Rayane Nogueira dos Santos
Propaganda
Pró-Reitoria de Graduação Pró-Reitoria de Graduação Curso de Biomedicina Curso de Biomedicina Trabalho de Conclusão de Curso II Trabalho de Conclusão de Curso EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA NS3 DO VÍRUS DENGUE TIPO 3 Autor: Rayane Nogueira dos Santos Orientador: PhD.Tatsuya Nagata Co-Orientador: PhD. Paula Autor: Rayane LuziaAndreia Viegas Silva da Silva Orientadora: Dra. PhD.Paula Andreia Silva Co-Orientador: Dr. PhD.TatsuyaNagata Brasília - DF 2012 - DF Brasília 2012 RAYANE NOGUEIRA DOS SANTOS TÍTULO: EXPRESSÃO E PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA NS3 DO VÍRUS DENGUE TIPO 3 Monografia apresentada ao curso de graduação em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília como requisito parcial para obtenção do título de Bacharel em Biomedicina Orientador: PhD. Tatsuya Nagata Co-Orientador: PhD. Paula Andréia Silva Brasília 2012 Monografia de autoria de Rayane Nogueira dos Santos, intitulado “Expressão e Purificação da Proteína NS3 do Vírus Dengue Tipo 3”, apresentado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina da Universidade Católica de Brasília, em 12 de Novembro de 2012, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada: __________________________________________________________ Prof. PhD.Tatsuya Nagata Orientador Curso de Patologia Molecular – UnB ____________________________________________________ Prof. PhD. Paula Andreia Silva Co - Orientador Curso de Biomedicina – UCB ____________________________________________________ Prof. MSc. Lidia Maria Pinto de Lima Curso de Biomedicina - UCB ____________________________________________________ Prof. PhD. João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa Programa de Pós Graduação em Ciências Genômicas e Biotecnologia- UCB Brasília 2012 Resumo Santos, R.N. Expressão e Purificação da Proteína NS3 do Vírus Dengue Tipo 3. 2012. 46. Monografia. Curso de Biomedicina, UCB, Brasília/DF. A dengue é a doença transmitida aos seres humanos por mosquitos Aedes aegypti infectados pelo vírus Dengue (DENV), que é responsável pela grande epidemia de dengue. Estes vírus pertencem à família Flaviviridae, gênero Flavivirus. Seu genoma consiste de uma fita positiva de RNA com aproximadamente 11kb e possuem quatro sorotipos distintos (DENV-1, 2, 3 e 4). O genoma viral codifica 3 proteínas estruturais (C, prM e E) e 7 proteínas não-estruturais (NS1, NS2A/B, NS3, NS4A/B e NS5). Em específico, a proteína não estrutural NS3 é uma proteína multifuncional com 619 aminoácidos que funciona como serino-protease e RNA helicase. O objetivo desse estudo foi expressar e purificar a proteína NS3 do DENV tipo 3 para que torne possível obter conhecimentos estruturais e posteriormente desenvolver inibidores da protease. A partir de uma amostra de soro positivo para DENV 3 foi feita extração, transcrição reversa e PCR do gene da proteína NS3. Em seguida, fragmentos de DNA do gene de NS3 foram clonados em vetor plasmidial pGEM-T. Após a confirmação do gene por sequenciamento foi feita subclonagem utilizando o vetor pET28a em células E. coli DH5α. Após esse processo foi feita uma nova transformação utilizando o vetor pET28a em células E. coli BL21 (DE3) para a expressão da proteína, confirmado com PAGE por Comassie blue e Western blotting. A expressão da proteína NS3 do DENV3 foi obtida com sucesso apresentando características insolúveis. Palavras - chave: Vírus Dengue, Aedes, DENV3, NS3. Abstract Dengue is a disease transmitted to humans by Aedes aegypti mosquitoes infected with Dengue virus (DENV), which is responsible for large epidemics of dengue. These viruses belong to the family Flaviviridae, genus Flavivirus. The genome consists of a positive strand RNA with approximately 11 kb and has four distinct serotypes (DENV-1, 2, 3 and 4). Viral genome encodes three structure proteins (C, prM and E) and seven non-structural proteins (NS1, NS2A / B, NS3, NS4A / B and NS5). In particular, the non-structural protein NS3 is a multifunctional protein with 619 amino acids which functions as serine protease and RNA helicase. The objective of this study was to express and purify the DENV-3 NS3 protein to make it possible to obtain knowledge about structural and subsequently develop protease inhibitors. In order to accomplish this, a positive serum sample against DENV-3 was used for RNA extraction, reverse transcription and PCR of the NS3 protein gene. Then, DNA fragments of NS3 gene were cloned into plasmid vector pGEM-T. After confirmation by sequencing, NS3 gene was subcloning into the vector pET28a and E. coli DH5α cells were transformed. After this process a new transformation was done using the vector pET28a in E. coli BL21 (DE3) for protein expression. The production of the protein was confirmed with PAGE followed by Comassie blue staining and Western blotting. The expression of NS3 protein of DENV3 was successfully obtained presenting insoluble characteristics. Keywords: Dengue virus, Aedes, DENV3, NS3. Sumário Introdução ........................................................................................................................8 Revisão da Literatura ......................................................................................................9 Materiais e Métodos ......................................................................................................13 1. Amplificação do gene NS3 ......................................................................................... 13 1.1 Amostras ..................................................................................................................... 13 1.2 Extração, RT-PCR e PCR ........................................................................................... 13 2. Clonagem: pGEM-T Easy + NS3 em DH5α ............................................................. 14 2.1 Adenilação (Adição de A-overhung) .......................................................................... 14 2.2 Purificação do inserto – Eluição de DNA ................................................................... 14 2.3 Quantificação .............................................................................................................. 14 2.4 Ligação – pGEM-T ..................................................................................................... 14 2.5 Dessalinização ............................................................................................................. 15 2.7 Extração do plasmídeo da cultura de células- Miniprep e Digestão do plasmídeo ..... 16 2.8 Sequenciamento .......................................................................................................... 16 2.9 Inoculo, Miniprep e Digestão do inserto ..................................................................... 16 2.10 RCA e digestão do vetor pET28a ................................................................................ 16 3. Subclonagem pET28a + NS3 em DH5α .................................................................... 17 3.1 Subclonagem em vetor pET28a .................................................................................. 17 3.2 Transformação em E. coli (DH5-α)............................................................................. 18 4. Subclonagem pET28a + NS3 em BL21(DE3) ........................................................... 18 4.1 Transformação em E.coli BL21(DE3) ........................................................................ 18 4.2 Confirmação da inserção do gene NS3 por reação de PCR ....................................... 18 5. Expressão .................................................................................................................... 18 5.1 Expressão e Indução .................................................................................................... 18 5.2 PAGE .......................................................................................................................... 19 5.3 Western blotting .......................................................................................................... 19 5.4 Teste de Solubilidade .................................................................................................. 20 Resultados ......................................................................................................................21 Discussão e Conclusão ...................................................................................................32 Referências Bibliográficas ............................................................................................ 35 Anexos ............................................................................................................................. 38 Anexo I - Protocolo de coloração por violeta cristal: .............................................................. 38 Anexo II - Protocolo de ligação inserto+vetor ........................................................................ 39 Anexo III - Protocolo de Transformação ................................................................................ 40 AnexoIV - Protocolo para Reação de RCA do pET28a .......................................................... 41 Anexo V- Protocolo de Precipitação com Etanol .................................................................... 42 Anexo VI - Protocolo para PAGE (Comassie blue e Western blotting).................................. 43 8 Introdução A Dengue é uma doença causada pelo vírus Dengue (DENV). Estes vírus pertencem à família Flaviviridae, gênero Flavivirus. Seu genoma consiste de uma fita positiva de RNA de aproximadamente 11kb. Existem quatro sorotipos denominados DENV-1, 2, 3 e 4 com base em suas características antigênicas, sendo útil para a identificação de fatores virais associados à severidade da doença (Brian et al., 2011). No Brasil, o DENV-1 foi o primeiro a ser encontrado durante a década de 80, seguindo-se a aparição do DENV-2 no início dos anos 90 (Teixeira et al., 2009). DENV-3 foi o terceiro a ser introduzido em 2001 (Tauil, 2002). A introdução do DENV-4 foi confirmada na região norte do Brasil, em 2008, na cidade de Manaus (Costa et al., 2009). Esta doença é transmitida predominantemente por meio da picada do mosquito Aedes aegypti, e também pode ser transmitida pelo Ae. albopictus. O aumento na incidência da doença na América ao longo das últimas três décadas é devido, em grande parte, a expansão geográfica de Ae. aegypti após o declínio dos esforços de controle (Brian et al., 2011). São muitas as dificuldades de controlar este mosquito em grandes e médias cidades, pois, existem facilidades para sua proliferação, bem como limitações para reduzir seus índices de infestação, geradas pela complexidade da vida urbana atual (Tauil, 2002). Com relação ao genoma do vírus este codifica três proteínas estruturais, sendo elas: capsídeo (C), precursora de membrana (prM) e envelope (E), estas proteínas sofrem uma série de mudanças conformacionais durante a entrada, montagem e maturação viral, sendo essenciais para o correto funcionamento dessas ações. Já as proteínas não estruturais (NS) compõem um conjunto de 7 proteínas: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5, sendo todas essas proteínas responsáveis por atuar na replicação viral (Idrees et al., 2012). Em específico, a proteína NS3 possui 619 aminoácidos e funciona como uma serinoprotease e também como uma helicase de RNA (Gebhard et al., 2012). Considerando estas funções, este projeto visa expressar e purificar a proteína NS3, utilizando o sistema heterólogo de expressão da bactéria Escherichia coli. E como resultado em longo prazo, estudos da estrutura da proteína podem contribuir para a elaboração de inibidores da proteína estudada. 9 Revisão da Literatura A Dengue é a arbovirose mundialmente mais importante, causada pelo vírus Dengue (DENV). Estes vírus pertencem à família Flaviviridae, gênero Flavivirus, que são filogeneticamente relacionados a outros importantes patógenos humanos, tais como o vírus da Febre amarela, vírus da Encefalite japonesa e o vírus do Nilo Ocidental. Esses vírus são partículas esféricas com envelope e possuem genoma de RNA de cadeia simples positiva com cerca de 11Kb (Martins et al., 2012). O DENV possui quatro sorotipos distintos (DENV-1, 2, 3 e 4) e cada sorotipo possui características únicas e podem apresentar manifestações graves em uma determinada população, dependendo de sua interação com a resposta do hospedeiro (Gupta et al., 2012). Estima-se que 70-500 milhões de infecções por DENV ocorram anualmente em países endêmicos. Cerca de 3,6 bilhões de pessoas (55% da população mundial) estão em risco de contrair a doença (dos Santos et al., 2011). A primeira epidemia da dengue no Brasil, com o isolamento do vírus, ocorreu em 1981, no estado de Roraima, quando DENV-1 e DENV-4 foram identificados. Em 1986 o DENV-1 foi identificado no estado do Rio de Janeiro e posteriormente disseminado para outros estados do Brasil (Bastos et al., 2012). DENV-2 foi identificado em 1990 e DENV-3 em 2000 no Rio de Janeiro (dos Santos et al., 2011). A dengue é transmitida predominantemente por meio da picada do mosquito Aedes aegypti infectado pelo DENV, um mosquito altamente domesticado, e também pode ser transmitida pelo Ae. albopictus. O aumento na incidência da doença na América ao longo das últimas três décadas é devido, em grande parte, à expansão geográfica de Ae. aegypti após o declínio dos esforços de controle (Brian et al., 2011). O Ae. aegypti é um mosquito tropical responsável pela transmissão da dengue no Brasil desde o início de 1980. O Ae. albopictus adaptou-se tanto em regiões tropicais e temperadas e colonizou vários tipos de criadouros nas áreas urbanas e suburbanas. Desde que a dengue foi inserida no Brasil, o Ae. albopictus não tem sido associado com epidemias de dengue no país, embora tenha sido encontrado naturalmente infectado com o vírus da Febre amarela. O melhor mecanismo conhecido de transmissão é pela transmissão horizontal (humano-mosquito), no entanto, a transmissão transovariana ou vertical, em que o mosquito fêmea infectado é capaz de transmitir o vírus a sua descendência, pode proporcionar um mecanismo para entender como o DENV persiste na natureza na ausência de hospedeiros vertebrados não imunes ou sob condições ambientais desfavoráveis para a atividade do mosquito (Martins et al., 2012). 10 Os mosquitos infectados com DENV permanecem infectados durante toda a sua vida e a viremia de um humano dura cerca de 7 a 10 dias. Uma vez que os mosquitos ingerem cerca de 1µL de sangue, a viremia de uma pessoa deve ter cerca de 103 unidades infecciosas/mL de sangue para ter um vírus infeccioso durante o repasto sanguíneo (Brian et al., 2011). Existem fatores que são importantes para determinar a incidência e a virulência da doença, ou seja, as características biológicas dos DENV, onde incluem os quatro sorotipos, virulência das cepas, sequência das infecções, a taxa de replicação. É levado também em consideração o hospedeiro, pois, depende da raça, idade, sistema imune. Outro fator importante é o vetor, onde é determinada a taxa de reprodução e adaptação ao meio ambiente (Teixeira et al., 2009). O processo de infecção se dá primeiramente pela adsorção da partícula viral, em seguida é endocitada em vesículas recobertas por clatrinas e o nucleocapsídeo é liberado no citoplasma após a fusão do envelope viral com a membrana do endossomo, essa fusão ocorre após mudança conformacional da proteína E. Depois da liberação do RNA genômico no citoplasma celular, esse RNA é traduzido em uma poliproteína que é clivada gerando proteínas estruturais e não - estruturais. A replicação do RNA genômico ocorre também no citoplasma e começa a com a síntese de uma fita de RNA complementar, com polaridade negativa, que serve como molde para a produção de novas fitas de RNA com polaridade positiva. A montagem da partícula viral ocorre nas proximidades do retículo endoplasmático, onde adquire o envelope. O transporte para a membrana plasmática é realizado por meio de vesículas por exocitose. O brotamento através da membrana citoplasmática é observado ocasionalmente, indicando não ser esse o principal mecanismo de liberação da partícula viral da célula hospedeira (Santos et al., 2008). Em áreas endêmicas, anualmente, cerca de 6-8% das crianças em idade escolar são infectadas com um DENV, mas apenas 5 - 50% dessas infecções são sintomáticas. A maioria dessas infecções sintomáticas possuem períodos de incubação que variam de 3 a 14 dias, mas geralmente são de 4 a 7 dias. A febre da dengue apresenta um início de febre súbita acompanhada de dor de cabeça, mialgia generalizada e artralgia, rubor da face, erupção cutânea, anorexia, dor abdominal e náuseas. A forma hemorrágica da dengue inclui sintomas como fragilidade capilar, petéquias, equimoses ou púrpura, sangramento da mucosa e do trato gastrointestinal. Já a síndrome do choque da dengue é exigida a presença dos critérios de dengue hemorrágica e insuficiência circulatória manifestada pelos sintomas seguintes: pulso fraco, aumento da frequência cardíaca, diminuição da pressão do sangue, modificação do estado mental, pele úmida e fria (Brian et al., 2011). 11 A evolução do paciente da febre hemorrágica da dengue (FHD) para a síndrome do choque da dengue (SCD) não é totalmente compreendido, mas FHD e SCD são manifestações graves de infecção pelo DENV em que a permeabilidade vascular aumenta, além da presença de hemorragia e choque. A presença preexistente de anticorpos para o DENV predispõe os pacientes a uma grave doença após a infecção por um segundo sorotipo de dengue (Dalrymple et al., 2012). Com relação ao genoma viral, a poliproteína viral é clivada para gerar 10 proteínas como outros vírus pertencentes à família Flaviviridae. Estas proteínas incluem três proteínas estruturais: capsídeo (C), precursora de membrana (prM) e envelope (E) (como ilustrado na figura 1) e sete proteínas não estruturais: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. A ordem dos genes é: 5’ UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3’ UTR. Estas proteínas virais são responsáveis para a replicação viral e várias funções celulares (Idrees et al., 2012). A proteína C é responsável pela montagem do nucleocapsídeo, mas apenas um pouco é conhecido sobre essa proteína e se localiza no núcleo. A proteína precursora de membrana (prM) é uma glicoproteína que funciona como uma parte do envoltório viral e auxilia a envolver a proteína para formar virions maduros. A proteína do envelope (E) está presente na superfície do vírus e está envolvida na ligação do vírus com a célula hospedeira através de receptores celulares tais como sulfato de heparina e é a proteína mais importante para a entrada do vírus na célula, esta proteína tem três domínios, domínio I (domínio estrutural), domínio II (dimmers) e domínio III (domínio de ligação) (Idrees et al., 2012). Figura 1: Representação esquemática Zone.http://viralzone.expasy.org/all_by_species/24.html da estrutura viral. Fonte: Viral 12 O genoma codifica sete proteínas não estruturais, incluindo NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5 (como ilustrado na figura 2). Estas proteínas são responsáveis pela replicação viral e outras funções celulares (Idrees et al., 2012). Em específico, a NS3 é uma proteína multifuncional essencial para a replicação de Flavivirus, que possui 619 aminoácidos. Esta protease viral está envolvida no processamento da poliproteína viral. A região N-terminal possui 167 aminoácidos e requer a região central com 40 aminoácidos associado com o cofator NS2B. O C-terminal de NS3 foi previsto pela primeira vez e, em seguida, demonstrou ter três diferentes atividades enzimáticas: NTPase, RNA trifosfatase (RTPase) e helicase. A atividade NTPase cliva a ligação anidrido fosfórico 5’-RNA e é a primeira das três reações enzimáticas sequenciais de RNA, que é essencial para a tradução do RNA viral e sua estabilidade. A atividade de desenrolar o RNA do DENV pela NS3 foi primeiramente relatada por Padmanabhan e colaboradores (1999). A análise mutacional indicou que as atividades ATPase / helicase e NTPase de DENV compartilham de um sítio ativo comum (Gebhard et al., 2012). Esta proteína é considerada o principal alvo de respostas para células T CD4+ e CD8+ durante a infecção do DENV, que pode estar envolvida na proteção (Costa et al., 2011) . Ou seja, a proteína NS3 é a segunda maior proteína não estrutural com a serinoprotease na extremidade N-terminal e a RNA helicase na extremidade C-terminal. A NS3 também está envolvida na replicação do RNA e ajuda na regulação do processamento da poliproteína. E, devido aos seus domínios e seu papel na replicação viral, a NS3 é considerada um alvo terapêutico importante contra a infecção pelo DENV. Mas ainda existe uma necessidade de desenvolver compostos antivirais que podem atingir os quatro sorotipos de dengue com a mesma eficiência (Idrees et al., 2012). Figura 2: Representação esquemática da poliproteína viral com os sítios de clivagem. Fonte: Viral Zone. http://viralzone.expasy.org/all_by_species/24.html. 13 Materiais e Métodos 1. Amplificação do gene NS3 1.1 Amostras As amostras de sorospositivos para DENV3 foram cedidas pela Universidade Federal de Goiás em 2010. Foram cedidas sete amostras, sendo elas: 935, 936, 937, 938, 939, 944, 964. 1.2 Extração, RT-PCR e PCR Foi feita extração e RT-PCR de todas as 7 amostras pela estudante Rayane Luzia Viegas da Silva. O RNA total foi extraído do plasma utilizando o kit “Purelink Viral RNA/DNA purification” (Invitrogen) e seguindo as recomendações do fabricante. Posteriormente foi realizado RT-PCR nas seguintes condições: 6µl H2O livre de RNase, 5µl de RNA total, 1µl de dNTP (10mM), 1µl de primer anti senso (25µM) sendo incubado a 65° C por 5 minutos. Após esta etapa foi adicionado 4µl de tampão MMLV (5x), 1µl de DTT (0,1M), 1µl de MMLV (400U, Invitrogen), 1µl RNaseOut (Invitrogen) e incubado por 50 minutos a 50°C. Em seguida, a solução foi incubada por mais 5 minutos a 85°C para desnaturar a enzima MMLV. O material foi armazenado no freezer a -20°C. A reação de PCR foi realizada nas seguintes condições: 14μL H2O, 1μL dNTP (10mM), 5μL 10x LongAmp DNA polymerase buffer (New England Biolabs), 0,5μL primer NS3 senso (25µM), 0,5μL primer NS3 anti senso (25 uM), 0,2μL LongAmp – DNA polimerase (5U/μL) (tabela 1), e 3μL cDNA para o volume final de 25µL. A programação realizada no termociclador foi: 1x 80°C por 1 minuto/ 94°C por 30 seg; 40 ciclos (94°C por 10 seg./ 55°C por 30 seg./ 65°C por 60 seg); 1x 65°C por 10 min/ 10°C ∞. Tabela1- Primers utilizados para a amplificação por PCR da região NS3. Sítios de restrição estão sublinhados para as enzimas NdeI (catatg) e NotI (gcggccgc). Primer Senso Primer Anti senso 5´ Cca tat gTC CGG CGT TCT ATG GGA CGT ACC 3´ 5´ Tgc ggc cgc CTT TCT GCC AGC CGC AAA GTC 3´ 14 2. Clonagem: pGEM-T Easy + NS3 em DH5α 2.1 Adenilação (Adição de A-overhung) O processo de adenilação tem a função aumentar a eficiência da clonagem em pGEMT, pois, a Taq polimerase adiciona adenina na extremidade do fragmento possibilitando a ligação ao vetor que possui nucleotídeos de timina em suas extremidades. A adenilação foi feita no termociclador por 30 minutos a uma temperatura de 70°C, onde para cada 25µL amostra de PCR acrescentou 0,2µL de Taq DNA polimerase (5U/μL). 2.2 Purificação do inserto – Eluição de DNA Para a purificação dos fragmentos de cDNA correspondente ao gene NS3 foi feito um gel de agarose 1% e inoculado 25µL da amostra em cada poço. Após a corrida, o gel foi corado com violeta cristal (anexo I) (40µg/mL) por 30 minutos e as bandas correspondentes ao tamanho de aproximadamente 1.857pb foram cortadas e eluidas com o kit “GFX band purification” (GE Heathcare Life Sciences) de acordo com o protocolo do fabricante. 2.3 Quantificação Para a ligação do inserto ao vetor é necessário quantificar o inserto. Para isso, foi utilizado o equipamento Qubit com o protocolo e reagentes do Quant-it (Invitrogen).E assim, posteriormente foi feita a ligação entre inserto e vetor pGEM-TEasy (figura 3). 2.4 Ligação – pGEM-T A ligação do inserto NS3 purificado com o vetor pGEM-T Easy (Promega) foi feita de acordo com a seguinte proporção:[(ng vetor x Kb inserto) / Kb veto] x 3/1. (protocolo detalhado no anexo II) 15 Figura 3: Mapa do plasmídeo pGEM-T Easy com sítios de restrição. Fonte: Promega. http://www.promega.com/~/media/Files/Resources/Protocols/Technical%20Manuals/0/pGEMT%20and%20pGEM-T%20Easy%20Vector%20Systems%20Protocol.pdf . 2.5 Dessalinização Com a finalidade de eliminar sais foi realizada a reação de dessalinização. Para isso a amostra foi dialisada em uma placa de Petri com água destilada, com uma membrana de nitrocelulose (Millipore) adicionando 5µL de amostra por um período de 15 minutos em temperatura ambiente. 2.6 Transformação do pGEM-TEasy recombinante em E. coli (DH5-α) Com o pGEM-T Easy recombinante (vetor + NS3) foi feita a transformação (anexo III) em E. coli DH5-α. Primeiramente a cuveta foi incubada por 15 minutos no gelo, em seguida colocado 2µL da ligação (NS3+pGEM-T) no tubo tipo “eppendorf” com 50µl de células competentes, em seguida foi dado o choque no eletroporador. Após a eletroporação foram adicionados 1000µL do meio SOC (Sambrook& Russell, 2001) na cuveta e homogeneizados. A seguir, o material transformado ficou no agitador por 1 hora a 37ºC com agitação de 200rpm. As bactérias foram plaqueadas em meio LB com ágar utilizando 20µL de ampicilina (100mg/mL), 20µL IPTG (200mg/ml), 40µL X-Gal (20mg/ml); foram plaqueados 200µL da amostra transformada. A incubação da placa foi na estufa à 37ºC por ± 16 horas. 16 2.7 Extração do plasmídeo da cultura de células- Miniprep e Digestão do plasmídeo A partir do crescimento das colônias na placa, foram feitos inoculos dessas colônias para em seguida purificar o plasmídeo em pequena escala (miniprep). Foi feito o miniprep das colônias escolhidas utilizando o kit “plasmidPrep Mini Spin Kit” (GE heathcare), de acordo com o fabricante. Posteriormente, foi feita a digestão do plasmídeo com a enzima de restrição EcoRI, para liberar o inserto do vetor e assim confirmar a inserção do gene alvo. Estoques desses inoculos foram armazenados na temperatura de 80ºC negativos. 2.8 Sequenciamento Após a confirmação da inserção do gene alvo no vetor, o clone 1 (pGEM-T-NS3) foi encaminhado para o sequenciamento na Macrogen (Coréia do Sul). Após a confirmação foi realizada a subclonagem em vetor de expressão de proteína pET28a. 2.9 Inoculo, Miniprep e Digestão do inserto Foram feitos dois inoculos a partir do estoque da colônia do clone 1 (pGEM-T-NS3) armazenado anteriormente a uma temperatura de 80ºC negativos. Em seguida foi feito miniprep e a digestão com as enzimas NotI e NdeI. Os insertos foram purificados utilizando o kit “GFX band purification” (GE Heathcare Life Sciences) por gel de agarose com corante violeta cristal, e em seguida quantificados, como descrito nos itens 2-2 e 2-3. 2.10 RCA e digestão do vetor pET28a O vetor de expressão de proteína pET28a foi amplificado por Rolling circle amplification (RCA) (anexo IV) em duplicata, que é um processo que objetiva o aumento exponencial do vetor aumentando assim a quantidade e a efetividade do mesmo. Em seguida foi feita a precipitação com etanol (anexo V), digestão pelas enzimas de restrição NotI e NdeI, desfosforilação [com a adição de 1µL de CIP-(NEB) por 1 hora a 37ºC] e purificação utilizando o kit “GFX band purification”(GE Heathcare Life Sciences). 17 3. Subclonagem pET28a + NS3 em DH5α 3.1 Subclonagem em vetor pET28a Com o inserto e o vetor pET28a purificados foi feita a ligação com a proporção molecular de vetor: inserto= 1:3 (anexo II). Figura 4: Mapa do plasmídeo pET-28a com sítios de restrição. Fonte: Novagen. http://ampliconexpress.com/vector_maps/pET28_map.pdf . 18 3.2 Transformação em E. coli (DH5-α) Após a ligação foi feita a dessalinização como descrita no item 2-5. A seguir foi realizada a transformação em E.coli DH5-α. As células transformadas produziram colônias que foram selecionadas. Em seguida foi feito o miniprep e o produto deste foi submetido a digestão com as enzimas de restrição NotI e NdeI. A transformação foi feita da maneira com descrita no item 2-6, exceto o uso do antibiótico que foi utilizado canamicina (50µg/mL), visto que o vetor pET28a é resistente a esse antibiótico. 4. Subclonagem pET28a + NS3 em BL21(DE3) 4.1 Transformação em E.coli BL21(DE3) Após a confirmação da construção pET28a-NS3, foi feita a transformação em outra cepa de E.coli, sendo a BL21 (DE3), feita como descrito no item 2-6. Essa cepa é utilizada para se expressar proteínas e a DH5α foi utilizada anteriormente por ser fácil para manipular. . 4.2 Confirmação da inserção do gene NS3 por reação de PCR Para confirmar a inserção do gene NS3 no plasmídeo pET28a foi realizada uma reação de PCR utilizando os primers T7 e o anti - senso. O T7 foi utilizado para iniciar a reação pela região do promotor do pET28a e o anti - senso por ser específico para NS3. O tamanho da banda esperado para essa amplificação é de 1982pb. 5. Expressão 5.1 Expressão e Indução Primeiramente foi feita uma expressão teste de NS3 com 10 mL de meio LB, Então, para o teste foram selecionados dois clones para o pré-inoculo: colônia de bactéria em 3mL de meio LB e 3µL canamicina (50µg/ml) incubados overnight a uma temperatura de 37ºC. A partir desse pré-inoculo foi feito um novo inóculo com 5 ml de meio LB contendo 5µL de canamicina (50µg/ml) com 500µl do pré-inoculo. Foi incubado por 1hora e 30 minutos à 37ºC até atingir OD próximo de 0.4 (colônia 1: 0,473; colônia 2: 0,480). Ao chegar nessa O.D600, 19 foi transferido 1mL desse inoculo para 10 mL de LB e incubado por 2 horas à 37ºC até chegar na O.D600 próxima de 0,4 (colônia 1: 0,456; colônia 2: 0,372), após essa leitura foi retirado 1 mL para se fazer controle negativo e os 9 mL restantes foram utilizados para se fazer a indução adicionando 18µL de IPTG (100mg/mL), para concentração final de 0,2% no meio. A indução foi feita em 2 horas a 37ºC e após esse período foram retiradas duas alíquotas de 1mL para cada colônia, centrifugada com rotação máxima por 1 minuto, descartando os sobrenadantes e armazenando os pellets a -20°C. Uma das alíquotas foi utilizada para avaliar na eletroforese de gel de poliacrilamida (PAGE) e a outra alíquota para o teste de solubilidade. Posteriormente foi feita expressão utilizando 200 mL de meio LB com os mesmos 2 clones da indução teste. 5.2 PAGE Os pellets bacterianos armazenados foram ressuspendidos em 40 µl de tampão (SDS 2x) e fervido à 100 ºC por 5 minutos. Foram feitos dois géis de poliacrilamida (anexo VI). Sendo que um gel foi corado com Comassie blue (0,1%) por 2 horas e descorado com solução descorante e o segundo gel foi utilizado para a realização de Western blotting, para a transferência de proteínas para uma membrana de nitrocelulose (GE Heathcare Life Sciences). 5.3 Western blotting O primeiro passo do Western blotting foi a incubação do gel descrito no item 5.2, da membrana de nitrocelulose e dos 4 papéis filtro numa solução de transferência por 10 minutos. Em seguida foi feita a transferência das proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose utilizando um “Transblot” (Bio-Rad) com 15V, 150mA por um período de 30 minutos. A membrana foi bloqueada por um tampão de bloqueio com PBS1X e leite em pó desnatado (final 1%) por um período de 1 hora sob agitação. Em seguida, a membrana foi lavada 3 vezes por 3 minutos por uma solução constituída por PBS 1X Tween 0,1%. Após uma nova incubação de 2 horas com tampão de bloqueio contendo 1µg/mL de anticorpo primário (Anti-His Tag, Invitrogen), foram realizadas três novas lavagens com PBS 1X Tween 0,1%. Foi feita outra incubação com um novo tampão de bloqueio contendo anticorpo secundário (Anti-Mouse conjugado com fosfatase alcalina, Sigma) (1µg/mL), por um período de 2 horas em temperatura ambiente. A membrana foi lavada por três vezes com a mesma solução de PBS 1X e Tween 0,1%. A revelação foi feita por uma solução contendo: 10 mL de Tampão Tris pH 9,5, com 50µL de Nitroblue Tetrazolium (NBT) (10mg/ml) e 30µL de 5- 20 Bromo-4-Cloro-3-Indolil Fosfato (BCIP) (10mg/ml). A revelação foi realizada num recipiente protegido de luz e a visualização da revelação observada de 3 em 3 minutos. 5.4 Teste de Solubilidade As alíquotas armazenadas como descrito no item 5.1 foram ressuspendidas em 1mL de PBS 1X e transferidos 100µL para um tubo eppendorf de 1,5mL. Em cada eppendorf foi adicionado 11µL de “Fastbreak” (Promega) e 0,1µL de DNase. Os tubos foram centrifugados por 1 minuto com velocidade máxima. Em seguida colocados no agitador orbital (80 rpm) por 20 minutos seguido de nova centrifugação de 1 minuto com velocidade máxima. O sobrenadante foi armazenado em um novo tubo eppendorf, e o pellet armazenado no próprio tubo eppendorf. Foram feitos dois géis de poliacrilamida utilizando o sobrenadante e o pellet de cada colônia, um gel corado com Comassie blue, e o outro para ser feito Western blotting. Outra metodologia utilizada para testar a solubilidade da proteína foi a sonicação. Foi feita uma nova expressão da NS3 apenas com o clone 1e aliquotado 1mL em diversos tempos, como: no tempo não induzido, após 30 minutos de indução, após 1hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas e overnight, em seguida foram centrifugados e os pellets foram ressuspendidos em 1mL de tampão Tris-NaCl (300mM NaCl, 50mM Tris-HCl). As células foram lisadas por sonicação com 2 pulsos de 15 segundos com intervalo de 30 segundos, usando amplitude de 20%. As alíquotas foram centrifugadas e o sobrenadante armazenado em um novo tubo eppendorf. Foi feito PAGE corado por Comassie blue com amostras do pellet e do sobrenadante. 21 Resultados Das sete amostras de soro testadas, apenas a amostra 938 foi positiva para NS3 do DENV3 por RT - PCR (figura 1). A partir da clonagem do gene NS3 no vetor pGEM-T Easy foi observado o crescimento de 8 colônias e foram escolhidas 3 colônias para se fazer miniprep (figura 2). Com o produto do miniprep foi feita a digestão desses 3 clones plasmidiais (figura 3), e no gel se observa uma banda compatível com o tamanho do inserto NS3, de aproximadamente 1.857pb e uma banda com tamanho aproximado de 5.000pb, correspondente ao tamanho do plasmídeo mais inserto. Pode-se inferir que a digestão ocorreu, mas não como esperada. Em seguida, o sequenciamento desse inserto confirmou a característica de ser NS3 do DENV3 e sua correta inserção no vetor quando comparado a amostras depositadas no GenBank (figura 4). Com essa confirmação foi feita subclonagem em células E.coli DH5α. E para a obtenção do inserto foram feitos dois inoculos do clone 1 do pGEM-T-NS3 (confirmado pelo sequenciamento) em meio LB, em seguida foi feito miniprep desses dois inoculos (figura 5) e na eletroforese se observa bandas esperadas de aproximadamente 5.000pb. Com relação ao vetor pET28a foi feita a reação de RCA em duplicata (figura 5), mas a reação não foi concluída com sucesso, pois, na eletroforese se observa bandas bastante fracas, e mesmo assim, o RCA B se mostra melhor que o RCA A. Com esses resultados, o pGEM-T – NS3 e o RCA B foram digeridos com as enzimas de restrição NotI e NdeI (figura 6), o inserto de tamanho esperado foi liberado, mas a quantidade do RCA B não se mostrou suficiente. O vetor pET28a foi cedido pelo professor Tatsuya Nagata com a reação de RCA feita. Dessa forma, o vetor foi precipitado com etanol, digerido, desfosforilado e purificado. A eletroforese mostra o produto de todas essas reações com tamanho esperado de 5.369pb (figura 7). Com a purificação do inserto e do vetor foi feita a ligação, dessalinização e a transformação com a célula de E. coli DH5α. Foram escolhidas 8 colônias e foi feito miniprep das seguintes colônias: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9 e 10; (figura 8). Em seguida, foi feita a digestão com enzimas de restrição de 3 clones escolhidos, mas o resultado da digestão foi inconclusivo. Foi adicionado plasmídeos na eletroforese para se comparar com a digestão dos seus respectivos clones (figura 9). 22 A reação de PCR utilizando os primers T7 e o anti - senso é observada na eletroforese que apresentou a banda de DNA com o tamanho do gene NS3 (1.857pb), confirmando a correta inserção (figura 10). Em seguida, o produto do miniprep da transformação em DH5α foi transformado em E. coli BL21 (DE3), a partir dessa transformação foram selecionados 2 clones da placa transformada para serem feitas as expressões. E as amostras não induzidas e induzidas foram avaliadas por PAGE (figura 11 A-B) e se observa que a indução ocorreu como esperado. As bandas de proteína com tamanho de 69 kDa foram observadas, tanto no PAGE visualizado com Comassie blue quanto no Western blotting. O gel com o teste de solubilidade (figura 12 A-B) apresentou características de proteína insolúvel, visto que, a proteína esteve presente no pellet e não no sobrenadante. Outra PAGE foi feita a partir da indução do clone1 e 2 (figura 13), com indução de duas horas em um volume final de 200 mL de meio LB, e se observa que a expressão funcionou. O resultado da solubilidade pela metodologia de sonicação se mostra com característica insolúvel, ou seja, a proteína está presente no pellet (figura 14), com tamanho de 69KDa, e não no sobrenadante (figura 15). M 2 3 4 5 6 7 8 12000 2000 1650 100 Figura 1- Eletroforese em gel de agarose do gene de NS3. Posições: 1- marcador 1Kb Plus (Invitrogen); 2- amostra 935; 3- amostra 937; 4- amostra 938; 5- amostra 939; 6- amostra 944; 7amostra 964; 8- amostra 936. 23 M 2 3 4 12000 5000 2000 1650 100 Figura 2- Eletroforese em gel de agarose dos produtos de miniprep contendo plasmídeos pGEM-TNS3, 3 colônias das 8 que cresceram. Posições: 1- marcador 1 Kb Plus (Invitrogen); 2- clone1; 3clone 2; 4- clone 3. M 2 3 4 12000 5000 2000 1650 Figura 3- Eletroforese em gel de agarose da digestão com enzima de restrição EcoRI dos 3 clones escolhidos. Posições: 1- marcador 1Kb Plus (Invitrogen); 2- clone 1; 3- clone 2; 4- clone 3. 24 >NS3-T7 promoter NS3 NCBI TCGATTCCATATGTCCGGCGTTCTATGGGACGTACCCAGCCCCCCAGAGACACAGAAAGC 60 -------------TCCGGCGTTCTATGGGACGTACCCAGCCCCCCAGAGACACAGAAAGC 47 *********************************************** NS3 NCBI AGAACTGGAAGAAGGGGTCTATAGGATCAAACAGCAAGGAATTTTTGGGAAAACCCAAGT 120 AGAACTGGAAGAAGGGGTCTATAGGATCAAACAGCAAGGAATTTTTGGGAAAACCCAAGT 107 ************************************************************ NS3 NCBI AGGGGTTGGAGTACAGAAAGAAGGAGTCTTCCACACCATGTGGCACGTTACAAGAGGGGC 180 AGGGGTTGGAGTACAGAAAGAAGGAGTCTTCCACACCATGTGGCACGTTACAAGAGGGGC 167 ************************************************************ NS3 NCBI AGTGTTGACATATAATGGGAAAAGACTGGAACCAAACTGGGCTAGCGTGAAAAAAGATCT 240 AGTGTTGACATATAATGGGAAAAGACTGGAACCAAACTGGGCTAGCGTGAAAAAAGATCT 227 ************************************************************ NS3 NCBI GATTTCATACGGAGGAGGATGGAGATTGAGCGCACAATGGCAAAAGGGGGAGGAGGTGCA 300 GATTTCATACGGAGGAGGATGGAGATTGAGCGCACAATGGCAAAAGGGGGAGGAGGTGCA 287 ************************************************************ NS3 NCBI GGTTATTGCCGTAGAGCCTGGGAAGAACCCAAAGAACTTTCAAACCATGCCAGGCACTTT 360 GGTTATTGCCGTAGAGCCTGGGAAGAACCCAAAGAACTTTCAAACCATGCCAGGCACTTT 347 ************************************************************ NS3 NCBI TCAGACTACAACAGGGGAAATAGGAGCAATTGCACTGGATTTCAAGCCTGGAACTTCAGG 420 TCAGACTACAACAGGGGAAATAGGAGCAATTGCACTGGATTTCAAGCCTGGAACTTCAGG 407 ************************************************************ NS3 NCBI ATCTCCCATCATAAACAGAGAGGGAAAGGTAGTGGGACTGTATGGCAATGGAGTGGTTAC 480 ATCTCCCATCATAAACAGAGAGGGAAAGGTAGTGGGACTGTATGGCAATGGAGTGGTTAC 467 ************************************************************ NS3 NCBI AAAGAATGGTGGCTACGTCAGCGGAATAGCGCAAACGAATGCAGAACCAGATGGACCAAC 540 AAAGAATGGTGGCTACGTCAGCGGAATAGCGCAAACGAATGCAGAACCAGATGGACCAAC 527 ************************************************************ NS3 NCBI ACCAGAATTGGAAGAAGAGATGTTCAAAAAGCGAAATCTAACCATAATGGATCTTCATCC 600 ACCAGAATTGGAAGAAGAGATGTTCAAAAAGCGAAATCTAACCATAATGGATCTTCATCC 587 ************************************************************ NS3 NCBI TGGGTCAGGAAAGACACGGAAATACCTTCCAGCTATTATTAGAGAGGCAATCAAGAGACG 660 TGGGTCAGGAAAGACACGGAAATACCTTCCAGCTATTATTAGAGAGGCAATCAAGAGACG 647 ************************************************************ NS3 NCBI TTTAAGAACTCTAATTTTGGCACCGACAAGGGTGGTTGCAGCTGAGATGGAAGAAGCATT 720 TTTAAGAACTCTAATTTTGGCACCGACAAGGGTGGTTGCAGCTGAGATGGAAGAAGCATT 707 ************************************************************ NS3 NCBI GAAAGGGCTCCCAATAAGGTACCAAACAACAGCAACAAAATCTGAACACACAGGAAGAGA 780 GAAAGGGCTCCCAATAAGGTACCAAACAACAGCAACAAAATCTGAACACACAGGAAGAGA 767 ************************************************************ NS3 NCBI GATTGTTGATCTAATGTGCCACGCAACGTTCACAATGCGTCTGCTGTCACCAGTTAGGGT 840 GATTGTTGATCTAATGTGCCACGCAACGTTCACAATGCGTCTGCTGTCACCAGTTAGGGT 827 ************************************************************ NS3 NCBI TCCAAACTATAACTTGATAATAATGGATGAAGCCCATTTCACAGACCCAGCCAGTATAGC 900 TCCAAACTATAACTTGATAATAATGGATGAAGCCCATTTCACAGACCCAGCCAGTATAGC 887 ************************************************************ NS3 NCBI GGCTAGAGGGTACATATCGACTCGTGTTGGAATGGGAGAGGCAGCTGCAATTTTCATGAC 960 GGCTAGAGGGTACATATCGACTCGTGTTGGAATGGGAGAGGCAGCTGCAATTTTCATGAC 947 ************************************************************ NS3 NCBI AGCAACGCCCCCTGGAACAGCTGATGCCTTTCCCCAGAGCAACGCTCCAATTCAAGATGA 1020 AGCAACGCCCCCTGGAACAGCTGATGCCTTTCCCCAGAGCAACGCTCCAATTCAAGATGA 1007 ************************************************************ NS3 NCBI AGAAAGGGACATACCAGAACGCTCATGGAATTCAGGCAATGAATGGATAACCGACTTCGC 1080 AGAAAGGGACATACCAGAACGCTCATGGAATTCAGGCAATGAATGGATAACCGACTTCGT 1067 *********************************************************** 25 NS3 NCBI TGGGAAAACGGTGTGGTTTGTCCCCAGCATTAAAGCCGGAAATGACATAGCAAACTGCTT 1140 TGGGAAAACGGTGTGGTTTGTCCCCAGCATTAAAGCCGGAAATGACATAGCAAACTGCTT 1127 ************************************************************ NS3 NCBI GCGAAAAAACGGGAAAAAGGTCATTCAACTTAGTAGGAAGACTTTTGACACAGAATATCA 1200 GCGAAAAAACGGGAAAAAGGTCATTCAACTTAGTAGGAAGACTTTTGACACAGAATATCA 1187 ************************************************************ NS3 NCBI GAAAACTAAACTGAATGATTGGGACTTCGTGGTGACAACTGACATTTCAGAAATGGGGGC 1260 GAAAACTAAACTGAATGATTGGGACTTCGTGGTGACAACTGACATTTCAGAAATGGGGGC 1247 ************************************************************ NS3 NCBI CAATTTCAAAGCAGATAGAGTGATCGACCCAAGAAGATGTCTCAAACCAGTGATTCTGAC 1320 CAATTTCAAAGCAGATAGAGTGATCGACCCAAGAAGATGTCTCAAACCAGTGATCCTGAC 1307 ****************************************************** ***** NS3 NCBI AGATGGACCAGAGCGGGTGATCCTGGCTGGACCAATGCCAGTCACCGCGGCGAGTGCTGC 1380 AGATGGACCAGAGCGGGTGATCCTGGCTGGACCAATGCCAGTCACCGCGGCGAGTGCTGC 1367 ************************************************************ NS3 NCBI GCAAAGGAGAGGGAGAGTTGGCAGGAACCCACAAAAAGAAAATGACCAGTACATATTCAC 1440 GCAAAGGAGAGGGAGAGTTGGCAGGAACCCACAAAAAGAAAATGACCAGTACATATTCAC 1427 ************************************************************ NS3 NCBI GGGCCAGCCTCTCAACAATGATGAAGACCATGCTCACTGGACAGAAGCAAAAATGCTGCT 1500 GGGCCAGCCTCTCAACAATGATGAAGACCATGCTCACTGGACAGAAGCAAAAATGCTGCT 1487 ************************************************************ NS3 NCBI GGACAACATTAATACACCAGAAGGGATCATACCAGCTCTCTTTGAGCCAGAAAGGGAGAA 1560 GGACAACATTAATACACCAGAAGGGATCATACCAGCTCTCTTTGAGCCAGAAAGGGAGAA 1547 ************************************************************ NS3 NCBI GTCAGCCGCCATAGACGGTGAGTATCGCTTGAAAGGTGAGTCCAGGAAGACTTTCGTGGA 1620 GTCAGCCGCCATAGACGGTGAGTATCGCTTGAAAGGTGAGTCCAGGAAGACTTTCGTGGA 1607 ************************************************************ NS3 NCBI ACTCATGAGGAGGGGTGACCTTCCAGTCTGGTTAGCCCATAAAGTAGCATCAGAAGGGAT 1680 ACTCATGAGGAGGGGTGACCTTCCAGTCTGGTTAGCCCATAAAGTAGCATCAGAAGGGAT 1667 ************************************************************ NS3 NCBI CAAATATACAGATAGAAAATGGTGCTTTGATGGACAACGTAATAATCAAATTTTAGAGGA 1740 CAAATATACAGATAGAAAATGGTGCTTTGATGGACAACGTAATAATCAAATTTTAGAGGA 1727 ************************************************************ NS3 NCBI GAACATGGATGTGGAAATCTGGACAAAGGAAGGAGAAAAGAAAAAATTGAGACCTAGGTG 1800 GAACATGGATGTGGAAATCTGGACAAAGGAAGGAGAAAAGAAAAAATTGAGACCTAGGTG 1787 ************************************************************ NS3 NCBI GCTTGATGCCCGCACTTATTCAGATCCCTTAGCACTCAAGGAATTCAAGGACTTTGCGGC 1860 GCTTGATGCCCGCACTTATTCAGATCCCTTAGCACTCAAGGAATTCAAGGACTTTGCGGC 1847 ************************************************************ NS3 NCBI TGGCAGAAAGGCGGCCGCAA 1880 TGGCAGAAAG---------- 1857 ********** Figura 4 – Análise comparativa do gene NS3 proveniente da amostra 938 e da amostra armazenada no GenBank “Dengue virus 3 isolate DENV-3/BR/BID-V3460/2006”. Em destaque, com sigla vermelha, mutação nucleotídica em ponto. 26 M 2 3 4 5 12000 5000 2000 1650 100 Figura 5: Eletroforese em gel de agarose do produto de miniprep do clone 1 (poços 2 e 3); e RCA do vetor pET28a (poços 4 e 5). Posição 1: marcador 1 Kb Plus (Invitrogen). M 2 3 12000 3000 2000 1650 200 Figura 6- Eletroforese em gel de agarose da digestão do clone 1 e do pET28a (RCA-B). Posições: 1marcador 1Kb Plus (Invitrogen); 2- inserto NS3 + pGEM-T; 3- digestão do pET28a (RCA-B). 27 M 2 10000 5000 1650 1000 750 500 250 Figura 7- Eletroforese em gel de agarose da purificação do vetor pET28a cedido pelo professor Tatsuya Nagata. Posições: 1- marcador 1Kb (Fermentas); 2- vetor pET28a purificado. M 2 3 4 5 6 7 8 9 10000 2000 1650 1000 750 500 250 Figura 8- Eletroforese em gel de agarose do miniprep da transformação com DH5α com pET28a – NS3. Posições: 1- marcador 1Kb (Fermentas); 2- inoculo 1; 3- inoculo 2; 4- inoculo 3; 5- inoculo 4; 6inoculo 5; 7- inoculo 7; 8- inoculo 9; 9- inoculo 10. 28 M 2 3 4 5 6 7 10000 5000 2000 1650 1000 750 500 250 Figura 9- Eletroforese em gel de agarose da digestão dos plasmídeos e os plasmídeos sem digestão dos 3 clones selecionados. Posições: 1- marcador 1Kb (Fermentas); 2-digestão clone 1; 3-digestão clone 2; 4- digestão clone 7; 5- plasmídeo do clone 1; 6- plasmídeo do clone 2; 7- plasmídeo do clone 7. 1 M 12000 2000 1650 100 Figura 10- Eletroforese em gel de agarose do PCR feito com a amostra do miniprep clone 1, utilizando os primers T7 e Anti senso do NS3. Posições: 1- NS3; 2- marcador 1Kb Plus (Invitrogen). 29 1 2 3 M 1 2 3 M 170 130 95 72 95 72 55 55 43 43 34 34 26 26 17 10 17 10 Figura 11 A Figura 11 B Figura 11 A e B- PAGE com proteínas expressas por indução teste. Corado com Comassie blue (figura 11-A) e feito Western blotting (figura 11-B). Posições: 1- Amostra não induzida; 2- Clone 1 induzido; 3- Clone 2 induzido; 4- marcador de proteína PageRuler (Fermentas). 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 170 130 95 72 55 95 72 55 43 43 34 34 26 26 17 17 10 Figura 12 A Figura 12 B Figura 12 A e B- PAGE avaliando teste de solubilidade da NS3. Corado com Comassie blue (figura 12-A), e feito Western blotting (figura 12-B). Posições: 1- pellet do clone 1; 2- sobrenadante do clone 1; 3- pellet do clone 2; 4- sobrenadante do clone 2; 5- marcador de proteína PageRuler (Fermentas). 30 M 2 3 4 5 116 66,2 45 35 25 Figura 13 – PAGE com proteínas expressas por indução em 200mL meio LB por 2 horas. Posições: 1marcador de proteína “Pre-stained” (Fermentas); 2- clone 1 não induzido; 3- clone 1 induzido; 4-clone 2 não induzido; 5- clone 2 induzido. 1 2 3 4 5 6 7 M 170 130 95 72 55 43 34 26 17 10 Figura 14- PAGE do pellet, para avaliar a solubilidade da NS3 por sonicação, e em diferentes tempos de indução. Posições: 1- sem indução; 2- 30 minutos; 3- 1 hora; 4- 2 horas; 5- 4 horas; 6- 6 horas; 7overnight; 8- marcador de proteína PageRuler (Fermentas). 31 M 2 3 4 5 6 7 8 170 130 95 72 55 43 34 26 17 10 Figura 15- PAGE do sobrenadante para avaliar a solubilidade da NS3 por sonicação, e em diferentes tempos de indução. Posições: 1- marcador de proteína PageRuler (Fermentas); 2- sem indução; 3- 30 minutos; 4- 1 hora; 5- 2 horas; 6- 4 horas; 7- 6 horas; 8- overnight. 32 Discussão e Conclusão A dengue é um importante problema emergente de saúde pública, que acomete anualmente milhões de indivíduos. Atualmente não existe terapia eficaz para o tratamento dessa infecção viral (Xu et al., 2005). O objetivo desse trabalho foi expressar e purificar a proteína NS3 do DENV tipo 3 para que torne possível obter conhecimentos estruturais dessa proteína e em seguida desenvolver antivirais. A busca de novas formas de contenção dessa doença se faz porque seu controle se tornou uma atividade difícil, visto que é feito apenas pelo controle do seu vetor Ae. aegypti. A vacinação é um método estratégico interessante de controle, entretanto, ainda está em desenvolvimento e a comercialização de vacina poderá ser autorizada no futuro. Assim, uma estratégia importante é o desenvolvimento de antivirais, mas ainda não existem essas drogas no mercado. Um alvo muito interessante para o desenvolvimento de inibidores específicos é a proteína NS3. Essa proteína é multifuncional de 69 kDa e é responsável pela atividade de protease e helicase desempenhando um papel importante na replicação viral (Xu et al., 2005). A análise comparativa entre as sequencias dos genes NS3 do DENV3 proveniente da amostra 938 do estudo e a amostra depositada no GenBank “Dengue virus 3 isolate DENV3/BR/BID-V3460/2006”, mostrou 99% de identidade. A diferença das duas amostras é de dois nucleotídeos. Sendo uma na posição 1080 com modificação de uma citosina por uma timina, e a outra na posição 1315 com modificação de uma timina por uma citosina. Na primeira modificação de nucleotídeos o aminoácido resultante da amostra 938 é uma alanina e na amostra armazenada no GenBank é uma valina, na segunda modificação de nucleotídeos o aminoácido resultante é uma isoleucina tanto na amostra 938 do estudo quanto na amostra armazenada no GenBank, e a ocorrência dessa mudança de nucleotídeos sem causar mudança de aminoácidos é chamada de mutação silenciosa. A NS3 da amostra “Dengue virus 3 isolate DENV-3/BR/BID-V3460/2006” corresponde do nucleotídeo 4493 ao 6349 de todo o genoma do DENV3. A expressão da proteína NS3 foi o ponto de partida para a cristalografia e para consequente conhecimento de suas estruturas tridimensionais. As proteínas estruturais são bem estudadas, com várias estruturas conhecidas, já as informações sobre as proteínas não estruturais são bem limitadas. Apesar de muitas dessas proteínas que compõe o genoma viral do DENV já tenham estruturas conhecidas para o sorotipo 2 e 4 (DENV2 e 4), algumas 33 proteínas continuam sem estrutura conhecida para o sorotipo 3, que é o sorotipo envolvido nesse trabalho. Por meio da metodologia descrita nesse trabalho, a proteína NS3 foi expressa com êxito, com peso de 69 kDa, mas apresentou ser insolúvel. A solubilidade é característica essencial para desenvolver a cristalografia, que deve estar na forma solúvel. De acordo com a metodologia descrita por Xu e colaboradores (2005) foi possível purificar e cristalografar a proteína NS3 do DENV2 com o sobrenadante. A metodologia em questão utilizou como enzimas de restrição a NcoI e HindIII, o plasmídeo de expressão foi o pET32b e a célula foi Escherichia coli BL21-CodonPlus (Stratagene). Os clones foram cultivados a 37ºC em meio LB contendo 100µg/mL de ampicilina e 50µg/mL de cloranfenicol com densidade óptica de 600nm. A expressão da proteína foi induzida a 14ºC por adição de isopropil-D-tiogalacto piranósido (IPTG), com uma concentração final de 0,4mM. Depois de uma noite de crescimento as células foram colhidas por centrifugação a 8000g durante 10 minutos a 4ºC e armazenado a 20ºC (Xu et al., 2005). Outra metodologia para clonagem, expressão e purificação de proteínas solúveis foi desenvolvida por Dipankar e colaboradores (2009) para a proteína não estrutural NS1 do DENV1. A expressão utilizou o vetor pBM802, com células E. coli induzidas por arabinose a diversas concentrações e a que obteve melhor padrão de expressão foi com a concentração final de 0,2%. As temperaturas utilizadas foram de 24ºC, 30ºC e 37ºC, e o melhor resultado foi a 30ºC por período de 16 horas (Dipankar et al., 2009). Para que se tenha sucesso nas etapas posteriores a este projeto, devem-se testar novas metodologias para tornar a proteína NS3 solúvel, pois, a solubilidade de uma proteína é determinada por uma variedade de fatores como o vetor, o hospedeiro e as condições de expressão que podem ser usadas para aumentar ou diminuir a proporção de formas solúveis e insolúveis. Em geral, as condições que diminuem a taxa de síntese de proteínas, tais como temperaturas baixas ou de indução de crescimento em concentrações baixas de meio, tendem a aumentar a porcentagem de proteína na forma solúvel (pET System Manual, 2006). Comparando as três metodologias e tendo a temperatura de indução como um fator determinante para a solubilidade se observa que a temperatura utilizada neste trabalho foi de 37ºC enquanto que por Xu e colaboradores (2005) foi de 14ºC e por Dipankar e colaboradores (2009) foi de 30ºC. Assim, a sugestão seria diminuir a temperatura de expressão e testar novamente a solubilidade. Outras mudanças que podem ser feitas seriam a utilização de novos vetores de expressão, indução em diferentes tempos, além de variações da concentração do indutor. 34 Após a expressão e purificação da proteína NS3 o passo seguinte é realizar a cristalografia, ciência essa destinada a estudar sistemas biológicos através da determinação da estrutura tridimensional em nível atômico de importantes classes de moléculas biológicas, como proteínas, ácidos nucleicos e vírus. Devido ao fato de que as macromoléculas são extraídas de complexas misturas biológicas, tais como as células, a purificação é um passo importante para a cristalogênesis. Como regra geral, pode-se dizer que, a baixa pureza da molécula biológica é a causa mais comum da falta de sucesso na cristalização da mesma (Azevedo Júnior, 2004). Levando todos esses aspectos em consideração e observando que ao longo dos anos existem ocorrências de epidemias de DENV em todo o mundo, isto nos infere a necessidade de estudos que possam reverter essa situação. A técnica aplicada nesse projeto obteve com sucesso a expressão da proteína NS3 do DENV3 com características insolúveis sendo necessárias novas metodologias para obtenção da proteína NS3 solúvel. 35 Referências Bibliográficas AZEVEDO JÚNIOR, W.F. Refinamento cristalográfico de biomoléculas. São José do Rio Preto- SP, 2004. BASTOS, M. S. Simultaneous circulation of all four dengue serotypes in Manaus, State of Amazonas, Brazil in 2011. Rev. Soc. Bras. Med. Trop,. Uberaba, 45(3):393-394, may-jun, 2012. BRIAN, R. M.; STEPHEN, S. W. Immune Response to Dengue Virus and Prospects for a Vaccine, Laboratory of Infectious Diseases, National Institutes of Allergy and Infectious Diseases, Bethesda, Maryland 20892; January 5, 2011. COSTA, C. A.; SANTOS, I. G. C. e BARBOSA, M. G. Detecção e tipagem de vírus dengue em Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) na Cidade de Manaus, Estado do Amazonas. Rev. Soc. Bras. Med. Trop., Uberaba, v. 42, p. 677-681, nov-dez. 2009. COSTA, S.M.; et al. Induction of a Protective Response in Mice by the Dengue Virus NS3 Protein Using DNA Vaccines. PLOS ONE, California, 6(10): e25685. doi:10.1371/journal.pone.0025685, 2011. DALRYMPLE, N.A., MACKOW, E. R. Roles for Endothelial Cells in Dengue Virus Infection. Advances in Virology, Nova York, Volume 2012, Article ID 840654, 8 pages, doi:10.1155/2012/840654. 2012. DIPANKAR, D.; MONGKOLAUNGKOON, S.; MAVANUR, R. S. Super induction of dengue virus NS1 protein in E. coli. Elsevier, Canadá, p.66–72, 2009. DOS SANTOS, B. F. et al. First report of multiple lineages of dengue viruses type 1 in Rio de Janeiro, Brazil. J Virol.London, vol. 387, p. 1-4, 2011. GEBHARD, L. G.; KAUFMAN, S. B.; GAMARNIK, A. V. Novel ATP-Independent RNA Annealing Activity of the Dengue Virus NS3 Helicase. PLOS ONE, California, vol. 10, e. 36244, April 2012. 36 GUPTA, E.; MOHAN, S.; BAJPAI, M.; CHOUDHARY, A.; and SINGH, G. Circulation of Dengue virus-1 (DENV-1) serotype in Delhi, during 2010–11 after Dengue virus-3 (DENV-3) predominance: A single centre hospital-based study. J Vector Borne Dis, New Delhi, v.49, p. 82-85, Jun. 2012. IDRESS, S.; ASHFAQ, U.A. A brief review on dengue molecular virology, diagnosis, treatment and prevalence in Pakistan. Genetic Vaccines and Therapy, Pakistan, 10:6, 2012. MARTINS, V. E. P., et al. Occurrence of Natural Vertical Transmission of Dengue-2 and Dengue-3 Viruses in Aedes aegypti and Aedes albopictus in Fortaleza, Ceará, Brazil. PLOS ONE, California, vol. 7, e. 41386, Jul. 2012. Novagen.pET-28a-c(+) Vectors. Disponível em: http://ampliconexpress.com/vector_maps/pET28_map.pdf . Data de acesso: 5 de Outubro. 2012. pET System Manual. Novagen. 11th Edition, 2006. Promega.pGEM®-T Vector Map and Sequence Reference Points. Disponível em: http://www.promega.com/~/media/Files/Resources/Protocols/Technical%20Manuals/0/pGEM -T%20and%20pGEM-T%20Easy%20Vector%20Systems%20Protocol.pdf . Data de acesso: 5 de Outubro. 2012. SANTOS, N. S. O.; ROMANOS, M. T.V.; WIGG, M. D. Introdução à Virologia Humana. 2.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. TAUIL, P. L. Aspectos críticos do controle do dengue no Brasil. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, v. 18, p. 867-871, mai-jun. 2002. TEIXEIRA, M. G.; COSTA, M. C. N.; BARRETO, F.;BARRETO, M. L. Dengue: vinte e cinco anos da reemergência no Brasil. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, v. 25, p. S7-S18, 2009. 37 Xu T. et al. Structure of the Dengue Virus Helicase/Nucleoside Triphosphatase Catalytic Domain at a Resolution of 2.4 Å. Journal of virology, London, Vol. 79-Nº16, p. 10278– 10288, 2005. 38 Anexos Anexo I - Protocolo de coloração por violeta cristal: O produto de PCR deve ser inoculado no gel de agarose utilizando tampão de corrida na proporção de 1/6 , sendo que para cada 6µL de amostra colocar 1µL de tampão. Correr gel para eluir banda (usar pente mais grosso): 0,4 g de agarose + 40 mL TBE (Gel grande) 0,2 g de agarose + 20 mL TBE (Gel pequeno) Colocar 25µL (amostra + tampão) em cada poço: - Corar com violeta cristal por 30 minutos Reagentes: -1mL de violeta cristal -100mL de H2O destilada 39 Anexo II - Protocolo de ligação inserto+vetor Para a ligação entre inserto e vetor foram utilizadas as seguintes proporções: -pGEM-T Easy 2x buffer 2,5 µL pGEM-T 0,5µL DNA (NS3) 1,5µL T4 DNA Ligase 0,5µL -pET28a DNA 2,5µL (100ng) pTE28a 2µL (100ng) T4 ligase 1µL H20 4,5µL Após a adição de todos os reagentes no tubo eppendorf, este, é incubado overnight na geladeira. 40 Anexo III - Protocolo de Transformação 1) Limpar o fluxo com etanol 70%; 2) Ligar a luz UV, e deixar o cuveta 15 minutos dentro do fluxo (no gelo); 3) Colocar ±2µl da ligação no eppendorf com 50µl de células; 4) Com a mesma ponteira (mudar apenas a pipeta) passar os 52µL para a cuveta (entre os metais); 5) Dar um choque nas células no eletroporador (acima de 3,5 é bom, ideal: até 5,0); 6) Depois da eletroporação, colocar 800µL do meio SOB na cuveta (no eppendorf tem 1000µL do meio SOC), homogeneizando 3x com cuidado para não fazer bolhas. Pegar o que foi eletroporado e colocar no tubo q ainda tem 200 µL do meio SOC, resultandonos 1052µL. 7) Colocar no shaker por 1 hora a 37ºC com a agitação de 200 a 240 rpm. 41 AnexoIV - Protocolo para Reação de RCA do pET28a 1) 1µL DNA 2) 3µL dNTP 3) 3µL BSA 10x 4) 3µL tampão (NEB) 5) 3µL primer tioprotegido 6) 0,018 phi- DNA polimerase- phi 29 7) 16,82 H2O - total: 30 µL. Armazenar a 28°C a 30°C por 20 horas. 42 Anexo V- Protocolo de Precipitação com Etanol 1) 60µL de DNA 2) 6µL de NaOAc 3) 2µL Carrier 4) 150µL de etanol absoluto 1) Misturar bem invertendo o tubo, 2) Incubar no freezer -80ºC por 30 minutos 3) Centrifugar a uma velocidade máxima por 15 minutos 4) Descartar o sobrenadante 5) Adicionar 1 ml de etanol 70% (gelado) 6) Lavar o tubo invertendo devagar 7) Centrifugar com velocidade máxima por 5 minutos 8) Descartar o sobrenadante com a pipeta de 200µL. 43 Anexo VI - Protocolo para PAGE (Comassie blue e Western blotting) Gel concentrador 5% Gel separador 12% Para 2 géis: Gel Separador 12% 4,5mL de H2O 5mL de acrilamida 3,125mL de Tris HCl 1,5M (pH= 8,8) 125µL de SDS 10% 35µL de TEMED 150µL de APS Gel Concentrador 5% 3,5mL de H2O 650µL de acrilamida 1,25mL de Tris HCl 1,5M (pH= 6,8) 50µL de SDS 10% 30µL de TEMED 60µL de APS. 1)Montar os vidros das cubas SDS-PAGE. 2)Pegar as placas de vidro e montá-las no suporte. 3)Colocar no suporte com a borracha. 4)Testar com H2O destilada (verificar se está vazando). 5)Desprezar a H2O e secar com papel absorvente. 6)Fazer o gel separador de poliacrilamida e aplicar o gel separador e completar com álcool 70% (esperar polimerizar). 7)Desprezar o álcool 70% e secar o excesso de álcool com papel filtro. 8)Completar com o gel concentrador até o limite evitando bolhas e colocar o pente. 44 9)Colocar os géis na cuba (vidro menor para dentro) tampão Tris-glicina 1x que tem que entrar em contato com as amostras (entre os géis o tampão deve está novo e na cuba pode ser usado). 10)Completar com tampão. 11)Aplicar as amostras. 12)Aplicar 5µL de marcador de proteínas, e 10 µL das amostras. 13)Colocar a fonte em 150V. 14)Deixar correr até a amostra cair do gel. Comassie blue 1) Corar o gel com Comassie blue por 2 horas sob agitação. 2) Descorar em solução descorante por 20 minutos, por 2 x. (Colocar uma primeira vez por 20 minutos, desprezar a solução descorante lavar com H2O destilada, colocar nova solução e deixar por mais 20 minutos e lavar com H2O destilada). Western blotting 1) Cortar 4 papéis filtro e 1 membrana do tamanho aproximado do gel. 2) Mergulhar o gel, os 4 papéis filtro e a membrana no tampão de transferência por 10 minutos. Filtro Filtro Gel Separador Membrana Filtro Filtro 3) Colocar no Trans-Blot por 15 minutos a 15 V e 150 mA. 4) Colocar a membrana no tampão de bloqueio por 40 minutos 5) Escorrer o tampão de bloqueio e acrescentar 10 ml de PBS 1x e leite desnatado (concentração de 3%) e 2 µl de anticorpo primário (anti His-Tag IgG monoclonal). Incubar por 2 horas ou overnight na geladeira (concentração 1:5000). 6) Lavar 3x com PBS 1x Tween 0,1%. Cada lavagem deve ficar no agitador por 3 minutos. 7) Acrescentar 12 mL de tampão de bloqueio e mais 4µL de anticorpo secundário (antimouse IgG). (Concentração 1:3000). 45 8) Incubar sob agitação por 1hora. 9) Lavar com PBS 1x Tween 0,1% no agitador por 3 minutos. 10) Revelar com NBT e BCIP: 33µl BCIP 66 µl NBT 10 mL de tampão alcalino 11) Deixar sob agitação em recipiente protegido de luz, olhar imediatamente e só retirar a membrana quando as bandas forem visualizadas. 12) Após a revelação, parar a reação com H2O destilada. Reagentes para PAGE: SDS 2x 1,6ml de H2O destilada. 0,4ml de Tris-HCl 1M (pH-6,8) 0,32ml de glicerol 0,64 ml de SDS 10% 0,16ml de 2-ß mercaptoetanol Uma pitada de azul de bromofenol. Tris-glicina 1x 40 ml de Tris-glicina 5x 160 ml de H2O destilada. Tris-glicina 5x 151g de Tris 94g de glicina 900 ml de H2O 50 ml de SDS 10% ou 5g de SDS. Acrilamida-Bis 30% - pH 7,0 29g de acrilamida 1g de N_N- metilenoisoacrilamida (metilenobisacrilamida) 60 ml de H2O destilada 46 Reagentes para Comassie blue: Solução Descorante 60 ml de metanol 20 ml de ácido acético 120 ml de H2O destilada Reagentes para Western blotting: Tampão de Transferência 3,03g de Tris 14,4g de glicina 200mL de metanol 600mL de H2O destilada Tampão de Bloqueio 3g de leite desnatado 100mL de PBS 1x Tampão PBS 1x Tween 0,1% 100mL de PBS 1x 10µL de Tween 0,1% Tampão Alcalino – pH9,5 4,85g de Tris 2,34 NaCl 1mL MgCl2 2M
