universidade federal fluminense

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE NOROVÍRUS EM CASOS
DE GASTROENTERITE AGUDA OCORRIDOS NA REGIÃO DO MÉDIO
PARAÍBA, ESTADO DO RIO DE JANEIRO, 2005.
Mônica Simões Rocha Ferreira
Niterói
2007
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
CENTRO DE CIÊNCIAS MÉDICAS
FACULDADE DE MEDICINA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS MÉDICAS
Mônica Simões Rocha Ferreira
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE NOROVÍRUS EM CASOS DE
GASTROENTERITE AGUDA OCORRIDOS NA REGIÃO DO MÉDIO PARAÍBA,
ESTADO DO RIO DE JANEIRO, 2005.
Dissertação apresentada à Coordenação do
Programa de Pós Graduação em Ciências
Médicas da Universidade Federal Fluminense,
como parte dos requisitos para obtenção do título
de Mestre em Ciências Médicas - área de
concentração: Ciências Médicas.
Orientadores:
Dra. Solange Artimos Oliveira
Dra. Marize Pereira Miagostovich
Niterói
2007
II
Mônica Simões Rocha Ferreira
DETECÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE NOROVÍRUS EM CASOS DE
GASTROENTERITE AGUDA OCORRIDOS NA REGIÃO DO MÉDIO PARAÍBA,
ESTADO DO RIO DE JANEIRO, 2005.
Orientadores:
Dra. Solange Artimos Oliveira
Dra. Marize Pereira Miagostovich
Aprovada em: 31 de Outubro de 2007.
Examinadores:
Prof. Dr. Sérgio Setúbal - Presidente
Prof. Dra. Liliana Cruz Spano
Prof. Dra. Flavia Barreto dos Santos
Membros Suplentes:
Prof. Dra. Caroline Corediro Soares
Prof. Dra. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia
Niterói
2007
III
Este trabalho foi realizado no Laboratório de
Virologia Comparada do Departamento de Virologia do
Instituto Oswaldo Cruz – Fundação Oswaldo Cruz e na
Universidade Federal Fluminense sob orientação da
Dra Solange Artimos de Oliveira e Dra Marize
Pereira Miagostovich.
IV
Às minhas filhas.
Sabor da minha vida, amor incondicional.
V
“Ninguém ignora tudo. Ninguém sabe tudo. Todos nós sabemos alguma coisa.
Todos nós ignoramos alguma coisa. Por isso aprendemos sempre.”
Paulo Freire
VI
AGRADECIMENTOS
À Coordenação e aos professores ao Programa de Pós-Graduação em Ciências
Médicas - UFF.
À Coordenação Nacional de Laboratórios e ao Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz
pelo suporte financeiro deste trabalho.
Às Secretarias Municipais de Saúde dos Municípios da Região do Médio Paraíba,
pelo envio das amostras.
Ao “American Fellows Program”, pelo treinamento da Dra. Marize Pereira
Miagostovich no diagnóstico molecular de norovirus realizado no “Centers for Disease
Control and Prevention”.
À Dra. Solange Artimos de Oliveira, por aceitar a orientação deste trabalho, sempre
tão delicada, com palavras de incentivo e apoio no decorrer deste projeto.
À Dra. Marize Pereira Miagostovich, pela co-orientação, por me fazer acreditar na
realização deste trabalho com incentivo e motivação, por seu apoio e carinho que foram
indispensáveis para que pudesse trilhar esse caminho. E, finalmente, pela orientação com
críticas e conselhos fundamentais a realização deste projeto estando sempre disponível e
disposta a ajudar, mesmo de longe.
Ao Dr. José Paulo Gagliardi Leite, uma amizade de muitos anos, exemplo de
seriedade e comprometimento com a instituição, obrigada pela contribuição na finalização
deste projeto.
À Silvana Augusta Rodrigues Portes minha grande amiga irmã, comadre de ontem,
hoje e sempre, com quem sempre pude contar nos piores e melhores momentos da minha
vida. E a todos seus familiares que também são como minha família.
VII
Aos Drs. Sérgio Setúbal pela revisão e críticas construtivas, Dra. Flávia Barreto dos
Santos, Dra. Liliane Cruz Spano, Dra. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia e Dra.
Caroline Soares Cordeiro por aceitarem participar da banca examinadora desta dissertação.
Aos colegas do Laboratório de Virologia Comparada:
A cada um eu dedico um espaço especial, pois a convivência nos traz um aprendizado
único, com cada um aprendi um pouco mais da vida.
Alexandre Fialho, a convivência nos proporcionou respeitar as diferenças.
Ana Maria Pinto, cara amiga sempre alegre e pronta para ajudar.
Carmen Baur, pessoa especial sempre prestativa, que tive o prazer de orientar.
Edson Pereira, amigo de todas as horas e excelente dançarino.
Eduardo Volotão, que a pouco chegou, e já nos conquistou com sua amizade.
Fabiana Fioretti, determinada, sabe o que quer.
Flávia Guimarães, sempre um bom papo.
Francisca dos Santos, pessoa iluminada que mora no meu coração.
Gilmar Alcântara, para quem está sempre tudo certo.
Irene Araújo, amiga de muitos anos, um carinho especial.
Joeler Vargas, um bom amigo que cuida da nossa saúde.
Juliana Bragazzi, obrigada pela leitura do texto das críticas e sugestões.
Marcelle Silva, amiga, dedicada e sempre pronta para o trabalho.
Maria da Penha Xavier, minha amiga nessa e em outras empreitadas da vida,
irmã, a quem agradeço especialmente pelo incentivo e apoio em todo processo.
Marilda Almeida, por seu trabalho sempre impecável.
Matías Victória, esse estrangeiro que a todos conquistou amigo sensível e
colaborador, saudades. Agradeço em especial por ter atuado diretamente nesse trabalho.
Rosane Maria Assis, sempre presente nos desabafos ”laboratoriais.”
VIII
Tulio Fumian, sempre de bom humor, pessoa de convivência fácil, a quem agradeço
de forma especial pela dedicação e atuação efetiva nesse trabalho.
Aos colegas que recentemente ingressaram no laboratório, Patrícia Estrada, Julia
Fioretti, Ludmila Rocha, Marcos Lima, Fernando López, Mariela Martinez. Que sejam bem
vindos ao nosso grupo fraterno.
Aos amigos que não compartilham mais nosso dia a dia, a minha comadre Celi
Moreira, Cristiane Monteiro, Liliane Spano, Alex Pina, Marcos Barreiros, Nieli Costa,
Andréa Marques, Vera Rocha, Joana D`arc, Marcos Brian pelos bons momentos
compartilhados.
Aos Colegas do Departamento de Virologia - Fiocruz, pela convivência de tantos
anos o meu respeito e carinho.
Ao meu marido Nivaldo, meu irmão, meus primos, tios, afilhados e amigos fora
da esfera científica cada um deles com uma parcela de contribuição no decorrer deste
trabalho com uma palavra, uma conversa, um sorriso.
E finalmente a Deus pela vida e aos meus pais, por minha formação profissional e
emocional, a base de tudo.
IX
SUMÁRIO
SUMÁRIO............................................................................................................................................................IX
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ........................................................................................................XI
LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................................................XIV
LISTA DE QUADROS ..................................................................................................................................... XV
LISTA DE TABELAS......................................................................................................................................XVI
LISTA DE FLUXOGRAMA E GRÁFICO....................................................................................................XVI
RESUMO ........................................................................................................................................................ XVII
ABSTRACT ...................................................................................................................................................XVIII
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................................ 19
1.1 HISTÓRICO ................................................................................................................................................. 19
1.2 CLASSIFICAÇÃO ......................................................................................................................................... 21
1.3 MORFOLOGIA E GENOMA VIRAL ............................................................................................................... 23
1.4 CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS ....................................................................................................... 24
1.5 PATOGÊNESE E MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS.............................................................................................. 26
1.6 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL .................................................................................................................. 27
1.7 EPIDEMIOLOGIA E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA ....................................................................................... 29
1.8 PREVENÇÃO E CONTROLE .......................................................................................................................... 32
2 RELEVÂNCIA DO ESTUDO......................................................................................................................... 33
3 OBJETIVOS ..................................................................................................................................................... 35
3.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................................................................... 35
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................................................... 35
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................................. 36
4.1 MATERIAL .................................................................................................................................................. 36
4.1.1 Espécimes clínicos ............................................................................................................................. 36
4.1.2 Amostras controle ............................................................................................................................. 37
4.1.3 Comitê de ética .................................................................................................................................. 38
4.1.4 Oligonucleotídeos .............................................................................................................................. 38
4.2 SOLUÇÕES............................................................................................................................................... 40
4.2.1 Tampão TRIS/HCl/Ca++ 0,01M pH 7,2 ......................................................................................... 40
4.2.2 Sílica ................................................................................................................................................... 40
4.2.3 EDTA 0,2M pH 8,0 ........................................................................................................................... 41
4.2.4 Tris-HCl 0,1M pH 6,4 ....................................................................................................................... 41
4.2.5 Tampão L6......................................................................................................................................... 41
4.2.6 Tampão L2......................................................................................................................................... 42
4.2.7 Tampão tris-boro-EDTA 10X pH 8,4 (TBE) .................................................................................. 42
4.2.8 Gel de agarose a 1,5%....................................................................................................................... 42
4.2.9 Solução de brometo de etídio ........................................................................................................... 43
4.2.10 Etanol 75% ...................................................................................................................................... 43
4.3 MÉTODOS ................................................................................................................................................ 44
4.3.1 Fluxograma da rotina do laboratório e deste estudo. .................................................................... 44
4.3.2 Preparo da suspensão fecal .............................................................................................................. 45
4.3.3 Extração do genoma viral................................................................................................................. 45
4.3.4 Reação de transcrição reversa (RT) ................................................................................................ 46
X
4.3.5 Reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção do norovírus (região B)...................... 47
4.3.6 Determinação dos genótipos de norovírus pela reação em cadeia pela polimerase (PCR - região
D) ................................................................................................................................................................. 48
4.3.7 Análise do produto da reação em cadeia pela polimerase ............................................................. 49
4.3.8 Purificação do amplicon obtido ....................................................................................................... 49
4.3.9 Reação de seqüênciamento e purificação da reação....................................................................... 50
4.3.10 Análise filogenética das seqüências da região D ........................................................................... 50
4.3.11 Reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qPCR) ......................................................... 51
5 RESULTADOS................................................................................................................................................. 53
5.1 INVESTIGAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA ............................................................................................................. 53
5.2 INVESTIGAÇÃO LABORATORIAL E IDENTIFICAÇÃO DO AGENTE ETIOLÓGICO ......................................... 54
5.3 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS NOROVÍRUS .................................................................................... 56
5.4 QUANTIFICAÇÃO DE NOROVÍRUS PELA REAÇÃO EM CADEIA PELA POLIMERASE EM TEMPO REAL
(QPCR)............................................................................................................................................................. 59
5.5 DISTRIBUIÇÃO DOS CASOS DE ACORDO COM A IDADE E AS MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS .......................... 60
6 DISCUSSÃO ..................................................................................................................................................... 62
7 CONCLUSÕES ................................................................................................................................................ 68
8 PERSPECTIVAS.............................................................................................................................................. 70
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................................................ 71
10 ANEXOS ......................................................................................................................................................... 86
ANEXO 1- FICHA DE INFORMAÇÕES CLÍNICAS E EPIDEMIOLÓGICAS......................................... 86
ANEXO 2 - EMAIL DE ACEITE DO TRABALHO CIENTÍFICO. ............................................................. 87
ANEXO 3 - PDF DO ARTIGO CIENTÍFICO ................................................................................................. 88
XI
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
A – adenina
Å – angstron
A260 – absorbância a 260 nm
aa – aminoácido
AdV – adenovírus
C – citosina
CA – Califórnia
CaCl2 – cloreto de cálcio
CaCV– calicivírus canino
CDC – “Centers for Disease Control and Prevention”
cDNA – ácido desoxirribonucléico complementar
CEP – Comitê de Ética em Pesquisa
CME – criomicroscopia eletrônica
cm3 – centímetro cúbico
CsCl – cloreto de césio
Ct – ciclo de contenção
Da – dalton
dATP – desoxiadenina
dCTP – desoxicitosina
dGTP – desoxiguanina
DMSO – dimetil sulfóxido
DNA – ácido desoxirribonucléico
dTTP – desoxitimina
dXTP – desoxiribonucleotídeos
EDTA – ácido etilenodiamino tetracético
EGPA – eletroforese em gel de poliacrilamida
XII
EIARA – ensaio imunoenzimático para detecção de antígenos de rotavírus e adenovírus
EIE – ensaio imunoenzimático
EUA – Estados Unidos da América
FeCV– calicivírus felino
Fiocruz – Fundação Instituto Oswaldo Cruz
G – genogrupo
g – grama
G – guanina
GG – grupo genético ou genótipo
HAstV – astrovírus humanos
HCl – ácido clorídrico
HMSN – Hospital Municipal Salles Neto
HuCV – calicivírus humanos
ICTV – Comitê Internacional de Taxonomia Viral
Ig – imunoglobulina
IME – imunomicroscopia eletrônica
kb – quilo bases
kDa – quilodalton
LVC-LRRR – Laboratório de Virologia Comparada-Laboratório de Referência Regional para
Rotaviroses
M – Molar
ME – microscopia eletrônica
mg – miligrama
MgCl2 – cloreto de magnésio
mL – mililitro
mM – milimolar
mm3 – milímetros cúbicos
N – Normal
NaOH – hidróxido de sódio
ng – nanograma
NLV – “norwalk like-vírus”
nm – nanômetro
NoV / NoVs – norovírus
nt – nucleotídeo
XIII
NTPase – proteína nucleosídeo trifosfatase
NVCP – proteína do capsídeo de norovírus
ORF – “open reading frame” - fase aberta de leitura
PA – pró-análise
pb – pares de bases
pH – concentração de íons hidrogênio livre
qPCR – reação em cadeia pela polimerase (PCR) quantitativo em tempo real
q.s.p. – quantidade suficiente para
RJ – Rio de Janeiro
RNA – ácido ribonucléico
RNAm – ácido ribonucléico mensageiro
RpRd – RNA polimerase RNA dependente
RT – reação de transcrição reversa
PCR – reação em cadeia pela polimerase
RT-PCR – reação em cadeia pela polimerase precedida de transcrição reversa
RV - A – rotavírus humano grupo A
rVLPs – “partículas virus-like recombinante”
SLV – “sapporo- like vírus”
SRSV – “small round structured virus“
T – timina
TBE – Tris Borato Edta
Tris – hidroximetil-tris-aminometano
U – unidades
UTR – “untranslated region” - região não traduzida
VLP – “virus like-particles” - partículas tipo-vírus
VPA – vírus pequenos e arredondados
VPg – “virus protein genome” - proteína viral associada ao genoma
µL – microlitro
µM – micromolar
o
C – graus centígrados
3D – três dimensões
XIV
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Árvore filogenética do gênero Norovirus.
22
Figura 2. Morfologia dos norovírus.
23
Figura 3. Organização do genoma dos Norovirus.
24
Figura 4. Vias de transmissão dos norovírus.
29
Figure 5. Mapa da Região do Médio Paraíba, Estado do Rio de Janeiro.
37
Figura 6. Eletroforese em gel de agarose a 1,5% dos produtos amplificados pela PCR da
região B para detecção de norovírus.
55
Figura 7. Eletroforese em gel de agarose a 1,5% dos produtos amplificados pela PCR da
região D para caraterização de norovírus.
56
Figura 8. Árvore filogenética obtida a partir da análise de 56 aminoácidos da região pertencente ao
capsideo dos norovírus.
58
XV
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Características dos iniciadores e sonda utilizados neste estudo para detecção,
seqüenciamento e quantificação dos norovírus.
39
Quadro 2. Reagentes utilizados na reação da transcrição reversa para a obtenção do cDNA a
partir do RNA viral extraído.
46
Quadro 3. Reagentes utilizados na reação em cadeia da polimerase para amplificação da
região B do norovírus.
47
Quadro 4. Reagentes utilizados na reação em cadeia pela polimerase para amplificação da
região D do norovírus.
49
Quadro 5. Reagentes utilizados na reação de seqüenciamento.
50
Quadro 6. Reagentes utilizados na reação de PCR em tempo real (qPCR).
52
XVI
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Distribuição das amostras estudadas para os NoVs pela reação em cadeia pela
polimerase (região B) de acordo com os bairros e municípios da região do Médio Paraíba,
estado do Rio de Janeiro, 2005.
55
Tabela 2: Matriz identidade (em vermelho aminoácidos e em preto nucleótideos) obtida a
partir do alinhamento das seqüências do estudo, juntamente com as amostras do município de
Carmo, amostra do Hospital Municipal Sales Neto-RJ (HMSN) e o protótipo GII.4 ("Bristol
virus").
57
Tabela 3: Detecção quantitativa de Norovírus utilizando a técnica de reação em cadeia pela
polimerase em tempo real (qPCR), o número de dias com diarréia dos casos com
gastroenterite aguda positivos e o número de cópias por grama de fezes.
59
Tabela 4: Manifestações clínicas apresentadas em 39 casos que relataram outros sintomas
além da diarréia de acordo com o grupo etário e o resultado da RT-PCR para norovírus.
61
LISTA DE FLUXOGRAMA E GRÁFICO
Fluxograma 1. Fluxograma da rotina laboratorial e das etapas do estudo.
44
Gráfico 1. Distribuição dos casos estudados de acordo com o grupo etário.
60
XVII
RESUMO
Em março de 2005, o Serviço de Epidemiologia do município de Resende, no estado do Rio
de Janeiro, relatou a ocorrência de casos agudos de gastroenterite em crianças pertencentes a
uma creche do município. A investigação epidemiológica realizada demonstrou que os
familiares das crianças também foram afetados. Entre os meses de maio e junho, outros dois
municípios, Piraí e Rio Claro, localizados no vale do Médio Paraíba, notificaram surto ou
casos esporádicos de gastroenterite aguda. Um total de 50 amostras fecais foram coletadas
entre março a junho de 2005 dos três municípios. As amostras fecais foram submetidas à
investigação bacteriana e parasitológica e foram negativas. Iniciamos a investigação dos
possíveis vírus envolvidos naqueles surtos e nos casos esporádicos de gastroenterite aguda.
Foram utilizados os métodos de eletroforese em gel de poliacrilamida para detecção de
rotavírus, ensaio imunoenzimático para detecção de adenovírus e rotavírus e a reação em
cadeia pela polimerase precedida de transcrição reversa (RT-PCR) para investigar a presença
de norovírus e astrovírus. Foi realizada ainda a reação em cadeia pela polimerase em tempo
real -“TaqMan” (qPCR) para detectar, quantificar e comparar os resultados com aqueles
obtidos com a RT-PCR convencional. O norovírus foi detectado em 33 das 50 amostras
(66%) por ambos os métodos demostrando concordância de 100%. A análise parcial da
seqüência do genoma que codifica para a proteína do capsídeo viral demonstrou que a
amostra circulante pertencia ao genótipo GII.4. Os resultados deste estudo destacam o papel
da infecção pelo norovírus em crianças e adultos em surtos bem como em casos esporádicos
de gastroenterite aguda.
XVIII
ABSTRACT
In March 2005, the Epidemiological Surveillance Service of Resende, municipality of
the Middle Paraiba Valley, State of Rio de Janeiro, reported a sudden spontaneous occurrence
of acute gastroenteritis cases in children in a public day care center. The follow investigation
showed that children’s relative were also affected. From May to June, two other
municipalities, Piraí and Rio Claro, also localized in the Middle Paraiba Valley, reported
gastroenteritis outbreaks or sporadic cases. A total of 50 fecal samples were collected from
March to June 2005. Since bacterial and parasitic investigations were negative in those
samples, we performed virus investigation in those outbreaks and sporadic cases of acute
gastroenteritis. Polyacrylamide gel electrophoresis for rotaviruses, enzyme immunoassay for
adenovirus and rotavirus, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) were
performed to investigate the presence of noroviruses (NoV) and astroviruses. Also, a
quantitative TaqMan real time PCR for NoV was performed to detect, quantified samples and
to compare these results with those obtained by conventional RT-PCR. NoV was detected in
33 out of 50 (66%) samples showing an agreement of 100% between both methodologies.
Partial nucleotide sequence analysis of the genome sequence for the capsid showed that the
circulating strain belonged to genogroup II and genotype 4. The results highlight the role of
NoV infection in children and adults in outbreaks as well as in sporadic cases of acute
gastroenteritis.
19
1 INTRODUÇÃO
1.1 Histórico
Os primeiros casos descritos de infecção por norovírus (NoV) datam provavelmente
da década de 30, quando a expressão “winter vomiting disease” foi introduzido por Zahorsky
(1929), ao descrever uma doença altamente infecciosa cujas características clínicas
predominantes eram vômito, dores abdominais e diarréia. Relatos subseqüentes de surtos com
as mesmas características foram descritos por diversos pesquisadores (Reimann et al., 1945 a,
b; Clark et al., 1972).
Durante as décadas de 40 e 50 os vírus já eram considerados agentes etiológicos da
gastroenterite aguda, embora o envolvimento destes nas infecções fosse estabelecido apenas
por exclusão (Gordon et al., 1947, 1956; Jordan et al., 1953).
Em 1968, um surto de “winter vomiting disease” ocorreu entre estudantes e
professores de uma escola elementar em Norwalk, Ohio, nos Estados Unidos (Adler e Zickl.,
1969). No período de dois dias, 50% (116/232) dos estudantes e professores apresentaram um
quadro de gastroenterite aguda, seguido por uma taxa de 32% de infecções secundárias em
conseqüência dos contatos. As manifestações clínicas mais freqüentes foram vômito/náusea
(90%) e diarréia (38%), e o período de incubação de aproximadamente 48 horas. Na ocasião,
estudos laboratoriais não evidenciaram o agente etiológico deste surto. Entretanto, na década
de 70, estudos com voluntários foram realizados com o objetivo de identificar o agente
etiológico desta doença. Amostras de fezes oriundas do surto primário e secundário de Ohio
(Dolin et al., 1971, 1972), assim como amostras de três surtos ocorridos em Guildford, no
20
Reino Unido (Clark et al., 1972) foram utilizadas, sem sucesso, na tentativa de propagar o
agente em cultivo celular e em animais de laboratório (Wyatt et al., 1978). Somente o surto de
Norwalk induziu a doença em dois dos três voluntários que foram inoculados. No mesmo
período, Kapikian et al.(1972) utilizando imuno microscopia eletrônica (IME) identificaram, a
partir de filtrado de fezes provenientes do surto de Ohio, agregados de partículas “virus-like”,
partículas semelhantes aos picornavírus e parvovírus denominadas de vírus “parvovirus-like”
(Kapikian et al., 1973). O desenvolvimento de anticorpos tanto em condições naturais como
em condições experimentais, juntamente com outras evidências, identificaram o vírus
Norwalk como agente etiológico do surto de Ohio, sendo o primeiro vírus descrito como
causador da gastroenterite aguda. Posteriormente, o diagnóstico de quadros de gastroenterite
viral aguda pela microscopia eletrônica (ME) resultou na descrição de dois grupos
morfológicos: com e sem característica definida, os calicivírus clássicos representados pelo
vírus Sapporo e os SRSV, representado pelo vírus Norwalk. Os “Norwalk-like virus” vírus
pequeno, não cultiváveis e associados a casos de gastroenterite aguda, antigenicamente
distintos, cujo protótipo é o vírus do surto de Norwalk (NLV) foram classificados como
pertencentes família Picornaviridade. O termo “small round structured viruses” (SRSV)
descrito até então deixou de ser utilizado depois da clonagem e sequenciamento, quando esses
vírus foram alocados na família Caliciviridae como gênero “Norwalk-like virus” (CDC,
2001).
Greenberg et al. (1981), observaram a presença de uma proteína estrutural de 59Da
(Dalton), e assim propuseram que os Norwalk passassem a constituir a família Caliciviridae,
considerando as orientações propostas pelo III Comitê Internacional de Taxonomia de Vírus
(ICTV), isto é: os vírus pertencentes a esta família teriam como características comuns
presença de uma proteína estrutural principal, que dá origem ao capsídeo; simetria icosaédrica
21
e a apresentação de 90 capsômeros formando 32 depressões que mostram a imagem de cálice
(calix, em latim), forma que deu origem ao nome da família (Green et al., 2000).
Madeley e Cosgrove (1976) descreveram pela primeira vez em humanos a presença de
calicivírus típicos em amostras de fezes de 10 crianças. Como em algumas crianças a infecção
era assintomática, não houve conclusão quanto à patogenia destes vírus. Nesse mesmo ano,
Flewett e Davies (1976) identificaram partículas de calicivírus típicos em biópsia de intestino
proveniente de um caso de gastroenterite fatal. Entretanto, a detecção simultânea de
adenovírus (AdV) no mesmo material não permitiu a determinação do agente causador da
doença.
Durante muitos anos, o papel dos calicivírus humanos (HuCV) em casos de
gastroenterite aguda teve seu reconhecimento comprometido pela indisponibilidade de
métodos diagnósticos capazes de detectar esses agentes. Entretanto, a partir da década de 90,
com a utilização de métodos moleculares, estes vírus foram definitivamente associados com
surtos de gastroenterites, sendo atualmente considerados, após os rotavírus, como os mais
importantes agentes etiológicos de casos de gastroenterite aguda, principalmente em surtos
onde o modo de transmissão é resultado da ingestão de água ou alimentos contaminados
(Glass et al., 2000).
1.2 Classificação
Em 2005, o gênero NLV foi renomeado como Norovirus pelo ICTV (Comitê
Internacional de Taxonomia Viral), tendo como espécie protótipo o vírus Norwalk. Os vírus
pertencentes a este gênero são denominados de acordo com o local onde foram inicialmente
detectados, tais como: Hawaii, Snow Mountain, Sapporo, Southampton, Tauton, Toronto,
Mexico entre outros (Em: ICVTdb: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb Acesso em: 26/05/2005; Green
et al., 2000).
22
O gênero Norovirus está dividido em cinco genogrupos (GI-GV), baseado na análise
da seqüência de aminoácidos (aa) da região que codifica o capsídeo viral (Figura 1). Os GI, II
e IV são constituídos de vírus de origem humana, com a exceção do GII/11 que é de origem
suína (Figura 1). Os genogrupos(G) são constituídos de grupos genéticos ou genótipos (GG),
que representam a unidade mínima de classificação dos NoVs. A classificação para os GG
consiste em agrupar por similaridade de nucleotídeos (nt) e aa os vírus em um determinado
ramo de uma árvore filogenética (Ando et al., 2000; Zheng et al., 2006), sendo que dois vírus
serão considerados como pertencentes a diferentes G se a distância entre as amostras, medido
pelo método de distância sem correção for ≥ 45%. E quando apresentam distância ≥ 14,3% ≤
43,8% são agrupadas em diferentes GG (Zheng et al., 2006).
Figura 1: Árvore filogenética do gênero Norovirus.
Fonte: adaptado de Zheng et al., (2006).
Árvore filogenética do gênero norovirus baseada na seqüência completa de aminoácidos do capsídeo
viral. A árvore contém os cinco genogrupos (G) e seus respectivos grupos genéticos ou genótipos
(GG), indicados nas caixas.
23
1.3 Morfologia e genoma viral
O vírion de 26 a 37nm de diâmetro, não envelopado, é composto de uma proteína de
capsídeo que apresenta 90 capsômeros na superfície dispostas em simetria icosaédrica (Figura
2). A proteína do capsídeo VP1 é composta de 180 moléculas organizadas em 90 dímeros, que
formam dois domínios: S e P. O domínio S forma a parte interna do capsídeo que envolve o
genoma do RNA (ssRNA) e o domínio P é subdividido em dois domínios: P1 e P2. Estes
domínios assumem uma forma semelhante a um cálice quando visualizados pela ME (Prasad
et al., 1999; Wilhelmi et al., 2003; Cardoso e Borges et al., 2005).
Figura 2. Morfologia dos norovírus.
B
C
A
D
Fonte: Adaptado de Prasad et al. (1999) e Cornelia Buchen-Osmond Em: ICTVdB
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb Acesso em: 25 de março de 2006.
A: Microscopia Eletrônica de partículas de vírus Norwalk vírus em filtrado de fezes - Barra 100
nanômetro, por C Büchen-Osmond; B: Reconstrução da imagem do Norwalk – Criomicrografia
eletrônica, e C: Reconstrução da proteína do capsídeo por Dr. B.V.Venkataram Prasad's; D:
Micrografia eletrônica de calicivírus inespecífico - Barra 100 nanômetro, por C Büchen-Osmond.
O genoma do NoV é constituído por um RNA de fita simples, polaridade positiva, 7,7
kb, que contém três fases abertas de leitura (ORFs), uma região não traduzida (UTR), tanto no
extremo 3’ quanto no extremo 5’ e uma cauda poli (A) 3' (Figura 3). Apresentam RNA
subgenômico de 2,3 kb, UTR no extremo 3’e outra no extremo 5’ (Bertolotti-Ciarlet et al.,
24
2003). A ORF1 representa 60% do genoma viral e codifica para uma poliproteína precursora
(193kDa) de proteínas não estruturais, incluindo a RNA polimerase RNA dependente (RpRd)
(Jiang et al., 1993). A ORF2 codifica a proteína VP1 que compõe o capsídeo viral (58kDa) e a
ORF3 codifica um polipeptídio VP2 (22kDa) que parece ter função estrutural (Hardy, 2005;
Vinjé et al., 2004).
Figura 3. Organização do genoma dos Norovirus.
ORF1
ORF2
ORF3
RNA sub genômico
Fonte: Adaptado de Hardy (2005).
p48: Proteína p48; NTPase: Proteína Nucleosídeo Trifosfatase; p22: Proteína p22; VPg: Proteína de
União ao Genoma; 3CLpro: Protease; RdRp: RNA Polimerase RNA dependente; VP1: Proteína
Principal do Capsídeo; VP2: Proteína Menor do Capsídeo. Círculo Verde: VPg; (A)n: Cauda Poli (A).
1.4 Características físico-químicas
Os NoVs têm capacidade de flutuação em cloreto de césio de 1,33 a 1,41g/cm3 e são
resistentes à inativação com cloro 3,75 a 6,25mg/L (cloro residual livre de 0,5 a 1,0mg/L),
que é a concentração usada em sistemas de tratamento e distribuição de águas. Os NoVs são
mais resistentes à inativação com o cloro do que o poliovírus tipo1 humano, os rotavírus
25
humanos (cepa Wa) e símio (cepa SA11) e os bacteriófagos F2 (Keswick et al., 1985), sendo
inativados quando o sistema de água é tratado com 10mg/L de cloro (Green et al., 2001;
Duizer et al., 2004).
Os calicivírus permanecem infecciosos após aquecimento a uma temperatura de 60°C
por 30 minutos, quando em filtrado de fezes com pH 2,7 e mantido em uma temperatura de
22-25°C por três horas, e após tratamento com éter 20% por 18 horas a 4°C (Dolin et al.,
1972). Doultree et al.(1999) relataram que os calicivírus felinos (FeCV) mantêm
infecciosidade após 20 dias sob superfície de vidro mantido a uma temperatura de 22-25°C.
Os calicivírus parecem ter longa persistência, não perdendo sua infecciosidade em diferentes
superfícies (Cheesbrough et al., 1997; D´Souza et al., 2006). Segundo D’Souza et al. (2006),
o material orgânico presente na suspensão fecal parece proteger contra a inativação do vírus.
Os NoVs são considerados resistentes a pH ácido, já que permanecem infecciosos após a
passagem pelo estômago, como outros vírus entéricos quando submetidos a pH baixo e a altas
concentrações de bílis, como os poliovírus, o vírus da hepatite A e os rotavírus (Dolin et al.,
1972; Caul 1996).
A inativação utilizando radiação ultravioleta é dose dependente para os calicivírus
canino (CaCV) e FeCV (Duizer et al., 2004; Thruston-Enriquez et al., 2003). Os NoVs se
mostraram sensíveis à temperatura de pasteurização regular (de 62ºC por 30 minutos), e à
temperatura de pasteurização clássica (70°C por 2 minutos) (Duizer et al., 2004). A grande
estabilidade dos NoVs, que permanecem estáveis em água clorada, pH ácido, viáveis após
congelamento, aquecimento a 60°C e a pasteurização regular indica a importância da rota de
transmissão da infecção envolvendo o preparo de comidas, bebidas e águas recreacionais
(Ponka et al., 1999; Hoebe et al., 2004; Koopmans e Duizer, 2004; Widdowson et al., 2005).
26
1.5 Patogênese e Manifestações clínicas
Os NoVs são estáveis em ambientes ácidos, atravessam o estômago e sua replicação
ocorre no intestino delgado, onde ocorre a infecção primária. A mucosa inflama e as células
epiteliais absortivas envolvidas apresentam aparência anormal, há expansão dos vilos e
encurtamento dos microvilos, provocando lesões na mucosa, resultando na indução da
diarréia. Após duas semanas, o intestino delgado retorna à sua aparência histológica normal.
As náuseas e os vômitos resultam da transitória gastroparesia que se resolve com o término da
infecção viral (Lopman et al., 2002). Indivíduos incapazes de manter uma hidratação (crianças
menores de 5 anos e idosos) podem apresentar desidratação grave, resultando em distúrbios
eletrolíticos e hospitalização. As infecções são auto limitadas e a maioria dos pacientes se
recupera sem seqüelas, entretanto, óbitos podem ocorrer em pacientes com desidratação grave
e subnutrição (Wilhelmi et al., 2003; Thornton et al., 2004).
Os NoVs causam gastroenterite aguda de intensidade variável, caracterizada por
diarréia, vômitos, náuseas, mal-estar, dores abdominais e musculares, dores de cabeça,
anorexia e febre moderada (Thornton et al., 2004; Bull et al., 2006). O período de incubação
varia de 10 a 50 horas (média 24 horas) e os vírus podem ser eliminados por até 22 dias. Em
surtos, este período varia de 4 a 77 horas após a exposição ao vírus, podendo resultar em altas
taxas de transmissão e grandes surtos (Dolin et al., 1971, 1972; Wyatt et al., 1974; Blacklow
et al., 1979; Steinhoff et al., 1980; Kaplan et al., 1982; Rockx et al., 2002; Clark e
McKendrick, 2004; Thornton et al., 2004).
Geralmente, a principal característica da doença em adultos é a diarréia, enquanto que
em crianças, é o vômito, sendo este sintoma menos freqüente em crianças menores de um ano
de idade (Rockx et al., 2002; Lopman et al., 2004).
27
1.6 Diagnóstico laboratorial
Os NoVs não são propagados em culturas celulares convencionais. Estudos utilizando
a técnica de “microcarriers” estão sendo conduzidos demonstrando a infecção e a replicação
do RNA viral dos NoVs em células epiteliais de intestino humano em 3D. Até o momento não
existe modelo animal que possa reproduzir a doença (Kapikian et al., 1996; Glass et al., 2000;
Straub et al., 2007).
A dificuldade em se estabelecer um diagnóstico acessível aos médicos para identificar
a etiologia das gastroenterites causadas pelos NoVs, fizeram com que Kaplan et al.(1982)
criassem uma série de critérios para distinguir os surtos causados por bactérias dos causados
pelos NoVs: vômito em mais de 50% das pessoas afetadas em um surto; período de incubação
entre 24 e 48 horas; duração da doença entre 12 e 60 horas e a não identificação de um agente
bacteriano (Kaplan et al., 1982). Esses critérios foram reavaliados pelos pesquisadores do
“Centers for Disease Control and Prevention”, que concluíram que tais critérios ajudam a
discriminar os surtos de origem alimentar causados pelos NoVs. Entretanto, esses critérios
não devem ser utilizados individualmente, e sim em conjunto e sempre que possível, as a
mostras devem ser enviadas ao laboratório (Turcios et al., 2006).
A ME continua sendo uma ferramenta importante para a investigação dos NoVs. A
partir dos primeiros sintomas, já é possível visualizar partículas virais em amostras de fezes
pela ME (Kapikian, 1994), que detecta 106 partículas por mg de fezes, sendo esta a taxa de
excreção destes vírus em pessoas infectadas. A ausência de partículas com a característica
peculiar dos HuCV (forma de cálice) pode dificultar sua identificação por este método (Caul e
Appelenton, 1982; Doane, 1994; Glass et al., 2000).
A IEM realizada com soros de pacientes convalescentes (Doane, 1994) foi bastante
utilizada para determinar a ocorrência de outros HuCV, porém essa ferramenta é limitada
28
para diagnóstico devido a uma lacuna na definição do anti-soro a ser utilizado (Thornhill et
al., 1977; Dolin et al., 1982; Vial et al., 1990).
Os ensaios imunoenzimáticos (EIE) para detecção de NoV tornaram-se possíveis
quando Jiang et al.(1992b) estabeleceram um sistema para expressão de proteínas do capsídeo
do Norwalk em baculovírus, permitindo tanto a obtenção de antígeno viral como a produção
de soro hiperimune em animais (Jiang et al., 1992b; Lopman et al., 2002). Antígenos
recombinantes têm sido desenvolvidos para detecção de diferentes vírus do gênero Norovirus,
tais como México, Snow Mountain, Hawaii (Atmar e Estes, 2001; Lopman et al., 2002).
Embora os EIEs apresentem baixa sensibilidade devido à grande diversidade genética desses
vírus, é um método aplicável em surtos como teste de triagem. Um teste mais sensível e
específico, como a RT-PCR, deve ser aplicado nas amostras que apresentarem resultado
negativo por EIE (Jiang et al., 2000; Richards et al., 2003; Cardoso e Borges, 2005).
A detecção de NoV pela RT-PCR foi primeiramente descrita por Jiang et al.(1992a) e
De Leon et al.(1992), sendo uma ferramenta de pesquisa utilizada em todo o mundo.
A clonagem e o seqüenciamento dos vírus Norwalk (Jiang et al., 1990) e Southampton
(Lambden et al., 1993) permitiram avanços nos estudos e na determinação da importância
epidemiológica dos NoVs. Com o seqüenciamento completo dos HuCVs (Jiang et al., 1993;
Lambden et al., 1993; Dingle et al., 1995; Lopman et al., 2002) foi possível o
desenvolvimento de diversos iniciadores para serem utilizados nas técnicas de RT-PCR, que é
mais sensível que a ME e é capaz de detectar o vírus até duas semanas após a infecção
(Yamazaki et al., 1996; Parashar et al., 1998; Lopman et al., 2002). Devido à grande
diversidade genética dos NoVs, até o momento não foram descritos iniciadores capazes de
detectar todos os genogrupos em uma única reação. Usualmente, é necessária a utilização de
uma mistura de iniciadores específicos para os diferentes genogrupos (GI, GII, GIV) (Jiang et
al., 2000) ou mesmo de iniciadores que amplifiquem diferentes regiões do genoma como a
29
RpRd (ORF1), a região da junção da ORF 1-ORF2, que são as mais conservadas do genoma
e o capsídeo (ORF2) (De Leon et al., 1992; Ando et al., 1995; Green et al., 1995; Green et al.,
2000; Lopman et al., 2002; Vinjé et al., 2004).
A PCR em tempo real (qPCR) é uma técnica que tem menor risco de contaminação e
pode estimar a concentração viral, além de ser rápida, bastante sensível e especifica. A
detecção é dada por captação de fluorescência permitindo a observação em tempo real do
processo de amplificação do produto da reação. Recentemente, o estabelecimento de um
protocolo de amplificação genômica quantitativo para detecção direta de NoV GI e GII em
espécimes clínicos tem permitido a detecção de NoV em amostras consideradas negativas por
ME e mesmo pela RT-PCR convencional (Kageyama et al., 2003; Trujillo et al., 2006; Vainio
et al., 2006).
1.7 Epidemiologia e distribuição geográfica
O modo de transmissão dos NoVs é predominantemente por via oral, pela ingestão de
água e alimentos contaminados, pelo contato pessoa a pessoa, ou mesmo por aerossóis
produzidos durante o vômito (Figura 4) (Marks et al., 2000; Pang et al., 2000; MorenoEspinosa et al., 2004; Jones et al., 2007).
As infecções por NoV ocorrem, usualmente, em instituições com grandes aglomerados
tais como: orfanatos, escolas, creches, asilos, cruzeiros marítimos, hospitais e quartéis
militares (Ho et al., 1989; Sharp et al., 1995; Monroe et al., 2000; Gallimore et al., 2004;
Goodgame, 2006). Os NoVs infectam indivíduos de todas as idades, o que raramente ocorre
com os outros vírus que causam gastroenterite (Glass et al., 2000). O NoV GII tem sido
descrito como o genogrupo detectado com maior freqüência em todo o mundo (Fankhauser et
al.,1998; Hale et al., 2000; Koopmans, 2001; Lopman et al., 2002).
30
Figura 4. Principais vias de transmissão dos norovírus.
Fonte: Adaptado de Moreno-Espinosa et al.(2004).
Um estudo internacional demonstrou a soroprevalência de anticorpos para HuCV em
todas as idades, encontrando níveis superiores a 70% no Nepal, Bangladesh, Suíça, Equador,
Bélgica e Estados Unidos (Greenberg et al., 1979). Em países onde foi detectada baixa
soroprevalência, como na Itália (Pelosi et al., 1999) e Noruega (Myrmel et al., 1996), foram
encontrados problemas na estratégia dos estudos realizados.
No Brasil foram descritos dois estudos de soroprevalência: Gabbay et al.(1994)
detectaram prevalência de anticorpos para Norwalk de 39% a 100% em oito comunidades
indígenas da Amazônia. Talal et al.(2000) encontraram 71% de soroprevalência para os NoV
em crianças menores de quatro anos de comunidades carentes no estado do Ceará.
Na última década, surtos de NoV foram descritos em diferentes países como Estados
Unidos (Fankhauser et al., 2002), Peru (Parashar et al., 2004), Austrália (Wright et al., 1998),
Chile (O’Ryan et al., 2000), países da Europa e Canadá (Ponka et al., 1999; Rockx et al.,
2002) e em países do continente Asiático (Okitsu-Negishi et al., 2004).
31
No Brasil, são raros os relatos de casos de gastroenterites associados a NoV.
Timenetsky et al.(1993) observaram pela ME a presença de SRSVs em fezes de crianças com
e sem diarréia em São Paulo. O primeiro estudo de prevalência dos NoV no Brasil foi descrito
por Parks et al.(1999), demonstrando a ocorrência 7% de casos de NoV GI e GII em crianças
com e sem diarréia e em crianças hospitalizadas com diarréia persistente.
O primeiro relato brasileiro de surtos de gastroenterite associado ao NoV foi descrito
por Gallimore et al.(2004). Os NoVs foram detectados em três dos quatro surtos de
gastroenterite ocorridos em uma creche na cidade do Rio de Janeiro. O genogrupo GII foi
detectado e sua prevalência variou de 23% a 67% nas amostras estudadas. Castilho et
al.(2006), em um estudo de prevalência e diversidade genética dos NoV envolvendo crianças
menores de três anos atendidas em ambulatórios de diferentes hospitais do estado de São
Paulo, demostraram que os NoVs foram detectados em 36,2% de casos de diarréia aguda, em
26,7% de casos de diarréia persistente e em 36,4% das amostras de fezes de crianças sem
diarréia. O genótipo predominante foi o GII.4. Borges et al.(2006), na região centro-oeste do
Brasil, detectaram 8,6% de calicivírus em amostras coletadas de crianças menores de cinco
anos com diarréia aguda internadas em hospitais públicos. Soares et al.(2007) demonstram
14,5% de NoV em fezes de crianças menores de 10 anos que apresentaram o quadro clínico
de gastroenterite e procuraram atendimento médico em hospitais, serviços de emergência e
ambulatórios da cidade do Rio de Janeiro, no período de janeiro de 1998 a dezembro de 2005,
sendo detectados genogrupos I (48%) e II (52%). Os NoVs GI e GII também foram
detectados na população pediátrica internada em hospitais públicos no Rio de Janeiro com
gastroenterite aguda, sendo o GII responsável por 96% dos casos de infecção por NoV
(Victória et al., 2007).
32
1.8 Prevenção e controle
Atualmente, os NoVs são considerados vírus emergentes pelo "National Institute of
Health" (Monroe et al., 2000), sendo a principal causa de surtos de gastroenterite aguda não
bacteriana transmitidos por água e alimentos contaminados, ocorrendo em diversos países
desenvolvidos ou não, e atingindo todos os grupos etários (Beller et al., 1997, Noel et al.,
1999, Ponka et al., 1999, Daniels et al., 2000; Goodgame, 2006). Estes dados sugerem que
somente a implantação de medidas de saneamento básico, melhoria de condições sanitárias e
de higiene da população não serão suficientes para prevenir esta infecção (Vinjé e Koopmans,
1996; Fankhauser et al., 1998; Wright et al., 1998).
A vacina é um instrumento de prevenção que poderá ser utilizado para reduzir a
morbidade e a mortalidade na população. Contudo, até o momento, não foi possível
estabelecer essa estratégia na prevenção e controle da gastroenterite por NoV.
Vacinas utilizando partículas de “virus-like” recombinantes (rVLPs) defectivas do
capsídeo viral produzidas em baculovírus demostraram ter potencial altamente imunogênico
quando administradas por via parenteral em animais (Green et al., 1993), entretanto com
resposta homotípica. O emprego de vacinas orais, utilizando plantas transgênicas, representa
um novo conceito em vacinas economicamente mais viáveis, está sendo desenvolvido (Tacket
et al., 2000; Tacket, 2005). Tacket (2005) utilizou batatas transgênicas expressando proteína
do capsídeo dos NoVs (NVCP) para determinar se voluntários humanos alimentados com esse
tubérculo seriam capazes de desenvolver anticorpos, produzindo um aumento de IgA
secretória e/ou IgG específica. Porém, somente 35% dos voluntários desenvolveram IgG ou
IgM.
A prevenção das infecções por NoV tem como obstáculo a sua grande diversidade
genômica e antigênica, um grande desafio para o controle das gastroenterites por NoV.
33
2 RELEVÂNCIA DO ESTUDO
A gastroenterite aguda constitui um problema de impacto mundial em termos de saúde
pública, principalmente nos países em desenvolvimento. No mundo estima-se que mais de
700 milhões de casos/ano ocorram em crianças com até cinco anos de idade (Kapikian, 1994).
Há uma estimativa de que ocorram 1,5 bilhão de episódios de diarréia a cada ano, sendo
considerada uma das maiores causas de morte entre as doenças infecciosas em todo mundo. A
taxa anual estimada é de 3,5 a 5 milhões de mortes, principalmente nos países em
desenvolvimento (Linhares, 2000; Fruhwirth et al., 2001; Nguyen et al., 2001; Rohayem et
al., 2004).
Recentemente, o Fundo das Nações Unidas para a Infância (UNICEF) divulgou que
pela primeira vez desde que começaram a ser feitos os primeiros levantamentos sobre
mortalidade infantil, na década de 60, o número de mortes entre crianças em 2006 em todo o
mundo foi inferior a 10 milhões. A gastroenterite aguda é causada por diferentes agentes
etiológicos, entre os quais os vírus, sendo os rotavírus, os adenovírus entéricos, os astrovírus e
os norovírus os principais agentes virais responsáveis por esta enfermidade (Lopez et al.,
2000; Monroe et al., 2000; De Wit et al., 2001; Koopmans, 2001; Trevino et al., 2001).
Durante muitos anos, as dificuldades de diagnóstico dos NoVs resultaram em uma
freqüência subestimada dos casos de gastroenterite por estes vírus. Entretanto, surtos
ocorridos em comunidades afetando indivíduos de todos os grupos etários, atingindo
pequenos grupos ou resultando em surtos com centenas de pessoas infectadas, demonstram
34
que os NoVs têm se tornado um crescente problema de saúde pública em todo o mundo
(Marks et al., 2000; Froggatt et al., 2004; Widdowson et al., 2004).
No Brasil, existem poucos estudos sobre a ocorrência de casos de gastroenterite aguda
por NoV (Parks et al., 1999; Gallimore et al., 2004; Borges et al., 2006; Castilho et al., 2006;
Soares et al., 2007; Victória et al., 2007). Essas investigações estão restritas a laboratórios de
pesquisas. Portanto, somente uma investigação mais abrangente, incluindo laboratórios
clínicos, a exemplo do que ocorre com relação aos RV, é que poderá fornecer a verdadeira
dimensão das infecções por NoV. A ausência de métodos de diagnóstico rápido e de baixo
custo tem resultado no não esclarecimento de surtos e casos esporádicos desta infecção. Desta
forma, a investigação de NoV em espécimes clínicos obtidos a partir de casos de
gastroenterite aguda ocorridos na Região do Médio Paraíba contribuirá com dados
laboratoriais e epidemiológicos sobre as infecções por esses vírus no estado do Rio de Janeiro.
A caracterização molecular determinará os genótipos circulantes, permitindo a realização de
estudos de epidemiologia molecular desses vírus. Além disso, poderá ainda contribuir para o
estabelecimento de medidas preventivas a serem tomadas e fornecer conhecimento para o
desenvolvimento de uma vacina eficaz para o controle da gastroenterite aguda pelos NoVs.
35
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Investigar a presença de NoV em espécimes clínicos obtidos de casos de
gastroenterite aguda ocorridos na Região do Médio Paraíba, Estado do Rio de Janeiro.
3.2 Objetivos específicos
- Detectar NoV pela RT-PCR em amostras de fezes provenientes de casos de
gastroenterite aguda;
- Detectar e quantificar o NoV pela qPCR e comparar com a PCR qualitativa
convencional;
- Realizar o seqüenciamento parcial do gene que codifica para a proteína do capsídeo
viral para determinação do genótipo dos NoVs detectados;
- Realizar estudo de epidemiologia molecular dos NoVs pela caracterização molecular
das seqüências obtidas.
36
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Material
4.1.1 Espécimes clínicos
Foram estudadas 50 amostras fecais obtidas de 50 casos de gastroenterite aguda, cujos
espécimes clínicos foram enviados ao Laboratório de Virologia Comparada-Laboratório de
Referência Regional para Rotaviroses (LVC-LRRR), Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz, no
período de março a junho de 2005. O estudo corresponde a casos atendidos nas Secretarias
Municipais de Saúde das cidades de Resende, Rio Claro e Piraí, localizadas na região do
Médio Paraíba do Estado do Rio de Janeiro (Figura 5).
As amostras fecais foram enviadas ao laboratório acompanhadas com Ficha de
Informações Clínicas e Epidemiológicas (Anexo 1) e mantidas sob refrigeração (2 - 8 °C) até
o momento da análise. Todas as amostras foram previamente testadas pela técnica de
eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA), pelo ensaio imunoenzimático para detecção de
rotavírus e adenovírus (EIARA) e pela reação de RT-PCR para detecção de astrovírus,
conforme protocolo descrito previamente (Pereira et al., 1983; 1985; Noel et al., 1995). Em
seguida todas as amostras do estudo foram testadas pela PCR para umfragmento da região B,
codificadora da região RNA polimerase RNA dependentete (RdRp). As amostras positivas de
NoVs para esta região foram também testados para região D extremidade 3’da ORF2,
codificadora da região do capsídeo viral, que caracterizou o genogrupo dessas amostras
(Beuret et al, 2002; Vinjé et al 2004). Destas amostras caracterizadas pela região D, quatro
amostras representando os municípios do estudo foram seqüenciadas. Foi construída uma
37
árvore filogenética, a partir do alinhamento das amostras do estudo com os protótipos de
NoV, e as seqüências do estudo foram depositadas no “GenBank”. Todas as 50 amostras dos
50 casos do estudo foram submetidas à reação qPCR (Fluxograma 1).
Figura 5: Mapa da Região do Médio Paraíba, Estado do Rio de Janeiro.
Fonte: http://www.codin.rj.gov.br/Images/mapas/Municipios/MP_MUNICIPIOS.pdf
Acesso em 25 de Março de 2006.
Mapa parcial do Estado do Rio de Janeiro mostrando a região do Médio Paraíba,
destacada na cor bege.
4.1.2 Amostras controle
Controles positivos e negativos foram introduzidos durante todos os procedimentos
deste estudo. Todos os cuidados e precauções para o trabalho com métodos de amplificação
genômica foram estritamente seguidos, sendo cada etapa realizada em áreas distintas. Para
todos os métodos, o controle negativo foi utilizado H2O livre de Dnase/Rnase.
38
Amostras padrões de NoV GI e GII, gentilmente cedidas pelo Dr. Chris Gallimore
pesquisador do “Enteric, Respiratory and Neurological Virus Laboratory - Health Public
Agency”, Colindale - Reino Unido, foram utilizadas para padronização e estabelecimento dos
protocolos de RT-PCR qualitativo e quantitativo. Posteriormente, uma amostra analisada e
caracterizada geneticamente como NoV no LVC-LRRR foi utilizada como controle positivo
nas reações.
Para aferição das reações de PCR em tempo real quantitativo (qPCR) foram utilizadas
alíquotas de plasmídeos recombinantes contendo a região alvo de NoV GII. Os plasmídeos
recombinantes, foram preparados previamente de acordo com o protocolo de Kageyama et al.
(2003).
4.1.3 Comitê de ética
Este estudo faz parte de um estudo global que abrange diagnóstico, vigilância e
epidemiologia molecular dos vírus envolvido na etiologia da gastroenterite aguda no Rio de
Janeiro, sendo submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fiocruz - CEP
311/06.
4.1.4 Oligonucleotídeos
Para síntese do DNA complementar (cDNA) foi utilizado o oligonucleotideo
randômico pd(N)6 (Amersham Biosciences, USA).
As seqüências dos oligonucleotídeos e da sonda, a localização no genoma dos
oligonucleotídeos que foram utilizados neste estudo para detecção e caracterização molecular
dos NoVs estão listados no Quadro 1.
39
Quadro 1: Características dos iniciadores e da sonda utilizados neste estudo para detecção e
seqüenciamento e quantificação dos nororovírus.
Iniciadores/ sonda
(Polaridade)
Seqüência 5´
3´
Posição
no
genoma
Concentração
Produto
(pb)
PCR NoV Região B
Mon 432 * (+)
Tgg ACI CgY ggI CCY AAY CA
5093-5114
Mon 434 * (-)
gAA SCG CAT CCA RCG gAA CAT
5285-5305
Tgg ACI AGR ggI CCY AAY CA
5093-5114
ggA YCT CAT CCA YCT GAA CAT
5285-5305
Mon 431
**
(+)
Mon 433** (-)
100 mM
213bp
50 mM
253bp
PCR NoV GII Região D
Cap C (-)
CCT TYC CAK WTC CCA Ygg
6667-6684
Cap D1 (+)
TgT CTR STC CCC CAg GAA Tg
6432-6451
Cap D3 (+)
TgY CTY ITI CCH CAR gAA Tgg
6432-6452
Taq Man NoV GII
COG2F (+)
COG2R (-)
CAR gAR BCN ATg TTY AgR Tgg ATg Ag
5003
600nM
TCg ACG CCA TCT TCA TTC ACA
5100
600nM
5048
250nM
FAM – Tgg gAg ggC gAT CgC AAT CTSonda RING2 -TP (+)
TAMRA
*Genogrupo I, **Genogrupo II
I: inosina, R: purina (A/G), Y: pirimidina (C/T), S: forte (C/G), W= (A/T).
A Posição dos iniciadores é baseada Norwalk (M87661) para GI e para GII Lordslade(X86557).
_
40
4.2 SOLUÇÕES
4.2.1 Tampão TRIS/HCl/Ca++ 0,01M pH 7,2
Tris - hidroximetil-tris-aminometano (SIGMA®)
1,21g
Cloreto de Cálcio -CaCl2- 0,0015M (Vetec®)
0,02g
Água destilada q.s.p.
1000mL
Em um bécher de 2000mL foram adicionados os reagentes, homogeneizados com
agitador magnético e ajustado o pH (7,2) com ácido clorídrico PA (Merck®) antes de
completar o volume final em balão volumétrico de 1000mL. A solução foi transferida um para
frasco com vedação e autoclavada a 121°C por 20 minutos. Foi conservada entre 2 - 4ºC.
4.2.2 Sílica
Dióxido de silício (SIGMA®)
Água destilada q.s.p.
60g
500mL
Em uma proveta de 500mL foram adicionadas água e 60g de sílica, a solução foi
homogeneizada vertendo-se a proveta, deixando sedimentar por 24 horas. Por sucção foram
desprezados 430mL do sobrenadante e adicionados 500mL de água destilada à sílica. Após
sedimentação por 5 horas, foram desprezados 440mL do sobrenadante. O pH (2,0) foi
ajustado adicionando-se 600µL de ácido clorídrico PA 37% (Merck®). A solução foi separada
em frascos de cor âmbar em alíquotas de 10mL e foi autoclavada a 121°C por 20 minutos e
estocada a 22°- 25°C.
41
4.2.3 EDTA 0,2M pH 8,0
EDTA-ácido etilenodiamino tetracético-(SIGMA®)
Água destilada q.s.p.
37,22mg
500mL
Em um bécher de 1000mL foram adicionados EDTA e 300mL de água destilada. Após
homogeneização com agitador magnético, o pH (8,0) foi ajustado com NaOH. A solução foi
transferida para um balão volumétrico de 500mL e ajustado o volume final. A solução foi
tranferida para um frasco com tampa e conservada a 22°- 25°C.
4.2.4 Tris-HCl 0,1M pH 6,4
Tris (hidroximetil-tris-aminometano) (SIGMA®)
Água destilada q.s.p.
12,11g
1000mL
Em um bécher de 1000mL foram adicionados os reagentes, homogeneizados com
agitador magnético e ajustado o pH (6,4) com ácido clorídrico PA (Merck®). O conteúdo foi
transferido para um balão volumétrico de 1000mL, e completado o volume final. A solução
foi acondicionada em frasco com tampa e conservada a 22°- 25°C.
4.2.5 Tampão L6
Isotiocianato de guanidina (Invitrogen®)
120g
Triton X-100 (SIGMA®)
2,6g
EDTA 0,2M pH 8,0 (SIGMA®)
Tris-HCl 0,1M pH 6,4 (SIGMA®) q.s.p
22mL
100mL
Em um bécher de 250mL foram adicionados os reagentes e homogeneizados com
agitador magnético. A solução foi transferida para balão volumétrico de 100mL, o volume
final completado e transferido para frasco âmbar, que foi conservado a 22°- 25°C.
42
4.2.6 Tampão L2
Isotiocianato de guanidina (Invitrogen®)
120g
Tris-HCl 0,1M pH 6,4 (SIGMA®) q.s.p.
100mL
Em um bécher de 250mL foram adicionados os reagentes e homogeneizados com
agitador magnético. O conteúdo foi transferido para balão volumétrico de 100mL e o volume
final completado. A solução final foi transferida para frasco âmbar e conservada a 22°- 25°C.
4.2.7 Tampão tris-boro-EDTA 10X pH 8,4 (TBE)
Tris-base (Invitrogen®)
108g
Ácido bórico (Reagen®)
55g
EDTA 0,5M pH 8, 8 (Sigma®)
Água Milli-Q q.s.p.
40mL
1000mL
Em um bécher de 2000mL foram adicionados os reagentes e homogeneizados com
agitador magnético. O conteúdo foi transferido para um balão volumétrico de 1000mL,
completado o volume final e transferido para frasco com vedação. A solução final foi
conservada entre 2 - 4ºC.
4.2.8 Gel de agarose a 1,5%
Agarose (Invitrogen®)
Tampão TBE 0,5 X pH 8,4 (Invitrogen®)
1,2g
80mL
A agarose foi pesada e colocada em um erlenmeyer adicionados 80mL de tampão TBE
0,5X. O erlenmeyer foi levado ao forno de microondas por 1minuto (em potência alta) até que
a agarose fosse dissolvida, deixando resfriar até +/- 50°C. A seguir, a agarose foi colocada na
cuba de eletroforese, tendo sido evitada a formação de bolhas.
43
4.2.9 Solução de brometo de etídio
Brometo de etídio 10mg/mL (Invitrogen®)
Água destilada
15µL
300mL
A solução de brometo de etídio foi dissolvida em água em recipiente plástico com
tampa, homogeneizada suavemente, em agitador magnético e conservada a 22°- 25°C. A
incidência direta da luz foi evitada.
4.2.10 Etanol 75%
Etanol PA
75mL
Água destilada
25mL
Em uma proveta de 100mL foram adicionados 75mL de álcool e o volume final
completado com a água destilada para 100mL. O conteúdo foi homogeneizado por inversão,
transferido para frasco com vedação e conservado a temperatura entre 2 - 4ºC.
44
4.3 MÉTODOS
4.3.1 Fluxograma da rotina do laboratório e deste estudo.
No fluxograma 1 estão descritos a rotina dos procedimentos do LVC-LRRR e os
procedimentos deste estudo.
Fluxograma 1. Fluxograma dos procedimentos laboratoriais na rotina do LVC-LRRR e os
procedimentos para as amostras do estudo.
AMOSTRA DE FEZES
PREPARO DA SUSPENSÃO FECAL A 10% (Tris-HCl-Ca++)
EIARA
RV – AdV
EGPA – RV
PCR - AdV
EXTRAÇÃO RNA
SÍNTESE DE cDNA
Iniciador randômico pd(N)6
RV-A
PCR
NoV
HAstV
Detecção
NoV (reg. B)
qPCR
TaqMan
Genotipagem
NoV (reg. D)
Seqüenciamento
Árvore filogenética Seqüências no
“GeneBank”
Obs.: Rotina do LVC-LRRR (cor preta) e procedimentos para as amostras do estudo (cor laranja)
45
4.3.2 Preparo da suspensão fecal
As suspensões fecais foram preparadas a 10% em tampão Tris-Ca++ 0,01 M pH 7,2,
homogeneizadas e clarificadas a 3000xg por 10 minutos a 4°C e estocados à - 20°C.
4.3.3 Extração do genoma viral
Para obtenção do RNA viral foi utilizado o método de Boom modificado (Boom et al.,
1990), como descrito a seguir:
Em um tubo tipo Eppendorf® foram adicionados 800µL de tampão L6 e 400µL de
suspensão fecal a 10%. Após homogeneização em vórtex por 10 segundos, o conteúdo foi
incubado a 56°C por 10 min. Foram acrescentados ao tubo 15µL de sílica, homogeneizado em
vórtex por 10 segundos e o tubo foi colocado em plataforma orbital com agitação lenta por 20
minutos. A seguir, o tubo foi centrifugado a 16.000 x g por 1 minuto e o sobrenadante
descartado em solução de NaOH 10N. O tubo foi vertido em papel de filtro, para secar. Foram
adicionados ao tubo 500µL de tampão L2, feita homogeneização em vórtex por 10 segundos e
centrifugação a 16.000 x g por 1 minuto. O sobrenadante foi descartado em solução de NaOH
10N e o tubo foi vertido em papel de filtro para secar. Foram adicionados 500 µL de etanol
70% gelado, feita homogeneização em vórtex por 10 segundos e o tubo centrifugado a 16.000
x g por 1 minuto, sendo o sobrenadante descartado e o tubo vertido em papel de filtro para
secar. Foram adicionados 500µL de acetona PA gelada, feita homogeneização em vórtex por
10 segundos e o tubo centrifugado a 16.000 x g por 1 minuto, sendo o sobrenadante
descartado e o tubo vertido em papel de filtro para secar. A seguir, o tubo foi levado em
banho-maria a 56°C por 15 minutos, com as tampas do banho-maria e do microtubo abertas
para que a sílica ficasse completamente seca. Foram adicionados ao tubo 60µL de água livre
de Rnase/Dnase (Invitrogen®), feita a homegeneização em vórtex por 10 segundos e o tubo
46
incubado a 56°C por 15 minutos. Finalmente foi acrescentado ao tubo 1µL (40U) de inibidor
de Rnase (Invitrogen®), feita a homogeneização em vórtex por 10 segundos e o tubo foi
centrifugado a 16.000 x g por 4 min. Foram coletados 45µL do sobrenadante e o ácido
nucléico viral foi estocado a -70°C.
4.3.4 Reação de transcrição reversa (RT)
A síntese do cDNA a partir do RNA extraído foi realizada utilizando-se o iniciador
randômico pd(N)6 (Amersham Biosciences®, USA). Em um Eppendorf® de 200µL foram
adicionados 4µL de dimetil sulfóxido (DMSO) a 10µL de RNA extraído. Após incubação a
97°C por 7 minutos, o tubo foi mantido em banho de gelo por 2 minutos. A seguir, foram
adicionados 36µL da mistura de reagentes (Quadro 2), e o tubo foi incubado a 42°C por 1
hora, seguido de 10 minutos a 95°C. O produto foi estocado a – 20°C até o momento da PCR.
Quadro 2. Reagentes utilizados na reação da transcrição reversa para a obtenção do cDNA a
partir do RNA viral extraído.
Reagentes
Concentração
Volume/Reação
-
20,5µL
10X
5,0µL
dxtp: dATP, dTTP, dGTP, dCTP ( Invitrogen®)
2,5 mM
4,0µL
MgCl2 (Invitrogen®)
50 mM
1,5µL
200U/µL
1µL
50 unidades (A260)
4µL
H2O livre de Dnase/Rnase (Invitrogen®)
Tampão de PCR sem MgCl2 (Invitrogen®)
RT Superscript IIITM (Invitrogen®)
pd(N)6 (Amersham Biosciences®)
47
4.3.5 Reação em cadeia pela polimerase (PCR) para detecção do norovírus (região B)
O protocolo utilizado tem sido descrito como adequado para triagem das infecções por
NoV, uma vez que utiliza quatro iniciadores que detectam simultaneamente os GI e GII ao
amplificarem um fragmento da região conservada do gene que codifica a RpRd, denominada
região B (Beuret et al., 2002; Zheng et al., 2006), como descrito a seguir:
Em um Eppendorf® de 200µL foram adicionados 5µL de cDNA em 20µL da mistura,
(Quadro 3), para volume final de 25µL. As amostras foram submetidas à desnaturação inicial
a 94ºC por 3 minutos e 40 ciclos subseqüentes de desnaturação (94oC/30 segundos),
anelamento (50oC/1 minuto), extensão (60oC/1 minuto) e um ciclo de extensão final (72oC/7
minutos), mantendo temperatura de 4°C por até 24horas. Os tubos foram colocados em
Termociclador, (Termocicler Applied Biosystems®, Foster City, CA, USA – modelo 2400).
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese (100 volts por 1 hora) em gel de
agarose a 1,5% (Invitrogen®) conforme descrito no item 4.3.7.
Quadro 3: Reagentes utilizados na reação em cadeia da polimerase para amplificação da
região B do norovírus.
Reagentes
H2O livre de Dnase/Rnase (Invitrogen®)
Concentração Volume/Reação
-
14,1µL
10X
2,5µL
dxtp: dATP, dTTP, dGTP, dCTP ( Invitrogen®)
2,5 mM
2,0µL
MgCl2 (Invitrogen®)
50 mM
0,8µL
Taq DNA polimerase platinum (Invitrogen®)
5 U/µL
0,3µL
Mistura de iniciadores Mon 431 – 432 – 433 – 434
100µM
0,3µL
Tampão de PCR sem MgCl2 (Invitrogen®)
48
4.3.6 Determinação dos genótipos de norovírus pela reação em cadeia pela polimerase
(PCR - região D)
Foram utilizados iniciadores (Quadro 1) para amplificação de um fragmento da região
do genoma que codifica para a proteína do capsídeo (região D), segundo Vinjé etal. (2004),
descrita como adequada para a posterior caracterização dos GG pelo sequenciamento desta
região (Zheng et al., 2006). Como descrito a seguir:
Em um Eppendorf® de 200µL foram adicionados 10µL de cDNA em 40µL da mistura,
(Quadro 4), para volume final de 50µL. As amostras foram submetidas à desnaturação inicial
à 95ºC por 3 minutos e 40 ciclos subseqüentes de desnaturação (94°C/1 minuto), anelamento
(44°C/1 minuto), extensão (72oC/1 minuto) e um ciclo de extensão final (72°C/10 minutos)
mantendo temperatura de 4°C por até 24 horas. Os tubos foram colocados no termociclador Termocicler Applied Biosystems®, Foster City, CA, USA – modelo 2400.
Quadro 4. Reagentes utilizados na reação em cadeia pela polimerase para amplificação da
região D do norovírus.
Reagentes
H2O livre de Dnase/Rnase (Invitrogen®)
Concentração Volume/Reação
-
26,20µL
10X
5,0µL
dXTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP ( Invitrogen®)
2,5mM
4,0µL
MgCl2 (Invitrogen®)
50mM
1,5µL
Taq DNA polimerase platinum (Invitrogen®)
5U/µL
0,3µL
Mistura de iniciadores CAP C /D1/D3
100µM
3,0µL
Tampão de PCR sem MgCl2 (Invitrogen®)
49
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese (100 volts por 1 hora) em
gel de agarose a 1,5% (Invitrogen®) conforme descrito no item 4.3.7. Quatro produtos
representando uma amostra do município Rio Claro, uma amostra de Piraí e duas amostras do
município de Resende foram posteriormente purificadas para seqüenciamento nucleotídico.
4.3.7 Análise do produto da reação em cadeia pela polimerase
Os produtos amplificados foram analisados por eletroforese (100 volts por 1 hora) em
gel de agarose a 1,5% (Invitrogen®) utilizando-se cuba Horizon 11.14 9 Life Technologies®
em tampão TBE 1X (Invitrogen®) pH 8,4. Foram aplicados em cada poço 10µL do produto da
reação somando-se a 2µL do corante azul de bromofenol (Invitrogen®). Como referência para
o tamanho do amplicon utilizou-se um padrão de tamanho molecular de 100pb ou 50pb
(Invitrogen®). O gel foi submerso em solução de brometo de etídio (Sigma Chemical
Company®) 0,5µg/ml por 20 minutos. Os “amplicons” foram visualizados em
transiluminador de luz ultravioleta (Labnet®). A imagem foi registrada em sistema de captura
de imagem “BioImaging Systems®”utilizando o programa Labworks 4.0. Foram consideradas
positivas as amostras que apresentaram fragmentos amplificados de 213 pares de bases para
região B e 253 pares de base para região D.
4.3.8 Purificação do amplicon obtido
Os produtos amplificados foram purificados com o kit comercial “QIAquick® PCR
Purification Kit” (QIAGEN®, Valencia, CA, USA), seguindo as recomendações do fabricante.
Após a purificação, os “amplicons” foram quantificados em gel de agarose a 2% por
visualização com a utilização de padrão de massa, “Low DNA Mass Ladder” (Invitrogen®).
50
4.3.9 Reação de seqüênciamento e purificação da reação
Para o seqüenciamento direto dos produtos amplificados e purificados foi utilizado o
kit comercial “Big Dye Terminator® v 3.1 Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems®, CA,
USA), conforme recomendado pelo fabricante (Quadro 5). Foram utilizados os mesmos
iniciadores da reação de amplificação genômica da região D. Os produtos da reação de
seqüência foram purificados com as colunas CENTRI-SEP® (Princeton Separations®, CA,
USA) conforme orientação do fabricante. O seqüenciador automático ABI Prism 3100
(Applied Biosystems®) foi utilizado e os eletroferogramas obtidos foram analisados.
Quadro 5. Reagentes utilizados na reação de seqüenciamento.
Reagente
DNA (25ng)
Volume/Reação
2-10µL
Tampão de seqüenciamento (Invitrogen®) (5X)
2µL
Big Dye (Invitrogen®)
2µL
Iniciadores CAP C /D1/D3 (1 iniciador por tubo de reação)
2µL
H2O livre de Dnase/Rnase (Invitrogen®) q.s.p.
10 - 20µL
4.3.10 Análise filogenética das seqüências da região D
O “BioEdit Sequence Alignment Editor” (Hall, 1999) foi o programa utilizado para
edição e alinhamento das seqüências obtidas.
A análise filogenética das seqüências foi realizada utilizando o programa MEGA2
versão 2.1 (Kumar et al., 2001) e a distância genética calculada pelo modelo Kimura 2parâmetros, utilizando o método “neighbor-joining” com “bootstrap” de 2000 réplicas. Para
51
esta análise foram utilizadas as seqüências dos protótipos dos diferentes genótipos GII NoV,
as quatro seqüências representando os municípios do estudo, as duas seqüências do município
de Carmo, pertencente ao estado do Rio de Janeiro. (Portal Entrez Pubmed – GenBank
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db =Nucleotide&itool=toolbar)
4.3.11 Reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qPCR)
Foi utilizado o protocolo descrito por Kageyama et al.(2003) adaptado para o aparelho
ABI 7500 (Applied Biosystems®, USA). O protocolo utiliza iniciadores específicos para NoV
GII, amplificando a seqüência da junção da ORF1-ORF2, região mais conservada do genoma
entre os NoVs (Quadro 1).
As amostras foram aplicadas em duplicatas em uma microplaca de 96 cavidades
(MicroAmp®, Applied Biosystem, Foster City, Califórnia, EUA), contendo 20µL da mistura
e 5 µL do cDNA (Quadro 6) para volume final de 25µL. Inicialmente as amostras foram
submetidas à temperatura de 50ºC por 2 minutos e posteriormente seguido por desnaturação à
95ºC por 10 minutos e 45 ciclos subseqüentes de desnaturação (95°C/15 segundos) e ciclo de
anelamento e extensão (56°C/1 minuto).
Os dados de amplificação e quantificação foram coletados e analisados no software
Sequence Detector versão 1.6 (Applied Biosystems®). Em cada reação, foi gerada uma curva
padrão especifica para NoV GII pela adição de 5 µL da diluíção seriada (1:10) do plasmídeo
recombinante purificado contendo o inserto de NoV GII nas concentrações de 107 a 101
cópias cDNA/reação. A curva apresentou “threshold cycle” (Ct) 36.88 para a diluição 101 e o
método apresentou um limite de detecção de 10 cópias de cDNA por reação.
52
Quadro 6: Reagentes utilizados na reação em cadeia pela polimerase em tempo real (qPCR).
Reagente
Volume/Reação
H2O livre de Dnase/Rnase (Invitrogen®)
3,875µL
Taq Man ® Universal PCR Master MIX (Invitrogen®)
12,5µL
Iniciadores COG 2F [10µM]
1,5µL
Iniciadores COG 2R [10µM]
1,5µL
Sonda RING2 [10µM]
0,625µL
53
5 RESULTADOS
5.1 Investigação epidemiológica
Entre a 10ª e 11ª semanas epidemiológicas (março) de 2005, a Secretaria Municipal de
Saúde - Serviço de Vigilância Epidemiológica de Resende notificou 12 casos de diarréia,
vômito e febre ocorridos em uma creche municipal no bairro de Fazenda da Barra II. A
investigação epidemiológica identificou que a primeira criança a adoecer foi a filha da
cozinheira que vomitou no refeitório e em outras salas da creche. Além das crianças, dois dos
19 funcionários da creche apresentaram quadro clínico semelhante no mesmo período e outros
três relataram algum desconforto gastrointestinal. A água da creche foi enviada ao
Laboratório Central de Saúde Pública para investigação bacteriológica e o resultado foi
negativo para enterobactérias patogênicas. No mesmo bairro e período, outros 23 casos de
gastroenterite foram notificados, sendo 15 em crianças e oito em adultos residentes no mesmo
bairro.
No mês de março, um total 112 casos de gastroenterite aguda foram notificados em 34
(40%) dos 85 bairros do município de Resende, sendo que 34 casos ocorreram no bairro
Fazenda da Barra II. No mês de abril, 21 novos casos foram notificados nos municípios de
Rio Claro e Piraí, também localizados na Região do Médio Paraíba.
54
5.2 Investigação laboratorial e identificação do agente etiológico
Entre março e junho de 2005 o LVC-LRRR do Instituto Oswaldo Cruz recebeu 50
amostras de fezes de 50 casos de gastroenterite aguda ocorridos em três municípios da região
do Médio do Paraíba para investigação laboratorial e identificação de um possível agente viral
envolvido nestes casos.
Todas as amostras recebidas foram previamente testadas pelo EGPA e pela EIARA,
segundo o fluxograma de trabalho adotado no laboratório (Fluxograma 1), sendo todas
negativas para rotavírus, tanto no EIARA quanto no EGPA, descartando a infecção por este
vírus. Somente uma (2%) das 50 amostras testadas foi positiva para adenovírus, detectado
pelo EIARA, e uma outra amostra foi positiva para astrovírus, detectado pela RT-PCR
específica. Todas as 50 amostras foram testadas pela RT PCR para NoV região B. A reação
de RT PCR para região B, foi realizada para detecção do NoV utilizando iniciadores para os
genogrupo I e II (Quadro1).
Das 50 amostras recebidas 33 (66%) foram positivas para NoV pela RT-PCR
convencional (Figura 6). Onze das 12 (92%) amostras inicialmente recebidas no laboratório
para investigação foram positivas para NoV pela RT-PCR convencional. Estas amostras
foram provenientes de cinco crianças que freqüentavam a creche municipal do bairro de
Fazenda da Barra II, da mãe de uma delas e de dois irmãos, além de quatro casos não
relacionados com a instituição, porém do mesmo bairro. A Tabela 1 apresenta a distribuição e
o percentual de casos de gastroenterite aguda associado a infecções por NoV no período
estudado.
Todas as 50 amostras do estudo submetidas à reação de PCR em tempo real, sendo que
33 amostras foram detectadas, tendo sido esse o mesmo percentual de detecção obtido pela
PCR convencional. Todas as 33 amostras foram quantificadas Tabela 3.
55
Figura 6: Eletroforese em gel de agarose 1,5% dos produtos amplificados pela PCR da região
B para detecção de norovírus.
1
2 3 4 5
6
7
8
9
213 pb
Linha 1: Tamanho Molecular 100 pares de bases;
Linhas 2, 3, 5, 6, 7: amostras positivas;
Linha 4: amostra negativa;
Linha 8: controle negativo; Linha 9: controle positivo.
Tabela 1: Distribuição das amostras estudadas para os NoV pela RT- PCR (região B) de
acordo com os bairros e municípios da região do Médio Paraíba, estado do Rio de Janeiro,
2005.
Município
Resende
Bairro
Amostras Positivas /
Amostras Estudadas (%)
Barra II
Capelinha
Cidade da Alegria
Fazenda da Barra II
Nova Alegria
Parque Embaixador
Visconde de Mauá
São Caetano
Novo Surubim
Não Informado
5/7
1/1
1/2
3/4
1/1
3/3
1/1
2/2
0/6
1/1
Subtotal
Piraí
18/28 (64.2)
Arrozal
Centro
Varjão
Subtotal
Rio Claro
Total
1/1
0/2
5/8
6/ 11 (54.5)
Fazenda Gama
9/11 (81.8)
33/50 (66.0)
56
5.3 Caracterização molecular dos norovírus
Todas as 33 amostras positivas para a RT-PCR da região B, foram submetidas à
caracterização molecular e o protocolo utilizado foi o da RT-PCR para região D, com
iniciadores específicos para GII. Todas as 33 amostras previamente positivas para região B
foram positivas para região D que caracterizou o genogrupo das mesmas como GII (Figura 7).
Figura 7: Eletroforese em gel de agarose 1,5% dos produtos amplificados pela RT-PCR da
região D para caracterização de norovírus.
13 14
1
3
2
1
4
2
5
3
6
1
7
4
10 11
8
5
6
7
13
12
8
9
14
14
10
11
253 pb
Linha 1: Tamanho Molecular 50 pares de base;
Linhas 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9: amostras positivas;
Linha10: controle negativo; Linha 11: controle positivo.
Das 33 amostras caracterizadas para região D, quatro amostras representando os
municípios estudados foram seqüenciadas para a determinação do genótipo.
Quatro amostras, uma do município Piraí, uma do município de Rio Claro e duas do
município de Resende foram seqüenciadas utilizando os mesmos inicidores da região D e as
mesmas foram caracterizadas com 0,02% de divergência de nucleotídeos (nt), não houve
divergência na seqüência de aminoácidos (aa) entre elas (Tabela 2). Foram também analisadas
duas amostras oriundas de um surto ocorrido no mesmo período do estudo no município de
Carmo, na região Serrana do Estado do Rio de Janeiro e estas amsotras mostraram o mesmo
57
perfil de divergência de nucleotídeos 0,02% e 100% de similaridade na seqüência de aa entre
elas e com as amostras do estudo (Tabela 2). A análise filogenética dos aa confirmou que as
amostras estudadas e as do município de Carmo pertenciam ao genogrupo II e genótipo 4
(Figura 8).
As quatro amostras seqüênciadas no estudo e as amostras do município de Carmo
foram depositadas no GenBank conforme identificação do número de acesso:
DQ857344-Hu/GII-4/10942/2005/Bra/Resende; DQ857342-Hu/GII-4/10689/2005/Bra/Resende;
DQ857340-Hu/GII-4/10641/2005/Bra/RioClaro; DQ857341-Hu/GII-4/10668/2005/Bra/Piraí;
DQ997036-Hu/GII/4/10840/2005/Bra/Carmo; DQ997035-Hu/GII/4/10842/2005/Bra/Carmo.
Tabela 2: Matriz identidade (em vermelho os aminoácidos e em preto os nucleótideos) obtida
a partir do alinhamento das seqüências do estudo, juntamente com as amostras do município
de Carmo, amostra do Hospital Municipal Sales Neto-RJ (HMSN) e o protótipo GII.4
("Bristol virus").
Número registro - Local de
origem
(AcessoGenbank)
10840 - Carmo
10840
1,000
0,996
10942 - Resende
Rio
Claro
HMSN Protótipo
GII 4
1,000
1,000
0,964
0,880
1,000
-
1,000
1,000
1,000
0,964
0,880
1,000
-
1,000
1,000
0,964
0,880
1,000
-
1,000
0,964
0,880
1,000
-
0,964
0,880
0,964
-
0,880
0,996
0,992
1,000
0,996
0,996
1,000
0,996
0,996
1,000
0,984
0,988
0,980
0,984
0,984
0,940
0,944
0,936
0,940
0,940
0,932
0,873
0,877
0,869
0,873
0,873
0,873
10641 - Rio Claro
(DQ857340)
9546 - HMSN
(DQ997040)
0,880
-
Protótipo GII 4
(X76716)
X76716
1,000
10668 - Piraí
(DQ857341)
10668 10641 9546
1,000
10689 - Resende
(DQ857342)
10689
-
10842 - Carmo
(DQ857344)
10942
Carmo Carmo Resende Resende Piraí
(DQ997036)
(DQ997035)
10842
0,865
58
Figura 8: Árvore filogenética obtida a partir da analise de 56 aminoácidos da região pertencente ao
capsideo dos norovírus.
DQ857344-Hu/GII-4/10942/2005/Bra/Resende
DQ857340-Hu/GII-4/10641/2005/Bra/Rio Claro
95
DQ997036-Hu/GII/4/10840/2005/Bra/Carmo
DQ997035-Hu/GII/4/10842/2005/Bra/Carmo
98
99
DQ857342-Hu/GII-4/10689/2005/Bra/Resende
DQ857341-Hu/GII-4/10668/2005/Bra/Piraí
DQ997040-Hu/GII/4/9546/2004/Bra
GII/4(X76716)
1
GII/6(AJ277620)
12
GII/11(AB074893)
GII/14(AY130761)
4
GII/7(AJ277608)
64
19
GII/8(AF195848)
47
86
GII/9(AY038599)
GII/2(X81879)
40
32
GII/5(AJ277607)
GII/10(AF427118)
86
GII/16(AY502010)
9
72
6
GII/1(U07611)
GII/12(AJ277618)
GII/13(AY113106)
32
39
GII/17(AY502009)
GII/3(U02030)
GII/15(AY130762)
GI/1(M87661)
0.05
Árvore filogenética obtida a partir da análise de 56 aminoácidos da região do capsídeo (região D).
Aplicando o programa MEGA2 versão 2.1 (Kumar et al., 2001) a distância genética calculada
pelo modelo Kimura 2-parâmetros, e o método “neighbor-joining” com “bootstrap” de 2000
réplicas. Utilizando as amostras obtidas neste estudo, as amostras do município de Carmo, dos
protótipos de GII e protótipo GI. Denominação do protótipo: Genogrupo /genótipo seguido pelo
número de acesso no “GenBank” e para as amostras brasileiras: o número de acesso seguido pelo
número registro, ano, país e município.
59
5.4 Quantificação de norovírus pela reação em cadeia pela polimerase em tempo real
(qPCR)
Foi utilizado o qPCR para detecção e quantificação rápida das amostras. Das 50
amostras fecais testadas, 33 foram positivas, demonstrando 100% de concordância com os
resultados obtidos com a RT-PCR convencional para região B. As amostras positivas foram
quantificadas pelo sistema “TaqMan” e o número de cópias detectadas foi avaliado de acordo
com os dias de diarréia. A faixa de detecção variou de 2,6 x 101 a 2,2 x 106 cópias de cDNA
de NoV por reação ou de 5.5 x 104 to 4.6 x 109 cópias de RNA de NoV por grama de fezes
(Tabela 3). Não foi observada diferença significativa na freqüência das amostras positivas
quando comparadas à freqüencia das amostras negativas em relação ao número de dias de
diarréia (< de cinco dias e ≥ a cinco dias χ2 = 0,59 p= 0,44 (p> 0,05)).
Tabela 3: Detecção quantitativa de norovírus por número de cópias de RNA por
grama de fezes utilizando a técnica da PCR em tempo real de acordo com o número de dias
com diarréia dos casos com gastroenterite aguda positivos.
1
Número de casos
positivos/
Número de casos
estudados (%)
3/4
2
Número de dias
com diarréia
Número de cópias/
por g de fezes
Média ±
Desvio Padrão
Mínimo – Máximo
8.2 x104 - 3.8 x 108
1.8 x 108 ± 1.9 x 108
4/7
8.0x 106 - 2.5 x 109
7.2 x 108 ± 1.2 x 108
3
8/9
4.6 x 106 - 4.6 x109
1.1 x 109 ± 1.6 x 109
4
6/10
5.0 x 106 - 1.4 x 109
5.5 x 108 ± 6.2 x 108
5
2/4
1.2 x 107 - 3.2 x 107
2.2 x 107 ± 1.4 x 107
6
0/2
ND*
7
5/5
3.2 x 10 - 3.2 x 10
1.3 x 10 ± 1.1 x 107
8
1/3
5.5 x 104
-
9
0/1
ND*
-
Não informado
4/5
1.6 x 105 - 1.5 x 109
5.0 x 108 ± 6.7 x 108
Total de amostras
33/50 (66)
*ND - Não determinado
5
7
7
60
5.5 Distribuição dos casos de acordo com a idade e as manifestações clínicas
A distribuição dos 49 casos estudados de acordo com o grupo etário evidenciou que
mais de 50% dos casos das infecções por NoV ocorreram em crianças com idade inferior a 10
anos, porém acometeu todas as faixas etárias atingindo adultos até 65 anos de idade (Gráfico
1). Em um caso a idade não foi informada.
Gráfico 1: Distribuição dos casos estudados de acordo com o grupo etário.
12
PCR Negativo
10
Número de casos
PCR Positivo
8
6
4
2
0
≤1
> 1 a ≤10
>10 a 19
≥20
Grupo etário (anos)
* Em um caso a idade era ignorada.
Todos os 50 casos investigados laboratorialmente apresentaram quadro de diarréia
aguda. Destes, 39 indivíduos relataram outras manifestações clínicas que usualmente
acompanham os quadros de gastroenterite aguda (Tabela 4). Entre os casos positivos para
NoV as principais manifestações observadas foram: vômito (19 - 55.9%), dor abdominal (14-
61
41.2%), e febre ≥ 37,5°C (13 - 38.2%). A freqüência destas manifestações clínicas não foi
estatisticamente significativa (p> 0,05) quando os casos positivos foram comparados com os
negativos (Vômito χ 2= 0,64 p= 0,423 - Dor abdominal χ 2 = 0,03 p= 0,855 - Febre (≥ 37,5°C)
χ 2 =0,05 p= 0,828).
Tabela 4: Manifestações clínicas apresentadas em 39 casos que relataram outros sintomas
além da diarréia de acordo com o grupo etário e o resultado da RT-PCR para norovírus.
Grupo
etário
RT-PCR
Vômito
Dor
Abdominal
Febre
Inapetência
Muco
Coriza
Tosse
Pos
3
2
2
1
4
2
2
Neg
2
0
2
1
1
1
1
Pos
9
5
7
4
2
3
4
Neg
2
3
5
3
2
3
3
Pos
2
1
0
0
0
0
0
Neg
0
0
1
1
0
0
0
Pos
5
6
4
4
0
0
0
≥20
Neg
3
3
0
1
0
0
0
Total
Pos
19
14
13
9
6
5
6
Neg
7
6
8
6
3
4
4
≤1
>1- ≤ 10
>10 - 19
A desidratação ocorreu em dois casos no grupo etário >1- ≤ 10, cujas amostras foram
positivas para norovírus. O exantema esteve presente em somente em um caso no grupo etário
≤ 1, cuja amostra foi positiva para norovírus, assim como o sangue detectado em uma amostra
no grupo etário >1- ≤ 10, cuja amostra foi negativa para norovírus.
62
6 DISCUSSÃO
Com os avanços dos métodos moleculares de detecção viral tem sido possível
demonstrar a importância dos NoVs como um dos mais importantes agentes etiológicos da
gastroenterite aguda (Willhemi et al., 2003). Diferentemente dos RV, os NoVs atingem
igualmente crianças e adultos, ocasionando surtos em comunidades onde haja aglomerado de
pessoas de diferentes idades. Esse agente viral, sem dúvida, deve ser considerado entre os
principais vírus responsáveis por surtos da doença, podendo envolver um grande número de
pessoas (Green et al., 2001; Fankhauser et al., 2002; Chan et al., 2006).
A rotina de laboratórios concentra-se em investigar a presença do RV-A e seu impacto
como agente etiológico da gastroenterite não bacteriana utilizando métodos para detecção de
RNA em amostras fecais (EGPA) e para detecção de antígenos por ensaios imunoenzimáticos
(EIE). O grande número de amostras negativas utilizando esses métodos, com casos
envolvendo crianças e adultos, sugerem a necessidade de investigar outros vírus
gastroentéricos como os HAstV, os AdV entéricos e os NoVs que têm um papel importante na
etiologia das gastroenterites virais (Bereciartu et al., 2002; Liu et al., 2006).
Como os NoVs não possuem, até o momento, um sistema de replicação em cultura
celular adequado e não há um modelo animal experimental satisfatório, o desenvolvimento de
métodos de diagnóstico destes vírus ficou restrito por muito tempo a estudos epidemiológicos
que eram limitados a pequenas vigilâncias realizadas em laboratórios de centros de referência,
utilizando a técnica de ME para a detecção viral. Em 1995, o estabelecimento da RT-PCR
63
para detecção de NoV, com sensibilidade de detecção de 102 partículas virais, representou um
grande avanço para o diagnóstico destas infecções (Glass et al., 2000). Assim sendo, os NoVs
despontaram como importantes agentes etiológicos da gastroenterite aguda, tanto em casos
esporádicos quanto em surtos (Bon et al., 2005).
No Brasil são poucos os estudos sobre NoV e sua prevalência ainda não foi bem
estabelecida. Parks et al.(1999) descreveram pela primeira vez a prevalência de NoV em casos
de gastroenterite aguda em crianças pertencentes a comunidades carentes de Fortaleza e
encontraram uma positividade de 7%. Gallimore et al.(2004) associaram pela primeira vez os
NoVs como agente etiológico em três de quatro surtos ocorridos em uma creche na cidade do
Rio de Janeiro. Posteriormente, algumas outras citações relatando a circulação de NoV em
crianças hospitalizadas foram descritos (Borges et al., 2006; Castilho et al., 2006; Victória et
al., 2007; Soares et al., 2007).
No presente estudo, a infecção por NoV em cinco crianças e em três familiares
atendidos em março de 2005 no ambulatório localizado em Fazenda da Barra II, no município
de Resende, sugere a ocorrência de um surto de NoV na mesma localidade. No mesmo mês,
novos casos ocorreram em outros dois municípios, Rio Claro (81,8%) e Piraí (54.5%) e novos
casos esporádicos foram detectados em Resende nos meses seguintes, demostrando a
circulação do NoV na região. Koopmans e Duizier (2004) relatam que quando os NoVs são
introduzidos numa comunidade ou população, pode ocorrer a disseminação da doença,
resultando em um grande número de infecções secundárias e o acometimento de mais de 50%
dos contatos. Freqüentemente, os NoVs são descritos como o principal agente causador de
gastroenterite aguda em adultos (De Wit et al., 2001; Fankhauser et al., 2002; Lopman et al.,
2002). Entretanto, especialmente em países em desenvolvimento, incluindo o Brasil o papel
destes vírus em casos esporádicos e em surtos de gastroenterite é ainda subestimado.
64
Neste estudo, foi utilizado iniciador randômico, Pd(N)6, para obtenção do cDNA viral.
A realização da RT-PCR em dois passos com iniciador randômico para a fase de transcrição
reversa é descrito como 100 vezes mais sensível do que a PCR com iniciadores específicos na
síntese de cDNA. Além de aumentar a sensibilidade, o emprego de iniciadores randômicos
para a síntese de cDNA permite que o mesmo seja utilizado para a detecção molecular de
outros vírus (Pang et al., 2005). Rotineiramente, a utilização de EIE comercial, permite a
análise de um grande número de amostras. Porém seus resultados são desapontadores para
detecção dos NoVs (de Bruin et al., 2006). Embora mais rápido e menos trabalhoso que a RTPCR, não é recomendável, principalmente devido à diversidade antigênica dos NoVs (BurtonMacLeod et al., 2004). Usualmente, a baixa sensibilidade e especificidade do EIE resultam na
necessidade de amostras negativas serem testadas utilizando a RT-PCR, o que aumenta o
custo para um diagnóstico correto (Gunson et al., 2003).
O uso da PCR convencional com dois pares de oligonucleotídeos cuja seqüência alvo
é a região conservada da extremidade 3’da ORF 1, que codifica a RdRp (região B), detectou o
NoV em 33(66%) das 50 amostras analisadas. Esse resultado quando comparado com o
protocolo da PCR em tempo real utilizando o sistema “TaqMan”, que obteve a mesma taxa de
detecção, mostra que a PCR convencional é uma boa ferramenta para diagnóstico de
laboratório e pode ser recomendada para investigação de surtos.
Neste estudo, o NoV afetou igualmente crianças e adultos como descrito em outros
estudos de surtos de NoV (Green et al., 2001; Wilhelmi et al., 2003; Froggat et al., 2004;
Lopman et al., 2004; Chan et al., 2006). Uma interessante observação que deve ser
considerada é a presença concomitante de sintomas respiratórios sugerindo a co-infecção com
vírus respiratórios em crianças de até 9 anos, o que foi previamente descrito por Victória et al.
(2007) em um estudo realizado em crianças que foram hospitalizadas em Rio de Janeiro.
65
Embora o vômito tenha sido descrito como principal manifestação clínica geralmente
observada em crianças (Moreno-Espinosa et al., 2004), neste estudo mais de 50% dos adultos
foi acometida por vômito. E quando comparamos os casos positivos para NoV com os casos
negativos, assim como para as outras manifestações clínicas como febre e dor abdominal, não
encontramos significância estatística.
O protocolo usado para a detecção do NoV (região B) tem sido um bom método de
triagem pois detecta os dois genogrupos prevalentes em uma única reação de PCR. A
genotipagem dos NoVs foi realizada utilizando o protocolo segundo Vinjé et al.(2004),
descrito como mais adequado para caracterização dos genótipos de NoV (Zheng et al., 2006).
O GII.4 caracterizado neste estudo revelou que há circulação do mesmo genótipo desde, pelo
menos ,1997 no estado do Rio de Janeiro, quando Gallimore et al.(2004) detectaram esse
genótipo em um dos surtos de gastroenterite ocorridos em uma creche na cidade do Rio de
Janeiro.
Na primeira semana de junho de 2005 o LVC-LRRR recebeu dez amostras de Carmo,
região serrana do estado do Rio de Janeiro, das quais oito (80%) foram positivas para NoV.
Duas destas amostras foram seqüenciadas (dados não demostrados) e o genótipo GII.4 foi
detectado e as seqüências foram inseridas na árvore filogenética do estudo (Figura 8). Essas
informações foram importantes, pois reforçam os nossos resultados demonstrando que há
circulação deste genótipo no Estado e corrobora com os dados da prevalência deste genótipo
no mundo (Bull et al., 2006; Kroneman et al., 2006).
O uso da RT-PCR, tanto para região B para detecção como para região D para
genotipagem dos NoVs utilizando o mesmo cDNA, mostra que esse método poderá ser
utilizado no diagnóstico laboratorial. Este procedimento, usando um iniciador randômico para
a obtenção do cDNA, reduz o custo do diagnóstico na rotina para detecção dos diferentes
66
vírus que são responsáveis por casos de gastroenterite aguda e permite a detecção da
ocorrência de co-infecção.
Neste estudo detectamos somente um caso de co-infecção NoV e AdV entérico.
Embora as co-infecções entre vírus gastroentéricos sejam bem documentadas (Oh et al., 2003;
De Grazia et al., 2004; Froggatt et al., 2004; Phan et al., 2004; Gabbay et al., 2005; Liu et al.,
2006), a detecção de um vírus geralmente resulta no término da investigação para outros
agentes infecciosos.
A técnica de qPCR tem sido apontada como mais sensível e mais rápida do que a
PCR, sendo capaz de detectar até 10 cópias do transcrito (Kageyama et al., 2003; Trujillo et
al., 2006). Neste estudo, a detecção na qPCR e da PCR convencional obtiveram o mesmo
percentual de detecção 33/50 (66%). Este resultado pode ser explicado porque as amostras
continham título viral acima do limite de detecção de ambas as técnicas. Com quantificação
entre 104 a 109 partículas virais por grama de fezes. A vantagem da técnica do qPCR é a
possibilidade de detectar e quantificar partículas virais em tempo real, ser mais rápida e com
menor risco de contaminação pós-reação.
Neste estudo embora tenha havido um discreto declínio na quantificação das partículas
virais nas amostras positivas, não houve significância estatística quando comparamos a
freqüencia das amostras positivas com a freqüencia das amostras negativas em relação ao
número de dias de diarréia. De acordo com Rockx et al.(2002) os NoVs podem ser
eliminados por até 22 dias depois da infecção e as amostras do estudo tinham até nove dias de
doença. Entretanto, alguns autores descrevem que o título de excreção pode não estar
relacionado diretamente com os dias da infecção e sim com uma série de fatores como idade,
pacientes imunocomprometidos e hospitalizados, com diarréia prolongada e ainda tentando
relacionar essas altas taxas de excreção ao GII.4 quando comparado as taxas de excreção pelo
GI (Chan et al., 2006; Lee et al., 2007).
67
Os nossos resultados revelam a importância de investigar a presença de outros vírus
diferente dos RV-A nos surtos de gastroenterite aguda, a fim de estabelecer medidas
preventivas para evitar a disseminação da infecção e para o conhecimento da circulação de
outros agentes virais causadores de gastroenterite aguda. O diagnóstico rápido e eficiente
usando uma reação de transcrição reversa com iniciadores randômico seguido por uma reação
de PCR convencional incentivou-nos a extender a vigilância para outros agentes virais e
juntamente com ferramentas epidemiológicas foi possível determinar uma relação de causa e
efeito entre a gastroenterite e o NoV GII.4 identificado.
68
7 CONCLUSÕES
•
O alto percentual de positividade (92%) das primeiras amostras investigadas no
laboratório, originárias dos contatos do primeiro caso ocorrido na creche do município de
Resende, evidenciou a ocorrência de um surto de gastroenterite aguda na região do Médio
Paraíba.
•
A detecção de NoV em 66% dos casos de gastroenterite aguda provenientes dos
municípios de Resende, Piraí e Rio Claro no Estado do Rio de Janeiro demonstraram a
circulação deste vírus na região e caracterizaram outros pequenos surtos e casos
esporádicos nestes municípios.
•
A utilização de um iniciador randômico pd(N)6 para transcrição reversa se mostrou útil e
econômico na determinação do agente etiológico viral em um surto de gastroenterite
aguda, permitindo a realização de diversos métodos de detecção, quantificação e
caracterização molecular dos vírus investigados a partir de um único cDNA.
•
O diagnóstico de NoV pelo método qualitativo de RT-PCR apresentou 100% de
concordância com o método quantitativo utilizando o sistema TaqMan, sugerindo a
utilização do primeiro para o diagnóstico de NoV.
•
A detecção quantitativa de NoV demonstrou uma alta taxa de eliminação viral nas fezes
variando de 104 a 109 partículas virais .
•
Não houve significância estatística na positividade das amostras pelo qPCR quando
comparamos a excreção de partículas virais com menos de cinco dias de diarréia e
amostras dos casos com cinco dias ou mais.
69
•
O seqüenciamento de um fragmento da região do genoma que codifica para a proteína do
capsídeo viral (região D) permitiu a caracterização molecular do NoV demonstrando a
circulação do genótipo GII.4 o que confirma a distribuição global desse vírus.
•
Percentual de similaridade de 100% de aminoácidos entre as amostras do estudo corrobora
a ocorrência de um surto na região.
•
Vômito, febre e dor abdominal foram as principais manifestações clínicas observadas
acompanhando os quadros de gastroenterite aguda, pelo NoV embora não tenha sido
evidenciada significância estatística quando os casos positivos foram comparados com os
negativos.
•
As manifestações como tosse e coriza observadas no grupo etário de um a nove anos,
sugerem a associação destas infecções com agentes etiológicos de infecções respiratórias.
•
A distribuição por grupo etário demonstrou a ocorrência de NoV em menores de um ano
de idade e adultos de até 65 anos.
•
Os resultados obtidos neste estudo alertam a necessidade do estabelecimento do
diagnóstico de NoV em surtos de gastroenterite aguda de forma a se determinar a real
importância epidemiológica destes vírus neste quadro clínico.
70
8 PERSPECTIVAS
Continuar investigando a prevalência de NoV na população do estado do Rio de
Janeiro e outros estados do Brasil nos casos de gastroenterite aguda recebidos no LVC-LRRR.
Participar em colaboração com Instituto Malbran na Argentina de um estudo para determinar
quais genótipos de norovírus estão circulando no Brasil e na Argentina. E conduzir um estudo
retrospectivo dos últimos dez anos das amostras de casos de gastroenterite aguda recebidas no
laboratório.
71
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Adler JL, Zickl R. Winter vomiting disease. J Infect Dis 1969; 119: 668-673.
Ando T, Jin Q, Gentsch JR. Epidemiologic applications of novel molecular methods to detect
and differentiate small round structured viruses (Norwalk-like) J Med Virol 1995; 47:145152.
Ando T, Noel JS, Fankhauser RL. Genetic classification of “Norwalk-like viruses. J Infect
Dis 2000; 181: S336-348.
Atmar RL, Estes MK. Diagnosis of no cultivatable gastroenteritis viruses, the human
caliciviruses. Clin Microbiol Rev 2001; 14: 15-37.
Beller M, Ellis A, Lee SH. Outbreak of viral gastroenteritis due to a contaminated well.
International consequences. JAMA 1997; 278: 563-568.
Bertolotti-Ciarlet A, Crawford SE, Hutson AM, Estes MK. The 3’ end of Norwalk virus
mRNA contains determinants that regulate the expression and stability of the viral capsid
protein VP1: a novel function for the VP2 protein. J Virol 2003; 77: 1603-1615.
Bereciartu A, Bok K, Gomez J. Identification of viral agents causing gastroenteritis among
children in Buenos Aires, Argentina. J Clin Virol. 2002; 25: 197-203.
Beuret C, Kohler D, Baumgartner A, Lüthi TM. Norwalk-like virus sequences in
mineral waters: one-year monitoring of three brands. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 19251931.
72
Blacklow NR, Cukor G, Bedigian MK. Immune response and prevalence of antibody to
Norwalk enteritis virus as determined by radioimmunoassay. J Clin Microbiol 1979; 10: 903909.
Bon F, Ambert-Balay K, Giraudon H, Kaplon J, Le Guyader S, Pommepuy M, Gallay A,
Vaillant V, de Valk H, Chikhi-Brachet R, Flahaut A, Pothier P, Kohli E. Molecular
epidemiology of caliciviruses detected in sporadic and outbreak cases of gastroenteritis in
France from December 1998 to February 2004. J Clin Microbiol 2005; 43:4659-4664.
Boom R, Sol CJA, Salimans MMM, Jansen CL, Wertheim-Van Dillen PME, Van Der Noorda
AJ. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol 1990; 28:
495-503.
Borges AM, Teixeira JM, Costa PS, Giugliano LG, Fiaccadori FS, Franco Rde C, Brito WM,
Leite JPG, Cardoso DD. Detection of calicivirus from fecal samples from children with acute
gastroenteritis in the West Central region of Brazil. Men Inst Oswaldo Cruz 2006; 101: 721724.
Burton-MacLeod JA, Erim MK, Rachel SB, Leslie AH, Roger IG, Ando T. Evolution and
comparision of two commercial enzyme-linked immunosorbent assay kits for detection of
antigenically diversy human noroviruses in stool samples. J Clin Microbiol 2004; 42: 25872595.
Bull RA, Tu ET, McIver CJ, Rawlinson WD. White PA. Emergence of a new norovirus
genotype II.4 variant associated with global outbreaks of gastroenteritis. J Clin Microbiol
2006; 44: 327-333.
Cardoso DDP, Borges AMT. Calicivírus Humanos. Rev Pat Trop 2005; 34: 17-26.
Castilho JG, Munford V, Resque HR, Fagundes-Neto U, Vinje J, Racz ML.Genetic diversity
of Norovirus among children with gastroenteritis in São Paulo State, Brazil. J Clin Microbiol
2006; 44: 3947-3953.
73
Caul EO, Appelenton H. The electron microscopical and physical characteristics of small
round human fecal viruses: an interim scheme for classification. J Med Virol 1982; 9: 257265.
Caul EO. Viral gastroenteritis: small round structured viruses, caliciviruses and astroviruses.
Part I. The clinical and diagnostic perspective. J Clin Pathol 1996; 49: 874-880.
Centers for Disease Control and Prevention. “Norwalk-like viruses:” public health
consequences and outbreak management. MMWR 2001; 50.
Chan MC, Sung JJ, Lam RK, Chan PK, Lee NL, Lai RW, Leung WK. Fecal viral load and
norovirus-associated gastroenteritis. Emerg Infect Dis 2006; 12: 1278-1280.
Cheesbrough JS, Barkess-Jones L, Brown DW. Possible prolonged environmental survival of
small round structured viruses [letter]. J Hosp Infect 1997; 35: 325-326.
Clark B, McKendrick M. A review of viral gastroenteritis. Curr Opin Infec Dis 2004; 17: 461469.
Clark SK, Cook GT, Egglestone SI. A virus from epidemic vomiting disease. Br Med J 1972;
3: 86-89.
D`Souza DH, Sair A, Williams K, Papafragkou E, Jean J, Moore C, Jaykus LA. Persistence
of caliciviruses on environmental surfaces and their transfer to food. Inter J of Food Microbiol
2006; 108: 84-91.
Daniels NA, Bergmire-Sweat DA, Schwab KJ. A foodborne outbreak of gastroenteritis
associated with Norwalk-like viruses: first molecular trace back to deli sandwiches
contaminated during preparation. J Infect Dis 2000; 181:1467-1470.
de Bruin E, Duizer E, Vennema H, Koopmans MP. Diagnosis of Norovirus outbreaks by
commercial ELISA or RT-PCR. J Virol Methods 2006; 137: 259-264.
74
De Grazia S, Giammanco GM, Colomba C, Cascio A, Arista S. Molecular epidemiology of
astrovirus infection in Italian children with gastroenteritis. Clin Microbiol Infect 2004; 10:
1025-1029.
De Leon R, Matsui SM, Baric RS. Detection of Norwalk virus in stool specimens by reverse
transciptase-polymerase chain reaction and non radioactive oligoprobes. J Clin Microbiol
1992; 30: 151-3157.
De Wit MA, Koopmans MP, Kortbeek LM, Van Leeuwen NJ, Bartelds AL, Van Duynhoven
YT. Gastroenteritis in sentinel general practices, The Neatherlands. Emerg Infect Dis 2001; 7:
82-91.
Dingle KE, Lambden PR, Caul EO, Clarke IN. Human enteric Caliciviridae: The complete
genome sequence and expression of virus-like particles from a genetic group II small round
structured virus. J Gen Virol 1995; 76: 2349-2355.
Doane FW. Electron microscopy for the detection of gastroenteritis viruses. In: Kapikian AZ,
editor. Viral Infection of the gastrointestinal tract. New York: Marcel Dekker 1994; 101-131.
Dolin R, Blacklow NR, Dupont H. Transmission of acute infectious nonbacterial
gastroenteritis to volunteers by oral administration of stool filtrates. J Infect Dis1971; 123:
307-312.
Dolin R, Blacklow NR, Dupont H. Biological properties of Norwalk agent of acute infectious
nonbacterial gastroenteritis. Proc Soc Exp Biol Med 1972; 140: 578-583.
Dolin R, Reichman KD, Treanor JJ. Detection by immune electron microscopy of the Snow
Mountain agent of acute viral gastroenteritis. J Infect Dis 1982; 146:184-189.
Doultree JC, Druce JD, Birch CJ, Bowden DS, Marshall JA. Inactivation of feline Calicivirus,
a Norwalk virus surrogate. J Hosp Infect 1999; 41: 51-57.
Duizer E, Bijkerk P, Rockx B, De Groot A, Twisk F, Koopmans M. Inactivation of
caliciviruses. Appl Environ Microbiol 2004; 70: 4538-4543.
75
Fankhauser RL, Noel JS, Monroe SS, Ando T, Glass RI. Molecular epidemiology of
"Norwalk-like viruses" in outbreaks of gastroenteritis in the United States. J Infec Dis 1998;
178: 1571–1578.
Fankhauser RL, Monroe SS., Noel JS, Humphrey CD, Bresee JS, Parashar UD.
Epidemiologic and molecular trends of "Norwalk-like viruses" associated with outbreaks of
gastroenteritis in the United States. J Infec Dis 2002; 186: 1-7.
Flewett, TH e Davies, H. Letter: Caliciviruses in man. Lancet 1976; i: 311.
Froggatt P.C., Barry Vipond I., Ashley C.R., Lambden P.R., Clarke I.N. and Caul E.O.
Surveillance of norovirus infection in a study of sporadic childhood gastroenteritis in South
West England and South Wales, during one winter season (1999-2000). J Med Virol 2004;
72: 307-311.
Fruhwirth M, Karmaus W, Moll-Schuler I, Brosl S, Mutz I. A prospective evaluation of
community acquired gastroenteritis in pediatric practices impact and disease burden of
rotavirus infection. Arch Dis Child 2001; 84: 393-397
Gabbay YB, Glass RI, Monroe SS. Prevalence of antibodies to Norwalk virus among
Amerindians in isolated Amazonian communities. Am J Epidemiol 1994; 139: 728-733.
Gabbay YB, Luz CR, Costa IV, Cavalcante-Pepino EL, Sousa MS, Oliveira KK, Wanzeller
AL, Mascarenhas JD, Leite JP, Linhares AC. Prevalence and genetic diversity of astroviruses
in children with and without diarrhea in São Luis, Maranhão, Brazil. Mem Inst Oswaldo Cruz
2005; 100: 709-714.
Gallimore CI, Barreiros MA, Brown DW, Nascimento JP, Leite JP. Noroviruses associated
with acute gastroenteritis in a children's day care facility in Rio de Janeiro, Brazil. Braz J Med
Biol Res 2004; 37: 321-326.
76
Glass RI, Noel J, Ando T, Fankhauser R, Belliot G, Mounts A, Parashar UD, Bresee JS,
Monroe SS. The epidemiology of enteric caliciviruses from humans: a reassessment using
new diagnostics. J Infect Dis 2000; 181: S254-61.
Goodgame R. Norovirus gastroenteritis. Curr Gastroenterol Rep 2006; 9: 401- 408.
Gordon I, Ingraham HS, Korns RF. Transmission of epidemic gastroenteritis to human
volunteers by oral administration of fecal isolates. J Exp Med 1947; 86: 409-422.
Gordon I, Patterson PR, Whitney E. Immunity in volunteers recovered from nonbacterial
gastroenteritis. J Clin Invest 1956; 35: 200-205.
Green J, Norcott JP, Lewis D. Norwalk-like viruses: Demonstration of genomic diversity by
polymerase chain reaction. J Clin Microbiol 1993; 31: 3007-3012.
Green J, Gallimore CI, Norcott JP. Broadly reactive reverse transcriptase polymerase chain
reaction for diagnosis of SRSV- associated gastroenteritis. J Med Virol 1995; 47: 392-398.
Green KY, Ando T, Balayan MS, Berke T, Clarke IN, Estes MK, Matson DO, Nakata S, Neill
JD, Studdert MJ, Thiel HJ. Taxonomy of the Caliciviruses. J Infec Dis 2000;181: S322-330.
Green KY, Chanock RM, Kapikian AZ. Human Caliciviruses. In: KNIPE DM, Howley PM,
Chanock RM, Melnick JL, Monath TP, Roizman B, Straus SE. (Eds.). Fields in Virology.
Philadelphia, Lippincott-Raven Publishers, 4th (ed.) 2001Vol.1, p. 841-874.
Greenberg HB, Valdesuso J, Yolken RH, Gangarosa E, Gary W, Wyatt RG, Konno T, Suzuki
H, Chanock RM, Kapikian AZ. Role of Norwalk virus in outbreaks of nonbacterial
gastroenteritis. J Infect Dis 1979; 139: 564-568.
Greenberg HB, Valdesuso JR, Kalica AR, Wyatt RG, Mc-Auliffe VJ, Kapikian AZ, Chanock
RM. Proteins of Norwalk virus. J Virol 1981; 37: 994-999.
Gunson RN, Miller J, Carman WF. Comparison of real-time PCR and EIA for the detection of
outbreaks of acute gastroenteritis caused by norovirus. Commun Dis Public Health 2003; 6:
297-299.
77
Hale AD, Tanaka TN, Kitamoto N. Identification of an epitope common to genogroup I
“Norwalk-like viruses”. J Clin Microbiol 2000; 38:1656-1660.
Hall TA. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program
for Windows 95/98/NT. Nucl Acids Symp Ser 1999; 41: 95-98.
Hardy ME. Norovirus protein structure and function. FEMS Microbiol Lett 2005; 253: 1- 8.
Ho MS, Glass RI, Monroe SS. Viral gastroenteritis aboard a cruise chip. Lancet 1989; 2: 961965.
Hoebe CJ, Vennema H, de Roda Husman AM, van Duynhoven YT. Norovirus outbreak
among primary school children who had played in a recreational water fountain. J Infect Dis
2004;189: 699-705.
Jiang X, Graham DY, Wang K, Estes MK. Norwalk virus genome cloning and
characterization. Science 1990; 250:1580-1583.
Jiang X, Wang J, Graham DY, Estes MK. Detection of Norwalk virus in stool by polymerase
chain reaction. Clin Microbiol 1992a; 30: 2529-2534.
Jiang X, Wang M, Graham DY, Estes MK. Expression, self-assembly, and antigenicity of
Norwalk virus capsid protein. J Virol 1992b; 66: 6527-6532.
Jiang X, Wang M, Wang K, Estes MK. Sequence and genomic organization of Norwalk virus.
Virology 1993; 195: 51-61.
Jiang X, Wilton N, Zhong WM, Farkas T, Huang PW, Barrett E, Guerrero M, Ruiz-Palacios
G, Green KY, Green J, Hale AD, Estes MK, Pickering LK, Matson DO. Diagnosis of human
caliciviruses by use of enzyme immunoassays. J Infect Dis 2000; 181: 349-359.
Jones EL, Kramer A, Gaither M, Gerba CP. Role of fomite contamination during an outbreak
of norovirus on houseboats. Int J Environ Health Res 2007; 17:123-131.
78
Jordan WS, Gordon I. A study of illness in a group of Cleveland families. VII.Transmission
of acute nonbacterial gastroenteritis to volunteers: Evidence for two different etiological
agents. J Exp Med 1953; 98: 461-475.
Kageyama T, Kojima S, Shinohara M, Uchida K, Fukushi S, Hoshino F; Takeda N, Katayama
K. Broadly reactive and higly sensitive assay for Norwalk-like viruses based on real-time
quantitative reverse transcription-PCR. J Clin Microbiol 2003; 41: 1548-1557.
Kappikian AZ, Wyatt RG, Dolin R, Thornhill TS, Kalica ARL, Chanock RM. Visualization
by immune electron microscopy of 27 nm particle associated with acute infections
nonbacterial gastroenteritis. J Virol 1972; 10: 1075-1081.
Kapikian AZ, Gerin JL, Wyatt RG, Thornhill TS, Chanock RM.Density in cesium chloride of
the 27 nm "8FIIa" particle associated with acute infectious nonbacterial gastroenteritis:
determination by ultra-centrifugation and immune electron microscopy. Proc Soc Exp Biol
Med 1973; 142: 874-7.
Kapikian AZ. Norwalk and Norwalk-like viruses. In: Kapikian AZ, ed. Virus Infections of the
Gastrointestinal Tract. New York: Marcel Dekker, 1994: 471-518.
Kapikian AZ, Estes MK, Chanock RM. Norwalk group of viruses. In: Fields Knipe BN,
Howley PM et al., eds. Virology. 1996; 3rd Vol 2. New York: Lippincott-Raven, 1996: 783810.
Kaplan JE, Gary GW, Baron RC, Singh N, Schonberger LB, Feldman R, Greenberg HB.
Epidemiology of Norwalk gastroenteritis and role of Norwalk virus in outbreaks of acute
gastroenteritis. Ann Intern Med 1982; 96: 756-761.
Keswick BH, Satterwhite TK, Johnson PC. Inactivation of Norwalk virus in drinking water by
chlorine. Appl Environ Microbiol 1985; 50: 261-264
Koopmans M. Molecular Epidemiology of human enteric caliciviruses in The Netherlands. In:
Gastroenteritis Viruses. Chichester: Wiley. 2001; 197-218.
79
Koopmans M, Duizer E. Foodborne viruses: an emerging problem. Int J Food Microbiol
2004; 90: 23-41.
Kroneman A, Vennema H, Harris J, Reuter G, von Bonsdorff CH, Hedlund KO, Vainio K,
Jackson V, Pothier P, Koch J, Schreier E, Bottiger BE, Koopmans M. Food-borne viruses in
Europe network. Increase in norovirus activity reported in Europe. Euro Surveill 2006; 11:
E061214.1
Kumar S, Tamura K, Jakobsen IB, Nei M. MEGA 2: molecular evolutionary genetics analysis
software. Bioinformatics 2001; 17: 1244-1245.
Lambden PR, Caul EO, Ashley CR, Clarke IN. Sequence and genome organization of a
human small round-structured (Norwalk-like) virus. Science 1993; 259: 516-519.
Lee N, Chan MCW, Wong B, Choi KW, Sin W, Lui G, et al. Fecal viral concentration and
diarrhea in norovirus gastroenteritis. Emerg Infect Dis 2007; 13:1399-1401
Linhares AC. Epidemiologia das infecções por rotavírus no Brasil e os desafios para o seu
controle. Cad Saúde Pública 2000; 16: 629-646.
Liu C, Grillner L, Jonsson K, Linde A, Shen K, Lindell AT, Wirgart BZ, Johansen K.
Identification of viral agents associated with diarrhea in young children during a winter
season in Beijing, China. 2006; J Clin Virol 35: 69-72.
Lopez L, Castilho FJ, Fernadez MA, Clvel A, Rubio MC, Gomez-Lus R, Cutillas B.
Astrovirus infection among children with gastroenteritis in the city of Saragoza, Spain. Eur J
Clin Microbiol Infect Dis 2000; 19: 545-547.
Lopman BA, Brown DW, Koopmans M. Human calicivirus in Europe. J Clin Virol 2002; 24:
137-160.
Lopman BA, Reacher MH, Vipond IB, Sarangi J, Brown DW. Clinical manifestation of
norovirus gastroenteritis in health care settings. Clin Infect Dis 2004; 39: 318-24.
80
Madeley CR, Cosgrove BP. Caliciviruses in man. [Letter] Lancet 1976; i: 199-200.
Marks PJ, Vipond IB, Carlisle D, Deakin D, Fey RE, Caul EO. Evidence for airborne
transmission of Norwalk-like virus (NVL) in a hotel restaurant. Epidemiol Infect 2000; 124:
481-487.
Monroe SS, Ando T, Glass RI. Introduction: human enteric caliciviruses an emergency
pathogen whose time has come. J Infect Dis 2000; 181: 249-251.
Moreno-Espinosa S, Farkas T, Jiang X. Human caliciviruses and pediatric gastroenteritis.
Semin Pediatr Infect Dis 2004; 15: 237-245.
Myrmel M, Rimstad E, Estes M, Skjerve E, Wasteson Y. Prevalence of serum antibodies to
Norwalk virus among Norwegian military recruits. Int J Food Microbiol 1996; 29: 233-240.
Nguyen VM, Nguyen VT, Huynh PL, Dang DT, Nguyen TH, Phan VT, Nguyen TL, Le TL,
Ivanoff B, Gentsch JR, Glass RI. Vietnam Rotavirus Surveillance Network. The
epidemiology and disease burden of rotavirus in Vietnam: Sentinel Surveillance at 6
hospitals. J Infect Dis 2001; 183: 1707-1172.
Noel JS, Lee TW, Kurtz JB, Glass RI, Monroe SS. Typing of human astroviruses from
clinical isolates by enzyme immunoassay and nucleotide sequencing. J Clin Microbiol 1995;
33: 797-801.
Noel JS, Fankhauser RL, Ando T. Identification of a distinct common strain of “Norwalk-like
viruses” having a global distribution. J Infect Dis 1999; 179:1334-1344.
Oh DY, Gaedicke G, Schreier E. Viral agents of acute gastroenteritis in German children:
prevalence and molecular diversity. J Med Virol 2003; 71: 82-93.
Okitsu-Negishi S, Nguyen TA, Phan TG., Ushijima H. Molecular epidemiology of viral
gastroenteritis in Asia. Pediatr Int 2004; 46: 245-252.
81
O' Ryan ML, Mamani N, Gaggero A, Avendano LF, Prieto S, Pena A, Jiang X, Matson DO.
Human caliciviruses are a significant pathogen of acute sporadic diarrhea in children of
Santiago, Chile. J Infect Dis 2000; 182: 1519-1522.
Pang XL, Honma S, Nakata S, Vesikari T. Human caliciviruses in acute gastroenteritis of
young children in the community. J Infect Dis 2000; 181: 288-294.
Pang XL, Preiksaitis JK, Lee B. Multiplex real time RT-PCR for the detection and
quantitation of norovirus genogroups I and II in patients with acute gastroenteritis. J Clin
Virol 2005; 33: 168-171.
Parashar UD, Dow L, Fankhauser RL. An outbreak of viral gastroenteritis associated with
consumption of sandwiches: Implications for the control of transmission by food handlers.
Epidemiol Infect 1998; 121: 615-621.
Parashar UD, Li JF, Cama R, Dezalia M, Monroe SS, Taylor DN, Figueroa D, Gilman RH,
Glass RI. Human caliciviruses as a cause of severe gastroenteritis in Peruvian children. J
Infect Dis 2004; 190: 1088-1092.
Parks CG, Moe CL, Rhodes D, Lima A, Barrett L, Tseng F, Baric R, Talal A, Guerrant, R.
Genomic diversity of "Norwalk like viruses" (NLVs): pediatric infections in a Brazilian
shantytown. J Med Virol 1999; 58: 426-434.
Pelosi E, Lambden PR, Caul EO. The seroepidemiology of genogroup I and genogroup II
Norwalk-like viruses in Italy. J Med Virol 1999; 58: 93-99.
Pereira HG, Azeredo RS, Leite JP. Electrophoretic study of the genome of human rotaviruses
from Rio de Janeiro, São Paulo and Para, Brazil. J Hyg 1983; 90:117-125.
Pereira HG, Azeredo RS, Leite JP, Andrade ZP, De Castro L. A combined enzyme
immunoassay for rotavirus and adenovirus (EIARA). J Virol Methods 1985; 10: 21-28.
82
Phan TG, Okame M, Nguyen TA, Maneekarn N, Nishio O, Okitsu S, Ushijima, H. Human
astrovirus, norovirus (GI, GII), and sapovirus infections in Pakistani children with diarrhea. J
Med Virol 2004; 73: 256-261.
Ponka A, Maunula L, Von Bonsdorff CH, Lyytikainen O. Outbreak of calicivirus
gastroenteritis associated with eating frozen raspberries. Euro surveill 1999; 4: 66-69.
Prasad BV, Hardy ME, Dokland T, Bella J, Rossmann MG, Estes MK. X-ray crystallographic
structure of the Norwalk virus capsid. Science 1999; 286: 287-290.
Reimann HA, Hodges JH, Price AH. Epidemic diarrhea, nausea, and vomiting of unknown
cause. JAMA 1945a; 127: 1-6.
Reimann HA, Hodges JH, Price AH. The cause of epidemic diarrhea, nausea, and vomiting
(viral dysentery?). Proc Soc Exp Biol Med. 1945b; 59: 8-9.
Richards AF, Lopman B, Gunn A, Curry A, Ellis D, Cotterill H, Ratcliffe S, Jenkins M,
Appleton H, Gallimore CI, Gray JJ, Brown DW. Evaluation of a commercial ELISA for
detecting Norwalk-like virus antigen in faeces. J Clin Virol 2003; 26: 109-115.
Rockx B, De Wit M, Vennema H, Vinje J, de Bruin E, Van Duynhoven Y, Koopmans M.
Natural history of human calicivirus infection: A prospective cohort study. Clin Infect Dis
2002; 35: 246–253.
Rohayem J, Berger S, Juretzek T, Herchenroder O, Mogel M, Poppe M, Henker J, Rethwilm
A. A simple and rapid single-step multiplex RT-PCR to detect norovirus, astrovirus and
adenovirus in clinical stool samples. J Virol Meth 2004; 118: 49-59.
Sharp TW, Hyams KC, Watts D. Epidemiology of Norwalk virus during an outbreak of acute
gastroenteritis aboard a US aircraft carrier. J Med Virol 1995; 45: 61-67.
Soares CC, Santos N, Beard RS, Albuquerque MCM, Adriana GM, Rocha LN, Ramírez ML,
Monroe SS, Roger IG, Gentsch J. Norovirus Detection and Genotyping for Children with
Gastroenteritis, Brazil. Emerg Infect Dis 2007; 13: 1245 – 1246.
83
Steinhoff MC, Douglas RG Jr, Greenberg HB, Callahan DR. Bismuth subsalicylate therapy of
viral gastroenteritis. Gastroenterology 1980; 78: 1495-1499.
Straub TM, Höner ZU, Bentrup K, Orosz-Coghlan P, Dohnalkova A, Mayer Bk,
Bartholomew RA, Valdez CO, Bruckner-Lea CJ, Gerba CP, Abbaszadegan M, Nickerson
CA. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis 2007; 13:
396-403.
Tacket CO, Mason SH, Losonsky G, Estes MK, Levine MM, Arntzen JC. Human immune
responses to a novel Norwalk virus vaccine delivered in transgenic potatoes. J Infec Dis 2000;
182: 302-5.
Tacket CO. Plant-derived vaccines against diarrhoeal diseases. Vaccine 2005; 23: 1866-1869.
Talal AH, Moe CL, Lima AA, Weigle KA, Barrett L, Bangdiwala SI, Estes MK, Guerrant
RL. Seroprevalence and seroincidence of Norwalk-like virus infection among Brazilian
infants and children. J Med Virol 2000; 61: 117-124.
Thornhill TS, Wyatt RG, Kalica AR. Detection by immune electron microscopy of 26-to 27
nm virus like particles associated with two family outbreaks of gastroenteritis. J Infect Dis
1977; 135: 20-27.
Thornton AC, Jennings- Conklin KS, McCormick MI. Norovirus: Agents in outbreaks of
acute gastroenteritis. Disaster Manag & Response 2004, 2: 4-9.
Thruston-Enriquez JA, Haas CN, Jacangelo J, Riley K, Gerba CP. Inactivation of feline
calicivirus and adenovirus type 40 by UV radiation. Appl Environ Microbiol 2003; 69: 577582.
Timenetsky MCS, Kisielius JJ, Grisi SJ, Escobar AMU, Ueda M, Tanaka H. Rotavírus,
Adenovírus, Astrovírus, Calicivírus e “Small Round Virus particles” em fezes de crianças,
com e sem diarréia aguda, no período de 1987 a 1988, na grande São Paulo. Rev Inst Med
Trop São Paulo 1993; 35: 275-280.
84
Trevino M, Prieto E, Penalver D, Alguilera A, Garcia-Zabarte A, Garcia-Riestra C, Regueiro
BJ. Diarrohea caused by adenovirus and astrovirus in hospitalized immmunodeficient
patients. Enferm Infecc Microbiol Clin 2001; 19: 7-10.
Trujillo AA, McCaustland KA, Zheng DP, Hadley LA, Vaughn G, Adams SM, Ando T,
Glass RI, Monroe SS. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection,
quantification, and typing of norovirus.J Clin Microbiol 2006; 44: 1405-1142.
Turcios RM, Widdowson MA, Sulka AC, Mead PS, Glass RI. Reevaluation of
epidemiological criteria for identifying outbreaks of acute gastroenteritis due to norovirus:
United States, 1998-2000. Clin Infect Dis 2006; 42: 970-971.
Vainio K, Myrmel M. Molecular Epidemiology of Norovirus Outbreaks in Norway during
2000 to 2005 and Comparison of Four Norovirus Real-Time Reverse Transcriptase PCR
Assays. J Clin Microbiol 2006; 44: 3695-3702.
Vial PA, Kotloff KL, Tall BD, Morris JG, Levine MM. Detection by immune electron
microscopy of 27-nm viral particles associated with community-acquired diarrhea in children.
J Infect Dis 1990; 161: 571-573.
Victoria M, Carvalho-Costa FA, Heinemann MB, Leite JPG, Miagostovich MP. Prevalence
and molecular epidemiology of noroviruses in hospitalized children with acute gastroenteritis
in Rio de Janeiro, Brazil, 2004. J Pediatr Infect Dis 2007; 26: 1-5.
Vinjé J, Koopmans MP. Molecular detection and epidemiology of small round-strutured
viruses in outbreaks of gastroenteritis in the Netherlands. J Infect Dis 1996; 174: 610-615.
Vinjé J, Hamidjaja RA, Sobey MD. Development and amplification of a capsid VP1 (region
D) based reverse transcription PCR assay for genotyping of genogroup I and II noroviruses. J
Virol Meths 2004; 116: 109-117.
85
Widdowson M-A, Cramer EH, Hadley L, Bresee JS, Beard S, Burlens SN, Charles M, Chege
W, Isakbaeva E, Wright JG, Mintz E, Forney D, Massey J, Glass RI, Monroe SS. Outbreaks
of acute gastroenteritis on cruise ships and land: Identification of predominant circulating
strain of norovirus – United States, 2002. J Infect Dis 2004; 190: 27-36.
Widdowson M-A, Sulka A, Bulens SN, Beard S, Chaves SS, Hammond R, Salehi EDP,
Swanson E, Totaro J,Woron R, Mead PS, Breese JS, Monroe SS, Glass RI. Norovirus and
Foodborne Disease, United States, 1991-2000. Emerg Infect Dis 2005; 11: 95-102.
Wilhelmi I, Roman E, Sanchez-Fauquier A. Viruses causing gastroenteritis. Clin Microbiol
Infect 2003; 9: 247-262.
Wright PJ, Gunesekere IC, Doultree JC, Marshall JA. Small round-structured (Norwalk-like)
viruses and classical human caliciviruses in southeastern Australia, 1980-1996. J Med Virol
1998; 55: 312-320.
Wyatt RG, Dolin R, Blacklow NR. Comparison of three agents of acute infections
nonbacterial gastroenteritis by cross-challenge in volunteers. J Infect Dis 1974; 129: 709-714.
Wyatt RG, Greenberg HB, Dalgard DW, Allen WP, Sly DL, Thornhill TS, Chanock RM,
Kapikian AZ. Experimental infection of chimpanzees with the Norwalk agent of epidemic
viral gastroenteritis. J Med Virol 1978; 2: 89-96.
Yamazaki K, Oseto M, Seto Y. Reverse transcription-polymerase chain reaction detection and
sequence analysis of small round-structured viruses in Japan. Arch Virol 1996; 12: 271-276.
Zahorsky J. Hiperemesis hiemis or the winter vomiting disease. Arch Pediatr 1929; 46: 391395.
Zheng DP, Ando T, Fankhauser RL, Beard RS, Glass RI, Monroe SS. Norovirus classification
and proposed strain nomenclature. Virology 2006; 346: 312-323.
86
10 ANEXOS
Anexo 1- Ficha de Informações clínicas e epidemiológicas.
87
Anexo 2 - Email de aceite do trabalho científico.
Enviada: ter 25/9/2007 10:11
Para: Jose Paulo
Assunto: JMV-07-0375.R1 - Decision
25-Sep-2007
Dear Dr. Leite,
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WITH NOROVIRUSES INFECTION IN THE STATE OF RIO DE JANEIRO" in its current form for
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http://www3.interscience.wiley.com/homepages/central/cta/USscta.pdf
Please print the form, complete both sides and forward to the Production Editor, Mrs Lori Hamilton at:
[email protected] or fax to Mrs Hamilton in the United States: 001 (937) 885 3289. PLEASE ENSURE
THAT YOUR MANUSCRIPT NUMBER IS INCLUDED ON THE CORRESPONDENCE.
You will receive your typeset proofs in due course.
Thank you for your contribution.
Kind regards,
Dr. Brian Mahy
US Editor
Journal of Medical Virology
[email protected]
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Anexo 3 - PDF do artigo científico