pró-reitoria de pesquisa e pós-graduação

PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
AVALIAÇÃO DA VACINAÇÃO ANTIRRÁBICA E DA
SUPLEMENTAÇÃO COM PROBIÓTICO NA RESPOSTA IMUNE
HUMORAL EM BOVINOS
MÁRCIA REGINA FELIPPE B. CROSCIOLI
Presidente Prudente – SP
2013
1
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL
AVALIAÇÃO DA VACINAÇÃO ANTIRRÁBICA E DA
SUPLEMENTAÇÃO COM PROBIÓTICO NA RESPOSTA IMUNE
HUMORAL EM BOVINOS
MÁRCIA REGINA FELIPPE B. CROSCIOLI
Dissertação apresentado a Pró-Reitoria de
Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade
do Oeste Paulista, como parte dos
requisitos para obtenção do título de Mestre
em
Ciência
Animal.
Área
de
Concentração: Fisiopatologia Animal.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Eduardo Pardo
Presidente Prudente – SP
2013
2
636.208 5
C949a
Croscioli, Márcia Regina Felippe B.
Avaliação da vacinação antirrábica e da
suplementação com probiótico na resposta imune
humoral em bovinos / Márcia Regina Felippe B.
Croscioli. – Presidente Prudente, 2013.
35 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) Universidade do Oeste Paulista – Unoeste,
Presidente Prudente, SP, 2013.
Bibliografia.
Orientador: Paulo Eduardo Pardo.
1. Raiva. 2. Cobertura vacinal. 3. Anticorpos. 4.
Bovinos. I. Título.
3
MÁRCIA REGINA FELIPPE B. CROSCIOLI
AVALIAÇÃO DA VACINAÇÃO ANTIRRÁBICA E DA SUPLEMENTAÇÃO COM
PROBIÓTICO NA RESPOSTA IMUNE HUMORAL EM BOVINOS
Dissertação apresentado a Pró-Reitoria
de
Pesquisa
e
Pós-Graduação,
Universidade do Oeste Paulista, como
parte dos requisitos para obtenção do
título de Mestre em Ciência Animal. Área de Concentração: Fisiopatologia
Animal.
Presidente Prudente, 21 de março de 2013.
BANCA EXAMINADORA
_______________________________________________
Prof. Dr. Paulo Eduardo Pardo
Universidade do Oeste Paulista – Unoeste
Presidente Prudente-SP
_______________________________________________
Prof. Dr. Luiz Fernando Coelho da Cunha Filho
Universidade Norte do Paraná – Unopar
Londrina – PR
_______________________________________________
Prof. Dr. Luis Carlos Vianna
Universidade do Oeste Paulista – Unoeste
Presidente Prudente - SP
4
DEDICATÓRIA
Aos meus pais que nunca mediram esforços para me ver feliz.
Ao meu esposo por estar sempre presente em minha vida.
Aos meus filhos, por serem a razão de tudo na minha vida.
5
AGRADECIMENTO
A Deus, por ter me dado forças nas horas em que precisei, pela vida e
por todas as bênçãos.
Ao Professor orientador, Dr. Paulo Eduardo Pardo que com sua
dedicação, amizade, paciência fez aprimorar meus conhecimentos me acolheu e
orientou com responsabilidade.
Aos professores do Programa de Pós-Graduação que fizeram parte
desta conquista acadêmica.
A Drª. Neuza Frazatti Gallina e toda a equipe do Setor de Raiva do
Instituto Butantã, pela colaboração no projeto.
A amiga nutricionista Sandra Genaro, pela amizade e colaboração.
A minha família, que em todos os momentos de realização deste
trabalho, estiveram presentes, ajudando e animando.
Em especial aos meus filhos, que sempre estiveram ao meu lado.
6
RESUMO
Avaliação da vacinação antirrábica e da suplementação com probiótico na
resposta imune humoral em bovinos
Esse estudo avaliou o efeito da suplementação do probiótico sobre a resposta imune
humoral em bovinos vacinados com uma única dose de vacina antirrábica. Trinta
bovinos machos, hígidos da raça Nelore, com idade de 12 meses, todos vacinados
com dose única de vacina antirrábica, divididos aleatoriamente em 2 grupos (15
bovinos/grupo): grupo controle (GC) recebeu 70 gramas de suplemento
mineral/animal/dia, o grupo probiótico (GP) recebeu 70 gramas de suplemento
mineral adicionado 4 gramas de probiótico/animal/dia. Os títulos individuais de
anticorpos neutralizantes foram determinados por meio da técnica de
soroneutralização baseado no Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) e no
Fluorescent Inhibitio Microtest (FIMT). Os resultados obtidos foram comparados pelo
teste t não pareado, e os títulos sorológicos dentro de cada grupo, aos 30 e 60 dias
pós-vacinação, pelo teste t-pareado para amostras relacionadas. Os resultados não
demonstraram diferenças estatísticas significativas entre as médias de
concentrações séricas entre os grupos, entretanto, houve diferenças estatísticas
significativas nas proporções de animais protegidos (> 0,5 UI/ml aos 60 dias),
concluindo que a administração do probiótico não interfere na resposta imune
humoral em bovinos.
Palavras-Chaves: Raiva. Bovino. Cobertura vacinal. Anticorpos.
7
ABSTRACT
Evaluation of rabies vaccination and supplementation on immune response
probiotic humoral in cattle
This study aims to evaluate the effect of the probiotic supplementation in response to
the humoral immune response in vaccinated cattle with one dose of anti-rabies
vaccine. Thirty Nelore male cattle, aged 12 months, all of them vaccinated with one
dose of anti-rabies vaccine, randomly divided in 2 groups (15 cattle/group): The
control group (CG) received 70 grams of mineral/animal/day supplement, the
probiotic group received 70 grams of the mineral supplement plus 4 grams of the
probiotic/animal/day. The individual titres of neutralizing antybodies were determined
by serum-neutralisation technique based on the Rapid Fluorescent Focus Inhibition
Test (RFFIT) and the Fluorescent inhibition Microtest (FIMT). The obtained results
were compared by the unpaired t test and the serological titres in each group at 30
and 60 days post-vaccination, by the t paired test for related samples. The results did
not demonstrate meaningful statistical differences between the averages
concentrations between the group, however, there was statistical differences in the
proportion protected animals (> 0,5 UI/ml in 60 days). Concluding that the
administration of the probiotic did not interferes in the humoral immune response in
cattle.
Keyword: Rabies. Cattle. Vaccinal coverage. Antibodies.
8
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 9
1.1 Raiva ..................................................................................................................... 9
1.2 Probiótico ............................................................................................................ 10
2 OBJETIVO.............................................................................................................. 14
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 15
3 ARTIGO CIENTÍFICO ............................................................................................ 18
ANEXO ......................................................................................................................31
9
1 INTRODUÇÃO
A raiva é uma zoonose causada por um Lyssavirus (RADOSTITS;
GAY; HINCHCLIFF, 2002; RODRIGUEZ et al., 2007), ocorrendo em quase todo o
mundo. Na América do Sul, o principal transmissor é o morcego Desmodus rotundus
(RODRIGUEZ et al., 2007), que quando infectado transmite o vírus rábico pela saliva
principalmente pela mordedura, e mais raramente pela arranhadura e lambedura de
mucosas (BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2008),
acomete o sistema nervoso central (ARENAS et al., 2009; FERREIRA et al., 2009;
QUEIROZ et al., 2009; MARIA et al., 2009).
Considerada uma das zoonoses de maior importância em Saúde
Pública, não só por sua evolução drástica e letal, como também por seu elevado
custo social e econômico (BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e
Abastecimento, 2005).
Todos os mamíferos são susceptíveis à infecção pelo vírus rábico,
(BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2008) sendo
responsável por enormes prejuízos econômicos em todo mundo (FERREIRA et al.,
2009; MARIA et al., 2009).
A vacinação contínua é o método mais efetivo, de baixo custo e
economicamente viável (FERREIRA et al., 2009; MARIA et al., 2009; REIS et al.,
2007).
Para aumentar a eficácia da vacinação contra o vírus da raiva é
imprescindível buscar alternativas que auxiliem nesse processo (FERREIRA et al.,
2009).
O uso de adjuvantes tem revelado bons resultados na restauração da
resposta imunitária e na potencialização de vacinas em relação a diversos agentes
patógenos. Uma das estratégias para aumentar a resposta imunológica dos animais
à imunidade induzida ou às infecções provocadas por vírus ou bactérias é o
acréscimo de probióticos ao suplemento mineral utilizado (ARENAS et al., 2009;
FERREIRA et al., 2009).
10
1.1 Raiva
A raiva é considerada uma enfermidade de notificação obrigatória,
invariavelmente fatal, afeta principalmente o sistema nervoso central (SNC) da
maioria dos mamíferos domésticos e silvestres, inclusive os seres humanos
(BARROS et al., 2006).
O morcego hematófago Desmodus rotundus é o principal vetor desta
enfermidade (FERREIRA et al., 2009).
O vírus penetra no organismo, multiplica-se no ponto de inoculação,
atinge o sistema nervoso periférico e, posteriormente, o sistema nervoso central. A
partir daí, dissemina-se para vários órgãos e glândulas salivares, onde também se
replica e é eliminado pela saliva das pessoas ou animais enfermos (BRASIL.
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2008).
A raiva é responsável pela morte de cerca de 100 a 500 mil bovinos por
ano na América Latina causando prejuízo de aproximadamente 50 milhões de
dólares (LIMA et al., 2005) e somente no Brasil na ordem de 30 a 40 mil bovinos/ano
segundo o Ministério da Agricultura. Isso representa prejuízos diretos de 15 milhões
de dólares e indiretos de 22,5 milhões de dólares (FERREIRA et al., 2009; ALBAS et
al., 2006; LIMA et al., 2005). Além das mortes de milhares de herbívoros, ocorrem
também gastos indiretos com a vacinação e inúmeros tratamentos pós exposição
(sorovacinação) de pessoas que mantiveram contato com animais suspeitos
(BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2005).
1.2 Probiótico
Os
probióticos
são
suplementos
alimentares
que
contém
microorganismos vivos que se administrados em doses adequadas, conferem
benefícios á saúde do hospedeiro (animais e seres humanos) atuando como
estimuladores do sistema imune e promotor do crescimento, aumentando ganho de
peso (ARENAS et al., 2007).
Os probióticos são microorganismos vivos que, quando integrados na
alimentação, são classificados de alimentos funcionais por beneficiarem a saúde do
hospedeiro com risco reduzido de causar doença no consumidor (BADARÓ et al.,
11
2009). Dentre os microrganismos mais usados estão os do gênero Lactobacillus e
Bifidobacterium, e uma levedura não patogênica, a Saccharomyces boulardii
(WILLIAMS, 2010).
Os probióticos são preparações de cultura de microorganismos vivos,
extratos e enzimas, não são tóxicas para os animais e nem deixam resíduos tóxicos
(OYETAYO; OYETAYO, 2005; PARDO; REIS, 2008).
A eficaz utilização dos probióticos depende unicamente da quantidade
e características das cepas de microorganismos utilizados na fabricação do produto
a ser utilizado como aditivo alimentar. As espécies bacterianas comumente
utilizadas para o seu preparo são: Lactobacillus bulgaris, L. acidophilus, L. casei, L.
lactis, L. salivaris, L. plantarium, L. reuteri, L. johonsie, Streptococcus thermophilus,
Enterococcus faecium, E. faecalis, Bifidobacterium SSP, Bacillus subtilis, B. toyoi,
Aspergillus oryzae e Saccharomyces cerevisiae (MATOS, 2008).
A grande vantagem da terapia com probióticos é a ausência de efeitos
secundários, como a seleção de bactérias resistentes (MARTINS et al., 2005).
Para um bom probiótico apresentar a alegação de promoção de saúde,
no seu rótulo, a Agência Nacional de Vigilância de Sanitária (BRASIL. Ministério da
Agricultura, Pecuária e Abastecimento, 2008) estabelece que a quantidade mínima
da cultura deva estar entre 108 a 109 UFC (Unidades Formuladoras de Colônias) por
porção do produto (HOLANDA et al., 2008).
O início da utilização de probióticos na alimentação animal ocorreu na
década de 70, com a utilização principalmente do Lactobacillus acidophilus, nas
rações de frangos de corte. Com a proibição da utilização de antibióticos como
promotores de crescimento pela União Européia, coube aos produtores a busca por
novos produtos e técnicas de manejo que propiciassem a mesma eficiência, sem
elevação dos custos (MATOS, 2008).
O uso de antibióticos e hormônios e dietas é uma prática que vem
sendo abolida, pois sua utilização pode deixar resíduos nos produtos de origem
animal (ALVES; ISEPON; BERGAMASHINE, 2004), e quando usado de forma
indiscriminada favorece o aparecimento de bactérias resistentes aos mesmos
(FRANCO et al., 2008).
12
O uso de probiótico vem substituindo a utilização de antibióticos
adicionados às rações como promotor de crescimento e controle de doenças
(MEURER et al., 2007; PARDO; REIS, 2008).
O sistema digestório contém milhões de bactérias, o equilíbrio entre
elas é muito importante inclusive para função imunológica (PARDO; REIS, 2008).
A microflora intestinal enfrenta desafios diários que podem causar um
desequilíbrio entre bactérias saudáveis e patogênicas, como por exemplo, a má
alimentação, o uso de antibióticos, estresse, intoxicação alimentar, dentre outros. Ao
ingerir alimentos com probióticos, bactérias saudáveis que sobrevivem às secreções
digestivas, chegam ao intestino grosso e são capazes de colonizar este ambiente,
favorecendo o equilíbrio microbiano (MILES, 2007). A interação entre a microflora
intestinal e a cepa probiótica tem por base a competição com as bactérias
patogênicas por sítios de adesão aos receptores epiteliais de nutrientes produção de
bacteriocinas (MILES, 2007; DOSTA et al., 2009).
As bacteriocinas são substâncias produzidas por diferentes bactérias
probióticas e servem como barreiras antimicrobianas ajudando a reduzir níveis de
microorganismos patógenos, melhora da digestibilidade e aumento da atividade
imunológica (ESPARZA; FRAGOSO, 2010; NOGUEIRA; GONÇALVES, 2011).
O principal alvo do probiótico é a mucosa intestinal e sua microbiota,
onde as bactérias probióticas ocupam os sítios de ligação (receptores ou pontos de
ligação) na mucosa intestinal, formando um tipo de barreira física às bactérias
patogênicas (PARDO; REIS, 2008). Essas bactérias não conseguem se ligar a
esses
receptores
e,
consequentemente,
são
excluídas
por
competição
(VARAVALLO; THOMÉ; TESHIMA, 2008).
Dentre os efeitos benéficos dos probióticos, estão sua utilização como
promotores de crescimento aumentando o ganho de peso, a redução do pH
intraluminal do tubo digestivo, reduzindo o estresse, bloqueando a colonização da
mucosa intestinal por bactérias patogênicas e aumentando a resposta imune
humoral (PARDO; REIS, 2008). Observou-se também um aumento significativo nos
títulos de anticorpos antirrábico em bovinos primovacinados contra raiva, além disso,
também elevou para 100% a frequência de animais que apresentaram títulos de
anticorpos protetores contra o vírus rábico, sugerindo a exclusão competitiva, em
que o probiótico competiria com os patógenos por sítios de fixação e nutrientes,
13
impedindo sua ação transitoriamente (ARENAS et al., 2007; FERREIRA et al., 2009,
RASTEIRO et al., 2007).
Nos últimos anos, as indústrias de alimentos que antes suplementavam
as rações animais com antibióticos para promover o crescimento e controlar
doenças, estão aumentando a procura por uma alternativa, já que o uso prolongado
desses produtos pode induzir ao aumento de populações bacterianas resistentes,
causando risco significativo à saúde animal e humana, uma vez que para combater
essas bactérias teriam que se usar antibióticos mais potentes. Sendo assim, os
probióticos tornaram-se a opção mais plausível, pois são utilizados na prevenção e
no tratamento de doenças, na regulação da microbiota intestinal, no controle de
distúrbios do metabolismo gastrintestinal, como imunomoduladores, na inibição da
carcinogênese, e como promotores de crescimento (ROOS, 2006).
Pesquisas recentes relacionadas à avaliação da resposta imune de
animais alimentados com dietas suplementadas com probióticos, revelaram, em sua
grande maioria, os efeitos benéficos destes microorganismos ao estimularem de
alguma maneira a resposta imune do hospedeiro, seja a resposta inata, a celular ou
a humoral (ERICKSON; HUBBARD, 2000).
Várias pesquisas tem demonstrado que os probióticos estimulam a
atividade fagocítica dos leucócitos (OYETAYO; OYETAYO, 2005), aumentam a
proliferação de linfócitos T, a atividade dos macrófogos elevam a atividade das
células Natural Killer (NK); ativam as células T Helper CD4+ subpopulação Th1
(OUWEHAND et al., 1999). Ainda modulam as bactérias da microflora intestinal,
atuando no balanço Th1/Th2, promovendo o controle de processos infecciosos e
imunológicos (NOGUEIRA; GONÇALVES, 2011). Aumentam também a produção de
anticorpos e a secreção de mediadores químicos que estimulam o sistema imune
(CROSS, 2002). Entre elas estão a produção de citocinas, interferon gama (IFN-y),
TFN, interleucina (IL) 1, IL-2, IL-10, e a IL-12 (OUWEHAND et al., 1999).
14
2 OBJETIVO
O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da suplementação do
probiótico, sobre a resposta imune humoral em bovinos vacinados com uma única
dose de vacina antirrábica.
15
REFERÊNCIAS
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2010.
18
1
3 ARTIGO CIENTÍFICO
2
Avaliação da vacinação antirrábica e da suplementação do probiótico na resposta imune
3
humoral em bovinos
4
Evaluation of rabies vaccination and supplementation on immune response probiotic humoral
5
in cattle
6
Márcia, R. F. B. C 1*, Jakeline, P. P. D.¹, S. C. Genaro¹, N. M. Frazatti-Galina 2, P. E.
7
Pardo¹, R. Giuffrida¹
8
RESUMO
9
Objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da suplementação do probiótico sobre a resposta
10
imune humoral em bovinos vacinados com uma única dose de vacina antirrábica. Trinta
11
bovinos machos, hígidos, da raça Nelore, com idade de 12 meses, todos vacinados com dose
12
única de vacina antirrábica, foram divididos aleatoriamente em 2 grupos (15 bovinos/grupo):
13
grupo controle (GC) recebeu 70 gramas de suplemento mineral/animal/dia, o grupo probiótico
14
(GP)
15
probiótico/animal/dia. Os títulos individuais de anticorpos neutralizantes foram determinados
16
por meio da técnica de soroneutralização baseado no Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test
17
(RFFIT) e no Fluorescent Inhibitio Microtest (FIMT). Os resultados obtidos foram
18
comparados pelo teste t não pareado, e os títulos sorológicos dentro de cada grupo, aos 30 e
19
60 dias pós-vacinação, pelo teste t-pareado para amostras relacionadas. Os resultados não
20
demonstraram diferenças estatísticas significativas entre as médias de concentrações séricas
21
entre os grupos, entretanto, houve diferenças estatísticas significativas nas proporções de
22
animais protegidos (> 0,5 UI/ml aos 60 dias), concluindo que a administração do probiótico
23
não interfere na resposta imune humoral em bovinos.
24
Palavras-Chave: Raiva, probiótico, bovino, resposta imune.
1
recebeu
70
gramas
de
suplemento
mineral
adicionado
4
gramas
de
Universidade do Oeste Paulista. UNOSTE. Rodovia Raposo Tavares, km 572. Bairro Limoeiro. CEP 19067175. Presidente Prudente – SP. Brasil. *[email protected]
2
Instituto Butantã, São Paulo – SP.
19
1
ABSTRACT
2
This study aims to evaluate the effect of the probiotic supplementation in response to the
3
humoral immune response in vaccinated cattle with one dose of anti-rabies vaccine. Thirty
4
Nelore male cattle, aged 12 months, all of them vaccinated with one dose of anti-rabies
5
vaccine, randomly divided in 2 groups (15cattle/group): The control group (CG) received 70
6
grams of mineral/animal/day supplement, the probiotic group received 70 grams of the
7
mineral supplement plus 4 grams of the probiotic/animal/day. The individual titres of
8
neutralizing antybodies were determined by serum-neutralisation technique based on the
9
Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test (RFFIT) and the Fluorescent inhibition Microtest
10
(FIMT). The obtained results were compared by the unpaired t test and the serological titres in
11
each group at 30 and 60 days post-vaccination, by the t paired test for related samples. The
12
results did not demonstrate meaningful statistical differences between the averages
13
concentrations between the group, however, there was statistical differences in the proportion
14
protected animals (> 0,5 UI/ml in 60 days). Concluding that the administration of the
15
probiotic did not interferes in the humoral immune response in cattle.
16
Keyword: Rabies, cattle, vaccinal coverage, antibodies.
17
INTRODUÇÃO
18
A raiva é uma zoonose (RADOSTITS et al., 2002; RODRIGUEZ et al., 2007), ocorrendo em
19
quase todo o mundo. Na América do Sul, o principal transmissor é o morcego Desmodus
20
rotundus. (RODRIGUEZ et al., 2007), que acomete o sistema nervoso central (ARENAS et
21
al., 2009; FERREIRA et al., 2009; QUEIROZ et al., 2009; MARIA et al., 2009).
22
A vacinação contínua é o método mais efetivo, de baixo custo e economicamente viável
23
(REIS et al., 2007; FERREIRA, 2009; MARIA et al., 2009).
24
Todos os mamíferos são susceptíveis à infecção pelo vírus rábico (BRASIL, 2009), sendo
25
responsável por enormes prejuízos econômicos em todo mundo (FERREIRA et al., 2009;
26
MARIA et al., 2009). Além das mortes de milhares de herbívoros, ocorrem também gastos
20
1
indiretos com a vacinação e inúmeros tratamentos pós exposição (sorovacinação) de pessoas
2
que mantiveram contato com animais suspeitos (BRASIL, 2005).
3
Para aumentar a eficácia da vacinação contra o vírus da raiva, é imprescindível buscar
4
alternativas que auxiliem nesse processo (FERREIRA et al., 2009).
5
O uso de adjuvantes tem revelado bons resultados na restauração da resposta imunitária e na
6
potencialização de vacinas em relação a diversos agentes patógenos. Uma das estratégias para
7
aumentar a resposta imunológica dos animais à imunidade induzida ou às infecções
8
provocadas por vírus ou bactérias é o acréscimo de probióticos ao suplemento mineral
9
utilizado (ARENAS, et al., 2009; FERREIRA et al., 2009).
10
Probióticos são suplementos alimentares que contém microorganismos vivos que se
11
administrados em doses adequadas, conferem benefícios á saúde do hospedeiro (animais e
12
seres humanos), atuando como estimuladores do sistema imune e promotor do crescimento,
13
aumentando ganho de peso, a redução do ph intraluminal do tubo digestivo reduzindo o
14
estresse, bloqueando a colonização da mucosa intestinal por bactérias patogênicas e
15
aumentando a resposta imune humoral (ARENAS et al., 2007; PARDO & REIS, 2008).
16
O uso de antibióticos e hormônios em dietas é uma prática que vem sendo abolida, pois sua
17
utilização pode deixar resíduos nos produtos de origem animal (ALVES et al., 2004), e
18
quando usado de forma indiscriminada favorece o aparecimento de bactérias resistentes aos
19
mesmos (FRANCO et al., 2008).
20
Observou-se também um aumento significativo nos títulos de anticorpos antirrábico em
21
bovinos primovacinados contra raiva, além disso, também elevou para 100% a frequência de
22
animais que apresentaram títulos de anticorpos protetores contra o vírus rábico, sugerindo a
23
exclusão competitiva, em que o probiótico competiria com os patógenos por sítios de fixação
24
e nutrientes, impedindo sua ação transitoriamente (ARENAS et al., 2007; FERREIRA et al.,
25
2009, RASTEIRO et al., 2007).
21
1
Devido a importância do probiótico na suplementação dos animais, objetivou-se avaliar os
2
efeitos da suplementação do probiótico, sobre a resposta imune humoral em bovinos
3
vacinados com uma única dose de vacina antirrábica.
4
MATERIAL E MÉTODOS
5
O experimento foi desenvolvido nos meses de outubro a novembro de 2011, com o período
6
experimental de 60 dias no município de Pirapozinho, localizado a oeste do Estado de São
7
Paulo, Brasil. Foi analisada a concentração de anticorpos neutralizantes antirrábicos em 30
8
bovinos, machos, hígidos da raça Nelore, com idade de aproximadamente 12 meses e
9
divididos aleatoriamente em 2 grupos (15 bovinos por grupo), os quais foram previamente
10
identificados e vermifugados no dia zero do experimento após exame parasitológico de fezes
11
(técnica de Gordon e Whitloclk). Ainda no dia zero o soro dos animais foi analisado para
12
verificar se haviam tido contato com o vírus rábico selvagem e vacinal. Utilizou-se a vacina
13
antirrábica (Vencofarma) contendo vírus rábico fixo inativado, adsorvido em gel de hidróxido
14
de alumínio produzido em cultivo celular. A aplicação foi feita em todos os bovinos em uma
15
dose de 2mL de vacina por via subcutânea.
16
As amostras de sangue dos bovinos foram colhidas nos dias 0, 30 e 60. Para isso, os bovinos
17
foram levados no período da manhã para o curral, contidos em tronco de contenção tipo Brete
18
e 10mL de sangue de cada animal foi colhido por meio de punção da veia jugular em tubos a
19
vácuo sem anticoagulante. Os tubos foram transportados em caixa térmica com gelo e após
20
cerca de 2 horas foram centrifugados a 3500 rotações por minuto (rpm) por 10 minutos. As
21
amostras de soro foram retiradas com pipeta automática, acondicionadas em tubos plásticos
22
de 1,5mL e armazenadas por congelação em freezer a -20ºC para posterior determinação do
23
título de anticorpos neutralizantes antirrábicos.
24
Os títulos individuais de anticorpos neutralizantes foram determinados no Laboratório de
25
Raiva do Instituto Butantã – São Paulo, por meio da técnica de soroneutralização em células
22
1
BHK21 clone 13. Esse teste, baseado no Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test – RFFIT
2
(SMITH et al., 1998) e no Fluorescent Inhibition Microtest – FIMT (ZALAN et al., 1979).
3
Os bovinos foram alimentados com capim Tanzânia em sistema de pastejo extensivo e os
4
piquetes utilizados pelos grupos de animais eram semelhantes na topografia e composição
5
botânica. Foram feitos ajustes e estabelecimento do consumo de probiótico adicionado ao sal
6
mineral. A quantidade desse produto adicionado ao sal mineral foi calculada de maneira que
7
cada animal ingerisse certa de 4 gramas por dia. (ARENAS et al., 2009).
8
O primeiro grupo, controle (GC) recebeu 70 gramas de suplemento mineral/animal/dia. O
9
segundo grupo recebeu 70 gramas de suplemento mineral adicionado 4 gramas de
10
probiótico/animal/dia (GP).
11
A determinação do consumo do probiótico/animal feita no primeiro mês do experimento foi
12
da seguinte maneira: o sal mineral suplementado com o probiótico foi pesado e colocado no
13
cocho e após 24 horas, retirado e pesado novamente. A diferença entre a primeira pesagem e a
14
segunda, dividida pelo número de animais que utilizaram o cocho foi considerado como
15
consumo médio de sal/bovinos durante 24 horas.
16
O probiótico comercial utilizado foi Proenzime – produzido por Empresa Brasileira de
17
Aumento de Produtividade Pecuária – EMBRAUPEC, Paranavaí – PR, Brasil, composto por
18
amilase, celulase, protease, lipase, pectinase, Lactobacilus acidophilus, Estreptococus
19
faecium, Bifedobacterium thermoplhilum, Bifedobacterium longum e zinco.
20
Utilizou-se o suplemento mineral Fosbovi Seca (Tortuga) Companhia Zootécnica Agrária,
21
São Paulo, SP, contendo para cada Kg de mistura: 30g de cálcio, 20g de fósforo, 20g de
22
enxofre, 83g de sódio, 560mg de manganês, 16mg de cobalto, 20mg de iodo, 8mg de selênio
23
e 1600mg de zinco e 240mg de cobre.
24
ANÁLISES ESTATÍSTICAS
25
Inicialmente empregou-se o teste de Kolmogov-Smirnov para avaliar a normalidade dos
26
dados, (P > 0,01). Os títulos sorológicos observados para os dois grupos estudados aos 30 e
23
1
60 dias foram comparados pelo teste T não pareado, e os títulos sorológicos dentro de cada
2
grupo, aos 30 e 60 dias pós-vacinação, pelo teste T-pareado para amostras relacionadas
3
(PAGANO & GAUVREAU, 2004). Considerando-se como ponto de corte para o título
4
vacinal protetor, o valor de 0,5 UI, as proporções de animais protegidos dentro de cada grupo
5
vacinado, aos 30 e 60 dias foram comparadas pelo teste exato de Fisher. Dentro de cada
6
grupo, a proporção de animais imunizados contra raiva foi comparada pelo teste Q de
7
Chochran. Todas as análises foram realizadas utilizando o pacote computacional Bioestat
8
(AYRES et al., 2007), com nível de significância de 5%.
9
RESULTADOS E DISCUSSÃO
10
As médias para cada um dos momentos, considerando-se o grupo tratado e controle estão
11
sumarizadas na tabela 1. Não foram observadas diferenças estatísticas significativas entre os
12
títulos soroneutralizantes entre os grupos estudados aos 30 dias pós-vacinação (P = 0,1123) e
13
60 dias pós-vacinação (P = 0,2193). As médias de títulos soroneutralizantes diferiram
14
significativamente entre 30 e 60 dias pós-vacinação para o grupo de animais tratados com
15
probióticos (P = 0,0020) e controle (P = 0,0098). Os valores médios de títulos
16
soroneutralizantes para cada momento dentro de cada grupo e estão representados na figura 1.
17
Na tabela 2, podem ser observadas as proporções de animais com títulos soroneutralizantes
18
considerados protetores para raiva (> 0,5 UI/ml). Os percentuais de animais com títulos
19
protetores foram estatisticamente superiores para o grupo probiótico apenas aos 60 dias pós-
20
vacinação.
21
Alguns probióticos (Lactobacillus e Bifidobacterium) modulam a resposta imune por aumento
22
da produção de anticorpos, ativação de macrófagos, proliferação de células T e produção de
23
interferon, potencializando as vacinas, o que abre uma nova perspectiva de sua utilização
24
(ROSS, 2006). O trabalho de FERREIRA et al. (2009), ALMEIDA et al. (2012) e de ROSA
25
et al. (2013) avaliaram a resposta imune humoral em bovinos utilizando a vacina antirrábica e
26
suplementação com probióticos e não encontraram diferenças estatísticas significativas entre
24
1
as médias de concentração séricas de bovinos primovacinados, concordando com o presente
2
estudo. Já o trabalho feito por ARENAS et al. (2009) avaliaram o efeito da resposta imune
3
humoral da vacina antirrábica com o uso de probiótico Proenzime® em bovinos e constataram
4
aumento significativo (P<0,05) nos títulos de anticorpos antirrábicos, discordando com o
5
presente estudo.
6
Entretanto apesar da magnitude dos títulos sorológicos não diferirem estatisticamente entre o
7
grupo controle e o experimental as proporções de animais protegidos (> 0,5 UI/ml) aos 60
8
dias foram estatisticamente maiores no grupo probiótico do que no grupo controle, diferindo
9
dos resultados de ALMEIDA (2012).
10
CONCLUSÃO
11
Às condições em que o experimento foi desenvolvido e de acordo com os resultados obtidos,
12
não houve diferenças estatísticas significativas entre as médias de concentrações séricas entre
13
os grupos, entretanto, houve diferenças estatísticas significativas nas proporções de animais
14
protegidos (> 0,05 UI/ml) aos 60 dias.
15
COMITÊ DE ÉTICA E BIOSSEGURANÇA – Comissão de Ética no Uso de Animais
16
(CEUA) – aprovado em 31/08/2011 – protocolo 855.
17
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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FRANCO, S. A. Manual de Terapêutica. In: PARDO, P. E.; REIS, L.S.L.S. Nutrientes e
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nutracêuticos em grandes animais. 3.ed. São Paulo: Roca, 2008. p.809-810.
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anti-rábica em bovinos. Archivos Zootechnics., v.58, supl. 1, p.605-608, 2009.
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PAGANO, N.; GRAUVREAU, K. Princípios de bioestatística. 2.ed. São Paulo: Pioneira
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22
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RODRIGUEZ, L. L. et al. Rhabdoviridae. In: FLORES, E. F. (ed.). Virologia veterinária.
12
Santa Maria: UFSM, 2007. p.691-718.
13
ROOS, T. B. Efeito de Saccharomyces boulardii e Bacillus cereus var. toyoi na resposta
14
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15
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3
1157(79)800024-4.
4
28
1
Tabela 1- Médias e desvio-padrão dos títulos de anticorpos soroneutralizantes contra vírus
2
rábico cepa vírus Pasteur mensurados aos 30 e 60 dias pós-vacinação em 15 bovinos tratados
3
com probiótico e 15 bovinos do grupo controle, Presidente Prudente, 2011.
Tratamento
30 dias
60 dias
Probiótico
2,425Aa ± 1,509
1,459Ab ± 1,022
Controle
1,536Aa ± 1,459
0,993Ab ± 1,006
4
Valores na mesma coluna seguidos de letras maiúsculas diferentes e na mesma linha seguidos
5
de letras minúsculas diferentes apresentam diferenças significativas (P < 0,05).
6
29
1
Tabela 2- Número de animais com títulos soro neutralizantes considerados protetores (>0,5
2
UI) mensurados aos 30 e 60 dias pós-vacinação em 15 bovinos tratados com probiótico e 15
3
bovinos do grupo controle, Presidente Prudente, 2011.
30 dias
Número de
60 dias
Número de
Número de
Número de
Grupos
animais com título animais com título animais com título animais com título
4
5
>0,5(%)UI/ml
<0,5(%)UI/ml
>0,5(%)UI/ml
<0,5(%)UI/ml
Probiótico
15 (100%)
0 (0%)
15 (100%)*
0 (0%)
Controle
12 (80%)
3 (20%)
7 (46,6%)
8 (53,4%)
* diferenças significativas entre grupo tratado com probiótico e controle (P = 0,0022)
30
1
4.50
4.00
3.50
3.00
2.50
2.00
1.50
1.00
0.50
0.00
30 dias
Controle
60 dias
Probiótico
2
3
Figura 1- Médias de títulos soroneutralizantes observadas em 15 bovinos tratados com
4
probiótico e 15 bovinos do grupo controle, aos 30 e 60 dias pós-vacinação com vírus rábico
5
cepa Pasteur. As barras de erros aplicadas referem-se aos desvios-padrões.
6
7
8
31
ANEXO
32
Normas para Publicação
1. CIÊNCIA RURAL - Revista Científica do Centro de Ciências Rurais da
Universidade Federal de Santa Maria publica artigos científicos, revisões
bibliográficas e notas referentes à área de Ciências Agrárias, que deverão ser
destinados com exclusividade.
2. Os artigos científicos, revisões e notas devem ser encaminhados
via eletrônica e editados em idioma Português ou Inglês. Todas as linhas deverão
ser numeradas e paginadas no lado inferior direito. O trabalho deverá ser digitado
em tamanho A4 210 x 297mm com, no máximo, 25 linhas por página em espaço
duplo, com margens superior, inferior, esquerda e direita em 2,5cm, fonte Times
New Roman e tamanho 12. O máximo de páginas será 15 para artigo científico,
20 para revisão bibliográfica e 8 para nota, incluindo tabelas, gráficos e
figuras. Figuras, gráficos e tabelas devem ser disponibilizados ao final do texto e
individualmente por página, sendo que não poderão ultrapassar as margens e
nem estar com apresentação paisagem.
3. O artigo científico deverá conter os seguintes tópicos: Título (Português e
Inglês); Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words; Introdução com Revisão de
Literatura; Material e Métodos; Resultados e Discussão; Conclusão e Referências;
Agradecimento(s) e Apresentação; Fontes de Aquisição; Informe Verbal; Comitê de
Ética e Biossegurança devem aparecer antes das referências. Pesquisa
envolvendo seres humanos e animais obrigatoriamente devem apresentar
parecer de aprovação de um comitê de ética institucional já na
submissão (Modelo .doc, .pdf).
4. A revisão bibliográfica deverá conter os seguintes tópicos: Título (Português
e Inglês); Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words; Introdução;
Desenvolvimento; Conclusão; e Referências. Agradecimento(s) e Apresentação;
Fontes de Aquisição e Informe Verbal; Comitê de Ética e Biossegurança devem
aparecer antes das referências. Pesquisa envolvendo seres humanos e animais
obrigatoriamente devem apresentar parecer de aprovação de um comitê de
ética institucional já na submissão (Modelo .doc, .pdf).
5. A nota deverá conter os seguintes tópicos: Título (Português e Inglês);
Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words; Texto (sem subdivisão, porém com
introdução; metodologia; resultados e discussão e conclusão; podendo conter
tabelas ou figuras); Referências. Agradecimento(s) e Apresentação; Fontes de
Aquisição e Informe Verbal; Comitê de Ética e Biossegurança devem aparecer antes
das referências. Pesquisa envolvendo seres humanos e animais
33
obrigatoriamente devem apresentar parecer de aprovação de um comitê de
ética institucional já na submissão. (Modelo .doc, .pdf).
6. Não serão fornecidas separatas. Os artigos encontram-se disponíveis no formato
pdf no endereço eletrônico da revista www.scielo.br/cr.
7. Descrever o título em português e inglês (caso o artigo seja em português) - inglês
e português (caso o artigo seja em inglês). Somente a primeira letra do título do
artigo deve ser maiúscula exceto no caso de nomes próprios. Evitar abreviaturas e
nomes científicos no título. O nome científico só deve ser empregado quando
estritamente necessário. Esses devem aparecer nas palavras-chave, resumo e
demais seções quando necessários.
8. As citações dos autores, no texto, deverão ser feitas com letras maiúsculas
seguidas do ano de publicação, conforme exemplos: Esses resultados estão de
acordo com os reportados por MILLER & KIPLINGER (1966) e LEE et al. (1996),
como uma má formação congênita (MOULTON, 1978).
9. As Referências deverão ser efetuadas no estilo ABNT (NBR 6023/2000) conforme
normas próprias da revista.
9.1. Citação de livro:
JENNINGS, P.B. The practice of large animal surgery. Philadelphia : Saunders,
1985. 2v.
TOKARNIA, C.H. et al. (Mais de dois autores) Plantas tóxicas da Amazônia a
bovinos e outros herbívoros. Manaus : INPA, 1979. 95p.
9.2. Capítulo de livro com autoria:
GORBAMAN, A. A comparative pathology of thyroid. In: HAZARD, J.B.; SMITH,
D.E. The thyroid. Baltimore : Williams & Wilkins, 1964. Cap.2, p.32-48.
9.3. Capítulo de livro sem autoria:
COCHRAN, W.C. The estimation of sample size. In: ______. Sampling techniques.
3.ed. New York : John Willey, 1977. Cap.4, p.72-90.
TURNER, A.S.; McILWRAITH, C.W. Fluidoterapia. In: ______. Técnicas cirúrgicas
em animais de grande porte. São Paulo : Roca, 1985. p.29-40.
9.4. Artigo completo:
O autor deverá acrescentar a url para o artigo referenciado e o número de
identificação DOI (Digital Object Identifiers), conforme exemplos abaixo:
MEWIS, I.; ULRICHS, CH. Action of amorphous diatomaceous earth against different
stages of the stored product pests Tribolium confusum(Coleoptera:
Tenebrionidae), Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae), Sitophilus
granarius (Coleoptera: Curculionidae) and Plodia interpunctella (Lepidoptera:
Pyralidae). Journal of Stored Product Research, Amsterdam (Cidade opcional),
v.37, p.153-164, 2001. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1016/S0022474X(00)00016-3>. Acesso em: 20 nov. 2008. doi: 10.1016/S0022-474X(00)000163.
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PINTO JUNIOR, A.R. et al (Mais de 2 autores). Resposta de Sitophilus
oryzae (L.), Cryptolestes ferrugineus (Stephens) e Oryzaephilus
surinamensis (L.) a diferentes concentrações de terra de diatomácea em trigo
armazenado a granel. Ciência Rural , Santa Maria (Cidade opcional), v. 38, n. 8,
p.2103-2108, nov. 2008 . Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S010384782008000800002&lng=pt&nrm=iso>. Acesso em: 25 nov. 2008. doi:
10.1590/S0103-84782008000800002.
9.5. Resumos:
RIZZARDI, M.A.; MILGIORANÇA, M.E. Avaliação de cultivares do ensaio nacional
de girassol, Passo Fundo, RS, 1991/92. In: JORNADA DE PESQUISA DA UFSM, 1.,
1992, Santa Maria, RS. Anais... Santa Maria : Pró-reitoria de Pós-graduação e
Pesquisa, 1992. V.1. 420p. p.236.
9.6. Tese, dissertação:
COSTA, J.M.B. Estudo comparativo de algumas caracterísitcas digestivas entre
bovinos (Charolês) e bubalinos (Jafarabad). 1986. 132f.
Monografia/Dissertação/Tese (Especialização/ Mestrado/Doutorado em Zootecnia) Curso de Pós-graduação em Zootecnia, Universidade Federal de Santa Maria.
9.7. Boletim:
ROGIK, F.A. Indústria da lactose. São Paulo : Departamento de Produção Animal,
1942. 20p. (Boletim Técnico, 20).
9.8. Informação verbal:
Identificada no próprio texto logo após a informação, através da expressão entre
parênteses. Exemplo: ... são achados descritos por Vieira (1991 - Informe verbal).
Ao final do texto, antes das Referências Bibliográficas, citar o endereço completo do
autor (incluir E-mail), e/ou local, evento, data e tipo de apresentação na qual foi
emitida a informação.
9.9. Documentos eletrônicos:
MATERA, J.M. Afecções cirúrgicas da coluna vertebral: análise sobre as
possibilidades do tratamento cirúrgico. São Paulo : Departamento de Cirurgia,
FMVZ-USP, 1997. 1 CD.
GRIFON, D.M. Artroscopic diagnosis of elbow displasia. In: WORLD SMALL ANIMAL
VETERINARY CONGRESS, 31., 2006, Prague, Czech
Republic.Proceedings… Prague: WSAVA, 2006. p.630-636. Acessado em 12 fev.
2007. Online. Disponível em:
http://www.ivis.org/proceedings/wsava/2006/lecture22/Griffon1.pdf?LA=1
UFRGS. Transgênicos. Zero Hora Digital, Porto Alegre, 23 mar. 2000. Especiais.
Acessado em 23 mar. 2000. Online. Disponível em:
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ONGPHIPHADHANAKUL, B. Prevention of postmenopausal bone loss by low and
conventional doses of calcitriol or conjugated equine estrogen.Maturitas, (Ireland),
v.34, n.2, p.179-184, Feb 15, 2000. Obtido via base de dados MEDLINE. 1994-2000.
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Acessado em 23 mar. 2000. Online. Disponível em: http://www.
Medscape.com/server-java/MedlineSearchForm
MARCHIONATTI, A.; PIPPI, N.L. Análise comparativa entre duas técnicas de
recuperação de úlcera de córnea não infectada em nível de estroma médio. In:
SEMINARIO LATINOAMERICANO DE CIRURGIA VETERINÁRIA, 3., 1997,
Corrientes, Argentina. Anais... Corrientes : Facultad de Ciencias Veterinarias UNNE, 1997. Disquete. 1 disquete de 31/2. Para uso em PC.
10. Desenhos, gráficos e fotografias serão denominados figuras e terão o número de
ordem em algarismos arábicos. A revista não usa a denominação quadro. As figuras
devem ser disponibilizadas individualmente por página. Os desenhos figuras e
gráficos (com largura de no máximo 16cm) devem ser feitos em editor gráfico
sempre em qualidade máxima com pelo menos 300 dpi em extensão .tiff. As tabelas
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não devem exceder uma lauda.
11. Os conceitos e afirmações contidos nos artigos serão de inteira responsabilidade
do(s) autor(es).
12. Será obrigatório o cadastro de todos autores nos metadados de submissão. O
artigo não tramitará enquanto o referido item não for atendido. Excepcionalmente,
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utilizado.
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14. Os artigos serão publicados em ordem de aprovação.
15. Os artigos não aprovados serão arquivados havendo, no entanto, o
encaminhamento de uma justificativa pelo indeferimento.
16. Em caso de dúvida, consultar artigos de fascículos já publicados antes de dirigirse à Comissão
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