Apoptose em Granulócitos da Medula Óssea Irradiada na Presença

Apoptose em Granulócitos da Medula Óssea
Irradiada na Presença e na Ausência de
Amifostina e Participação da via p53 / PUMA na
Sinalização do Processo
Segreto, HRC; Giordani, AJ; Addios, PC; Segreto, RA
Depto de Oncologia Clínica e Experimental
Setor de Radioterapia – UNIFESP
Apoio FAPESP
(aceito para publicação - Acta Histochemica, 2010)
Introdução
Medula Óssea
• Órgão crítico durante o tratamento Ca (RT/QT e RIT)
• SAR após exposições acidentais
• Radiação induz apoptose
p53 – sinalização da apoptose / reparo (retardo G1)
p53 - Morte / Sobrevivência ?
Introdução
Reparo: È concentração p53
Apoptose: Ç concentração p53/interação Proteínas
PUMA ((2001))
• p53 up-regulated modulator of apoptosis
b l 2 ativação
ti
ã caspase 9 e 3 após
ó llesão
ã DNA
• bcl-2,
Amifostina
• Bom radioprotetor para medula óssea
• Proteção diferencial entre tecido normal/tumor
Objetivo
Quantificar a apoptose em granulócitos da medula
óssea irradiada,, in vivo,, na p
presença
ç e na
ausência de amifostina e verificar a participação da
via p53/PUMA na sinalização do processo.
Material e Método
56 camundongos C57BL10 – 4 grupos – N = 14/grupo
GC (SF, IP), GAmi (400mg/kg Ami, IP), GI (SF+RT),
GAmi+I ((Ami 30min. antes RT))
Radiação 60Co, taxa de dose 1,69 Gy/min-1, dose
ú i 7 Gy,
G corpo inteiro
i t i
única
Sacrifício: 0,5, 1, 2 e 4h depois tratamento
Remoção dos fêmures com a medula óssea
Material e Método
Contagem apoptose em ocular histométrica – período
4h (N=20) – Giemsa – Mann Whitney (p<0,001)
Imuno-histoquímica
p53 p
p53 (Ser
(S 15), PUMA,
PUMA caspase
3 clivada
• p53,
p-p53
caspase-3-clivada
• Estreptovavidina peroxidase
• Controle com omissão do anticorpo primário
Resultados
250
Nºº de cél. em
m apoptose
e
195.4*
200
150
105*
100
50
13.6
15
GC
GAmi
0
GI
GAmi+I
4h após radiação
Número de células apoptóticas nos grupos: GC, GAmi, GI, GAmi+I, 4 horas depois da irradiação.
Os dados representam a média ± EP dos valores obtidos de 5 (N=5) animais por experimento *p≤ 0,05.
Resultados (IHQ)
Expressão da Proteína (granulócitos)
GC
GAmi
GI
GAmi+I
Caspase-3
p
clivada
-----
-----
cito:++/+++
cito:-
p53
-----
-----
nu,cito:++/+++
nu,cito: -/+
p-p53
-----
nu: ++/+++
nu: +++
nu: +/++
PUMA
nu,, cito: -/+
nu,, cito: -/+
nu,, cito: +++
nu,, cito: -/+
Conclusão
Amifostina
È Estatisticamente número de células apoptose
Ativação p53 granulócitos não irradiados
• Sensor redox – apoptose – célula transformada
• Não apoptose – células normais
Conclusão
A via p53/PUMA está
sinalização da apoptose.
apoptose
ativada
durante
Amifostina reduziu consideravelmente esta via
de sinalização.
Conclusão
Considerando o impacto da resposta dos granulócitos
para a sobrevivência de pacientes irradiados, o
conhecimento
h i
t de
d moléculas
lé l envolvidas
l id na sinalização
i li
ã
do stress radioinduzido nesta linhagem celular e o
papel de anti-oxidantes neste processo é desejável e
com potencial aplicação clínica.
clínica