Infecção experimental com Aeromonas hydrophila em Astyanax

Infecção experimental com Aeromonas hydrophila em Astyanax bimaculatus
alimentados com dieta suplementada com probióticos
Jatobá, Adolfo1; Batista, Elizabeth Baggio2; Moreira, Luiz Sérgio3; Ferreira, Mario4.
1,2,3,4
IFCatarinense, Araquari/SC
INTRODUÇÃO
Os lambaris (Axtyanax sp.) tem grande potencial para piscicultura, são espécies
dulcícolas, distribuídos em todo território nacional, podendo atingir produtividades superiores
a 100 T por ha. Entretanto, para obtenção dessa elevada produtividade exige-se uma
intensificação dos sistemas de cultivo, favorecendo o surgimento de enfermidades.
O uso inadequado de antibióticos na piscicultura, como agentes terapêuticos no
controle de doenças bacterianas, está associado ao desenvolvimento de cepas resistentes.
Sendo os probióticos uma alternativa capaz de promover benefícios sobre o hospedeiro, por:
modificar a microbiota, melhorar a absorção dos nutrientes pelo animal, tornar mais eficiente
o sistema imunológico do hospedeiro frente enfermidades, e/ou melhorar o seu ambiente.
(JATOBÁ et al., 2008; 2011; MUÑOZ et al., 2013). E uma das formas de avaliar o efeito
desses probióticos é por meio da realização de desafios experimentais.
O objetivo deste trabalho foi avaliar a sobrevivência do Axtyanax bimaculatus
infectado experimental com Aeromonas hydrophila, alimentados com dieta suplementada
com bactérias ácido-láticas, após determinação da dose letal.
MATERIAL E MÉTODOS
1
Docente EBTT
Graduanda em Medicina Veterinária
3
Auxiliar Agropecuário
4
Colaborador
Trabalho com apoio do CNPq, FAPESC e GUABI.
2
O trabalho foi realizado no Laboratório de Aquicultura do IFCatarinense, câmpus
Araquari, em parceria com o setor de microbiologia do laboratório de camarões marinhos
(LCM) da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC).
Material Biológico
Foi utilizada uma cepa de bactéria ácido-láctica presente no cepário do Laboratório de
Aquicultura do IFCatarinense. A cepa foi isolada e selecionada de acordo com o projeto
intitulado: “Seleção de probióticos para lambari e sua especificidade com os hospedeiros”
aprovados em edital081/2012 PIBITI/PIBIC/PIBIC-Af/CNPq/IFC. E uma cepa de Aeromonas
hydrophila (ATCC 7966) fornecida pelo setor de microbiologia do LCM/UFSC.
Definição da dose para infecção experimental (DL50)
Para isto, 150 lambaris do rabo amarelo (A. bimaculatus), com 10,2 ± 0,3 g, foram
distribuídos em 15 caixas de polietileno, 10 peixes em cada, equipadas com filtro biológico e
temperatura constante (24 – 25°C). Inóculo de A. hydrophila foi incubado em tubos de ensaio,
em caldo de coração e cérebro (BHI), a 30°C por 24 horas. Após esse período, o inóculo foi
centrifugado por 15 min a 10.000 g, e o precipitado ressuspenso em 10 mL de solução salina
estéril (SSE) 0,65% NaCl, estabelecendo as cinco doses (tratamentos) avaliadas: 2,1x10³,
2,1x104, 2,1x105, 2,1x106 e 2,1x107 unidades formadoras de colônias (UFC) de A. hydrophila
por mL, em triplicata. Todos os peixes receberam 100µL com a dose de A. hydrophila
ressuspensa em SSE, e a mortalidade acumulativa dos peixes foram avaliadas a cada 6 horas,
durante 24 horas.
Infecção experimental com Aeromonas hydrophila
A dieta experimental foi preparada de acordo com o descrito em Jatobá et al.(2008).
Para infecção experimental serão utilizados 80 lambaris do rabo amarelo distribuídos, com
peso médio 10,4 ± 0,3 g, em 8 caixas de polietileno (40L) equipadas com filtros individuais e
termostatos mantendo a temperatura aproximadamente entre 28 - 29°C. Os lambaris foram
alimentados duas vezes ao dia ad libitium, com a ração suplementada com a bactéria ácidoláctica e ração controle. O oxigênio dissolvido e pH variaram entre 5,2 – 5,5 mg/L e 7,1 – 7,3,
respectivamente.
O experimento foi em delineamento completamente ao acaso, distribuídos em dois
tratamentos, peixes submetidos à injeção intraperitoneal de 100 μL de SSE 0,65% NaCl
2
(Controle) e peixes submetidos à injeção intraperitoneal de 2,1x106 UFC de A. hydrophila
suspensos em 100 μL de SSE, com três repetições. Após 24 horas, foi avaliada a
sobrevivência dos peixes.
Avaliação microbiota do trato intestinal
Um dia, 24 horas, após a infecção experimental, foi coletado um “pool” do trato
intestinal de quatro lambaris, por unidade experimental. Para esta coleta os peixes foram
anestesiados em óleo de cravo (1%) e sacrificados por comoção cerebral. Os tratos foram
macerados e diluídos serialmente (fator 1:10) em solução salina estéril (SSE) 0,65%. As
amostras de cada diluição foram semeadas em meio Plate Count Agar (PCA), Agar
tiossulfato citrato bile sacarose (TCBS), Agar Cetrimide e Agar MRS, e incubados por 48h a
30°C, para contagem de bactérias totais, vibrionaceas, Pseudomonas e ácido-láticas,
respectivamente.
Avaliação estatística
Para as análises estatísticas, os valores das contagens microbiológicas serão
transformados para log(x + 1). A DL50 foi avaliada por meio de uma regressão, enquanto os
dados da infeção experimental foram submetidos à análise de variância. Uma vez encontrada
a diferença entre os tratamentos, as médias foram comparadas, pelo teste Student-NewmanKeuls, a 5% de probabilidade.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nas três doses mais elevadas foi registrado mais de 50% de mortalidade após 18 horas,
enquanto a menor dose registrou apenas 36,7 ± 5,8 %, após 24 horas, sendo a dose de 2,1x104
responsável por 50,0 ± 10,0 % da mortalidade (gráfico 1). Com isto, a dose de 2,1x104 UFC
de A. hydrophila por mL foi definida como DL50, sendo a dose mais indicada para ensaios
experimentais em Astyanax bimaculatus, com aproximadamente 10 g. A mortalidade da
DL50 para os lambaris do rabo amarelo, 24 horas, após infecção com A. hydrophila, pode ser
expressa pela equação y = 16x – 13,3333, com r² = 0,9443.
A sobrevivência, após a infecção experimental com 2,1x104 UFC de A. hydrophila por
mL, não foi influenciada pela suplementação das bactérias ácido-láticas (Tabela 1), apesar de
3
ser registrado um média superior, indicando que novos testes podem ser realizados com um
“n” maior, com intuito de reduzir o desvio padrão.
Mortalidade
120
Mortalidade (%)
100
80
60
y = 16x - 13,333
R² = 0,9443
40
20
0
2
3
4
5
6
7
8
10x UFC de Aeromonas hydrophila por mL
Gráfico 1. Mortalidade do A. bimaculatus, 24 horas após infecção
experimental com A. hydrophila.
Jatobá et al (2008) não observaram efeitos na sobrevivência de tilápias do Nilo
alimentadas com bactérias ácidos-láticas desafiadas experimentalmente com Enterococcus sp.
Entretanto, isto divergiu do observado por Mouriño et al. (2013) que registraram maior
sobrevivência de pintados, alimentados com dieta suplementada com bactérias ácido-láticas,
após uma infecção experimental contra a mesma A. hydrophila.
No trato intestinal dos lambaris do rabo amarelo, alimentados com dieta suplementa
com bactérias probióticas foi observado um maior número de bactérias ácido-lácticas, e
menores de bactérias totais e Vibrios sp. .por g de trato intestinal, nos peixes alimentados com
dieta suplementada com probiótico, em relação aos alimentados com dieta controle (Tabela
1). Esta alteração na microbiota do trato intestinal já foi observada em diversos animais
aquáticos quando alimentados com dietas suplementadas com bactérias ácido-láticas
(Carnevali et al. 2006; Gatesoupe, 2008; Jatobá et al. 2008, 2011; Barbosa et al. 2011;
Mouriño et al. 2012).
Tabela 1. Média ± desvio padrão da sobrevivência e microbiota do trato digestório do A. bimaculatus,
alimentados com dieta suplementada com bactérias acido-lática, 24 horas após infecção de A.
hydrophila.
Tratamento
Sobrevivência
(%)
Bactérias
heterotróficas totais
log(x + 1)
Bactérias
ácido-láticas
log(x + 1)
Vibrios sp.
log(x + 1)
4
Probiótico
63,0 ± 10,5
5,3 ± 0,4*
Controle
49,3 ± 17,8
7,0 ± 0,6
*Indica diferenças significativas entre os tratamentos no t-test (5%).
3,3 ± 0,5*
2,4 ± 0,4*
0,9 ± 0,8
,3 ± 0,4
CONCLUSÕES
A dose de 2,1x104 UFC de A. hydrophila por mL foi definida como DL50, sendo a dose
mais indicada para ensaios experimentais em Astyanax bimaculatus, com aproximadamente
10 g.
A suplementação de bactérias probióticas não interferiu a sobrevivência do
Astyanax bimaculatus, 24 horas após uma infecção experimental com 2,1x104 UFC de A.
hydrophila por mL.
A suplementação de bactérias probióticas alterou beneficamente a microbiota do
Astyanax bimaculatus, 24 horas após uma infecção experimental com 2,1x106 UFC de A.
hydrophila por mL.
REFERÊNCIAS
BARBOSA, M. C. et al. Cultivation of Juvenile Fat Snook (Centropomus parallelus Poey,
1960) Fed Probiotic in Laboratory Conditions, Brazilian Archives of Biology and
Technology, v.54, n.4, p. 795 – 801, 2011.
CARNEVALI, O. et al. Growth improvement by probiotic in European sea bass juveniles
(Dicentrarchus labrax, L.), with particular attention to IGF-1, myostatin and cortisol gene
expression. Aquaculture, v. 258, p. 430–438, 2006.
GATESOUPE, F. J. Updating the importance of lactic acid bacteria in fish farming: natural
occurrence and probiotic treatments. Journal Molecular Microbiology Biotechnology, v. 14
(1), p. 107-114, 2008.
JATOBÁ, A. et al. Diet supplemented with probiotic for Nile tilapia in polyculture system
with marine shrimp. Fish Physiology and Biochemestry, v. 37, p. 725-732, 2011.
JATOBÁ, A., et al. Lactic-acid bacteria isolated from the intestinal tract of Nile tilapia
utilized as probiotic. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 43, n.9, p.1201-1207, 2008.
MOURIÑO, J.L.P et al.; Effect of dietary supplemantation of inulin and W. cibaria on
haemato-immnunological parameters of hybrid surubim (Pseudoplatystoma sp.).
Aquaculture Nutrition, v.18, p. 73-80, 2012.
5
MUÑOZ, A. ,E., et al. Antimicrobial activity, antibiotic susceptibility and virulence factors of
Lactic Acid Bacteria of aquatic origin intended for use as probiotics in aquaculture. BMC
Microbiology. Vol.13, p.15-15, 2013.
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