ROSELI SANTOS DE FREITAS CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E
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ROSELI SANTOS DE FREITAS CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E PADRONIZAÇÃO DE ANTÍGENOS DE H. capsulatum VAR. capsulatum PARA O DIAGNÓSTICO DA HISTOPLASMOSE. Dissertação de Mestrado, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. Área de Concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientadora: Dra. Adriana Pardini Vicentini São Paulo 2005 1 FICHA CATALOGRÁFICA Preparada pelo Centro de Documentação – Coordenadoria de Controle de Doenças/SES reprodução autorizada pelo autor Freitas, Roseli Santos de Caracterização fenotípica e padronização de antígenos de Histoplasma capsulatum var. capsulatum para o diagnóstico da histoplasmose / Roseli Santos de Freitas – São Paulo, 2005. Dissertação (mestrado)—Programa de PósGraduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo. Área de concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública Orientadora: Adriana Pardini Vicentini 1. Histoplasma 2. Histoplasmose / diagnóstico 3. Antígenos 4. Testes sorológicos 5. Imunoquímica SES/CCD/CD-070/05 2 Este trabalho foi realizado na Seção de Imunologia do Serviço de Microbiologia e Imunologia da Divisão de Biologia Médica do Instituto Adolfo Lutz de São Paulo e no Laboratório de Micologia Médica (LIM-53) do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo. Apoio Financeiro: Instituto Adolfo Lutz de São Paulo- Coordenadoria de Controle de DoençasSES-SP. Projeto CTC-IAL # 107/97 e 06/04. 3 MENSAGEM 4 “Uma reflexão implica sempre em uma análise crítica do trabalho que realizamos. Se estamos fazendo uma reflexão sobre nosso trabalho estamos questionando sua validade, o significado que ele tem para nós e para com os sujeitos com quem trabalhamos, e para a comunidade da qual fazemos parte e que estamos construindo. A resposta as questões que nos propomos só pode ser encontrada em dois espaços: no da nossa prática, na experiência cotidiana da tarefa que procuramos desempenhar, e no da reflexão crítica sobre os problemas que essa prática faz surgir como desafios para nós. Questões-limites não são perguntas quaisquer. São perguntas que nascem de situações problemáticas e que, portanto, precisam ser respondidas. O que as caracteriza como problemáticas, aliás, é exatamente a necessidade de superação. Nós nos deparamos com inúmeros obstáculos em nossa vivência das situações em que nos encontramos. Só alguns deles, entretanto, merecem a denominação de problemas – são aqueles que têm uma significação especial em nossa perspectiva existencial e precisam sair de nosso caminho. Esse “tirar do caminho” um obstáculo tem sido chamado de solução do problema. Entretanto, se analisarmos bem, verificaremos que os problemas não sofrem uma solução, não são “solvidos”, não são solúveis. Eles são superáveis, devem ser superados. Quando superamos um problema, não diluímos – o que fazemos é seguir a dinâmica de um processo, no qual há como que uma absorção, um rearranjo de elementos, e em que se vai à frente de forma nova. Não deixamos para trás os elementos problemáticos; levamo-los conosco de outra maneira, incorporados á experiência, que é contínua”. Terezinha A. Rios, “O caminho educador” 5 DEDICATÓRIAS 6 Dedicatórias A Deus...sem Ti...nada é possível! Aos meus filhos Rodrigo, Rafael e André Felipe, maior conquista e razão da minha vida, pelos momentos em que não pude estar presente. Apesar de crianças sempre estavam prontos a me ajudar e compreender da maneira mais carinhosa. Amo vocês!!! A minha mãe Maria da Conceição, meu exemplo de dignidade, força e determinação. Obrigada por confiar em mim. A meus irmãos Rosemeire, Fernanda e Rildo, de perto ou de longe vocês são o meu amparo, meus companheiros nas horas felizes e nos momentos tristes. A meu cunhado Sérgio Luis e sobrinho Luis Henrique pelo incentivo e apoio durante toda esta trajetória. 7 AGRADECIMENTOS 8 Agradecimentos Especiais Ao Prof. Dr. Carlos da Silva Lacaz Que em minha carreira profissional foi o mestre que me orientou a ter a consciência da missão com o próximo, pois segundo ele, tudo que realizamos necessariamente tem que ser o melhor e “Tudo é para a glória de Deus e o bem estar da humanidade”, sendo que para conquistarmos o nosso ideal devemos nos lembrar de Camões: “As coisas árduas e lustrosas só se alcançam com trabalho e fadiga”. A Profa. Dra.Adriana Pardini Vicentini Eu creio que na vida nada é por acaso e que possuímos o que merecemos, por isso agradeço a Deus com todo meu coração e no mais intimo de minha alma a alegria de ter me concedido o melhor, ou seja, a orientação dedicada, profissional e amiga que me introduziu diretrizes e conhecimentos.que serão empregados durante toda minha vida científica. 9 Ao Prof. Dr. Cezar Mendes de Assis pela co-orientação, colaboração amiga, com opiniões enriquecedoras e essenciais no presente trabalho. Ao Prof. Dr. José Eduardo Costa Martins, Chefe do LIM-53 do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo, meu eterno agradecimento pelo apoio, confiança e incentivo. À pesquisadora Regina Tomie Kimura, Chefe da Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz, por ocasião do início de minha trajetória, minha eterna gratidão por permitir o desenvolvimento de grande parte deste trabalho junto ao Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses. Obridaga pela acolhida ... As pesquisadoras Elizabeth Maria Heins e Natalina Takahashi de Melo, pelos ensinamentos, amizade, apoio, carinho e compreensão durante estes longos anos de convivência. A amizade sincera e apoio de Simone Nunes de Azevedo, Otilia Batista e Jussara Clemente de S. P. Moraes. À Profa. Dra. Cídia Vasconcellos, pela amizade, disponibilidade e convívio agradável. Aos funcionários do Laboratório de Micologia do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo, em especial a Sra. Antônia Chagas dos Santos, Cláudia de Freitas Caetano e Creusa Paes Siqueira pela amizade, auxílio e por não terem medido esforços para me ajudar na conquista deste sonho... Aos funcionários, estagiários e pós-graduandos dos Laboratórios de Micologia e Sorologia do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo (LIM 53), Judith Maria de Jesus, Simone Rocha, Sonia Cristina Cavalcante, Vivian Ribeiro Kloth, Cecília Eugenia Charbel, Cristiane Neves Pereira, Sarah Desihee Cavalcanti, Ísis Riboldi,Teixeira, Giovana Letícia Henandez Arriagada, Mônica Martinelli Scarpelli Vidal e Kátia Cristina Dantas, pela amizade e pelos bons momentos que passamos juntos. 10 Aos colegas do Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz: Lenice Elpídio de Oliveira, Décio Fragata da Silva, Jarita de Oliveira Carvalho-Vivi e Daniele de Lima Franco meu muito obrigada pelo apoio, amizade, momentos de descontração e compreensão na execução deste trabalho. Aos funcionários da Seção de Imunologia, em especial a Sra. Irene Mara Zamboni, Srta. Lúcia Cupertino Barreto, Sr. Vasco Gouveia, pela amizade e valoroso auxílio. Obrigada por não ter medido esforços para me ajudar... Aos pesquisadores, estagiários e pós-graduandos da Seção de Imunologia do Instituto Adolofo Lutz pelo apoio, amizade e momentos de descontração. Aos docentes, funcionários, estagiários e alunos, em especial do Laboratório de Sorologia da Profa.. Dra.. Maria Aparecida Shikanai Yasuda, Claúdia de Abreu Fonseca, Aya Sadahiro e Márcia Andréia Ferreira. Ao Almir Robson Ferreira e Maria Iranides Santana de Oliveira, setor de Programação Visual, meu sincero agradecimento pela amizade e disponibilidade. As funcionárias da Seção de Coleção de Culturas do Instituto Adolfo Lutz: Lia Teixeira e Mônica Cândida Gear Gete Scola pelo inestimável auxilio na liofilização dos antígenos de Histoplasma capsulatum, obrigada pelo apoio e compreensão. À Profa. Dra. Claudete Rodrigues de Paula do Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo, Prof. Dr. Zoilo Pires de Camargo da Universidade Federal de São Paulo e Ricardo Bamman do Instituto de Infectologia Emílio Ribas, pelas sugestões apresentadas no exame de qualificação. À Dra. Maria de Fátima Costa Pires, coordenadora do Programa de PósGraduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo, pela colaboração. 11 À Secretaria de Pós-Graduação da Área de Concentração Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Coordenadoria de Controle de Doenças em especial as Sras. Tirces Francine e Liria Maria de Jesus Silva pelo atendimento sempre carinhoso e colaboração. A bibliotecária Sandra do Centro de Documentação da Coordenadoria de Controle de Doenças-SES pelas informações e auxilio. Ao Paulo César da Costa dos Santos, pelo inestimável auxílio na análise estatística dos resultados. A Beatriz Julieta Celeste, do Laboratório de Sorologia (LIM 48), pela doação de soros de pacientes com leishmaniose. Ao Instituto Adolfo Lutz, pelo auxílio financeiro, que viabilizou a execução deste trabalho. Aos pacientes que anônima e voluntariamente, entregam-se à ciência. A todos que direta ou indiretamente desenvolvimento desse trabalho. 12 contribuíram para o RESUMO Doze amostras de H. capsulatum foram avaliadas quanto aos aspectos fenotípicos e cinética de crescimento em ágar batata e ágar Sabouraud-dextrose, a 27o C, durante 45 e 90 dias respectivamente. Trinta e três porcento apresentaram textura velutínea e cotonosa, saliência e/ou elevação central, sulcos radiais, faixas concêntricas e pigmentos centrais e difusos. A microscopia óptica verificou-se hifas hialinas, delgadas, septadas, micro e macroaleuroconídios tuberculados; apresentando média de 47 dias para a fase estacionária. 67% eram cotonosas com tendência a ser plana, sendo 75% cotonosa e branca, com hifas delgadas e septadas. Antígenos de H. capsulatum foram obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), a partir das amostras cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose a 27o C durante 15 e 33 dias. A extração dos determinantes antigênicos foi realizada, cobrindo-se as culturas com solução de mertiolato-borato 1:5000 por 24 h, a temperatura ambiente. A imunoreatividade dos antígenos foi avaliada por imunodifusão dupla (ID) e immunoblotting (IB) frente a soros homólogos e heterólogos e anticorpos policlonais espécieespecíficos e heterólogos. Verificamos aumento na sensibilidade da técnica de ID quando empregamos antígeno obtido das amostras 200 e 406, em ambos os tempos de cultivos e 20 vezes concentrado, observando ainda que todos os antígenos avaliados apresentaram 100% de especificidade. Por IB, observamos intensa reatividade dos soros de pacientes com HP doença e infecção frente às frações de 74 e 120 kDa. Concluímos que para a obtenção de antígenos com boa especificidade e sensibilidade, a escolha da amostra fúngica bem como o meio de cultura assume grande importância. Além disto, a metodologia adotada para a obtenção dos mesmos mostrou-se uma alternativa de baixo custo operacional, de fácil exeqüibilidade, consumindo menor tempo para sua produção. Palavras chaves: Histoplasma, histoplasmose/diagnóstico, antígenos, testes sorológicos, imunoquímica. 13 ABSTRACT Twelve H. capsulatum samples were cultivated at 27 ºC in potato agar and in Sabouraud-dextrose agar during 33 and 90 days in order to evaluate their phenotypical aspects as well as their growth curve. Thirty three percent showed cottony texture, salience and/or semi-elevated central surface, radial groove, concentric areas, and diffuse and central pigments. By microscopic observation we verified septate, thin, hyaline hyphae and microaleuroconidia and tuberculate macroaleuroconida; showing 47 days to the stationary phase. 67% were cottony texture, plane tendency and 75% were cottony white with septate, thin hyphae. H. capsulatum antigens were obtained from isolates cultivated at 27º C on Sabouraud-dextrose agar for 15 and 33 days. After incubation mycelial cells were suspended in aqueous solution of thimerosal (1:5,000) at room temperature for 24 h. The immunoreactivity pattern of antigens were evaluated, using the immunodifusion (ID) and immunoblotting (IB) assays against homologous and heterologous serum and species-specific and heterologous polyclonal antibodies. Through ID, it was verified that the best pattern of reactivity was observed for antigens obtained with 33 days of culture from the isolates 200 and 406 and for the antigen 200 with 15 days of culture. By IB, it was observed intense reactivity of the sera from patients with HP (infection or illness) against epitopes with molecular mass from 74 to 119 kDa. It is noteworth that the antigen from sample 200, with 15 or 33 days of culture, presented the best pattern of recognition against the homologous sera. The results suggest the employment of the soluble antigen from sample 200 in the ID assay due to its good capacity to discriminate both sera from patients with HP illness and HP infection, besides its high specificity (100%) against heterologous sera. Key words: H. capsulatum var. capsulatum, histoplasmosis, antigens, imunodiagnosis. 14 LISTA DE ABREVIATURAS µL Microlitro µm Micrômetro A. fumigatus Aspergillus fumigatus A. nidulans Aspergillus nidulans A. niger Aspergillus niger Ag Antígeno Ag Hc Antígeno de H. capsulatum Ag Pb Antígeno de P. brasiliensis Aids Acquired immunodeficiency syndrome B. dermatitidis Blastomyces dermatitidis BCIP 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyphosphate BHI Brain heart infusion Bp Pares de base C. immitis Coccidioides immitis C. neoformans Cryptococcus neoformans CD Cluster de diferenciação CDC Center for Diseases Control CIE Contraimunoeletroforese Da Daltons cm Centímetro ELISA Enzyme-liked immunosorbent assay EUA Estados Unidos da América FC Fixação de complemento g Gramas GG Gomori-Crocott H Hora H. capsulatum Histoplasma capsulatum H. capsulatum var. duboisii Histoplasma capsulatum variedade H. Histoplasma capsulatum capsulatum var. capsulatum 15 capsulatum duboisii variedade HE Hematoxilina-Eosina HIV Vírus da Imunodeficiência Humana HP Histoplasmose HTT Hipersensibilidade do tipo tardio IAL Instituto Adolfo Lutz IB Immunoblotting ID Imunodifusão dupla IgG Imunoglobulina G IgM Imunoglobulina M IL-12 Interleucina 12 INF-γ Interferon gama kDa Kilo Dalton mA Miliamper mg Miligramas mL Mililitro mM Milimolar mm Milímetros NBT Azul de nitrotetrazolio NGTA Neopeptona Glicose Tiamina e Asparagina ºC Graus Celsius P. brasiliensis Paracoccidioides brasiliensis P. marneffei Penicilium marneffei p/v Peso/volume PAS Ácido Periódico de Schiff PBS Solução salina tamponada com fosfatos PBS-T Solução salina tamponada com fosfato acrescida de Tween 20 pH Concentração hidrogênio-iônica PM Peso molecular PMSF Fenil-metil-sulfonil-fluorato RAPD Randon amplified polymorphic DNA Rf Reference front 16 RIA Radioimmunoassay SAB Ágar Sabouraud-dextrose SDS Sódio Dodecil Sulfato SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com sódio dodecil sulfato Sida Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Sabouraud-tiamina-asparagina STA Temed N,N, N,’- tetrametil-etilenodiamina Th Linfócitos T helper TNF-α Fator de necrose tumoral alfa Tris Tris-(hidroxi-metil)-amino-metano V Volts v/v Volume/volume Rpm Rotação por minuto mm Milímetro 17 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Isolamento de Histoplasma capsulatum var. capsulatum de solos brasileiros 36 Tabela 2. Microepidemias de HP no Brasil (1959-1978) 38 Tabela 3. Amostras de H. capsulatum var. capsulatum 80 Tabela 4. Aspectos morfológicos das culturas de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar batata e ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, por 33 dias 95 Tabela 5. Aspectos micromorfológicos das culturas de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar batata, segundo Ridell (1950), 27oC, por 45 dias 98 Tabela 6. Aspectos macromorfológicos das culturas de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, por 90 dias. 106 Tabela 7. Dosagem protéica, segundo Bradford (1976), dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 10 e 20 vezes concentrados, cultivados em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, por 15 e 33 dias, segundo Kaufman e Standard (1978) 107 Tabela 8. Screening dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, in natura, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias 112 Tabela 9. Screening dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 10 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias 18 113 Tabela 10. Screening dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias 114 Tabela 11. Padrão de reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 10, 20 e 30 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 15 dias 116 Tabela 12. Padrão de reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias frente a soros de pacientes com histoplasmose histoplasmose infecção, pela técnica de imunodifusão dupla doença e 117 Tabela 13. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, 15 dias frente a soros de pacientes com histoplasmose doença e infecção 119 Tabela 14. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, 33 dias frente a soros de pacientes com histoplasmose doença e infecção 121 Tabela 15. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias, 19 avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose doença 123 Tabela 15 a. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias, avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose infecção 124 Tabela 15 b. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 15 dias, avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose doença 124 Tabela 15 c. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 15 dias, avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose infecção 125 Tabela 16. Perfil eletroforético observado em SDS-PAGE a 10%, dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 10 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabourauddextrose, 27ºC, por 33 dias 126 20 LISTA DE FIGURAS Figura 1. Macromorfologia das culturas 49 (A), 200 (B), 299 (C), 340 (D), 268 (E) e 406 (F) de H. capsulatum var. capsulatum cultivadas em ágar batata, 27ºC, por 33 dias 96 Figura 2. Macromorfologia das culturas 49 (A), 212 (B), 361 (C), 406 (D), 2030 (E) e RP (F) de H. capsulatum var. capsulatum cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias 96 Figura 3. Micromorfologia das culturas 49, 200, 212, 268, 299, 340, 361, 406, 584, 802, 2030 e RP de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar batata, 27ºC, por 45 dias 97 Figura 4. Curva de crescimento das amostras 49 (A) e 200 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 90 dias 99 Figura 5. Curva de crescimento das amostras 212 (A) e 268 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 90 dias 100 Figura 6. Curva de crescimento das amostras 299 (A) e 340 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 90 dias 101 Figura 7. Curva de crescimento das amostras 361 (A) e 406 (B) de H. capsulatum var. capsultum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 90 dias. 102 Figura 8. Curva de crescimento das amostras 584 (A) e 802 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 90 dias 103 21 Figura 9. Curva de crescimento das amostras 2030 (A) e RP (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 90 dias 104 Figura 10. Anverso e verso das colônias gigantes das amostras de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 90 dias 105 Figura 11. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 33 dias, frente a anticorpo policlonal anti-antígeno de H. capsulatum. 115 Figura 12. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, durante 15 dias, frente a soros de pacientes com histoplasmose doença 120 Figura 13. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, 33 dias, frente a soros de pacientes com histoplasmose doença 122 Figura 13 a. Reatividade dos exoantígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, 33 dias, frente a soros de pacientes com histoplasmose infecção 122 Figura 14. Perfil eletroforético dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27oC, 33 dias. Linha 1: Padrão de Peso Molecular; linha 2: Exoantígeno de Referência (Filtrado de Cultura de H. capsulatum var. capsulatum- 22 Faculdade de Farmácia da Universidade Estadual Paulista de Araraquara); linha 3: Ag Hc 49, linha 4: Ag Hc 200; linha 5: Ag Hc 212, linha 6: Ag Hc 268; linha 7: Ag Hc 299; linha 8: Ag Hc 340; linha 9: Ag Hc 361; linha 10: Ag Hc 406; linha 11: Ag Hc 584; linha 12: Ag Hc 802; linha 13: Ag Hc 2030 e linha 14: Ag Hc RP. Concentração dos Ag Hc aplicados nos slots 3 a 14: 10 vezes concentrados. 127 Figura 15. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 49, 10 vezes concentrado,obtido segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias 130 Figura 16. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 200, 10 vezes concentrado,obtido segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias 130 Figura 17. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 268, 10 vezes concentrado,obtido segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias 131 Figura 18. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 406, 10 vezes concentrado,obtido segundo 23 Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias 131 Figura 19. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 200, 10 vezes concentrado,obtido segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 15 dias 132 Figura 20. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 268, 10 vezes concentrado,obtido segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 15 dias 132 Figura 21. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente a antígeno da amostra 406, 10 vezes concentrado,obtido segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, por 15 dias 133 Figura 22. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de indivíduos pertencentes a um grupo de espeleólogos (1 a 17), grupo de indivíduos que trabalham com fungos (18 a 21), anticorpo policlonal anti-exoantígeno de H. capsulatum (22), pool de soros de indivíduos com leishmaniose (23), pool de soro de indivíduos saudáveis (24), frente a antígeno da amostra 200,10 vezes concentrado, cultivada em ágar Sabouraud-dextrose a 27ºC, por 33 dias 135 24 Figura 23. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-P. brasiliensis frente a soros de indivíduos pertencentes a um grupo de espeleólogos (1 a 17), grupo de indivíduos que trabalham com fungos (18 a 21) e pool de soro de indivíduos saudáveis (22), frente a exoantígeno da amostra 113 de P. brasiliensis cultivada em caldo NGTA a 36ºC, por 20 dias 135 Figura 24. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-A. fumigatus frente a soros de indivíduos pertencentes a um grupo de espeleólogos (1 a 17), grupo de indivíduos que trabalham com fungos (18 a 21) e pool de soro de indivíduos saudáveis (22), frente a exoantígeno de A. fumigatus (pool das amostras 354, 356 e 727), 10 vezes concentrado, cultivadas em caldo Sabouraud-dextrose, a 27º C, por 30 dias 136 Figura 25. Estabilidade dos antígenos das amostras de H. capsulatum, 12 meses após obtenção, frente a anticorpo policlonal anti-exoantígeno de H. capsulatum. Lâmina A: Antígenos das amostras 49, 200, 268 e 406, 20 vezes concentrado. Lâmina B: Antígenos das amostras 49, 200, 268 e 406, 10 vezes concentrado 25 137 INDICE 1.0. Introdução 30 1.1. Histórico da Histoplasmose 30 1.2. Etiologia do H. capsulatum 32 1.3. Distribuição Geográfica e Ecoepidemiologia 32 1.4. Aspectos Clínicos da Histoplasmose 39 1.4.1. Histoplasmose Infecção 40 1.4..2. Histoplasmose Doença 41 1.4.2.1. Histoplasmose Disseminada 41 1.4.2.2. Histoplasmose Disseminada Aguda 42 1.4.2.3. Histoplasmose Disseminada Sub-aguda 43 1.4.2.4. Histoplasmose Disseminada Crônica 43 1.5. Resposta Imunológica 44 1.5.1. Resposta Imune Celular 44 1.5.2. Resposta Imune Humoral 46 1.6. Tratamento da Histoplasmose 47 1.7. Diagnóstico Laboratorial da Histoplasmose 48 1.7.1. Exame Direto 48 1.7.1.2. Isolamento 51 1.7.1.3. Técnicas Sorológicas 53 1.7.1.4. Técnicas Moleculares 57 1.8. Antígenos de Histoplasma capsulatum var. capsulatum 60 2.0. Relevância 68 26 3.0. Objetivos 71 4.0. Considerações Éticas 72 5.0. Delineamento Experimental 73 6.0 Materiais e Métodos 74 6.1. Amostras Fúngicas 74 6.1.1. Amostras de H. capsulatum var. capsulatum 74 6.1.2. Amostras de Paracoccidioides brasiliensis 74 6.1.3. Amostras de Aspergillus fumigatus 74 6.2. Animais 75 6.3. Soros 75 6.3.1. Soro Controle Positivo de Referência 77 6.3.2. Soros Hiperimunes Obtidos em Coelhos 77 6.4. Aspectos Morfológicos das Amostras de H. capsulatum var. capsulatum 78 6.4.1. Cultivo das Células Fúngicas em Tubos 78 6.4.2. Cultivo das Células Fúngicas em Placas e Curva de Crescimento 78 6.4.3. Cultivo em Lâminas 78 6.5. Meios de Cultura 82 6.6. Antígenos Fúngicos 82 6.6.1. Antígeno de H. capsulatum var. capsulatum 82 6.6.2. Exoantígeno de P. brasiliensis 83 6.6.3. Exoantígeno de A. fumigatus 83 6.6.4. Antígenos de Referência de H. capsulatum 84 27 6.7. Determinação da Viabilidade Fúngica dos Antígenos 84 6.8. Determinação da Esterilidade dos Antígenos 85 6.9. Determinação de Proteínas 85 6.10. Imunodifusão Dupla em Gel de Agarose 85 6.11. Análise do Perfil Eletroforético dos Anttígenos de H. capsulatum var. capsulatum 87 6.11.1. SDS-PAGE 87 6.11.2.Immunoblotting 88 6.11.3. Detecção do Peso Molecular 90 6.12. Antissoros 90 6.12.1. Soro de Coelhos Anti- Antígeno de H. capsulatum var. capsulatum 90 6.12.2. Soro de Coelho Anti- Exoantígeno de P. brasiliensis e AntiExoantígeno de A. fumigatus 91 6.13. Purificação de Imunoglobulinas 91 6.14. Titulação dos Antissoros 92 6.15. Análise Estatística 92 7.0. Resultados 94 7.1. Aspectos Morfológicos das Amostras de H. capsulatum 94 7.2. Curva de Crescimento das Células Micelianas de H. capsulatum var. capsulatum e Aspectos Fenotípicos das Colônias Fúngicas 94 7.3. Dosagem Protéica dos Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum 107 7.4. Screening dos Antígenos de H. capsulatum 108 28 7.5. Análise do Padrão de Reatividade dos Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum 118 7.6. Perfil Eletroforético dos Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum 125 7.7. Immunoblotting para Detecção da Reatividade de Anticorpos antiH. capsulatum em Soros de Pacientes com HP doença e infecção 128 7.8. Estudo da Estabilidade dos Antígenos de H. capsulatum 137 8.0. Discussão 138 9.0. Conclusões 152 10.0. Referências Bibliográficas 154 Anexos 174 29 1.0. INTRODUÇÃO 1.1. Histórico da Histoplasmose O primeiro caso de histoplasmose (HP) foi estudado no Panamá, por Samuel Darling (1905), ao necropsiar um negro no Ancon Hospital, encontrando numerosos parasitos, redondos ou ovais, sendo na sua maioria fagocitados, observado em microscopia óptica de tecido dos pulmões, baço e fígado. Em 1906, em nova necropsia realizada na Martinica encontrou outro caso apresentando os mesmos caracteres anátomo-patológicos, ainda no mesmo ano, observou um terceiro caso, em nativo do Cantão que residia há alguns meses, no Panamá. A partir dos achados destas três necropsias, Darling individualizou esta nova doença que se caracterizava particularmente por febre irregular, com hepato-esplenomegalia acentuada e leucopenia. Do ponto de vista anatomo-patológico, a doença manifestava-se com aumento de elementos retículo-histiocitários e presença de numerosos parasitos, redondos ou ovais, muito semelhantes a leishmanias, no interior dos histiócitos, que foram considerados por Darling como protozoários. Ele procurava, nas autopsias que realizava, casos suspeitos de calazar ou leishmaniose visceral e por isso selecionava os doentes falecidos que apresentassem quadro clínico com manifestações de leucopenia, febre irregular e hepato-esplenomegalia. Ao encontrar nos tecidos lesados o microrganismo pensou, inicialmente, que se tratasse de um novo protozoário, denominando-o primeiramente de Histoplasma capsulata, a seguir corrigindo para Histoplasma capsulatum (Alves, 1996; Lacaz et al., 2002). Após os relatos de Darling, numerosos casos de HP foram registrados, contribuindo de forma expressiva para compreensão desta patologia. Comparando o material estudado por Darling (1906), com casos de linfangite epizoótica causada por H. farciminosum e esfregaços de 30 sangue de casos de leihsmaniose, Rocha Lima (1912), verificou que o H. capsulatum apresentava, morfologicamente, maior semelhança com leveduras do que com protozoários. Neste estudo, o autor enfatizou as propriedades de impregnação de corantes, a presença de formas em brotamento e a ausência de formas flageladas descrita anteriormente por Darling. Dodd e Tompkins (1932), diagnosticaram o primeiro caso de HP em esfregaços de sangue periférico de uma criança portadora de anemia incomum, residente no Estado de Tennesse (EUA). Este material foi enviado para De Monbreum (1934), que realizou com sucesso o primeiro isolamento de H. capsulatum. O autor demonstrou também o dimorfismo desta espécie fúngica, por meio da inoculação em animais de experimentação, concluindo que formas saprofíticas do fungo provavelmente existiam livres na natureza, causando doença, em humanos, com quadro não fatal mais freqüentemente do que se supunha. O primeiro caso de HP no Brasil foi diagnosticado através do exame de fragmentos de fígado de uma criança, sendo encontrado células retículo-endoteliais parasitadas pelo H. capsulatum (Villela e Madureira Pará, 1941). Com o advento da Aids, em 1981, observou-se aumento do número de casos de HP disseminada associada àquela patologia em zonas endêmicas, sendo que esta associação pode ser desencadeada pelo despertar de processos pulmonares quiescentes (Wheat et al., 1986) e apresentando-se como a primeira infecção oportunística associada a outras infecções e ou neoplasias em pacientes residentes ou procedentes de zonas endêmicas, fato que levou o CDC-USA, em 1985, quando não havia provas sorológicas e moleculares para a identificação do HIV, a incluir a HP disseminada como infecção “marcadora” de Aids. 31 1.2. Etiologia do H. capsulatum Anamorfo:Histoplasma capsulatum var. capsulatum. Darling (1906). Histoplasma capsulatum var. duboisii. Ciferri (1960). Teleomorfo: Emonsiella capsulata. Kwon-Chung (1972). Ajellomyces capsulatus. McGinnis et Katz (1979). A HP é infecção causada por três variedades de fungos pertencentes ao gênero Histoplasma: H. capsulatum var. capsulatum; H. capsulatum var. duboisii e H. capsulatum var. farciminosum. As duas primeiras variedades causam infecção em humanos e animais e a var. farcimonosum é o agente da linfangite epizoótica (Alves, 1996; Lacaz et al., 1998, Lacaz et al., 2002). O agente etiológico da HP clássica ou Doença de Darling é o H. capsulatum var. capsulatum, sendo que o seu teleomorfo é o A. capsulatus. Este microrganismo no estado anamorfo pertence ao reino Fungi, subdivisão Deuteromycotina, classe Hyphomycetes, ordem Moniliales, família Moniliaceae e gênero Histoplasma; enquanto o seu teleomorfo pertence à subdivisão Ascomycotina, classe Ascomycetes, ordem Onygenales e gênero Ajellomyces. A forma sexuada ou teleomorfa das duas primeiras variedades de Histoplasma receberam, inicialmente, a denominação de Emonsiella capsulata e posteriormente de Ajellomyces capsulatus (McGinnis e Katz,1979; Kwon-Chung e Bennett, 1992; Lacaz et al., 1998; Lacaz et al., 2002). 1.3. Distribuição Geográfica e Ecoepidemiologia A HP é micose sistêmica que apresenta ampla distribuição geográfica, sendo possível detectar casos autóctones em mais de 60 países distribuídos nos diversos continentes, principalmente na área compreendida 32 entre 45° latitude ao norte e 30° latitude ao sul do Equador. No entanto, apresenta nítida prevalência nos continentes Americano e Africano. Nas Américas estende-se desde o sul do Canadá até as regiões centrais da Argentina, sendo que as zonas endêmicas de maior importância se situam em Ohio, Bacia do Rio Prata, Serra do Mar, Vales do Rio Mississipi e Missouri (Zancopé-Oliveira e Wanke, 1987; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Silva et al., 1999; Negroni, 2001; Panackal et al., 2002; Lacaz et al., 2002). Casos da doença têm sido descritos nas regiões oeste e sudeste da Europa, no oeste da Ásia e Austrália, contudo, estes se encontram comumente limitados a um único ou a um número muito pequeno, não se sabendo ao certo a fonte de infecção. Soma-se a isto, o fato de nenhum surto epidêmico ter sido descrito até o momento fora do continente americano (Panackal et al., 2002). No Brasil, a ocorrência da HP tem sido descrita pela observação de casos clínicos autóctones, seja sob a forma de casos isolados ou sob a forma de microepidemias, bem como pela realização de inquéritos epidemiológicos empregando o teste cutâneo da histoplasmina (ZancopéOliveira e Wanke, 1987; Silva-Vergara e Martinez, 1998; Severo et al., 2001; Cury et al., 2001). H. capsulatum é habitualmente encontrado em regiões de clima tropical ou temperado, com temperatura média anual entre 15 a 22o C, índice pluviométrico anual de 1000 mm e umidade relativa do ar de 67 a 87 % (Negroni, 2001; Lacaz et al., 2002). Acredita-se que alguns ou o conjunto de fatores descritos anteriormente determinam a distribuição do H. capsulatum no meio ambiente, geralmente havendo associação de seu isolamento com microambientes fechados, como cavernas ou grutas, construções abandonadas, galinheiros, celeiros, florestas ou qualquer local onde o solo encontra-se enriquecido com excretas de aves e/ou morcegos (Zancopé- 33 Oliveira e Wanke, 1987; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Silva et al., 1999; Negroni, 2001). Determinadas características físico-químicas do solo como textura e acidez, associadas ao enriquecimento do mesmo por dejetos de aves e quirópteros, que atuariam como importante fonte de nitrogênio, têm sido consideradas por diversos autores como meio de cultura adequado para o crescimento, desenvolvimento e disseminação deste patógeno (ZancopéOliveira, 1987; Silva et al., 1999; Negroni, 2001). Segundo Kwon-Chung e Bennett (1992), locais onde existem elevadas concentrações de aves ou morcegos podem dar origem a surtos epidêmicos ou microepidêmicos que diferem em sua magnitude quando da exposição simultânea de pessoas ao agente infectante. Em publicação recente Panackal et al. (2002), relatam que na América do Norte a HP tem sido considerada por diversos pesquisadores como doença recreacional entre espeleólogos. Segundo os autores 60 a 64% dos indivíduos que possuem o hábito de freqüentar cavernas e ou grutas apresentam teste cutâneo positivo à histoplasmina. Recentemente, maio de 2001, um grupo de 15 estudantes do Estado da Geórgia-EUA viajou para Nicarágua onde visitaram uma mina de prata. Três dias após o retorno do grupo para os EUA, 12 (80%) indivíduos apresentaram sinais clínicos compatíveis com HP aguda, confirmada posteriormente por meio de provas sorológicas (Panackal et al., 2002). Erkens et al. (2002), descrevem a presença de anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum, empregando a técnica de immunoblotting, em cinco integrantes de um grupo de oito pesquisadores alemães, que haviam passado dez dias em Cuba, estudando os hábitos de morcegos. Registrou-se também, que duas pessoas do grupo que relataram a utilização de máscaras faciais, não apresentaram nenhuma sintomatologia, 34 enfatizando assim, a necessidade e importância do uso de equipamentos de proteção individual para pessoas que visitam cavernas. H. capsulatum tem sido isolado de diferentes fontes ambientais como ar, solo de cavernas e grutas, bem como de vísceras e fezes de morcegos, ratos, cães e outros animais silvestres (Emmons, 1949; Silva e Paula, 1956; Silva, 1961 apud Silva-Vergara et al., 2001; Araújo, 1970; Arias et al., 1982; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Lacaz et al., 1998; Cury et al., 2001; Lacaz et al., 2002). Zancopé-Oliveira e Wanke (1986), realizaram a captura de 103 animais silvestres nativos no Município do Rio de Janeiro, isolando H. capsulatum de vísceras de três animais (2,9%), aparentemente sadios; sendo dois marsupiais (Metachirus opossum) e um rato (Rattus rattus). Taylor et al. (1999), descreveram o isolamento de H. capsulatum das vísceras (intestino, pulmão, fígado e baço) em 17, de um total de 208, morcegos capturados nos Estados de Guerrero e Morelos, no México. Silva-Vergara et al. (2001), demonstraram o isolamento de H. capsulatum no Estado de Minas Gerais, a partir de cultura de vísceras de Didelphis albiventris, uma espécie de marsupial encontrado no Brasil. Os autores chamam a atenção para a ampla distribuição geográfica deste mamífero pelo continente, a qual coincide com a distribuição da HP. A Tabela 1 resume os isolamentos do H. capsulatum a partir de amostras de solo de diferentes regiões do Brasil, a grande maioria obtida de locais com elevada quantidade de excretas de galinhas e morcegos. 35 Tabela 1. Isolamento de H. capsulatum var. capsulatum de solos brasileiros. Localidade Associação com Amostras Amostras aves ou morcegos examinadas positivas Galinheiros 50 01 Silva,1956 01 01 Fava Netto, Jacobina (BA) Ubatuba/Caraguatatuba Fezes de Morcegos (SP) Referência 1967 Lagoa Santa (MG) Brasília (DF) Galinheiro 02 01 Araújo,1970 Fezes de morcego 15 02 Schmidt ,1973 Galinheiro 06 01 Moraes e Humboldt (MT) Almeida,1976 Angra dos Reis (RJ) Galinheiro 02 02 Wanke,1985 Angra dos Reis (RJ) Fezes de Morcego 04 02 Wanke,1985 São Gonçalo (RJ) Fezes de morcego 07 05 Wanke,1985 Petrópolis/Itaipava (RJ) Fezes de morcego 18 13 Wanke,1985 Niterói/Rio do Ouro (RJ) Fezes de morcego 05 03 Wanke,1985 -------- Severo, 1986 General Câmara (RS) Galinheiro -------- Fonte: Zancopé-Oliveira, 1987. O último relato de isolamento de H. capsulatum a partir de amostras de solo realizado no Brasil foi o conduzido por Zancopé-Oliveira e Wanke (1987). Neste estudo, os autores avaliaram o índice de contaminação do solo pelo H. capsulatum na localidade de Rio da Prata (RJ), área periurbana com características rurais. A análise de 111 amostras de solo coletadas em diferentes locais revelou positividade em oito (7,2%). Todas as amostras para análise foram colhidas de galinheiros, sendo que em um destes foi observado a existência de guano de morcegos. Segundo os pesquisadores, o elevado nível de contaminação do solo nesta região pode ser comparado aos níveis observados em áreas endêmicas para esta micose nos EUA. 36 Testes intradérmicos empregando a histoplasmina têm sido realizados em cães, no rebanho bovino e eqüino, a fim de verificar a incidência da HP infecção. Estes inquéritos epidemiológicos revelam que 50% dos cães e gatos abrigam esta espécie fúngica, sendo considerados, portanto, como disseminadores desta enfermidade, sugerindo desta forma, que a infecção primária possa acontecer primeiramente em hospedeiros animais. Acredita-se que a transmissão ao homem possa estar associada à presença de determinados vetores invertebrados, como os carrapatos; estando assim relacionada tanto a ocupações rurais como urbanas (Alves, 1996; Lacaz et al., 2002). Em 1945, importante estudo epidemiológico contribuiu para a demonstração da reatividade cutânea à histoplasmina, correlacionando-a a presença de calcificações pulmonares em indivíduos tuberculina negativos (Christie e Peterson, 1945). Palmer (1946), em estudo multicêntrico realizado nos EUA, onde avaliou 10.580 enfermeiras, demonstrou a incidência de reagentes à histoplasmina. O autor verificou que o Estado de Kansas apresentava o maior índice de positividade (7,1%), encontrou, contudo, 58,1% de provas duvidosas. A média dos casos positivos foi de 3,2% e casos duvidosos de 20,1%. No Brasil, pelo fato da HP não ser doença de notificação compulsória, fica extremamente difícil o mapeamento da real distribuição deste processo infeccioso. A Tabela 2 resume as microepidemias ocorridas em território nacional no período compreendido entre 1959 e 1987. Tabela 2. Microepidemias de HP no Brasil (1959-1987). 37 Fontes de infecção Nº de casos Autor (es) e ano de publicação 1. Gruta com morcegos/Paraíba do Sul/RJ 13 Paula (1959) 2. Caixa d’agua/ Santa Teresa/RJ 07 Tufic Simão (1959) 3. Forro de casa/ Ubatuba/SP 08 Fava Netto et al. (1967) 4. Gruta com morcegos/ Vassouras/RJ 05 Paula & Pomp (1972) 5. Gruta com morcegos/ Brasília/DF 14 Schmidt et al. (1973) 6. Gruta com morcegos/ Rio de Janeiro/RJ 05 Rego et al. (1976) 7. Gruta com morcegos/ Ubatuba/SP 10 Fava Netto et al. (1976) 8. Gruta/ Angra dos Reis/RJ 08 Mello et al. (1976) 9. Gruta/ Rio do Ouro – Niterói /RJ 08 Peçanha et al. (1981) 10. Mina abandonada/ São Gonçalo/RJ 10 Wanke (1981) 11. Mina abandonada/ São Gonçalo/RJ 04 Wanke (1981) 12. Minas abandonadas/ Itaipava /RJ 10 Wanke (1981) 13. Minas abandonadas/ Itaipava /RJ 05 Wanke (1981 14. Minas abandonadas/ Niterói /RJ 05 Wanke (1982) 15. Gualinheiro/ Tinguá/RJ 10 Bethlem et al (1984) 16. Galeria de águas/ Pendotiba/RJ 10 Paula e Aidê (1979) 17. Bueiro/ Borborema/PB 06 Fernandes & Costa (1967) Fonte: Aloysio de Paula (1988) apud Lacaz et al., 2002. Wanke (1985), estudou a epidemiologia da HP, empregando como antígeno a histoplasmina, avaliando população de 453 indivíduos, na região hiper-endêmica de Praia Vermelha (Ilha Grande, Angra dos Reis, RJ), encontrando 94,6% de positividade ao ensaio de HTT. O autor demonstrou também, que minas abandonadas de caulim eram a fonte de infecção desta microepidemia de HP aguda. Neste estudo o agente etiológico desta micose foi isolado em rato-paca (Proechimys dimidiatus); roedor silvestre comum naquela área. 38 Zancopé-Oliveira e Wanke (1986), realizaram em área periurbana do Município do Rio de Janeiro (localidade de Rio da Prata) inquérito epidemiológico com histoplasmina em 470 escolares, com faixa etária entre 5 a 14 anos, encontrando 19,6% de positividade. Neste mesmo trabalho, a autora, realizou inquérito epidemiológico empregando paracoccidioidina em 455 crianças da mesma região. A leitura foi realizada em 433 crianças, apresentando 9,2% de positividade (40 reações). Severo et al. (2001), relataram a endemicidade da HP no Estado do Rio Grande do Sul, particularmente na região do Vale do Rio Jacuí. Segundo o autor, H. capsulatum tem sido isolado do solo e 89% da população masculina jovem desta região apresenta positividade ao teste cutâneo com histoplasmina. Cury et al. (2002), descreveram casos de HP pulmonar aguda desenvolvida por quatro indivíduos que freqüentavam cavernas habitadas por morcegos, na cidade de Pedro Leopoldo, Estado de Minas Gerais. 1.4. Aspectos Clínicos da Histoplasmose H. capsulatum não é regularmente um microrganismo oportunista, contudo, nas últimas décadas o aumento de sua incidência tem sido observado em pacientes imunocomprometidos, entre os quais podem-se citar aqueles portadores de doenças hematológicas malignas, acometidos pelo vírus da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (HIV/Aids), pacientes transplantados ou indivíduos que receberam terapias citotóxicas ou imunossupressoras (Wu-Hsieh e Howard, 1989; Alves, 1996; Lacaz et al., 1998; Marques et al., 2000; Cury et al., 2001; Negroni, 2001; Lacaz et al., 2002). A HP é uma infecção fúngica caracterizada por determinar variadas manifestações clínicas no 39 hospedeiro, desde infecção assintomática até doença disseminada (Silva et al., 1999; Marques et al., 2000; Lacaz et al., 2002). Acredita-se que o mecanismo de infecção do hospedeiro vertebrado se faça pela via aérea superior, por meio da inalação de propágulos fúngicos infectantes conhecidos como conídios, que se instalariam primeiramente nos alvéolos pulmonares, invadindo posteriormente os linfonodos hilo-mediastinais e finalmente disseminando-se pela corrente sanguínea. Essa fungemia é assintomática e permite que o agente etiológico parasite todos os tecidos do sistema monocíticohistiocitário, tais como pulmões, fígado, baço, linfonodos e estruturas linfáticas do tubo digestivo. A partir daí, a resposta tissular do hospedeiro contra o processo infeccioso vai determinar a extensão da doença. (Silva et al., 1999 ; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Marques et al., 2000; Lacaz et al., 2002). A HP clássica, ou seja, a causada pelo H. capsulatum var. capsulatum pode se manifestar como: HP infecção e HP doença (Eissenberg e Goldman, 1991; Lacaz et al., 2002). 1.4.1. Histoplasmose Infecção A gravidade da doença em indivíduos imunocompetentes parece estar relacionada ao número de microaleuroconídios inalados. Nestes indivíduos, o processo infeccioso se estabelece após o microrganismo conseguir escapar do sistema de defesa inato imposto pelo tecido hospedeiro. Estima-se que cerca de 90 a 95% dos indivíduos que inalaram microaleuroconídios desta espécie fúngica não desenvolvem a doença (WuHsieh e Howard, 1989; Eissenberg e Goldman, 1991; Lacaz et al., 2002). 40 Pode ser dividida em: primo infecção assintomática e infecção pulmonar aguda. A primo infecção assintomática, representa a maior parte das infecções primárias. Neste caso, o contato do indivíduo com o agente etiológico é evidenciado apenas com a realização de inquéritos epidemiológicos havendo conversão da reatividade de negativa para positiva em teste cutâneo, frente a histoplasmima ou aparecimento de calcificações pulmonares (Eissenberg e Goldman, 1991; Lacaz et al., 2002). A infecção pulmonar aguda corresponde a primo-infecção sintomática. É caracterizada por apresentar um amplo espectro de manifestações clínicas, desde casos que simulam gripe até pneumopatias agudas graves, com insuficiência respiratória. A tosse é o sintoma freqüentemente observado na maioria dos casos. Febre com duração maior que uma semana, astenia, anorexia, dor torácica, cefaléia e mialgias fazem parte do quadro clínico. Radiologicamente observam-se infiltrados intersticiais pulmonares difusos, uni ou bi laterais, pode-se também encontrar nódulos, únicos ou múltiplos, disseminados em ambos pulmões com adenomegalia hilar e/ou mediastinal. Essa forma clínica é autolimitada e a involução das lesões ocorre de um até três meses, deixando como seqüelas calcificações pulmonares e extra- pulmonares (Eissenberg e Goldman, 1991; Alves, 1996). 1.4.2. Histoplasmose Doença 1.4.2.1. Histoplasmose Disseminada A HP disseminada é uma doença rara que apresenta evolução potencialmente fatal decorrente da deficiência da imunidade celular do 41 hospedeiro, devendo ser relacionada a infecções oportunistas. São descritos três grupos de possíveis hospedeiros: as crianças com imaturidade imunológica, imunossuprimidos e um grupo sem deficiência imune mensurável pelos métodos atuais (Lacaz et al., 1999; Silva et al., 1999). A presença do fungo observado em exame de sangue periférico ou anátomo-patológico e seu desenvolvimento em cultura desempenha papel fundamental para o diagnóstico dessa forma da doença (Silva et al., 1999; Lacaz et al. 2002). 1.4.2.2. Histoplasmose Disseminada Aguda Observa-se essa forma na primeira infância, em algumas áreas de alta endemicidade e em pacientes com comprometimento da imunidade celular, especialmente naqueles indivíduos acometidos por leucose, linfomas e Aids. Clinicamente predominam as manifestações gerais de um processo infeccioso severo: febre elevada, perda ponderal, astenia, diarréia, vômitos, hepatoesplenomegalia, adenomegalias generalizadas e lesões cutâneas, com meningoencefalite em 20% dos casos. Em crianças e pacientes com Aids, pode ocorrer coagulação intravascular disseminada. A evolução para óbito ocorre na totalidade dos casos, em um período de dois a seis meses (Silva et al., 1999; Alves, 1996; Lacaz et al., 2002; Wheat et al.,2004). A HP quando está associada a Aids pode apresentar quadro clínico benigno, moderadamente grave ou grave. Alves (1996), analisou do ponto de vista clínico e laboratorial, 27 casos de HP disseminada associados a Aids. Febre, perda de peso, dispnéia, lesões cutâneas disseminadas, adenomegalia, hepato e esplenomegalia foram evidentes, bem como infiltrado intersticial difuso dos pulmões. O tratamento, nesses casos, com drogas antifúngicas podem conduzir a uma cura clínica e micológica. 42 A Aids contribuiu de maneira decisiva para o aumento da incidência da HP disseminada. Em zonas endêmicas acomete de dois a cinco porcento dos pacientes com Aids, atingindo nas cidades de grandes endemias até 25%. O Estado de São Paulo não é considerado zona endêmica de HP disseminada, entretanto em pacientes com Aids, esta forma clínica da doença, apresenta elevada letalidade, com grande incidência de lesões mucocutâneas, podendo apresentar quadro clínico semelhante à tuberculose miliar, patologia de alta freqüência no país, induzindo os médicos a pensarem nesta última infecção, não considerando a HP disseminada no diagnóstico diferencial, conseqüentemente promovendo prejuízo na instauração do tratamento antifúngico adequado (Alves, 1994; Lacaz et al., 2002). 1.4.2.3. Histoplasmose Disseminada Sub-aguda Forma clínica semelhante à aguda, diferenciando-se apenas por apresentar evolução mais prolongada e deterioração mais lenta do estado geral do paciente (Wheat et al.,2004). 1.4.2.4. Histoplasmose Disseminada Crônica É observada com maior freqüência em indivíduos do sexo masculino, com idade superior a 40 anos, apresentando relação de 12:1 de incidência/prevalência entre indivíduos do sexo masculino em relação ao feminino. Geralmente os pacientes apresentam deficiências imunes leves, produzidas por diferentes fatores, associados ou não, como idade avançada, alcoolismo crônico, diabetes, tumores sólidos, corticoterapia e linfomas. Os sinais clínicos mais importantes são astenia, perda de peso e presença de lesões cutâneas e/ou mucosas. 43 As lesões mucosas são observadas em aproximadamente 90% dos casos, sendo polimorfas, ulceradas ou úlcero-vegetantes e se situam na língua, na mucosa oral, na faringe, no septo nasal e na laringe. As lesões cutâneas são menos freqüentes que as anteriores, sendo descritas em apenas 10% dos casos. Apresentam-se como úlceras de bordas nítidas, profundas, com fundo granuloso e pápulas acneiformes, com ápice ulcerado, pustuloso ou nodoso (Silva et al., 1999; Alves, 1996; Lacaz et al., 2002; Wheat et al.,2004). 1.5. Resposta Imunológica 1.5.1. Resposta Imune Celular A resposta imune celular mediada por células T é pré-requisito indispensável para que o tecido hospedeiro resista ao processo infeccioso causado por H. capsulatum (Allendoerfer e Deepe,1998). Segundo os autores, a importância das células T para o hospedeiro humano, pode ser evidenciada pelo aumento expressivo da susceptibilidade a HP disseminada observada entre indivíduos HIV positivos ou por aqueles cuja imunidade celular foi deprimida pelo uso prolongado de agentes supressores. Willians et al. (1978) apud Allendoerfer e Deepe (1998), demonstraram que camundongos congenitamente deficientes de células T são mais susceptíveis a HP. Em adição, Allendoerfer (1998), relata que camundongos depletados de receptor αβ de célula T (TCR+) sucumbiram à infecção primária e secundária causada por H. capsulatum. Sabe-se que os dois maiores fenótipos de células T, CD4+ e CD8+, desempenham funções distintas durante o processo infeccioso. Allendoerfer et al. (1998), demonstraram que a depleção de linfócitos T CD4+ em camundongos infectados experimentalmente com células de H. 44 capsulatum promoveu aumento expressivo da taxa de mortalidade destes animais. Por outro lado, o mesmo autor observou que a transferência de clones de células T CD4+ foi capaz de conferir proteção a animais naive desafiados com leveduras de H. capsulatum. Deepe (1994), relatou que camundongos knockout para β-2 microglobulina ou camundongos depletados de células T CD8+ demonstraram nítido clearance de células fúngicas. Baseado no exposto pode-se dizer que linfócitos T CD4+ são cruciais para a sobrevivência de hospedeiros infectados por H. capsulatum, enquanto células CD8+ são necessárias para o clearence dos fungos. O principal mecanismo pelo qual, células T contribuem para a resposta imune protetora se dá pela liberação de citocinas, responsáveis pela ativação dos macrófagos. Das diferentes citocinas secretadas, o IFN-γ desempenha papel primordial, uma vez que atua inibindo o crescimento intracelular das células fúngicas, pela limitação do ferro existente no interior da célula, decorrente provavelmente da síntese do óxido nítrico (Allendoerfer e Deepe, 1998). Zhou et al. (1998), demonstraram que a neutralização de IFN-γ resultou em aumento da taxa de mortalidade de camundongos infectados por via endovenosa com células de H. capsulatum. Allendoerfer e Deepe (1997 e 1998), observaram que camundongos naive que apresentaram falha na expressão do gene para IFN-γ, não foram capazes de controlar a infecção pulmonar provocada por H. capsulatum. O papel da IL-12 no mecanismo de proteção contra o processo infeccioso causado por H. capsulatum, foi estudado por Allendoerfer et al. (1998), que demonstraram que a neutralização de IL-12 endógena esta 45 associada com o aumento de unidades formadoras de colônias e com a aceleração do tempo de mortalidade durante a infecção primária. Allendoerfer et al. (1998), descreveram que a neutralização de TNF-α, por anticorpo policlonal ou monoclonal anti- TNF-α aumenta a susceptibilidade da infecção primária e secundária causada pelo H. capsulatum, promovendo uma aceleração no tempo de mortalidade. O autor observou também, que a carga fúngica aparece aumentada em camundongos depletados de TNF-α. Em resumo, a efetividade da resposta imune celular contra o processo infeccioso causado pelo fungo H. capsulatum depende da interação de diferentes tipos de citocinas com diferentes componentes celulares em estágios distintos da infecção. 1.5.2. Resposta Imune Humoral Pouco se sabe sobre a influência das células B no mecanismo de proteção do tecido hospedeiro contra o H. capsulatum (Wu-Hsieh e Howard, 1989). Alguns estudos têm indicado que a transferência de soro hiperimune não altera o processo infeccioso, Saslow (1956) apud Allendoerfer e Deepe (1998). Em linha de pesquisa semelhante, Newman et al. (1990), demonstraram que a opsonização de leveduras com anticorpos e/ou complemento não promoveu aumento expressivo no mecanismo de fagocitose. 46 1.6. Tratamento da Histoplasmose O tratamento das primos-infecções sintomáticas é realizado empregando-se apenas medidas de suporte ventilatório em indivíduos que apresentem casos mais graves, visto que o processo infeccioso involue espontaneamente (Kauffman, 2000). Segundo Goldman (1994), o emprego de terapia antifúngica só se justifica, neste grupo, quando os sintomas não regridem após uma a três semanas de acompanhamento ou quando o paciente necessita de hospitalização. O tratamento específico só é indicado em pacientes imunodeprimidos, visando principalmente evitar a progressão da doença. Nestes casos, aplica-se uma série curta de anfotericina B, até completar dose total de 500 mg, ou cetoconazol, em dose de 400 mg/dia, por seis meses, ou itraconazol 100 mg/dia, por igual período (Kauffman, 2000). Nas formas pulmonares crônicas ou disseminadas crônicas, podese indicar derivados imidazólicos, com dose diária em prazos iguais aos citados anteriormente. Mediante falha terapêutica, com esses derivados, ou em casos associados à tuberculose ativa, usa-se a anfotericina B, na dose de 0,7 a 0,8 mg/kg, chegando à dose total/dia de 35 mg/Kg (Kauffman, 2000). Negroni et al. (1980), utilizaram o cetoconazol no tratamento da HP, na dosagem de 400 mg diariamente, obtendo bons resultados em 78,5% (grupo de 13 pacientes). O tratamento com cetoconazol em pacientes imunocompetentes com HP pulmonar crônica mostrou-se eficiente em 85% ou com taxa de cura de 72% (Dismukes, 1995); no entanto quando usada em paciente 47 imunodeprimido, inclusive pacientes com Aids, esta terapia apresentou taxa de falência em mais de 90% (Wheat et al., 1990). Nas formas disseminadas agudas, indica-se o itraconazol, na dose de 200 a 400 mg/dia, por 12 meses, ou anfotericina B, com dose total de 400 mg/kg (Kauffman, 2000). Negroni et al (1986), trataram com itraconazol por via oral, 18 pacientes com HP na dosagem de 100 mg/dia durante seis meses e após a cura clínica na dosagem de 50 mg/dia. Em dois casos com recidivas anteriores, a medicação foi prolongada por um ano. Ao término do tratamento, 16 pacientes encontravam-se clinicamente curados, e os dois restantes exibiam sensível melhora. Ao se referir ao uso do itraconazol, Wheat (1994), discutiu um problema de extrema importância, ou seja, a interação medicamentosa entre este antifúngico e as medicações que aceleram seu metabolismo hepático, inibindo seletivamente as enzimas P-450 do fígado, provocando falhas no tratamento, não se alcançando concentrações sanguíneas terapêuticas. Nos casos associados a Aids, é aconselhável profilaxia secundária com 100 mg/dia de itraconazol, durante um ano (Kauffman, 2000). 1.7. Diagnóstico Laboratorial da Histoplasmose 1.7.1. Exame Direto O exame direto para a observação, em microscopia óptica, de células leveduriformes de H. capsulatum é realizado em material biológico 48 (secreções do trato respiratório, aspirado de medula óssea, esfregaços sanguíneos periféricos, úlceras bucais, raspados cutâneos, líquor, linfonodo e urina) fixado em lâminas, por meio de esfregaços e imprints, empregandose as técnicas de colorações de May-Grünwald-Giensa, Wright ou Leishman. A visualização destas formas fúngicas pode também ser observada em cortes histológicos, geralmente corada pelas técnicas de HematoxilinaEosina (HE), PAS (Ácido periódico de Schiff) ou Gomori-Grocott (Lacaz et al., 1984; Rincon, 1989; Lacaz et al.,1998; Sidrim e Oliveira, 1999; KwonChung e Bennett, 1992; Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Artal, 2004). Nos cortes histológicos corados pela HE, observam-se células de H. capsulatum var. capsulatum esféricas ou ovais ligeiramente basofílicas, com 2 a 4 µm de diâmetro, com halo envolvente devido à retração do citoplasma. Geralmente estas leveduras podem ser encontradas no interior das células do sistema retículo endotelial ou liberadas, nesse tecido, após ruptura do citoplasma das mesmas. Raramente encontram-se brotamentos, mas quando presentes são unipolares (Kwon-Chung e Bennett, 1992; Lacaz et al.,1998; Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Artal, 2004). Apesar de fornecer diagnóstico precoce, o exame histopatológico possui menor sensibilidade quando comparado a cultura. Soma-se a este fato a dificuldade na visualização das leveduras, freqüentemente observada nos locais onde os laboratoristas têm pouca experiência em identificar o H. capsulatum, além disto, o estudo morfológico do H. capsulatum nos tecidos não determina sua identidade, sendo considerado apenas um parâmetro sugestivo da doença (Almeida e Lacaz, 1947). Embora as leveduras de H. capsulatum var. capsulatum sejam visíveis em médio aumento quando coradas pela HE, recomenda-se a utilização de objetiva de imersão visando o diagnóstico do patógeno, 49 diferenciando-o de protozoários como Leishmania donovani e Toxoplasma gondii, que apresentam formas intracelulares semelhantes ao H. capsulatum (Mendes-Giannini e Melhem, 2001, Lacaz et al., 2002; Artal, 2004). O diagnóstico diferencial do H. capsulatum var. capsulatum é realizado pelo fato das amastigotas de L. donovani, quando coradas pelo Giemsa, apresentarem cinetoplasto em forma de bastonete, não sendo observada esta característica quando submetidas à coloração de HE (Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Artal, 2004). Os cistos de T. gondii diferenciam-se das células fúngicas de H. capsulatum, por apresentarem células menores e sem halo claro envolvente, quando coradas pela HE (Lacaz et al., 2002). Observou-se que estes protozoários não se coram com corantes específicos (Gridley, PAS, GG) para fungos (MendesGiannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Artal, 2004). A análise microscópica das hifas revela estruturas finas e septadas, das quais se originam lateralmente conidióforos curtos, que raramente se desenvolvem e em algumas culturas estão ausentes. Os conídios são de dois tipos: microaleuroconídios e macroaleuroconídios. Os microaleuroconídios aparecem primeiro, sendo redondos a piriformes, hialinos (2 a 4 µm), apresentando parede celular lisa e finamente rugosa. Eles originam-se dos conidióforos ou diretamente da parede de hifas. Os macroaleuroconídios são redondos podendo ocasionalmente ser oblongos e ou piriformes (7 a 15 µm), com parede celular espessa, que com o amadurecimento desenvolvem espículas ou finas projeções na sua superfície, sendo conhecidos como macroaleuroconídios tuberculados. Verificou-se que nas amostras de H. capsulatum cultivadas em condições de anaerobiose, à 27ºC, os macroaleuroconídios tuberculados formam-se em abundância. (Rincon, 1989; Sidrim e Oliveira, 1999; Lacaz et al., 1998; Lacaz et al., 2002). 50 1.7.1.2. Isolamento Em alguns casos é extremamente difícil diferenciar células de H. capsulatum var. capsulatum em tecidos, de células de Candida glabrata, Penicilium marneffei, H. capsulatum var. farciminosum e formas diminutas de Blastomyces dermatitidis (Mendes-Giannini e Melhem, 2001). A cultura é o método definitivo no diagnóstico da HP (KwonChung e Bennett, 1992; Yeo e Wong, 2002; Lacaz et al., 2002). O isolamento do H. capsulatum ocorre à temperatura ambiente (27º C), em ágar Sabouraud-dextrose, ágar batata ou ágar infusão cérebro coração (BHI) suplementado com cinco porcento de hemácea de carneiro, produzindo micélios aéreos brancos com aspecto algodonoso; formando colônias branco-creme a ocre-marrom, produzindo abundantes macroconídios. A esporulação geralmente está associada com esta coloração. Estes micélios desenvolvem-se lentamente, requerendo de 10 a 14 dias de incubação para iniciar crescimento, sendo que após varias semanas de incubação a superfície inteira da base estará recoberta com a colônia. Com a realização de repiques sucessivos as mesmas tornam-se brancas, de forma irreversível, não produzindo mais estas estruturas (Rincon, 1989; Sidrim e Oliveira, 1999; Lacaz et al., 1998; Lacaz et al., 2002). A reversão de micélio para levedura é observada em ágar BHI suplementado com 5 a 10% de sangue ou com soro bovino fetal ou Lcisteina. Neste caso, observa-se macroscopicamente a presença de colônias sulcadas apresentando tonalidade creme a bege, que pode tornar-se acinzentada com o tempo de cultura (Fressatti et al., 1992; Alves, 1996; Lacaz et al., 1998; Wu-Hsieh e Howard, 1989; Lacaz, et al., 2002). 51 Entre as dificuldades de isolamento do H. capsulatum pode-se citar: a) o tempo prolongado (duas a seis semanas) necessário para o isolamento e identificação do agente etiológico, fato este que além de provocar atraso na liberação do resultado pode ocasionar atraso na introdução da medida terapêutica específica; b) prejuízo no isolamento e identificação do fungo, por métodos tradicionais, a partir de hemocultura, devido estes possuirem pouca sensibilidade. Para sanar este problema, diversas modificações técnicas foram introduzidas, visando melhorar a sensibilidade e/ou reduzir o tempo da cultura. Entre estes se destacam: o meio bifásico (Kiehn et al., 1981), que elevou a freqüência de isolamento de fungos a partir de sangue de pacientes infectados; lise-centrifugação (Gill et al.,1984), introduzido no mercado como DuPont Isolator® System, no qual o microrganismo é liberado a partir de leucócitos sanguíneos, inativando fatores séricos inibitórios e agentes microbianos, gerando em conseqüência maior rapidez e sensibilidade na identificação de fungemias. Além destes, existe a monitoração automatizada usando o BacT/Alert® System ou o BACTEC® System (Munoz et al, 1990). A fibrobroncoscopia é um procedimento útil no diagnóstico da HP, quando o material clínico é processado adequadamente. Unis et al. (2004), relataram a utilização da fibrobroncoscopia para a obtenção de material clínico de dez pacientes do sexo masculino, com idade entre 29 e 57 anos, procedentes do Rio Grande do Sul, com HP disseminada e Aids. A avaliação micológica foi realizada semeando-se a amostras nos meios Mycosel e ágarSabouraud-dextrose acrescido de 0,01% de cloranfenicol. Segundo os autores, a positividade do cultivo para material biológico cultivado em Mycosel foi 60%, enquanto no ágar-Sabouraud-dextrose-cloranfenicol foi de apenas 20%, evidenciando a importância do meio seletivo no isolamento do H. capsulatum de espécimes clínicos potencialmente contaminados, 52 salientando também, a importância das informações clínicas para o laboratório. 1.7.1.3. Técnicas Sorológicas O emprego de ensaios sorológicos é de extrema importância no diagnóstico confirmatório da HP, visto que a demonstração em exame direto bem como o isolamento e identificação do H. capsulatum muitas vezes apresenta resultados negativos, principalmente em formas autolimitadas da doença. Além disso, as provas sorológicas propiciam a obtenção de resultados em menor tempo quando comparadas as micológicas (Hopwood e Evans, 1991; Kwon-Chung e Bennett, 1992; Hamilton, 1998; MendesGiannini e Melhem, 2001; Lacaz et al., 2002; Wheat , 2003). Entre os diferentes ensaios sorológicos existentes, testes como imunodifusão dupla (Heiner, 1958; Kaufman, 1970; Wheat et al., 1986; Kwon-Chung e Bennett, 1992; Hamilton, 1998; Hamilton e Gómez, 1998; Lacaz et al., 2002; Yeo e Wong, 2002; Wheat, 2003) contraimunoeletroforese (Kleger e Kaufman, 1973; Wheat et al., 1986; Lacaz et al., 2002), fixação de complemento (Hopwood e Evans, 1991; Lacaz et al., 2002) são freqüentemente utilizados para a pesquisa de anticorpos circulantes anti - H. capsulatum. Em 1958, Heiner detectou seis faixas de precipitação quando soros de pacientes portadores de HP foram avaliados pela técnica de imunodifusão dupla (ID) frente a histoplasmina, preparação antigênica obtida de filtrado de cultura de células micelianas de H. capsulatum var. capsulatum. Duas dessas faixas, foram denominadas de M e H, sendo consideradas suficientes para diagnosticar, com grande margem de segurança, essa micose. Segundo o autor, a reatividade do soro de paciente face ao antígeno M sugeria que o indivíduo havia entrado em contato com H. 53 capsulatum ou havia sido imunizado com histoplasmina. A faixa H era detectável junto com a M na vigência de alguma infecção em curso. O mesmo pesquisador registrou ainda, que os antígenos H e M contidos no filtrado de cultura, eram passíveis de separação por eletroforese. Anticorpos precipitantes anti-M são detectados em até 85% dos pacientes que apresentam as formas aguda e crônica de HP e podem ou não estar associados à doença ativa. Indivíduos com reação intradérmica positiva a histoplasmina, ou com infecção remota, podem apresentar anticorpos circulantes contra este antígeno (Hopwood e Evans, 1991; Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Yeo e Wong, 2002). A detecção do antígeno H indica HP ativa, podendo ser observada até dois anos após a cura clínica do paciente; raramente ocorre na ausência de M, sendo detectado pela reação de fixação de complemento (FC), onde os anticorpos fixadores do complemento podem ser demonstrados na maioria dos pacientes com HP, já a partir da quarta semana após a infecção, sendo, portanto considerada mais sensível do que a ID (Di Salvo et al., 1986; Mendes-Giannini e Melhem, 2001). O ensaio de FC é realizado tanto com antígenos da fase miceliana como da fase leveduriforme de H. capsulatm, apresentando sensibilidade de 90 a 80 % respectivamente (Mendes-Giannini e Melhem, 2001). Kleger e Kaufman (1973), avaliaram a técnica de contraimunoeletroforese (CIE) objetivando a identificação rápida e específica das frações H e M de H. capsulatum. Os autores avaliaram 52 soros de pacientes com HP frente a filtrado de cultura (histoplasmina), demonstrando que a técnica de CIE foi capaz de identificar anticorpos circulantes anti-H e anti-M em 81% (42 pacientes). No mesmo estudo, os autores avaliaram o padrão de reatividade deste antígeno pela ID e FC, obtendo 83% (43 pacientes) e 88% (46 pacientes), respectivamente de positividade. 54 Pizzini et al. (1999), avaliaram a especificidade do ensaio de Western blot empregando como antígeno, as frações H e M de Histoplasma, obtidas por cromatografia de troca iônica a partir de filtrado de cultura (histoplasmina), deglicosiladas pelo tratamento com metaperiodato de sódio. A análise dos resultados revelou uma maior capacidade discriminatória desta prova, frente a 20 soros de pacientes com HP pulmonar aguda, quando comparada às reações de ID e FC freqüentemente utilizadas na rotina diagnóstica. Os autores demonstraram também que a sensibilidade do ensaio foi de 100% e a especificidade subiu de 46,1% frente a frações H e M sem tratamento para 91,2%. Uma das possíveis explicações para este fenômeno seria a oxidação do antígeno C, fato este que diminuiria a ocorrência de reatividade cruzada. O diagnóstico sorológico baseado na pesquisa de anticorpos circulantes anti-H. capsulatum, apresenta valor limitado em pacientes portadores de Aids e HP disseminada bem como naqueles pacientes com manifestações pulmonares severas. Nestes casos, a detecção de antígenos fúngicos em amostras de soro e urina, assume grande importância (Hopwood e Evans, 1991; Kwon-Chung e Bennett, 1992; Hamilton e Gomes, 1998; Mendes-Giannini e Melhem, 2001; Yeo e Wong, 2002; Lacaz et al., 2002). A detecção de antígenos circulantes empregando-se o RIA (Radioimmunoassay), realizada em laboratórios de referência, constitui-se em método estabelecido para o diagnóstico da HP, além de permitir o acompanhamento da resposta ao tratamento antifúngico instaurado (Zimmerman et al., 1989; Wheat et al., 1986; Wheat et al., 1996; Durkin et al., 1997). Uma das vantagens da técnica consiste no fato do congelamento e o descongelamento do material biológico não afetar a detecção de antígenos, sendo reprodutível, ter alta precisão e podendo ser utilizado na identificação de recidivas (Wheat, 1991). Entretanto, a metodologia apresenta algumas desvantagens entre as quais pode-se citar: a 55 necessidade de radioatividade, que pode não ser facilmente adaptada para kits e, o emprego de anticorpos policlonais, que tem demonstrado intensa variabilidade inter ensaio; além de apresentar reatividade cruzada com outros fungos dimórficos como B. dermatitidis, P. brasiliensis e P. marneffei (Wheat et al., 1996; Durkin et al., 1997; Wheat et al., 1997; Yeo e Wong, 2002). Wheat et al. (1986), detectaram utilizando RIA, antígenos polissacarídeo circulantes, proveniente da parede celular fúngica, em amostras de soro e urina de 88 pacientes, dentre os quais 16 eram HIV positivos. Wheat et al. (1992), empregando a técnica de RIA, detectaram a presença de antígeno polissacarídico, em lavado bronco-alveolar, em 70% dos 27 casos de pacientes HIV positivos que apresentavam co-infecção pelo H. capsulatum com quadro de HP disseminada. Neste mesmo trabalho, os autores observaram o agente etiológico por microscopia direta em 70% dos casos analisados, isolando-o em 88,9% dos pacientes. Zimmerman et al. (1989), compararam a técnica de RIA e ELISA (Enzyme-linked immunoassay) visando à detecção do antígeno polissacarídico de H. capsulatum em amostras de urina de pacientes com HP, indivíduos portadores de outras infecções fúngicas e indivíduos saudáveis. A sensibilidade das técnicas foi similar em pacientes com a doença disseminada (89,5% no teste de ELISA e 94,7% em RIA), o mesmo ocorrendo em relação à especificidade (95%). Os autores concluíram que a técnica de ELISA apresenta menor sensibilidade quando comparado ao RIA, podendo apresentar resultados falso-negativos em amostras clínicas que contenham baixos níveis de antígenos circulantes. Andreau et al. (1992), padronizaram para o diagnóstico da HP, uma técnica de micro-ELISA indireta que ofereceu bons resultados, inclusive 56 nos casos comprovados da infecção que apresentavam prova de imunodifusão negativa. Torres et al. (1993), avaliaram o uso das técnicas de ELISA e Western blot para o diagnóstico da HP, verificando que a técnica de ELISA, usando anti-IgG humana, apresentava sensibilidade de 86% e especificidade de 91%. Quando utilizaram anti-IgM humana, obtiveram sensibilidade de 66% e especificidade de 100%. Utilizando o Western blot foi possível o reconhecimento de quatro frações antigênicas, com massa molecular aparente de 38, 70, 83 e 91 kDa, respectivamente. Os autores concluíram que ambas as técnicas podem ser empregadas para o diagnóstico confirmatório da HP. Gómez et al. (1997), padronizaram um ELISA competitivo para detecção de antígeno circulante de H. capsulatum, utilizando anticorpo monoclonal contra a fração antigênica do fungo de 69-70 kDa. Amostras de soro e urina de pacientes portadores das diferentes formas de HP foram analisadas, sendo a sensibilidade de 71,4% e especificidade de 85,4%, em relação a soros de pacientes com outras micoses e 98% com soros humanos de pacientes normais de áreas endêmicas. Gómez et al. (1999), utilizando o mesmo antígeno, verificaram a importância da prova de ELISA de inibição em pacientes imunocompetentes e com Aids, que apresentavam as diferentes formas clínicas da HP, demonstrando a importância e reprodutibilidade desta prova no acompanhamento destes pacientes. 1.7.1.4. Técnicas Moleculares O aumento expressivo na incidência de infecções fúngicas principalmente entre pacientes imunocomprometidos, associado ao fato dos 57 métodos sorológicos apresentarem limitações como a existência de reatividade cruzada pela presença de epítopos semelhantes entre as espécies fúngicas, tem reforçado a necessidade da implantação de técnicas diagnósticas, empregando métodos moleculares, de rápida execução e de grande acurácia, visando a elucidação de processos fúngicos invasivos (Yeo e Wong, 2002; Guedes et al., 2003). Os métodos de amplificação e hibridização do ácido nucléico são de fundamental importância para o diagnóstico molecular (Yeo e Wong, 2002; Lacaz et al., 2002). Sandhu et al. (1995), relataram a obtenção de sonda específica (probe) do H. capsulatum var. capsulatum, com eventual possibilidade de emprego em materiais clínicos diversos. Nesse estudo a região do gene 28S do RNAr, de aproximadamente 100 fungos, representando cerca de 50 espécies patogênicas e saprofíticas, foram seqüenciados para produzir primers universais de PCR e probes de oligonucleotídeos espécieespecíficos para detecção e identificação de fungos de interesse médico. Estes primers foram testados em material biológico apresentando elevado nível de especificidade. Chandrashekar et al. (1997), clonaram e caracterizaram antígeno recombinate de H. capsulatum visando sua aplicabilidade no diagnóstico da HP, obtendo um produto (GH17) de 80 bp que codifica um antígeno com potencial uso no imunodiagnóstico. A análise do produto por Southern blot indicou que o GH17 encontra-se confinado numa localização simples do DNA genômico de H. capsulatum. O autor verificou por immunoblotting que os produtos protéicos do GH17 (expresso como uma proteína de fusão para β-galactosidase de 140 kDa) foram reconhecidos pela totalidade de soros avaliados (18 soros de pacientes com HP), não observando reatividade cruzada frente a soros de pacientes acometidos por outras doenças fúngicas. 58 Zancopé-Oliveira et al. (1999), clonaram e caracterizaram o determinante antigênico imunodominante de H. capsulatum, o antígeno M. O gene do DNA para o antígeno M consiste de 2.187 bp codificando uma proteína de 80 kDa, e apresenta significante homologia com a catalase de A. fumigatus. A autora demonstrou a imunoreatividade da proteína de fusão recombinante frente a anticorpo monoclonal dirigido contra o antígeno M, anticorpo policlonal anti-M obtido em camundongo e soro de paciente com HP. Poonwan et al. (1998), utilizaram a técnica de RAPD (Randon amplified polymorphic DNA) empregando três diferentes primers, mostrando que os materiais genéticos (DNA) isolados de 29 amostras de pacientes eram homogêneos, e com exceção de uma amostra, reconheceram uma banda de 700 bp, apresentando 100% de sucesso na identificação frente a amostra de referência, bem como em todos os isolados, demonstrando assim, a especificidade do primer para identificação do H. capsulatum. Guedes et al. (2003), utilizou regiões do gene do antígeno M que apresentavam pouca ou nenhuma homologia para construir quatro seqüências de oligonucleotídeos para aplicação na técnica de PCR visando à detecção e identificação de H. capsulatum var. capsulatum. A PCR identificou corretamente 31 amostras de H. capsulatum var. capsulatum isoladas a partir de material biológico humano, animal, ambiental (solo) e uma amostra de H. capsulatum var. duboisii. Nenhum produto de amplificação foi obtido do DNA extraído da amostra fúngica de H. capsulatum var. farciminosum. A especificidade da técnica de PCR empregando os primers derivados do antígeno M foi confirmada pela ausência total de produtos da amplificação quando o DNA genômico de outras espécies fúngicas foram aplicados na reação. Segundo os autores, a rapidez, sensibilidade e especificidade desta técnica permite que ela seja amplamente utilizada na identificação de amostras típicas e atípicas do H. capsulatum var. capsulatum. 59 1.8. Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum As preparações antigênicas de H. capsulatum var. capsulatum mais estudadas, são o filtrado de cultura da fase miceliana ou histoplasmina e o antígeno obtido a partir de células leveduriformes de H. capsulatum (Pine et al., 1966; Ehrhard e Pine et al., 1972; Reeves et al., 1972; Bradeley et al., 1974; Gross et al., 1975; Kwon-Chung e Bennett, 1992). Segundo Ehrhard e Pine (1972), o sucesso da utilização da histoplasmina, visando o diagnóstico confirmatório da HP, empregando a prova de imunodifusão dupla (ID) esta intimamente relacionada ao conteúdo qualitativo e quantitativo dos antígenos H e M, presentes na mesma. Wiggins e Schubert (1965) apud Ehrhard e Pine (1972), verificaram em estudo comparativo, que apenas histoplasminas que apresentavam em sua composição as frações H e M, eram capazes de reagir pela prova de fixação de complemento (FC) frente a totalidade de soros de pacientes com HP avaliados. Os autores demonstraram também, que preparações antigênicas (histoplasmina) constituídas apenas pelo antígeno H, reagiam somente frente a alguns soros destes pacientes. Segundo Ehrhard e Pine (1972), a relação dos resultados entre o crescimento do H. capsulatum, produção de exoantígenos, liberação de carboidratos, proteínas e ácidos nucléicos, sugerem que a expressão dos antígenos H e M resultem da autólise celular e sua produção pode ser diferenciada controlando-se condições como: a correta escolha da amostra, composição do meio de cultura além de fatores como agitação, temperatura e pH. Os autores observaram, que o máximo de produção de antígenos H e M ocorreu antes do máximo de rendimento celular, verificando ainda, que em geral, a produção de antígeno permanece constante ou aumenta durante 60 o declínio da massa miceliana, concluindo que no processo de autólise celular há liberação de antígenos H e M. Gross et al. (1975), concluíram que para melhor avaliar um lote de histoplasmina é necessário o uso de um soro adequado para demonstrar a presença dos antígenos H e M, sendo que as características das linhas de precipitação podem mudar radicalmente devido à concentração do antígeno ou do soro. Os autores verificaram que a escolha da amostra de H. capsulatum bem como a quantidade e fase (micélio ou levedura) do inóculo estão relacionadas à produção de histoplasmina contendo as frações H e M de H. capsulatum. Segundo os autores, culturas em shaker são preferidas, por produzir antígeno mais rapidamente, entretanto na sua indisponibilidade ou falta de volume necessário, pode se utilizar culturas estacionárias similarmente inoculadas com leveduras, que fornecem resultados consistentes e de confiança, contudo requerem longos períodos de incubação, que podem variar de cinco a seis meses. Reeves et al. (1972), descrevem a produção de antígeno solúvel, obtido a partir de suspensão de leveduras de H. capsulatum (amostra 6623) em solução salina contendo mertiolato na concentração de 1:10.000. Segundo os autores, a preparação antigênica obtida, apresentou especificidade e sensibilidade relativamente elevada pela prova de FC, revelando ainda atividade anticomplementar quando avaliada após ter sido armazenada a 4º C, por quatro meses. A ocorrência de antígenos específicos pode separar os fungos a partir de similaridades morfológicas do Histoplasma com espécies não patogênicas e justificar sua posição taxonômica. Foram identificadas 143 de 144 culturas submetidas para análise de exoantígenos, quando comparadas pela identificação morfológica. As formas micelianas do gênero Histoplasma são caracterizadas pela produção de macroaleuroconídios tuberculados. A similaridade micromorfológica, referente à produção de microaleuroconídios 61 e ou macroaleuroconídios do Histoplasma, Chrysosporium, Corynascus, Renispora e Sepedonium dificultam a identificação destes microrganismos. Isolados atípicos de H. capsulatum, não esporulados e pigmentados podem ser identificados, utilizando exoantígenos H e M de H. capsulatum, pela técnica de ID, que é sensível, específica, e de simples execução, permitindo fazer uma identificação rápida para esta espécie fúngica (Di Salvo et al., 1980). Kaufman e Standard (1978), obtiveram exoantígenos de B. dermatitides, Coccidiodes immits, H. capsulatum e P. brasiliensis, cultivandoos em ágar Sabouraud-dextrose, os quais foram concentrados e avaliados por ID frente à anti-soros e exoantígenos de referência; não apresentando reações cruzadas. Os autores concluíram que estes reagentes poderiam transformar-se em uma importante ferramenta para a identificação presuntiva de fungos patogênicos, sendo que em 1982, recomendaram o uso de thimerosal na obtenção desses antígenos (Standard e Kaufman, 1982). Andreu et al. (1990), obtiveram exoantígenos de 27 amostras de H. capsulatum, uma de H. capsulatum var. duboisii e três de P. brasiliensis, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, a 37o C, por 15 dias e posteriormente cobertas com solução de mertiolato-borato de sódio 1:5.000 e mantidas a 25o C, por 24 horas, seguindo-se de filtração; avaliando-os por ID e CIE, frente a soros hiperimunes obtidos em coelhos, encontrando 96% de positividade para H. capsulatum. Os autores verificaram que os antígenos eram expressos a partir do 10o dia de cultivo, sendo os melhores resultados observados no 15o dia. Os autores demonstraram ainda, a especificidade, rapidez e sensibilidade desta técnica para a obtenção de antígenos bem como sua utilização na imunoidentificação de amostras fúngicas. Pine et al. (1966), obtiveram antígenos a partir de 14 amostras de H. capsulatum, por meio da ruptura das células leveduriformes empregando 62 métodos mecânicos ou extração química, verificando que há produção de frações solúveis e insolúveis altamente antigênicas. Os autores observaram, contudo, que as frações solúveis perdem rapidamente a antigenicidade, ocorrendo redução da atividade de algumas frações particuladas. Neste mesmo estudo, componentes protéicos da parede celular do H. capsulatum foram purificados, verificando-se que eram antigênicos, estáveis e com pouca reatividade cruzada frente a soros heterólogos. Os resultados obtidos sugerem que o tratamento químico não reduz totalmente a reatividade cruzada, sendo que as amostras de H. capsulatum tratadas com mertiolato possibilitaram a obtenção de um antígeno estável e específico. Markiwitz (1967), produziu antígenos solúveis e particulados, a partir de diferentes isolados de H. capsulatum, empregando meio Salvin, cultivando-os por nove meses, a temperatura ambiente. Antígenos assim preparados foram avaliados frente a soros de pacientes com histoplamose, soros de camundongos e coelhos imunizados com suspensão de células leveduriformes (2,2mg/mL), da amostra 6651 de H. capsulatum, avaliados por ID e FC. A análise dos resultados frente aos anti-soros de camundongos e coelhos demonstrou que na reação de FC a resposta do anticorpo está diretamente ligada à dose utilizada na imunização do animal. Em relação aos soros humanos utilizados no teste de FC quantitativo frente a antígeno polissacarídico bruto, foi demonstrado que a fixação do anticorpo varia com o tempo de curso da doença e os soros utilizados. O autor concluiu, que a expressão dos antígenos está relacionada com as propriedades antigênicas de cada amostra fúngica. Desta maneira, a observação da persistência de um tipo específico de anticorpo pode também, estar relacionado à qualidade da preparação antigênica bem como com a sensibilidade e especificidade do teste sorológico usado. Da Mata et al. (2003), caracterizaram exoantígenos de H. capsulatum obtidos a partir de cultivos em meios de Sabouraud-tiaminaasparagina (STA), pH 6,0 e Smith pH 4,0 e 6,0; em temperatura ambiente. 63 Os autores verificaram que o crescimento ótimo foi obtido em meio STA, observando fase de latência no 3o dia, seguido por uma fase exponencial no 7° dia e uma estacionária no 11° dia. O antígeno obtido em STA, quando avaliado frente a soro de pacientes com HP, revelou reatividade contra uma fração protéica de 97 kDa. Os componentes protéicos apresentaram reações cruzadas com soros de pacientes com outras micoses, mas não com antisoro de coelho anti-P. brasiliensis e anti-C. immitis. Negroni et al. (1998), obtiveram e estudaram o perfil de reatividade de exoantígenos de H. capsulatum a partir de três amostras recém isoladas, cultivadas em ágar-caldo glicosado a 2%, a 27º C, por sete dias com posterior incubação em solução de mertiolato-borato de sódio 1:5.000 e fenil-metil-sulfonil-fluorato (PMSF), por 72 horas, a temperatura ambiente. Após centrifugação o sobrenadante foi armazenado a –20ºC. Os exoantígenos foram concentrados 25 vezes e a concentração de proteínas ajustada para 5,5 mg/mL e testados pela técnica de imunodifusão frente a 50 soros: 7 de pacientes HIV negativo e 43 de pacientes HIV positivo, obtendo um padrão de reatividade de 34,8% de positividade contra 13,9% da histoplasmina em pacientes HIV positivo e 100% de positividade contra 71,4% da histoplasmina em pacientes HIV negativo. Garcia et al. (1990), obtiveram exoantígenos utilizando quatro amostras de H. capsulatum cultivadas em caldo neopeptona, glicose, tiamina e asparagina (NGTA), a 36ºC, sob agitação constante, por um, dois e três meses, avaliando-os frente a soro hiperimune anti-H. capsulatum, soros homólogos e heterólogos de pacientes e antígeno de referência empregando a técnica de ID. Dos antígenos avaliados, três apresentaram a presença das frações H e M e um produziu somente a fração H. Dois antígenos apresentaram reação cruzada frente aos soros heterólogos. Williams et al. (1991), estudando o antígeno polissacáridico de H. capsulatum no soro e em tecido, verificaram que o nível do mesmo está 64 relacionado com a gravidade da HP, sendo útil para monitorar a gravidade da doença e a eficácia da terapia anti-fúngica. Segundo Green e Pine (1985) e Harris e Deepe (1998), o antígeno H é uma glicoproteína constituída por 10 a 30% de carboidratos, apresentando massa molecular de 108 -120 kDa e ponto isoelétrico de 4,5. Na análise imunoquímica, o antígeno M foi caracterizado como uma glicoproteína com massa molecular de aproximadamente 70-94 kDa (Reiss et al.,1986; Hamilton, 1990; Zancopé-Oliveira et al., 1993; ZancopéOliveira et al., 1994) e ponto isoelétrico de 4,7 (Green e Pine, 1985). Zancopé-Oliveira et al. (1994 a), descreveram que o antígeno M contém epítopos espécie-específico e epítopos glicosídicos. Segundo ZancopéOliveira et al. (1994 b), os epítopos do peptídeo reagem com anticorpos humanos não sendo afetados pela deglicolisação. Visando a purificação das frações H e M de H. capsulatum e sua aplicação como padrões primários, na prova de ID, no imunodiagnóstico da HP, Bradley (1974), fracionou em colunas de cromatografia (Sepahadex G100, Sephadex G-200 e DEAE celulose) histoplasmina contendo mertiolato (1:10.000). As frações foram monitoradas por SDS-PAGE, ID e FC. A análise dos resultados demonstrou que as frações H e M da histoplasmina são constituídas por um complexo de pelo menos cinco antígenos H e três antígenos M. Os autores verificaram ainda, pela técnica de SDS-PAGE, a presença de um antígeno M com massa molecular superior a 200.000 daltons e dois antígenos H com peso molecular superior a 200.000 daltons, apresentando essencialmente uma simples banda protéica. Pela ID e FC, foi possível verificar que as duas frações H e a fração M, quando avaliadas frente a soros de pacientes com HP, blastomicose e coccidioidomicose, reagiam apenas com soros de pacientes com HP ou com suspeita clínica de HP, demonstrando também reatividade contra anticorpos anti- H e anti-M, respectivamente. Os autores demonstraram ainda, que ambos (H e M) 65 apresentaram em sua composição açúcares como: galactose, glicose, manose e hexoamina, sendo a manose o açúcar predominante. Os antígenos H e M de H. capsulatum possuem epítopos semelhantes aos apresentados pelo antígeno C, uma galactomanana que causa reatividade cruzada compartilhada pelos principais fungos dimórficos (Reiss et al., 1986; Zancopé-Oliveira et al., 1994 a). Zancopé-Oliveira et al. (1994 a), avaliaram por SDS-PAGE e immunoblot o antígeno M e os produtos obtidos por oxidação e deglicolização enzimática, utilizando anticorpo monoclonal murino específico. Ao analisar o antígeno bruto, foi verificado uma forte reação contra a proteína de 94 kDa (antígeno de M). Quando a preparação antigênica foi submetida ao tratamento com metaperiodato de sódio e deglicolisação enzimática, observou-se reatividade frente a proteínas de 74, 80 e 88 kDa. Ao avaliar antígenos tratados frente a anticorpo monoclonal anti-antígeno C, a autora demonstrou que a oxidação promovida pela adição de metaperiodato de sódio foi capaz de eliminar epítopos, do antígeno C, presente no antígeno de M. Zancopé Oliveira et al. (1999), avaliaram molecularmente o antígeno M identificando a natureza biológica deste. Realizou sua purificação a partir da histoplasmina, fazendo digestão parcial com proteinases, e cromatografia para separar os peptídeos liberados. Um fragmento de 321 bp do gene que codifica o antígeno M foi amplificado a partir do DNA genômico do H. capsulatum e usado para selecionar uma biblioteca genômica do DNA fúngico, conduzindo ao isolamento, clonagem, e seqüênciamento do gene. O gene da fração M consiste em DNA 2.187 bp que codifica uma proteína de 80,719 Da, que apresenta homologia significativa a catalase do Aspergillus fumigatus, A. nidulans, A. niger e Eimericella. A proteína recombinante de fusão era imunorreativa com os anticorpos monoclonais, anti-soro anti-M e amostra de soro de paciente com 66 HP. O gene que codifica o antígeno imunodominante M do H. capsulatum é provavelmente uma catalase, proteína recombinante com atividade de sorodiagnóstico. 67 2.0. RELEVÂNCIA Nos últimos anos, o estudo de antígenos fúngicos tem assumido notável importância, principalmente no que diz respeito à aplicabilidade dos mesmos, como reagentes biológicos na avaliação da resposta imune celular e/ou humoral de indivíduos acometidos por patologias causadas por agentes fúngicos. Uma das motivações para o estudo destes antígenos esta relacionada as fortes evidências de que os processos infecciosos causados por fungos patogênicos ou oportunistas passaram a ser considerado grave problema de Saúde Pública. Postula-se que o aumento expressivo da incidência de processos infecciosos causados por Candida sp, Aspergillus sp, Cryptococcus neoformans, H. capsulatum, C. immitis e P. brasiliensis, espécies fúngicas normalmente pouco invasivas para hospedeiros imunocompetentes, vem aumentando concomitantemente ao uso de antibióticos, drogas imunossupressoras, uso prolongado de medicação administrada por via parenteral, diálise peritoneal, uso de cateteres, radioterapia e quimioterapia, sendo observado com maior freqüência em indivíduos portadores de doenças debilitantes como no caso das imunodeficiências congênitas ou adquiridas entre as quais pode-se citar: doença granulomatosa crônica, Aids, doenças neoplásicas, Diabetes mellitus e pacientes transplantados (Marques e Shikanai-Yasuda, 1994; Khoo e Denning, 1994; Kappe, et al., 1998; Lazzarini-de-Oliveira, 1999; Benard e Duarte, 2000; Marques et al., 2000; Negroni, 2001; Wanke et.al, 2001). O diagnóstico laboratorial das infecções causadas por agentes fúngicos é realizado empregando-se métodos diretos e indiretos. Entre os primeiros, podemos destacar os exames diretos os quais baseiam-se na observação, em microscópio óptico, de alguns aspectos morfológicos dos fungos, a partir do preparo de lâminas contendo material biológico (a fresco 68 ou fixado) como: secreções, raspados de lesões, escarro, lavado brônquico ou broncoalveolar, pús e biopsias mucocutâneas (Mendes-Giannini e Melhem, 2001). Pode-se dizer, que dificuldades no diagnóstico preciso das micoses estão muitas vezes relacionadas à falta de caracteres clínicoradiológicos diferenciais, principalmente entre as micoses sistêmicas e outras patologias. Nestes casos, o conjunto de evidências micológicas e histopatológicas fornecem as únicas bases para a obtenção de um diagnóstico confiável. Contudo, em algumas situações entre as quais podese citar a falta de técnico com experiência na pesquisa direta de estruturas fúngicas, compatíveis com Histoplasma e estado físico ou clínico dos pacientes, tornam-se impossível o acesso ao local da lesão, impedindo assim a coleta do material biológico. Deste modo, a pesquisa de anticorpos e antígenos circulantes, específicos no soro de pacientes, assume grande importância no diagnóstico indireto (sorológico), sendo comprobatório da infecção (Kaufman e Reiss, 1986; Mendes-Giannini et al., 1989; Ferreira-da-Cruz, 1990; Freitas-da-Silva, 1992; Figueroa, 1994; Hamilton, 1998; Salina, 1998; Sugizaki, 1999; Do Valle, 2001). Técnicas sorológicas como ELISA, FC, Imunoeletroforese, Immunoblotting e Imunodifusão Radial Dupla têm sido utilizadas para a detecção de anticorpos circulantes em micoses causadas por H. capsulatum, P. brasiliensis, A. fumigatus, Candida sp, entre outros (Hopwwod e Evans, 1991). Apesar da disponibilidade de vários ensaios sorológicos, a ID é a mais utilizada para o diagnóstico confirmatório de micoses como: histoplasmose, paracoccidioidomicose e aspergilose, uma vez que permite ao clínico realizar o acompanhamento da evolução da doença bem como o 69 monitoramento da eficácia do tratamento terapêutico por meio da análise da queda do título de anticorpos circulantes. Além destes aspectos, deve ser levado em consideração o fato desta metodologia apresentar sensibilidade e especificidade adequadas, ser de fácil exeqüibilidade técnica e baixo custo operacional, não necessitando de automação (Ferreira-da-Cruz et al., 1985). Para a realização desta metodologia, recomenda-se que o antígeno utilizado para detectar a presença de anticorpos circulantes no soro de pacientes com suspeita clínica de micoses, como as anteriormente descritas, seja de fácil obtenção, apresentem estabilidade e especificidade e principalmente permitam a obtenção de resultados reprodutíveis. Diante do exposto, fica claro que a obtenção de antígenos de referência para o uso em ensaios imunológicos é de vital importância. A obtenção destes antígenos associado a existência de uma metodologia extremamente padronizada, ou seja, ID permitirá aos clínicos e laboratoristas resultados confiáveis e que possam ser reproduzidos em qualquer laboratório. 70 3.0. OBJETIVOS O objetivo deste estudo foi o estabelecimento de um protocolo definido para a produção de antígeno a partir de amostras de H. capsulatum var. capsulatum que possa ser utilizado como referência em ensaios sorológicos que visam o diagnóstico confirmatório da histoplasmose. Objetivos específicos: 1. Avaliar os aspectos morfológicos das amostras de H. capsulatum var. capsulatum a fim de averiguar se a produção de conídios esta relacionada com a expressão de antígenos H e M; 2. Avaliar a cinética de crescimento das amostras de H. capsulatum var. capsulatum como critério de seleção das amostras fúngicas para a produção de antígenos; 3. Avaliar antígenos de H. capsulatum var. capsulatum obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), cultivados em ágar Sabourauddextrose, 27o C, durante 15 e 33 dias; 4. Verificar a presença de antígenos H e M nos diferentes lotes antigênicos; 5. Avaliar a sensibilidade e especificidade, pela prova de imunodifusão dupla, dos diferentes antígenos frente a soros de pacientes com HP (infecção e doença), soros heterólogos, anticorpos policlonais antiantígeno de H. capsulatum var. capsulatum, anti-antígeno de P. brasiliensis e anti-antígeno de A. fumigatus; 6. Avaliar a estabilidade antigênica dos antígenos obtidos. 71 4.0. CONSIDERAÇÔES ÉTICAS A realização deste projeto de pesquisa foi aprovada pela Comissão Científica da Divisão de Biologia Médica do Instituto Adolfo Lutz (IAL) e Comitê Técnico Cientifico (Projeto CTC-IAL # 06/04). [Anexos A] Seguindo as diretrizes da Resolução 196/96, o referido trabalho foi submetido e aprovado pelos Comitês de Ética em Pesquisa das Instituições envolvidas no mesmo, a saber: § Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo Lutz (Projeto CTCIAL # 06/04); § Comissão de Ética para Análise de Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (Projeto # 983/03); § Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (Projeto # 10/03). [Anexos B, C e D] 72 5.0. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL Amostras de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas sem agitação, a 27º C 15 dias 33 dias 90 dias(agar Sabouraud-dextrose) 45 dias (ágar batata) Obtenção de exoantígeno de Micromorfologia H. capsulatum, cultivado em Macromorfologia e Curva de ágar Sabouraud-dextrose, crescimento 27º C,segundo Kaufman e Standard (1978). Ø Dosagem de proteínas Ø IDD Ø SDS-PAGE 10% Ø Imunoblotting 73 6.0. Materiais e Métodos 6.1. Amostras Fúngicas 6.1.1. Amostras de H. capsulatum var. capsulatum Foram utilizadas as amostras 49, 200, 212, 268, 299, 340, 361, 406, 584, 802, 2030 e RP de H. capsulatum, isoladas de materiais clínicos de pacientes com HP (Tabela 3), atendidos no Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo, Centro de Referência para o Tratamento da Aids (CRTAids) e Instituto de Infectologia Emílio Ribas e enviadas ao Laboratório de Micologia (LIM-53) do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo para isolamento e identificação. As amostras fúngicas são mantidas na Coleção de Culturas Emergentes do referido Laboratório na fase filamentosa, em ágar batata [Anexo E, item E.1.1], a 27º C, sendo repicadas a cada três meses. 6.1.2. Amostras de Paracoccidioides brasiliensis Foi utilizada a amostra 113 de P. brasiliensis, gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Carlos da Silva Lacaz do Laboratório de Micologia Médica (LIM-53) do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo. Esta amostra é mantida na Micoteca do Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses, da Seção de Imunologia do IAL na fase filamentosa em ágar batata [Anexo E, item 5.2.1], a 27º C, sendo repicada a cada três meses. 6.1.3. Amostras de Aspergillus fumigatus Foram utilizadas as amostras 354, 456 e 727 de A. fumigatus, gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Carlos da Silva Lacaz do Laboratório de 74 Micologia Médica (LIM-53) do Instituto de Medicina Tropical da Universidade de São Paulo. Estas amostras são mantidas na Micoteca do Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses, da Seção de Imunologia do IAL na fase filamentosa em ágar batata [Anexo E, item 5.2.1], a 27º C, sendo repicadas a cada três meses. 6.2. Animais Coelhos albinos da raça Nova Zelândia, machos de aproximadamente quatro meses de idade, oriundos do Biotério do Instituto Adolfo Lutz, foram utilizados para a obtenção de anticorpos policlonais antiexoantígeno de H. capsulatum, anti-exoantígeno de P. brasiliensis e antiexoantígeno de A. fumigatus. Os animais foram mantidos no Biotério de Inoculação de Animais, do referido Instituto, sendo que os procedimentos experimentais realizados respeitaram a Ética Animal, ou seja, os coelhos não foram submetidos à situação desnecessária de estress, privação de comida ou água, sendo garantida a ventilação e luminosidade necessária para o bem estar dos mesmos. 6.3. Soros Foram analisados quanto à presença de anticorpos circulantes anti-H. capsulatum um total de 105 amostras de soros assim distribuídos: § 15 amostras de soro de indivíduos sadios, doadores de banco de sangue e gentilmente cedidos pela Fundação Hemocentro de São Paulo; 75 § 13 amostras de soro de indivíduos com leishmaniose cutânea (07) e leishmaniose-mucocutânea (06); referentes à demanda de amostras recebidas pelo Laboratório de Imunologia do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (LIM 48), para a confirmação sorológica da doença; § 22 amostras de soro de indivíduos com histoplasmose, referentes à demanda de amostras recebidas pelo Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz para a confirmação sorológica da doença; § 07 amostras de soro de três indivíduos com histoplasmose infecção, oriundos de casos sorologicamente positivos, identificados após um inquérito soroepidemiológico realizado em um grupo de 15 espeleólogos pelo Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz; § 16 amostras de soro de indivíduos com confirmação sorológica de paracoccidiodomicose (PCM), recebidas pelo Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz; § 10 amostras de soro de indivíduos com confirmação sorológica de aspergilose, recebidas pelo Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz; § 11 amostras de soro de indivíduos com suspeita clínica de histoplasmose e que apresentaram ausência de reatividade ao H. capsulatum, pela prova de imunodifusão dupla em gel de agarose, frente a antígenos de referência, recebidas pelo Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz; 76 11 amostras de soro de indivíduos que apresentam como hábito freqüentar cavernas localizadas em diferentes regiões geográficas do Brasil e que haviam mostrado ausência de reatividade para H. capsulatum, pela prova de imunodifusão dupla em gel de agarose, frente a antígenos de referência. 6.3.1. Soro Controle Positivo de Referência Os diferentes lotes antigênicos produzidos foram avaliados frente a soro controle positivo de referência anti-H. capsulatum, produzido em cabra, anti-fração H e M (Immuno-Mycologics, Inc, Norman, USA). 6.3.2. Soros Hiperimunes Obtidos em Coelhos § Anticorpo policlonal anti-exoantígeno de H. capsulatum var. capsulatum obtido em coelho, lote 01/2000, produzido pelo Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da Seção de Imunologia do IAL; § Anticorpo policlonal anti-exoantígeno de P. brasiliensis obtido em coelho, lote 01/2000, produzido pelo Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da Seção de Imunologia do IAL; § Anticorpo policlonal anti-exoantígeno de A. fumigatus obtido em coelho, lote 01/2000, produzido pelo Laboratório de Imunodiagnóstico das Micoses da Seção de Imunologia do IAL; 77 6.4. Aspectos Morfológicos das Amostras de H. capsulatum var. capsulatum 6.4.1. Cultivo das Células Fúngicas em Tubos Tubos de ensaio 20 x 200 mm, contendo ágar batata e/ou ágar Sabouraud-dextrose (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA) , foram inoculados em três pontos, com inóculos diminutos de amostras de H. capsulatum e mantidos a 27º C, durante 33 dias. Amostras fúngicas cultivadas nestas condições foram analisadas quanto aos aspectos macro e micromorfológicos. 6.4.2. Cultivo das Células Fúngicas em Placas e Curva de Crescimento Amostras de H. capsulatum foram inoculadas, no ponto central, de placas de Petri (90 x 15 mm) contendo 20,0 mL de ágar Sabourauddextrose (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA), a 27º C, durante 90 dias. A análise das macro-colônias orientou-nos na avaliação da velocidade de crescimento do fungo, diâmetro alcançado, perfil e bordas, textura e coloração de cada amostra. O exame destas macro-colônias durante o seu desenvolvimento foi realizado com cuidado, sem inversão da posição das placas, que estavam sendo incubadas, a fim de evitar a formação de colônias satélites, que prejudicam o pleno desenvolvimento da colônia central. 6.4.3. Cultivo em Lâmina A técnica de cultivo em lâmina, para a o estudo micromorfológico das amostras de H. capsulatum, foi realizada segundo metodologia proposta por Riddell (1950). 78 Quinze mililitros de ágar batata foram distribuídos em placas de Petri estéril, após a solidificação do ágar, com o auxílio de um bisturi previamente flambado, cortou-se porções de aproximadamente 1,0 cm2 de ágar, sendo estas distribuídas na superfície central de lâminas de microscopia dispostas em placas de Petri estéril. A seguir, semeou-se nos quatro lados do fragmento de meio de cultura pequenos fragmentos de micélio, cobrindo-o com lamínula estéril. Após esta etapa, fechou-se a placa de Petri, tomando-se o cuidado de umedecer o ambiente para possibilitar o desenvolvimento fúngico, incubando o sistema a 27º C. O crescimento fúngico bem como sua esporulação foi monitorada semanalmente, pela observação ao microscópio óptico (Olimpus, modelo BX51FL-IV). Após 45 dias de cultura, removeu-se com o auxílio de um estilete flambado, a lamínula e o fragmento de ágar batata, adicionando-se uma gota de álcool 95% (Merck, Darmstadt, Alemanha) no centro da lamínula e outra no centro da lâmina, objetivando a melhor penetração do corante. Na superfície central de uma lâmina de vidro, colocou-se uma gota de azul de algodão e sobre esta se colocou a lamínula contendo o cultivo. Sobre a lâmina contendo a outra parte do cultivo, colocou-se outra lamínula de vidro, vedando o sistema com esmalte de unha. Após a montagem do sistema, examinou-se a microscopia óptica. 79 Tabela 3. Amostras de Histoplasma capsulatum var. capsulatum Amostras de H. capsulatum Data Isolamento Tempo em micoteca (anos) 49 12/02/1996 7 200 14/10/2002 212 Material Biológico Dados Clínicos dos Pacientes Microrganismo Isolado HIV + Histoplasma capsulatum e Cryptococcus neoformans 1 Lavado broncoalveolar Sangue periférico Fragmento de pele Lesão cutânea Histoplasma capsulatum 31/10/1996 7 Líquor HIV + Histoplasma capsulatum 268 24/02/1997 6 Líquor HIV+ Histoplasma capsulatum 299 26/03/1997 6 Sangue periférico HIV+ Histoplasma capsulatum 340 04/06/1997 6 Sangue Periférico HIV+ Histoplasma capsulatum 6 Fragmento de pele Lesão cutânea Histoplasma capsulatum 406 31/071997 29/10/1997 6 Líquor HIV+ Histoplasma capsulatum 584 20/11/1998 5 Medula óssea HIV+ Histoplasma capsulatum 802 16/03/2000 3 Urina Transplantado renal Histoplasma capsulatum 2030 RP 05/12/2001 02/07/1990 2 13 Sangue periférico Urina HIV+ Diabetes mellitus Histoplasma capsulatum e Cryptococcus neoformans Histoplasma capsulatum 361 HIV: Vírus da Imunodeficiência Humana 6.5. Meios de Cultura Os meios de cultura utilizados para o desenvolvimento deste trabalho, suas respectivas formulações e modo de preparo encontram-se descritos no Anexo 5. 6.6. Antígenos Fúngicos 6.6.1. Antígeno de H. capsulatum var. capsulatum A obtenção de antígenos de H. capsulatum foi realizada segundo metodologia proposta por Kaufman e Standard (1978), com algumas modificações. Desta forma, células micelianas de cada uma das doze amostras de H. capsulatum, mantidas em ágar batata a 27º C, foram primeiramente adaptadas em ágar Sabouraud-dextrose (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA), com repiques mensais, mantendo-se esta mesma temperatura, durante quatro meses. Após o período de adaptação, realizouse a expansão das culturas fúngicas, onde cada amostra foi semeada em 50 tubos de ensaio (20 x 200 mm) contendo 20,0 mL de ágar Sabourauddextrose (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA), sendo incubada a 27º C por 15 e 33 dias. Finalizado o período de incubação, as culturas foram cobertas com solução de borato-thimerosal a 1:5000 e deixadas em repouso por 24 horas a 27º C. Em seguida os sobrenadantes foram coletados e filtrados, em papel Whatman® número 03 (Whatman, Brentford, Reino Unido) e os sobrenadantes concentrados 10 e 20 vezes por liofilização (Edward’s – Super Modulyo), sendo armazenados a -20ºC até o momento do uso. O meio de cultura e a solução utilizada para o preparo do antígeno de H. capsulatum encontram-se descritos nos ANEXO E (itens E.1.1. e E.2.1) e ANEXO F, respectivamente. 82 6.6.2. Antígeno de P. brasiliensis A obtenção do Antígeno de P. brasiliensis foi realizada segundo metodologia proposta por Garcia (1993). Após a reversão para a fase de levedura células da amostra 113 de P. brasiliensis cultivadas em quatro tubos (18 x 180 mm) contendo 10,0 mL de ágar NGTA (neoptona-glicose, tiamina e asparagina), a 36º C por sete dias, foram transferidas para frascos de 500,0 mL tipo Erlenmeyer, contendo 250,0 mL de caldo NGTA, sendo incubadas em estufa contendo plataforma de agitação orbital, por 20 dias, a 36o C, com rotação constante de 50 rpm (Incubadora com plataforma de agitação orbital, modelo 430D, Nova Ética, Vargem Grande Paulista, São Paulo, Brasil). Após o período de incubação, o crescimento fúngico foi interrompido pela adição de solução borato-thimerosal 1:5000 e o cultivo mantido em repouso por cinco dias a 4ºC. Após esta etapa, as leveduras foram separadas por filtração em papel Whatman® número 03 (Whatman, Brentford, Reino Unido). O sobrenadante foi aliquotado e armazenado a 4ºC até o momento do uso. O meio de cultura e a solução utilizada para o preparo do antígeno de P. brasiliensis encontram-se descritos nos ANEXO E (item E.4.1) e ANEXO F, respectivamente. 6.6.3. Antígeno de A. fumigatus Para a obtenção deste antígeno, o crescimento fúngico de sete dias de quatro tubos contendo células micelianas das amostras 354, 356 e 727 de A. fumigatus crescidos em ágar Sabouraud-dextrose (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA), a 27°C, foram inoculados em frascos de 500,0 mL tipo Erlenmayer contendo 250,0 mL de caldo Sabouraud-dextrose (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA) e incubados por 30 dias, a 27°C, em fase estacionária. Após este período, as culturas foram inativadas pela 83 adição de solução thimerosal 1:5000 e deixadas em repouso durante cinco dias a 4oC. Em seguida foram filtradas em papel Whatman® número 03 (Whatman, Brentford, Reino Unido), e os sobrenadantes concentrados 10 vezes por liofilização (Edward’s–Super Modulyo), sendo armazenados a 20ºC até o momento do uso. O meio de cultura e a solução utilizada para o preparo do antígeno de A. fumigatus encontram-se no ANEXO E (item E.2.1) e ANEXO F. 6.6.4. Antígenos de Referência de H. capsulatum var. capsulatum Foram utilizados como antígenos de referência de H. capsulatum, o antígeno (H e M) de H. capsulatum da Immuno Mycologics, Inc., Norman,USA e filtrado de cultura de H. capsulatum produzido pela Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual Paulista de Araraquara. 6.7. Determinação da Viabilidade Fúngica A determinação da viabilidade dos fungos P. brasiliensis e A. fumigatus foi realizada inoculando amostras das culturas inativas pela adição de solução de thimerosal-borato (1:5000), em ágar Sabouraud-dextrose (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA) e Ágar infusão-cérebro-coração (BHI) (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA) deixando-os em cultura estacionária, a 27ºC, por um período de 30 a 45 dias. 84 6.8. Determinação da Esterilidade dos Antígenos Fúngicos A determinação da esterilidade dos antígenos de H. capsulatum, P. brasiliensis e A. fumigatus foi realizada inoculando os sobrenadantes de cultura inativados com solução de thimerosal em ágar Sabouraud-dextrose (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA) e ágar BHI (Difco Laboratories, Detroit, Mi, USA) e deixando-os em cultura estacionária, à temperatura de 36°C por um período de 30 a 45 dias. 6.9. Determinação de Proteínas dos Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum As concentrações protéicas dos antígenos obtidos foram realizadas segundo método proposto por Bradford (1976), que utiliza Coomassie Brilliant Blue G-250 (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA) como reativo e albumina bovina (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA) 1,0 mg/mL como padrão. O preparo do reativo de Coomassie Brilliant Blue encontra-se descrito no Anexo G. 6.10. Imunodifusão Dupla em Gel de Agarose (ID) Esta metodologia proposta por Ouchterlony (1949), foi utilizada para verificar a reatividade dos diferentes antígenos de H. capsulatum frente a soros de pacientes portadores de histoplasmose doença e infecção, paracoccidioidomicose, aspergilose, leishmaniose cutânea e muco-cutânea, soros de indivíduos com suspeita clínica de histoplasmose e não reagentes pela prova de imunodifusão frente a antígeno de referência (ImmunoMycologics, Inc, Norman, USA), soros 85 de indivíduos que visitam freqüentemente cavernas, soros de indivíduos sadios e soros hiperimunes produzidos em coelhos anti-antígeno de H. capsulatum, anti-antígeno de P. brasiliensis e anti-antígeno Aspergillus fumigatus, bem como frente a soro controle positivo de referência anti-H. capsulatum (Immuno-Mycologics, Inc, Norman, USA). Lâminas de vidro (26x75 mm) foram primeiramente revestidas com 1,0 mL de solução de ágar a 1%. Estas foram então recobertas com 3,0 mL de solução de ágar-citrato e deixadas em câmara úmida, até a solidificação da agarose. O gel foi escavado com auxílio de molde em forma de roseta (Bioficina-Indústria e Comércio de Aparelhos Laboratoriais São Paulo-Brasil), contendo um orifício central e seis laterais, sendo o excesso do gel retirado empregando-se pipeta Pasteur acoplada a bomba de vácuo (DIA-PUMP Compressor, FANEN, São Paulo, Brasil). Após a aplicação dos reagentes nos orifícios, as lâminas foram incubadas em câmara úmida, à temperatura ambiente, por 48 horas. Após esse período, com o auxílio de negatoscópio, realizou-se a leitura para verificação de linhas de precipitação. As lâminas de vidro foram lavadas por 45 minutos em solução citrato de sódio 5% seguindo-se de sucessivas lavagens, por 24 horas, em solução salina. Ao fim dessa etapa, os orifícios foram recobertos com solução de ágar 1% e as lâminas levadas para secar em estufa a 60°C (FANEN, São Paulo, Brasil). Após secagem, as lâminas foram coradas pelo Coomassie Brilliant Blue R (Sigma-Aldric Co., St. Louis, Missouri, USA), durante 10 minutos e em seguidas descoradas. A leitura definitiva foi então realizada. As soluções, tampões, corantes e descorantes utilizados na técnica de ID encontram-se nos ANEXO H. 86 6.11. Análise do Perfil Eletroforético dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum 6.11.1. SDS-PAGE Os procedimentos para eletroforese vertical em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS) (Sigma-Aldrich Co.,St. Louis, Missouri, USA) foram conduzidos segundo metodologia proposta por Laemmli (1970), com gel de separação linear a 10% e gel de empilhamento a 3% de acrilamida com espessura de 1,0 mm; empregando equipamento Mini-Protean II Electrophoresis Cell (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Califórnia, USA). As diferentes preparações antigênicas foram denaturadas por aquecimento a 100º C por 5 minutos em tampão de ruptura (62 mM de TrisHCl pH 6,8 contendo 0,2% (p/v) de SDS, 50 mM de 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA), 0,005% de azul de bromofenol (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA) e 10% (v/v), de glicerol (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA), em água deionizada), sendo aplicadas 30 µL de antígeno em cada orifício para visualização do padrão protéico de migração dos mesmos; e para a transferência (western Blotting), 250 µL de antígeno em cada mini-gel, quando utilizou-se pente preparativo. A corrida eletroforética foi realizada com diferença de potencial de 100 V para percorrer o gel de empilhamento e 120 V para percorrer o gel de separação, empregando-se fonte (Hoefer Power supply, modelo SX 250, Hoefer Pharmacia Biotech Inc., São Francisco, Califórnia, USA). Para cada corrida eletroforética foi utilizado padrão de baixo peso molecular (PM), composto de: MBP-β-galactosidase (175.000 Da), MBPparamiosina (83.000 Da), desidrogenase glutâmica (62.000 Da), aldolase (47.500 Da), triose-fosfato-isomerase (32.500 Da), β- lactoglobulina A 87 (25.000 Da), lisozima (16.500 Da) e aprotinina (6.500 Da) (New England Biolabs Inc., Woburn, Massachussetts, USA). A partir da análise da migração destes padrões, as massas moleculares das proteínas fúngicas foram calculadas. Ao término da corrida eletroforética, para visualização das bandas protéicas o gel foi corado pelo Coomassie azul brilhante (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Missouri, USA). As soluções, tampões e corantes utilizados na técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida encontram-se no ANEXO I. 6.11.2. Immunoblotting A transferência eletroforética de proteínas contidas em géis de poliacrilamida para membranas de nitrocelulose foi executada conforme metodologia descrita por Towbin et al. (1979), usando equipamento TransBlot System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, Califórnia, USA). Após a eletroforese, os géis foram apostos sobre membranas de nitrocelulose de 0,22 µm (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, USA), recobertos com papel de filtro e comprimidos com esponjas de poliuretano. Todo o material utilizado foi previamente embebido em tampão de transferência constituído por 25 mM de Tris-HCl, glicina 192 mM e metanol 20% (v/v), sendo em seguida, encaixados em placas acrílicas perfuradas e mergulhadas na cuba de eletroforese contendo o mesmo tampão. A transferência foi realizada empregando-se amperagem constante de 150 mA por 3 horas, em banho de gelo. Após a transferência, para verificar a eficácia do processo, as membranas foram coradas com 88 Ponceau-S (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, Mo, USA) por 10 minutos e descoradas em água bidestilada. As membranas contendo as proteínas transferidas foram identificadas, cortadas em tiras, de aproximadamente 0,5 cm, e incubadas por 1 hora, a temperatura ambiente, em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7,4 contendo 5% de leite desnatado (Molico, Nestlé, São Paulo, BR), para a saturação dos sítios inespecíficos; em plataforma agitadora para blotting (Bioficina-Indústria e Comércio de Aparelhos Laboratoriais São Paulo-Brasil). Em seguida, as fitas foram depositadas em canaletas e incubadas com soros de pacientes com HP doença e infecção, soros de indivíduos com suspeita clínica de HP e não reagentes para H. capsulatum pela técnica de ID, soros de pacientes com PCM e aspergilose, soros de indivíduos saudáveis, soros de indivíduos com leishmaniose, soros de indivíduos que freqüentam cavernas e não reagentes para H. capsulatum pela técnica de ID e com soro hiperimune obtidos em coelhos anti-exoantígeno de H. capsulatum var. capsulatum. Os soros foram aplicados sobre as membranas no volume final de 1,0 mL na diluição de 1:100 em tampão PBS pH 7,4. Nesta etapa o ensaio foi realizado a temperatura ambiente sob agitação constante (Plataforma agitadora para blotting, Bioficina-Indústria e Comércio de Aparelhos Laboratoriais, São Paulo-Brasil), por 18 h. Finalizado o período de incubação, as fitas de nitrocelulose foram lavadas por seis vezes de 10 minutos cada em solução PBS acrescida de 0,1 % de Tween 20 [PBST] (Sigma -Aldrich Co. St. Louis, Mo, USA). Após esta etapa, as membranas foram incubadas com soro antiIgG conjugado à peroxidase ou fosfatase alcalina espécie-específico (SigmaAldrich Co. St. Louis, Mo, USA), diluído a 1:1000 e mantidas por 2 h sob agitação constante (Plataforma agitadora para blotting, Bioficina-Indústria e Comércio de Aparelhos Laboratoriais, São Paulo-Brasil), a temperatura 89 ambiente, protegidas da luz, sendo em seguida lavadas por seis vezes de 10 minutos cada, em solução PBS-T . O desenvolvimento da cor da reação foi obtido empregando-se solução de 4-cloro-1naftol (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, Mo, USA) ou Nitro Blue Tetrazolium (NBT) e 5-Bromo-4Chloro-3-Indolyphosphate (BCIP) (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, Mo, USA), na dependência do conjugado empregado. O bloqueio da reação foi feito por lavagens sucessivas em água bidestilada. As soluções, tampões e corantes utilizados no ensaio de Immunoblotting encontram-se no ANEXO I. 6.11.3. Determinação do Peso Molecular Os pesos moleculares (PMs) das bandas protéicas foram determinados colocando seus Rf(s) (Referent front) na curva de calibração construída com os padrões de PM (New England Biolabs Inc., Woburn, Massachussetts, USA). A curva foi traçada em papel monolog, colocando-se os valores dos padrões de PM no eixo das ordenadas e os valores calculados no eixo das abscissas. Rf = distância em mm da migração de cada padrão ou amostra dividido pela distância em mm da migração do corante azul brilhante-R. 6.12. Antissoros 6.12.1. Soro de Coelho Anti-antígeno de H. capsulatum var. capsulatum. Coelhos albinos foram imunizados por via subcutânea com 100ug de filtrado de cultura de H. capsulatum, gentilmente cedido pelo Laboratório 90 de Micosorologia do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, em quatro sítios distintos, com adjuvante completo de Freund (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, Mo, USA) na proporção 1:1 na primeira imunização e com adjuvante incompleto de Freund (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, Mo, USA) nas subseqüentes, repetidas a cada semana, por um período de 30 dias. 6.12.2. Soro de Coelho Anti-exoantígeno de P. brasiliensis e Antiexoantígeno de A . fumigatus Foi seguido o mesmo protocolo descrito no item 6.12.1. 6.13. Purificação de Imunoglobulinas A purificação das imunoglobulinas foi realizada a partir do soro de animais previamente imunizados, seguindo-se a metodologia proposta por McKinney e Parkinson (1987). Após o término do protocolo de imunização, procedeu-se sangria teste para verificação da reatividade dos soros dos animais frente a antígenos espécie-específicos empregando-se a prova de imunodifusão dupla em gel de agarose. Animais foram então submetidos à sangria total, por meio de punção cardíaca. Após retração do coágulo, aferiu-se o volume de soro obtido acrescentando-se tampão acetato pH 4.0, na relação 1:4. Após novo ajuste do pH da mistura para 4.5, acrescentou-se lentamente 2,5 mL de ácido caprílico (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, Mo, USA) para cada 100,0 mL do volume total da mistura, deixando sob agitação lenta por 30 minutos a temperatura ambiente. Findado o período de agitação, a mistura foi centrifugada a 10.000 x g (Sorvall-Kendro Laboratory Products, USA) a 5º C por 30 minutos. O sobrenadante foi filtrado em papel Whatman® no 1 (Whatman, Brentford, Reino Unido), acrescentando-se a seguir 1,0 mL de 91 tampão PBS-EDTA 10 vezes concentrado para cada 10,0 mL de sobrenadante. O pH da mistura foi ajustado, sob agitação, para 7.4, adicionando-se a seguir 277,0g de sulfato de amônia (Sigma-Aldrich Co. St. Louis, Mo, USA) para cada 1000,0 mL de sobrenadante, afim de atingir 45% de saturação; seguindo-se de agitação em banho de gelo por 30 minutos. Após este período, a mistura foi novamente centrifugada a 10.000 x g (Sorvall-Kendro Laboratory Products, USA) a 5º C por 30 minutos. O sobrenadante foi desprezado e o precipitado resultante foi ressuspendido em 25,0 mL de tampão PBS-EDTA. A suspensão foi dialisada em tampão PBSEDTA a 4º C, sob agitação durante 48 horas, procedendo-se troca do tampão de diálise a cada 4 horas. Após este período, o conteúdo da membrana de diálise foi retirado e aquecido em banho-maria, por 20 minutos a temperatura de 50 a 55º C e centrifugada por 20 minutos a 4000 rpm (Centrífuga Ce-12 Juan Inc, França). O sobrenadante foi filtrado em filtro de 0,22 µm (Millipore), aliquotado e armazenado a -20º C. 6.14.Titulação dos Anti-soros Anti-exontígenos de H. capsulatum var. capsulatum, P. brasiliensis e A. fumigatus A titulação dos soros de coelhos anti-exontígeno de H. capsulatum, P. brasiliensis e A. fumigatus foi realizada pela técnica de ID (item 6.10). 6.15. Análise Estatística O cálculo da sensibilidade e especificidade dos resultados provenientes dos ensaios sorológicos utilizados para a avaliação dos diferentes antígenos de H. capsulatum, empregando-se a técnica de imunodifusão dupla, levando-se em consideração o tempo de cultivo das 92 amostras foi realizado pelo Método de Byes (Minitab V13.1 Software-Minitab Inc., State College, PA). 93 7.0. RESULTADOS 7.1. Aspectos Morfológicos das Amostras de H. capsulatum var. capsulatum A análise dos aspectos macromorfológicos das 12 amostras de H. capsulatum foi realizada avaliando-se o fenótipo das células fúngicas cultivadas a 27º C em ágar batata e em ágar Sabouraud-dextrose (Tabela 4 e Figura 1 e Figura 2). O padrão micromorfológico foi avaliado nas amostras mantidas em ágar batata (Tabela 5 e Figura 3). 7.2. Curva de Crescimento das Células Micelinas de H. capsulatum var. capsulatum e Aspectos Fenotípicos das Colônias Fúngicas Avaliamos as curvas de crescimento das amostras de H. capsulatum, em sua fase miceliana, cultivadas em placas de Petri, contendo ágar Sabouraud-dextrose a 27º C, por 90 dias. A mensuração do diâmetro das colônias gigantes foi realizada medindo-se dois eixos aleatórios, nos seguintes dias após a inoculação dos micélios no meio de cultura: 07, 14, 21, 28, 33, 40, 49, 60, 72, 80 e 90 dias sendo que as médias dos diâmetros foram plotadas para a obtenção da curva de crescimento. As Figuras 4 A e B, 5 A e B, 6 A e B, 7 A e B, 8 A e B e 9 A e B, demonstram a cinética de crescimento das amostras de H. capsulatum. A maioria das amostras fúngicas apresentou crescimento exponencial (fase log) entre o 40º e 47º dia de cultivo, mantendo-se a partir daí em fase estacionária. As amostras 268, 361 e 584 apresentaram crescimento exponencial até o 60º dia e o isolado 406 até o 72º dia de cultura. As amostras 340 e 2030 entraram em fase estacionária no 33º dia de cultura (Figura 6B e Figura 9A). Avaliamos também o verso e o anverso das colônias gigantes, cujas descrições dos aspectos macromorfológicos seguem descritos (Figura 10 e Tabela 6). 94 Tabela 4. Aspectos macromorfológicos das culturas de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar batata e ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, por 33 dias. Meios de Cultura Ágar batata Culturas de H. capsulatum var. capsulatum Ágar Sabouraud-dextrose Textura Pigmentação Textura Pigmentação 49 Cotonosa Bege Cotonosa Branca 200 Cotonosa Ocre Cotonosa Bege 212 Cotonosa/Coreácia Branca Cotonosa Branca 268 Cotonosa Bege Cotonosa Branca 299 Cotonosa Bege a ocre Cotonosa Branca 340 Cotonosa Bege Membranosa/Coreácia Branca 361 Cotonosa Branca Cotonosa/Coreácia Branca 406 Cotonosa Bege Cotonosa/Coreácia Bege clara 584 Cotonosa Bege Cotonosa Branca 802 Cotonosa Bege Cotonosa Branca 2030 Cotonosa Bege Cotonosa Branca RP Cotonosa Bege Cotonosa/Coreácia Branca 95 Figura 01. Macromorfologia das culturas 49 (A), 200 (B), 299 (C), 340 (D), 268 (E) e 406 (F) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar batata, 27ºC, durante 33 dias. A B C D E F Figura 02. Macromorfologia das culturas 49 (A), 212 (B), 361 (C), 406 (D), 2030 (E) e RP (F) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, durante 33 dias. 96 A B C D 97 E F Figura 3. Micromorfologia das amostras 49, 200, 268, 340, 361, 406, 584, 802, 2030 e RP de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar batata, 27o C, por 45 dias e d c d c Hc 49 (400X) Hc 200 (400 X) b Hc 212 (400X) Hc 268 (400X) f d d a Hc 299 (400X) Hc 340 (400X) Hc 361 (400 X) Hc 406 (600X) d f e d Hc 584 (600 X) Hc 802 (400 X) d Hc 2030 (400 X) d Hc RP (600 X) a) Hifas hialinas septadas e delgadas; b) hifas hialinas septadas e espessas; c) microaleuroconídios; d) macroaleuroconídios tuberculados, e) macroaleuroconídios degenerados e f) tubo germinartivo. 98 Tabela 5. Aspectos micromorfológicos, das culturas de H capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar batata, segundo Ridell (1950), 27º C, por 45 dias. Culturas de H. capsulatum var. capsulatum 49 200 212 268 299 340 361 406 584 802 2030 RP Hifa Conídios Microaleuroconídio hialina + + + + + + + + + + + + septada + + + + + + + + + + + + delgada + + + + + + + + + + + espessa + - tubo germinativo + + - 99 Macroaleuroconídio hialino redondo piriforme liso tuberculado degenerado + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + + + + + - + + + + + + + + + + - Figura 4. Curva de crescimento das amostras 49 (A) e 200 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, durante 90 dias. 70 Média em Diâmetro (mm) 60 50 40 Am 49 30 20 10 0 7 14 21 28 33 40 47 60 72 80 90 Tempo (dias) A 70 Média em Diâmetro (mm) 60 50 40 Am 200 30 20 10 0 7 14 21 28 33 40 47 60 72 80 90 Tempo (dias) B 100 Figura 5. Curva de crescimento das amostras 212 (A) e 268 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C durante 90 dias. 70 Média em Diâmetro (mm) 60 50 40 Am 212 30 20 10 0 7 14 21 28 33 40 47 60 72 80 90 Tempo (dias) A 70 Média em Diâmetro (mm) 60 50 40 Am 268 30 20 10 0 7 14 21 28 33 40 47 60 72 80 90 Tempo (dias) B 101 Figura 6. Curva de crescimento das amostras 299 (A) e 340 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, durante 90 dias. 70 Média em Diâmetro (mm) 60 50 40 Am 299 30 20 10 0 7 14 21 28 33 40 47 60 72 80 90 Tempo (dias) A 70 Média em Diâmetro (mm) 60 50 40 Am 340 30 20 10 0 7 14 21 28 33 40 47 60 72 80 90 Tempo (dias) B 102 Figura 7. Curva de crescimento das amostras 361 (A) e 406 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C durante 90 dias. 70 50 40 Am 361 30 20 10 0 7 14 21 28 33 40 47 60 72 80 90 Tempo (dias) A 70 60 Média em Diâmetro (mm) Média em Diâmetro (mm) 60 50 40 Am 406 30 20 10 0 7 14 21 28 33 40 47 60 72 80 90 Tempo (dias) B 103 Figura 8. Curva de crescimento das amostras 584 (A) e 802 (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C durante 90 dias. 70 Crescimento em Diâmetro (mm) 60 50 40 Am 584 30 20 10 0 7 14 21 28 33 40 47 60 72 80 90 Tempo (dias) A 70 Média em Diâmetro (mm) 60 50 40 Am 802 30 20 10 0 7 14 21 28 33 40 47 60 72 80 90 Tempo (dias) B 104 Figura 9. Curva de crescimento das amostras 2030 (A) e RP (B) de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabourauddextrose, 27o C durante 90 dias. Média em Diâmetro (mm) 70 60 50 40 Am 2030 30 20 10 0 7 14 21 28 33 40 47 60 72 80 90 Tempo (dias) A 80 70 Média em Diâmetro (mm) 60 50 40 Am RP 30 20 10 0 7 14 21 28 33 40 47 60 72 80 90 Tempo (dias) B 105 Figura 10. Anverso e verso das colônias gigantes de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, durante 90 dias. Isolado 49 Isolado 200 Isolado 212 Isolado 268 Isolado 299 Isolado 584 Isolado 340 Isolado 802 Isolado 361 Isolado 2030 Isolado 406 Isolado RP 106 Tabela 6. Aspectos macromorfológicos das culturas de H. capsulatum var. capsulatum, cultivadas em ágar Sabourauddextrose, a 27ºC, por 90 dias. Culturas de H. capsulatum var. capsulatum Tipo Pigmentação 49 Cotonoso Branco Sulcos Plana Forma Irregular Textura Membranosa 200 Velutíneo Branco a ocre Sulcos radiais Irregular 212 Cotonoso Branco Plana 268 Cotonoso Branco Salientes com faixas concêntricas Semi-elevada, depressão e saliência Semi-elevada 299 Velutíneo Bege 340 Cotonoso Branco a ocre Semi-elevada, depressão e saliência Plana 361 Cotonoso Bege 406 Cotonoso 584 Macromorfologia Textura Superfície Central Superfície Mediana Borda Pigmentação Área do Inóculo Difusa Exudato - - - Ondulada Ocre Bege claro - Regular Lisa Bege Bege claro - Plana Irregular Membranosa Bege Bege claro - Plana Regular Membranosa Bege - - Faixas concêntricas e sulcos radiais Regular Membranosa Bege - - Saliente e pregueada (coreácia) Sulcos intercalados, micélio membranoso Regular Membranosa Bege claro - - Bege claro Semi-elevada Regular Membranosa Bege claro Bege claro + Cotonoso Branco Saliente Regular Membranosa Bege Bege - 802 Velutíneo Branco Saliente Sulcos radiais seguidas por plana Sulcos radiais, seguidas por plana Plana Regular Membranosa - Bege claro - 2030 Cotonoso Branco Semi-elevada Sulcos radiais, seguidas por plana Regular Membranosa Bege Bege claro - RP Cotonoso Bege claro Semi-elevada Sulcos radiais Regular Membranosa Bege Bege Claro - 107 7.3. Dosagem Protéica dos Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum Verificou-se que lotes obtidos in natura, ou seja, não concentrados por liofilização, apresentaram valores sem padrão de leitura. Antígenos concentrados 10 vezes, demonstraram variabilidade na concentração protéica entre 0,77 a 1,88 µg/µL e 0,48 a 1,39 µg/µL, para as preparações obtidas com 15 e 33 dias, respectivamente. Antígenos concentrados 20 vezes, apresentaram valores protéicos entre 1,48 a 3,75 µg/µL e 1,01 a 2,82 µg/µL para as preparações antigênicas obtidas com 15 e 33 dias, respectivamente (Tabela 7). Tabela 7. Dosagem protéica, segundo Bradford (1976), dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 10 e 20 vezes concentrados, cultivados em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, por 15 e 33 dias, segundo Kaufman e Standard (1978). Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum 49 15 dias 10 vezes concentrados 0,77 µg/ µL 15 dias 20 vezes concentrados 1,48 µg/ µL 33 dias 10 vezes concentrados 0,78 µg/ µL 33 dias 20 vezes concentrados 1,60 µg/ µL 200 1,65 µg/ µL 3, 32 µg/ µL 1,39 µg/ µL 2,77 µg/ µL 212 0,85 µg/ µL 1,66 µg/ µL 0,55 µg/ µL 1,12 µg/ µL 268 1,75 µg/ µL 3, 48 µg/ µL 1,19 µg/ µL 2,33 µg/ µL 299 0,92 µg/ µL 1,88 µg/ µL 0,63 µg/ µL 1,33 µg/ µL 340 1,20 µg/ µL 2,28 µg/ µL 1,17 µg/ µL 2, 38 µg/ µL 361 1,19 µg/ µL 2,37 µg/ µL 1,14 µg/ µL 2,30 µg/ µL 406 1,74 µg/ µL 3,48 µg/ µL 1,36 µg/ µL 2,82 µg/ µL 584 1,88 µg/ µL 3,75 µg/ µL 0,48 µg/ µL 1,01 µg/ µL 802 1,19 µg/ µL 2,33 µg/ µL 0,87 µg/ µL 1,77 µg/ µL 2030 1,18 µg/ µL 2,36 µg/ µL 1,18 µg/ µL 2,28 µg/ µL RP 1,63 µg/ µL 3,18 µg/ µL 1,18 µg/ µL 2,33 µg/ µL Pool (49,200, 268 e 406) 0,94 µg/ µL 1,92 µg/ µL 1,20 µg/ µL 2,28 µg/ µL 108 7. 4. Screening dos Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum A seleção dos antígenos obtidos a partir de culturas de H. capsulatum mantidas em ágar Sabouraud-dextrose, a 27º C por 33 dias, segundo a metodologia proposta por Kaufman e Standard (1978), foi feita analisando-se a reatividade dos mesmos, pela técnica de imunodifusão dupla em gel de agarose (ID) frente a anticorpos policlonais, produzidos em coelhos, anti-antígeno de H. capsulatum, anti-fração H e M de H. capsulatum, anti-exoantígeno de P. brasiliensis e anti-exoantígeno de A. fumigatus. As preparações antigênicas foram avaliadas em três condições distintas: antígenos in natura, ou seja, não concentrados e antígenos concentrados 10 e 20 vezes por liofilização. A análise dos resultados demonstrou que antígenos produzidos a 27º C em ágar Sabouraud-dextrose durante 33 dias e concentrados 20 vezes, apresentou melhor padrão de reatividade quando comparado a preparações antigênicas in natura ou concentradas 10 vezes por liofilização (Tabela 8, Tabela 9 e Tabela 10). Observou-se, que 100 % dos antígenos de H. capsulatum que foram 20 vezes concentrados, apresentaram linhas de precipitação bem definidas e de forte intensidade (Figura 11), frente a anticorpo policlonal anti-antígeno de H. capsulatum, sendo que os obtidos das amostras 268, 299, 361, 406, 584 e RP apresentaram duas linhas de precipitação (Tabela 10 e Figura 11). Apenas 25 % dos antígenos de H. capsulatum 10 vezes concentrados (361, 406 e 584) reagiram frente a anticorpo policlonal espécie-específico, não sendo possível detectar linha de precipitação para antígenos in natura (Tabela 8 e Tabela 9). Oitenta e três porcento dos antígenos (49, 200, 268, 299, 361, 406, 584, 802, 2030 e RP), 20 vezes concentrados, reagiram frente a anticorpo policlonal anti-fração H e M de H. capsulatum, sendo que os 109 antígenos obtidos a partir das amostras 49 e 200 apresentaram linhas de precipitação de forte intensidade (Tabela 10). Não se observou linha de precipitação, quando os antígenos foram avaliados frente à anti-soros heterólogos (Tabela 10). Baseados nos resultados apresentados na Tabela 10 e Figura 11 verificou-se que das 12 amostras fúngicas empregadas para a produção de antígenos de H. capsulatum, 10 podem ser consideradas fortes candidatas como amostras a serem aplicadas na produção destes reagente biológicos, visto que revelaram bom potencial antigênico. Apenas as amostras 212 e 340 podem ser excluídas deste estudo, visto que não demonstraram bom perfil de reatividade frente a anticorpos policlonais espécie-específico em nenhuma das concentrações estudadas. Diante do exposto, empregou-se como critério de seleção os seguintes parâmetros: presença de duas linhas de precipitação frente aos anticorpos policlonais espécie-específicos e intensidade e nitidez das linhas formadas. Assim, foram escolhidas para dar continuidade a este estudo, as amostras 49 e 200 por terem formado linhas de precipitação de forte intensidade e bem definidas frente a anticorpo policlonal anti-antígeno de H. capsulatum (Tabela 10 e Figura 11) e anticorpo policlonal anti-fração H e M de H. capsulatum (Tabela 10) e as amostras 268 e 406 por terem apresentado duas linhas de precipitação frente ao anticorpo policlonal antiantígeno de H. capsulatum e linhas de forte intensidade frente a anticorpo policlonal anti-fração H e M (Tabela 10). Tendo em vista os resultados promissores obtidos com antígenos produzidos com 33 dias de cultura, avaliou-se também, o efeito da diminuição do tempo de incubação das células fúngicas na liberação/produção de determinantes antigênicos, empregando as quatros amostras selecionadas. 110 Desta forma, lotes antigênicos produzidos a partir das amostras 49, 200, 268 e 406 incubados em ágar Sabouraud-dextrose a 27o C, por 15 dias foram avaliados in natura, 10 e 20 vezes concentrados, quanto ao padrão de reatividade por ID, frente a anticorpos policlonais produzidos em coelhos anti-antígeno de H. capsulatum, anti-fração H e M de H. capsulatum, anti-exoantígeno de P. brasiliensis e anti-exoantígeno de A. fumigatus. A análise dos resultados mostrou que antígenos, produzidos com 15 dias de cultura, in natura não apresentou reatividade frente aos anticorpos policlonais espécie-específicos. Quando as preparações antigênicas foram 10 vezes concentradas por liofilização, observou-se reatividade de fraca intensidade frente aos anticorpos anti-antígeno de H. capsulatum e que apenas os antígenos obtidos das amostras 49 e 406 reagiram fracamente frente ao anticorpo policlonal anti-fração H e M. Quando concentrados 20 vezes, verificou-se melhora substancial do padrão de reconhecimento dos antígenos produzidos a partir das amostras 49 e 200, que apresentaram a formação de duas linhas de precipitação e para o antígeno produzido a partir da amostra 406 de H. capsulatum, que apresentou melhora na intensidade da linha de precipitação formada. Tendo em vista, o baixo desempenho da preparação antigênica obtida a partir da amostra 268, optou-se por concentrar ainda mais as mesmas. Desta forma, os lotes antigênicos foram concentrados 30 vezes, concentração esta que manteve para os antígenos obtidos das amostras 49, 200 e 406 o padrão de reatividade demonstrado para as preparações 20 vezes concentradas. Nesta condição, o antígeno obtido da amostra 268 reagiu frente a anticorpo policlonal anti-antígeno de H. capsulatum, contudo não apresentou reatividade frente anticorpo policlonal anti-fração H e M (Tabela 11). Não se observou reatividade cruzada frente a anticorpos policlonais anti-exoantígeno de P. brasiliensis e anti-exoantígeno de A. fumigatus para nenhuma das concentrações avaliadas. 111 Antígenos de H. capsulatum obtidos com 33 dias de cultivo foram avaliados frente à amostra de soro de paciente com histoplasmose doença e amostra de soro de indivíduo com HP infecção. Verificou-se que 58,3% das preparações antigênicas, obtidas das amostras 49, 200, 212, 406, 802, 2030 e RP, reagiram frente a soro de histoplasmose doença. Quando analisados frente a soros de pacientes com histoplasmose infecção observou-se 100% de reatividade, sendo que 58,3 % dos antígenos obtidos a partir das amostras 49, 200, 212, 406, 802, 2030 e RP, apresentaram linhas de precipitação de forte intensidade e 41, 6% reagiram fracamente frente à amostra de soro (Tabela 12). 112 Tabela 8. Screening dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, in natura, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias. Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum Ac poli anti- antígeno de H. capsulatum var. capsulatum Ac poli anti-fração H e M de H. capsulatum var. capsulatum Ac poli anti-exoantígeno de P. brasiliensis Ac poliu antiexoantígeno de A. fumigatus 49 200 212 268 299 340 361 406 584 802 2030 RP Referência - - - - Ac poli: Anticorpo policlonal; Referência: Antígeno (H e M) de H. capsulatum var. capsulatum, Immuno Mycologics. 113 Tabela 9. Screening dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum,10 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias. Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum Ac poli anti- antígeno de H. capsulatum var. capsulatum Ac poli anti-fração H e M de H. capsulatum var. capsulatum Ac poli anti-exoantígeno de P. brasiliensis Ac poli antiexoantígeno de A. fumigatus 49 200 212 268 299 340 361 406 584 802 2030 RP Referência + + + + + + + * + + + + + + + - - *: Fracamente positivo; Ac poli: Anticorpo policlonal; Referência: Antígeno (H e M) de H. capsulatum var. capsulatum, Immuno Mycologics. 114 Tabela 10. Screening dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, durante 33 dias. Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum Ac poli anti- antígeno de H. capsulatum var. capsulatum Ac poli anti fração H e M de H. capsulatum var. capsulatum Ac poli antiexontígeno de P. brasiliensis Ac poli antiexoantígeno de A. fumigatus 49 200 212 268 299 340 361 406 584 802 2030 RP Referência +* +* * +** +** * +** +** +** * * * + + + +* * + +* + + + + + - - *: Fracamente positivo; +*: Fortemente positivo; +**: Positivo com duas linhas de precipitação; Ac poli: Anticorpo policlonal; Referência: Antígeno (H e M) de H. capsulatum var. capsulatum, Immuno Mycologics. 115 Figura 11. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), cultivados em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, durante 33 dias frente a anticorpo policlonal anti-antígeno de H. capsulatum. RP 212 299 49 361 C+ C+ 21 2 299 268 200 C+ C+ C+ C+ 49 802 RP 802 361 340 406 2030 584 C+ C+ 268 2030 200 A C+ C+ C+ C+ 340 406 584 B C D 116 E F Tabela 11. Padrão de reatividade dos exoantígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 10, 20 e 30 vezes concentrados. Segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, durante 15 dias. Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum Ac poli anti- antígeno de H. capsulatum var. capsulatum Ac poli anti fração H e M de H. capsulatum var. capsulatum Ac poli antiexoantígeno de P.brasiliensis Ac poli antiexoantígeno de A. fumigatus 49, in natura 49, 10 x [ ] 49, 20 x [ ] 49, 30 x [ ] 200, in natura 200, 10 x [ ] 200, 20 x [ ] 200, 30 x [ ] 268, in natura 268, 10 x [ ] 268, 20 x [ ] 268, 30 x [ ] 406, in natura 406, 10 x [ ] 406, 20 x [ ] 406, 30 x [ ] Referência * +* +* * +* +* * * + * + + + * + + * + * * + + - - *: Fracamente positivo; +*: Positivo com duas linhas de precipitação; Ac poli: Anticorpo policlonal; Referência: Antígeno (H e M) de H. capsulatum, Immuno Mycologics. 117 Tabela 12. Padrão de reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, segundo Kaufman e Standard (1978), cultivados em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, durante 33 dias, frente a soro de pacientes com histoplasmose doença e histoplasmose infecção, pela técnica de imunodifusão dupla. Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum 49 200 212 268 299 340 361 406 584 802 2030 RP Referência Histoplamose doença + + + + + + + + Histoplasmose infecção +* +* +* * * * * +* * +* +* +* + *: Fracamente positivo; +*: Fortemente positivo; Referência: Antígeno (H e M) de H. capsulatum var. capsulatum, Immuno Mycologics. 118 7.5. Análise do padrão de reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum. A imunoreatividade dos antígenos de H. capsulatum obtidos das amostras 49, 200, 268 e 406 cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, a 27oC durante 15 e 33 dias, foi avaliada empregando-se a técnica de imunodifusão dupla, frente a soros de pacientes com HP doença e infecção, soros de indivíduos com suspeita clínica de HP e não reagentes para H. capsulatum pela técnica de ID frente a antígeno de referência, soros de pacientes com paracoccidioidomicose (PCM) e aspergilose, soros de pacientes com leishmaniose cutânea e leishmaniose muco-cutânea, soros de indivíduos saudáveis, soros de indivíduos que freqüentam cavernas e não reagentes para H. capsulatum pela técnica de ID face a antígeno de referência bem como frente a soros hiperimunes obtidos em coelhos anti-antígeno de H. capsulatum, anti-exoantígeno de P. brasiliensis e antiexoantígeno de A. fumigatus. A análise dos resultados demonstrou que a sensibilidade dos antígenos de H. capsulatum obtidos com 15 dias de cultura frente a soros de pacientes com HP doença foi de 40,9% para antígeno da amostra 49; 95,5% para antígeno da amostra 200 e 406 e 4,5% para o antígeno da amostra 268. Não observamos aumento no padrão de reatividade quando se analisou o desempenho do pool antigênico, preparado pela mistura dos antígenos das amostras 49, 200, 268 e 406 cultivados em ágar Sabouraud-dextrose, a 27º C por 15 dias frente a soros de pacientes com HP doença (Tabela 13). Lotes antigênicos assim preparados, quando avaliados frente a soros de indivíduos com HP infecção apresentaram padrões distintos de reatividade quando comparados ao ensaio anterior, observouse que o percentual de positividade do antígeno da amostra 49 foi de 85,7% e de 71,4% para os obtidos das amostras 200 e 406 de H. capsulatum. A preparação antigênica obtida da amostra 268 não foi avaliada (Tabela 13). Na análise dos soros de indivíduos com HP infecção, verificou-se que dos sete soros testados, o pool antigênico apresentou capacidade discriminatória frente a seis soros (85,7%), 119 sensibilidade superior à apresentada pelos antígenos obtidos das amostras 200 e 406 (71,4%) (Tabela 13 e Figura 12). Tabela 13. Reatividade dos antígenos de Histoplasma capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, 15 dias, frente a soros de pacientes com histoplasmose doença e histoplasmose infecção. Soros Antígenos de H. Histoplasmose Histopalsmose capsulatum Doença Infecção var. capsulatum N % N % 49 9 40,9 6 85,7 200 21 95,5 5 71,4 268 1 4,5 ... ... 406 21 95,5 5 71,4 Pool 6 27,2 6 85,7 Referência 22 100,0 7 100,0 Pool: Mistura dos antígenos das amostras 49, 200, 268 e 406 de H. capsulatum; Referência: Antígeno (He M) de H. capsulatum var. capsulatum, Immuno-Mycologics 120 Figura 12. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtido segundo Kaufman e Standard (1978) das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, 15 dias, frente a soros de pacientes com histoplasmose doença. Padrão de Reatividade (%) 120 100 80 Positivo 60 Negativo 40 20 0 49 200 268 406 Pool Ag Ref. Exoantígenos Antígenos produzidos com 33 dias de cultura, 20 vezes concentrados, apresentaram sensibilidade superior quando comparados aos obtidos com 15 dias nesta mesma concentração. Preparações antigênicas assim produzidas quando avaliadas frente a soros de pacientes com HP doença apresentaram 77,3% de reatividade para a amostra 49; 95,5% para as amostras 200 e 406 e 18,2% para a 121 amostra 268. Quando avaliados frente a soros de indivíduos com HP infecção, observou-se 85,7% de reatividade para o antígeno produzido a partir da amostra 49 e 71,4% para os antígenos das amostras 200 e 406. O antígeno obtido da amostra 268 não apresentou reatividade. Ensaios de ID conduzidos empregandose pool antigênico, não apresentaram aumento significativo na capacidade discriminatória frente aos soros avaliados (Tabela 14 e Figura 13 e Figura 13 a). Tabela 14. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtido segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, 33 dias, frente a soros de pacientes com histoplasmose doença e histoplasmose infecção. Soros Antígenos de H. capsulatum Histoplasmose Histopalsmose var. capsulatum Doença Infecção N % N % 49 17 77,3 6 85,7 200 21 95,5 5 71,4 268 4 18,2 _ _ 406 21 95,5 5 71,4 Pool 6 27,2 6 85,7 Referência 22 100,0 7 100,0 Pool: Mistura dos antígenos das amostras 49, 200, 268 e 406 de H. capsulatum; Referência: Antígeno (He M) de H. capsulatum var. capsulatum, Immuno-Mycologics 122 Figura 13. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtido segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, 33 dias, frente a soros de pacientes com histoplasmose doença. Padrão de Reatividade (%) 120 100 80 Positivo 60 Negativo 40 20 0 49 200 268 406 Pool Ag Ref. Exoantígenos Figura 13 a. Reatividade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 20 vezes concentrados, obtido segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, 33 dias, frente a soros de pacientes com histoplasmose infecção. Padrão de Reavtividade (%) 120 100 80 Positivo 60 Negativo 40 20 0 49 200 268 406 Exaontígenos 123 Pool Ag Ref. Empregou-se o método estatístico byesiano avaliar a sensibilidade e especificidade das preparações antigênicas, levando-se em conta o tempo de cultivo. O cálculo da sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos foi realizado utilizando-se o Software MINITAB 13.0. A especificidade dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum foi avaliada frente a soros heterólogos, soros de indivíduos saudáveis (doadores de banco de sangue) e soros de indivíduos com suspeita clínica de histoplasmose não reagentes pelo ensaio de ID frente a antígeno de referência e soros de indivíduos que freqüentam rotineiramente cavernas, sendo que estes também não apresentaram reatividade a H. capsulatum pela ID frente a antígeno de referência (ImmunoMycological). Aplicando-se o software MINITAB 13.0, observou-se que as preparações antigênicas de 15 e 33 dias apresentam 100% de especificidade (Tabela 15, Tabela 15a, Tabela 15b e Tabela 15c). Tabela 15. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 15 dias, avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose doença. Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum Referência Prevalência Sensibilidade Especificidade Valor preditivo positivo Valor Preditivo negativo Test t 49 200 268 406 Pool 0,2245 1,0000 1,0000 1,0000 0,2245 0,4091 1,0000 1,0000 0,2245 0,9545 1,0000 1,0000 0,2245 0,0455 1,0000 1,0000 0,2245 0,9545 1,0000 1,0000 0,2245 0,2727 1,0000 1,0000 1,0000 0,8539 0,9870 0,7835 0,9870 0,8261 P=0,05 P=0,07 P= 0,05 P= 0,22 P= 0,05 P=0,06 Pool: Mistura dos exoantígenos das amostras 49, 200, 268 e 406 de H. capsulatum; Referência: Antígeno (He M) de H. capsulatum var. capsulatum, Immuno-Mycologics 124 Tabela 15a. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 15 dias, avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose infecção. Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum Referência Prevalência Sensibilidade Especificidade Valor preditivo positivo Valor Preditivo negativo Test t 49 200 268 406 Pool 0,0843 1,0000 1,0000 1,0000 0,0843 0,8571 1,0000 1,0000 0,0843 0,7143 1,0000 1,0000 0,0843 0,0000 0,0921 0,0000 0,0843 0,7143 1,0000 1,0000 0,0843 0,8571 1,0000 1,0000 1,0000 0,9870 0,9744 0,5000 0,9744 0,9870 P=0,05 P=0,08 P= 0,05 P= 0,28 P= 0,05 P=0,06 Pool: Mistura dos antígenos das amostras 49, 200, 268 e 406 de H. capsulatum; Referência: Antígeno (He M) de H. capsulatum var. capsulatum, Immuno-Mycologics Tabela 15b: Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias, avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose doença. Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum Referência Prevalência Sensibilidade Especificidade Valor preditivo positivo Valor Preditivo negativo Test t 49 200 268 406 Pool 0,2245 1,0000 1,0000 1,0000 0,2245 0,7727 1,0000 1,0000 0,2245 0,9545 1,0000 1,0000 0,2245 01818 1,0000 0,0000 0,2245 0,9545 1,0000 1,0000 0,2245 0,2727 1,0000 1,0000 1,0000 0,9383 0,9870 0,8085 0,9870 0,9861 P=0,05 P=0,05 P= 0,05 P= 0,11 P= 0,05 P=0,06 Pool: Mistura dos antígenos das amostras 49, 200, 268 e 406 de H. capsulatum; Referência: Antígeno (He M) de H. capsulatum var. capsulatum, Immuno-Mycologics 125 Tabela 15c. Calculo de sensibilidade, especificidade, prevalência e valores preditivos dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), das amostras 49, 200, 268 e 406, cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, 27ºC, por 33 dias, avaliadas por ID frente a soros de pacientes com histoplasmose infecção. Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum Referência Prevalência Sensibilidade Especificidade Valor preditivo positivo Valor Preditivo negativo Test t 49 200 268 406 Pool 0,0843 1,0000 1,0000 1,0000 0,0843 0,8571 1,0000 1,0000 0,0843 0,7143 1,0000 1,0000 _ _ _ _ 0,0843 0,7143 1,0000 1,0000 0,0843 0,8571 1,0000 1,0000 1,0000 0,9870 0,9744 _ 0,9744 0,9870 P=0,05 P=0,08 P= 0,05 _ P= 0,05 P=0,08 Pool: Mistura dos antígenos das amostras 49, 200, 268 e 406 de H. capsulatum; Referência: Antígeno (He M) de H. capsulatum var. capsulatum, Immuno-Mycologics 7.6. Análise do perfil eletroforético dos antígenos de H. capsulatum var. capsulatum A separação eletroforética sob condições denaturantes, empregando 10% de acrilamida, revelou que a maioria dos antígenos apresentava bandas protéicas com massa molecular entre 10 e 120 kDa. Após coloração pelo Coomassie Blue, identificou-se 15 frações para o antígeno obtido da amostra 49 com massa molecular aparente de: 100, 84, 77, 69, 62, 57, 50, 40, 37, 33, 30, 20, 16, 12 e 11 kDa. Para o antígeno obtido da amostra 200 de H. capsulatum, observou-se a migração de 12 bandas protéicas, apresentando massas moleculares de 120, 100, 84, 79, 74, 69, 55, 36, 33, 24, 13 e 11 kDa. A 126 preparação antigênica oriunda da amostra 268 apresentou 17 frações com pesos moleculares aproximados de: 94, 83, 69, 62, 55, 51, 40, 36, 33, 28, 26, 22, 18, 16, 14, 11 e 10 kDa. Verificou-se para o antígeno produzido a partir da amostra 406, 14 bandas protéicas com massa molecular aparente de 115, 109, 94, 84, 79, 73, 62, 55, 47, 42, 27, 14, 11 e 10 kDa (Figura 14 e Tabela 16). Antígenos obtidos das oito amostras fúngicas (212, 299, 340, 361, 584, 802, 2030 e RP) não selecionadas para este estudo, apresentaram de 4 a 14 frações antigênicas, com massa molecular entre 120 e 10 kDa (Figura 14). Os resultados indicam, que além da riqueza de seus componentes antigênicos, os diferentes antígenos de H. capsulatum produzidos, demonstraram a presença de determinantes antigênicos relevantes, como por exemplo, o complexo de frações entre 97 e 70 kDa descrita por Reiss (1986), Hamilton (1990), Zancopé-Oliveira (1993, 1994, 1999), Da Mata (2003) como sendo a fração M de H. capsulatum e o complexo protéico compreendido entre 108 e 120 kDa correspondendo a fração H de H. capsulatum (Deepe, 1995) Tabela 16. Perfil eletroforético observado em SDS-PAGE a 10%, de antígenos de H. capsulatum var. capsulatum, 10 vezes concentrados, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar Sabouraud-dextrose, 27o C, por 33 dias. Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum Fração Protéica em kDa 49 100, 84, 77, 69, 62, 57, 50, 40, 37, 33, 30, 20, 16, 12 e 11. 200 120, 100, 84, 79, 69, 55, 36, 33, 24, 13 e 11. 268 94, 83,69, 62, 55, 51, 40, 36, 33, 28, 26,22,18,16,14,11 e 10. 406 115, 109, 94, 84, 79, 73, 62, 55, 47, 42, 27, 14, 11 e 10. 127 Figura 14. Perfil eletroforético dos antígenos de H. capsulatum var.capsulatum, obtidos segundo Kaufman e Standard (1978), em ágar-Sabouraud-dextrose, 27o c, 33 dias de cultura. Linha 1: Padrão de Peso Molecular; linha 2: Antígeno de Referência (Filtrado de Cultura de H. capsulatum var. capsulatum- Faculdade de Farmácia da Universidade Estadual Paulista de Araraquara); linha 3: Ag Hc 49, linha 4: Ag Hc 200; linha 5: Ag Hc 212, linha 6: Ag Hc 268; linha 7: Ag Hc 299; linha 8: Ag Hc 340; linha 9: Ag Hc 361; linha 10: Ag Hc 406; linha 11: Ag Hc 584; linha 12: Ag Hc 802; linha 13: Ag Hc 2030 e linha 14: Ag Hc RP. kDa 175 83 62 47,5 33 25 17,5 1 2 3 4 5 6 7 128 8 9 10 11 12 13 14 7.7. Immunoblotting para detecção da reatividade de anticorpos anti-H. capsulatum var. capsulatum em indivíduos com HP doença e infecção. A análise da imunoreatividade dos soros de pacientes com HP doença frente a antígenos obtidos com 33 dias de cultura, 10 vezes concentrados, revelou que 100 % das amostras avaliadas frente ao antígeno obtido da amostra 49 de H. capsulatum reconheceram de forma específica, apresentando forte intensidade, a fração correspondente ao antígeno M de H. capsulatum. Anticorpos circulantes da classe IgG, reconheceram componentes com massa molecular aparente entre 92 e 31 kDa, sendo que 47,6% (10 soros) das amostras, reconheceram a fração antigênica de 92 kDa e 95,2% reagiram frente a fração de 74 kDa. O padrão de reatividade do antígeno da amostra 49 frente a soros de HP infecção revelou o reconhecimento de proteínas com peso molecular aproximado entre 92 a 31 kDa. Observou-se que os componentes antigênicos reconhecidos com maior freqüência por 100% das amostras de HP infecção (sete soros) correspondem as frações de 92, 74 e 59 kDa. Observou-se reatividade de fraquíssima intensidade frente a soros de indivíduos doadores de banco de sangue (indivíduos saudáveis), que pode ser explicada provavelmente pelo reconhecimento de epítopos protéicos semelhantes (Figura 15) A Figura 16 demonstra o padrão de reatividade dos soros de pacientes com HP doença e infecção frente ao antígeno produzido a partir da amostra 200 de H. capsulatum. Verificou-se que 100% das amostras avaliadas reconhecem mais de um determinante antigênico. Dos 21 soros de pacientes com HP doença, 38% reagiram com a fração de massa molecular aparente de 120 kDa, 100% reconheceu a fração de 94 kDa; 95, 2 % a de 74 kDa e 76,2% a de 62 kDa. O padrão de reatividade do antígeno da amostra 200 frente a soros de HP infecção revelou o reconhecimento de proteínas com peso molecular aproximado entre 120 a 39 kDa. Dos sete soros analisados, quatro (57,1%) foram reativos frente a fração de 120 kDa e 100% reagiram com os componentes de 94 e 74 kDa. As frações de 59 e 54 kDa foram reconhecidas por 100 % dos soros. Observou-se reatividade 129 de fraquíssima intensidade frente a soros de indivíduos doadores de banco de sangue (indivíduos saudáveis). As figuras 17 e 18 demonstram a imunoreatividade dos soros de pacientes com HP doença e infecção frente aos antígenos obtidos das amostras 268 e 406 respectivamente. Quando estes soros foram testados frente a estas preparações antigênicas, observou-se que apesar da totalidade ter reagido contra as frações imunodominates de H. capsulatum (frações H e M), o padrão de reatividade mostrou-se de forma menos intensa. A imunoreatividade dos soros de pacientes com HP doença e infecção frente a antígeno obtido da amostra 200 de H. capsulatum produzido com 15 dias de cultura, demonstrou que 100% das amostras avaliadas apresentaram anticorpos IgG circulantes anti-H. capsulatum, que reconheceram de forma específica, apresentando forte intensidade, as frações correspondentes aos antígenos H e M de H. capsulatum. A análise do padrão de reatividade, revelou predomínio de reatividade para as frações com massa molecular de 120, 94 e 74 kDa (Figura 19). Quando estes soros foram testados frente a antígenos das amostras 268 e 406 (Figuras 20 e 21), observou-se que apesar da totalidade ter reagido contra as frações imunodominates de H. capsulatum (frações H e M), o padrão de reatividade mostrou-se de forma menos intensa, contudo, o perfil de reatividade do antígeno da amostra 268 foi superior quando comparado aquele observado para o antígeno obtido com 33 dias de cultura. 130 Figura 15. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente ao antígeno da amostra 49, 10 vezes concentrado, segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabourauddextrose, 27º C, por 33 dias. kDa 92 74 59 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Figura 16. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de pacientes com HP doença (1 a 22), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente ao antígeno da amostra 200, 10 vezes concentrado, segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabourauddextrose, 27º C, por 33 dias. kDa 120 94 74 62 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 131 Figura 17. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente ao antígeno da amostra 268, 10 vezes concentrado, segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabourauddextrose, 27º C, por 33 dias. kDa 94 83 62 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Figura 18. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 28) e soro de indivíduos saudáveis (29 a 32), frente ao antígeno da amostra 406, 10 vezes concentrado, segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabourauddextrose, 27º C, por 33 dias. kDa 97 83 77 69 60 43 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 132 Figura 19. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de pacientes com HP doença (1 a 20), HP infecção (21 a 27) e soro de indivíduos saudáveis (28 a 30) frente ao antígeno da amostra 200, 10 vezes concentrado, segundo Kaufman e Standard (1978), cultivado em ágar Sabourauddextrose, 27º C, por 15 dias. kDa 120 94 74 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Figura 20. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de pacientes com HP doença (1 a 20), HP infecção (21 a 27) e soro de indivíduos saudáveis (28 a 30) frente ao antígeno da amostra 268, 10 vezes concentrado, segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabourauddextrose, 27º C, por 15 dias. kDa 120 94 83 69 36 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Figura 21. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de pacientes com HP doença (1 a 21), HP infecção (22 a 27) e soro 133 de indivíduos saudáveis (28 a 30) frente ao antígeno da amostra 406, 10 vezes concentrado, segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabourauddextrose, 27º C, por 15 dias. kDa 109 97 69 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 134 Foram avaliadas, amostras de soros obtidas de indivíduos que visitam freqüentemente cavernas virgens e/ou exploradas, e que haviam apresentado ausência de reatividade pelo ensaio de imunodifusão dupla frente aos antígenos de H. capsulatum, obtidos com 15 e 33 dias de cultura bem como frente a antígeno de referência. Este ensaio foi conduzido, empregando-se o antígeno obtido da amostra 200 por este ter apresentado melhor capacidade discriminatória nos ensaios anteriores. A interpretação dos resultados demonstra que para as 17 amostras de soros avaliadas, 94,1% reagiram frente as frações de 94 e/ou 74 kDa. Neste mesmo ensaio, avaliou-se também o padrão de reconhecimento de quatro soros de indivíduos hígidos que atuam na área de pesquisa e trabalham com amostras fúngicas há pelo menos 03 anos, verificando o reconhecimento de pelo menos um determinante antigênico por 100% das amostras. A existência de reatividade cruzada frente a pool de soros de pacientes com leishmaniose e soros de doadores de banco de sangue foi observada. (Figura 22). A fim de caracterizar melhor este grupo, os soros foram analisados frente a antígeno metabólico da amostra 113 de P. brasiliensis e de uma preparação antigênica obtida do pool das amostras 354, 356 e 727 de A. fumigatus. Verificou-se reatividade de fraca intensidade frente a gp43 de P. brasiliensis para nove soros (52,9 %) dos indivíduos pertencentes ao grupo dos espeleólogos e para dois soros (50%) do grupo de indivíduos que trabalham com fungos (Figura 23). Em relação ao padrão de reatividade frente ao antígeno de A. fumigatus, observou-se reatividade para 13 soros (76,4%) de indivíduos do grupo de espeleólogos contra apenas um soro do grupo de pessoas que trabalham com fungos (Figura 24). 135 Figura 22. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-H. capsulatum de soros de indivíduos pertencentes a um grupo de espeleólogos (1 a 17), grupo de indivíduos que trabalham com fungos (18 a 22), anticorpo policlonal anti-antígeno de H. capsulatum, pool de soro de indivíduos com leishmaniose (23), pool de soro de indivíduos saudáveis (24), frente ao antígeno da amostra 200, 10 vezes concentrado, segundo Kaufman e Standard (1978), cultivada em ágar Sabouraud-dextrose, 27º C, por 33 dias. kDa 120 94 74 62 36 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Figura 23. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-P. brasiliensis frente a soros de indivíduos pertencentes a um grupo de espeleólogos (1 a 17), grupo de indivíduos que trabalham com fungos (18 a 21) e pool de soro de indivíduos saudáveis (22), frente a antígeno da amostra 113 de P. brasiliensis cultivada em caldo NGTA, 36º C, por 20 dias. kDa 43 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 136 Figura 24. Imunoreatividade dos anticorpos circulantes da classe IgG anti-A. fumigatus frente a soros de indivíduos pertencentes a um grupo de espeleólogos (1 a 17), grupo de indivíduos que trabalham com fungos (18 a 21) e pool de soro de indivíduos saudáveis (22), frente a antígeno de A. fumigatus (pool das amostras 354, 356 e 727), 10 vezes concentrado, cultivadas em caldo Sabouraud-dextrose, 27º C, por 30dias. kDa 40 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 137 7.8. Estudo da Estabilidade dos Antígenos de H. capsulatum var. capsulatum Antígenos obtidos das amostras 49, 200, 268 e 406 cultivados em ágar Sabouraud-dextrose a 27o C, por 15 e 33 dias, 10 e 20 vezes concentrados, e armazenados a -20o C, foram avaliados quanto a manutenção da capacidade discriminatória frente a anticorpos policlonais espécie-específicos, anticorpos policlonais heterólogos e soros de pacientes com HP doença e HP infecção, empregando-se a técnica de ID, após seis e 12 meses da data de obtenção. A análise dos resultados revelou que as preparações antigênicas estocadas por 12 meses a - 20o C apresentam a capacidade discriminatória preservada frente aos anticorpos policlonais espécie-específicos bem como frente a soros de pacientes com HP doença e infecção. Figura 25. Estabilidade dos antígenos das amostras de H. capsulatum var. capsulatum, 12 meses após obtenção, frente a anticorpo policlonal anti-antígeno de H. capsulatum. Lâmina A: antígeno das amostras 49, 200, 268 e 406, 20 vezes concentrado. Lâmina B: antígeno das amostras 49, 200, 268 e 406, 10 vezes concentrado. 138 8.0. DISCUSSÃO Nos últimos anos, a freqüência dos processos infecciosos invasivos causados por espécies fúngicas vem aumentando de forma dramática (Yeo e Wong, 2002). Desta forma, o diagnóstico precoce e preciso destas infecções assume grande importância, pois permite entre outros fatores, a instituição de terapia antifúngica adequada, a diminuição do emprego desnecessário de drogas tóxicas; além de reduzir o uso de terapia empírica, reduzindo, portanto, o processo de seleção frente às mesmas minimizando conseqüentemente, o surgimento de linhagens fúngicas multidrogas resistentes (Yeo e Wong, 2002). A histoplasmose é micose sistêmica resultante da infecção causada pelo fungo geofílico H. capsulatum. Enfermidade de ocorrência mundial, mas com elevada prevalência nas regiões centrais e sudeste da América do Norte, bem como em certas áreas da América Central e do Sul (Kwon-Chung e Bennett, 1992; Ashford et al, 1999; Taylor et al., 1999; Wheat et al, 2000; Kauffman, 2000; Panackal et al., 2002). No Brasil, casos de doença e infecção foram relatados em São Paulo, Rio de Janeiro, Rio Grande do Sul, Minas Gerais, Paraná, Santa Catarina, Goiás, Amazonas, Bahia, Pará e Pernambuco (Lacaz, 1984; ZancopéOliveira e Wanke, 1987; Vergara e Martinez, 1998; Severo et al., 2001; Unis, 2004, Unis 2004 a, Unis, 2005). A infecção ocorre pela inalação de propágulos da fase filamentosa encontrados no solo de cavernas, grutas, celeiros, galinheiros e florestas contaminados com excrementos de aves e morcegos (Goodwin et al., 1978; Eissenberg e Goldman, 1991; Silva et al., 1999), os quais transformam-se em leveduras nos pulmões (Lacaz et al., 2002). As manifestações clínicas da HP incluem desde a forma assintomática, pulmonar aguda, pulmonar crônica e infecção extra pulmonar disseminada (Goodwin et al., 1978; Eissenberg e Goldman, 1991; Alves, 1996; Silva et al., 139 1999), sendo que nos pacientes imunodeprimidos, principalmente nos portadores de HIV/Aids, doenças neoplásicas, transplantados e diabéticos, a infecção por H. capsulatum representa sério risco (Wheat et al., 1991; Wheat et al., 1992; Marques e Shikanai-Yasuda, 1994; Khoo & Denning, 1994; Alves, 1996; Kappe et al., 1998; Lazzarini de Oliveira et., al., 1999; Marques et al., 2000; Bernard e Duarte, 2000; Wanke et al., 2001; Negroni, 2001; Corti et al., 2001; Woods, 2002; Nobre et al., 2003; Artal, 2004; Unis et al., 2004, Ruhnke, 2004; Gutierrez et al., 2005). O diagnóstico considerado como padrão ouro é o isolamento do agente etiológico em cultura, embora possa demorar até um mês. (Kwon-Chung e Bennett, 1992; Lacaz et al., 2002; Yeo e Wong, 2002). Em alguns casos é extremamente difícil diferenciar células de H. capsulatum var. capsulatum em tecido de células de C. glabrata, P. marneffei, H. capsulatum var. farciminosum e formas diminutas de B. dermatitidis (MendesGiannini e Melhem, 2001). Nos casos onde a biópsia é possível e menos lesiva para o paciente, colorações especiais como o Gomori-Groccott podem auxiliar no diagnóstico da HP por meio da observação no interior das células do sistema retículo endotelial de leveduras de H. capsulatum (Lacaz et al., 1984, Lacaz et al., 1998; Kwon-Chung e Bennett, 1992; Lacaz et al., 2002; Artal, 2004). Apesar de fornecer diagnóstico precoce, o exame histopatológico se apresenta menos sensível quando comparado à cultura. Soma-se a este fato a dificuldade na observação das leveduras, freqüentemente observada nos locais onde os laboratoristas têm pouca experiência em identificar o H. capsulatum, além disto, o estudo morfológico do H. capsulatum nos tecidos não é conclusivo para sua identificação, sendo considerado apenas um parâmetro da doença (Almeida e Lacaz, 1947, Póton, 2002, Artal, 2004). Antígenos fúngicos são macromoléculas imunogênicas solúveis produzidas pelo fungo. A avaliação dos mesmos depende da interação entre o 140 antígeno concentrado ou não, obtido em cultura, frente a imunoglobulinas precipitantes e homólogas. Durante a reação antígeno-anticorpo, linhas de precipitação são formadas e visualizadas, diminuindo o tempo necessário para o isolamento e identificação do agente causal da doença (Kaufman e Standard, 1988). Diante do exposto, o estudo de antígenos fúngicos tem assumido notável importância, principalmente no que diz respeito à aplicabilidade dos mesmos, como reagentes biológicos na avaliação da resposta imune celular e/ou humoral de indivíduos acometidos por patologias causadas por fungos. Apesar de técnicas sorológicas como imunodufusão dupla (Heiner, 1985; Kaufman, 1970; Wheat et al., 1986; Kwon-Chung e Bennett, 1992; Lacaz et al., 2002; Yeo e Wong, 2002, Freitas et al., 2004), contraimunoeletroforese (Kleger e Kaufman, 1973; Wheat et al, 1986), fixação de complemento (Hopwood e Evans, 1991), ELISA (Zimmerman et al., 1989, Andreau et al., 1992; Torres et al., 1993; Gómez et al. 1997, Gómez et al., 1999; Guimarães et al, 2004) e Western blot (Pizzini et al., 1999), serem empregadas para o diagnóstico confirmatório da HP visando à pesquisa de anticorpos e antígenos circulantes, os índices de resultados falso-positivos e falso-negativos ainda são muito elevados (Wheat et al., 1996), estando a especificidade e sensibilidade da técnica diretamente relacionada ao antígeno empregado (Do Valle et al., 2001). Dados da literatura demonstram variabilidade na metodologia utilizada pelos diferentes centros de pesquisa com o objetivo de produzir antígenos de H. capsulatum. Entre estas pode-se citar: a escolha da amostra fúngica, tamanho do inóculo, meio de cultura utilizado, período de incubação, forma de incubação (com ou sem agitação), temperatura, bem como sua morfologia (micélio ou levedura). A grande heterogeneidade destes parâmetros na obtenção destes reagentes biológicos muitas vezes interfere no produto final, ou seja, antígenos que apresentem sensibilidade, especificidade, 141 estabilidade e reprodutibilidade, características estas de vital importância no imunodiagnóstico da HP, bem como de outras micoses (Pine, 1966, Markiwitz, 1967; Ehrhard e Pine, 1972; Reeves, 1972; Bradeley, 1974; Gross, 1975; Kaufman e Standard, 1978; Andreau et al.,1990; Garcia et al., 1990; Kwon-Chung e Bennett, 1992, Negroni et al., 1998; Da Matta et al., 2003). Historicamente, a identificação de anticorpos circulantes anti-H. capsulatum em soros de pacientes com histoplasmose tem se revelado de suma importância no diagnóstico confirmatório bem como no prognóstico da doença. A histoplasmina ou filtrado de cultura da fase micelina de H. capsulatum, tem sido fonte de antígenos para os ensaios sorológicos. Caracterizada por apresentar duas frações antigênicas de particular importância, o antígeno H (120 kDa), contra o qual, anticorpos são produzidos durante a doença ativa; e o antígeno M (94 kDa) contra o qual anticorpos são formados durante a fase ativa e crônica da histoplasmose. Ambas frações são tidas como sendo proteínas espécieespecíficas, quando comparadas a outros componentes da histoplasmina, como o antígeno C, que reage cruzadamente com soros de pacientes com coccidioidomicose e blastomiocose (Reis et al., 1986). Segundo Wheat et al. 1982, a histoplasmina tem se mostrado útil na detecção de anticorpos pelas provas de imunodifusão dupla (ID) e fixação de complemento (FC), sendo que mais de 80% dos indivíduos com histoplasmose apresentam positividade nestes ensaios. No caso da prova de ID, a identificação concomitante das frações H e M indicam que o paciente apresenta histoplasmose ativa. Entretanto, a detecção da banda M pode ser influenciada pela aplicação prévia de histoplasmina em testes intradérmicos, um fator que também pode interferir nos ensaios de FC (Kaufman, 1992). Em geral, a técnica de FC é menos específica que a ID, resultado da existência de epítiopos semelhantes, principalmente em soros de pacientes com paracoccidiodomicose, blastomicose e coccidioidomicose, que acabam por provocar reatividade cruzada. 142 O objetivo central deste trabalho foi à padronização de antígenos de H. capsulatum var. capsulatum empregando uma metodologia de fácil execução e de baixo custo operacional, que possa ser utilizada por laboratórios de menor condição técnica e financeira, visando sua aplicabilidade no diagnóstico confirmatório da histoplasmose pela técnica de ID. Assim, o meio de cultura semisólido Sabouraud-dextrose foi eleito para a produção dos mesmos, empregando como método de extração o tratamento das culturas com solução de mertiolatoborato, segundo metodologia proposta por Kaufman e Standard (1978). Estudando os aspectos macro e micromorfológicos das amostras de H. capsulatum observou-se grande variabilidade fenotípica e comportamental entre as diferentes amostras. A análise do padrão macromorfológico das amostras de H. capsulatum cultivadas em ágar batata, a 27º C, durante 30 dias, revelou que 100% apresentaram textura cotonosa com pigmentação variando de branco a ocre. Quando analisadas em relação ao aspecto micromorfológico, verificou-se que 75% encontravam-se em período de intensa esporulação, e que o meio de cultura utilizado altera o padrão fenotípico, textura e pigmentação de algumas amostras de H. capsulatum. Apesar de considerarmos de suma importância a análise do padrão morfológico não se pode afirmar categoricamente que o aspecto fenotípico interfira na capacidade de produção de determinantes antigênicos pelas amostras de H. capsulatum. Infelizmente a literatura, é pobre na abordagem deste aspecto, neste sentido, encontramos apenas dois trabalhos: Pine et al. (1966), ao avaliarem a produção de antígenos a partir de leveduras de H. capsulatum não encontraram diferença entre o padrão morfológico das seis amostras avaliadas e sua composição antigênica e Da Matta et al. (2003), ao analisarem antígenos obtidos a partir de células micelianas nos meios líquidos Sabouraud-tiamina-asparagina (pH=6,0) e Smith pH=4,0 e pH=6,0, verificaram diferenças morfológicas, não observando, contudo, relação com a expressão de determinantes antigênicos. 143 A abordagem entre as características fenotípicas e produção de determinantes antigênicos, merecerá certamente maior investimento de nosso grupo, contudo, alguns achados nos chamaram a atenção. Berliner (1968), ao estudar diferentes amostras de H. capsulatum, verificou que a maioria apresentava dois tipos de colônias distintas: marrom ou tipo B, caracterizada por apresentar colônias planas pigmentadas com grande quantidade de macroaleuroconídios tuberculados e pouca freqüência de microaleuroconídios e albina ou tipo A, caracterizada pela presença de micélio aéreo, hifas espessas, grande quantidade de macroaleuroconídios lisos e/ou tuberculados e microaleuroconídios esporulantes ou não. O autor observou, contudo, que apesar de ambas serem fenoticamente estáveis que as colônias do tipo A (albina) mesmo crescendo rapidamente interrompem de forma irreversível, pela realização de repiques sucessivos, o processo de esporulação. Outros autores relacionaram a pigmentação com a capacidade de esporular (Rincon, 1989; Lacaz et al., 1998; Sidrim e Oliveira, 1999; Lacaz et al., 2002). Borok (1980), avaliando 21 amostras de Histoplasma, mantidas por subcultivos sucessivos em ágar Sabouruaud-dextrose, a 27ºC, há pelo menos três anos, observou que cultivos procedentes de culturas marrons, para a forma não esporulante albina, podem ser revertidas por meio da manipulação do substrato usado no cultivo, sugerindo assim, que a indução-supressão deste mecanismo possa estar envolvido nas variações morfológicas desta espécie. Ao avaliarmos o padrão de pigmentação das culturas mantidas em ágar Sabouraud-dextrose e ágar batata, a 27º C, observamos diferenças no padrão de expressão de pigmentos, sendo que no ágar batata 83,3% das amostras apresentou pigmentação que variou de bege a ocre e no ágar Sabouraud-dextrose duas amostras (16,7%) apresentaram pigmentação que variou de bege (amostra 200) a bege clara (amostra 406). Nossos resultados estão em concordância com Borok 144 (1980) no que diz respeito ao mecanismo de indução-supressão do estado esporulante e a relação deste com o substrato de cultivo. Ao avaliarmos os aspectos morfológicos das colônias e sua possível relação com a expressão de determinantes antigênicos, verificamos que amostras com textura cotonosa e pigmentação variando de bege a bege clara, quando cultivadas em ágar-Sabouraud-dextrose, a 27º C, por 33 dias apresentaram expressão de frações protéicas com massa molecular aparente de 116 e 97 kDa, correspondente as frações H e M de H. capsulatum respectivamente; consideradas marcadores sorológicos da doença. Em contrapartida, amostras cultivadas nas mesmas condições e que apresentaram textura cotonosa e pigmentação branca expressaram preferencialmente a fração M de H. capsulatum. Nossos resultados indicam que das 12 amostras fúngicas inicialmente empregadas para a obtenção de antígenos de H. capsulatum, 10 podem ser consideradas fortes candidatas a serem aplicadas na produção destes reagente biológicos, visto que revelaram bom padrão de reatividade frente a anticorpos policlonais espécie-específicos. Verificamos que antígenos obtidos a partir das amostras 212 e 340, as quais revelaram na análise morfológica textura cotonosa, pigmentação branca (212) e branca a ocre (340) e presença de conídios degenerados e ausência de tubérculos e/ou conidiogênese, não reagiram frente a anticorpo policlonal anti-fração H e M de H. capsulatum em nenhuma das concentrações empregadas, ou seja, antígeno in natura 10 e 20 vezes concentrados. Ao avaliarmos as características micromorfológicas das 12 amostras de H. capsulatum, segundo metodologia proposta por Riddell (1950), verificamos uma possível relação entre a produção de micro e macroaleuroconídios e a expressão dos antígenos H e M. Zancopé-Oliveira et al. (2004), ao estudarem a imunolocalização e expressão do antígeno M de H. capsulatum demonstrou que 145 este antígeno encontra-se localizado nos micro e macroaleuroconídios, sendo expresso com maior intensidade pelos microaleuroconídios. Esta observação reforça a importância da análise do padrão morfológico das amostras de H. capsulatum visando principalmente à escolha das mesmas como produtoras de antígenos para o imunodiagnóstico da histoplasmose. A análise da cinética de crescimento das amostras de H. capsulatum demonstrou que 58,3% apresentaram crescimento exponencial médio até o 47º dia de cultivo, mantendo-se a partir daí em fase estacionária. As amostras 268, 361 e 584 apresentaram crescimento exponencial até o 60º dia, a 406 até o 72º dia e as amostras 340 e 2030 entraram em fase estacionária no 33º dia de cultura. Diante do perfil encontrado, nas quais amostras entraram em fase estacionária a partir do 40º dia de cultura, optamos em desenvolver um protocolo de obtenção de antígenos, estabelecendo o período de incubação das amostras fúngicas em 33 dias, pois acreditamos que com a incubação das mesmas em tempo superior a 47 dias, pode acontecer degradação das hifas e consequentemente liberação de enzimas proteolíticas, que podem atuar na degradação dos antígenos. Segundo Ehrhard e Pine (1972 a), há relação entre o crescimento das culturas fúgicas e a expressão dos antígenos H e M de H. capsulatum, sendo que o máximo de massa celular esta relacionada com a maior expressão do antígeno, podendo permanecer constante ou diminuir durante o declínio de seu cultivo. Da Mata et al. (2003), analisou a expressão de antígenos de H. capsulatum, obtidos de células micelianas, cultivadas em caldo STA (pH 6,0), caldo Smith (pH 4,0) e caldo Smith (pH 6,0), a 27º C, sob agitação constante. A análise do perfil protéico revelou que antígenos obtidos em caldo STA apresentou oito bandas protéicas com pesos moleculares entre 29 e 116 kDa. Antígenos obtidos em caldo Smith (pH 4,0) revelou migração de frações protéicas de 55 e 66 kDa, a partir do 8º dia de cultivo e no pH 6,0 três bandas protéicas entre 84 e 116 146 kDa. Os autores verificaram que antígenos obtidos nos meios STA (pH 6,0) e Smith (pH 6,0) eram semelhantes, observando uma fração imunorreativa de 97 kDa, que apresentava reatividade cruzada frente a pool de soros de pacientes com paracoccidiodomicose. Em nosso trabalho antígenos obtidos das amostras 49, 200, 268 e 406 de H. capsulatum, em ágar Sabouraud-dextrose (pH 6,3), apresentaram 15, 12, 17 e 14 frações protéicas respectivamente. Pela técnica de immunoblotting, obtivemos 100% de reatividade dos mesmos frente a soro hiperimune específico bem como frente a soros de pacientes com HP doença e infecção, sendo observado reconhecimento de forte intensidade para as frações de 120 kDa (amostra 200 , 15 dias de cultura), 94 kDa (antígeno das amostras 49, 200 e 268, 33 dias de cultura) e 77 kDa (antígeno da amostra 406, 33 dias de cultura). Ehrhard e Pine (1972 b), empregaram os meios Smith-asparagina, McVeigh e Morton suplementado de vitaminas e meio de Pine sem sulfato de zinco, para avaliar a possível influência da composição química na produção dos antígenos H e M por células leveduriformes de oito amostras de H. capsulatum. Os autores observaram que a produção das frações H e M pelas amostras analisadas apresentou diferença substancial nos diferentes meios de cultura, sendo detectado variação da capacidade de expressão entre 5 e 33 dias para o antígeno H, obtendo-se o menor tempo de expressão para o meio de Pine; no meio asparagina a expressão do antígeno M aconteceu com 13 dias de cultura e no meio MacVeigh e Morton não detectou-se produção do antígeno H sendo que o antígeno M foi obtido em 50% das amostras. Os mesmos autores demonstram que a adição de caseína hidrolisada ao meio Smith asparagina acelerou o crescimento das culturas fúngicas, verificando ainda que o crescimento e a produção de antígenos diminuem na ausência de glicose, demonstrando a importância dos meios de cultura no 147 crescimento e produção de determinantes antigênicos. Os autores analisaram os efeitos da concentração de caseína hidrolisada e glicose na obtenção de exoantígenos no meio asparagina preparados com concentrações diferentes destes componentes (4,0% de glicose e 0,4% de caseína hidrolisada; 0,4% de glicose e 4,0% de caseína hidrolisada e meio original usado como controle), verificando que alta concentração de glicose e baixa de aminoácidos aumenta o rendimento celular, mas não afeta a produção dos antígenos H e M, quando comparados ao meio original; sendo que da mesma maneira a baixa concentração de glicose e alta de aminoácidos diminui o rendimento celular bem como a produção de antígenos H e M. Diante do exposto elegemos o meio ágar Sabouraud-dextrose, para a produção de antígenos fúngicos visando sua aplicabilidade no imunodiagnóstico da histoplasmose, pois os anticorpos circulantes presentes no soro de indivíduos infectados pelo Histoplasma reconhecem determinantes estimulados e expressos em maior ou menor quantidade de acordo com a composição química do meio. Nossos resultados demonstram que antígenos produzidos em ágar Sabourauddextrose expressam esses determinantes antigênicos com 15 e 33 dias de cultura, de acordo com a amostra em estudo, apresentando excelente padrão de sensibilidade e especificidade. Trabalhos de nosso grupo têm demonstrado que antígenos de H. capsulatum, obtidos pela metodologia proposta Kaufman e Standard (1978), cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose e concentrados 20 vezes, apresentaram excelente padrão de reatividade frente a anticorpo policlonal espécie-específico, sendo observada a presença das frações H e M, não detectando reatividade cruzada destes lotes antigênicos frente a anticorpos policlonais anti-exoantígeno de P. brasiliensis e anti- exoantígeno de A. fumigatus empregando-se a técnica de imunodifusão dupla. Por outro lado, antígenos produzidos em ágar BHI, apesar de apresentarem especificidade frente a anticorpo policlonal anti-exoantígeno de H. 148 capsulatum, apresentaram intensa reatividade cruzada quando avaliados frente a anticorpo policlonal anti-exoantígeno de P. brasiliensis, salientando a importância da escolha do meio de cultura usado na obtenção destas preparações antigênicas (Freitas et. al., 2004). Em relação ao método de extração de antígenos, nossos dados encontram-se em concordância aos da literatura (Pine et al. 1966; Reeves et al. 1972; Kaufman e Standard 1978 a; Kaufman e Standard 1978 b; Di Salvo et al., 1980; Andreau et al., 1990; Negroni et al. 1998; Da Mata et al. 2003), uma vez que empregando solução de mertiolato-borato obtivemos antígenos com índices elevados de sensibilidade, especificidade além dos mesmos se apresentarem estáveis após 12 meses da data de obtenção. Nossos resultados confirmam e reforçam os dados disponíveis na literatura que indicam que a sensibilidade e especificidade da técnica de imunodifusão dupla esta diretamente relacionada à qualidade do antígeno empregado (Wheat et al., 1996; Elias-Costa, 2000; Do Valle et al., 2001). A análise dos antígenos de H. capsulatum obtidos a partir das amostras 49, 200, 268 e 406 cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, a 27º C por 15 e 33 dias, revelam diferença no percentual de sensibilidade da técnica de imunodifusão dupla. Ao analisarmos a reatividade dos antígenos obtidos com 15 dias frente a pacientes com histoplasmose doença observamos que o melhor índice de sensibilidade foi obtido para antígenos das amostras 200 e 406 (95,4%), seguido pelo antígeno obtido da amostra 40 com 77,2% e o obtido da amostra 268 revelou sensibilidade de apenas 18,1%. Quando avaliamos a sensibilidade da preparação antigênica obtida pela mistura de todos os isolados (pool antigênico), não detectamos aumento da sensibilidade, sendo a mesma inferior (27,7%) as obtidas para antígenos da amostras 49, 200 e 406. Quando avaliamos estes antígenos frente a soros de pacientes com histoplasmose infecção observamos discreto decréscimo na sensibilidade para as amostras 200 e 406 (71,4%), em 149 contrapartida o índice de sensibilidade para a amostra 49 e para o pool antigênico foi de 85,7%. Antígenos obtidos com 33 dias de cultura analisados frente a soros de pacientes com histoplasmose doença conservaram o índice de sensibilidade (95,4%) para as amostras 200 e 406, 40,9% para o obtido da amostra 49 e apenas 4,5% para o obtido da amostra 268. A sensibilidade da reação de imunodifusão dupla empregando estes antígenos frente a soros de pacientes com histoplasmose infecção foi de 85,7% para antígeno da amostra 49 e para o pool antigênico; 71,4% para antígenos das amostras 200 e 406. Devido ao baixo índice de sensibilidade, não avaliamos o antígeno obtido a partir da amostra 268. A especificidade da técnica de imunodifusão empregando as preparações antigênicas obtidas com 15 e 33 dias de cultura foi de 100%, ou seja, não houve reatividade cruzada frente a soros heterólogos. Bauman e Smith (1975), ao avaliarem a sensibilidade das técnicas de imunodifusão dupla e fixação de complemento empregando como antígeno filtrado de cultura, frente a 70 soros de pacientes com histoplasmose encontraram 90% de sensibilidade pela prova de imunodifusão contra 72,8% pela de fixação de complemento. Negroni et al. (1998), avaliando o padrão de reatividade de antígenos de H. capsulatum, pela prova de imunodifusão frente a 43 soros de paciente HIV positivos e co-infectados pelo Histoplasma obteve 34,8% de positividade, observando, contudo, reatividade cruzada frente a soros de paciente com paracoccidiodomicose. Nossos resultados empregando a técnica de immunoblotting comprovam que os antígenos obtidos das amostras 49, 200, 268 e 406 produzem além das as frações H (120 kDa) e M (94 kDa), consideradas como antígenos imunodominates de H. capsulatum, uma gama de determinantes antigênicos que merecem certamente maior atenção no futuro. Ao avaliarmos o antígeno obtido da amostra 200 com 15 dias de cultura observamos que 100% dos soros avaliados, histoplasmose doença e infecção, reconheceram de forma específica as frações de 120 e 94 kDa, correspondente aos antígenos H e M de H. capsulatum respectivamente. Verificamos ainda, que para antígeno desta mesma amostra obtido com 33 dias de cultura, apesar da reatividade frente à fração de 120 kDa, o 150 melhor padrão de reconhecimento foi observado para a fração de 94kDa. Os resultados obtidos para antígenos da amostra 200, estão em concordância com Ehrhard e Pine (1972), que observaram que a expressão da fração H (120 kDa) ocorre precocemente com a liberação de ácidos nucléicos e carboidratos, observando também que a produção do antígeno M é maior nas amostras cultivadas na ausência de agitação (fase estacionária). Bachi (2004), ao avaliar a produção das frações H e M pelas amostras Chesc e Almnara, cultivadas em caldo Smith asparagina, a temperatura ambiente, por 30, 60 e 90 dias, verificaram que a produção das frações H e M iniciava-se aos 30 dias de cultivo, sendo que com 60 dias a produção encontrava-se maior e aos 90 dias havia degradação dos mesmos. Lacaz et al., (1999), avaliaram a imunoreatividade do soro de paciente com histoplasmose frente a antígeno obtido a partir de amostra de H. capsulatum isolada de fragmento de pele cultivado em fase estacionária, verificando por immunoblotting o reconhecimento da fração de fração de 94 kDa. Em nosso estudo, avaliamos por immunoblotting a reatividade de soros de quatro indivíduos imunocompetentes e que trabalham com o fungo P. brasiliensis há pelo menos três anos, observando que 100% dos soros reagiu frente as frações de 94, 74 e 62 kDa. Estes achados reforçam a sensibilidade do ensaio de imunodifusão dupla, pois todos os indivíduos apresentavam sorologia negativa para H. capsulatum empregando-se além do antigeno da amostra 200 antígenos de referência, sugerindo assim, que a reatividade cruzada possa ser devido à existência de epítopos semelhantes entre P. brasiliensis e H. capsulatum. Avaliamos também o padrão de reatividade de amostras de 17 soros obtidas de indivíduos que visitam freqüentemente cavernas virgens e/ou exploradas, e que haviam apresentado ausência de reatividade pelo ensaio de imunodifusão dupla frente aos antígenos de H. capsulatum, obtidos com 15 e 33 dias de cultura bem como frente a antígeno de referência. Por immunoblotting verificamos que 94,1% reagiram frente às frações de 94 e 74 kDa, confirmando que estes indivíduos entraram em contato com o agente etiológico da histoplasmose em algum momento de sua vida. Bachi (2004), em sua dissertação 151 de mestrado chama a atenção para o resultado obtido pela técnica de immunoblotting obtido frente a oito soros de indivíduos sadios, observando que 30% reconheceram a molécula de 94 kDa e 10% a molécula de 120 kDa, sugerindo que os mesmos possivelmente tenham tido exposição prévia ao fungo e histoplasmose-infecção A interpretação do conjunto de ensaios sorológicos sugere que o emprego dos antígenos obtidos da amostra 200 de H. capsulatum cultivadas em ágar Sabouraud-dextrose, por 15 e 33 dias, a 27º C, segundo metodologia proposta por Kaufman e Standard (1978), apresentam boa capacidade discriminatória tanto para soros de pacientes com histoplasmose doença e infecção, não havendo assim, necessidade de se trabalhar com pool antigênico obtidos de diferentes antígenos, podendo ser considerada uma alternativa para a produção de antígenos de baixo custo operacional, exigindo menor período de tempo para sua obtenção amostras de H. capsulatum e produção, minimizando conseqüentemente o risco de contaminação das culturas fúngicas, podendo ser aplicada como antígeno de referência na rotina diagnóstica confirmatória da histoplasmose, uma vez que apresenta sensibilidade de 94,4% e especificidade de 100,0%. Além disso, podemos sugerir que a expressão de determinantes antigênicos está relacionada não apenas com o meio de cultura utilizado para a produção dos lotes antigênicos bem como possivelmente com as características fenotípicas das amostras de H. capsulatum, uma vez que em nosso estudo, observamos que amostras que apresentaram pigmentação bege a ocre e intensa conidiogênese demonstraram melhor padrão de reatividade, por meio de provas sorológicas, frente a soros homólogos. 152 9.0. CONCLUSÕES 1. A escolha da amostra de H. capsulatum var. capsulatum, é importante para a obtenção de antígenos com alta especificidade. 2. A expressão de determinates antigênicos esta relacionada não apenas com o meio de cultura utilizado para a produção dos lotes antigênicos bem como possivelmente com as características fenotípicas das amostras de H. capsulatum, uma vez que em nosso estudo, observamos que amostras que apresentaram pigmentação bege a ocre e intensa conidiogênese demonstraram melhor padrão de reatividade, por meio de provas sorológicas, frente a soros homólogos. 3. A cinética do crescimento fúngico, indica que a fase log vai do 40º ao 47º dia de cultura, depois deste período, o crescimento entra em latência, o que ocasiona provavelmente degeneração das células micelianas devido a ação de enzimas proteolíticas. 4. O emprego de ágar Sabouraud-dextrose, constituiu-se em um excelente meio para a produção de exoantígenos de H. capsulatum, abrindo assim, perspectivas futuras para Laboratórios de Mico-Sorologia que não possuam condições para adquirir meios de cultura mais complexos produzirem antígenos com bom nível de especificidade. 5. Amostras de H. capsulatum que se encontravam em período de intensa esporulação apresentaram melhor expressão de determinantes antigênicos, exceto o 268 que era pleomórfico. 7. Exoantígenos produzidos a partir de uma única amostra apresentam boa capacidade discriminatória frente a soros de pacientes com HP doença e HP infecção, não havendo assim, necessidade de trabalhar-se com pool de amostras. 153 8. O emprego de solução mertiolato-borato (1:5.000) para a extração de determinantes antigênicos, auxilia na manutenção da estabilidade antigênica. 9. Os resultados sugerem uma alternativa de baixo custo operacional, menor período de tempo, fácil exeqüibilidade técnica, reprodutibilidade para a obtenção de antígenos de H. capsulatum visando o diagnóstico confirmatório da HP. 154 10.0. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Allendoerfer R, Deepe GS Jr. Intrapulmonary response to Histoplasma capsulatum gamma interferon knockout mice. Infect Immun. 1997; 65(7): 2564-9 2. Allendoerfer R, Deepe GS Jr. Blockade of endogenous TNF-α exacerbates primary and secondary pulmonary histoplasmosis by differential mechanisms. J Immunol. 1998; 160: 6072(12)-82. 3. Allendoerfer R, Deepe GS Jr. Infection with Histoplasma capsulatum: Host-fungus interface. Rev Iberoam Micol.1998; 15: 256-60. 4. Allendoerfer R, Brunner GD, Deepe. Cytokine profiles in lungs of immunodeficient mice with pulmonary histoplasmosis. 98th General Meeting of the American Society for Microbiology, Atlanta, GA, 1998, Abstract F-5. 5. Alves K S. 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J Immunol.1998; 160(3): 1359-68. 174 Anexo A Aprovação do Projeto CTC – IAL #06/04 pela Comissão Científica da Divisão de Biologia Médica e Comitê Técnico - Cientifico do Instituto Adolfo 175 Lutz. Anexos B, C e D Aprovação do Projeto pelos: Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Adolfo Lutz (Projeto CTC-IAL #06/04), Comissão de Ética parta Análise de Pesquisa do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (Projeto # 983/03), Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (Projeto # 10/03). 176 ANEXO E E 1. Meio de Cultura para Manutenção dos Isolados Fúngicos E 1.1. Meio de Agar Batata Infusão de Batata 500,0 mL Dextrose (Oxoid) 10,0 g Ágar (Oxoid) 15,0 g Água destilada 500,0 mL a) colocar 200,0 g de batatas descascadas em 500,0 mL de água e cozinhá-las; b) filtrar o infuso através de gaze, e completar o volume para 1000,0 mL com água destilada; c) adicionar o ágar, dissolvê-lo completamente e então adicionar a glicose; d) distribuir e autoclavar a 120°C, durante 15 minutos. E 2. Meios de Cultura para Isolamento e Crescimento do H. capsulatum var capsulatum E 2.1. Meio de Ágar Sabouraud-dextrose Dextrose (Difco) 40,0 g Peptona (Oxoid) 10,0 g Ágar (Oxoid) 15,0 g Água Destilada 1000,0 mL a) dissolver o ágar em 1000,0 mL de água, aquecendo-o em banhomaria; 177 b) adicionar a dextrose e a peptona, misturando-as bem; c) distribuir e autoclavar a 120°C durante 15 minutos. E.2.2 Meio Micobiótic (Ágar Sabouraud modificado) Dextrose (Difco) 20,0 g Peptona (Oxoid) 10,0 g Agar (Oxoid) 15,0 g Água Destilada 1000,0 mL a) dissolver o ágar em 1000,0 mL de água, aquecendo-o em banhomaria; b) adicionar a dextrose e a peptona, misturando-as bem; c) diluir separadamente 400 mg de cicloheximida em 10,0 mL de acetona, 100 mg de cloranfenicol em 10,0 mL de álcool 95°C, misturar as soluções e adicionar ao ágar Sabouraud; c) distribuir e autoclavar a 120°C durante 15 minutos. E 2.3. Agar Infusão de Cérebro e Coração Brain Heart Infusion (Difco) 37,0 g Ágar (Oxoid) 15,0 g Água destilada 1000,0 mL pH= 7.4 a 25º C. a) dissolver, aquecendo em banho Maria; b) distribuir e esterilizar a 120º C durante 15 minutos. E.3. Meio de Cultura para o Estudo dos Micromorfológicos do H. capsulatum (Cultivo em Lâmina) 178 Aspectos E.3.1. Meio de Agar Batata Descrito no item E 1.1. E.4. Meio de Cultura para a Produção de Exoantígeno de H. capsulatum E 4.1. Meio de Ágar Sabouraud-dextrose Descrito no item E 2.1. E.4. Meio de Cultura para a Produção de Exoantígeno de P. brasiliensis E 4.1. Caldo NGTA Neopeptona (Difco) 16,0 g Glicose (Difco) 10,0 g Cloreto de Tiamina (Sigma) 100,0 mg L-asparagina (Sigma) 200,0 mg Água deinonizada a) 1000,0 mL dissolver 16,0 g de neopeptona em 32,0 mL de água deionizada aquecida a 45º C; b) colocar a solução de neopeptona em membrana de diálise e dialisar contra água destilada (cerca de 1000,0 mL), durante cinco horas a 70º C e por uma noite a 4º C; c) retirar o conteúdo da membrana de diálise, completar o volume com água destilada até 1000,0 mL e adicionar a glicose, tiamina e asparagina, homogeneizar; d) ajustar o pH para 6,8-7,0 179 e) distribuir e esterilizar a 120º C durante 15 minutos. E.5. Meio de Cultura para a Produção de Exoantígeno de A. fumigatus E 5.1.- Caldo Sabouraud Dextrose (Difco) 40,0 g Peptona (Oxoid) 10,0 g Água Destilada 1000,0 mL a) dissolver a dextrose e a peptona em 1000,0 mL de água, aquecendoo em banho-maria; b) distribuir e autoclavar a 120°C durante 15 minutos. 180 ANEXO F F.1. Solução de Thimerosal, segundo Standard & Kaufman, 1982. Etil mercúrio tio salicilato de sódio (Sigma) 1,0 g Borato de Sódio 1,4 g Água destilada 100,0 mL 181 ANEXO G G.1. Reativo de Coomassie Blue-G Coomassie Blue-G (Sigma) 10,0 mg Etanol 95% (Merck) 5,0 mL Ácido ortofosfórico 85% (Merck 10,0 mL Água deionizada qsp 100,0 mL Dissolver o Coomassie Blue- G no etanol, acrescentar o ácido ortofosfórico e a água. Estocar em frasco âmbar a temperatura ambiente. Esta solução permanece estável por 30 dias. 182 ANEXO H H.1. Soluções utilizadas no Ensaio de Imunodifusão Dupla em Gel de Agarose H.1.1. Solução de Agar a 1% Agar purificado (Oxoid) 1,0 g Água bidestilada 100,0 mL Pesar o ágar e colocá-lo em erlenmeyer de 200,0 mL. Homogeneizar e levar ao forno de microondas para fundir, tomando cuidado para não levantar fervura. Após fusão distribuir 10,0mL da solução em tubos de ensaio 16X160 e estocar a 4°C. H.1.2. Solução de Agar Citrato Cloreto de sódio (Synth) 0,90 g Citrato de sódio (Synth) 0,40 g Glicina (Synth) 7,50 g Agarose tipo II EEO (Sigma) 1,00 g Thimerosal (Sigma) 0,01g Água bidestilada (qsp) 100,0 mL Dissolver em aproximadamente 80,0 mL de água bidestilada, o cloreto de sódio, o citrato de sódio e a glicina. Ajustar o pH da solução entre 6,7- 6,9. Acrescentar a agarose e levar ao forno microondas para fundir. Deve-se prestar muita atenção para que a solução não entre em fervura, a mesma estará fundida quando ficar transparente. Após a etapa de fusão, adicionar o thimerosal. Distribuir 10,0 mL da solução em tubos de 16X160 e estocar a 4°C. 183 H.1.3. Solução de Citrato de Sódio a 5% Citrato de sódio (Synth) 5,0 g Água bidestilada 1000,0 mL Distribuir em frascos âmbar e estocar a 4º C. H.1.4. Solução Salina a 0,85% Cloreto de Sódio (Synth) 34,0 g Água bidestilada 4000,0 mL H.1.5. Solução Corante Coomassie Brilliant Blue R-250 Coomassie brilliant blue R250 (Sigma) 4,0 g Ácido acético glacial (CAAL) 100,0 mL Etanol (CAAL) 450,0 mL Água bidestidada (qsp) 1000,0 mL Em um balão volumétrico adicionar o ácido acético e o etanol, completar o volume para 1000,0 mL de água. Adicionar o corante. Homogeneizar lentamente em agitador magnético até completa dissolução do corante. Filtrar e estocar em frasco âmbar a temperatura ambiente. H.1.6. Solução Descorante Ácido acético glacial (CAAL) 100,0 mL Etanol (CAAL) 450,0 mL Água bidestilada 450,0 mL 184 Esta solução pode ser reaproveitada, para tanto basta filtrá-la em carvão ativado 185 ANEXO I I.1. Soluções utilizadas na Técnica de Eletroforese em Gel de Poliacrilamida I.1.1. Solução Estoque de bis – acrilamida Acrilamida 30% (Sigma) 30,0 g Bis - Acrilamida (Sigma) 0,8 g Água bidestilada qsp 100,0 mL Homogenizar a acrilamida e bis-acrilamida em 50,0 mL de água bidestilada em becker envolto com papel alumínio. certar o volume para 100,0 mL, filtrar em funil com papel de filtro. Estocar a 4oC em frasco âmbar envolto em papel alumínio. Esta solução pode ser conservada por um período de 3 a 4 meses. I.1.2. Lower Gel Buffer Trizma base (Sigma) 18,2 g SDS (Sigma) 0,4 g Água bidestilada qsp 100,0 mL Adicionar 50,0 mL de água bidestilada ao trizma base, homogenizar e acertar o pH da solução para 8,8. Acrescentar o SDS, completar o volume e filtrar a solução. Estocar a 4oC em frasco âmbar envolto em papel alumínio. Esta solução pode ser conservada por um período de 3 a 4 meses. 186 I.1.3. Upper Gel Buffer Trizma base (Sigma) 3,0 g SDS (Sigma) 0,2 g Água bidestilada qsp 50,0 mL Adicionar 25,0 mL de água bidestilada ao trizma base, homogenizar e acertar o pH da solução para 6,8. Acrescentar o SDS, completar o volume e filtrar a solução. Estocar a 4oC em frasco âmbar envolto em papel alumínio. Esta solução pode ser conservada por um período de 3 a 4 meses. I.1.4. Solução de Persulfato de Amônia a 10% Persulfato de sódio 0,5 g Água bidestilada 5,0 mL Distribuir em alíquotas e manter congelado a –20 °C. I.1.5. Solução de Duodecil Sulfato de Sódio (SDS) a 20% SDS (Sigma) 10,0 g Água bidestilada 50, 0 mL I.1.6. Tampão de Amostra Redutor 5 vezes Concentrado Tris pH 6.8 0,6 mL Glicerol 2,5 mL SDS 20% 1,0 mL 2-Mercaptoetanol 0,5 mL H2O bidestilada 4,4 mL Distribuir em alíquotas e manter congelado a –20 °C. 187 I.1.7. Tampão de Corrida 10 vezes Concentrado Glicina (Sigma) 144,0 g Trizma (Sigma) 30,3 g SDS (Sigma) 10,0 g Água bidestilada qsp 1000,0 mL Dissolver em 600.0 ml de água destilada a glicina e o trizma, homogenizar e acertar o pH da solução para 8,3. Adicionar as 10,0 g de SDS, homogenizar até completa dissolução. Completar para 1000,0 mL. Para uso, diluir na seguinte proporção: Tampão de transferência 10 vezes concentrado Água bidestilada 100,0 mL 1000,0 mL I.1. 8. Gel de separação na concentração de 10% de acrilamida Água bidestilada 6,7 mL Tampão Lower 4,0 mL Solução de acrilamida 3,0 mL 25 µL Persulfato de amônia 5 µL Temed (Sigma) I.1.9. Gel de empilhamento na concentração de 3% de acrilamida Água bidestilada 2,95 mL Tampão Upper 1,25 mL Solução de acrilamida 0,8 mL 15 µL Persulfato de amônia 5 µL Temed (Sigma) 188 I.1.10 Coloração pelo Brilhante Blue Coomassie Brilhante Blue R-250 (Sigma) 4,0 g Ácido Acético Glacial (Merck) 100,0 mL Etanol (Merck) 450,0 mL Água bidestilada qsp 1000,0 mL Em um balão volumétrico adicionar o ácido acético glacial e o etanol, completar para 1000,0 mL de água bidestilada. Adicionar o corante. Homogeneizar lentamente em agitador magnético até completa dissolução do corante. Filtrar e estocar em frasco âmbar a temperatura ambiente. I.1.11. SOLUÇÃO DESCORANTE Ácido Acético Glacial (Merck) 100,0 mL Etanol (Merck) 450,0 mL Água bidestilada qsp 450,0 mL 189 ANEXO J J.1. Soluções utilizadas no ensaio de Immunoblotting J.1.1.Tampão de Transferência 10 vezes concentrado Tris (Sigma) 15,15 g Glicina (Sigma) 72,0 g Água bidestilada qsp 500,0 mL Para uso, diluir na seguinte proporção: Tampão de transferência 10 vezes concentrado 100,0 mL Metanol 100,0 mL Água bidestilada 800,0 mL J.1.2. Solução Corante utilizada para controle da transferência Ponceau-S (Sigma) 1,0g Ácido Acético Glacial (Merck) 2,0 mL Água bidestilada qsp 200,0 mL J.1.3. Solução Salina Tamponada com Fosfatos (PBS) pH 7,4 (10 vezes concentrado) Cloreto de Sódio 82,0 g NaH2PO4 . H2O 3,6 g NaHPO4 14,2 g Água bidestilada qsp 1000,0 mL Para uso, diluir na seguinte proporção: Tampão de transferência 10 vezes concentrado 190 100,0 mL Água bidestilada 1000,0 mL J.1.4. Solução Bloqueadora (5%) Leite desnatado (Molico, Nestlé) 5,0 g PBS (pH 7,4) 100,0 mL J.1.5. Solução PBS-Tween 20 (0.1%) 500,0 µL Tween 20 (Sigma) PBS (pH 7,4) 500,0 mL J.1.6. Tampão Tris-salina (pH 7,5) Tris (Sigma) 1,2 g Cloreto de Sódio (CAAL) 9,0 g Água bidestilada qsp 1000,0 mL J.1.7. Solução Cromógena J.1.7.1. Para anti-imunoglobulina conjugado à peroxidase 4-cloro 1-naftol (Sigma) 15,0 mg Tris-salina (pH7,5) 20,0 mL Metanol (Merck) 5,0 mL Peroxido de hidrogênio 20,0 µL Preparo da solução reveladora: 191 Dissolver o 4 cloro 1- naftol no metanol frio, acrescentar a solução Trissalina e por último o peróxido de hidrogênio. J.1.7.2.Para anti-imunoglobulina conjugado à fosfatase alcalina 5-bromo-4-cloro-indolil (BCIP) Nitroblue tetrazólio (NBT) Preparo da solução reveladora: Diluir 44 µL de NBT em 10,0 mL de solução Tris-HCl 0.1M, pH 9,5, 0.1M de NaCl e 50 mM de Adicionar BCIP Mg Cl2 ,homogeneizar gentilmente. 33 µL homogeneizar. 192
