Avaliação radiográfica da influência da osteoporose na

SABRINA DE CASTRO BRASIL
ª
AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA DA INFLUÊNCIA DA
OSTEOPOROSE NA EVOLUÇÃO DE LESÕES
PERIRRADICULARES EM RATAS
2013
i
2011
SABRINA DE CASTRO BRASIL
AVALIAÇÃO RADIOGRÁFICA DA INFLUÊNCIA DA OSTEOPOROSE NA
EVOLUÇÃO DE LESÕES PERIRRADICULARES EM RATAS
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Odontologia da
Universidade Estácio de Sá visando a
obtenção do grau de Mestre em
Odontologia (Endodontia).
Orientadoras:
Prof.ª Dra. Luciana Armada Dias
Prof.ª Dra. Rachel Moreira Moraes dos Santos
UNIVERSIDADE ESTÁCIO DE SÁ
RIO DE JANEIRO
2013
ii
Dedicatória
À Deus, que me conduz e fortalece
a cada dia.
Ao meu amado filho Rafael, que
mesmo sem entender direito o que
estava acontecendo, me renovou a
cada dia desta trajetória com muito
amor e alegria.
À minha mãe Celi, por ter vivido
cada fase de forma companheira e
por ter sido tão ajudadora em todo
tempo.
À minha irmã Paula pelo incentivo,
amizade, apoio e por ser um
exemplo profissional em minha vida.
iii
AGRADECIMENTOS
À Prof.ª Dra. Luciana Armada Dias, a quem tenho grande respeito e admiração,
pela orientação, amizade, incentivo e por ter acreditado em mim para a
realização deste trabalho. Sua competência e dedicação foram e sempre serão
motivadores essenciais em minha vida.
À Prof.ª Dra. Rachel Moreira dos Santos Morais pela orientação, paciência,
apoio, amizade, e por ter me recebido com tanto carinho nas instalações da
Universidade Federal Fluminense. Sua humildade, seriedade e habilidade
foram e serão inspiradores. Obrigada por me ajudar a acreditar que seria
possível.
Ao coordenador do PPGO, Prof. Dr. José Freitas Siqueira Júnior, a quem tenho
a honra de ter conhecido e a gratidão por ter depositado confiança em mim
para a execução deste trabalho.
Aos meus pais pelo apoio emocional em todo o tempo, por me incentivarem
durante toda a minha trajetória profissional e por terem me ensinado valores
indispensáveis para a execução de tarefas aparentemente impossíveis.
Ao meu filho Rafael pela compreensão, carinho e amor, que funcionaram como
combustível para a conclusão desta etapa da minha vida.
À minha irmã Paula, pelo apoio emocional, amizade, pelas palavras de
incentivo e motivação.
Ao Luciano, meu companheiro e amigo pelo incansável apoio emocional e
profissional.
Aos brilhantes professores que compõem o PPGO da UNESA, pois todos
contribuíram grandemente em minha vida com seus ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Flávio Ferreira Alves, por ter acreditado em mim e me incentivado
a ingressar no PPGO. Agradeço por sua contagiante motivação e dedicação.
Aos professores Prof. Dr. Fábio Vidal, pelas brilhantes considerações na etapa
de qualificação, ao Prof. Dr. José Cláudio Provenzano pelo incentivo e palavras
motivadoras e a Prof. Dra. Mônica Schultz Neves, a quem tenho grande
carinho, gratidão e admiração por sua excelência clínica.
Ao Prof. Dr. Fábio Ramôa Pires, pelas brilhantes considerações na
qualificação, pela contribuição para a realização da análise morfológica e nas
etapas de inclusão e cortes histológicos.
iv
À equipe técnica do laboratório de Patologia da UERJ pelo auxílio nas etapas
de inclusão, cortes histológicos e confecção das lâminas.
Ao Renan de Souza Lima, médico veterinário, pela parceria no trato com os
animais em todo o experimento, principalmente nas etapas de ovariectomia,
desenvolvimento de lesão perirradicular e sacrifício.
À secretária Angélica Pedrosa pelo imenso carinho, apoio e amizade.
À minha ASB e amiga Rosilene Santos pela compreensão, amizade e parceria.
Às minhas amigas de trabalho, Dras. Benícia Bizzo, Priscila Nielle e Danielle
Torres pelo incentivo, paciência, carinho e acima de tudo pela grande amizade.
À equipe da Universidade Federal Fluminense, em especial a técnica Arlete
pela presteza e auxílio nas etapas de descalcificação e inclusão, a aluna de
iniciação científica Roberta pelo auxílio com os animais e companhia nas
leituras de lâminas durante a citologia e ao bioterista Redinei pelo auxílio no
cuidado com os animais.
À equipe técnica do laboratório de Patologia da UERJ pelo auxílio nas etapas
de inclusão, cortes histológicos e confecção das lâminas.
À equipe da Clínica CIROD Radiologia Oral, que permitiram a realização das
radiografias digitais em todas as fases experimentais.
Aos colegas de turma Adirson Jorge e Helena Baruffaldi pelo carinho e
amizade em todo o decorrer do curso, e aos demais colegas do Mestrado e
Doutorado pela amizade e companheirismo em especial Natasha Ajuz, Camila
Arão, Fábio Barcelos, Cintia Bueno e Renata Val.
v
ÍNDICE
Página
RESUMO..............................................................................................................
vii
ABSTRACT...........................................................................................................
viii
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................
ix
LISTA DE TABELAS.............................................................................................
xi
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS................................................................
xii
1. INTRODUÇÃO..........................................................................................
01
2. REVISÃO DE LITERATURA.....................................................................
03
3. JUSTIFICATIVA........................................................................................
27
4. HIPÓTESE................................................................................................
28
5. PROPOSIÇÃO..........................................................................................
29
6. MATERIAIS E MÉTODOS........................................................................
30
7. RESULTADOS..........................................................................................
35
8. DISCUSSÃO.............................................................................................
43
9. CONCLUSÕES.........................................................................................
50
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................
51
11. ANEXO.....................................................................................................
62
vi
RESUMO
Objetivo: Avaliar os efeitos da osteoporose na evolução da lesão
perirradicular.
Métodos: Foram utilizadas ratas Wistar (n=24), isogênicas e virgens, com 3
meses de idade, previamente avaliadas por citologia vaginal. Metade dos
animais foi ovariectomizada (OVX) e a outra metade foi pseudo-operada (C).
Após 150 dias de castração foi estimulado o desenvolvimento de lesão
perirradicular através da exposição pulpar dos primeiros molares inferiores
esquerdos. A massa corporal foi verificada semanalmente. Ao final dos
períodos experimentais (21 e 40 dias de lesão) os animais foram sacrificados, o
sangue foi coletado para análise de fosfatase alcalina, cálcio e fósforo e as
mandíbulas foram excisadas e radiografadas.
Resultados: A deficiência estrogênica resultou em ganho de massa corporal
significantemente maior (p < 0.01) em OVX 40 dias quando comparado ao C 40
dias. Esta diferença não foi observada no experimento de 21 dias. Os níveis
séricos de cálcio, fósforo e fosfatase alcalina não apresentaram diferenças
estatisticamente significativas entre OVX e C (21 e 40 dias). As lesões
perirradiculares avaliadas radiograficamente foram significativamente maiores
no grupo OVX 40 quando comparado a C 40 (p<0.05) e a C 21 (p< 0.001).
Conclusões: Através deste estudo foi possível verificar que a osteoporose
atuou como modificador da doença, pois influenciou na evolução da lesão
perirradicular, principalmente em períodos crônicos.
Palavras-chaves: lesão perirradicular; osteoporose; mandíbula.
vii
ABSTRACT
Aim: Evaluate the effects of osteoporosis in the evolution of apical periodontitis.
Methods: Wistar rats (n = 24),isogenic and virgins, 3 months old, previously
assessed by vaginal cytology were used. Half of the animals were
ovariectomized (OVX) and the other half pseudo-operated (C). 150 days after
castration was induced development of apical periodontitis by pulp exposure of
their mandibular left first molars. Body weight was checked weekly. At the end
of the experimental periods (21 and 40 days of injury) the animals were
sacrificed, blood was collected for analysis of alkaline phosphatase, calcium
and phosphorus and the jaws were excised and radiographed.
Results: Estrogen - deficient state resulted in significantly greater gain in body
mass (p <0.01), OVX at 40 days compared to C 40 days. This difference was
not observed in the experiment of 21 days. Serum calcium, phosphorus and
alkaline phosphatase showed no statistically significant differences between
OVX and C (21 and 40 days). The periradicular lesions evaluated
radiographically were significantly higher in the OVX group compared to 40 C
40 (p <0.05), and C 21 (p <0.001).
Conclusions: The findings from this study showed that osteoporosis acted as
a modifier of the disease, as influenced the evolution of apical periodontitis,
especially in chronic periods.
Key-words: apical periodontitis, osteoporosis; jaw.
viii
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1: Dano tecidual direto e indireto causado por bactérias ao
exercerem sua patogenicidade.................................................................. 11
Figura 2: Funções do RANK, RANKL e OPG na osteoclastogênese em
condições homeostáticas e inflamatórias.................................................. 16
Figura 3: Modificadores da doença...........................................................
17
Figura 4: Fotomicrografia de lâminas de esfregaço vaginal de ratas
controle, nas diferentes fases o Ciclo Estral, coradas pelo método
tricômico de Shoor..................................................................................... 26
Figura 5: Citologia vaginal......................................................................... 31
Figura 6: Desenvolvimento de lesão perirradicular................................... 32
Figura 7: Valor de massa corporal inicial (g)............................................. 36
Figura 8: Valor de massa corporal final (g)...............................................
36
Figura 9: Valor de Δ (massa corporal final-massa corporal inicial)........... 37
Figura 10: Análise comparativa dos níveis séricos de cálcio....................
38
Figura 11: Análise comparativa dos níveis de fósforo..............................
39
Figura 12: Análise comparativa dos níveis de fosfatase alcalina.............. 40
Figura 13: Análise comparativa do tamanho de lesões perirradiculares
entre os grupos experimentais................................................................... 42
Figura 14: Radiografias de mandíbulas....................................................
ix
42
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1: Mediadores Químicos da inflamação e seus efeitos.................
10
Tabela 2: Valores de massa corporal inicial (g)........................................
35
Tabela 3: Médias das concentrações séricas de cálcio (mg/dl) por
grupo.......................................................................................................... 38
Tabela 4: Médias das concentrações séricas de fósforo (mg/dl) por
grupo.......................................................................................................... 39
Tabela 5: Médias das concentrações séricas de fosfatase alcalina (U/L)
por grupo.................................................................................................... 40
Tabela 6: Médias dos tamanhos das lesões perirradiculares...................
x
41
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
C
controle
°C
graus Celsius
dl
decilitro
FcyR
receptor celular de superfície gama
Fcy
receptor de superfície
FcyRIIIa
receptor celular de superfície gama IIIa
FSH
hormônio folículo estimulante
IFN-γ
interferon Gama
HIV
vírus da imunodeficiência humana
Ig
imunoglobulina
IL-1
interleucina-1
IL-1α
interleucina-1 alfa
IL 1-β
interleucina-1 beta
IL-6
interleucina-6
IL-11
interleucina-11
IL-17
interleucina-17
LH
hormônio luteinizante
M-CSF
fator estimulante de colônia de macrófago
mg
miligrama
Mmol
milimol
OPG
osteoprotegerina
xi
OVX
ovariectomizado
PAF
fator de agregação plaquetária
PTH
paratormônio
PG
prostaglandina
RANK
receptor activator of NF Kappa
RANKL
receptor activator of NF-kB ligand
TNF
fator de necrose tumoral
TNF-α
fator de necrose tumoral alfa
TNF-β
fator de necrose tumoral beta
Toll
toll-like receptors
U/L
unidade por litro
Δ
delta
xii
1. INTRODUÇÃO
A lesão perirradicular é uma doença inflamatória de etiologia microbiana
causada primariamente pela infecção do sistema de canais radiculares
(SIQUEIRA, 2011). Embora fatores de ordem física e química possam induzir
ao aparecimento de uma lesão perirradicular, vários estudos indicam que
apenas os agentes microbianos são responsáveis pela progressão e
manutenção da inflamação perirradicular (KAKEHASHI, et al.,1965; MÖLLER,
1966; SUNDQVIST,1976; MÖLLER et al., 1981). A ocorrência da doença
perirradicular está associada às respostas inflamatória e imunológica do
hospedeiro com o intuito de conter o avanço da infecção endodôntica (LOPES
& SIQUEIRA, 2010).
Diversos mediadores químicos, como por exemplo, interleucinas (IL) 6,
11, 17 e fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), são liberados aos tecidos
perirradiculares em casos de infecção. Ao atingirem níveis críticos, estes
estimularão células do estroma e osteoblastos a expressarem receptor
activator of NF-kB ligand (RANKL), e diminuir a produção de osteoprotegerina
(OPG), promovendo a diferenciação e ativação dos osteoclastos, responsáveis
pela reabsorção óssea e consequente crescimento da lesão perirradicular
(TAKAYANAGI, 2005a e 2005b).
No entanto, os hospedeiros podem apresentar diferentes respostas
à infecção perirradicular e ao mesmo tipo de tratamento endodôntico. Tal fato
ocorre, pois alguns indivíduos apresentam condições que podem influenciar na
1
susceptibilidade da doença (SEGURA-EGEA et al., 2005; ROSANIA et al.,
2009). Estas condições podem ser referidas como modificadores da doença,
desde que não sejam sua causa, mas possam influenciar no desenvolvimento,
diagnóstico, severidade ou resposta ao tratamento (SIQUEIRA, 2011).
A osteoporose representa uma das osteopatias mais comuns, e
caracteriza-se pela redução da massa óssea e deterioração do tecido ósseo,
conduzindo a um aumento da fragilidade óssea e a um consequente aumento
do risco de fratura (AMADEI et al., 2006). Quando o metabolismo ósseo está
em condições normais, existe um equilíbrio entre a formação e a reabsorção
ósseas. Porém, tanto no hipogonadismo como na senescência, há um
desequilíbrio na remodelação óssea que resulta em redução de massa óssea,
caracterizando assim um quadro de osteoporose (JHONSON et al., 2002).
As alterações no metabolismo ósseo levam a um aumento da
reabsorção óssea e a uma diminuição na possibilidade de reparo. É provável
que
esta
condição
exerça
influência
sobre
a
evolução
das
lesões
perirradiculares, que são processos inflamatórios que resultam em destruição
do osso alveolar ao redor do ápice dentário. Porém, não existem relatos na
literatura sobre a osteoporose como modificador da doença perirradicular.
2
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Infecções Endodônticas
Em condições fisiológicas assépticas, os tecidos e órgãos internos de
mamíferos encontram-se livres de microrganismos. Esta situação é mantida
pela ação de barreiras naturais, representadas por fatores mecânicos, químicos
e biológicos, que isolam o interior do organismo, impedindo assim, o contato
com microrganismos ambientais e com os componentes da própria microbiota
anfibiôntica (SIQUEIRA & DANTAS, 2000). Portanto, a exposição da dentina
coloca a polpa em risco de infecção como consequência da permeabilidade da
dentinária normal inerente a estrutura tubular (COHEN, 2011).
As principais alterações patológicas que acometem a polpa e os tecidos
perirradiculares são de natureza inflamatória e etiologia infecciosa. Estudos
clásssicos indicam que agentes microbianos são os principais responsáveis
pela progressão e manutenção da inflamação perirradicular (KAKEHASHI, et
al.,1965; MÖLLER, 1966; SUNDQVIST,1976; MÖLLER et al., 1981).
Quando os microrganismos que colonizam o sistema de canais
radiculares conseguem alcançar os tecidos perirradiculares via forame apical,
ou via forames laterais, instala-se um processo inflamatório na região com o
intuito de tentar evitar que a infecção se dissemine pelo osso e pelos tecidos
moles. Na maioria das vezes, há um equilíbrio entre as defesas do hospedeiro
e a agressão causada pelos patógenos endodônticos, originando uma lesão
perirradicular crônica. Porém, quando a agressão microbiana aos tecidos for
3
muito intensa, um abscesso perirradicular agudo poderá se desenvolver na
região, podendo a infecção alcançar outras áreas da região da cabeça e do
pescoço (SIQUEIRA & RÔÇAS, 2008).
A inflamação é a principal resposta da polpa e dos tecidos
perirradiculares a uma gama de estímulos que causam injúria tecidual. A
intensidade da resposta inflamatória irá variar conforme o tipo de agressão e,
principalmente, a sua intensidade. Uma vez que a agressão rompe a
integridade tecidual, a resposta inflamatória localiza e prepara os tecidos
alterados para a reparação da região afetada. Na persistência do estímulo
agressor, as próprias respostas de defesa do hospedeiro, específicas ou
inespecíficas, podem gerar o dano tecidual. No caso de doenças pulpares e
perirradiculares, a destruição tecidual causada pelas defesas do hospedeiro em
resposta a uma agressão persistente parece ser mais significativa do que os
próprios efeitos diretos proporcionados pelos microrganismos (LOPES &
SIQUEIRA,
2010),
e
é
caracterizada
por
alterações
vasculares,
extravasamento e migração de neutrófilos e monócitos ao local da agressão
(SIQUEIRA, 2011).
Na infecção endodôntica, os microrganismos penetram no sistema de
canais radiculares além do alcance das defesas do hospedeiro e de antibióticos
sistêmicos. A falta de suprimento sanguíneo ativo na polpa necrosada ou
dentes despolpados (tratados) impede o transporte de células/moléculas de
defesa e antibióticos sistêmicos ao sítio infectado. Tal fato difere a infecção
endodôntica de infecções que ocorrem em outros locais do corpo humano
(CHÁVES de PAZ, 2007; JUNGERMANN et al., 2011).
4
Quanto
à
localização,
as
infecções
endodônticas
podem
ser
classificadas em intrarradicular e extrarradicular A infecção intrarradicular
ocorre quando microrganismos colonizam o sistema de canais radiculares, e
pode ser classificada como primária, secundária ou persistente (SIQUEIRA,
2011).
A infecção primária é causada por microrganismos que inicialmente
invadem e colonizam o tecido pulpar necrótico. Já a secundária é causada por
microrganismos que não estavam presentes durante a infecção primária, mas
invadiram o canal radicular algum tempo após intervenção profissional. A
infecção persistente ocorre quando microrganismos envolvidos na primária e
secundária resistiram aos procedimentos antimicrobianos e à escassez de
nutrientes em canais tratados (RÔÇAS et al., 2011).
A persistência das infecções crônicas está geralmente relacionada à
organização comunitária dos biofilmes e à inacessibilidade às defesas do
hospediro, devido à localização anatômica da infecção (COHEN, 2011). O
biofilme pode ser definido como uma comunidade microbiana multicelular
séssil, caracterizada por células que estão firmemente ligadas a uma superficie
e aderidas em matriz polimérica extracelular, usualmente, polissacarídeos
(DUGGAN & SEDGLEY, 2007; SIQUEIRA, 2011). As células localizadas mais
profundamente no biofilme são expostas às condições ambientais que diferem
daqueles na superfície, incluindo diminuição da tensão de oxigênio. Isto resulta
em uma alteração fenotípica em termos de taxa de crescimento e transcrição
de genes, que podem facilitar certas características de sobrevivência e
virulência. A lenta taxa metabólica de microorganismos em biofilmes, bem
5
como a matriz extracelular do biofilme pode impedir a eficácia de muitos
antimicrobianos (DUGGAN & SEDGLEY, 2007).
A infecção extrarradicular é caracterizada pela invasão microbiana do
tecido perirradicular inflamado como uma sequela da infecção intrarradicular.
Teoricamente, essas infecções podem ser dependentes ou independentes da
infecção intrarradicular, embora a última apresente controvérsias (RICUCCI &
SIQUEIRA, 2008).
As lesões perirradiculares constituem uma resposta inflamatória e imune
contra patógenos bacterianos que infectam e destroem a polpa dental, em
consequência da formação de cáries dentárias e traumas. Este processo
inflamatório resulta em destruição do osso alveolar ao redor do ápice radicular
(FUMISHIGE et al., 2009).
2.2. Defesa Tecidual contra Infecções Endodônticas
A resposta imune à penetração e proliferação bacteriana nos tecidos é
dividida em imunidade inata e imunidade adaptativa. A imunidade inata é a
primeira linha de defesa, e a resposta imune adaptativa é a mais sofisticada e
efetiva em termos de reconhecimento e prevenção à reinfecção (SIQUEIRA,
2011).
2.2.1. Resposta Imune Inata
A imunidade inata é uma defesa inicial, ativada imediatamente após a
invasão de bactérias nos tecidos. Esta resposta pode ser dividida em fase préinflamatória
primariamente,
onde
macrófagos
6
residentes
e
sistema
complemento tentam eliminar bactérias, e resposta inflamatória aguda. Os
principais mecanismos da resposta inata contra bactérias são ativação do
sistema complemento, fagocitose e a resposta inflamatória (SIQUEIRA, 2011).
ITO et al. (2013) descrevem a resposta inata como uma rápida proteção
contra patógenos, a qual, com o tempo, pode ativar e iniciar a resposta imune
adaptativa através de receptores Toll-like receptors (Toll), que também
desempenham
papel
importante
no
reconhecimento
de
componentes
microbianos.
Quando da persistência da agressão bacteriana, não eliminada pela
defesa inata não induzida, um dano tecidual é gerado, o que induz o
desenvolvimento da resposta inflamatória aguda (SIQUEIRA & DANTAS,
2000).
A destruição tecidual e a inflamação observadas na lesão perirradicular
estão associadas ao tecido de granulação, que contém células inflamatórias
como
linfócitos
T
e
B,
plasmócitos
e
inúmeras
células
como
monócitos/macrófagos. Estas células produzem uma gama de mediadores
químicos envolvidos no processo inflamatório (ABBAS et al., 2007) .
Alterações vasculares são induzidas pela variedade de mediadores
químicos liberados em resposta ao reconhecimento de microrganismos e ao
dano tecidual. No local onde ocorreu a injúria, ocorrem alterações no calibre
vascular, com o consequente aumento do fluxo sanguíneo; alterações
estruturais nos componentes da microcirculação, acarretando em aumento da
permeabilidade vascular e na saída de células e moléculas dos vasos para os
7
tecidos; migração de células de defesa (leucócitos) e acúmulo no espaço
extravascular (SILVERTHORN, 2003).
2.2.2. Resposta Imune Adaptativa
A imunidade adaptativa é iniciada quando ocorre falha na eliminição da
infecção pela imunidade inata (SIQUEIRA, 2011). Trata-se de uma resposta
antígeno específica, e serve para aprimorar os mecanismos de proteção da
imunidade inata inespecífica (HAHN & LIEWEHR, 2007).
A resposta imunológica adaptativa é dividida em dois tipos básicos:
imunidade humoral, mediada por anticorpos, moléculas responsáveis pelo
reconhecimento específico de partículas estranhas, e imunidade celular,
mediada por linfócitos T. A imunidade adaptativa inclui receptores específicos
nos linfócitos T e B, além dos seus produtos os quais incluem as quimiocinas,
citocinas inflamatórias e anticorpos. Quimiocinas inflamatórias dirigem o tráfico
de células do sistema imunológico, e as citocinas induzidas durante a ativação
das células T promovem a regulação de respostas imunes e inflamatórias
(HAHN & LIEWEHR, 2007; LOPES & SIQUEIRA, 2010).
O maior componente de defesa envolvido na inflamação crônica,
portanto, é a resposta imune adaptativa, que pode ser dividida em três fases:
reconhecimento de antígenos, ativação de linfócitos e fase efetora (SIQUEIRA,
2011).
8
2.3.
Mediadores
Químicos
Envolvidos
na
Evolução
das
Lesões
Perirradiculares
Os mediadores químicos endógenos da inflamação são substâncias
responsáveis pela indução, controle e amplificação dos eventos vasculares e
celulares da inflamação. Podem ser vasoativos, causando vasodilatação e
aumento
da
permeabilidade
vascular,
e
quimiotáticos
para
células
inflamatórias, atraindo-as para o local da lesão tecidual. Estas substâncias
agem como opsoninas, destroem bactérias, causam dano tecidual e dor
(SILVERTHORN, 2003).
A origem dos mediadores químicos ocorre basicamente de duas formas:
através do plasma (intravascular) e de células. Mediadores derivados do
plasma estão presentes em suas formas precursoras, e podem ser ativados,
usualmente, por uma série de clivagens proteolíticas. A ativação normalmente
ocorre após danos aos vasos sanguíneos ou extravasamento do plasma aos
tecidos. Mediadores químicos derivados do plasma incluem bradicinina e os
sistemas complemento, fibrinolítico e o de coagulação. Mediadores derivados
de células podem ser encontrados em estágio de pré-formação intracelular ou
podem ser imediatamente produzidos por células de defesa em resposta a
estímulos. Exemplos destes mediadores incluem histamina, metabólitos do
ácido aracdônico (prostraglandinas e leucotrienos) enzimas lisossomais,
metaloproteinases de matriz, e citocinas dentre outros (Tabela 1) (SIQUEIRA,
2011).
9
Tabela 1: Mediadores Químicos da inflamação e seus efeitos
MEDIADOR
EFEITO
Prostaglandinas, Histamina, Óxido Nítrico
Vasodilatação
Neuropeptídeos
Histamina, C3a e C5a, Bradicinina,
Aumento da permeabilidade vascular
Leucotrienos C4, D4 e E4, Fator de
agregação plaquetária, Neuropeptídeos
Quimiocinas, C5a, Leucotrienos B4, Fator
Quimiotaxia
de agragação plaquetária, Fibrinopeptídeos
Enzimas lisossomais, Matriz
Dano Tecidual
metaloproteinases, Óxido Nítrico, Citocinas,
Prostaglandinas
IL-1 e TNF, Prostaglandinas
Febre
Bradicinina, Prostaglandinas
Dor
*Adaptada de: SIQUEIRA, 2011.
Citocinas pró-inflamatórias e pró-reabsortivas desempenham papel
fundamental na reabsorção óssea associada à lesão perirradicular (Figura 1).
Mecanismos pró-inflamatórios devem ser bem controlados de modo a prevenir
a destruição tecidual excessiva. O equilíbrio entre citocinas pró-inflamatórias e
anti-inflamatórias controla a extensão da resposta do hospedeiro e a
estimulação antigênica durante o processo inflamatório crônico (MORSANI et
al., 2011).
10
Figura 1: Dano tecidual direto e indireto causado por bactérias ao exercerem sua
patogenicidade (Adaptada de: SIQUEIRA, 2011).
É possível verificar que em resposta a infecção endodôntica, diversos
mediadores químicos, como as citocinas IL-1β, IL-6, IL-11, IL-17 e TNF-α são
liberados aos tecidos perirradiculares. Esses mediadores são essenciais
durante o processo de formação da lesão perirradicular. Ao atingirem níveis
críticos vão estimular células do estroma e osteoblastos a expressar RANKL, e
diminuir a produção de OPG, o que acaba estimulando a osteoclastogênese
(TAKAYANAGI, 2005a e 2005b).
A IL-1 é um regulador chave de defesa a infecções microbianas, e o
maior modulador de catabolismo de matriz extracelular e reabsorção óssea.
Existem basicamente duas formas de IL-1: α e β. IL 1-β é 15 vezes mais potente
que a IL-1α e mil vezes mais que TNF em induzir reabsorção (LOPES &
SIQUEIRA, 2010). Macrófagos são os principais produtores de IL -1. Células
11
endoteliais e algumas epiteliais também podem produzir essa citocina
(SIQUEIRA, 2011). A IL-1 pode induzir a expressão de TNF e IL-6, outras
citocinas envolvidas no processo inflamatório (COIL, 2004).
O TNF pode existir nas formas α e β. TNF-α é um polipeptídeo
sintetizado predominantemente por macrófagos e linfócitos T, estes últimos em
menor quantidade. TNF-β, também conhecido como linfotoxina, é uma
glicoproteína produzida exclusivamente por linfócitos T ativados. Ambas as
moléculas induzem a formação de osteoclastos a partir dos precursores e
estimulam a função de osteoclastos maduros. Seus efeitos sobre os
osteoclastos também são indiretos, sendo mediados por osteoblastos. Além
disso, TNF também inibe a neoformação óssea (LOPES & SIQUEIRA, 2010).
HENRIQUES et al. (2011) encontraram níveis significantes de TNF-α em
lesões perirradiculares refratárias em dentes com tratamento endodôntico,
quando comparadas a dentes saudáveis. Como é um potente mediador das
respostas imunológicas, aguda e crônica, o TNF-α tem a capacidade de
aumentar a reabsorção óssea.
A IL-6 é uma citocina sintetizada por macrófagos, células endoteliais,
fibroblastos e outras células. É sintetizada por osteoblastos em resposta a
outros agentes envolvidos na reabsorção como o paratormônio (PTH),
prostaglandina (PG) e IL-1. A IL-6 pode estimular a formação de osteoclastos a
partir de precursores hematopoiéticos (LOPES & SIQUEIRA, 2010).
As PGs são derivadas da metabolização do ácido aracdônico pela
enzima cicloxigenase, e induzem a síntese de colagenase por osteoblastos,
favorecendo o início da reabsorção. Tem sido demonstrado que PGs estimulam
12
a reabsorção de osso, fato este comprovado pela constatação de que
indometacina e flurbiprofeno, inibidores da síntese de PGs, inibiam a
reabsorção óssea. Contudo, é inteiramente possível que os efeitos mediados
por PGs sejam indiretos e estejam relacionados à sensibilização das células
ósseas à ação de outros mediadores químicos. As PGs têm sido envolvidas
nos processos de reabsorção associados às doenças inflamatórias, como
periodontites, artrite reumatóide e lesões perirradiculares (SIQUEIRA &
DANTAS, 2000).
A IL-11, produzida por células do estroma da medula óssea e por
osteoblastos, pode promover a proliferação e diferenciação dos precursores
hematopoiéticos dos osteoclastos. Evidências sugerem que a IL-11 seja um
fator essencial para o desenvolvimento de osteoclastos, o que depende da
adesão intercelular (contato célula-célula) entre os precursores do osteoclasto
e as células do estroma da medula ou dos osteoblastos (TAKAYANAGI, 2005a
e 2005b).
A IL-17 atua principalmente em células endoteliais estromais e epiteliais,
bem como
no subconjunto de monócitos para induzir a secreção de
mediadores pró-inflamatórios. Esta citocina está associada tanto na fase ativa
e reabsortiva, quanto na fase crônica da lesão periapical. A correlação positiva
entre Interferon gama (IFN-γ) e IL-17 foi demonstrada em culturas de lesões
periapicais, sugerindo que ambas as citocinas são importantes para a
exacerbação da inflamação (HENRIQUES, 2011).
O fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF) é um
polipeptídeo produzido por macrófagos, células endoteliais, osteoblastos e
13
fibroblastos. A sua produção por osteoblastos pode ser induzida por IL-1 e
TNF, sugerindo que M-CSF pode servir na comunicação do sinal reabsortivo do
osteoblasto para osteoclasto e estimula a proliferação dos precursores de
osteoclasto (SIQUEIRA & DANTAS, 2000).
2.3.1. Reabsorção Óssea
O processo de perda óssea é regulado por fatores físicos como
estímulos mecânicos, e por inúmeros polipeptídeos, como hormônios e
citocinas que atuam no aumento na ativação de substâncias que induzam o
aumento da atividade osteoclástica (GRIMAUDI et al., 2003).
Osteoclastos são células que possuem a função de degradação de
matriz óssea (YANG, 2007). Segundo LOPES & SIQUEIRA (2010), são tipos
celulares gigantes multinucleadas, oriundas da mesma linhagem de células
precursoras dos monócitos/macrófagos, cuja diferenciação é primariamente
regulada por M-CSF, ligante do receptor para ativação do RANKL e OPG. A
diferenciação do precursor em osteoclasto requer a presença de células do
estroma da medula óssea ou osteoblastos, as quais expressam as duas
moléculas essenciais para a promoção da osteoclastogênese – M-CSF e
RANKL (SIQUEIRA, 2011).
A diferenciação e ativação de osteoclastos são dirigidas pela interação
de Receptor Activator NF Kappa (RANK) com o ligante RANKL, e regulada pela
OPG.
ZHANG & PENG (2005) relataram a identificação de RANKL e seu
receptor RANK como uma proteína essencial na ativação de osteoclastos, cuja
diferenciação pode ser responsável pela reabsorção óssea periradicular.
14
RANKL é expressa principalmente na membrana de osteoblastos ou células do
estroma, e participa de cada fase da osteoclastogênese enquanto o RANK é o
receptor presente na superfície de pré- osteoclastos.
A OPG é uma proteína que regula a densidade óssea e que pode agir
localmente ou sistematicamente na inibição da maturação de osteoclastos.
OPG é um receptor que se liga e inibe a ligação de RANKL ao seu receptor
RANK e, por isso, protege o tecido dental mineralizado de reabsorção. A
detecção de OPG em macrófagos, linfócitos e células do plasma, sustenta a
afirmação da presença desta citocina na regulação das respostas imune e
inflamatórias (KUTZ, 2001).
Em condições homeostáticas, níveis de RANKL e OPG encontram-se
em equilíbrio, regulando a origem de osteoclastos responsáveis pela
reabsorção. Em contrapartida, uma super expressão de RANKL pode ser
observada em condições inflamatórias, principalmente como resultado da
presença
de
RANKL/OPG,
células
levando
inflamatórias,
a
uma
resultando
excessiva
em
desequilíbrio
atividade
entre
osteoclástica
e
consequentemente à reabsorção óssea patológica (Figura 2) (MENEZES et al.,
2008).
15
Figura 2: Funções de RANK, RANKL e OPG na osteoclastogênese em condições
homeostáticas e inflamatórias. (Adaptada de: MENEZES et al., 2008).
2.4. Modificadores da Doença
Embora existam protocolos altamente eficazes à erradicação da doença,
diferentes respostas à infecção podem ocorrer ao mesmo tipo de tratamento
endodôntico, quando estes apresentam fatores que, embora não sejam a
causa, possam influenciar na susceptibilidade, desenvolvimento ou severidade
da doença, principalmente por deficiências na resposta do sistema imunológico
(Figura 3). Tal fato pode esclarecer o surgimento de sintomatologia dolorosa
em casos assintomáticos, a cura tardia de algumas lesões, e explicam por que
canais bem tratados podem resultar em fracasso. Os modificadores da doença
16
com potencial de influenciar a lesão perirradicular incluem condições
sistêmicas (diabetes e infecções virais), genética (polimorfismo genético), e
hábitos adquiridos (fumo) (SIQUEIRA, 2011).
LESÃO PERIRRADICULAR
Bactéria
Composição e Virulência
Anticorpos
S. Complemento
Fagócitos
Componentes Estruturais
Bacterianos e seus Produtos
Resposta Inflamatória
& Imunológica
Citocinas
MMPs
Prostaglandinas
RANKL
Tecido Conjuntivo
e/ou
Destruição Óssea
Mudanças
no meio
Sinais Clínicos
& Sintomas da
Doença
Siqueira, 2011.
Figura 3: Modificadores da doença (Adaptada de: Siqueira, 2011).
O diabetes mellitus é uma desordem metabólica caracterizada por
concentrações anormalmente altas de glicose no sangue, causadas por
secreção de insulina inadequada e células-alvo com reações anormais ou
ambas as situações. Esta doença pode se apresentar de duas formas distintas:
Tipo 1, que é uma condição auto imune, causada pela deficiência de insulina
pela destruição das células beta de Langerhans, e Tipo 2, a mais comum,
caracterizada por um comprometimento metabólico e alteração nos níveis de
insulina no sangue, apresentando-se de forma mais elevada que o normal
(SILVERTHORN, 2003). A doença afeta muitas funções do sistema imune, e
17
está associada ao comprometimento da cicatrização. As complicações orais
mais frequentes de portadores de diabetes mellitus não controlada podem
incluir: xerostomia, infecções, dificuldade na cicatrização, aumento da
incidência e severidade de cáries, candidíase, gengivite e doença periodontal
(SEGURA-EGEA et al., 2005).
A influência do diabetes no desenvolvimento, curso e resposta ao
tratamento de lesões perirradiculares tem sido comprovada (SIQUEIRA, 2011).
Um estudo realizado por ARMADA–DIAS et al., (2006), revelou que ratos
diabéticos Tipo 1 apresentaram lesões perirradiculares significativamente
maiores e com exsudato inflamatório
quando comparados com os ratos
normais, e que ratos diabéticos podem ser mais propensos a desenvolver
lesões perirradiculares extensas, possivelmente devido à diminuição da
capacidade de defesa contra patógenos microbianos. SEGURA-EGEA et al.
(2005) e MAROTTA et al. (2012) verificaram que lesões perirradiculares foram
significantemente maiores em dentes de indivíduos portadores de diabetes
Tipo 2, sugerindo que
o diabetes mellitus pode se manifestar como um
modificador da doença perirradicular.
Outra condição reconhecida como modificador da doença perirradicular
é o polimorfismo genético. Trata-se de uma variação genética na sequência de
bases nucleotídicas, ou na estrutura cromossômica que ocorre com uma
frequência maior que 1% na população. O tipo mais comum de polimorfismo é
o que envolve um único nucleotídeo, chamado de polimorfismo de nucleotídeo
único ou polimorfismo de transição, onde, durante a replicação, ocorre a
substituição de um nucleotídeo por outro, ocorrendo a troca de um único par de
18
base, podendo ainda assim afetar a estrutura e a função de um gene,
consequentemente afetando a expressão de proteína (KINANE & HART, 2003).
Polimorfismos em genes relacionados com a inflamação, como por
exemplo, nos genes receptor celular de superfície gama (FcyR), podem levar
ao aumento ou a inibição de eventos mediados por FcyR e consequentemente,
podem influenciar a susceptibilidade e/ou gravidade das doenças inflamatórias.
Os receptores Fcy presentes na superfície expressa nos leucócitos para a
região constante de imunoglobulina G (IgG), se ligam a bactérias ou produtos
bacterianos solúveis e funcionam como uma opsonina, favorecendo a
fagocitose
pelos
neutrófilos
via
Fcy
ou
internalização
pelas
células
apresentadoras de antígeno, incluindo macrófagos e células B (SIQUEIRA,
2011).
Um estudo realizado por SÁ et al. (2007) relacionou polimorfismo com
sintomatologia, sugerindo que fatores genéticos podem influenciar no
desenvolvimento de abscessos perirradiculares agudos. SIQUEIRA (2011)
investigou a associação do polimorfismo genético do receptor FcyRIIIa com
periodontite apical pós-tratamento e concluíram que o polimorfismo no receptor
FcyRIIIa não influencia a resposta do tratamento endodôntico em dentes com
periodontite apical.
Supostamente, a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana
adquirida (HIV) também pode ser considerada como um fator modificador da
lesão perirradicular. Considera-se que as células T, que exercem importante
papel no desenvolvimento, progressão e cura da lesão perirradicular pela
ativação de macrófagos, células B e outros tipos celulares, sejam a célula –
19
alvo do HIV, é razoável afirmar que pacientes portadores do HIV possam
apresentar dificuldade em elaborar uma resposta imune contra bactérias
invasoras do tecido perirradicular (SIQUEIRA, 2011). Porém, ainda não existem
estudos que comprovem esta suposição.
Embora ainda existam controvérsias a respeito da relação entre o fumo
e a lesão perirradicular, alguns autores consideram este hábito um potencial
fator de risco à doença, além de considerarem que esta associação pode
exercer papel relevante no curso da doença (KIRKEVANG & WENZEL, 2003;
SIQUEIRA, 2011).
LÓPEZ et al. (2012) concluíram em estudo que, após analisar sexo,
idade, número de dentes, estado endodôntico, qualidade da obturação e
estado diabético como co-variáveis, a presença de lesões perirradiculares está
fortemente associada ao tabagismo.
Outras condições como stress, infecção por herpes-vírus e osteoporose
tem sido sugeridas como possíveis modificadores da lesão perirradicular,
porém estudos ainda precisam ser realizados (SIQUEIRA, 2011).
2.5. Osteoporose
O osso é um tecido que desempenha papel importante na homeostasia
mineral, na reserva de elementos hematopoiéticos e no suporte para
movimentos (SIQUEIRA & DANTAS, 2009). É uma estrutura dinâmica,
continuamente
renovada
e
reconstruída
através
da
remodelação.
A
remodelação óssea é definida como um processo de aposição fisiológico e
contínuo no qual há reabsorção do osso antigo e substituição por osso
20
recentemente formado. Esse evento continua por toda a vida adulta, sendo
responsável pela renovação do esqueleto e manutenção da integridade
anatômica e estrutural. É influenciada por diversos fatores, como mecanismos
regulatórios intracelulares, hormonais, além de fatores locais e externos.
Alterações na remodelação óssea podem resultar em diferentes distúrbios,
entre eles a osteoporose (AMADEI et al., 2006).
A osteoporose é uma doença do metabolismo ósseo, caracterizada por
redução da massa e deterioração na arquitetura do esqueleto (BRAUNWALD
et.al., 2005; LANE, 2005). É considerada uma “doença silenciosa” até o
momento em que ocorre a fratura (GASS & DAWSON-HUGHES, 2006).
Quando o metabolismo ósseo está em condições normais, existe um
equilíbrio entre a formação e a reabsorção. Porém, tanto no hipogonadismo
como na senescência ocorre um desequilíbrio na remodelação óssea que
resulta em redução de massa óssea, caracterizando assim um quadro de
osteoporose (JHONSON et al., 2002).
Esta doença pode ser primária (tipos: I – pós-menopausa e II – senil) ou
secundária. A osteoporose tipo I, pós-menopausa, é o tipo mais comum desta
condição e está associada à deficiência de estrógeno. A perda da função do
ovário altera significativamente a homeostase óssea e aumenta a perda de
tecido ósseo. Este tipo de osteoporose afeta o osso trabecular, promovendo o
imenso risco às mulheres pós-menopausa (HORAN &TIMMINS, 2009).
Os esteroides sexuais possuem efeitos no desenvolvimento e maturação
do esqueleto, como crescimento da placa de maturação e fechamento durante
o crescimento longitudinal, regulação diferencial do metabolismo de ossos
21
cortical e trabecular, estimulam o pico de massa óssea e inibem a perda óssea
(LIBOUBAN et al., 2002). A ação estrogênica anti-reabsortiva está relacionada
à sua capacidade de regular fatores modeladores da osteoclastogênese e não
de uma ação direta no osteoclasto (MANOLAGAS, 2000; VANDERSCHUEREN
et al., 2004).
O aumento da liberação das citocinas no estado de hipoestrogenismo
acelera a reabsorção óssea. Alguns estudos sugerem a participação de IL-1,
IL-6 e TNF na perda óssea, já que seus níveis se encontraram aumentados em
camundongos ovariectomizados e mulheres pós-menopausa; acreditando
haver um aumento da secreção, pelos osteoblastos ou pelas células do
estroma da medula óssea, capazes de estimular a osteoclastogênese e o
consequente aumento da reabsorção óssea. Inversamente, a terapia de
reposição hormonal suprime as citocinas, prevenindo a perda óssea
(GRIZ, 2000; RAMALHO et al., 2000).
Um estudo realizado por KRIBBS et al. (1983), analisou a relação entre
osteopenia esquelética e alterações dentárias em 30 mulheres pósmenopáusicas com diagnóstico confirmado da osteoporose. Os resultados
demonstraram que a osteopenia esquelética exerce influência sobre condições
orais. Os autores afirmam que a massa óssea do rebordo alveolar e sua
densidade mostram uma relação significativa com o cálcio total do corpo, e que
quaisquer medidas terapêuticas que controlam ou têm efeito sobre a
osteoporose, podem, por conseguinte, exercer influência sobre a densidade do
rebordo residual.
22
A osteoporose tipo II ocorre após 65 anos de idade, afetando a
população idosa de homens e mulheres na proporção de 1:3, e se traduz por
uma perda mais lenta de osso trabecular e cortical e por fraturas de fêmur
proximal, úmero e vértebras. As fraturas de fêmur proximal são as que trazem
maior morbidade e mortalidade, e em 95% dos casos sofrem correções
cirúrgicas (KRAHE, 2003; WIREN, 2005).
A osteoporose secundária ocorre como consequência de processos
patológicos
(artrite
reumatóide,
hipertireoidismo,
hiperparatireoidismo
e
mieloma múltiplo) e outras condições, tais como alcoolismo, imobilização,
terapia crônica com heparina, uso de anticonvulsivantes e hipervitaminose A
(MANOLAGAS, 2000).
2.6. Modelo experimental da perda óssea por hipogonadismo
A castração em ratos é o modelo utilizado com maior frequência para o
estudo de eventos associados à osteopenia, pois mimetiza perda óssea por
hipogonadismo (LIBOUBAN et al., 2002; IWAMOTO et al., 2004; BORST &
CONOVER, 2006).
Os principais mecanismos biológicos responsáveis pelo ganho e perda
óssea durante o crescimento normal e a vida adulta são os mesmos em seres
humanos e ratos. Sabe-se também que ratos e humanos respondem
similarmente à terapia hormonal. Por isso, murinos são ideais para a avaliação
do agente terapêutico para a prevenção da osteoporose (OLIVERA et al., 2003;
FITTS et al., 2004)
23
Antes de realizar a castração em fêmeas, é importante acompanhar as
modificações na citologia vaginal para verificar se as ratas estão apresentando
funcionamento normal ovariano. Roedores de laboratório, como camundongos,
ratos e hamsters, são espécies poliestrais, em que o estro ocorre regularmente
a cada 4-5 dias (MARCONDES et al., 2002).
A concentração sérica dos hormônios sexuais apresenta variações ao
longo do ciclo estral, decorrentes de modificações morfo-funcionais dos
ovários, induzidas pelas gonadotrofinas hipofisárias, hormônio luteinizante (LH)
e hormônio folículo estimulante (FSH). As variações hormonais cíclicas
repercutem na morfologia e funcionalidade dos órgãos do aparelho reprodutor.
No epitélio vaginal ocorrem alterações decorrentes da ação de estrogênio e de
progesterona, que podem ser avaliadas à microscopia de luz (TEBAR et al.,
1995).
Em ratas, podem-se evidenciar quatro etapas que, normalmente, se
sucedem a cada quatro ou cinco dias e que possuem relações com a
concentração de hormônio gonadal presente. Estas fases são denominadas:
proestro; estro; metaestro e diestro (MARCONDES et al., 2002).
O proestro (Figura 4A) tem duração aproximada de doze horas. É o
período pré-ovulatório, no qual ocorre aumento exponencial do folículo
ovariano. Na manhã de proestro, a concentração sérica de estradiol é máxima
promovendo na tarde do proestro o pico de LH, que é responsável pela
ovulação e que é sucedido por um pico de secreção de progesterona (KALRA
& KALRA, 1974). Caracteriza esta fase, ao esfregaço vaginal, por células
redondas de tamanho pequeno e nucleadas.
24
A fase seguinte, denominada de estro (Figura 4B), tem duração
aproximada de vinte quatro horas, quando ocorre a maturação final do folículo
de Graaf e ovulação. Os níveis séricos de estradiol, progesterona e LH são
baixos (KALRA & KALRA, 1974). Ao esfregaço vaginal, foram observadas
células queratinizadas anucleadas e ausência de leucócitos. Este é o período
de receptibilidade sexual (BERALDO, 1972; FEDER, 1981; RODRIGUES,
1992).
O período consecutivo, metaestro (Figura 4C), dura de vinte quatro a
trinta e seis horas. Ocorre, aí, o crescimento do corpo lúteo que passa a
secretar níveis séricos crescentes de estradiol e progesterona, com queda
brusca do estradiol sérico, ao final da fase (KALRA & KALRA, 1974). A análise
microscópica do epitélio vaginal revela três tipos celulares: células nucleadas,
células queratinizadas e leucócitos (BERALDO, 1972; FEDER, 1981;
RODRIGUES, 1992).
O diestro (Figura 4D), que dura em torno de vinte e quatro horas, pode
se estender a quarenta e oito horas em algumas ratas. Caracteriza-se pela
involução do corpo lúteo e nova fase de proliferação folicular, que ocorre caso
o óvulo não seja fecundado. O estradiol sérico está baixo, porém ascendente;
progesterona e LH apresentam concentração sérica baixa (KALRA & KALRA,
1974). A citologia vaginal mostra células nucleadas, mas a característica desta
fase é a predominância de leucócitos (BERALDO, 1972; FEDER, 1981;
RODRIGUES, 1992).
25
4A
4B
4D
4C
Figura 4: Fotomicrografia de lâminas de esfregaço vaginal de ratas controle, nas diferentes
fases do Ciclo Estral, coradas pelo método tricômico de Shoor (40x). Fases do Ciclo Estral: 4A:
Proestro, 4B: Estro, 4C: Metaestro, 4D: Diestro.
26
3. JUSTIFICATIVA
A redução na capacidade de remodelação e de reparação do tecido em
pacientes com osteoporose tem sido comprovada ao longo dos anos. Porém,
não existem estudos que investiguem a provável influência da osteoporose na
evolução da lesão perirradicular.
27
4. HIPÓTESE
A lesão perirradicular é um processo inflamatório que resulta em
destruição do osso alveolar ao redor do ápice dentário. Alterações no
metabolismo ósseo, características da osteoporose, levam a um aumento da
reabsorção óssea e a uma diminuição na possibilidade de reparo. Espera-se
através deste estudo, verificar a influência da osteoporose na evolução de
lesões perirradiculares.
28
5. PROPOSIÇÃO
5.1. Objetivo Geral

Avaliar os efeitos da osteoporose na evolução da lesão perirradicular.
5.2. Objetivos Específicos

Determinar o tamanho de lesões perirradiculares através de análise
radiográfica.

Comparar as imagens radiográficas de animais controles e castrados
com lesões perirradiculares de 21 e 40 dias.
29
6. MATERIAIS E MÉTODOS
6.1. Parecer Ético
O projeto de pesquisa está de acordo com Princípios Éticos da
Experimentação Animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
(COBEA) e obteve aprovação do Comitê de Ética e Pesquisa Animal (CEPA),
sob o número de protocolo 00134/09.
6.2. Seleção da Amostra
Para realização deste estudo foram utilizadas ratas adultas (n= 24), da
linhagem Wistar, isogênicas e virgens, com 3 meses de idade, mantidas em
gaiolas, com temperatura ambiente controlada (25 a 27C), umidade constante
e ciclo claro/escuro de 12 horas (6:00h às 18:00h), sendo a água e ração
(Nuvilab, Sogorb Indústria e Comércio LTDA, SP, Brasil) fornecidas ad libitum.
Os animais foram mantidos no biotério do departamento de Fisiofarmacologia
do Instituto Biomédico da Universidade Federal Fluminense (UFF).
Antes de dar início a cada experimento, as fêmeas foram avaliadas,
diariamente, por duas semanas consecutivas através de citologia vaginal e
somente as ratas com ciclos regulares foram incluídas no estudo.
6.2.1. Determinação das Fases do Ciclo Estral
Coletas diárias de esfregaço vaginal (Figura 5) foram realizadas entre
9:00 e 10:00 horas, com a finalidade de selecionar os animais que
30
apresentassem ciclo estral regular. A coleta do fluido vaginal foi realizada com
auxílio de ponteira plástica contendo solução de cloreto de sódio a 0.9%, que
foi depositado em lâminas de vidro e analisado à fresco em microscópio óptico
(Leica DM500, Heerbrugg, Suécia) com objetiva 10x, sendo classificadas de
acordo com as proporções dos tipos celulares encontrados em cada fase do
ciclo estral (MARCONDES, 2002).
5B
5A
Figura 5: Citologia vaginal. A: coleta de esfregaço vaginal. B: Análise a fresco de fluido
coletado.
6.3. Castração
Após esta etapa de avaliação, metade das ratas foram submetidas à
remoção bilateral dos ovários (ovariectomia), sob anestesia com Tiopental,
(Thiopentax, Cristália, São Paulo, Brasil) (0,1ml /100 g peso corporal), enquanto
as ratas restantes, grupo controle, sofreram apenas estresse cirúrgico (pseudooperadas).
31
6.4. Desenvolvimento de Lesão Perirradicular
Noventa dias após a cirurgia, todos os animais foram anestesiados com
Tiopental (0,1ml /100g peso corporal), e o esmalte e a dentina dos primeiros
molares inferiores esquerdos foram desgastados com broca carbide esférica de
½ (KG Sorensen, São Paulo, Brasil) com motor de baixa rotação (Dentec, CS
421, Brasil). A abertura foi realizada na fóssula mesial da superfície oclusal até
a exposição pulpar (Figura 6).
6A
6B
Figura 6: Desenvolvimento de lesão perirradicular. A: Determinação da área de trabalho. B:
Exposição pulpar.
Desta forma, 4 grupos experimentais foram formados:

Grupo Controle com lesão de 21 dias (C 21 dias): n=6

Grupo Ovariectomizado com lesão de 21 dias (OVX 21 dias): n=6

Grupo Controle com lesão de 40 dias (C 40 dias): n=6

Grupo Ovariectomizado com lesão de 40 dias (OVX 40 dias): n=6
32
Ao final de cada período experimental (21 e 40 dias após
desenvolvimento da lesão), os animais foram sacrificados por exsanguinação,
sob anestesia com Tiopental (0,2 ml/100 g peso corporal), e removidos sangue
e mandíbula.
6.5. Avaliação Biométrica
A massa corporal dos animais foi verificada desde o inicio do
experimento ate o dia do sacrifício. A pesagem foi realizada semanalmente
com auxílio de uma balança digital (Mettler Toledo, Marte As 1000, SP, Brasil).
6.6. Avaliação Bioquímica
O sangue dos animais foi coletado por punção cardíaca e centrifugado
em centrífuga (RDE, MC 28, RJ, Brasil). Após a obtenção do soro, foram
analisadas as concentrações de cálcio (calcio arsenazo III, K051), fósforo
(phosphorus, K020) e fosfatase alcalina (phosphatase alkaline 019) através de
testes colorimétricos da marca Bioclin (Quibasa, Belo Horizonte, Brasil) em
espectofotômetro (Bioespectro, SP-22, PR, Brasil).
6.7. Avaliação Radiográfica
As hemi-mandíbulas esquerdas foram lavadas e imersas em solução
salina. Após este processo, as tomadas radiográficas foram realizadas em
Aparelho Radiográfico Digital (Modelo Radioesfera – Siemens – SP, Brasil).
As áreas das lesões perirradiculares presentes nos ápices das raízes
mesiais dos primeiros molares da mandíbula esquerda foram mensuradas nas
33
radiografias através do software Image J (National Institute of Mental Health,
Bethesda, USA).
6.8. Análise Estatística
A análise comparativa dos dados obtidos foi realizada através de testes
não paramétricos Kruskal-Wallis e Dunn´s Multiple Comparison utilizando o
programa GraphPad Prism 4 (GraphPad Software, Inc, California, USA). A
significância estatística considerada foi p<0.05.
34
7. RESULTADOS
7.1. Avaliação Biométrica
Os valores numéricos das médias de massa corporal inicial e final, assim
como os valores das médias das diferenças entre massa corporal final e inicial
(∆) nos grupos C e OVX são apresentados na Tabela 2. Não houve diferença
significativa entre a massa inicial dos animais do estudo (Figura 7). Foi possível
observar que os grupos OVX apresentaram a massa corporal final e o ∆
superiores em todos os períodos experimentais (C 21 dias: ganho 13.5%, OVX
21 dias: ganho 23.4%, C 40 dias: ganho 4.3%, OVX 40 dias: ganho 31.4%)
quando comparados com os grupos C. Porém, esses dados apenas foram
estatisticamente significativos quando comparados OVX e C 40 dias, ou seja,
com 191 dias de castração (Figuras 8 e 9).
Tabela 2: Valores de massa corporal inicial (g).
Grupo
Massa corporal
inicial (g)
Massa corporal
final (g)
∆ (g)
C 21 dias
269.2  21.18
289.2  32.05
31.8  28.51
OVX 21 dias
260.2  18.40
321.0  21.87
60.8  12.24
C 40 dias
261.6  29.29
275.2  25.58
13.6  30.67
OVX 40 dias
263.3  27.07
344.7  25.01
81.4  28.59
* Os resultados são expressos por média  DPM. ∆= massa corporal final- massa corporal
inicial.
35
Massa corporal (g)
300
200
100
0
C 21
OVX 21
C 40
OVX 40
Figura 7: Valores de massa corporal inicial em todos os grupos experimentais expressos em
(g).
*#
Massa corporal (g)
400
300
200
100
0
C 21
OVX 21
C 40
OVX 40
Figura 8: Valores de massa corporal final de todos os grupos experimentais expressos em (g).
* OVX 40 vs C 21 p < 0.05, # OVX 40 vs C 40 p< 0.01.
36
*#
100
 (g)
75
50
25
0
C 21
OVX 21
C 40
OVX 40
Figura 9: Valores de Δ (Massa corporal final-Massa corporal inicial) de todos os grupos
experimentais expressos em (g). * OVX 40 vs C 21 p < 0.05, # OVX 40 vs C 40 p< 0.01.
7.2. Avaliação Bioquímica
7.2.1. Concentrações Séricas de Cálcio
Os valores numéricos das médias das concentrações séricas de cálcio
nos grupos C e OVX podem ser observados na Tabela 3. Os níveis séricos de
cálcio foram semelhantes nos grupos C e OVX de 21 dias. Em 40 dias os
níveis do grupo C foram maiores quando comparados ao OVX, mas esta
diferença não foi estatisticamente significativa (Figura 10).
37
Tabela 3: Médias das concentrações séricas de cálcio (mg/dl) por grupo.
Grupo
Cálcio (mg/dl)
Desvio padrão
C 21 dias
2.063
 0.5630
OVX 21 dias
1.960
 0.7301
C 40 dias
2.725
 1.740
OVX 40 dias
2.560
 0.3209
3.5
Cálcio mg/dl
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
C 21
OVX 21
C 40
Figura 10: Análise comparativa dos níveis séricos de cálcio (mg/dl).
38
OVX 40
7.2.2. Concentrações Séricas de Fósforo
Os valores numéricos das médias das concentrações séricas de fósforo
nos grupos C e OVX podem ser observados na Tabela 4. Os níveis séricos de
fósforo foram menores nos grupos OVX de todos os períodos experimentais
quando comparados aos grupos C. Porém,
esta diferença
não foi
estatisticamente significativa (Figura 11).
Tabela 4: Médias das concentrações séricas de fósforo (mg/dl) por grupo.
Grupo
Fósforo (mg/dl)
Desvio padrão
C 21 dias
4.823
 1.680
OVX 21 dias
3.939
 0.5008
C 40 dias
4.450
 1.566
OVX 40 dias
3.193
 0.5617
6
Fósforo mg/dl
5
4
3
2
1
0
C 21
OVX 21
C 40
Figura 11: Análise comparativa dos níveis de fósforo (mg/dl).
39
OVX 40
7.2.3. Concentrações Séricas de Fosfatase Alcalina
Os valores numéricos das médias das concentrações séricas de
fosfatase alcalina nos grupos C e OVX podem ser observados na Tabela 5. Os
níveis séricos de fosfatase alcalina foram maiores nos grupos OVX de todos os
períodos experimentais quando comparados aos grupos C. Porém, esta
diferença não foi estatisticamente significativa (Figura 12).
Tabela 5: Médias das concentrações séricas de fosfatase alcalina (U/L) por grupo.
Grupo
Fosfatase alcalina
(U/L)
Desvio padrão
C 21 dias
21.87
 6.654
OVX 21 dias
25.60
 4.011
C 40 dias
21.23
 5.900
OVX 40 dias
23.60
 7.184
Fosfatase alcalina U/L
30
20
10
0
C 21
OVX 21
C 40
OVX 40
Figura 12: Análise comparativa dos níveis de fosfatase alcalina (U/L).
40
7.3. Avaliação Radiográfica
Os
valores numéricos
das
médias
dos
tamanhos das lesões
perirradiculares nos grupos C e OVX podem ser observados na Tabela 6. As
lesões perirradiculares foram maiores nos grupos OVX de todos os períodos
experimentais quando comparados aos grupos C. Porém, esta diferença foi
estatisticamente significativa nas comparações OVX 40 dias x C 21 dias e OVX
40 dias x C 40 dias (Figura 13). Algumas das imagens obtidas através de
radiografia podem ser observadas na Figura 14.
Tabela 6: Tamanho das lesões perirradiculares (pixel).
Grupo
Tamanho da lesão
(pixel)
Desvio padrão
C 21 dias
268.5
 40.98
OVX 21 dias
353.7
 49.31
C 40 dias
304.8
 36.98
OVX 40 dias
548.4
 141.7
41
Tamanho da lesão (pixel)
600
300
0
C21
OVX21
C40
OVX40
*#
Figura 13: Análise comparativa do tamanho de lesões perirradiculares entre os grupos
experimentais. ). * OVX 40 vs C 21 p < 0.05, # OVX 40 vs C 40 p< 0.01.
A
B
C
D
Figura 14: Radiografias de mandíbulas. A: C 21 dias, B: C 21 dias, C: C 40 dias, D: OVX 40
dias. As setas indicam as lesões perirradiculares nas raízes mesiais dos primeiros molares
esquerdos.
42
8. DISCUSSÃO
A osteoporose é uma condição sistêmica que gera alterações no
metabolismo ósseo, o que sugere possíveis influências sobre as lesões
perirradiculares, que também são caracterizadas por perda óssea patológica.
SIQUEIRA & RÔÇAS (2008) e GARNER et al. (2009) comprovam que as
condições sistêmicas podem exercer papel relevante na cura, tratamento e
prognóstico das lesões perirradiculares.
Alterações no metabolismo ósseo, provenientes da deficiência de
esteróides sexuais em mulheres no período pós-menopausa, constituem a
principal causa da osteoporose (HORAN & TIMMINS, 2009). KALU (1991)
definiu o modelo animal de perda óssea pós-menopausa como um animal vivo,
o qual a perda óssea espontânea ou induzida devido à deficiência hormonal
ovariana pode ser estudada, e em que as características da perda de massa
óssea e suas sequelas se assemelham aos encontrados em mulheres na pósmenopausa em um ou mais aspectos. Portanto, para a realização do presente
trabalho foi adotado o modelo de ovariectomia para o desenvolvimento da
osteoporose em ratas adultas.
Antes do procedimento cirúrgico, foi realizada uma avaliação prévia do
ciclo estral que, de acordo com MARTINS et al. (2005), é considerada
importante para verificar variações que ocorrem durante o ciclo reprodutivo dos
animais. De acordo com GOLDMAN et al. (2007), a avaliação do ciclo estral em
roedores de laboratório pode ser uma medida útil da integridade reprodutiva do
eixo hipotalâmico - pituitário - ovariano, e pode ser considerado uma forma de
43
assegurar que os animais exibem padrões anormais de ciclagem. Neste
estudo, a análise microscópica diária do material coletado, em concordância
com os estudos prévios (GOLDMAN et al., 2007; WESTWOOD, 2008), revelou
alterações na padronização do fluido vaginal por diferentes tipos celulares
observados durante o ciclo reprodutivo. Cinco animais que apresentavam ciclos
irregulares foram descartados e somente aqueles com ciclos regulares foram
incluídos no estudo.
Após a seleção da amostra, a ovariectomia foi realizada em metade dos
animais. JEFFCOAT et al. (2000) afirmaram que a castração pode influenciar a
densidade óssea alveolar, da mesma maneira que pode influenciar na massa
óssea observada em outras estruturas ósseas corporais. Em ratas, os efeitos
sistêmicos da deficiência estrogênica surgem após aproximadamente 30 dias
(KALU,1991; ARMADA et al., 2006). Realizamos a indução da lesão
perirradicular em animais com 150 dias de castração, que de acordo com
ARMADA (2009), possuem alterações ósseas características da osteoporose
mais significativas. A metodologia utilizada para a indução da lesão
perirradicular seguiu os mesmos parâmetros de estudos anteriores (ARMADA–
DIAS et al., 2006; YANG et al., 2009; LIU et al., 2012). A reabsorção óssea
perirradicular, induzida pela exposição pulpar, foi observada em todos os
grupos experimentais através da análise radiográfica.
Além da avaliação do tecido ósseo através de radiografia, também
realizamos as avaliações biométrica e bioquímica para acompanhar os efeitos
sistêmicos da deficiência estrogênica.
44
De acordo com a literatura, a deficiência hormonal característica do
período pós-menopausa está relacionada às mudanças adversas no peso, na
composição corpórea e na distribuição de gordura no corpo feminino. Esse
aumento de peso se faz com o aumento de tecido adiposo e diminuição da
massa magra (KIRCHENGAST et al., 1999). No presente estudo foi observado
ganho de massa corporal significativamente maior em OVX em relação a C em
ratas de 40 dias (190 dias de castração). Porém, não foi verificada diferença
estatisticamente significativa na massa corporal entre os grupos OVX e C de 21
dias (171 dias de castração) corroborando com o estudo de ARMADA (2009),
em ratas aos 150 dias de castração. Para VASCONCELLOS et al. (2004) o
aumento na massa corporal em deficiência estrogênica pode não ocorrer
devido ao ganho ponderal, ou seja, animais ovariectomizados apresentam
aumento de tecido adiposo mas sofrem perda óssea.
A osteoporose se caracteriza por alterações do metabolismo ósseo e,
por esta razão, neste estudo foram avaliadas as dosagens séricas de cálcio e
fósforo (componentes do tecido ósseo) e da fosfatase alcalina (marcador da
atividade osteoblástica). As concentrações séricas de cálcio e fósforo se
mantiveram constantes entre os grupos, confirmando dados encontrados na
literatura (NETTO et al., 2006; ARMADA, 2009). Segundo TAKADA et al.
(1997),
somente
em
circunstâncias
extremas,
como
desnutrição
ou
hiperparatireoidismo, estes íons sofrem alterações. Os níveis séricos de
fosfatase alcalina também não apresentaram diferença estatisticamente
significativa apesar de apresentarem valores esperados aos grupos de estudo,
ou seja, maiores em OVX e menores em C. Esses resultados diferem de
45
NETTO et al. (2006) que ao avaliarem o metabolismo ósseo em ratas Wistar
castradas encontraram médias estatisticamente maiores para atividade sérica
da fosfatase alcalina quando comparadas às controles. Porém, os autores
realizaram esta avaliação apenas com 60 dias de castração. YOSHIKUBO et
al. (2005) também descrevem um aumento da atividade da fosfatase alcalina
na osteomalácia ou outras condições onde o metabolismo ósseo está
aumentado.
No presente estudo, não houve diferença estatisticamente significativa
entre o tamanho das lesões de animais OVX e C com 21 dias. São poucos os
estudos (GUILLES, et al., 1997; XIONG et al., 2007; LIU et al., 2010) de
avaliação da influencia da osteoporose na evolução de lesões perirradiculares
em 21 dias e a comparação entre os resultados é dificultada pela diferença
existente entre as metodologias.
GUILLES et al. (1997) realizaram castração de ratas Sprague-Dawley
com 3 meses. Após 3 semanas da cirurgia foi realizada a indução de lesões
perirradiculares nos canais distais dos primeiros molares mandibulares
esquerdos através de instrumentação com limas endodônticas, seguida da
inserção de fatores de reabsorção óssea (IL-1 ou lipopolissacarídeo do
Campylobacter Rectus 314) e selamento dentário. Esse procedimento foi
repetido por 3 dias. Foram realizadas radiografias e foi verificado aumento
significativo de lesões perirradiculares em OVX quando comparado com os
controles.
XIONG et al. (2007) realizaram experimento com ratas Sprague-Dawley
(n=40) com 3 meses. Metade dos animais foi castrada e 3 semanas após a
46
cirurgia foi realizada a indução de lesões perirradiculares com exposição
pulpar. Foram formados 4 grupos experimentais: normais, controles com lesão,
OVX com lesão, OVX com lesão recebendo terapia com alendronato. O
período experimental foi de 21 dias de lesão. Foram realizadas radiografias e
foi verificado aumento significativo de lesões perirradiculares em OVX quando
comparado com os grupos OVX com alendronato e controle.
LIU et al. (2010) realizaram castração de ratas Sprague-Dawley (n=24)
com 3 meses. Após 1 semana da cirurgia foi realizada a indução de lesões
perirradiculares com a exposição pulpar. O período experimental foi de 21 dias
de lesão. Os resultados demonstraram perda óssea significativa no grupo OVX
quando comparado ao Controle.
Em nosso estudo também foi realizado um periodo experimental crônico
de lesão. Através da análise radiográfica, foi possível verificar que essas lesões
perirradiculares em períodos mais crônicos (40 dias) em animais do grupo OVX
foram significativamente maiores em relação ao grupo C 21 dias e C 40 dias.
Esse resultado demonstra que a presença de osteoporose modificou a
evolução da doença perirradicular. Não existem na literatura estudos com
tempo de lesão semelhante.
47
9. CONCLUSÕES
Através deste estudo foi possível verificar que a osteoporose atuou
como modificador da doença, pois influenciou na evolução da lesão
perirradicular, principalmente em períodos crônicos. Estes achados sugerem a
importância da utilização de protocolos antimicrobianos mais eficazes para
portadores desta doença, embora estudos em humanos ainda precisem ser
realizados.
48
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11. ANEXO
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