E21P67E21 e E45S17 como nanocarreadores dA GRISEOFULVINA

E21P67E21 E E45S17 COMO NANOCARREADORES DA
GRISEOFULVINA: ESTUDOS DE SOLUBILIZAÇÃO E
CITOTOXICIDADE
Samira A. de Oliveira1, Felipe G. Verçosa1, Maria E. N. P. Ribeiro1, Luzia K. A. M.
Leal2, Amanda de A. Lopes2, Nágila M. P. S. Ricardo1
1
Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Laboratório de Polímeros e Inovações de Materiais,
Universidade Federal do Ceará, Fortaleza (CE), Brasil.
2
Departamento de Farmácia, Laboratório de Toxicologia e Farmacologia Celular, Universidade Federal
do Ceará, Fortaleza (CE), Brasil.
E-mail: [email protected]
Resumo. A baixa solubilidade da griseofulvina em meio aquoso (1,4 e 1,95 mg/dL a 25 e 37 °C,
respectivamente) é fator limitante para sua administração. No entanto, soluções micelares preparadas
com copolímeros vêm sendo utilizadas para aumentar a solubilidade desses fármacos. Além disso, essas
misturas de surfactantes apresentam baixa toxicidade, como também eficiência no processo de
dissolução, sendo estes, fatores determinantes para despertar interesse nas pesquisas com copolímeros.
Esse trabalho propõe o uso de misturas micelares dos copolímeros E21P67E21 (P123) e E45S17
(denominado S17) para se obter capacidades de solubilização do fármaco grisolfulvina mais elevadas,
bem como o estudo de citotoxicidade desses carreadores. Foi observado que o menor CMC é
apresentado pela mistura P123/S17 50/50 a 37 °C (0,0015 g dm-3), consequentemente esse sistema
apresentou o melhor resultado de capacidade de solubilização para grisofulvina (8,13 mg/g). Os
polímeros estudados não são citotóxicos, o que potencializa seu uso em formulações farmacêuticas.
Palavras-chave: copolímeros em bloco, solubilização, griseofulvina, citotoxicidade
1.
INTRODUÇÃO
Um desafio das ciências da saúde e da indústria farmacêutica é aperfeiçoar o
desempenho de fármacos no organismo humano, reduzindo assim, as doses de
administração, o nível de toxicidade e os efeitos colaterais, melhorando sua eficiência.
Por esta razão, vários tipos de nanopartículas coloidais vêm sendo investigados, dentre
eles, micelas poliméricas formadas por copolímeros em bloco. Esses copolímeros têm
atraído grande interesse devido a características como a ação do núcleo hidrofóbico no
controle e na liberação do fármaco no organismo, como também por apresentarem baixa
toxicidade e principalmente por serem capazes de aumentar a solubilidade de fármacos
poucos solúveis em água (Aliabadi e Lavasanifar, 2006). A griseofulvina, cuja estrutura
química é indicada na Figura 1, é um fármaco aromático pouco solúvel em água que
possui atividade antifúngica. É um padrão apropriado para testar solubilização de drogas
em micelas poliméricas (Rekatas e col, 2001). Trabalhos recentes mostraram que as
micelas de copolímeros em bloco sintetizados com blocos hidrofóbicos de óxido de
estireno, com os comprimentos destes blocos variando de 5 a 19 unidades repetitivas
são solubilizantes mais eficientes para fármacos lipofílicos do que as soluções micelares
de copolímeros em bloco do tipo EmPnEm (Rekatas e col, 2001; Crothers e col, 2005;
Taboada e col, 2005). Com isso, assumindo que a solubilidade e citotoxicidade são
fatores essenciais para a biodisponibilidade e eficácia do fármaco, esse trabalho tem
como objetivo encapsular a griseofulvina nas misturas dos copolímeros P123 e E45S17
(S17), quantificá-la por espectroscopia UV/Vis, bem como analisar a citotoxicidade dos
carreadores.
H3CO
OCH 3
O
4
1'
3
2
H3CO
O
6
7
Cl
H
3'
O
5'
H3C
H
1
Figura 1. Estrutura química
da griseofulvina.
[CH 3(CH 2)15CH 2CH 2][OCH 2CH 2O(CH 2CH 2O) 18CH 2CH 2OH]
A
B
C
D
E
E
2.
MATERIAIS E MÉTODOS
2.1
Concentração Micelar Crítica (CMC)
F
F
G
G
2
A determinação da concentração micelar crítica (CMC) dos copolímeros E45S17
(cedido pelo Laboratório de Polímeros da Universidade de Manchester e denominado
S17), P123 (obtido da BASF) e suas misturas foi realizada usando um
espectrofotômetro de fluorescência Hitachi F-4500. O corante 1,6-difenil-1,3,5hexatrieno (DPH) da Biochemika foi utilizado como agente fluorescente e utilizado
como recebido. Soluções estoque de 1% m/v dos polímeros foram preparadas por
dissolução em água Milli-Q por 24 horas para completa solubilização antes das
diluições necessárias (0,01 mg dm-3–100 mg.dm-3). O DPH foi dissolvido em metanol
(0,4 mM) e adicionado a solução dos polímeros na razão de 1:100 (40 µL de DPH em 4
mL de solução). Para as medidas no fluorímetro e construção dos gráficos, o
comprimento de excitação usado foi de 350 nm e a emissão medida foi em 428 nm. As
medidas de fluorescência foram feitas entre 4 e 8 horas após a adição de DPH. Os dados
foram coletados a 25 e 37 + 0,2 °C.
2.2
Solubilização
Utilizou o método de dissolução direta para a incorporação do fármaco
griseofulvina (obtido da Aldrich). Foram preparadas soluções aquosas a 1% m/v dos
polímeros e a uma alíquota de 10 mL de solução foi adicionada uma porção do fármaco
griseofulvina (m≈10 mg). Os sistemas foram lentamente agitados a 25 °C (± 0,1 ºC),
por 4 dias, num banho termostatizado QUIMIS. Retirou-se uma alíquota de 3 mL do
sobrenadante, e em seguida foi filtrado em membrana Millipore de porosidade 0,45 µm,
para remoção de qualquer porção de fármaco não solubilizado. O restante da solução foi
mantida no banho a 37 °C por 4 dias e o mesmo procedimento foi realizado. A
quantificação de fármaco solubilizado foi investigada por espectroscopia UV/Vis.
2.2.1 Quantificação por Espectroscopia UV/Vis
A partir da curva de calibração para o fármaco griseofulvina em metanol foi
possível obter a equação que correlaciona absorção e concentração (mg/L) no
comprimento de 292 nm. Alíquotas das amostras filtradas foram diluídas com metanol e
a concentração de fármaco foi monitorada por espectroscopia UV/VIS, usando-se
metanol puro para estabelecer a linha de base. A solubilidade do fármaco apenas em
água foi calculada com o mesmo procedimento descrito no item 2. As absorbâncias das
soluções aquosas dos polímeros no comprimento de onda do fármaco também foram
medidas para correção dos valores de absorbância obtidos para o sistema contendo o
fármaco. Todas as medidas foram feitas pelo menos em triplicata.
2.3
Ensaios de Citotoxicidade: Determinação de Lactato Desidrogenase (LDH)
A LDH é uma enzima citosólica, assim sua detecção no fluido extracelular é um
indicativo de morte ou perda da integridade celular e, na avaliação da viabilidade celular
constitui num método mais sensível do que a técnica de exclusão com azul tripan. O
princípio do ensaio constitui numa medida espectrofotométrica do consumo de NADH
durante a ação catalítica da LDH que reduz o piruvato a lactato (Henson, 1971;
Lucisano e Mantovani, 1984). A citotoxicidade dos polímreos foi avaliada pela medida
da LDH em neutrófilo humano, utilizando o kit LDH Liquiform (Labtest Diagnostica).
Neutrófilos (5 x 106 céls./mL) foram incubadas durante 15 min a 37 °C na presença dos
polímeros (1, 10, 50 e 100 µg/mL), Triton X-100 0,2 %, DMSO 0,4 % (controle) ou
solução de Hanks (normal).
2.3.1 Análise Estatística
A análise foi realizada com auxílio do programa GraphPad Prism 5.0 (USA). Os
resultados estão expressos como média ± EPM e a comparação entre as médias foi
realizada utilizando análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey. As
diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando P<0.05.
3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1
Concentração Micelar Crítica (CMC)
Os resultados obtidos para os valores da concentração micelar crítica (CMC)
estão contidos na Tabela 1. O copolímero S17 apresenta menor CMC que o copolímero
P123, fato esperado, uma vez que o copolímero S17 apresenta o núcleo S (polióxido de
estireno) mais hidrofóbico que o núcleo P (polióxido de propileno). A arquitetura
também favorece a CMC. O dibloco possui uma melhor liberdade espacial que o
tribloco. Observa-se que esses valores sofreram diminuição com o aumento da
temperatura. Em geral, o aumento da temperatura diminui a CMC, pois aumenta a
hidrofobicidade do copolímero. Pode-se observar que a mistura P123/S17 50/50
apresenta um baixo CMC, o que significa uma boa contribuição entre as arquiteturas
dos copolímeros nesta proporção.
Tabela 1. Resultados de concentração micelar crítica (CMC) dos copolímeros P123, E45S17 e
suas misturas a 25 e 37 °C.
CMC (g dm-3)
CMC (g dm-3)
25ºC
37ºC
P123*
0,14
0,04
P123/S17 50/50
0,0014
0,0015
P123/S17 30/70
0,0022
-
S17
0,0028
0,002
Sistemas
(-) medida em andamento
* referência [7]
3.2
Solubilização
A quantificação da griseofulvina por espectroscopia UV/Vis foi calculada a
partir da Eq. 1.
(1)
A = 0,01144  0,06359[S ](mg / L)
Os valores obtidos para a capacidade de solubilização do fármaco (Scp) estão
mostrados na Tabela 2.
Foi possível observar que a melhor capacidade de solubilização foi a da mistura
P123/S17 50/50 a 37 °C, devido a baixa CMC desta mistura. Logo, esta proporção
apresenta melhor estabilidade e melhor capacidade de carreamento do fármaco em
estudo.
Tabela 2. Capacidade de solubilização da griseofulvina (mg/g) do copolímero P123 e das
misturas de P123 com o S17 a 25 e 37 °C por espectroscopia UV/Vis.
Scp (mg/g)
Scp (mg/g)
25 °C
37 °C
P123
3,28
5,10
P123/S17 50/50
2,75
8,13
P123/S17 30/70
2,35
2,82
Sistemas
3.3
Ensaios de Citotoxicidade: Determinação de Lactato Desidrogenase (LDH)
A Figura 2 (a e b) mostra o efeito de P123 e E45S17 sobre a viabilidade de
neutrófilo humano mensurada através da atividade da LDH.
(A)
(B)
60
Atividade LDH
(U/L)
***
40
20
Atividade LDH
(U/L)
***
60
40
20
Tr
ito
n
-1
00
-5
0
P1
23
-1
0
P1
23
-1
P1
23
P1
23
4%
SO
DM
Tr
ito
n
-1
00
17
-5
0
E
45
S
17
-1
0
E
45
S
17
E
45
S
17
-1
4%
45
S
E
S
S
O
B
S
M
H
D
HB
SS
0
0
g/mL
g/mL
Figura 2. Avaliação da citotoxicidade de polímeros - E45S17 (A) e P123 (B) em neutrófilo
humano, mensurada pela atividade da lactato desidrogenase.
O polímero P123 (1, 10, 50 e 100 μg/mL), ao contrário do Triton X-100 (padrão
de citotoxicidade) não aumentou significativamente a atividade da LDH (21,84 ± 2,59;
22,89 ± 3,57; 26,65 ± 4,51 e 22,26 ± 4,61 U/L) dos neutrófilos humano quando
comparada ao grupo controle - DMSO 0,4% (13,00 ± 3,03 U/L). Resultados
semelhantes foram obtidos com o E45S17 (1, 10, 50 e 100 μg/mL) que também não
mostrou citotoxicidade (LDH: 12,32 ± 4,45; 12,95 ± 4,25; 11,10 ± 2,89 e 5,93 ± 0,21
U/L) quando comparada ao grupo Controle- DMSO 0,4%: (LDH: 13,00 ± 3,03 U/L).
Pode-se observar ainda que o copolímero dibloco E45S17 apresenta menor citotoxicidade
que o copolímero tribloco P123. Os polímeros (1–100 µg/mL), DMSO 0,4 % (controle),
solução de Hanks (Normal) ou Triton X-100 0,2% (padrão) foram adicionados à
suspensão de neutrófilos (5 x 106 céls/mL) por 15 min a 37 °C antes da determinação da
atividade da lactato desidrogenase (LDH). Os valores representam a média ± EPM.
*=p<0,05 (ANOVA, Tukey)
4.
CONCLUSÕES
Dentre os copolímeros estudados, a mistura P123/S17 50/50 foi a que apresentou
melhor estabilidade micelar (devido ao baixo CMC), sendo, portanto o melhor carreador
e agente solubilizante. A toxicidade exibida pela avaliação preliminar da citotoxicidade
dos copolímeros E45S17 e P123, estudada em neutrófilo humano, sugere que os mesmos
não interferem na permeabilidade celular, mensurada pela atividade da lactato
desidrogenase.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem aos órgãos CNPq, CAPES (PRODOC) e FUNCAP pelo suporte
financeiro.
REFERÊNCIAS
Aliabadi, H. M., Lavasanifar, A. (2006) Expert Opion. Drug Deliv., , 3, 139.
Crothers, M., Zhou, Z., Ricardo, N. M. P. S., Yang, Z., Taboada, P., Chaibundit, C., Attwood, D., Booth,
C. (2005) Int. J. of Pharm., 293, 91.
Henson, P. M. (1971) The Journal of Immunology, 107, 1535.
Lucisano, Y. M., Mantovani, B. (1984) The Journal of Immunology, 132, 2015.
Rekatas, C. J., Mai, S.-M., Crothers, M., Quinn, M., Collett, J. H., Attwood, D., Heatley, Martini, F., L. ,
Booth, C. (2001) Phys. Chem. Chem. Phy., 3, 4769.
Taboada, P., Velasquez, G., Barbosa, S., Castelletto, V., Nixon, S. K., Yang, Z., Heatley, F., Hamley, I.
W., Ashford, M., Mosquera, V., Attwood, D., Booth, C. (2005) Langmuir, 21, 5263.
E21P67E21 AND E45S17 AS GRISEOFULVIN NANOCARRIERS:
SOLUBILISATION AND CYTOTOXICITY STUDIES
Samira A. de Oliveira1, Felipe G. Verçosa1, Maria E. N. P. Ribeiro1, Luzia K. A. M.
Leal2, Amanda de A. Lopes2, Nágila M. P. S. Ricardo1
1
Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, Laboratório de Polímeros e Inovações de Materiais,
Universidade Federal do Ceará, Fortaleza (CE), Brasil.
2
Departamento de Farmácia, Laboratório de Toxicologia e Farmacologia Celular, Universidade Federal
do Ceará, Fortaleza (CE), Brasil.
E-mail: [email protected]
Abstract. The low solubility of griseofulvin in aqueous medium (1.4 and 1.95 mg/dL at 25 and 37 °C,
respectively) is the limiting factor for its administration. However, micellar solutions prepared with
copolymers have been used to increase the solubility of those drugs. Besides, those mixtures of
surfactants present low toxicity, as well as efficiency in the dissolution process, being those determinant
factors to increase interest on the research of these copolymers. This work proposes the use of micellar
mixtures of the copolymers E21P67E21 (P123) e E45S17 (denominated S17) to obtain higher solubilisation
capacities for griseofulvin, as well as the cytotoxicity study of those carriers. It was observed that the
mixture P123/S17 50/50 (0.0015 g dm -3) presented at 37 °C the lower CMC, consequently this system
presented the best result of solubilisation capacities for griseofulvin (8.13 mg/g). The polymers that have
been studied are not cytotoxic, which potentialize its use in pharmaceutical formulations.
Keywords: block copolymer, solubilisation, griseofulvin, cytotoxicity