential predictive factors for blastocyst implantation potential were selected for the establishment of a prediction model using binary multiple logistic regression. The final model of blastocyst rate included 14 factors, whereas the final prediction model for implantation included 4. This model provides a helpful tool for embryologists in order to classify embryos according with their potential to develop into blastocyst, as well as according with the potential of implantation of the resulting blastocyst, improving embryo selection for transfer. The optimization of embryo selection represents a large potential to increase treatment success rates, allowing the transfer of a reduced number of embryos and minimizing the risks of multiple pregnancy. 148 LISTAS E APÊNDICE - Documento de aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa 149
