Trabalho

XII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de novembro.
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DE DIFERENTES
LINHAGENS DE TUMOR DE MAMA DE CADELAS E ANÁLISE
FRACTAL DA ANGIOGÊNESE TUMORAL UTILIZANDO
MEMBRANA CORIOALANTÓIDE DE EMBRIÕES DE CODORNA
Nathália Maria Feliciano Henrique de Sousa1,Jeine Emanuele Santos da Silva2, Romildo de Albuquerque Nogueira3
Introdução
O câncer é um problema de saúde pública em todo o mundo, ocorrendo tanto na espécie humana quanto em animais
de companhia como cães e gatos. Em cães, o câncer representa a principal causa de óbitos não acidentais, estando
relacionado a fatores como raça, idade, sexo e fatores ambientais, podendo ocorrer de forma local ou disseminada;
sendo os tumores de mama responsáveis por aproximadamente 70% de todas as neoplasias na fêmea canina, onde 50%
destas são malignas (De Nardi, 2002; Merlo, 2008; Green, 2009). Há várias décadas a quimioterapia tem sido o
tratamento padrão para o câncer, porém devido à alta toxicidade dos fármacos utilizados e ao desenvolvimento de
resistência ao tratamento, nos últimos anos a oncologia têm se concentrado na busca por alternativas a esta terapêutica.
As estratégias para tratamento do câncer utilizando agentes antiangiogênicos incluem o desenvolvimento de: (1)
drogas que inibem moléculas mediadoras do processo de neovascularização; (2) drogas que influenciam proliferação e
migração de células endoteliais; (3) drogas que neutralizam moléculas angiogênicas já liberadas, e (4) drogas que
induzem uma reação inflamatória para retardar a proliferação celular endotelial. A maioria dos agentes antiangiogênicos
ainda está em fase de testes, havendo a necessidade de desenvolvimento de modelos experimentais, como proposto
nesse trabalho, que viabilizem estes estudos para uma melhor compreensão dos mecanismos e características deste
processo.
Material e métodos
A. Preparação dos ovos, implante tumoral e histologia
Ovos fertilizados de codorna (Coturnix japonica) livres de patógenos específicos foram fornecidos pela Estação
Experimental de Pequenos Animais de Carpina (EEPAC/UFRPE), desinfectados e incubados a 37,5°C e Umidade
Relativa (UR) em torno de 60%. Após 48 horas de incubação foi feita uma janela na casca dos ovos com tesoura
esterilizada para remoção de 1mL de albúmen. A janela foi selada com parafilme para evitar dessecamento do embrião e
os ovos reintroduzidos na incubadora.
No bioensaio com fragmento de tumor de Erlich foram utilizados vinte ovos, sendo 10 para o grupo controle e 10
para o grupo tratado; obtidas a partir de cepas de manutenção oriundas do Departamento de Cancerologia Experimental
da UFPE/Laboratório de Farmacologia do DMFA-UFRPE, ajustadas em solução de Ringer pH 7,2, contendo 200.000U
de penicilina G potássica, inoculadas na região central do disco do sistema circulatório córion-alantóideo de
preparações de ovos fertilizados após 96h de incubação. Concluído a implantação do tumor, as janelas nas cascas dos
ovos foram novamente seladas com parafilme e colocados na incubadora.
Fragmentos de tumor de mama de cadela oriundos dos animais atendidos no Hospital Veterinário da UFRPE foram
coletados imediatamente após mastectomia, armazenada em solução salina estéril até o momento do implante tumoral
(após 168h de incubação), enquanto parte do fragmento foi armazenada em solução de paraformaldeído 4% e
processada para posterior análise histopatológica.
No décimo dia de incubação, foi realizada a remoção da MCA juntamente com o fragmento tumoral para análise
histológica. O material foi fixado em paraformaldeído a 4% durante 24 horas em temperatura ambiente. Seguindo-se a
desidratação e diafanização do material que foi submetido a diversos banhos de soluções de concentrações crescentes de
etanol (de 70 a 100%) em água. Após este processo foi feita a parafinização utilizando-se xilol e parafina, formando
blocos rígidos contendo o material que foi microtomizado, fixado em uma lâmina e corado com hematoxilina e eosina
(H-E).
1
Graduando (Medicina Veterinária) – Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) - Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos CEP: 52171-900 – Recife, PE - [email protected];
2
Doutoranda do PPGBA - Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) -Rua Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos - CEP: 52171900 – Recife, PE – [email protected]
3
Professor Associado 4 do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal - Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) - Rua Dom
Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos - CEP: 52171-900 – Recife, PE - [email protected].
XII JORNADA DE ENSINO, PESQUISA E EXTENSÃO – JEPEX 2013 – UFRPE: Recife, 09 a 13 de novembro.
B. Análise de imagem e cálculo da dimensão fractal
As imagens digitalizadas foram segmentadas e binarizadas, para posterior análise da geometria da rede vascular que
se forma ao longo do tempo de observação. Para obtenção do valor médio da dimensão fractal (Df) da vascularização
das MCA de codorna (Coturnix japonica) foram utilizados os métodos de contagem por caixas (box-counting)
utilizando Software BenoitTM 1.3 Fractal Analysis System (Figura 1).
Inicialmente foi utilizado o teste de Shapiro-Wilks para testar a normalidade da distribuição das dimensões fractais
da vascularização da membrana corioalantóide dos embriões de codorna de cada grupo experimental. Para verificar se
há diferenças significativas entre as dimensões fractais dos grupos experimentais foi realizada uma análise nãoparamétrica pelo Método de Kruskal-Wallis.
Resultados e Discussão
Para o implante da massa de tumor de Erlich, foi calculada a relação entre o peso do embrião e o peso da massa
tumoral, considerando-se o valor de 0,01g de tumor por grama de peso vivo do embrião. Para o grupo implantado,
observou-se que apenas uma das amostras sobreviveu 24h após o implante. Sendo assim, as imagens do referido grupo
não puderam ser obtidas. Dessa forma, a análise fractal foi realizada apenas nas amostras do grupo controle, cujas
imagens foram capturadas nos momentos 72, 96 e 120h de incubação. Os valores médios da dimensão fractal das
MCAs (Tabela 1) não apresentam diferença significativa, de acordo com o teste de Kruskal-Wallis (p = 0,48).
Os implantes de tumor de mama de cadela foram realizados no 7º dia incubação, onde a formação da membrana
corioalantóide está estabelecida, e observou-se a viabilidade tumoral até o 10o dia. Os fragmentos tumorais provenientes
de tumor de mama de cadelas foram viáveis em 60% das amostras, 12 num total de 20. Os tumores viáveis tinham
aparência esbranquiçada, enquanto os inviáveis mostraram-se enegrecidos no primeiro ou segundo dia pós-implante.
Resultados semelhantes foram obtidos por Malik et al. (2000).
Na análise histológica, é possível observar um processo de fixação do fragmento tumoral à membrana
extraembrionária (Figura 2). A viabilidade do implante tumoral provavelmente resulta da rica vascularização da
membrana, que provê o suprimento de oxigênio e nutrientes necessários à manutenção do tumor, após o estímulo a
angiogênese. Este resultado concorda com aqueles observados por Balke et al. (2009), em que os referidos autores
utilizaram diferentes linhagens de osteossarcomas para implante em membrana corioalantóide de embriões de galinha.
Agradecimentos
Agradecemos a PIBIC-CNPQ pela bolsa de iniciação cientifica ao Laboratório de Biofísica Teórico-Experimental e
Computacional (LABTEC) do DMFA -UFRPE pelo suporte na realização dos experimentos.
Referências
Balke, M.; Neumann, A.; Kersting, C.; Agelopoulos, K.; Gebert, C.; Gosheger, G.; Buerger, H.; Hagedorn, M.
Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. Biomed Central. 3:58,
2010.
De Nardi, AB; Rodaski, S; Sousa, RS; Costa, TA; Macedo, TR; Rodigheri, S.M., Rios, A & Piekarz, CH. Prevalência
de neoplasias e modalidades de tratamentos em cães, atendidos no hospital veterinário da Universidade Federal do
Paraná. Archives of Veterinary Science. 7(2):15-26. 2002.
Green, KT; Franciosi, A; Santos, MBF & Guérios, SD. Incidência de neoplasia mamária em fêmeas caninas atendidas
no Hospital Veterinário da Universidade Federal do Paraná – Curitiba. VI Encontro Internacional de Produção
Científica Cesumar, 2009.
Malik, E.; Meyhöfer-Malik, A.; Berg, Ch.; Böhm, W.; Kunzin-Rapp, K.; Diedrich, K; Rück, A. Fluorescence diagnosis
of endometriosis on the chorioallantoic membrane using 5-aminolaevulinic acid. Human Reproduction. v.15, nº3,
pp.584-588, 2000.
Merlo D.F. Cancer Incidence in Pet Dogs: Findings of the Animal Tumor Registry of Genoa, Italy. Journal of Veterinary
Internal Medicine. 22(4):976-984. 2008.
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Tabela 1. Valores médios e desvio-padrões da dimensão fractal da vascularização da MCA do grupo controle nos momentos 72, 96 e
120h.
Figura 1. Janela do software BenoitTM Fractal Analysis System 1.3 realizando a análise fractal pelo método de contagem por
caixas (Box-counting).
Figura 2. Corte histológico mostrando aderência do fragmento tumoral (seta) à MCA. Hematoxilina-Eosina. Pequeno aumento.