solubilização da griseofulvina em misturas de copolil

SOLUBILIZAÇÃO DA GRISEOFULVINA EM MISTURAS DE
COPOLI (OXIALQUILENO)S TRIBLOCOS: E43B14E43 E
E69P39E69
L
Maria E. N. P. Ribeiro1*, Igor M. Cavalcante1, Lillian M. U. Dutra1, Francisco C. F. de França1, Nadja M. P. S.
Ricardo1, Nágila M. P. S. Ricardo1
1*
Universidade Federal do Ceará – UFC, Campus do Pici, Fortaleza-Ce – [email protected]
Micelas de copoli(oxialquileno)s são importantes meios de solubilização e liberação de fármaco. Seu tamanho de escala
nano e conformação promovem maior proteção ao fármaco e maior tempo de circulação corporal. A solubilidade do
fármaco depende da composição do núcleo micelar, do peso molecular e concentração do copolímero, da temperatura,
bem como do método de solubilização empregado. Visando alcançar o máximo de solubilidade do fármaco modelo
griseofulvina, foram empregados quatro métodos de solubilização (dissolução, fundido, filme e sonicação) aos
copolímeros E43B14E43 e E62P39E62 e suas misturas (50/50 a 90/10). A solubilidade do fármaco e o coeficiente de
partição micela – água foi determinada por espectroscopia de UV-Vis. As misturas dos copolímeros promoveram maior
solubilidade ao fármaco em comparação aos copolímeros isolados. Neste estudo, o método de sonicação foi o mais
eficiente, sendo um método preparativo reprodutível e com a simplicidade aplicável a escala laboratorial e industrial.
Palavras-chave: copoli(oxialquileno)s, triblocos, micelas, solubilização, griseofulvina.
Solubilisation of griseofulvin in mixed triblock copoly(oxyalkylene)s: E43B14E43 e E69P39E69
Micelles of copoly(oxyalkylene)s are important microenvironment for solubilisation and drug release. Its nanoscale size
and conformation promote a greater protection to the drug and a higher body circulation time. The solubility of drugs
depends on the composition of the micellar core, molecular weight and concentration of copolymer, temperature, and
the method of solubilisation employed. To achieve the maximum solubility of the model drug griseofulvin, four
methods of solubilisation were used (dissolution, melt, film and sonication) to E43B14E43 and E62P39E62 copolymers and
their mixtures (50/50 to 90/10). The drug solubility and micelle – water partition coefficient (P) were determined using
UV – Vis spectroscopy. Mixtures of copolymers improve the drug solubilisation compared to the isolated copolymers.
In this study, the method of sonication was the most efficient which is a preparative and reproducible method and
simple to use in laboratory and industrial scale.
Keywords: copoly(oxyalkylene)s, triblocks, micelles, solubilisation, griseofulvin.
Introdução
Copolímeros em bloco de poli(oxialquileno)s ao serem dissolvidos em solventes seletivos
para um dos componentes podem se auto-organizar e formar micelas em soluções diluídas1. Quase
metade dos fármacos em potencial, falha em seu progresso para formulações farmacêuticas devido à
sua baixa solubilidade em água e sua absorção fraca ou errática2. Dessa forma, o fenômeno da
micelização tem suscitado interesse na aplicação desses copolímeros anfifílicos para a solubilização
aquosa de compostos hidrofóbicos encontrados na flora brasileira, como rutina e quercetina3, e para
carreamento e liberação de fármacos4. As micelas que possuem corona de polióxido de etileno
apresentam uma importante vantagem de resistirem à fagocitose pelos macrófagos, resultando em
um maior tempo de circulação no sangue ou fluidos corporais5 e promovendo uma proteção
adicional ao fármaco. Outra característica das micelas é o fato de apresentarem diâmetro de 10 a
100 nm, caracterizando-as como nanopartículas, favorecendo a sua circulação no organismo sem
acarretar obstrução dos vasos sanguíneos5.
Vários estudos têm utilizado copolímeros em bloco como solubilizantes de fármacos.
Observou-se que a solubilização é afetada pela composição do núcleo micelar, pelo peso molecular
e concentração do copolímero, pela temperatura, bem como pelo método empregado6. Visando
promover a máxima solubilidade do fármaco no meio micelar, diferentes métodos de solubilização
da griseofulvina (Figura 1), extensivamente estudada como fármaco modelo, foram empregados em
misturas de copolímeros triblocos com blocos hidrofílicos (corona micelar) de poli(óxido de
etileno) (Em), blocos hidrofóbicos de poli(óxido de propileno) (Pn) e poli(óxido de butileno) (Bn)
constituindo o núcleo micelar. A solubilidade do fármaco e o coeficiente de partição micela – água
foi obtida por espectroscopia de UV–Vis. A termodinâmica da solubilização também foi discutida
considerando a energia livre padrão de solubilização ( G°).
H3C
CH3
O
O
O
O
O
H3C O
Cl
CH3
Figura 1 – Estrutura química da griseofulvina
Experimental
1. Materiais
O copolímero E62P39E62 comercialmente conhecido como F87 foi obtido da Uniquema (ICI
Surfactants) e o copolímero E43B14E43 denominado B20-5000 foi obtido da Dow Chemical
Company. Água milli-Q e metanol (SYNTH) foram utilizados como solventes. O fármaco
griseofulvina foi obtido da Aldrich.
2. Misturas dos Copolímeros
As misturas foram preparadas com o copolímero E43B14E43 e com o copolímero E62P39E62,
respectivamente (50/50, 60/40, 70/30, 80/20 e 90/10). As misturas foram denominadas: BF50
(mistura 50/50), BF40 (mistura 60/40), BF30 (mistura 70/30), BF20 (mistura 80/20), BF10 (mistura
90/10).
3. Solubilização
A curva de calibração da griseofulvina foi preparada a partir dos dados de concentração
(mg/L) versus absorbância (A) com leitura no comprimento de onda de 292 nm. Espectrofotômetro
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U-2000 da Hitachi foi utilizado no experimento. Quatro métodos de solubilização foram utilizados
para estudo da capacidade de solubilização dos copolímeros triblocos e misturas. Nos métodos 1
(Dissolução) e 2 (Fundido) as soluções foram divididas em dois grupos, onde um dos grupos passou
pela etapa de centrifugação visando avaliar o efeito desta na solubilidade obtida por estes métodos.
Todas as medidas foram feitas em triplicata.
3.1. Método 1 (Dissolução)
Em alíquotas de 10 mL de cada solução estoque a 1% m/v dos copolímeros e misturas, foi
adicionada 10 mg de griseofulvina. As soluções foram lentamente agitadas a 25 oC por 4 dias e
posteriormente a 37 oC (± 0,1 ºC) pelo mesmo período em um banho termostatizado QUIMIS.
Retirou-se alíquotas de 3 mL do sobrenadante, sendo posteriormente filtradas em membrana
Millipore (0,45 m) para remoção de alguma porção de fármaco não solubilizado. Alíquotas das
amostras filtradas foram diluídas com metanol em concentrações conhecidas e a absorbância das
soluções resultantes determinadas em comprimento de onda de 292 nm. Os valores das
absorbâncias das soluções aquosas do fármaco e dos copolímeros foram obtidos e subtraídos dos
valores obtidos para as soluções aquosas dos copolímeros com fármaco.
3.2. Método 2 (Fundido)
Em 100 mg do copolímero fundido a 65 oC foi adicionado 10 mg do fármaco griseofulvina, e
a mistura permaneceu sob agitação por 3 horas para dissolução. Após este período foi acrescentado
10 mL de água a 65 oC, necessária para compor a concentração de 1% m/v. Esta temperatura foi
mantida por mais 1 hora e em seguida resfriada a 25 oC, temperatura na qual permaneceu por 4 dias.
A solução foi filtrada (Millipore 0,45 m) para remover o excesso do fármaco.
3.3. Método 3 (Filme)
Utilizou-se a metodologia descrita por Elsabahy e col. (2007) com algumas modificações7. O
copolímero (100 mg) e o fármaco (10 mg) foram dissolvidos em etanol (10 mL). O solvente foi
rotaevaporado à temperatura ambiente de 30 ºC e o volume final reconstituído com água milli-Q (10
mL). As soluções obtidas ficaram sob agitação por 24 horas, sendo em seguida centrifugadas (6000
rpm, 30 minutos), o sobrenadante coletado e filtrado através de membrana Millipore 0,45 µm.
3.4. Método 4 (Sonicação)
Em alíquotas de 5 mL de soluções dos copolímeros e misturas a 1% m/v utilizou-se 5 mg de
griseofulvina. Um sonicador Sonifier®/Branson W-450D de alta freqüência foi usado na amplitude
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de 20% (16 Watts) num intervalo de 1 minuto com pulsos alternados de 1s em banho de gelo,
mantendo a temperatura em torno de 25 °C. As soluções obtidas foram centrifugadas (6000 rpm, 30
minutos), o sobrenadante coletado e filtrado através de membrana Millipore 0,45 µm.
Resultados e Discussão
A Tabela 1 mostra as características moleculares dos copolímeros E43B14E43 e E62P39E62, tais
como massa molar numérica média (Mn), fração em massa do bloco E (WE) obtido por
espectroscopia de RMN 13C e a razão Mw/Mn obtida por cromatografia de permeação em gel.
Tabela 1 – Características moleculares dos copolímeros triblocos.
Copolímero
Mn (g/mol)
WE
Mw/Mn
Referência
E43B14E43
4790
0,693
1,08
Crothers e col. (2005)6
E62P39E62
7720
0,710
1,09
Ricardo e col. (2005)8
A curva de calibração da griseofulvina em metanol encontra-se na Figura 2. A equação da reta
obtida pelo programa Origin 7.0 é:
A = 0,02734 + 0,06173S (mg/L) (1)
1.50
A bsorbância
1.25
1.00
0.75
0.50
0.25
0.00
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0 12.5 15.0 17.5 20.0
C onc entraç ão (m g/L)
Figura 2 – Curva de calibração da griseofulvina em metanol.
A solubilidade é estudada através da massa do fármaco solubilizada por massa de copolímero,
chamada de capacidade de solubilização (Scp). A Scp é calculada a partir da solubilidade total do
fármaco na solução do copolímero (Stot) menos a solubilidade do fármaco em água (So) dividido
pela massa do copolímero (mcop).
Scp = Stot - So /mcop (2)
Visando verificar a contribuição da corona de polióxido de etileno na solubilização
promovida pelo copolímero, Chaibundit e col. (2002) estudaram a solubilidade da griseofulvina
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numa solução de polietileno glicol a 5% m/m (Mn = 6000 g mol-1) e verificaram que a solubilidade
apresentou-se pouco diferente das medidas de solubilidade desse fármaco em água9. Portanto, a
solubilização na corona formada pelos blocos E não é uma consideração relevante.
Crothers e col. (2005) também estimaram a capacidade de solubilização (Scp) da corona
composta por blocos E e concluíram que esta não influencia no valor de Scp do copolímero como
um todo6. Assim, apenas a porção hidrofóbica é levada em consideração e a capacidade de
solubilização em mg/g de bloco hidrofóbico (Sh) é analisada. A solubilidade é calculada a partir dos
valores de Scp, com Sh = Scp/Wh, onde Wh é a fração em massa do bloco hidrofóbico (Wh = 1–WE,
com valores de Wh calculada para as misturas, usando os valores separados dos copolímeros em
função de sua proporção). A quantidade de Sh fornece uma medida direta da eficiência da
solubilização em núcleos micelares, sendo independente da composição do copolímero.
A análise dos valores de Scp do copolímero E43B14E43 obtidos pelos métodos 1 (Dissolução) e
2 (Fundido) demonstrou que tais valores estão abaixo dos dados encontrados na literatura6 (Tabela
2). Entretanto, pode-se observar que os métodos 3 (Filme) e 4 (Sonicação) fornecem valores de Scp
intermediários entre os métodos 1 e 2 utilizando os dados da literatura para análise (Tabela 2). O
perfil de solubilidade em função do método aplicado é similar ao descrito por Ribeiro e col.
(2009a): Fundido > Sonicação > Filme > Dissolução10. Os dados da literatura6 para os métodos de
dissolução e fundido são uma média dos valores obtidos na faixa de concentração de 1-2,5% m/m.
Observou-se que para esse sistema, os métodos de solubilização por dissolução e fundido não
promovem boa solubilidade do fármaco, sendo compatível com a idéia de que cada sistema
polímero/fármaco exerce uma interação que será dependente do método de solubilização utilizado2.
A solubilidade da griseofulvina é maior no copolímero E43B14E43 do que no copolímero E62P39E62,
que é atribuído ao fato do E43B14E43 ser mais hidrofóbico do que o E62P39E62.
Tabela 2 – Valores de Scp obtidos neste trabalho e os citados na literatura para os copolímeros E43B14E43 e E62P39E62
Copolímero
Dissolução*
Dissolução
Fundido*
Fundido
25 °C
25 °C
37 °C
25 °C
25 °C
37 °C
E62P39E62
-
0,5
0,8
-
-
-
E43B14 E43
3,3
2,0
2,5
6,1
3,2
2,9
-
2,3
2,6
-
-
3,0
E43B14 E43**
*Crothers e col., 20056
**Soluções centrifugadas a 6000 rpm por 30 minutos.
#So 25°C = 3,6mg/100mL, So 37°C = 3,7mg/100mL
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A etapa de centrifugação não afeta a solubilização nos métodos 1 (Dissolução) e 2 (Fundido),
uma vez que o teor de fármaco suspenso no sobrenadante é pequeno e não precipita no processo.
Apenas a filtração removeu qualquer porção insolúvel existente.
A Tabela 3 mostra os valores de Scp e Sh obtidos pelos métodos 3 (Filme) e 4 (Sonicação) para
os copolímeros E43B14E43, E62P39E62 e suas misturas. Analisando os valores de Scp para os
copolímeros E43B14E43, E62P39E62 e de suas misturas observa-se que houve um aumento
significativo da capacidade de solubilização para mistura a partir de 70% do bloco mais hidrofóbico
(E43B14E43). Os valores de Scp obtidos pelo método da sonicação exibem valores superiores aos
polímeros isolados a partir de 60%. Tal comportamento foi também observado em estudos de
solubilização para misturas dos copolímeros E137S18E137 e E62P39E62 a partir de 80% do copolímero
E137S18E137 na formulação11. Torna-se relevante destacar que, em todos os métodos empregados
neste estudo, as misturas favorecem uma maior solubilidade do que os copolímeros isolados.
Tabela 3– Valores de Scp e Sh obtidos pelos métodos 3 (Filme) e 4 (Sonicação) para os copolímeros E43B14E43, E62P39E62 e suas misturas.
Sistema
Filme
Sonicação
Scp (mg/g)
Sh (mg/g)
Scp (mg/g)
Sh (mg/g)
E62P39E62
1,3
4,6
3,8
13
E43B14E43
4,2
13,7
5,5
18
BF50
3,5
11,8
4,9
16,4
BF40
4,1
13,7
6,2
20,7
BF30
4,6
15,2
7,1
23,5
BF20
5,0
16,5
7,1
23,4
BF10
5,0
16,4
7,3
23,9
O coeficiente de partição micela – água (P) é a razão da concentração do fármaco na micela
pela concentração do fármaco em água de uma determinada concentração de copolímero, como
mostrado abaixo:
P = Stot - So /So (3)
onde Stot é a solubilidade do fármaco pela solução micelar do copolímero à concentração específica
e So é a solubilidade do fármaco em água, respectivamente.
Termodinamicamente, a solubilização pode ser considerada como uma partição normal do
fármaco entre as fases micela e água, e a energia livre padrão de solubilização ( G°) pode ser
representada pela seguinte equação:
G° = -RT lnP (4)
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onde R é a constante universal dos gases, T é a temperatura absoluta e P é o coeficiente de partição
entre a micela e a fase aquosa.
Na Tabela 5 encontram-se os valores de coeficiente de partição (P) e energia livre padrão de
solubilização ( G°) obtidos pelos métodos 3 (Filme) e 4 (Sonicação). Os resultados de
solubilização obtidos pelos métodos 3 e 4 mostram que há um aumento significativo no coeficiente
de partição do copolímero E62P39E62 para o copolímero E43B14E43. Em estudos realizados com uma
série de copolímeros do tipo EmPnEm foi observado aumento no coeficiente de partição em função
da concentração e temperatura, mostrando que o copolímero torna-se mais hidrofóbico com o
aumento da tempertaura e de sua concentração no estudo de solubilização12. Ao comparar
copolímeros diferentes pode se observar que quanto maior o coeficiente de partição mais
hidrofóbico será o copolímero. No caso, o copolímero E43B14E43 é mais hidrofóbico do que o
copolímero E62P39E62. Nas misturas observa-se um aumento do coeficiente de partição com o
aumento da proporção do copolímero mais hidrofóbico condizente com o discutido anteriormente, o
qual se torna maior que o copolímero E43B14E43 a partir de 70% na mistura para o método 3 e 60%
para método 4.
Tabela 5 – Valores de coeficiente de partição (P) e energia livre padrão de solubiliação ( G°) obtidos pelos métodos 3 (Filme) e 4 (Sonicação) para
os copolímeros E43B14E43, F87 e suas misturas.
Sistema
Filme
P
Sonicação
G° (KJ/mol)
P
G° (KJ/mol)
E62P39E62
0,36
+ 2,6
1,06
-0,1
E43B14E43
1,15
-0,4
1,53
-1,0
BF50
0,96
+0,1
1,36
-0,8
BF40
1,12
-0,3
1,72
-1,3
BF30
1,26
-0,6
1,97
-1,7
BF20
1,37
-0,8
1,97
-1,7
BF10
1,37
-0,8
2,03
-1,8
A solubilização espontânea do fármaco griseofulvina nas soluções aquosas dos copolímeros e
misturas é manisfetada por valores negativos de energia livre padrão ( G°), o qual sugere
apreciável aumento do número de agregação de micela12.
Os sistemas apresentam o perfil de espontaneidade pelo método 3, com exceção para o
copolímero E62P39E62 e a mistura BF50 que são pouco hidrofóbicos. O método 4 (Sonicação)
favoreceu a espontaneidade da solubilização. A espontaneidade de solubilização é obtida quando a
solubilidade na solução micelar é igual ou maior ao dobro da solubilidade em água (P > 1). As
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misturas favoreceram uma maior solubilidade, o que indica a existência de maior agregado micelar
em relação aos copolímeros separados.
Conclusões
Os copolímeros E43B14E43 e E62P39E62 são bons solubilizadores da griseofulvina. Entretanto,
vale destacar que dentre os métodos empregados, o método de sonicação exibe maior eficiência de
solubilização, sendo este um método preparativo reprodutível e com a simplicidade aplicável a
escala laboratorial e industrial.
Agradecimentos
Os autores agradecem a CAPES, FUNCAP e ao CNPq.
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