Potencial Genotóxico do Extrato Aquoso da raiz da planta Physalis

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TERESINHA ROSA CABRAL
Potencial Genotóxico do Extrato Aquoso da raiz da planta Physalis
Angulata
Belém – Pará
2005
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TERESINHA ROSA CABRAL
Potencial Genotóxico do Extrato Aquoso da raiz da planta Physalis
Angulata
Dissertação
apresentada
ao
Programa
de
Pós-
Graduação em Neurociências e Biologia Celular, do
Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal
do Pará, como requisito parcial para obtenção do grau de
mestre.
Prof. Orientador: Dr. Rommel M. R. Burbano
Belém – Pará
3
2005
Dados Internacionais da Catalogação-na-Publicação (CIP)
Biblioteca de Pós-Graduação do ICB-UFPA – Belém (PA)
Cabral, Teresinha Rosa
Potencial genotóxico do extrato aquoso da
raiz da planta Physalis Angulata / Teresinha Rosa
Cabral; orientador, Rommel Mario Rodríguez Burbano.
– 2005.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Pará,
Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação
em Neurociências e Biologia Celular, Belém, 2005.
1. Plantas medicinais. 2. Plantas medicinais – Toxicidade.
3. Solanaceae. 4. Toxicologia genética. 5. Matéria médica
vegetal. I. Título.
4
CDD – 20. ed. 615.321
5
TERESINHA ROSA CABRAL
Potencial Genotóxico do Extrato Aquoso da raiz da
planta Physalis Angulata
Banca Examinadora:
________________________________________________
Prof. Dr. Rommel Mario Rodrigues Burbano (orientador)
Departamento de Biologia, CCB, UFPA
________________________________________________
Prof. Dr. José Luiz Martins do Nascimento
Departamento de Fisiologia, CCB, UFPA
________________________________________________
Profª Drª. Maristela Gomes da Cunha
Departamento de Patologia, CCB, UFPA
________________________________________________
- Profª Dra. Marucia I. Medeiros de Amorim
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, UNAMA
________________________________________________
Prof. Dr. Edivaldo Herculano Corrêa de Oliveira (suplente)
Departamento de Genética, CCB, UFPA
Belém – Pará
6
2005
DEDICATÓRIA
▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬
AMIGOS
Tenho amigos que não sabem o quanto são meus amigos.
Não percebem o amor que lhes devoto e a absoluta necessidade que tenho deles.
A amizade é um sentimento mais nobre do que o amor, eis que permite que o objeto
dela se divida em outros afetos, enquanto o amor tem intrínseco o ciúme, que não
admite a rivalidade. E eu poderia suportar, embora não sem dor, que tivessem
morrido todos os meus amores, mas enlouqueceria se morressem todos os meus
amigos! Até mesmo aqueles que não percebem o quanto são meus amigos e o
quanto minha vida depende de suas existências.
A alguns deles não procuro, basta-me saber que eles existem. Esta mera condição
me encoraja a seguir em frente pela vida. Mas, porque não os procuro com
assiduidade, não posso lhes dizer o quanto gosto deles. Eles não iriam acreditar.
Muitos deles estão lendo esta crônica e não sabem que estão incluídos na sagrada
relação de meus amigos.
Mas é delicioso que eu saiba e sinta que os adoro, embora não declare e não os
procure. E às vezes, quando os procuro, noto que eles não tem noção de como me
são necessários, de como são indispensáveis ao meu equilíbrio vital, porque eles
fazem parte do mundo que eu, tremulamente, construí e se tornaram alicerces do
meu encanto pela vida. Se um deles morrer, eu ficarei torto para um lado. Se todos
eles morrerem, eu desabo!
Por isso é que, sem que eles saibam, eu rezo pela vida deles. E me envergonho,
porque essa minha prece é, em síntese, dirigida ao meu bem estar. Ela é, talvez,
fruto do meu egoísmo. Por vezes, mergulho em pensamentos sobre alguns deles.
Quando viajo e fico diante de lugares maravilhosos, cai-me alguma lágrima por não
estarem juntos de mim, compartilhando daquele prazer .Se alguma coisa me
consome e me envelhece é que a roda furiosa da vida não me permite ter sempre ao
meu lado, morando comigo, andando comigo, falando comigo, vivendo comigo,
todos os meus amigos, e, principalmente os que só desconfiam ou talvez nunca vão
saber que são meus amigos!
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A gente não faz amigos, reconhece-os.
(Vinícius de Moraes)
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Aos meus pais, João e Fátima, pelo amor
transmitido e por seus ensinamentos que me
tornaram a pessoa que sou.
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Aos meus irmãos João, Léa, Conce, Gênia,
Bel, Pedro e Ivone, aos meus sobrinhos Fer,
Carol, Tiago, Pedro Henrique, Lucas, Leila por
existirem na minha vida, pois sei que sem eles
eu seria um pouco menos. E a minha Marina,
estímulo às minhas conquistas.
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AGRADECIMENTOS
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Descobertas e aperfeiçoamentos importantes
invariavelmente envolvem a cooperação de muitas
mentes. Eu posso ter recebido o crédito por ter
deixado uma trilha, mas quando olho o
desenvolvimento subseqüente, eu percebo que o
mérito pertence também aos outros. (Graham Bell)
Ao concluir este trabalho quero registrar minha gratidão às pessoas que
atuaram de modo fundamental para a sua realização.
Ao Profº Dr. Rommel Burbano, no processo de orientação deste trabalho.
A uma pessoa muito especial, Profª Dra. Isabel Cabral, por sua contribuição
imprescindível na construção deste trabalho.
A Coordenação do Curso de Pós-graduação em Neurociências e Biologia
Celular, UFPA.
De maneira muito especial à equipe do Laboratório de Citogenética Humana e
Genética Toxicológica, pelo apoio, mesmo que algumas vezes, apenas emocional.
11
A ciência será sempre uma busca, jamais um
descobrimento real. É uma viagem, nunca uma
chegada.
12
Karl Popper
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RESUMO
▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬▬
A Physalis angulata pertece à família Solanaceae que é largamente distribuída nas
regiões tropicais e subtropicais do mundo. Extratos e infusões desta planta são
amplamente usados em vários continentes na medicina popular para tratamento de
uma variedade de patologias, tais como: malária, gonorreia, dermatite, hepatite,
entre outras. Todavia, não há relatos de investigação da genotoxicidade de extratos
aquoso desta planta. Assim, o objetivo desta pesquisa foi investigar o potencial
genotóxico do extrato aquoso da P. angulata, nos linfócitos de sangue periférico
humano, usando os ensaios de aberrações cromossômicas e de eletroforese em gel
de células individualizadas ou teste do Cometa. Os resultados obtidos neste estudo
indicam que: (a) na presença do extrato aquoso nas concentrações de 0,1 µg/mL,
0,5 µg/mL, 1 µg/mL, observou-se um aumento na taxa de proliferação dos linfócitos
tratados (p<0,01), (b) as concentrações acima de 2 µg/mL as doses foram
consideradas citotóxicas, pois resultou em 50% de citotoxicidade comparada ao
controle negativo; (c) o extrato aquoso da P. angulata não apresentou efeito
clastogênico; (d) houve indícios de quebra de fitas simples do DNA ou outro tipo de
lesão nessa molécula, segundo o teste do Cometa. O Extrato aquoso da P. angulata
exibiu efeito tóxico sobre o cromossomo ou sobre a molécula de DNA.
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ABSTRACT
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The Physalis angulata belong to the Solanaceae family that is widely distributed in
tropical and subtropical regions of the world. Extracts and infusions of this plant are
widely used in various continents in folk medicine to treat a variety of diseases such
as malaria, gonorrhea, dermatitis, hepatitis, among others. However, there are no
reports of investigation of genotoxicity of extracts or isolated compounds from this
plant. The objective of this research was to investigate the genotoxic potential of
aqueous extract of P. angulata, in human peripheral blood lymphocytes, using the
chromosomal aberrations assay and single cell gel electrophoresis (Comet Assay).
The results of this study indicate that: (a) in the presence of aqueous extract at
concentrations of 0.1 g / mL, 0.5 mg / mL, 1 mg / mL, there was an increased rate of
proliferation of lymphocytes treated (p <0.01), (b) concentrations above 2 mg / mL
doses were considered cytotoxic because it resulted in 50% cytotoxicity compared to
negative control, (c) the aqueous extract of P. angulata showed no clastogenic effect,
(d) there were no breaks single strands of DNA or other type of lesion in this
molecule, second test of the Comet. The aqueous extract of P. angulata showed toxic
effect on the chromosome or on the DNA molecule.
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SUMÁRIO
I INTRODUÇÃO
I.1 AS PLANTAS MEDICINAIS
I.2 FITOTERÁPICOS NO SISTEMA DE SAÚDE BRASILEIRO
1.3 PESQUISA DE GENOTOXICIDADE EM PLANTAS MEDICINAIS
I.3.1 Alterações na Molécula de DNA
a) Teste das Aberrações Cromossômicas
b) Teste do Cometa (SCGE – Single Cell Gel Eletrophoresis)
I.3.2 A pesquisa da genotoxicidade de plantas medicinais no Brasil
I.4 A Physalis angulata
I.4.1 Taxonomia
I.4.2 Descrição da Planta
I.4.3 Etnofarmacologia da Physalis angulata
I.4.4 Efeito biológico de extratos e compostos derivados de P. angulata
a) Atividade antiinflamatória
b) Atividade Imunomoduladora
c) Atividade Antitumoral
II OBJETIVOS
III MATERIAL E MÉTODOS
III.1 MATERIAL BOTÂNICO
III.2 OBTENÇÃO DO EXTRAÇÃO AQUOSO DA PLANTA P. angulata
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III.3 AMOSTRA CELULAR
31
III.4 CULTIVO DE LINFÓCITOS DO SANGUE PERIFÉRICO
32
III.4.1 Teste do Cometa em linfócitos humanos
32
III.4.2 Teste das Aberrações Cromossômicas
34
III.5 Análise Estatística
34
IV RESULTADOS
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IV.1 EFEITO GENOTÓXICO DO EXTRATO AQUOSO DA Physalis angulata EM
LINFÓCITOS HUMANOS DE SANGUE PERIFÉRÍCO, TRATADOS IN
VITRO , AVALIADO PELO ENSAIO DO COMETA.
IV.2 EFEITO GENOTÓXICO DO EXTRATO AQUOSO DA Physalis angulata EM
LINFÓCITOS HUMANOS DE SANGUE PERIFÉRÍCO TRATADOS IN
VITRO , AVALIADO PELO ENSAIO CITOGENÉTICO DE ABERRAÇÕES
CROMOSSÕMICAS.
V DISCUSSÃO
VI CONCLUSÃO
42
43
VII REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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I - INTRODUÇÃO
I.1 – AS PLANTAS MEDICINAIS
Ao longo de sua história, o ser humano acumulou informações sobre o
ambiente que o cerca e, sem dúvida, toda essa informação foram baseadas na
observação constante e sistemática dos fenômenos e características da natureza e
na experimentação empírica desses recursos.
A preocupação em desvendar e resgatar o conhecimento referente ao uso
dos elementos do ambiente natural incluiu os conhecimentos relativos ao mundo
vegetal, em especial, o estudo das plantas medicinais.
Sabe-se que o uso das espécies vegetais com fins de tratamento e cura
de doenças e sintomas, se perpetuou na história da civilização humana e chegou até
os dias atuais.
A utilização de fitoterápicos1 e seus efeitos genotóxicos, tem sido alvo de
muitos estudos, pois o uso dos produtos naturais tem sido utilizado como uma
tentativa de buscar novas opções de combate a diferentes patologias, porém,
poucos estudos têm sido realizados acerca da genotoxicidade de fármacos.
Grande parte dos medicamentos comercializados são oriundos dos
produtos naturais, principalmente de plantas. Além disso, sabe-se que os produtos
naturais na medicina alternativa (homeopatia, florais de Bach) ou fitoterápica
(produtos de origem vegetal, como ervas medicinais) são utilizados por
aproximadamente 80% da população mundial, através dos chamados remédios
“naturais” (UICN, 1993).
Há um estímulo crescente, principalmente das indústrias farmacêuticas
para realização de estudos das propriedades farmacológicas de princípios ativos
isolados de plantas, na tentativa de descobrir novas moléculas de valor terapêutico,
1
Fitoterápico é todo medicamento tecnicamente obtido e elaborado, empregando-se exclusivamente matériasprimas ativas vegetais com finalidade profilática, curativa e para fins de diagnósticos, com benefício para o
usuário. É caracterizado pelo conhecimento da eficácia e dos riscos de seu uso, assim como pela
reprodutibilidade e constância de sua qualidade: é o produto final acabado, embalado e rotulado, segundo a
PORTARIA Nº 6/MS/SNVS de 31 de janeiro de 1995.
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principalmente as encontradas nas florestas tropicais, tais como a existente na
região amazônica.
Para realização destes estudos, são adotados testes padronizados em
animais, usando extratos de milhares de plantas, porém estes testes são
demorados, têm custos elevados e os resultados nem sempre são os esperados
pela indústria. Para minimizar custos e aumentar a especificidade, os pesquisadores
recorrem ao conhecimento etnobotânico, a fim de dirigir os estudos experimentais, e
visando identificar substâncias ou compostos com efeito terapêutico comprovado,
cientificamente. Considerando a enorme biodiversidade, além do conhecimento
etnobotânico e etnofarmacológico, muito comum entre a população brasileira, o
Brasil poderia ser um país potencialmente importante neste mercado (FERREIRA,
1998; BALICK & MENDELSOHN, 1992; ALICE et al, 1991)
A flora brasileira, com sua grande biodiversidade, apresenta muitas
plantas medicinais, com possível valor terapêutico, com base nas indicações
etnofarmacológicas, são usadas para o tratamento de doenças específicas, tais
como: quebra-pedra (Phyllanthus niruri L.), utilizada na redução de cálculo renal,
calêndula (Calendula officinalis L.) usada como cicatrizante e anti-séptico, ipê-roxo
(Tabebuia avellaneade) para asma e infecções, babosa (Aloe Vera) usada como
hidratante e antiinflamatório e pata-de-vaca (Bauhinia forficata) para curar diabetes
tipo II. Porém, pouco se conhece a cerca dos efeitos biológicos da grande maioria
dessas plantas (BARROS et al., 2003; CHOI & CHUNG, 2003; DE MIRANDA et al,
2004; PEPATO et al., 2004)
É inegável a existência de muitos benefícios no uso de um produto
natural, porém necessariamente, não implica em ausência de efeitos colaterais.
Sabe-se que a utilização de algumas plantas medicinais pode causar riscos à saúde
humana, o que já foi registrado para plantas tais como: o confrei (Symphitum sp.L)
que pode causar lesões hepáticas, inclusive carcinoma (Hirono et al., 1978); a folha
do pessegueiro (Amygdalus pérsica L.) que contêm amigdalina, um glicosídeo
altamente tóxico que gera ácido cianídrico ao ser hidrolisado no organismo,
provocando a inibição da respiração celular e consequente anóxia; a flor da
dedaleira (Digitalis purpúrea) que contêm digitalis, medicamento utilizado para
aumentar as contrações do coração em paciente com insuficiência cardíaca, porém
estes glicosídeos possuem dose terapêutica próxima à dose tóxica (MARULLAZ,
1991).
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Adicionalmente, muitos xenobiontes, incluindo substâncias isoladas de
plantas medicinais, são capazes de induzir modificações químicas no DNA as quais
podem ser nocivas às células, pois interferem em processos vitais, como a
duplicação do DNA e a transcrição gênica, bem como podem agredir a estrutura do
DNA promovendo lesões gênicas e cromossômicas (TRAORE et al., 2000; TAYLOR
et al., 2003; VERSCHAEVE et al., 2004). Estas alterações podem culminar com a
morte celular ou o desenvolvimento de processos neoplásicos.
A identificação dos possíveis efeitos biológicos desses produtos naturais
com propriedades farmacológicas permite definir a melhor forma de sua utilização
em larga escala, sendo de impacto para populações de países subdesenvolvidos ou
em desenvolvimento, uma vez que o custo para a produção dos fitoterápicos é
inferior àquele para as drogas industrializadas (FERREIRA, 1998).
O consumo cada vez maior de fitoterápicos tem despertado o interesse
em pesquisas científicas nessa área, e o custo inferior na sua produção tem
motivado a implantação nos sistema de saúde pública.
I.2- FITOTERÁPICOS NO SISTEMA DE SAÚDE BRASILEIRO
Parte da população brasileira utiliza-se de vegetais para amenizar seus
males e as propriedades medicinais em muitas dessas plantas ainda reside apenas
em observações etnobotânicas. Paralelamente, estudos científicos têm comprovado
a atividade farmacológica de extratos vegetais, o que vem forçando o governo
brasileiro a estabelecer uma política de apoio às pesquisas com fitoterápicos bem
como sua utilização pelo Sistema Único de Saúde (SUS).
Assim sendo, alguns fitoterápicos vêm sendo introduzidos nas farmácias
do Sistema de Saúde de diversas cidades brasileiras, inclusive capitais, como pode
observado para o Programa de Plantas Medicinais da Secretaria do Estado de
Saúde do Rio de Janeiro, Farmácia Popular da Secretaria Municipal de Saúde de
Campinas (SP), Programas Farmácia Verde e Farmácia Viva, de Ipatinga e Betim
(MG).
Somando-se ao movimento internacional de valorização das plantas
medicinais em larga escala, e considerando-se os riscos no seu uso indiscriminado,
há pouco tempo o governo brasileiro passou a recomendar que os fitoterápicos
14
sejam alvos de investigação do seu potencial mutagênico antes de serem
comercializados. Tal ação foi implementada pelo Ministério da Saúde do Brasil por
meio da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) na Resolução-RE nº90,
de 16 de março de 2004, a qual determinou que os estudos de toxicidade pré-clínica
de produtos fitoterápicos incluam a avaliação in vitro e in vivo de genotoxicidade,
sugerindo o teste da reversão de mutação em bactérias (com e sem ativação
metabólica), de danos a cromossomos de mamíferos e a avaliação do dano em
cromossomos de células hematopoiéticas de roedores (BRASIL, 2004).
Essa exigência deve-se ao fato de que, concomitante a comprovação do
efeito farmacológico é indispensável a investigação de genotoxicidade, visto que
esse efeito pode ser extrapolado como de risco para a saúde humana. Essa
determinação busca a segurança no uso da fitoterapia, ou seja, a minimização ou
eliminação de possíveis efeitos colaterais citotóxicos e genotóxicos do uso de
fitoterápicos, uma vez que esses efeitos foram identificados para alguns extratos de
plantas medicinais (VERSCHAEVE et al, 2004; TAYLOR et al, 2003; TRAORE et al,
2000).
Embora várias plantas sejam utilizadas com fins terapêuticos, inclusive
comercializadas, em muitos casos não se possui dados científicos que comprovem
sua eficácia e seu espectro toxicológico no homem. Porém, as exigências de
segurança, eficácia e qualidade, estabelecidas pelas agências regulamentadoras de
medicamentos, se tornaram mais rígidas, sendo que a permanência ou entrada no
mercado desses produtos está relacionada com o desenvolvimento de estudos
científicos
objetivando
a
obtenção
de
matérias-primas
controladas,
o
desenvolvimento de tecnologias apropriadas para a obtenção de extratos vegetais e,
especialmente, a realização de ensaios biológicos (BRASIL, 2004).
I.3 – PESQUISA DE GENOTOXICIDADE DE PLANTAS MEDICINAIS
Segundo a Food and Drug Administration (FDA-USA, 1997) e outras
agências especializadas, a pesquisa de genotoxicidade de produtos naturais deve
se iniciar com a aplicação do teste de Ames que avalia a capacidade de compostos
ou misturas complexas induzirem mutações em Salmonella, tendo excelente
correlação com a genotoxicidade induzida no genoma humano. Complementando a
15
bateria mínima, tem-se os testes in vitro com células humanas com análise de
lesões no DNA e em cromossomos (testes do Cometa e das aberrações
cromossômicas) que refletem diretamente o potencial genotóxico do agente-teste,
útil para predição de riscos.
Há uma ampla variedade de agentes capazes de induzir lesões no DNA
celular, estas podem ser reparadas, restaurando a função biológica da informação
genética, ou podem não ser reparadas ou reparadas inadequadamente, resultando
em mutações. Algumas dessas mutações podem ser visualizadas como aberrações
cromossômicas, dessa forma, pode-se avaliar a atividade mutagênica de um agente
por meio de análise dessas alterações (GOLLIN, 2005).
Os linfócitos são indicadores sensíveis aos agentes genotóxicos, pois há
uma correlação entre os danos induzidos nas células do sangue e outras células
somáticas, servido de eficiente modelo para pesquisas de genotoxicidade, além de
apresentarem uma vida relativamente longa, circulam por todos os tecidos, e ainda,
são facilmente obtidos. Dentre os ensaios, tem-se os que utilizam linfócitos
circulantes, tais como a pesquisa de aberrações cromossômicas ou micronúcleo e o
teste do cometa (ALBERTINI et al, 2000; RABELLO-GAY et al, 1991).
Os resultados dos ensaios in vitro utilizando linhagens celulares
estabelecidas ou linfócitos circulantes de sangue periférico podem ser extrapolados
para a exposição humana, porém, deve-se considerar as limitações dessa
extrapolação, uma vez que não é possível reproduzir todas as condições fisiológicas
da exposição in vivo, como por exemplo, o funcionamento dos sistemas de
biotransformação e de reparo de lesões no DNA (PRESTON, 2005).
Mesmo considerando as limitações dos ensaios in vitro, estes são de
grande valia, pois possuem a vantagem de similaridade com o sistema humano e,
consequentemente
com
mutações
importantes
na
etiologia
de
doenças
degenerativas como o câncer e outras doenças genéticas (FENECH, 2000;
MOLLER et al, 2000).
A toxicidade genética não é uma medida de carcinogenicidade, mas é
frequentemente usada como indicador para o câncer, uma vez que os testes de
mutagenicidade medem o evento inicial ou intermediário da tumorigênese (NOWAK
et al, 2002), há uma associação entre os resultados positivos em testes de
toxicidade genética e a carcinogenicidade.
16
Sabe-se que as mutações gênicas atuam em etapas do processo de
carcinogênese e que ensaios que detectam compostos genotóxicos permitem
identificar substâncias com risco potencial à saúde humana. Dentre os principais
testes utilizados para detecção de potencial mutagênico de agentes químicos estão
os testes citogenéticos in vitro em células de mamíferos que podem detectar
alterações cromossômicas estruturais e/ou numéricas (RIBEIRO & MARQUES,
2003).
I.3.1 – Alterações na molécula de DNA
Em exposição ambiental, o DNA pode sofrer alterações em suas bases
nitrogenadas, que podem resultar em mutações estabelecidas após a sua
duplicação, na divisão celular, cuja consequência dependerá da extensão e
localização do evento. As mutações podem não ter efeito biológico, por não
atingirem os genes ou por não alterarem a estrutura e função das proteínas
correspondentes. As mutações gênicas tem um amplo espectro de efeitos, podendo
inclusive determinar a morte celular ou o crescimento desordenado das células,
caracterizando os neoplasmas (HASTY, 2005).
As mutações podem ser classificadas como mutações de ponto, quando
alteram poucos nucleotídeos, ou cromossômicas, quando envolvem milhares de
nucleotídeos e alteram a estrutura ou número dos cromossomos, sendo que os
agentes que induzem as aberrações cromossômicas estruturais são denominados
clastogênicos, enquanto aqueles que induzem aberrações numéricas são ditos
turbagênicos. Tais agentes podem ser de natureza química, física ou biológica
(CARRANO & NATARAJAN, 1988).
As alterações cromossômicas numéricas pode ser por ganho ou perda de
lote haplóide (euploidia) ou por alteração de cromossomos em número diferente do
número haploide (aneuploidias) (MITCHELL et al., 1995).
As alterações cromossômicas estruturais podem ser classificadas em
instáveis e estáveis, sendo que as instáveis conduzem à morte celular, como os
cromossomos em anel e multicêntricos. São consideradas estáveis as alterações na
estrutura cromossômica que não atrapalham o processo mecânico da divisão celular,
podendo desta forma passar para outras gerações celulares, como são as
translocações e deleções. Todavia, estas podem ser responsáveis por alterações na
função ou comportamento social da célula (MOORE & BENDER, 1993).
17
Independente da viabilidade, as alterações cromossômicas estruturais
são o resultado de quebra na estrutura da molécula de DNA seguidas de reparo
inexato ou ausência de reparo. Por conseguinte, a presença de alterações
cromossômicas é um indicativo de que a célula sofreu dano no DNA decorrente de
algum agente indutor. Da mesma forma, a presença de quebras cromatídicas
identificadas em metáfase é interpretada como uma mutação cromossômica em
potencial, pois o reparo não corrigiu a lesão inicial (BRYANT, 2004).
As quebras na dupla hélice de DNA podem ser causadas por agentes
exógenos, como as radiações ionizantes e inibidores de topoisomerases, ou por
agentes endógenos, como as espécies reativas de oxigênios (PIERCE et al, 2001).
Essas quebras, quando ocorrem em S tardio ou G2, podem ser corretamente
reparadas por recombinação homóloga. Todavia, a forma mais comum de reparo
desse tipo de lesão é a ligação das extremidades, a qual não é livre de erros por
desconsiderar a identidade das moléculas envolvidas no reparo, o que pode
conduzir a rearranjos complexos. Esta forma de reparo ocorre em toda a interfase
(LEES-MILLER &MEEK, 2003).
a) Teste de aberrações cromossômicas
A detecção de danos ocorridos no material genético pode ser feita por
vários métodos, dentre estes, os citogenéticos, geralmente usando células obtidas
de animais ou linfócitos de sangue periférico.
Estudos epidemiológicos indicam que há relação entre a frequência
elevada de aberrações cromossômicas em linfócitos de sangue periférico e risco
elevado para o desenvolvimento de doenças humanas, inclusive o câncer (BONASSI
et al, 1995; HAGMAR et al, 1998; NATARAJAN, 2002). Assim, as aberrações
cromossômicas são consideradas como importantes biomarcadores da exposição
humana a agentes genotóxicos (OBE et al, 2002) e vem sendo amplamente utilizada
em vários tipos celulares para diversos fins, tais como, genética toxicológica,
biomonitoramento e em dosimetria biológica, por sua sensibilidade aos danos
ocorridos ao DNA, além de apresentar uma taxa espontânea relativamente baixa
(NATARAJAN, 1993).
b) - Teste do Cometa (SCGE – Single Cell Gel Eletrophoresis)
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Por definição o nucleóide é uma série de alças superenoveladas de DNA
desprovido de histonas, aderidas à matriz nuclear residual, do tamanho do núcleo da
célula. Caso existam quebras na molécula de DNA, a estrutura do nucleóide sofre
mudanças durante a microeletroforese, visto que as alças relaxadas de DNA e os
fragmentos livres de DNA danificado se desenovelam migrando para além do
nucleóide.
O teste do Cometa é muito utilizado no estudo de dano e reparo de DNA
por ser relativamente fácil e rápido, com sensibilidade semelhante à técnica
citogenética, além de requerer quantidade pequena de célula e não necessita de
proliferação celular (OSTLING & JOHANSON, 1984)
Em 1989, Olive seguriu o nome “Comet Assay” a este teste, devido ao
nucleóide com o DNA danificado, no momento de migração, ser semelhante a um
cometa. No teste, as células são analisadas e classificadas segundo o comprimento
e intensidade da cauda, a qual indica fitas de DNA danificadas (SINGH et al, 1988,
1991; POOL-ZOBEL et al, 1994; SPEIT et al, 1995). Atualmente, o tamanho, a
intensidade de flourescência, o aspecto e outras características dos cometas são
visualmente mensurados sob microscopia óptica ou por programas específicos de
análise de imagem (TICE, 1995).
O teste do Cometa é muito utilizado em estudos toxicogenético, pois
apresenta muitas vantagens quando comparado com outros testes para detecção de
substâncias genotóxicas. Esse teste detecta lesões genômicas que podem resultar
em mutação, que não foram corretamente reparadas, porém não quantifica
mutações estabelecidas. Por isso, pode ser também utilizado para estudos de reparo
do DNA, podendo trazer informações importantes sobre a cinética e o tipo de lesão
reparada, embora não possibilite inferir a fidedignidade do processo de reparo. O
teste permite a detecção de danos e seu reparo em uma única célula, e
conseqüentemente em determinada subpopulação celular, por isso sua relevância
para avaliação de compostos genotóxicos, visto que os danos no DNA são
freqüentemente célula e tecido-específicos (GONTIJO & TICE, 2003).
O ensaio do cometa combina a simplicidade das técnicas bioquímicas
para detecção de quebra de fita simples de DNA e/ou sítios álcali-lábeis com as
abordagens típicas dos ensaios citogenéticos, e algumas vantagens tais como:
sensibilidade para detecção de danos no DNA; a coleta de dados em células
individualizadas, o uso de amostras de células extremamente pequena; e qualquer
19
população de células de eucarioto pode ser utilizada para análise (SPEIT &
HARTMANN, 2005).
I.3.2 – A pesquisa da genotoxicidade de plantas medicinais no Brasil
O Brasil, sendo um país com enorme biodiversidade, pode contribuir para
o desenvolvimento de medicamentos produzidos a partir de plantas, porém percebese um pequeno avanço nesta direção, pois existem vários produtos naturais sendo
utilizados com fins terapêuticos e comercializados, sem a comprovação científica de
sua atividade biológica no homem. A despeito disso, é inexpressiva a investigação
do potencial genotóxico de plantas medicinais brasileiras, tendo sido publicados
poucos trabalhos com esse enfoque, tais como:
Vargas et al. (1991) empregou o teste do Salmonella para avaliar a
presença da atividade mutagênica dos extratos aquosos de Achyrocline satureoides
(Macela), Baccharis anômala, Luehea divaricata (Açoita cavalo), Iodina rhombifolia
(Cancorosa), Desmodium incanum (carrapicho-beiço-de-boi), Tibouchina asperior
(douradinha) e Maytenus ilicifolia (Espinheira Santa). O resultado positivo foi
observado apenas para as três primeiras, mediante ativação por enzimas
microssomais.
Ribeiro et al. (1991, 1993) avaliaram a clastogenicidade in vivo de extrato
aquoso do fruto de Indigofera suffruticosa Mill. ; extrato hidroalcoólico da raiz de
Solanum agrarium Stendt e extrato aquosos e metanólicos de folhas e frutas de
Crotalaria retusa L e Crotalaria mucronata Desv. Os autores relataram atividade
genotóxica em I. suffuticosa na diluição de 25% da DL502 e os extratos obtidos das
frutas de Crotalaria retusa induziram um aumento dose-dependente na frequência de
aberrações cromossômicas.
O óleo de Pterodon pubescens (sucupira), a lactona eremantina, extraída
da Eremanthus elaeagnus, ambos usados como cercaricida, e o alcaloide bondina,
extraído de Peumus boldus (boldo-do-chile), não tiveram atividade clastogênica em
experimentos com células de mamíferos in vivo e in vitro (TAVARES & TAKAHASHI,
1994; DIAS et al., 1995).
2
A DL50 equivale à dose letal para 50% dos animais tratados. Em experimentos in vitro, equivale-se
àquela dose que reduz à metade o índice mitótico.
20
A associação de pesquisas farmacológicas e de genotoxicidade permite
estabelecer um contraponto entre efeitos terapêuticos e dose segura a ser utilizada.
Assim, a ausência de pesquisas sobre a genotoxicidade de fitoterápicos é um fator
de risco para população, bem como compromete a finalização das pesquisas de
novos fármacos e a comercialização daqueles já identificados. Esse fato justifica a
realização de ensaios para investigação da genotoxicidade em Physalis angulata,
ainda inéditos na literatura pertinente.
Existe uma grande variedade de plantas utilizadas na medicina
alternativa, cuja utilização está baseada apenas em observações, porém existem
outras com valor terapêuticos confirmados cientificamente e outras que estão em
fase de estudos. Dentre estas últimas tem-se a Physalis angulata, objeto deste
estudo, no qual serão apresentadas suas propriedades terapêuticas e sua atividade
biológica, com ênfase nos efeitos sobre o DNA.
I.4 – A Physalis angulata
I.4.1 – Taxonomia
A planta Physalis angulata pertence ao reino Plantae, a divisão
Magnoliophyta, a classe Magnoliopsida, ordem Solanales e a família Solanaceae.
Nesta família existem aproximadamente duas mil espécies distribuídas em 95
gêneros, além de apresentar uma ampla variedade de plantas que são econômica
e/ou farmacologicamente importantes, dentre estas são encontrados os gêneros
Solanum (batata) o Capsicum (pimenta), além do physalis (camapu) (TOMASSINI, et
al., 2000).
I.4.2 – Descrição da planta
O gênero Physalis inclui cerca de cento e vinte espécies conhecidas,
dentre estas podemos destacar P. alkekengi, P. lanceolata, P. latifólia e a P. angulata.
Como sinonímia científica a P. angulata pode ser identificada como:
Physalis capsicifolia, Physalis lanceifolia, Physalis ramosissima, Physalis dubia Link;
Physalis linkiana Nees; Physalis ciliata Sieb et Zucc, com descrições botânicas
análogas (RODRIGUES, 1989; LORENZI, 1982; MARTINS, 1989). Neste gênero as
plantas apresentam caracteres herbários e hábitos perenes, e se distribuem ao
21
longo de regiões tropicais e subtropicais do mundo, principalmente nas Américas
Central e do Sul (KISSMANN & GROTH, 1995, TOMASSINI et al, 2000; SANTOS et
al., 2003).
A P. angulata apresenta forma de vida herbácea, que pode alcançar até
um metro de altura, é uma erva anual, muito ramosa e glabra, de caule ereto e
formato triangular na base e quadrangular, tanto na parte superior quanto nos ramos,
apresentando coloração verde clara (Figura 1). Suas folhas ovado-oblongas,
alternadas ou geminadas, dotadas de pecíolo longo, cerrada-dentada. Possui flores
pequenas e amareladas (Figura 2), e fruto comestível, apresentando-se como uma
baga de 2 a 3 cm de diâmetro, amarelo-esverdeado quando maduro, encerrado
totalmente pelo cálice, contendo grande quantidade de sementes, assemelhando-se
a um tomate (Figura 3) . Suas sementes apresentam grande poder germinativo,
preferencialmente em solos semi-úmidos e sombreados. Em conseqüência, é
amplamente encontrada na Amazônia, inclusive infestando lavouras e, portanto é
considerada como planta daninha, conforme apresentado na Figura 4 (LORENZI,
1982).
Dependendo do local onde é encontrada é da cultura popular regional, a
P. angulata é vulgarmente conhecida como camapu, mulaca, bolsa mullaca, canapu,
bicho-de-rã, mata-fome, juá-de-capote, camambu ou camaru (BRANCH & SILVA,
1983).
O fruto de P. angulata é comumente consumido, no continente americano,
principalmente nas áreas rurais, tendo se tornado popular nas grandes cidades a
partir do crescente consumo na Europa e Japão. Em diferentes continentes, esse
vegetal tem ainda uma ampla utilização na medicina popular (SOARES et al., 2003).
22
Figura 1: Planta Physalis angulata, visualizando-se folhas, flores e frutos.
Figura 2: Visualização da flor da Physalis angulata.
23
Figura 3: Fruto da Physalis angulata revestido com o cálice.
Figura 4: Physalis angulata como erva daninha.
24
I.4.3 – Etnofarmacologia da P. angulata
A P. angulata é uma planta que ocorre nos trópicos, incluindo África, Ásia
e Américas e em todos esses continentes seu uso é bastante difundido na medicina
popular e, mais recentemente, pelos adeptos da fitoterapia nos demais continentes.
Em toda a Amazônia o infuso de diferentes partes da planta é empregado
contra problemas hepáticos, renais, reumatismo crônico, sedativo e diurético. Essa
planta também é amplamente utilizada no tratamento de gonorréia na América
Central e Caribe, sendo também descrita a utilização como anti-pirético, diurético,
resfriados, entre outros (ALMEIDA, 1993; CÁCERES et al., 1995; KEMBER & RENG,
1995).
Essas e outras indicações de uso da P. Angulata estão compiladas na
Tabela 1.
25
Tabela 1: Indicação de uso etnobotânico da P. angulata em diferentes regiões do
mundo.
Local
Utilização Etnobotânica
África
Esterilidade, males da garganta
Gana
Antipirético, estômago, síncope
Haiti
Antipirético, diurético, hidropsia
Brasil
Antipirético, analgésico, depurativo, diurético, sedativo,
dermatite, reumatismo, males da vesícula biliar, dos rins,
icterícia e hepatite.
China
Expectorante, diurético e parto
Colômbia
Antipirético, antiinflamatório, desinfectante, narcótico, asma,
dermatite
Gana
Antipirético, estômago, síncope
Guatemala
Malária, prevenção de aborto, gonorréia
Japão
Antipirético, diurético, antídoto, resfriado, inchaços, garganta
Peru
Antiinflamatório, asma, diabetes, desinfectante, analgésico,
hepatite, males do fígado, malária, reumatismo e dermatite
Suriname
Diurético, malária, gonorréia, icterícia, nefrites
Taiwan
Antipirético, diurético, hepatite, tumores
Trinidad
Antipirético, anti-séptico, indigestão, nefrites, rinite
Raintree Nutrition – Tropical Plant Database, disponível em
http://www.raintree.com.br/produtos/mullaca_database.htm
26
I.4.4 - Efeitos biológicos de extratos e compostos derivados de P. angulata
Inúmeras pesquisas investigaram o efeito de extratos alcoólicos e
aquosos de diferentes partes morfológica da P. angulata, bem como de alguns
compostos isolados, identificando-se princípios ativos em folhas, flores, raízes, caule
e frutos (CACERES et al, 1995; FREIBURGHAUS et al, 1996; CHOI e HWANG,
2003; SOARES et al, 2003; BASTOS, 2006).
A partir de estudos fitoquímicos na P. angulata vários compostos foram
isolados e quimicamente caracterizados. Dentre esses, encontram-se flavonoides,
alcaloides, glicosídeos, vitangulinas, fisangulinas e fisalinas, sendo que alguns
desses compostos eram desconhecidos da literatura científica (ROW et al,
1978;1980; SHINGU et al, 1992; ISMAIL et al, 2001).
Na comunidade científica, a planta têm sido o alvo de pesquisa
laboratorial e clínica e os estudos preliminares têm sugerido que ela é
imunomoduladora eficaz e citotóxica para vários tipos de células de câncer e que
possui propriedades antimicrobianas.
Nas
espécies
da
família
Solaneceae
estão
presentes
alguns
vitaesteróides, dentre estes estão as vitafisalinas e fisalinas, distribuídos dentre
alguns gêneros dessa família. As plantas do gênero Physalis possuem fisalinas,
vitafisalinas, vitanolidos, ixocapalactonas, acnistinas dentre outras. Dentre os
vitaesteróides, as fisalinas são as mais produzidas pelo gênero Physalis as quais
foram isoladas nas seguintes espécies: P alkekengi,
P. ixocarpa, P. lanifolia, P.
minima, P. peruviana, P. phyladelphia, P. pubescens, P. viscosa e P. angulata.
(TOMASSINI et al, 2000).
Os vitaesteróides encontrados na P. angulata, tem recebido especial
atenção dos pesquisadores por apresentarem diversas atividades biológicas, tais
como: antimicrobiana (HWANG et al., 2004, CÁCERES et al., 1995, JANUARIO et
al., 2002), antiinflamatário (CHOI & HWANG, 2003), imunomoduladora (SOARES et
al.,
2003),
antitumoral,
tripanossomicida
(FREIBURGHAUS
et
al.,
1996,
NAGAFUGIJI et al., 2004) antimoluscicidal (DOS SANTOS et al., 2003), antimalarica
(ANKRAH et al., 2003).
As atividades biológicas da P. angulata podem ser assim descritas:
a) Atividade Antimicrobiana
O poder antimicrobiano pôde ser constatado em diversos estudos.
Cáceres et al. (1995), utilizaram extrato hidroalcoólico de folha a 50% e verificaram a
27
atividade antigonorréica deste extrato sobre culturas de Neisseria gonorrhoeae.
Freiburghaus et al. (1996), utilizaram um extrato diclorometânico de caule de
Physalis angulata em cultura de Trypanosoma brucei rhodesiense, isolado na
Tanzânia, e verificaram a atividade anti-tripanossômica desse extrato, na
concentração de 0,1 µg/ml. Elegami et al. (2001), verificaram a atividade bactericida
de extratos de Physalis angulata extraídos com CHCl3, MeOH e H2O, em culturas de
Bacillus subtilis, Staphylococcus, Escherichia coli e Pseudomonas aeroginosa, com
zonas de inibição3 que variaram de 12-15 cm.
b) Atividade Antiinflamatória
Choi e Hwang (2003), em experimentos com ratos, demonstraram que o
extrato metanólico das flores de P. angulata exibem uma ação antiinflamatória em
edema de pata induzido por carragenina, artrite induzida por formaldeído, além de
atividade
antialérgicas
contra
dermatite
de
contato
induzida
por
2,4,
dinitrofluorobenzeno.
O extrato alcoólico de raízes também exibiu atividade antiinflamatória em
edema induzido por carreginina em ratos (SOARES et al., 2003, BASTOS, 2004).
c) Atividade Imunomoduladora
A imunomodulação foi observada em estudos que mostraram esteróides
(como as fisalinas B, F e G, mas não D) isolados de P. angulata causando uma
redução na produção de óxido nítrico por macrófagos estimulados com
lipopolisacarídeo bacteriano (LPS) e interferon-γ. LIN et al. (1992), também
demonstraram efeitos de várias frações de extrato de P. angulata na resposta
imunomodulatória, incluindo resposta na blastogênese e produção de anticorpos.
d) Atividade antitumoral
Fisalinas são obtidas a partir do extrato alcoólico de qualquer parte da
planta. Compõem um grupo de glicosídeos amargos, do tipo esteróides, cujas
atividades antineoplásicas e citotóxica in vivo e in vitro foram demonstradas contra
inúmeros tipos de células neoplásicas, por CHIANG et al. (1992a e b). Esses autores
3
Zona de inibição, nos antibiogramas, é a área de ação do disco da droga em uso, que age sobre as
bactérias semeadas em placa de Petri, impedindo-as de crescerem.
28
identificaram atividade antineoplásica para as fisalinas F e D em linhagens celulares
humanas derivadas de diferentes tumores sólidos: HA22T (hepatoma), HeLa (cervix
uterino), KB-16 (carcinoma epidermóide de nasofaringe), Colo-205 (cólon) e Calu-1
(pulmão). Posteriormente, outro estudo do mesmo grupo de pesquisadores da
National Taiwan University apresentou o efeito antineoplásico das fisalinas F e B
sobre linhagens de diferentes leucemias, merecendo destaque a ação da fisalina F
sobre células de leucemia mielóide aguda e leucemia linfóide aguda de células B.
Todavia, os autores não apontam o mecanismo responsável por esse efeito.
O glicosídeo mirecitina-3-O-neoesperidosídeo demonstrou ter importante
toxicidade contra linhagens celulares de carcinoma epidermóide de nasofaringe,
adenocarcinoma de pulmão e, principalmente, contra células P388 de leucemia
linfocítica (Ismail & Alam, 2001).
JUANG et al, (1989), sugeriram que a vintagulina A, princípio ativo da P.
angulata inibe a topoisomerase II na concentração de 20 μM in vitro, detendo a
proliferação celular. Esse fato poderia justificar o papel dessa planta na
anticarcinogenicidade, pois as topoisomerases são enzimas celulares essenciais
para manutenção da estrutura da cromatina, atuando no relaxamento da tensão
gerada pela torção do DNA durante a transcrição gênica ou replicação do DNA na
divisão celular mitótica ou meiótica (MALIK & NITIS, 2004).
As topoisomerases quebram e religam uma fita (topoisomerase I) ou duas
fitas da molécula de DNA (topoisomerase II). Essa quebra possibilita a passagem
DAE uma fita sobra a outra, alterando o número de voltas na molécula de DNA,
evitando a superespiralização à frente da forquilha de replicação ou transcrição
(WANG, 1985; BERGER & WANG, 1996). Assim, as topoisomerases atuam na
manutenção da integridade do genoma. No momento das quebras do material
genético, elas se ligam covalentemente às extremidades 5' e 3' geradas por estas,
formando um complexo de clivagem DNA-enzima. Estes complexos estão presentes
em
baixa
concentração,
porém
alguns
xenobiontes
podem
aumentar
signficativamente a concentração fisiológica ou o tempo de vida destas quebras,
podendo desencadear mutações no DNA e cromossomos (FERGUSON &
BAGULEY, 1996).
A inibição de topoisomerases tem sido associada a clastogenicidade, e
seu envolvimento na segregação cromossômica mitótica e meiótica sugerem a
associação desses inibidores com euploidias (poliploidias e endorreduplicação) em
29
Drosophila e humanos (ROWE et al., 1986; FRANCHITTO et al., 2000; CORTÉS &
PASTOR, 2003), era sugerido tais efeitos em linfócitos cultivados na presença de P.
angulata.
Este fato pode justificar a ação antineoplásica de extratos e compostos
isolados de P. angulata com possibilidades de gerar lesões cromossômicas. A
despeito disso, nenhuma publicação sobre a genotoxicidade dessa planta foi
identificada na literatura pertinente.
30
II - OBJETIVOS
Geral
Investigar o potencial genotóxico do extrato aquoso da raiz da P. angulata.
Específicos:
a) investigar sua ação sobre a proliferação celular;
b) verificar se há efeito sobre as fibras do fuso, capazes de promover
aneuploidias ou poliploidias;
c) determinar sua capacidade de promover danos na estrutura da molécula de
DNA e dos cromossomos;
31
III - MATERIAL E MÉTODOS
III.1 - MATERIAL BOTÂNICO
A raiz da referida espécie foi coletada no estado do Pará, nos municípios
de Belém, Mojú e Castanhal, em áreas de plantação e terra firme. Imediatamente
após a colheita da planta toda, a raiz passou pelo processo de limpeza, onde esta foi
lavada em água corrente para a retirada dos resíduos de terra. Em seguida, o
material botânico foi pesado e processado para a extração do extrato bruto aquoso.
A identificação e classificação do material botânico foram feitas pelo Dr.
Ricardo Secco, curador do herbário do Museu Emílio Goeldi, onde uma exsicata da
espécie foi depositada.
III.2 – OBTENÇÃO DO EXTRATO AQUOSO DA PLANTA P. angulata
O extrato bruto foi obtido da raiz da planta, as quais foram pesadas após
a colheita, a partir da qual extraiu-se por decocção. Adicionando 150 g de raiz,
devidamente lavadas em 700 mL de água super-pura (Milli-Q plus), para assim
proceder a decocção que será realizada em manta aquecedora a 100° C, sendo que
o extrato obtido será concentrado até 14% do volume inicial. O decocto foi
congelado e estocado em freezer à temperatura de –20° C para subseqüente
liofilização. Assim, um pó de extrato foi obtido, e foi estocado à temperatura de 4 a 8
°C, para evitar contaminação e deteriorização.
III.3 – AMOSTRA CELULAR
Foram coletados 5 mL de sangue periférico com seringa heparinizada, de
seis doadores voluntários, de ambos os sexos, na faixa etária de 18 a 32 anos.
32
Os estudos genéticos foram aprovados pelo Comité de Ética da
Universidade Federal do Triângulo (Protocolo nº 440) e Comité de Ética do Hospital
Universitário João de Barros Barreto de Belém-PA, Brazil.
III.4 – CULTIVO DE LINFÓCITOS DO SANGUE PERIFÉRICO.
Para a realização do ensaio, os linfócitos foram cultivados em meio de
cultura HAM-F10 (Sigma) complementado com estreptomicina (0,01 mg/mL),
penicilina (0,005 mg/mL), 20% de soro bovino fetal (Cultilab) e 2% de
fitohemaglutinina (Gibco). Seis horas após o início da incubação, quando as células
encontravam-se em G1, adicionou-se o extrato aquoso da P. angulata, nas
concentrações finais de 1µg/mL, 0,5 µg/mL, 2 µg/mL, 3 µg/mL e 6 µg/mL. Foram
ainda realizadas culturas controle negativo e controle positivo, nesta última
utilizando-se a doxorrubicina (CAS 25316-40-9) como agente genotóxico, na
concentração de 0,15 µg/mL. Todos os frascos foram envolvidos em alumínio, a fim
de bloquear a exposição à luz.
Após 47 horas de cultivo agita-se manualmente cada frasco de cultura
retirando-se 300 µL de cada para a realização do ensaio Cometa, e o restante do
material será utilizado para análise citogenética das aberrações cromossômicas.
III.4.1 – Teste do Cometa em linfócitos humanos
a) Preparação da lâmina
-
Derreteu-se a solução de agarose comum em microondas, manteve-se em
banho-maria a 60ºC em frasco com altura suficiente para um lâmina.
- Mergulhou-se a lâmina na agarose e removeu-se o excesso de agarose da face
posterior da lâmina com o auxílio de lenço de papel.
- As lâmina foram mantidas sob temperatura ambiente/12 h e posteriormente
armazenadas a 4ºC, em geladeira.
b) No dia da colheita
-
Retirou-se as lâminas pré-gelatinizadas da geladeira; deixando em
temperatura ambiente.
- Derreteu-se a agarose LMP (baixo ponto de fusão) em tampão, e manteve-se em
banho-maria 37ºC;
33
- As lâminas foram mergulhadas em solução de lise final, cobertas com papel
alumínio e mantidas em geladeira (4ºC);
c) Procedimento para Colheita
- Descartou-se o meio de cultura com o tratamento;
- Lavou-se as células 2 vezes com 5 mL PBS em temperatura ambiente;
- Centrifugou-se em 1250 rpm por 5 minutos;
- Desprezou o sobrenadante com pipeta Pasteur;
- Adicionou-se 500 µL de tripsina 0,025%, com intuito das células perderem a
adesão de contato, aguardando-se em torno de 2 minutos;
- Inativou-se a tripsina com 5 mL de meio de cultivo contendo soro bovino fetal;
-
Centrifugou-se em 1250 rpm por 5 minutos; desprezou-se o sobrenadante
deixando cerca de 0,5 mL de meio de cultura;
d) Desnaturação, Eletroforese, Neutralização e Fixação
- Em tubo de 500 µL, colocar 300 µL de suspensão celular com 120 µL de agarose
LMP (0,5%) a 37ºC.
- Depositou-se a suspensão celular sobre lâmina pré-gelatinizada com ponto de
fusão normal (1,5%), após solidificação do gel (4°C);
-
Submeteu-se a lâmina a citólise; e em seguida a eletroforese em tampão
alcalino (300 mA, 0,5-1 V/cm, <4°C, pH 13).
-
Cobriu-se a lâmina com tampão PBS; deixando-as no escuro por 20 minutos
para se desnaturar o DNA.
- A corrida eletroforética foi realizada sob 25 V e 300 mA, por 20 minutos, na
ausência de luz, com a cuba depositada em um recipiente contendo gelo;
- Após a corrida retirou-se as lâminas do tampão e fez-se a neutralização em 5 mL
de Tris (0,4 M, pH 7,5) por 15 minutos (3 ciclos de 5 min).
- Deixou-se as lâminas escorrendo por cerca de 15 minutos;
- Mergulhou-se as lâminas em etanol absoluto para fixação por 10 minutos.
- Após a secagem as lâminas foram guardadas em caixa de vidro na geladeira.
e) Coloração e Leitura
- Para que fosse feita a leitura, é necessário corar, e para isso, depositou-se 100
µL de brometo de etídio 0,002 mg/mL sobre a lâmina e cobriu-se com lamínula.
34
- Após a coloração a análise é feita no aumento de 400 X, em filtro de excitação
515-560 nm de comprimento de onda e filtro de barreira 590 nm;
- Terminada a leitura descartar a lamínula, deixar a lâmina secar e guardar.
Sempre manuseando o material com luvas.
III.4.2 – Teste das Aberrações Cromossômicas
As preparações citológicas para a para a obtenção de cromossomos
metafásicos em linfócitos do sangue periférico humano foram obtidas baseando-se
na técnica de Moorhead et al. (1960), com os seguintes passos:
- As células foram cultivadas conforme descrito no item II.4
- Após retirar a aliquota para o cometa, adicionou-se 0,1ml colchicina (0,016%
Sigma) para bloquear a divisão celular, deixando-a agir por duas horas;
- Transferiu-se as culturas para tubo de centrífuga de fundo cônico;
- Após a centrifugação por 10 min a 1000 rpm, retirou-se o sobrenadante e colocouse lentamente, 4mL de solução de KCl 0,075 M sobre o botão de células;
- homogeneizou-se gentilmente com pipeta Pasteur e deixando na estufa a 37ºC por
5 minutos;
- Centrifugou-se novamente por 5 minutos a 1000 rpm,m retirou-se o sobrenadante e
acrescentou-se 5 mL de fixador recém-preparado (metanol:ácido acético 3:1),
homogeneizando o material;
- Centrifugou-se (1000 rpm/5 minutos) e trocou-se o fixador mais duas vezes.
- A suspensão celular obtida foi depositada em lâminas adequadamente limpas, as
quais foram coradas em solução de Giemsa em tampão fosfato.
- As lâminas foram identificadas e, sob microscopia ótica em objetiva com aumento
de 100x, foram analisadas 100 metáfases (2n=46±2);
III.5 - ANÁLISE ESTATÍSTICA
O teste F (ANOVA) de dois critérios foi utilizado para detectar diferenças
entre as freqüências de aberrações cromossômicas, bem como para os valores de
IM que podem ser observados nas diversas doses do extrato e seus respectivos
controles (AYRES et al., 2003).
35
O teste T de Student foi realizado quando o teste F identificou diferenças
significativas. Em todas as análises foram estabelecidos em 5% o nível de
significância.
36
IV - RESULTADO
IV.1 – AVALIAÇÃO DO EFEITO GENOTÓXICO DO EXTRATO AQUOSO DA P.
angulata EM LINFÓCITOS HUMANOS, DE SANGUE PERIFÉRICO, TRATADOS IN
VITRO, UTILIZANDO O ENSAIO DO COMETA
Em cada teste, foram analisados 100 células classificando-as de 0 a 4,
conforme o comprimento e intensidade da cauda do Cometa: (a) tipo 0, sem danos
(<5%); (b) tipo 1, baixo nível de danos (5-20%); (c) tipo 2, médio nível de danos (2040%), (d) tipo 3, alto nível de danos (40-95%), (e) tipo 4, dano total (>95%). Foram
analisadas apenas as células que apresentaram núcleos de mesmo tamanho, e
desprezados os núcleos apoptóticos. Após a leitura foi calculado o score de cada
tratamento multiplicando-se o número de núcleos observados em cada classe pelo
valor da classe, obtendo-se o score total de cada tratamento.
Todos os experimentos foram conduzidos no mínimo duas vezes e os
dados obtidos foram qualitativamente reproduzíveis, embora a variabilidade na taxa
de danos do DNA tenha sido identificada nos linfócitos dos doadores.
A Figura 4 ilustra algumas das classes de Cometa observadas neste
estudo e a Tabela 2 apresenta a frequência média das diferentes classes de
Cometas observados em linfócitos humanos tratados in vitro com diferentes
concentrações de P. angulata.
A eficiência do teste em identificar genotoxicidade induzida pôde ser
verificada entre os indivíduos nas diferentes concentrações utilizadas, considerandose a distribuição das células nas diferentes classes.
A análise dos dados da Tabela 2 demonstrou que o tratamento feito com
as quatro maiores concentrações de extrato, aumentou de forma significativa a
frequência de células com Cometa e o índice de danos no DNA quando comparado
ao controle negativo (p<0,05). A distribuição dos cometas entre as classes 1, 2, 3 e 4
também foi alterada pelas doses crescentes do extrato, aumentando-se a ocorrência
de lesões à medida que se aumentou a concentração do produto testado, sendo
mais significativo nas classes 3 e 4.
37
(a)
(b)
(c)
Figura 4: Cometas de classes 0 (a), (b) 2, (c) 4 observados em linfócitos humanos
tratados com extrato aquoso de P. angulata.
38
Tabela 2: Proporção de danos no DNA, freqüência de células com Cometas e
distribuição entre as classes de Cometas em linfócitos humanos tratados in vitro com
diferentes concentrações de extratos aquoso de P. angulata.
Tratamento
µg/mL
Classe de Cometa (%)
Índice de Dano
Células com
do DNA ± SD
cometas (%)
0
1
2
3
4
Controle negativo
(n=6)
57,2
32,2
8,2
2
0,4
0,15 ± 0,19
42,8
Controle
positivo*(n=6)
32
29,7
32
3
3,3
1,15a ± 0,19
73,8a
0,1 (n=6)
50,2
34
2,2
3,6
0,2
0,75 ± 0,14
49,8
0,5 (n=6)
38,2
41
16,2
4,2
0,4
0,87a ±0,28
61,8
1,0 (n=6)
32,6
45,2
16,8
4,2
0,4
0,93a ± 0,33
69,4
2,0 (n=6)
38,6
33,4
22,2
4,2
1,6
0,90a ± 0,26
61,4
3,0 (n=6)
40
33,8
19,4
5
1,8
0,95a ± 0,12
60,0
6,0 (n=6)
42,7
28
20
8,3
1
1,14a ± 0,65
57,3
Extrato
a
Estatisticamente diferente do grupo controle negativo (p<0,05)
SD: Desvio Padrão
*Doxorrubicina: 0,15µg/mL
39
IV.2 EFEITO GENOTÓXICO DO EXTRATO AQUOSO DA P. angulata EM
LINFÓCITOS DE SANGUE PERIFÉRICO TRATADOS IN VITRO AVALIADO PELO
ENSAIO CITOGENÉTICO DE ABERRAÇÕES CROMOSSÔMICAS.
Neste ensaio, foram computadas as alterações cromossômicas numéricas
ou estruturais, observando-se a posição do centrômero, alterações no grau de
ploidia e aberrações estruturais, tais como lesões acromáticas (gaps), quebras
cromatídicas e rearranjos complexos, como anéis, trirradiais e quadrirradiais.
Para monitorar a toxicidade celular induzida pelo agente em questão, foi
determinado o índice mitótico pela contagem do número de metáfases em 2000
linfoblastos/cultura, aplicando-se a seguinte fórmula:
IM= Número de metáfases X 100
2000 linfoblastos
Os dados obtidos de índice mitótico neste ensaio estão apresentados na
Tabela 3, enquanto que os dados de aberrações cromossômicas estão na Tabela 4.
Conforme os resultados obtidos neste ensaio, o índice mitótico revelou
que o extrato aquoso da P. angulata induziu um aumento dose dependente e
estatisticamente significativo na taxa de proliferação dos linfócitos tratados com 0,1
µg/mL; 0,5 µg/mL e 1 µg/mL. Porém, a partir da concentração de 2 µg/mL alcançouse a dose citotóxica (CD50), a qual é expressa como a dose que resultou em 50%
de citotoxicidade comparada à cultura controle.
Nos dados apresentados na Tabela 4 pode-se observar que as
aberrações cromossômicas nas culturas tratadas foram uniformemente distribuídas e
em taxas similares àquelas observadas na amostra controle. Ou seja, não foi
identificado qualquer efeito genotóxico estatisticamente significativo do extrato
aquoso da P. angulata durante o tratamento nas concentrações 0,1 µg/mL, 0,5
µg/mL e 1 µg/mL, em relação às culturas não-tratadas ( p=0,754).
A inclusão dos gaps como aberrações cromossômicas não alterou esse
resultado, uma vez que sua ocorrência também não diferiu entre as amostras
(F=1,083; p=0,405) ou tratamentos (F=2,583; p=0,118).
Considerando-se os diferentes tipos de alterações observadas, tem-se
que
não
houve
prevalência
na
frequência
de
cromossômicas, bem como nas frequências de gaps.
quebras
cromatídicas
ou
40
Apenas
uma
célula
exibiu
alteração
complexa,
do
tipo
troca
intercromatídica, gerando uma figura quadriradial (Figura 5), tendo sido considerada
um evento isolado.
As euploidias também foram consideradas como um evento raro, pois
somente uma célula tetraploide foi observada em todos os experimentos realizados.
O efeito citotóxico do extrato aquoso da P. angulata em concentrações de
2 e 3 µg/mL, impossibilitou a realização do teste das aberrações cromossômicas nas
culturas tratadas com estas concentrações.
Os dados obtidos nesse estudo foram utilizados para a elaboração de um
artigo científico a ser submetido para publicação em revista especializada (anexo 1).
Figura 5: Metáfase de linfócito tratado com 1 µg/mL do extrato aquoso de
Physalis angulata, exibindo uma troca cromatídica entre diferentes
cromossomos, gerando uma figura quadrirradial.
41
Tabela 3: Valores referentes aos índices mitóticos (%) obtidos em culturas de
linfócitos tratadas com diferentes concentrações de extrato aquoso de P. angulata.
AMOSTRA
0 µg/mL
0,1 µg/mL
0,5 µg/mL
1 µg/mL
2 µg/mL
3 µg/mL
1
0,70
2,25
2,30
2,30
0,85
0,50
2
0,90
1,45
0,80
1,15
0,03
0,50
3
0,65
1,40
1,55
1,15
0,05
0,03
4
0,65
1,85
1,75
1,35
0,25
0,25
5
0,75
1,75
1,90
1,45
0,35
0,40
6
0,85
1,65
1,85
1,35
0,25
0,35
Média
0,75
1,73
1,78
1,46
0,34
0,38
Desvio Padrão 0,22
1,92
2,30
3,69
1,45
0,21
p*
<0,01
<0,01
<0,01
<0,05
<0,05
*valor de p em relação à amostra controle (0 µg/mL)
42
Tabela 4: Distribuição de alterações cromossômicas observadas em linfócitos
humanos após tratamento in vitro com extrato aquoso de P. angulata.
Amostras
Metáfases
normais
Metáfases alteradas
Ctb
0 µg/mL
1
2
3
4
5
6
100
95
98
100
99
99
Total
591
0,1 µg/mL
1
2
3
4
5
6
97
99
99
100
99
99
Total
593
0,5 µg/mL
1
2
3
4
5
6
100
99
100
98
100
99
Total
596
1
1 µg/mL
1
2
3
4
5
6
99
100
100
100
99
99
2
Csb
Ctg
1
4
1
1
Csg
Outras alterações
1
1
2
1
6
0
2
1
0
0
1
1
1
1
3
0
3
1
tetraploidia
1
0
1
0
1
0
1
1
Quadrirradial*
1
1
Total
597
3
0
0
1
*quebras cromatídicas envolvidas no rearranjo listados na coluna ‘outras alterações’
43
- Ctb: quebra cromatídica; Csb: quebra cromossômica; ctg:gap cromatídico; Csg:gap
cromossômico.
44
V – DISCUSSÃO
Grande parte da população mundial utiliza as plantas medicinais com fins
terapêuticos. Além disso, muitos dos medicamentos industrializados são obtidos a
partir de extratos de plantas (FERREIRA, 2004), situação esta, que desperta
interesse tanto das indústrias quanto dos centros de pesquisas científicas a respeito
da ação dessas plantas.
Sabendo que alguns fármacos são capazes de interagir com a molécula
de DNA, provocando lesões cromossômicas (VERSCHAEVE et al, 2004; TAYLOR et
al, 2003; TRAORE et al, 2000), este trabalho teve com objetivo a análise dos
possíveis efeitos mutagênicos e/ou genotóxicos do extrato aquoso da P. angulata,
em linfócitos de sangue periférico humano.
A P. angulata é uma planta que ocorre na África, Ásia e América, sendo
que em todos os continentes seu uso é bastante difundido na medicina popular, por
apresentar atividade biológica no tratamento de várias doenças, seja através de
seus extratos brutos ou compostos isolados, desta forma, faz-se necessário avaliar
seu efeito mutagênico e/ou genotóxico, conforme recomendam as agências
internacionais de regulamentação de produtos farmacêuticos.
No presente estudo, os experimentos foram feitos usando-se o extrato
aquoso
da
P.
angulata,
adicionando-se
na
fase
G1
do
ciclo
celular,
concomitantemente à fitohemaglutinina, e as células foram cultivadas por 47 horas,
ou seja, permitindo-se passar por dois ciclos de divisão celular. O extrato foi testado
em diferentes concentrações: 0,1 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1 µg/mL, 2 µg/mL e 3 µg/mL de
meio de cultura, sendo que essas doses foram escolhidas baseando-se nas doses
utilizadas no trabalho em que o extrato aquoso suprimiu o processo inflamatório
carragenina-induzido em ratos (BASTOS et al, 2005). A utilização deste recurso fezse
necessário, pois não foram
encontrados na
literatura, trabalhos que
investigassem a genotoxicidade desta planta em cultivo celular que pudessem servir
de parâmetro para este estudo.
Neste estudo, a genotoxicidade foi investigada por meio dos testes do
Cometa e de aberrações cromossômicas em metáfase, enquanto a citotoxicidade foi
avaliada pelo índice mitótico.
45
A mais típica resposta observada após a exposição in vitro a agentes
genotóxicos sejam de natureza química ou física, é a citotoxicidade, medida por
diferentes métodos, incluindo-se o índice mitótico em linfócitos cultivados. Esse
índice representa a proporção de células na fase de mitose do ciclo celular, portanto
a diminuição deste reflete a quiescência ou entrada da célula na fase G0 do ciclo.
Em experimentos in vitro, o índice mitótico é utilizado também para monitorar a
toxicidade celular induzida. O grau de citotoxicidade serve para selecionar o período
do cultivo e as concentrações a serem testadas adequadamente, servindo assim
para avaliar os riscos ao homem, de determinados compostos aos quais estão
expostos.
No presente estudo foi observado, através da avaliação do índice
mitótico, que o extrato aquoso da P. angulata induziu um aumento estatisticamente
significativo na taxa de proliferação dos linfócitos tratados com concentração de 1
µg/mL (p<0,01), enquanto nas concentrações acima de 2 µg/mL houve uma
diminuição no índice mitótico (p>0,05), considerando-se essas como doses
citotóxicas alcançando-se o CD50, pois diminui em 50% o índice mitótico comparado
à cultura controle.
Na literatura, um único estudo investigou a citotoxicidade da P. angulata
(WU et al, 2004), porém os autores utilizaram um extrato cerca de quatro vezes
menos concentrado, linhagem celular estabelecida e o parâmetro utilizado para
investigação da citotoxicidade foi a indução de apoptose, o que inviabiliza a
comparação de resultados. Seus dados mostraram que o extrato etanólico é mais
citotóxico que o extrato aquoso em concentração muito mais elevada que no
presente estudo. Este fato pode ter sua explicação nas diferenças entre os
experimentos.
Dentre as diversas atividades biológicas apresentadas pela P. angulata,
pode-se
destacar:
antimicrobiana,
antiinflamatória,
imunomoduladora,
tripanossomicida, antimoluscidal, antimalárica e a antitumoral (HWANG et al., 2004;
NAGAFUJI et al., 2004; ANKRAK et al., 2003; CHOI & HWANG, 2003; DOS
SANTOS et al., 2003; SOARES et al., 2003; JANUÁRIO et al., 2002;
FREIBURGHAUS et al., 1996; CÁCERES et al., 1995 e CHEN et al., 1989).
Entre os benefícios atribuídos a P. angulata, BASTOS et al (2005)
demonstraram que seu extrato aquoso suprimiu um processo inflamatório
carragenina-induzido em ratos, todavia o presente estudo indicou um aumento
46
significativo na proliferação de linfócitos T humanos fitohemaglutinina-estimulados.
Esse estímulo à proliferação de linfócitos poderia ser explicado como uma resposta
inespecífica, ou seja, uma ativação policlonal, e desta forma pode-se sugerir para o
referido extrato da P. angulata um papel adjuvante na resposta imune, o que deve
ser
melhor
investigado
experimentalmente,
pelo
grande
interesse
em
imunomoduladores.
Uma outra atividade benéfica dessa planta é aquela antineoplásica, e
para melhor explorar tal tema, faze-se necessário citar que os principais agentes
antineoplásicos são classificados de acordo com seu modo de ação, podendo ser
divididos em: agentes citotóxicos, hormônios e agentes diversos. Dentre os agentes
citotóxicos, tem-se os agentes alquilantes, antimetabólicos, antimotóticos e
inibidores de topoisomerases, categorias que abrigam agentes genotóxicos (SILVA
et al., 2003; RANGE et al., 2004).
Segundo JUANG et al (1989), a vitangulina A, composto extraído da P.
angulata a partir de seu extrato alcoólico, é capaz de inibir a topoisomerase II. Sendo
as topoisomerases enzimas celulares que participam de diversos processos
metabólicos
como
a
replicação,
recombinação,
transcrição
e
segregação
cromossômica, os agentes capazes de inibi-las podem levar o DNA a ter uma
topologia desfavorável durante e após a replicação, permitindo assim, a ocorrência
de recombinação homóloga e não-homóloga, propiciando a formação de aberrações
cromossômicas (MALIK & NITISS, 2004).
Com o término da replicação do DNA, as topoisomerases II, separam as
várias fitas de DNA recém-formadas durante a condensação progressiva da
cromatina que leva à mitose. Elas também separam as cromátides no início da
anáfase, que estavam associadas na metáfase. Desta forma, qualquer interferência
nesta função, conduz a um aumento na recombinação mitótica e pode inibir a
segregação cromossômica normal durante a anáfase, resultando em aneuploidias.
Existem inibidores de topoisomerases II que são capazes de formar cromossomos
quadrirradiais (DA SILVA et al., 2003). Assim considerando, a ausência de
aneuploidia, euploidia e clastogenicidade descritas no presente estudo, indicam que
no extrato aquoso da P. angulata não existem substâncias capazes de inibir a ação
das topoisomerases.
As fisalinas também são compostos isolados obtidos a partir do extrato
alcoólico de qualquer parte da P. angulata, tiveram suas atividades antineoplásicas e
47
citotóxicas demonstradas em experimentos in vivo e in vitro. A fisalina F teve efeito
antileucêmico em camundongos e exibiu excelente efeito contra linhagens celulares
humanas
derivadas
de
diferentes
tumores
sólidos,
principalmente
HA22T
(hepatoma) e HeLa (cérvix uterino), mas também foi citotóxica em outros tipos
celulares (CHIANG et al, 1992a). Em um estudo posterior, esses autores
demonstraram que as fisalinas F e B atuam eficazmente sobre linhagens de
diferentes leucemias, merecendo destaque à ação da fisalina F sobre células de
leucemia mieloide aguda e leucemia linfoide aguda de células B (CHIANG et al.,
1992b). Todavia, não apontam o mecanismos responsável por esse efeito.
Nas condições aplicadas neste estudo, o extrato aquoso da P. angulata
não induziu qualquer efeito sobre a citocinese ou fibras do fuso celular, visto que não
houve aumento no número de células com aneuploidia ou poliploidia. Da mesma
forma, a ausência de lesões na estrutura dos cromossomos na presente
investigação sugere que a vitangulina A não se encontra presente no extrato aquoso
desta planta.
O ensaio do Cometa permite identificar alterações de fita simples e dupla,
bem como a presença de sítios apurínicos. No presente estudo, as células
submetidas ao tratamento com P. angulata apresentaram tais alterações em
frequência estatisticamente significativa. Esses dados não corroboram aqueles
obtidos no ensaio de aberrações cromossômicas, sugerindo que as quebras de fita
simples e os sítios apurínicos, identificados no ensaio Cometa, foram reparados,
não sendo convertidos em quebras cromatídicas ou cromossômicas, ambas lesões
não identificadas neste estudo.
Nas concentrações acima de 2 µg/mL, foi observado o efeito citotóxico do
extrato aquoso da P. angulata, impossibilitando a realização do teste das aberrações
cromossômicas nas culturas tratadas, porém sugerimos que esta inibição do
crescimento celular, deve-se a quantidade elevada da substância ao meio de cultura,
e não pela ação do extrato sobre o DNA.
Os diferentes tipos de lesões observadas nas metáfases tiveram baixa
freqüência, tendo sido considerados eventos raros, desta forma os dados deste
estudo indicam que o extrato aquoso da P. angulata, se exibiu efeito tóxico sobre o
cromossomo, pode ter sido reparado.
Neste estudo investigando a genotoxicidade do extrato aquoso da P.
angulata, nenhuma atividade genotóxica foi observada nos ensaios de aberrações
48
cromossômicas com linfócitos de sangue periférico, porém no teste do Cometa
houve aumento da frequência de células com cometas e o índice de danos no DNA.
Ainda assim, para aumentar a segurança dos resultados obtidos nesta investigação,
sugere-se a realização de estudos adicionais, tais como ensaios com camundongos
e com microrganismos (teste de Ames), bem como testes antimutagênicos.
49
VI – CONCLUSÃO
Analisando os resultados obtidos no presente estudo a cerca do extrato
aquoso da planta P. angulata, pode-se concluir que:
a) O referido extrato apresentou características de um agente
imunomodulador, pois estimulou a proliferação de linfócitos T nas
concentrações de 0,1 µm/mL, 0,5 µm/mL e 3 µm/mL.
b) O referido extrato, a partir da concentração de 2 µg/mL, alcançou a
dose citotóxica (CD50), a qual é expressa como a dose que resultou
em 50% de citotoxicidade comparada à cultura controle;
c) A ausência de observação de aneuploidias ou poliploidias leva a
inferir que o extrato aquoso da P. angulata não provoca efeitos
sobre as fibras do fuso.
d) Em uma análise quantitativa, esse extrato promoveu danos na
estrutura da molécula de DNA, avaliados pelo teste do Cometa,
porém não foi clastogênico no teste de aberrações cromossômicas.
50
VII – REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA
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Anexo 1
AVALIAÇÃO DO POTENCIAL GENOTÓXICO DA PHYSALIS ANGULATA L. EM
LINFÓCITOS HUMANOS
RAQUEL ALVES DOS SANTOS1, TERESINHA ROSA CABRAL2, ISABEL ROSA CABRAL2, LUSÂNIA MARIA
GREGGI ANTUNES3,4, CRISTIANE PONTES ANDRADE3, PLÍNIO CERQUEIRA DOS SANTOS CARDOSO 1,
MARCELO DE OLIVEIRA BAHIA2, CLAUDIA PESSOA5, JOSÉ LUIS MARTINS DO NASCIMENTO2,
ROMMEL RODRÍGUEZ BURBANO2, CATARINA SATIE TAKAHASHI1,6
1. Departamento
de Genética, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São
Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.
2. Centro
de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém, PA, Brazil.
3. Departamento
de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, MG,
Brazil.
4. Departamento Análises
Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas, Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.
5. Departamento
de Fisiologia e Farmacologia, Faculdade de Medicina, Universidade Federal do
Ceará, Fortaleza, CE, Brazil.
6. Departamento
de Biologia, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto,
Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.
Key words: P. angulata, micronuclei, comet assay.
RESUMO
A Physalis angulata L pertence à família Solanaceae que é largamente distribuída nas regiões
tropicais e subtropicais do mundo. Extratos e infusões desta planta são amplamente usados em
vários continentes na medicina popular para tratamento de uma variedade de patologias, tais como:
malária, gonorreia, dermatite, hepatite, entre outras. Todavia, não há relatos de investigação da
genotoxicidade de extratos ou compostos isolados desta planta. Assim, o objetivo desta pesquisa foi
investigar o potencial genotóxico do extrato aquoso da P. angulata, nos linfócitos de sangue
periférico humano, usando os ensaios de aberrações cromossômicas e de eletroforese em gel de
células individualizadas ou teste do Cometa. Os resultados obtidos neste estudo indicam que: (a) na
presença do extrato aquoso nas concentrações de 0,1 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1 µg/mL, observou-se um
aumento na taxa de proliferação dos linfócitos tratados (p<0,01), (b) as concentrações acima de 2
µg/mL as doses foram consideradas citotóxicas, pois resultou em 50% de citotoxicidade comparada
ao controle negativo; (c) o extrato aquoso da P. angulata não apresentou efeito clastogênico ou
aneugênico; (d) não houve indícios d quebra de fitas simples do DNA ou outro tipo de lesão nessa
molécula, segundo o teste do Cometa. O Extrato aquoso da P. angulata exibiu efeito tóxico sobre o
cromossomo ou sobre a molécula de DNA, portanto, mostrou-se inadequado ao consumo humano,
todavia são necessários testes adicionais, especialmente, ensaios in vivo para garantir maior
segurança na sua utilização terapêutica.
MATERIAL E MÉTODOS
INTRODUÇÃO
Extrato da planta
Physalis angulata L pertence à família
Espécimes de P. angulata foram coletados
Solanaceae que é amplamente distribuída em em Belém, Estado do Pará, Brasil, e
toda América Tropical. Essa planta é usada na identificadas (Herbário e Laboratório de Neuromedicina popular de diferentes paísese da Química,
Departamento
de
Fisiologia,
África, Ásia e América, no tratamento de dor, Universidade Federal do Pará, comprovante de
febre, inflamações, malária, asma, dermatite, número 15). 150 g de raiz da planta P. angulata
reumatismo (Soares et al., 2003; Choi and foram lavadas em água e fervidas em 700 mL de
Hwang, 2003).
água ultrapura (Milli-Q plus), concentrando-se a
Diferentes extratos dessa planta têm exibido 14% do volume inicial, que foi congelado (-20 º
atividade in vitro anti-tripanosomal, anti- C), liofilizada e foram obtidas 2.712 g de extrato.
inflamatória e bactericida, sendo letal para Este extrato foi dissolvido em água destilada e
algumas bactérias patogênicas ao homem tais filtrado em filtro Millipore 0,22 μm. Esta solução
com Staphylococcus, Escherichia coli, Neisseria foi mantida a 4ºC e protegida da incidência de
gonorrhoeae and Pseudomonas aeruginosa.
luz até o uso. Bleomicina (CAS 9041-93-4) foi
A despeito das propriedades medicinais adquirida da Biosintética (Brasil) e utilizados no
atribuídas à P. angulata, não há relatos sobre ensaio de micronúcleo como um controle
sua atividade genotóxica, conforme as positivo, e doxorrubicina (CAS 25316-40 - 9) foi
recomendações para validação dos fitoterápicos. adquirido da Eurofarma Laboratórios (São Paulo,
No presente estudo, nós avaliamos a Brasil) e usado como um controle positivo em
formação de danos cromossômicos na molécula ensaio do cometa. A Citocalasina B (CAS 14930de DNA induzidos pelo extrato aquoso da P. 96-2), foi adquirida da Sigma (St. Louis, MO,
angulata em linfócitos periféricos humanos.
E.U.A.).
Para medir os danos na molécula de DNA e
sistema de reparo, realizou-se o teste do Cultura de linfócitos
Cometa, também chamado de eletroforese de
Linfócitos humanos do sangue periférico
célula única em gel alcalino. Essa técnica foram usados para os ensaios in vitro.
permite detectar quebras na fita simples do DNA,
Os linfócitos foram obtidos de seis voluntários
sítios álcali-lábeis e ligações cruzadas DNA-DNA saudáveis, não-fumadores, três machos e três
e DNA-proteína, tenso alta sensibilidade para fêmeas com idade entre 18-30 anos com os
detecção de danos no DNA em baixos níveis.
seus
consentimento. O sangue total
Adicionalmente foram investigadas lesões heparinizado (0,5 mL) foi adicionada a 4,5 mL do
cromossômicas pelo teste das aberrações meio contendo 78% RPMI 1640 (Sigma
cromossômicas e do micronúcleo, este último Chemical Co., E.U.A.), 20% de soro fetal bovino
mais eficiente na identificação do efeito inativado
(Gibco-Invitrogen,
Denmark),
aneugênico.
antibióticos
(penicilina
0,005
mg/mL
e
estreptomicina 0,01 mg/mL), estimulados com
2% de fitohemaglutinina (PHA; Gibco- Invitrogen,
Denmark). Cada amostra de sangue foi testada
co diferentes concentrações do extrato da P.
angulata
estabelecidas
em
experimentos
preliminares (0,1, 0,5, 1,2,3 e 6 µg/mL de meio
de cultura). Adicionalmente foram estabelecidas
as culturas controle negativo (não-tratadas) e
positiva.
Procedeu-se a preparação citológica para
obtenção
de
cromossomos
metafásicos,
realizando-se a hipotonização e a fixação em
metanol e ácido acético.
O material celular obtido foi depositado em
lâminas adequadamente limpas e corado em
solução de GIEMSA em tampão fosfato.
As lâminas foram codificadas e, sob
Teste do Micronúcleo
microscopia óptica (100X), foram analisadas 100
Para o teste do micronúcleo, após 24 horas metáfases (2n=46±2) nas quais computou-se as
de cultivo as células foram tratadas com as alterações
cromossômicas
numéricas
ou
diferentes concentrações de P. Angulata. A estruturais, observando-se a posição do
Citocalasina B (6 mg / mL) foi adicionado a 44 h. centrômero, alterações do grau de ploidia e
Depois 72 h, a 37º C, as células foram coletadas aberrações estruturais, tais como lesões
por centrifugação, lavadas e submetidos a uma acromáticas (gaps), quebras cromatídicas e
hipotonia leve (1% de citrato de sódio) e rearranjos complexos, como anéis e trocas
imediatamente fixado com metanol: ácido cromatídicas.
acético ácido. As lâminas foram preparadas de
Para monitorar a toxicidade celular induzida
acordo
com
procedimento
padrão
de pelo agente em questão, foi determinado o
citogenética e coradas com Giemsa a 4%. As índice mitótico pela contagem do número de
lâminas foram codificadas e analisadas por metáfases
em
2000
linfoblástos/cultura,
microscopia óptica em aumento de 400x 1000X, aplicando-se a seguinte fórmula.
se necessário. Para cada experimento, foram
IM = número de metáfases X 100
computados 2000 linfócitos binucleados com o
2000 linfoblástos
citoplasma bem preservado. Os micronúcleos
foram identificados de acordo com os critérios de Ensaio do Cometa
Fenech et al. (2003).
Uma alíquota de 300 µL de cultura foi
depositada num tubo de 500 µL e em seguida
Teste das Aberrações Cromossômicas
adicionados 120 µL de agarose com baixo ponto
Para o teste das aberrações cromossômicas, de fusão (0,5%), depositando-se tal mistura
seis horas após o início da incubação, quando sobre uma lâmina pré-preparada com agarose
as células encontravam-se em G1, adicionou-se com ponto de fusão normal (1,5%). Após a
a solução aquosa de P. angulata nas mesmas solificação do gel (4ºC) o material foi submetido
concentrações do teste de micronúcleo. A cultura à citólise e em seguida à eletroforese em
controle positivo foi tratada com doxorrubicina tampão alcalino (300 mA, 0,5-1 V/cm, <4ºC, pH
nas concentração de 0,15 µg/mL. Todos os 13). As lâminas foram então neutralizadas em
frascos foram envolvidos em papel alumínio, a Tris (0,4 M, pH 7,5) e fixadas em etanol
fim de bloquear a exposição à luz.
absoluto. Posteriormente, deu-se a coloração
Após 47 horas de cultivo agitou-se com brometo de etídio com análise imediata sob
manualmente cada frasco de cultura, retirando- microscopia de flourescência (filtro 516-560 nm,
se 300 µL de cada um para a realização do barreira de filtro de 590 nm e aumento total de
ensaio do Cometa. Em seguida, o crescimento 400X).
celular foi bloqueado pela adição de colchicina
Foi possível a visualização de imagens
(0,016% SIGMA).
microscópicas com contorno circular (sem danos
no DNA) ou estruturas em forma de “cometa”
(com danos no DNA). A extensão de imagem
significa a distância de migração da fita de DNA
danificada, que foi classificada segundo SINGH
et al (1988,1991), POOL-ZOBEL et al (1994) e
SPEIT et al (1995), onde a proporção de DNA
presente na cauda do Cometa os agrupa em
cinco categorias: 0 = sem danos (<5%); 1 =
baixo nível de danos (5-20%); 2 = médio nível de
danos (20-40 %); 3 = alto nível de danos (4095%); 4 = dano total (>95%).
Análise Estatística
O Teste F (ANOVA) de dois critérios foi
utilizado para detectar diferenças entre as
frequências de aberrações cromossômicas e
micronúcleos bem como para os valores de IM
observados nas diversas doses do extrato e
seus respectivos controles (AYRES et al, 2003).
O Teste T de Student foi realizado quando o
teste F identificou diferenças significativas.
Em todas as análises foi estabelecido em 5%
o nível de significância.
RESULTADOS
A Tabela 1 apresenta a distribuição dos
Cometas observados em linfócitos humanos
tratados in vitro com diferentes concentrações
da P. angulata. Nela, pode-se observar que, a
partir da concentração de 0,1 µg/mL, houve um
aumento significativo no escore de danos no
DNA (p=0,043) com uma distribuição uniforme
entre as diferentes classes de danos (0-4).
Todavia, deve ser ressaltado que as lesões
detectáveis por meio do teste do Cometa são
ainda passíveis de reparo, e portanto não devem
ser extrapoladas diretamente para o efeito in
vivo.
Adicionalmente, na Tabela 2 pode-se
observar que o tratamento com o extrato aquoso
de P. angulata em doses iguais ou inferiores a 1
µg/mL promoveu aumento no índice mitótico em
relação à cultura controle. Todavia, a partir dessa
dose, observou-se a indução de efeito citotóxico
nas concentrações utilizadas investigadas.
A Tabela 3 apresenta dados sobre a pesquisa
de efeitos citogenéticos do fitoterápico em
questão, onde pode ser observado que não foi
identificado
qualquer
efeito
genotóxico
estatisticamente significativo do extrato aquoso
de P. angulata durante o tratamento na fase G1
do ciclo celular nas concentrações 0,1 µg/mL;
0,5 µg/mL e 1 µg/mL.
Na análise de aberração cromossômica, a
frequência de células com quebras cromatídicas
e cromossômicas foi igual ou inferior a 3%, não
diferindo entre as culturas tratadas e expostas
(F=1; p=0,438), todavia a amostra no 1 exibiu
maior taxa de aberrações, diferindo dos demais
(p=0,003). A inclusão dos gaps não alterou esse
resultado, uma vez que sua ocorrência também
não diferiu entre as amostras (F=1,083; p=0,405)
ou tratamentos (F=2,583; p=0,118).
Os dados da análise de MN em linfócitos
binucleados são apresentados nas Tabelas 4 e
5.
A Tabela 4 mostra os resultados do total de
células binucleadas com MN e o total de MN
após tratamento com o composto-teste nas
diferentes concentrações. O tratamento com as
quatro menores concentrações de extrato
aquoso da P. angulata não mostrou aumento
significativo no total de células binucleadas com
MN, quando comparado às culturas não tratadas
(p>0,05). Linfócitos tratados com extrato aquoso
da raiz da P. angulata na concentração 3 e 6
µg/mL exibiram um aumento significativo no total
de células com MN (p<0,05). De modo geral, um
MN foi observado por célula, mas algumas
células apresentaram dois ou três MN.
DISCUSSÃO
Os princípios ativos em extratos de uam
variedade de plantas de regiões tropicais e
subtropicais são estudados para possíveis
utilização na saúde humana (Arouma, 2003).
Para se investigar a atividade genotóxica da P.
angulata, diferentes concentrações de seu
extrato aquoso foram empregadas no teste de
aberrações cromossômicas, micronúcleo e
Cometa.
O estudo de danos em nível cromossômico é
parte essencial da Genética Toxicológica porque
essas lesões são um importante evento no
processo de carcinogênese (Fenech, 2000). Os
micronúcleos
são
pequenos
corpos
extranucleares originados na mitose a parte de
fragmentos acêntricos ou cromossomos inteiros
que não forma incluídos no núcleo durante o
processo de replicação do DNA e citocinese
(Fenech, 1997)
P. angulata nas menores concentrações
testadas não induziu efeito genotóxico nos
testes empregados, todavia, observou-se que
nas concentrações mais elevadas (3 e 6 µg/mL)
houve aumento na frequência de micronúcleos,
concentrações essas que inviabilizaram a
análise de aberrações cromossômicas.
O fato de algumas plantas exibirem atividade
genotóxica depende da presença de compostos,
em
seus
extratos
e
das
condições
experimentais. As fisalinas B, F e G purificadas
de P. angulata
tem forte atividade
imunosupressora
em
macrófagos
em
camundongos (Soares et al, 2003). Outros
compostos isolados de P. angulata exibiram
atividade contra a forma epimastigota e
tripomastigota do T. cruzi in vitro, demonstrando
sua
potencialidade
como
agentes
quimioterapêutico para tratamento de doença de
Chagas (Nagafugi et al., 2004).
O extrato aquoso da P. angulata exibiu
toxicidade no presente estudo em concentrações
a partir de 2 µg/mL. Um único estudo investigou
a citotoxicidade da P. angulata, porém os autores
utilizaram um extrato, cerca de quatro vezes
menos
concentrado,
linhagem
celular
estabelecida e o parâmetro utilizado para
investigação da citotoxicidade foi a indução por
apoptose, o que inviabiliza a comparação dos
resultados (Wu et al, 2004).
Os diferentes tipos de lesões observadas nas
metáfases tiveram baixa frequência, tendo sido
considerados eventos raros, desta forma os
dados do presente estudo indicam que o extrato
aquoso não exibiu efeito tóxico sobre o
cromossomo ou sobre a molécula de DNA, e,
portanto, sob a ótica da genotoxicidade mostrase seguro para utilização terapêutica.
Esses dados indicam que o efeito
antineoplásico da planta observado in vivo e in
vitro não deve ser obtido por via genotóxica,
devendo ser investigadas as demais vias.
Este é o primeiro estudo investigando a
genotoxicidade do extrato aquoso da raiz da P.
angulata, e aqui nenhuma atividade genotóxica
foi observada nos ensaios de aberrações
cromossômicas e no teste do Cometa. Todavia,
para aumentar a segurança dos resultados
obtidos nesta investigação, sugere-se a
realização de estudos adicionais, tais como
ensaios
em
camundongos
e
com
microrganismos (teste de Ames), bem como
antimutagênicos.
AGRADECIMENTOS
Este estudo recebeu apoio financeiro do
CNPq. CPA recebeu bolsa do BIC/FAPEMIG.
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Anexo 1
Tabela 1: Proporção de danos no DNA, frequência de células com Cometas e distribuição entre as
classes de Cometas em linfócitos humanos tratados in vitro com diferentes concentrações de extratos
aquoso de P. angulata.
Tratamento µg/mL
0
1
2
3
4
Índice de Dano no
DNA
± SD
Controle negativo
(n=6)
Controle
positivo*(n=6)
Extrato
57,2
32,2
8,2
2
0,4
0,15 ± 0,19
32
29,7
32
3
3,3
1,15 ± 0,19
73,8
0,1 (n=6)
50,2
34
2,2
3,6
0,2
0,75 ± 0,14
49,8
0,5 (n=6)
1,0 (n=6)
2,0 (n=6)
3,0 (n=6)
6,0 (n=6)
a
Classe de Cometa (%)
38,2
32,6
38,6.
40
42,7
41
45,2
33,4
33,8
28
16,2
16,8
22,2
19,4
20
4,2
4,2
4,2
5
8,3
0,4
0,4
1,6
1,8
1
Estatisticamente diferente do Grupo controle (p<0,05)
SD: Desvio Padrão
*DXR: 0,15µg/mL
a
Células com
cometas
(%)
42,8
a
a
61,8
a
69,4
a
61,4
a
60,0
a
57,3
0,87 ±0,28
0,93 ± 0,33
0,90 ± 0,26
0,95 ± 0,12
1,14 ± 0,65
Tabela 2:
Valores referentes aos índices mitóticos (%) obtidos em culturas de linfócitos tratadas
com diferentes concentrações de extrato aquoso de P. angulata.
AMOSTRA
0 µg/mL
0,1 µg/mL
0,5 µg/mL
1 µg/mL
2 µg/mL
3 µg/mL
1
0,70
2,25
2,30
2,30
0,85
0,50
2
0,90
1,45
0,80
1,15
0,03
0,50
3
0,65
1,40
1,55
1,15
0,05
0,03
4
0,65
1,85
1,75
1,35
0,25
0,25
5
0,75
1,75
1,90
1,45
0,35
0,40
6
0,85
1,65
1,85
1,35
0,25
0,35
Média
0,75
1,73
1,78
1,46
0,34
0,38
Desvio Padrão
0,22
1,92
2,30
3,69
1,45
0,21
<0,01
<0,01
<0,01
<0,05
<0,05
p*
*valor de p em relação à amostra controle (o µg/mL)
Tabela 3: Distribuição de alterações cromossômicas observadas em linfócitos humanos após
tratamento in vitro com extrato aquoso de P. angulata.
Amostras
Metáfases
normais
Metáfases alteradas
Ctb
Csb
Ctg
1
4
Csg
Outras alterações
0 µg/mL
1
100
2
95
3
98
4
100
5
99
6
99
1
Total
591
2
1
1
1
1
6
0
2
1
0
0
0,1 µg/mL
1
97
2
99
1
3
99
1
4
100
5
99
6
99
Total
593
1
1
3
0
3
1
0,5 µg/mL
1
100
2
99
3
100
4
98
5
100
6
99
Total
596
1
1
99
2
2
100
3
100
4
100
5
99
6
99
tetraploidia
1
0
1
0
1
0
1
1
1 µg/mL
Quadrirradial*
1
1
Total
597
3
0
0
1
*quebras cromatídicas envolvidas no rearranjo listados na coluna ‘outras alterações’
- Ctb: quebra cromatídica; Csb: quebra cromossômica; ctg:gap cromatídico; Csg:gap cromossômico.
Anexo 1
Tabela 4. Indução de micronúcleos em linfócitos humanos cultivados e tratados com extrato aquosos
de P. angulata L.
Distribuição de MN em BN
Total de
MN
25
0 MN
1 MN
2 MN
3 MN
Controle negativo
Total de BN
com MN
23
11977
21
2
0
Controle positivo
245
274
11755
219
23
3
0,1 µg/mL
25
26
11975
24
1
0
0,5 µg/mL
23
27
11977
19
4
0
1 µg/mL
26
26
11974
26
0
0
2 µg/mL
34
37
11966
32
1
1
3 µg/mL
38
40
11962
36
2
0
6 µg/mL
37
41
11963
34
2
1
Tratamentos
P. angulata
12000 células analisadas/tratadas;
BN: células binucleadas; MN: micronúcleo
*Bleomicina: (BLM) = 1,5 µg/mL ( 10µl/cultura)
a
p<0,05 tratado VS controle negativo
Tabela 5 – Indução de citotoxicidade em cultura de linfócitos humanos tradada com extrato de
Physalis angulata L.
Tratamento
Distribuição de células de acordo com o
%BN
IPBC ± DP
µg/mL
número de núcleo
1
2
3
4
Controle negativo *n=6)
1227
1438
191
144
47,93
1.742
Controle positivo* (n=6)
1852
1019
71
58
33,96
1.426
0.1 (n=6)
1157
1584
136
123
52.80
1.701
0.5 (n=6)
1284
1442
138
136
48.06
1.661
1.0 (n=6)
1291
1496
119
94
49.86
1.642
2.0 (n=6)
1186
1514
151
149
50.46
1.705
3.0(n=6)
1289
1517
121
73
50.56
1.635
6.0(n=6)
1199
1500
163
138
50.00
1.817
PAE (n=6)
12000 células analisadas e tratadas ; %BN: percentagem de células binucleadas; DP: Desvio Padrão.
IPBC: Indíce de proliferação cytokinesis blocked {[M1 + 2(M2) + 3(M3 + M4)]/ N}
*Bleomycina: [BLM] = 1.5 µg/ml (10 µl/cultura)
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