Severina Denise Sales de Oliveira
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DA TERRA INSTITUTO DE QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Aplicação das técnicas eletroanalíticas (voltametria cíclica e de pulso diferencial) usando o eletrodo de diamante dopado com boro para o estudo da isoniazida, etambutol, rifampicina e pirazinamida Severina Denise Sales de Oliveira ________________________________________________________ Dissertação de Mestrado Natal/RN, julho de 2013 Severina Denise Sales de Oliveira Aplicação das Técnicas Eletroanalíticas (Voltametria Cíclica e de Pulso Diferencial) Usando o Eletrodo de Diamante Dopado com Boro para o Estudo da Isoniazida, Etambutol, Rifampicina e Pirazinamida Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Química da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Química. Orientador: Profº. Dr. Carlos Alberto MartinezHuitle Co-Orientador: Profº. Dr. Daniel de Lima Pontes Natal – RN 2013 , Isoniazida, Etambutol, Rifampicina, Pirazinamida, Voltametria de pulso diferencial. Divisão de Serviços Técnicos Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN Biblioteca Setorial do Instituto de Química Oliveira, Severina Denise Sales de Aplicação das Técnicas Eletroanalíticas (Voltametria Cíclica e de Pulso Diferencial) Usando o Eletrodo de Diamante Dopado com Boro para o Estudo da Isoniazida, Etambutol, Rifampicina e Pirazinamida / Severina Denise Sales de Oliveira. – Natal, RN, 2014. 128 f.: il. Orientador: Carlos Alberto Martinez-Huitle Co-Orientador : Daniel de Lima Pontes Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências Exatas e da Terra. Programa de Pós-Graduação em Química. 1. Voltametria de pulso diferencial – Dissertação. 2. Isoniazida – Dissertação. 3. Etambutol – Dissertação. 4. Rifampicina – Dissertação. 5. Pirazinamida – Dissertação. I. Martinez_Huitle, Carlos Alberto II. Pontes, Daniel de Lima. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UFRN/BSE-IQ CDU 543.552(043) Dedico este trabalho aos meus pais Maria José de Oliveira e Paulo Sales de Oliveira pelo apoio incondicional para que eu pudesse alcançar mais essa conquista. Obrigada pelos conselhos e incentivos, principalmente nos momentos mais difíceis. Aos professores Carlos e Daniel, que me ajudaram muito durante todo o processo pela busca do conhecimento, me incentivando e dizendo que sempre iria dá certo. Obrigada! AGRADECIMENTOS A Deus, Pai criador de todas as coisas, que sem a Sua vívida energia e força, eu nada seria. Ao Professor Dr. Carlos Alberto Martinez-Huitle pela oportunidade que me concedeu, acreditando nesse trabalho. Agradeço por sua orientação, incentivo e ensinamentos, que foram muito importantes para mim. Ao Professor Dr. Daniel de Lima Pontes por sua dedicação a esse trabalho, dando-me conselhos, apoio e tirando minhas dúvidas ao decorrer do trabalho. Aos meus pais por seus sacrifícios para que eu pudesse estar aqui, como também o carinho e compreensão por todo esse tempo. Obrigada por suas motivações, pois essa conquista também é de vocês. Ao meu primo Berg e sua esposa Jacimara por terem me abrigado em sua casa por todo esse tempo. Desde já agradeço muito por sua ajuda, pois sem ela, tudo isso não teria sido possível. Aos membros do Laboratório de Eletroanalítica e Sensores, principalmente a Danyelle Medeiros, Elisama, Jéssica, Elaine e Eliane do laboratório de Química Analítica e Meio Ambiente. Aos membros do Laboratório de Química de Coordenação e Polímeros por suas amizades. Aos meus grandes amigos Rusceli, Heloiza, Camila Lima, Luciane, Vanessa e Ulisandra por suas amizades e por nunca permitirem que eu desistisse ou me deixaram nos momentos mais difíceis. Ao Professor Dr. Francisco Ordelei Nascimento da Silva e a Professora Dra. Maria de Fátima Vitória de Moura por ceder os padrões farmacêuticos utilizados nos experimentos. Ao laboratório NU_PER que contribuiu com os resultados das análises. À Comissão de Apoio Pessoal do Ensino Superior CAPES pelo suporte financeiro, ao FINEP, CNPQ e PETROBRAS pelo suporte instrumental. À todas as pessoas que, direta ou indiretamente, colaboraram para execução desse trabalho. Muito Obrigada! Viver no mundo sem tomar consciência do significado do mundo é como vagar por uma imensa biblioteca sem tocar nos livros (Dan Brown). Duas coisas são infinitas: o universo e a estupidez humana, mas não estou tão certo a respeito do universo (Albert Einstein). RESUMO Neste trabalho foi feito um estudo eletroquímico utilizando a voltametria cíclica e voltametria de pulso diferencial para os fármacos isoniazida (INH), etambutol (EMB), rifampicina (RIF) e pirazinamida (PZA) usando o eletrodo de diamante dopado com boro (BDD) como eletrodo de trabalho. Foi também verificado a aplicabilidade da técnica de voltametria de pulso diferencial na quantificação dos princípios ativos usados no tratamento da tuberculose, posteriormente aplicando em amostras de formulação farmacêutica. Dentre os quatro princípios ativos estudados, a isoniazida apresentou os melhores resultados de detecção e quantificação com o uso da voltametria de pulso diferencial. Em pH 4 e pH 8, as curvas de calibração para a INH apresentaram boa linearidade, apresentando os limites de quantificação de 6,15 μmol L-1 (0,844 ppm) e 4,08 μmol L-1 (0,560 ppm), para os respectivos pH. O método proposto pode ser usado para a determinação de isoniazida em fármacos, pois foram obtidos valores de recuperação em torno de 100%. Palavras- chave: Voltametria de pulso Rifampicina. Pirazinamida. diferencial. Isoniazida. Etambutol. ABSTRACT In this work a study was done using electrochemical cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry for isoniazida (INH), ethambutol (EMB), rifampicina (RIF) and pyrazinamide (PZA) using the electrode boron-doped diamond (BDD) as working electrode. It also verified the applicability of the technique of differential pulse voltammetry in the quantification of the active compounds used in the treatment of tuberculosis, subsequently applying in samples of pharmaceutical formulation. Among the four active compounds studied, isoniazid showed the best results for the detection and quantification using differential pulse voltammetry. At pH 4 and pH 8, for the calibration curves to INH showed good linearity, with quantification limits of 6.15 mmol L-1 (0,844 ppm) and 4.08 mmol L-1 (0.560 ppm) for the respective pH. The proposed method can be used to determine drug isoniazid, for recovery values were obtained in approximately 100%. Key-words: Differential pulse voltammetry. Isoniazid. Ethambutol. Rifampicin. Pyrazinamide. LISTA DE FIGURAS Figura 01 – Tomografia de Raio X do tórax de um paciente doente ....... Figura 02 – Proposta de algoritmo da estratégia PAL para indivíduos com tosse.................................................................... Figura 03 – 26 29 Programa proposto pela ONU, após analisar os problemas mundiais: 8 Jeitos de Mudar o Mundo (nome chamado no Brasil).......................................................................... 31 Figura 04 – Série histórica da taxa de incidência da TB por ano, Brasil, 1990-2007.................................................................... 33 Figura 05 – Municípios segundo a taxa de incidência (por 100 mil habitantes) para a tuberculose ....................................... 34 Figura 06 – Estrutura Molecular da INH............................................. 36 Figura 07 – Estrutura Molecular do EMB .......................................... 40 Figura 08 – Estrutura Molecular da RIF ............................................ 43 Figura 09 – Estrutura Molecular da PZA ........................................... 46 Figura 10 – Sinais de excitação de tensão versus tempos empregados na voltametria............................................................... Figura 11 – 48 Potenciostato/Galvanostato modelo PGSTAT 302N da Autolab/Eco Chemie ..................................................... 59 Figura 12.a.I – Fluxograma do estudo realizado com a solução padrão de INH............................................................................. 60 Figura 12.a.II – Fluxograma do estudo realizado com a solução do comprimido, com ênfase na INH .................................... Figura 12.b – Fluxograma do estudo realizado com a solução padrão de EMB e da solução do comprimido ................................. Figura 12.c – 61 Fluxograma do estudo realizado com a solução padrão de rifampicina e da solução do comprimido ........................ Figura 12.d – 60 61 Fluxograma do estudo realizado com a solução padrão de pirazinamida ................................................................ 62 Figura 13 – Célula eletroquímica ..................................................... Figura 14 – Voltamograma cíclico da solução padrão de INH 1,92 x 10-3 64 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de BDD. Velocidade de varredura: 0,100 Vs-1........................ Figura 15 – 65 Voltamograma cíclico da solução padrão de INH 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de GC. Velocidade de varredura: 0,100 Vs-1 .......................... Figura 16 – 66 Voltamograma de pulso diferencial da solução padrão de INH 0,980 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de BDD. Modulação de amplitude: 0,050 V........................................................................ 68 Figura 17 – Voltamograma de pulso diferencial da solução padrão de INH 0,980 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de GC. Modulação de amplitude: 0,050 V ....................................................................... Figura 18 – 68 Voltamograma de pulso diferencial da solução padrão de INH 0,980 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 usando o eletrodo de (a) GC e (b) BDD. Modulação de amplitude: 0,050 V........................................................................ 69 Figura 19 – Voltamogramas cíclicos da solução padrão de INH 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl (a) pH 4. (b) pH 8. Velocidade: 0,100 V s-1 .................................................. 70 Figura 20 – Voltamogramas cíclicos da solução padrão de INH 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl (pH4), com a velocidade de varredura variando de 50 a 400 mV s-1 e o gráfico da relação de corrente vs. velocidade de varredura. .............. Figura 21 – 71 Gráfico da taxa de velocidade vs. área dos voltamogramas cíclicos da solução padrão de INH 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) ......................................................... Figura 22 – Gráfico da taxa de velocidade vs. área dos voltamogramas 72 cíclicos da solução padrão de INH 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl (pH 8) ........................................................ Figura 23 – 72 Voltamogramas cíclicos da solução padrão de INH em 0,1 mol L-1 KCl (pH4), com adição de a até e: 0,495, 0,980, 1,46, 1,92 e 2,38 x 10-3 mol L-1 de INH. Velocidade: 0,100 V s-1 ........................................................................... Figura 24 – 73 Voltamogramas de pulso diferencial da solução padrão de INH 0,980 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl: linha preta – pH 4; linha vermelha – pH 8. Modulação de amplitude: 0,050 V.. 74 Figura 25 – Voltamogramas de pulso diferencial de solução padrão de INH em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com adição de (a) 0 mol L-1; (b) 0,249 mmol L-1; (c) 0,495 mmol L-1; (d) 0,739 mmol L-1; (e) 0,980 mmol L-1; (f) 1,22 mmol L-1; (g) 1,46 mmol L-1; (h) 1,69 mmol L-1; (i) 1,92 mmol L-1 de INH. Modulação de amplitude: 0,050 V ....................................................... Figura 26 – Curvas de calibração das repetições das 75 medidas voltamétricas da solução padrão de INH em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 .......................................................................... Figura 27 – 75 Voltamogramas de pulso diferencial de solução padrão de INH em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com adição de (a) 0 mol L-1; (b) 0,249 mmol L-1; (c) 0,495 mmol L-1; (d) 0,739 mmol L-1; (e) 0,980 mmol L-1; (f) 1,22 mmol L-1; (g) 1,46 mmol L-1; (h) 1,69 mmol L-1; (i) 1,92 mmol L-1 de INH. Modulação de amplitude: 0,050 V ...................................................... Figura 28 – 77 Voltamogramas de pulso diferencial da solução de INH em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) usando o método de adição de padrão. (a) 800 μL da amostra sintética. (b) 0,122 mmol L-1 de solução padrão. (c) 0,244 mmol L-1 de solução padrão. (d) 0,365 mmol L-1 μL de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V ...................................................... Figura 29 – Voltamogramas de pulso diferencial da solução de INH em 79 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) em água deionizada usando o método de adição de padrão. (a) 800 μL da solução sintética. (b) 0,122 mmol L-1 de solução padrão. (c) 0,244 mmol L-1 de solução padrão. (d) 0,365 mmol L-1 de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V ........................ Figura 30 – 80 Voltamogramas de pulso diferencial da solução de INH em 0,1 mol L-1 KCl (pH 8) usando o método de adição de padrão. (a) 800 μL da amostra sintética. (b) 0,122 mmol L-1 de solução padrão. (c) 0,244 mmol L-1 de solução padrão. (d) 0,365 mmol L-1 de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V ........................................................ Figura 31 – 81 Curvas de calibração das quatro medidas obtidas durante um mês da solução padrão de INH 1,92 x10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 ........................................................... Figura 32 – 82 Voltamogramas de pulso diferencial do comprimido em 0,1 mol L-1 KCl (1) pH 4 e (2) pH 8. (a) e (b) RIF. (c) INH. Modulação de amplitude: 0,050 V.................................... Figura 33 – 84 Voltamogramas de pulso diferencial do comprimido em 0,1 mol L-1 KCl (pH 8) usando o método de adição da solução padrão da INH. (a) sem presença da solução padrão de INH. (b) 0,122 mmol L-1 de solução padrão. (c) 0,244 mmol L-1 de solução padrão. (d) 0,365 mmol L-1 de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V ........................ Figura 34 – 85 Voltamogramas de pulso diferencial da solução padrão de INH 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) juntamente com a curva analítica, (a) na ausência de RIF e com as concentrações de RIF de b até f: 0,308, 0,614, 0,916, 1,21 e 1,51 x 10-4 mol L-1. Modulação de amplitude: 0,050 V....... Figura 35 – Voltamogramas de pulso diferencial da solução padrão de RIF 1,21 x 10-4 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) juntamente com a curva analítica, (a) na ausência de INH e com 87 concentrações de INH de b até f: 0,495, 0,980, 1,46, 1,92 e 2,38 x 10-3 mol L-1. Modulação de amplitude: 0,050 V.......... Figura 36 – 88 Voltamograma de pulso diferencial das soluções padrão de INH 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl. (a) no início dos experimentos; (b) depois de seis meses; (c) novo padrão sólido. Modulação de amplitude: 0,050 V ........................ Figura 37 – 89 Voltamograma cíclico da solução padrão de EMB 1,92 x 103 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de BDD. Velocidade de varredura: 0,100 Vs-1 .................... 90 Figura 38 – Voltamograma de pulso diferencial da solução padrão de EMB 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de BDD. Modulação de amplitude: 0,050 V........................................................................ 91 Figura 39 – Voltamogramas de pulso diferencial de solução padrão de EMB em KCl 0,1 mol L-1 pH 4 com adição de (a) 0,249 mmol L-1; (b) 0,495 mmol L-1; (c) 0,739 mmol L-1; (d) 0,980 mmol L-1; (e) 1,22 mmol L-1; (f) 1,46 mmol L-1; (g) 1,69 mmol L-1; (h) 1,92 mmol L-1 de EMB. Modulação de amplitude: 0,050 V........................................................................ 92 Figura 40 – Voltamogramas de pulso diferencial de solução padrão de etambutol 0,05 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 8 com adição de (a) 0,249 mmol L-1; (b) 0,495 mmol L-1; (c) 0,739 mmol L1 ; (d) 0,980 mmol L-1; (e) 1,22 mmol L-1; (f) 1,46 mmol L-1; (g) 1,69 mmol L-1; (h) 1,92 mmol L-1 de EMB. Modulação de amplitude: 0,050 V......................................................... 93 Figura 41 – Voltamogramas de pulso diferencial da solução de EMB em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) usando o método de adição de padrão. (a) 800 μL da solução-amostra. (b) 0,122 mmol L-1 de solução padrão. (c) 0,244 mmol L-1 de solução padrão. (d) 0,365 mmol L-1 de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V ....................................................... 95 Figura 42 – Voltamogramas de pulso diferencial da solução de EMB em 0,1 mol L-1 KCl (pH 8) usando o método de adição de padrão. (a) 800 μL da solução-amostra. (b) 0,122 mmol L-1 de solução padrão. (c) 0,244 mmol L-1 de solução padrão. (d) 0,365 mmol L-1 de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V ....................................................... Figura 43 – Voltamogramas de pulso diferencial da amostra 96 do comprimido em 0,1 mol L-1 KCl (1) pH 4 e (2) pH 8. (a) e (b) RIF; (c) INH; (d) EMB. Modulação de amplitude: 0,050 V........................................................................ 97 Figura 44 – Voltamogramas de pulso diferencial do comprimido em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) usando o método de adição de padrão EMB. (a) sem presença de padrão EMB. (b) 0,122 mmol L-1 de solução padrão. (c) 0,244 mmol L-1 de solução padrão. (d) 0,365 mmol L-1 de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V ........................................................ Figura 45 – 98 Voltamograma cíclico da solução padrão de rifampicina 6,2 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 8 com eletrodo de trabalho de BDD. Velocidade de varredura: 0,100 Vs-1 ...... Figura 46 – 99 Voltamograma de pulso diferencial da solução padrão de rifampicina 6,2 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 8 com eletrodo de trabalho de BDD. Modulação de amplitude: 0,050 V ....................................................................... Figura 47 – 100 Voltamogramas de pulso diferencial de solução padrão de rifampicina 6,2 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 8 com adição de (a) 0,308 x 10-4 mol L-1; (b) 0,614 x 10-4 mol L-1; (c) 0,916 x 10-4 mol L-1; (d) 1,21 x 10-4 mol L-1; (e) 1,51 x 104 mol L-1; (f) 1,81 x 10-4 mol L-1; (g) 2,10 x 10-4 mol L-1; (h) 2,38 x 10-4 mol L-1. Juntamente com a curva analítica: pontos pretos – primeiro pico; pontos vermelhos – segundo pico. Modulação de amplitude: 0,050 V............................. 101 Figura 48 – Voltamograma de pulso diferencial da amostra de -1 comprimido em 0,1 mol L KCl pH 8. (a) RIF. Modulação de amplitude: 0,050 V........................................................ Figura 49 – 102 Voltamogramas de pulso diferencial do comprimido em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) usando o método de adição de padrão de RIF. Linha azul – sem presença de padrão RIF. Linha preta – 0,308 x 10-4 mol L-1 de solução padrão de RIF. Linha vermelha – 0,614 x 10-4 mol L-1 de solução padrão de RIF. Linha verde – 0,916 x 10-4 mol L-1 de solução padrão de RIF. Modulação de amplitude: 0,050 V.............................. 103 Figura 50 – Voltamograma cíclico da solução padrão de PZA 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de BDD. Velocidade de varredura: 0,100 Vs-1 .................... 104 Figura 51 – Voltamograma cíclico da solução padrão de PZA 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de GC. Velocidade de varredura: 0,100 Vs-1 .......................... Figura 52 – 105 Voltamograma de pulso diferencial da solução padrão de PZA 1,92 x 10-3mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de BDD. Modulação de amplitude: 0,050 V........................................................................ 106 Figura 53 – Curva analítica das adições de 0,980 a 11,5 x 10-3 mol L-1 de solução padrão de PZA em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 ........... Figura 54 – 107 Voltamogramas de pulso diferencial de solução padrão de pirazinamida 0,05 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com adição de (a) 0 mol L-1; (b) 0,249 mmol L-1; (c) 0,495 mmol L-1; (d) 0,739 mmol L-1; (e) 0,980 mmol L-1; (f) 1,22 mmol L-1; (g) 1,46 mmol L-1; (h) 1,69 mmol L-1; (i) 1,92 mmol L-1. Modulação de amplitude: 0,050 V.................................... 108 LISTA DE TABELAS Tabela 01 – Tuberculose: Estimativas e Notificações em 22 Países Prioritários e no Mundo / 2011 ............................................ 30 Tabela 02 – Parâmetros Para a Voltametria Cíclica ................................. 62 Tabela 03 – Parâmetros para a Voltametria de Pulso Diferencial .............. 63 Tabela 04 – Fatores de correlação linear das curvas de calibração obtidas para a INH em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 ..................................... Tabela 05 – Fatores de correlação linear das curvas de calibração obtidas para a INH em 0,1 mol L-1 KCl pH 8...................................... Tabela 06 – 95 Teste de Recuperação do EMB na solução de concentração conhecida em 0,1 mol L-1 KCl pH 8 ...................................... Tabela 15 – 93 Teste de Recuperação do EMB na solução de concentração conhecida em 0,1 mol L-1 KCl pH 4....................................... Tabela 14 – 92 Fatores de correlação linear das curvas de calibração obtidas para o EMB em 0,1 mol L-1 KCl pH 8 ................................... Tabela 13 – 85 Fatores de correlação linear das curvas de calibração obtidas para o EMB em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 ................................... Tabela 12 – 83 Teste de Recuperação da INH na amostra de comprimido em 0,1 mol L-1 KCl ................................................................. Tabela 11 – 81 Valores de Recuperação de INH na solução padrão durante um mês ........................................................................... Tabela 10 – 80 Teste de Recuperação da INH na solução de concentração conhecida em 0,1 mol L-1 KCl pH 8 ...................................... Tabela 09 – 79 Teste de Recuperação da INH na solução em 0,1 mol L-1 KCl pH4 em água deionizada ................................................... Tabela 08 – 77 Teste de Recuperação da INH na solução de concentração conhecida em 0,1 mol L-1 KCl pH 4....................................... Tabela 07 – 76 Teste de Recuperação do EMB na amostra de comprimido em 96 0,1 mol L-1 KCl ................................................................. 98 LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS ΔEp – Diferença de Potencial de Pico μA – Microampère μL - Microlitros ʋ - Velocidade de varredura (FcM)TMA – (ferrocetylmethyl)trimethylammonium A – Ampère AC – Acre AIDS – Adquired Immunodeficiency Syndrome AAS – Ácido Acetilsalicílico BDD – Bored Dopad Diamond (Diamante Dopado com Boro) C – Concentração CG – Glass Carbon (Carbono Vítreo) CTA – Comitê Técnico Assessor CV – Ciclic Voltammetry (Voltametria Cíclica) DOTS – Directly Observed Therapy, Short-course DPV – Differential Pulse Voltammetry (Voltametria de Pulso Diferencial) E – Potencial EMB – Etambutol Epa – Potencial de Pico Anódico Epc – Potencial de Pico Catódico EQM – Eletrodo Quimicamente Modificado HIV – Human immunodeficiency virus HPLC – High Performance Liquid Chromatography (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) i – Corrente ipa – Corrente de Pico Anódico ipc – Corrente de Pico Catódico INH – Isoniazida LD – Limite de Detecção LQ – Limite de Quantificação mA - Miliampère Me – Metil MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura MS – Ministério da Saúde ODM – Objetivos do Desenvolvimento do Milênio OMC – Ordered Mesoporous Carbon OMS – Organização Mundial da Saúde ONU – Organização das Nações Unidas PAL – Practical Approach to Lung Health pH – Potencial de Hidrogênio PNCT/MS – Programa Nacional de Controle da Tuberculose/Ministério da Saúde PVC - Cloreto de Polivinila PZA – Pirazinamida RIF – Rifampicina s – Desvio-padrão da Resposta S – Coeficiente Angular da Curva analítica SINAN – Sistema de Informação Nacional de Agravos de Notificação SNVS/RN – Sistema Nacional de Vigilância em Saúde no Rio Grande do Norte SVS – Secretaria de Vigilância Sanitária TB – Tuberculose TMAPO – 2,2,6,6-tetramethyl-4-acetylpiperidine-1-oxy V – Volts SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................... 23 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ............................................. 26 2.1 TUBERCULOSE................................................................... 26 2.1.1 Tuberculose no Brasil ........................................................ 32 2.1.2 Tuberculose no Rio Grande Do Norte .................................. 34 2.2 TRATAMENTO DA TUBERCULOSE ...................................... 35 2.2.1 Tuberculostáticos de primeira escolha ................................ 36 2.2.1.1 Isoniazida ........................................................................... 36 2.2.1.1.1 Mecanismo de ação ............................................................ 38 2.2.1.1.2 Farmacocinética ................................................................. 39 2.2.1.2 Etambutol ........................................................................... 39 2.2.1.2.1 Mecanismo de ação ............................................................ 41 2.2.1.2.2 Farmacocinética ................................................................ 42 2.2.1.3 Rifampicina ......................................................................... 42 2.2.1.3.1 Mecanismo de ação ............................................................ 44 2.2.1.3.2 Farmacocinética ................................................................ 44 2.2.1.4 Pirazinamida ....................................................................... 45 2.2.1.4.1 Mecanismo de ação ............................................................ 46 2.2.1.4.2 Farmacocinética ................................................................ 47 2.3 ELETROANALÍTICA ............................................................. 47 2.3.1 Voltametria ........................................................................ 47 2.3.1.1 Voltametria de pulso diferencial .............................................. 48 2.3.1.2 Voltametria cíclica ................................................................ 49 2.4 ELETRODOS DE TRABALHO ............................................... 50 2.4.1 Diamante dopado com boro ................................................ 51 2.4.2 Carbono vítreo ................................................................... 54 3 OBJETIVOS ....................................................................... 56 3.1 OBJETIVO GERAL .............................................................. 56 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................. 56 4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL ...................................... 57 4.1 MATERIAL ......................................................................... 57 4.1.1 Reagentes ......................................................................... 57 4.1.2 Soluções utilizadas ............................................................ 57 4.1.2.1 Solução de limpeza .............................................................. 57 4.1.2.2 Eletrólitos ........................................................................... 57 4.1.2.3 Soluções padrões ................................................................ 58 4.1.2.4 Amostra do comprimido ........................................................ 59 4.2 EQUIPAMENTOS E SISTEMA DE ELETRODOS ...................... 59 4.2.1 Medidas voltamétricas ........................................................ 59 4.2.2 Sistema de eletrodos .......................................................... 63 4.2.3 Célula eletroquímica ........................................................... 64 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................... 65 5.1 ISONIAZIDA ....................................................................... 65 5.1.1 Perfil eletroquímico ............................................................ 65 5.1.2 Voltametria de pulso diferencial .......................................... 73 5.1.2.1 Curva analítica em pH 4 ........................................................ 74 5.1.2.2 Curva analítica em pH 8 ........................................................ 76 5.1.3 Determinação de INH em solução de concentração conhecida .......................................................................... 78 5.1.3.1 Amostra sintética em pH 4 ..................................................... 78 5.1.3.2 Amostra sintética em pH 8 ..................................................... 80 5.1.4 Estabilidade da INH ............................................................ 82 5.1.5 Determinação da INH em comprimidos ................................ 83 5.1.6 Interferentes ...................................................................... 87 5.1.7 Degradação da INH ............................................................. 89 5.2 ETAMBUTOL ...................................................................... 90 5.2.1 Perfil eletroquímico ............................................................ 90 5.2.2 Voltametria de pulso diferencial .......................................... 91 5.2.2.1 Curva analítica em pH 4 ........................................................ 91 5.2.2.2 Curva analítica em pH 8 ........................................................ 92 5.2.3 Determinação de EMB em solução de concentração conhecida .......................................................................... 94 5.2.3.1 Solução em pH 4 ................................................................. 94 5.2.3.2 Solução em pH 8 ................................................................. 95 5.2.4 Determinação de EMB em comprimidos ............................... 97 5.3 Rifampicina ......................................................................... 99 5.3.1 Perfil eletroquímico ............................................................ 99 5.3.2 Voltametria de pulso diferencial .......................................... 101 5.3.2.1 Curva analítica em pH 8 ........................................................ 101 5.3.3 Determinação de RIF em comprimidos ................................. 102 5.4 Pirazinamida ....................................................................... 104 5.4.1 Perfil eletroquímico ............................................................ 104 5.4.2 Determinação da faixa de concentração ............................... 106 5.4.3 Comportamento da pirazinamida em pH 8 ............................ 108 6 CONCLUSÕES ................................................................... 110 7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS......................... 112 REFERÊNCIAS ................................................................... 113 APÊNDICE I ....................................................................... 128 23 1 INTRODUÇÃO A tuberculose (TB) é uma das principais causas de mortes no mundo e continua sendo um grave problema de saúde publica, especialmente em países em desenvolvimento, ocupando um papel de destaque entre as principais doenças contagiosas. Ela está associada às populações com piores condições socioeconômicas. Nos últimos anos teve sua situação agravada pela epidemia da AIDS, causando situações desesperadoras, principalmente nos países da África (HIJJAR et al., 2006). A tuberculose está cada vez mais difícil de ser diagnosticada devido à alta incidência de resultados negativos nos testes de expectoração (ASIF, 2012). Outra dificuldade é o tratamento da doença devido a alguns fatores como: resistência bacteriológica, interação das drogas com o organismo causando efeitos colaterais e interrupção ou abandono do tratamento por parte do paciente. Os fármacos utilizados no tratamento da tuberculose podem ser divididos em duas categorias: os de primeira linha, que tem o maior índice de eficiência; e os de segunda linha, quando há resistência microbiana em relação aos fármacos da primeira linha. Ainda há estudos de novas drogas antituberculostática como nitroimidazol (PA – 824, OPC – 67783 e GCI – 17341), imidazol e análogos, diarilquinolina, purina, tiolactomicina, mefloquina e outras (ASIF, 2012). Entre os fármacos de primeira linha se destacam a isoniazida, etambutol, rifampicina e pirazinamida. A isoniazida é bacteriostática para os bacilos “em repouso”, tendo também atividade bactericida para os microrganismos em rápida divisão. O etambutol suprime o crescimento da maioria dos bacilos resistentes à isoniazida e à estreptomicina. A rifampicina inibe o crescimento da maioria das bactérias gram-positivas e de muitos microrganismos gram-negativos. A pirazinamida destrói os bacilos da tuberculose no interior dos macrófagos (MANDELL; PETRI-JR., 1996). O sistema de tratamento, no Brasil, para TB, recomendado pelo Programa Nacional de Controle da Tuberculose/Ministério da Saúde (PNCT/MS) desde 1979, com a introdução da Rifampicina e unificações de ações, está sendo modificado. As principais mudanças propostas pelo Comitê Técnico Assessor (CTA) do PNCT/MS são: introduzir um quarto fármaco, o Etambutol, na fase de ataque (esquema 24 2RHZE/4RH), onde R = rifampicina, H = isoniazida, Z = pirazinamida e E = etambutol; adotar a associação dos fármacos em forma de comprimidos, com doses fixas combinadas 4 em 1 (RHZE), para a fase de tratamento intensivo, e 2 em 1 (RH), para fase de continuação; utilizar formulações de comprimidos em substituição às cápsulas anteriormente disponíveis; adequar as doses de isoniazida e pirazinamida em adultos para 300 mg/dia e 1.600 mg/dia, respectivamente (Conde et al, 2009). Os comprimidos do combinado farmacêutico utilizados atualmente para o tratamento da TB são produzidos por Svizera Labs Pvt.. Ltd., apresentando as seguintes proporções: 0,150 g de rifampicina, 0,075 g de isoniazida, 0,400 g de pirazinamida e 0,275 g de etambutol. As determinações dos fármacos são obtidas através de muitas técnicas analíticas como eletroforese capilar, espectroscopia de absorção molecular na região do visível e UV, espectrofluorimetria na região do UV, quimiluminescência por injeção em fluxo, colorimetria, titrimetria, oxidimetria, cromatográfica líquida de alta eficiência (HPLC) e cromatografia líquida de camada delgada. As técnicas eletroanalíticas apresentam características experimentais que as tornam de grande importância na quantificação de fármacos, como por exemplo, alta sensibilidade, baixo volume de amostra (LOMILLO et al., 2001), simplicidade, rapidez de análise e baixo custo (SIANGPROH et al, 2011). Dentre essas técnicas se destacam a polarografia de pulso diferencial e voltametria com diferentes eletrodos como íon seletivo, ouro, carbono vítreo, polihistidina, pasta de carbono, eletrodo de gotejamento de mercúrio, eletrodos modificados, entre outros eletrodos. Na literatura são encontrados poucos trabalhos utilizando as técnicas eletroanalíticas para a determinação desses fármacos. Para a isoniazida, por exemplo, não foram encontrados trabalhos utilizando eletrodo de diamante dopado com boro ou carbono vítreo. O eletrodo de diamante dopado com boro (BDD) é um material inovador, emergindo como um eletrodo alternativo devido à sua inegável boa condutividade elétrica, baixa capacitância de dupla camada, ampla janela de potencial eletroquímico e de biocompatibilidade (SZUNERITS et al., 2012). 25 O eletrodo de carbono vítreo (GC) é muito popular por causa de suas excelentes propriedades mecânicas e elétricas, ampla janela de potencial, inércia química e desempenho reprodutível (WANG, 2006). Neste trabalho foi feito um estudo eletroquímico utilizando a voltametria cíclica e voltametria de pulso diferencial para os fármacos isoniazida, etambutol, rifampicina e pirazinamida usando o eletrodo de diamante dopado com boro como eletrodo de trabalho, e para perfis eletroquímicos para a isoniazida e pirazinamida também foi utilizado o eletrodo de carbono vítreo como eletrodo de trabalho. Além disso, foi verificado a aplicabilidade da técnica de voltametria de pulso diferencial na quantificação dos princípios ativos usados no tratamento da tuberculose, posteriormente aplicando em amostras de formulação farmacêutica. Esse trabalho mostrou-se necessário para que futuramente possa procurar-se um sensor que seja utilizado na vida cotidiana do paciente, podendo ajudar de forma efetiva durante o tratamento. 26 2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1 TUBERCULOSE A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa causada pelo Mycobacterium tuberculosis ou bacilo de Koch, em homenagem ao bacteriologista alemão Robert Koch, descobridor da bactéria (ARAGUAIA, 2012). A transmissão é direta, ocorre via gotículas de saliva contendo o agente infeccioso e tem maior risco de transmissão durante contatos prolongados em ambientes fechados e pouca ventilação. Alguns pacientes podem não apresentar os sintomas ou podem confundir os sintomas com os da gripe. Tosse seca e contínua se apresentando posteriormente com secreção e com duração de mais de quatro semanas, sudorese noturna, cansaço excessivo, palidez, falta de apetite e rouquidão são os sintomas da doença. Na Figura 01 é apresentando uma tomografia de raio X de um paciente doente, onde pode ser observado que o pulmão esquerdo (mais escuro) está normal e o pulmão direito (mais claro) apresenta-se lesionado. Figura 01 – Tomografia de Raio X do tórax de um paciente doente Fonte: www.brasilescola.com Embora a tuberculose seja uma doença antiga e mundialmente conhecida, ela ainda é tratada de forma negligenciada. A grave situação mundial da tuberculose está intimamente ligada ao aumento da pobreza, à má distribuição de renda e à urbanização acelerada (HIJJAR et al., 2001). O quadro do desenvolvimento dessa doença é tão preocupante que a Organização Mundial da Saúde (OMS), a partir de 1993, decretou a tuberculose como uma emergência mundial. Porém, isso não foi suficiente, pois o tratamento muitas vezes não é disponibilizado para a população necessitada. 27 Provavelmente a tuberculose vem acometendo a humanidade há mais de 5000 anos. Desde a antiguidade, a maior informação que se tem sobre as vítimas de tuberculose é relativa às camadas sociais mais altas. Como o Egito, por exemplo, quase tudo o que se sabe da tuberculose refere-se aos faraós e altos sacerdotes. A primeira evidência mais segura de tuberculose foi constatada em 44 múmias bem preservadas, datando de 3.700 a 1000 a.C., em Tebas (ROSEMBERG, 1999). A primeira múmia plebeia com tuberculose foi identificada em uma índia do Peru, com técnicas de biologia molecular. A datação constatou que a índia viveu há 1.100 a.C.; é o primeiro diagnóstico bacteriológico de certeza em múmia milenar, comprovando a existência da tuberculose na América, na era pré-colombiana (ROSEMBERG, 1999). Em toda a história das conquistas territoriais, das colonizações, onde o homem civilizado chegou, levou também o bacilo da tuberculose, contaminando os nativos, os quais, sem defesas imunitárias, tiveram grandes contingentes dizimados. No Brasil não há evidência de que ela existisse entre os índios antes da invasão de Portugal, em 1500. Na colonização do Brasil vieram jesuítas e colonos, na maioria tuberculosos, que foram atraídos pelos benefícios do clima ameno (ROSEMBERG, 1999). Dos últimos séculos, tem-se mais dados sobre os dramas dos indivíduos das classes sociais mais altas. Enquanto que sobre as multidões populares, muitas vezes viviam em condições abaixo da dignidade humana, quase nada foi escrito. Grande quantidade de tuberculosos existiram, na idade média, por quase toda a Europa. Nessa época, os monarcas cristãos ficaram com o objetivo de curar as pessoas através da superstição religiosa. Nessa fase medieval, havia multidões de tuberculosos, com formas muito grave da doença (ROSEMBERG, 1999). Entre o final do século 18 e o início do século 19, ocorreu a revolução industrial na Inglaterra, estendendo-se pela Europa. Multidões operárias concentraram-se nos maiores centros urbanos. Sua maioria vivia em condições precárias, amontoados em cortiços, subalimentados, trabalhando 15 horas ou mais por dia, foram vitimados pela tuberculose, cuja mortalidade chegou a atingir 1.100 por 100.000 pessoas em Londres (ROSEMBERG, 1999). Em meados do século 19, operaram-se em Paris grandes reformas urbanas, promovidas pelo governo de Napoleão Bonaparte. A cidade foi embelezada com 28 imensos jardins e largas avenidas. Mas multidões de trabalhadores pobres foram jogadas para a periferia nas piores condições imagináveis, em cortiços improvisados, geralmente com uma única privada, sem esgoto para mais de 100 pessoas. Com essa realidade, os óbitos por tuberculose atingiam 80% da mortalidade geral. Na segunda metade do século 19, a mortalidade tuberculosa nas capitais europeias ia de 400 a 600 por 100 mil, atingindo a 30% da mortalidade geral (ROSEMBERG, 1999). Na primeira guerra mundial (1914-18), na França e na Alemanha, contraíram tuberculose ativa 80000 e 50000 combatentes, respectivamente. Muitos perambulavam pelas ruas porque não havia mínimas condições de hospitalização. Na década dos anos 1990, morreram de tuberculose no mundo de 30 a 35 milhões de pessoas, na sua maioria pessoas que não tinham acesso à quimioterapia, sendo que quase todas as mortes foram nos países em desenvolvimento (98,8%) (ROSEMBERG, 1999). Em 1993, a Organização Mundial da Saúde (OMS) declarou a TB como uma emergência global e lançou a estratégia DOTS (Directly Observed Therapy, Shortcourse), como a forma mais eficaz e de melhor custo-benefício de controle da doença em nível mundial (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2006). A estratégia DOTS foi aperfeiçoada sendo chamada de PAL (Practical Approach to Lung Health). Essa estratégia visa fortalecer o sistema de saúde através de conexão entre as atividades de controle da TB e dos serviços de saúde. Como o sintoma mais comum na TB pulmonar é a tosse, para fins de busca de casos, serão considerados casos do sintomático respiratório todos os indivíduos com tosse. Na Figura 02, está apresentada uma proposta de algoritmo da estratégia PAL. 29 Figura 02 – Proposta de algoritmo da estratégia PAL para indivíduos com tosse. Adaptado da Organização Mundial de Saúde. Fonte: CONDE et al., 2009. A OMS priorizou 22 países onde se concentram 80% dos casos estimados. Segundo dados da OMS coletados em 2011 e divulgados em 2012, os países que têm maiores números de casos estimados, em ordem decrescente, são: Índia, China, África do Sul, Indonésia, Paquistão, Bangladesh, Filipinas, Etiópia, Nigéria, Mianmar, Vietnã, Rússia, Moçambique, Congo, Quênia, Tailândia, Brasil, Tanzânia, Zimbábue, Uganda, Afeganistão, e Camboja. A África do Sul tem a maior taxa de incidência da doença. Embora o Brasil esteja em 17º lugar, ele apresenta a menor taxa de incidência entre os 22 países – de 42/100.000 habitantes (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2012). 30 Tabela 01 – Tuberculose: Estimativas e Notificações em 22 Países Prioritários e no Mundo / 2011 População do País Casos estimados Número de casos Por 100.000 Hab. 1. Índia 1.241.492.000 2.200.000 181 (16)* 2. China 1.347.565.000 1.000.000 75 (21) 3. África do Sul 50.460.000 500.000 993 (1) 4. Indonésia 242.326.000 450.000 187 (15) 5. Paquistão 176.745.000 410.000 231 (10) 6.Bangladesh 150.494.000 340.000 225 (11) 7. Filipinas 94.852.000 260.000 270 (8) 8. Etiópia 84.734.000 220.000 258 (9) 9. Nigéria 162.471.000 190.000 118 (19) 10. Mianmar 48.337.000 180.000 381 (5) 11. Vietnã 88.792.000 180.000 199 (12) 12. Rússia 142.836.000 140.000 97 (20) 13. Moçambique 23.930.000 130.000 548 (3) 14. Congo 67.758.000 120.000 327 (6) 15. Quênia 41.610.000 120.000 288 (7) 16. Tailândia 69.519.000 86.000 124 (16) 17. Brasil 196.655.000 83.000 42 (22) 18. Tanzânia 46.218.000 78.000 169 (17) 19. Zimbábue 12.754.000 77.000 603 (2) 20. Uganda 34.509.000 67.000 193 (13) 21. Afeganistão 32.358.000 61.000 189 (14) 22. Camboja 14.305.000 61.000 424 (4) 4.370.719.000 7.100.000 6.122 PAÍS TOTAL Prioritários GLOBAL 6.947.687.000 8.700.000 (*) Ranking entre os 22 países Fonte: OMS, 2012 – Controle Global da Tuberculose. Nas Américas, o Brasil é o país que mais notifica casos – cerca de 83 mil novos casos anuais. O Brasil e o Peru contribuem com 50% de todos os casos da região. Segundo dados informados pela OMS, em 2010 foram diagnosticados e notificados 6,2 milhões de casos de tuberculose no mundo, sendo 5,4 milhões de casos novos, equivalentes a 65% dos casos estimados para o mesmo ano (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2012). 31 No ano de 2000, a Organização das Nações Unidas (ONU), ao analisar os maiores problemas mundiais, estabeleceu-se oito Objetivos de Desenvolvimento do Milênio (ODM), que no Brasil são chamados de Oito Jeitos de Mudar o Mundo (Figura 3). A tuberculose está contemplada no 6º objetivo intitulado: combater a aids, a malária e outras doenças (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2012). Figura 03 – Programa proposto pela ONU, após analisar os problemas mundiais: 8 Jeitos de Mudar o Mundo (nome chamado no Brasil). Adaptado de www.objetivosdomilenio.org.br. O Plano Global para o Combate da Tuberculose 2011-2015 (The Global Plan to Stop Tuberculosis 2011-2015) proposto pela OMS tem como visão livrar o mundo da tuberculose. Seu objetivo é reduzir drasticamente a carga da doença até 2015, de acordo com o que foi pactuado nos ODM. O plano está dividido em seis componentes: expandir a estratégia DOTS com qualidade; visar a existência da combinação de TB/HIV e as necessidades de populações pobres e vulneráveis; fortalecer o sistema de saúde baseado na atenção primária; ajudar as pessoas com tuberculose e a sociedade civil organizada; envolver todos os prestadores de serviços de saúde; e possibilitar e promover pesquisas (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2012). O Plano ainda apresenta, como principais metas: reduzir, pela metade, a incidência e a mortalidade por tuberculose até 2015, comparados aos valores de 1990, e eliminar a tuberculose como problema de saúde pública até 2050. 32 Novos casos de TB vêm caindo há vários anos e a taxa de novos casos caiu 2,2% entre 2010 e 2011. Dessa forma, as metas globais para a redução de casos de tuberculose e de mortes causadas pela doença continuam. A taxa de mortalidade diminuiu 41% desde 1990 e o mundo está no caminho certo para atingir a meta global de diminuição de 50% dos casos até 2015. No entanto, o número de casos no mundo ainda é enorme. Em 2011, estima-se que teve 8,7 milhões de novos casos de TB no mundo (13% ocorrendo juntamente com HIV) e 1,4 milhões de mortes (incluindo os casos com HIV). O que pode ser observado também, é que o processo global esconde as variações regionais: as regiões africanas e europeias não estão tendo bons resultados que demonstram que vão atingir a meta de reduzir à metade a taxa de mortalidade causada pela TB até 2015 (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2012). Apesar de apresentar uma alta taxa de mortalidade, o acesso ao tratamento aumentou substancialmente. Desde a metade da década de 90, com a implantação da estratégia PAL, 51 milhões de pessoas teve sucesso no tratamento contra a TB, salvando mais 20 milhões de vidas. Embora os estudos para o tratamento para as pessoas que desenvolveram a tuberculose multi-resistente aos medicamentos utilizados na quimioterapia ainda continua lento, há pesquisas para o desenvolvimento de novas drogas e vacinas. Novos ou readaptações dos medicamentos contra a tuberculose e novos regimes de TB para tratar tuberculose multi-resistente estão avançando em ensaios clínicos e revisão regulamentar. Onze vacinas para prevenir a TB estão sendo estudadas através de estágios de desenvolvimento (ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE, 2012). 2.1.1 Tuberculose no Brasil A TB é provavelmente a doença infecto-contagiosa que mais mortes ocasiona no Brasil (VARELLA, 2012). A tuberculose tem relação direta com a miséria e a exclusão social. No Brasil, a TB afeta principalmente as periferias urbanas e está associada, geralmente, às más condições de moradia e alimentação, à falta de saneamento básico, ao abuso das drogas e do álcool, tabaco e outros. Apesar do Brasil ainda ser um dos 22 países responsáveis por 80% dos casos de tuberculose no mundo, até o ano de 2007, houve uma diminuição de 26% 33 na incidência e 32% na mortalidade por TB (CONDE et al., 2009). Essa queda se tornou expressiva a partir de 1999 com a implantação da estratégia DOTS. A taxa de incidência da TB durante o período de 1990 a 2007 no Brasil está apresentada na Figura 04. Figura 04 – Série histórica da taxa de incidência da TB por ano, Brasil, 1990-2007 Fonte: CONDE et al., 2009 Em 2006, a taxa de incidência da TB por regiões variou de aproximadamente 30 casos/100.000 habitantes nas regiões sul e centro-oeste para aproximadamente 50 casos/100.000 habitantes nas regiões norte, nordeste e sudeste. De acordo com o MS, a incidência concomitante da TB/HIV ocorreu em 6,2% dos casos, com os estados do RS, SC e SP apresentando os maiores percentuais, e AC e RR com os menores percentuais. O percentual de cura e abandono em 2006 foi, respectivamente, de 73% e 9% para os casos novos e de 57% e 14% para os casos HIV positivos. Adicionalmente, houve uma queda de 31% na taxa de mortalidade por 100.000 habitantes de 1990 para 2006. De acordo com dados do MS, em 2006, a maior taxa de mortalidade foi na região Nordeste, seguida pela região Sudeste (CONDE et al., 2009). Em 2011, a taxa de incidência da TB no Brasil caiu para 36,0 casos para cada grupo de 100 mil habitantes em relação ao ano de 2000, que era de 42,8 casos para 34 cada grupo de 100 mil habitantes. Isso significa uma queda de 15,9 pontos percentuais na última década (SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE, 2012). 2.1.2 Tuberculose no Rio Grande Do Norte O plano emergencial de controle da TB foi implantado no estado do Rio Grande do Norte em 2000, tendo suas ações direcionadas à 6 dos 167 municípios que detém 77% do total dos casos (SECRETARIA ESTADUAL DE SAÚDE PÚBLICA/RN, 2008). O estado notifica anualmente cerca de 1.300 casos a cada ano com 45 óbitos, 4,5% dos casos registrados. Em 2004, foram registrados no Sistema de Informação de Agravos de Notificação (SINAN) 1.342 novos casos, representando 71,2% dos casos esperados. A taxa de incidência foi de 46,6 a cada grupo de 100 mil habitantes (SECRETARIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA, 2006). Aproximadamente 50% dessa demanda são pacientes residentes em Natal. A Figura 05 apresenta os municípios do estado do Rio Grande do Norte segundo sua incidência. Figura 05 – Municípios segundo a taxa de incidência (por 100 mil habitantes) para a tuberculose Fonte: SNVS/RN, 2006 35 2.2 TRATAMENTO DA TUBERCULOSE Os fármacos utilizados no tratamento da tuberculose podem ser divididos em duas grandes categorias: agentes de primeira linha e segunda linha. Os fármacos de primeira linha, ou primeira escolha, associam o seu maior nível de eficácia a um grau aceitável de toxicidade. Nestes incluem a pirazinamida, etambutol, rifampicina, isoniazida e estreptomicina. A grande maioria dos pacientes com tuberculose pode ser tratada com sucesso. Para obter excelentes resultados no tratamento, tem-se um tratamento de duração de 6 meses; nos dois primeiros meses administra-se isoniazida, rifampicina e pirazinamida, seguidas de isoniazida e rifampicina durante quatro meses (CONDE et al., 2009). Todavia, em certas ocasiões, devido à resistência microbiana, pode ser necessário recorrer a fármacos de segunda linha, ou segunda escolha, de modo que o tratamento pode ser iniciado com 5-6 fármacos. Essa categoria inclui o ofloxacino, ciprofloxacino, etionamida, ácido aminosalicílico, cicloserina, amicacina, canamicina e capreomicina. Nos pacientes com HIV que estejam utilizando inibidores da protease e/ou inibidores não-nucleosídeos da transcriptase reversa, as interações farmacológicas com as rifamicinas (rifampicina, rifapentina, rifabutina) representam um problema importante. Uma vez que esses inibidores interagem com as rifamicinas, diminuindo a potência da terapia contra AIDS, aumentando o risco da resistência do HIV ao tratamento. O sistema de tratamento, no Brasil, para TB recomendado pelo Programa Nacional de Controle da Tuberculose/Ministério da Saúde (PNCT/MS) desde 1979, com a introdução da rifampicina e unificações de ações, está sofrendo modificações. As principais mudanças propostas pelo Comitê Técnico Assessor (CTA) do PNCT/MS são: introduzir um quarto fármaco, o etambutol, na fase de ataque (esquema 2RIF, INH, PZA, EMB/4RIF, INH); adotar a associação dos fármacos em forma de comprimidos, com doses fixas combinadas 4 em 1 (RIF, INH, PZA, EMB), para a fase de tratamento intensivo, e 2 em 1 (RIF, INH), para fase de continuação; utilizar formulações de comprimidos em substituição às cápsulas anteriormente disponíveis; adequar as doses de isoniazida e pirazinamida em adultos para 300 mg/dia e 1.600 mg/dia, respectivamente (CONDE et al., 2009). 36 2.2.1 Tuberculostáticos de primeira escolha 2.2.1.1 Isoniazida A isoniazida (INH) é um pró-farmaco que continua sendo o principal agente para a quimioterapia da TB. A enzima catalase-peroxidase micobacteriana converte a isoniazida em um metabólito ativo que age inibindo a síntese do ácido micólico, peculiar na formação da parede celular do bacilo (JUNIOR, 2004). A INH, cuja fórmula estrutural é apresentada na Figura 06, tem fórmula química C6H7N3O, com a massa molecular de 137,14 g/mol e o nome oficial é 4-hidrazida ácida piridincarboxílica. Figura 06 – Estrutura Molecular da INH CONHNH 2 N Fonte: AUTOR, 2013 A INH é a hidrazida do ácido isonicotínico, descoberta em 1945 por Chorine (MANDELL; PETRI-JR., 1996). Apresenta-se como um pó cristalino branco, solúvel em água, ligeiramente solúvel em etanol e clorofórmio e praticamente insolúvel em éter etílico e benzeno. Apresenta três pKa de 2,0, 3,9 e 11,2 (este correspondente à hidrazina). A INH é bacteriostática para os bacilos “em repouso”, mas tem atividade bactericida para os microrganismos em rápida divisão. O fármaco é notavelmente seletivo para as micobactérias. Penetra facilmente nas células e mostra-se igualmente eficaz contra bacilos que crescem no interior das células. O mecanismo mais comum de resistência à isoniazida consiste em mutações na catalase-peroxidase que diminuem a sua atividade, impedindo a conversão do pró-fármaco isoniazida em seu metabolito ativo (BLANCHARD, 1996). O tratamento com isoniazida isoladamente leva ao aparecimento de cepas resistentes in vivo. Hoje estima-se que a resistência atinja 8% dos isolados, embora 37 possa ser muito mais elevada em certas populações, incluindo imigrantes asiáticos e hispânicos, bem como em grandes áreas urbanas e comunidades litorâneas (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 1999). A isoniazida continua sendo o fármaco mais importante no mundo inteiro para o tratamento de todos os tipos de tuberculose. Os efeitos tóxicos podem ser minimizados por meio de uma terapia profilática com piridoxina e cuidadosa vigilância do paciente. A isoniazida pode ser utilizada como terapia intermitente para a tuberculose; depois de dois meses, no mínimo, de terapia diária com isoniazida, rifampicina e pirazinamida. Os pacientes podem ser tratados com duas doses semanais de isoniazida mais rifampicina durante quatro meses (MANDELL; PETRI-JR., 1996). A piridoxina deve ser administrada com isoniazida para minimizar as reações adversas em pacientes desnutridos e naqueles com predisposição à neuropatia. Essa administração profilática de piridoxina impede o desenvolvimento não apenas da neurite periférica, como também da maioria dos outros distúrbios do sistema nervoso em praticamente todos os casos. Têm-se várias técnicas analíticas para a determinação de INH nos últimos anos. Liu et. al. (1996) detectaram hidrazina, metilhidrazina e isoniazida por eletroforese capilar utilizando o eletrodo modificado de páladio. Enquanto que Wang e Zhou (1996), usando a mesma técnica, determinaram isoniazida e hidrazina usando um microeletrodo de fibra de carbono modificado com platina. Alguns autores utilizaram a técnica de espectrofotometria de absorção na região do visível para a determinação da isoniazida. Dentre eles, os autores ElKommos e Yanni (1988) utilizaram a mesma técnica, porém com 6,7- dicloroquinolina-5,8-diona como reagente para determinar a isoniazida em comprimidos e xaropes. Nagaraja et al. (1996) determinaram a INH em comprimidos farmacêuticos usando 1,2 naftoquinina-4-sulfonato e cetiltrimetil bromato de amônio como reagentes, baseado no método da formação de um produto de cor vermelha. Os autores Gowda et al. (2002) determinam a isoniazida em formulações farmacêuticas baseado na oxidação do ácido 4,5-dihidroxi-1,3-benzendisulfonico (Tiron) pelo metaperiodato de sódio seguido pela oxidação acoplada com a isoniazida. 38 Em relação às técnicas eletroanalíticas, vários trabalhos foram realizados. Lomillo et al. (2001) utilizaram um modelo matemático para determinar isoniazida, rifampicina e pirazinamida em misturas ternárias utilizando a polarografia de pulso diferencial. Os autores Asadpour-Zeynali e Soheili-Azad (2010) determinaram simultaneamente isoniazida e rifampicina utilizando a polarografia de pulso diferencial, otimizando os parâmetros como pH e taxa de velocidade. Para a determinação de fármacos utiliza-se também a voltametria com diferentes tipos de eletrodos de trabalho. Fogg et al. (1983) determinaram a isoniazida usando a voltametria por injeção em fluxo, e o eletrodo de carbono vítreo como eletrodo de trabalho. Apostolakis et al. (1991) utilizou a voltametria por injeção em fluxo com um eletrodo de íon seletivo de fluoreto para a determinação de isoniazida em formulações farmacêuticas comerciais. Ghoneim et al. (2003) fizeram um estudo do comportamento eletroquímico da isoniazida na forma pura, em comprimidos farmacêuticos e fluídos biológicos, usando a voltametria de onda quadrada com eletrodo de mercúrio. Hamman et al. (2004) fizeram um ensaio voltamétrico com isoniazida e rifampicina, tanto combinado como separadamente, em formulações farmacêuticas e amostra de soro humano, utilizando as voltametrias cíclica e de onda quadrada com eletrodo de pasta de carbono. Alguns autores utilizaram eletrodos quimicamente modificados (EQM) para a determinação da isoniazida, dentre eles, Majidi et al. (2006) que determinaram a isoniazida em medicamentos usando a voltametria cíclica com o eletrodo de carbono vítreo modificado com polipirrol. Leandro et al. (2009) utilizaram a polarografia de pulso diferencial com o eletrodo de gotejamento de mercúrio como eletrodo de trabalho para determinar isoniazida e rifampicina em formulações farmacêuticas. 2.2.1.1.1 Mecanismo de ação O mecanismo de ação da isoniazida era desconhecido até recentemente. Com base em estudos sobre os mecanismos de resistência, foi proposto que a isoniazida é uma forma latente (pré-droga) que é ativada por oxidação catalisada por uma catalase-peroxidase endógena (LEMKE, 2002). Da reação entre a isoniazida e a enzima resultam produtos como isonicotinaldeído, ácido isonicotínico e 39 isonicotinamida, formados por intermediários reativos como radical isonicotinoíla e ácido perisonicotínico. Esses produtos são espécies reativas capazes de acilar um sistema enzimático encontrado exclusivamente no M. tuberculosis, em que a principal enzima é uma enoil redutase NADH-dependente chamada inhA, que regula a síntese dos ácidos micólicos, mais especificamente de ácidos graxos de cadeia longa (maior que 26 carbonos). As espécies reativas da isoniazida acilam a posição 4 do NADH, impedindo a síntese de ácidos micólicos (GEORGIEVA; GADJEVA, 2002). 2.2.1.1.2 Farmacocinética O fármaco atinge concentrações plasmáticas máximas dentro de 1-2 h após a ingestão oral de doses habituais. A isoniazida difunde-se rapidamente em todos os líquidos do corpo. A concentração do fármaco é inicialmente mais elevada no plasma e no músculo do que no tecido infectado; porém, o tecido infectado retém o fármaco por um longo período, em quantidades bem acima das necessárias para uma ação bacteriostática. Cerca de 75 a 95% de uma dose de INH são excretadas na urina em 24 h, principalmente em forma de metabólitos. Os principais produtos de excreção resultam de acetilação enzimática e hidrólise enzimática. A velocidade de acetilação altera significativamente as concentrações do fármaco atingidas no plasma, bem como a sua meia-vida na circulação. A meia-vida do fármaco pode ser prolongada na presença de insuficiência hepática (MANDELL; PETRI-JR., 1996) 2.2.1.2 Etambutol O etambutol (EMB) é um fármaco amplamente utilizado na terapia da TB (MANDELL; PETRI-JR., 1996; Lemke, 2002) e sua fórmula estrutural é apresentada na Figura 07. Sua fórmula química é C10H24N2O2, sua massa molecular é 204 g/mol e seu nome oficial é o etilenodiiminobutanol. O EMB é um composto hidrossolúvel e termoestável, facilmente solúvel em água, solúvel em metanol e etanol, pouco solúvel em clorofórmio e praticamente insolúvel em éter etílico. O EMB apresenta 40 dois pKa, em 6,6 e 9,5 (SHEPHERD et al., 1966). O etambutol apresenta centros assimétricos, sendo que o enantiômero (+) é 200 a 500 vezes mais ativo que o enantiômero (-) (REYNOLDS et al., 1999). Este fato indica que, provavelmente, o etambutol tenha um receptor específico em seu local de ação. Figura 07 – Estrutura Molecular do EMB Fonte: AUTOR, 2013 Em virtude da menor incidência de efeitos tóxicos e da melhor aceitação por parte dos pacientes, o etambutol substitui essencialmente o ácido aminossalicílico. O EMB acumula-se em pacientes com comprometimento da função renal, exigindo um ajuste de dose. O efeito colateral mais importante consiste em neurite óptica, com consequente redução da acuidade visual e perda da capacidade de distinguir o vermelho do verde (BOBROWITZ, 1974). Nos últimos 50 anos, muitos procedimentos analíticos foram utilizados para a quantificação de etambutol em urina, plasma e formulação farmacêuticas. Ma et. al. (1995) otimizaram as condições experimentais, faixa de detecção linear e precisão do método de cromatografia líquida para determinar etambutol e cloridrato de benzexol em comprimidos. Breda et al. (1996) determinaram o EMB em plasma humana e urina utilizando HPLC com detecção de fluorescência do fluído. Jiang et al. (2002) determinaram etambutol utilizando a cromatografia líquida de fase reversa com detecção UV sem pré-tratamento da amostra usando 1-heptanosulfonado de sódio como par iônico. Song et al. (2007) determinaram simultaneamente drogas de primeira linha (INH, EMB, PZA e RIF) e seus principais índices metabólicos utilizando HPLC e espectroscopia de massa. Gong et al. (2009) determinaram simultaneamente o etambutol e pirazinamida em plasma humano por cromatografia líquida/espectroscopia de massa. 41 Hsieh et al. (2006) analisaram etambutol e metoxifenamina em plasma humano utilizando a eletroforese capilar acoplada com detecção eletroquimiluminescente usando o eletrodo de trabalho de óxido de titânio/índio. Faria et al. (2008) validaram alguns parâmetros como linearidade, seletividade, precisão da área, recuperação média e limite de quantificação para a determinação de EMB em amostras de formulação farmacêutica usando a eletroforese capilar com detecção UV em 262 nm. Faria et al. (2010), depois de validarem os parâmetros, fizeram a determinação simultânea de INH, EMB, PZA e RIF por eletroforese capilar usando a detecção direta por UV. Silva et al. (2010) utilizaram o método de eletroforese capilar acoplado com detecção de condutividade sem contato para determinar EMB em formulações farmacêuticas. Utilizando métodos eletroanalíticos, Hassan e Shalaby (1992) descreveu pela primeira vez a determinaçã do etambutol usando titulação potenciométrica em preparações farmacêuticas. Gupta et al. (2003) relataram um novo procedimento usando um eletrodo de íon-seletivo do quelato de etambutol-cobre(II) em uma matriz de cloreto de polivinila (PVC) para a determinação de etambutol. Técnicas voltamétricas começaram a serem utilizadas a partir de Zhang e Yang (2002), que fizeram um estudo do comportamento voltamétrico utilizando o eletrodo de carbono vítreo para determinar etambutol em comprimidos e urina. Chen et al. (2008) propuseram um novo método para a determinação de etambutol utilizando a voltametria de pulso diferencial tendo como eletrodo de trabalho o carbono vítreo modificado com nanotubos de carbonos multifoliados. Perantoni et al. (2011) determinaram etambutol em amostras farmacêuticas utilizando a análise por injeção em fluxo usando um eletrodo composto por grafite e parafina como detector amperométrico. 2.2.1.2.1 Mecanismo de ação O fármaco suprime o crescimento da maioria dos bacilos da tuberculose resistentes à isoniazida e estreptomicina (MANDELL; PETRI-JR., 1996). O esclarecimento dos mecanismos de ação do etambutol nas micobactérias é muito recente. Apesar das diversas hipóteses sobre o mecanismo de ação deste fármaco, sabe-se que ele atua especificamente sobre a biossíntese da parede celular 42 (RASTOGGI et al., 1990; BELANGER et al., 1996; ALCAIDE et al., 1997; RAMASWAMY et al., 2000; ZHANG; TELENTI, 2000; ZHANG et al., 2003), inibindo a polimerização da arabinose de arabinogalactanos e de lipoarabinomanoses, (TAKAYAMA; KELBURN, 1989; DENG et al., 1995; MIKUSOV et al., 1995; ZHANG et al., 2003) os quais servem de ligação para os ácidos micólicos presentes na parede celular de M. tuberculosis e de outras micobactérias (KHOO et al., 1996). Dessa forma, o etambutol tem a função de aumentar a permeabilidade da parede celular, promovendo um acúmulo de ácido micólico e finalmente a morte da célula (RAMASWAMY et al., 2000). 2.2.1.2.2 Farmacocinética As concentrações plasmáticas tornam-se máximas dentro de 2-4 h após a administração do fármaco. O EMB tem meia vida de 3-4 horas. Dentro de 24 h, 75% de uma dose ingerida de etambutol são excretados em sua forma inalterada na urina; até 15% são excretados em forma de 2 metabolitos: um aldeído e um derivado de ácido dicarboxílico. 2.2.1.3 Rifampicina As rifamicinas são membros da classe das ansamicinas de produtos naturais isolados do Streptomyces mediterranei (MANDELL; PETRI-JR., 1996). Esta classe é caracterizada por moléculas com uma cadeia alifática interligando duas posições não-adjacentes de uma porção aromática (ponte ansa) (LEMKE, 2002). A rifampicina (RIF), cuja fórmula estrutural é apresentada na Figura 08, é um derivado semi-sintético de um desses antibióticos – rifamicina B. Sua fórmula química é C43H58N4O12 e a massa molecular é de 822,95 g/mol. O seu nome oficial é 3-[[(4metil-1-piperazinil)imino]metil]rifamicina. 43 Figura 08 – Estrutura Molecular da RIF. Fonte: LOMILLO et al. (2001) A rifampicina apresenta-se como um pó cristalino, vermelho alaranjado, sendo pouco solúvel em água e acetona, solúvel em metanol, tetrahidrofurano (THF) e acetato de etila, pouco solúvel em etanol, muito solúvel em clorofórmio e dimetilsulfóxido (DMSO). A RIF apresenta dois valores de pKa: 1,7, relacionado ao grupamento 4-hidroxila, e 7,9, relacionado ao nitrogênio do grupo piperazina (GALLO; RADAELLI, 1976). Embora segundo Gallo e Radaelli (1976) a RIF é mais solúvel em pH ácidos do que em pH básicos (em pH 2 a solubilidade é de 100 mg/mL, enquanto que em pH 7,5 é reduzida para 2,8 mg/mL). A rifampicina está disponível como fármaco isolado e como combinação em dose fixa com isoniazida ou isoniazida e pirazinamida. A rifampicina e a isoniazida constituem os fármacos de maior eficiência disponíveis para o tratamento da tuberculose. Assim como alguns outros fármacos, a RIF nunca deve ser utilizada isoladamente no tratamento dessa doença, devido à rapidez com que pode ocorrer desenvolvimento de resistência (MANDELL; PETRI-JR., 1996). A hepatite causada por rifampicina raramente ocorre em pacientes com função hepática normal. De modo semelhante, a combinação de isoniazida e rifampicina parece ser geralmente segura nesses pacientes. 44 Como a rifampicina é um potente indutor das enzimas microssômicas hepáticas, sua administração determina uma redução da meia-vida de diversos compostos, dentre eles os inibidores da protease e inibidores não nucleosídeos da transcriptase reversa do HIV. Dessa forma, o uso da rifabutina nesses casos apresenta menos efeitos sobre o metabolismo dos inibidores da protease do HIV (MANDELL; PETRI-JR., 1996). Algumas técnicas analíticas foram utilizadas para o estudo e determinação da RIF. Galal et al. (1992) utilizaram espectrofotometria para a determinação de rifampicina em cápsulas e amostras de urina. Halvatzis et al. (1993) determinaram a RIF com o método quimiluminométrico de fluxo contínuo. Eles demonstraram que o método tem boa acurácia e precisão. Yang et al. (2003) determinaram a rifampicina usando a técnica de HPLC com um detector quimiluminescente. Liang et al. (2007) determinaram RIF em preparações farmacêuticas e urina humana pela técnica de eletroquimiluminescência. 2.2.1.3.1 Mecanismo de ação Pertence ao grupo dos antibióticos macrocíclicos complexos, que possui ação bactericida para microrganismos intra e extracelular. Inibe o crescimento da maioria das bactérias Gram-positivas assim como de numerosos organismos Gramnegativos (MANDELL; PETRI-JR., 1996). A rifampicina é um bactericida que inibe a RNA polimerase dependente do DNA das micobactérias através da formação de um complexo fármaco-enzima estável que acarreta na supressão da formação da cadeia de RNA. A RNA polimerase nuclear de uma variedade de células eucarióticas não se liga à rifampicina, de modo que a síntese de RNA não é afetada. As rifamicinas em altas concentrações também inibem as RNA polimerases dependentes do DNA, bem como as transcriptase reversas (MANDELL; PETRI-JR., 1996). 2.2.1.3.2 Farmacocinética A administração oral da RIF produz concentrações plasmáticas máximas em 2-4 h. O ácido aminossalicílico pode retardar a absorção da rifampicina. Caso esses 45 fármacos sejam utilizados concomitantemente, devem ser administrados em separado, com intervalo de 8-12 h (RADNER, 1973). A rifampicina é rapidamente eliminada pela bile. A RIF sofre desacetilação progressiva, de modo que, depois de 6 h, quase todo o antibiótico presente na bile encontra-se na forma desacetilada. Não há necessidade de ajuste da dose em pacientes com comprometimento da função renal. A meia-vida da rifampicina varia de 1,5-5 h e aumenta na presença de disfunção hepática. Por outro lado, pode estar reduzida em pacientes que estejam usando concomitantemente isoniazida, que são inativadores lentos desse fármaco (MANDELL; PETRI-JR., 1996). A rifampicina distribui-se por todo organismo. A sua presença pode ser percebida pela propriedade do fármaco de conferir coloração alaranjada à urinas, fezes, saliva, escarro e lágrimas (FURESZ, 1970; FARR, 2000). 2.2.1.4 Pirazinamida A pirazinamida (PZA) é um pró-fármaco derivado da nicotinamida, cuja fórmula estrutural é apresentada na Figura 09. Sua fórmula química é C5H5N3O, sua massa molecular é de 123,11 g/mol e seu nome oficial é pirazinacarboxiamida. É ligeiramente solúvel em água, pouco solúvel em etanol e muito pouco solúvel em éter. Suas soluções aquosas são neutras. Apresenta valor de pKa de 0,50 para a base conjugada (BH+) (MERCK, 2000). Esta substância é a única capaz de atuar em bacilos dentro de macrófagos infectados. É utilizada na primeira fase do tratamento, quando a infecção encontrase ainda como granulomatosa, pelo fato deste fármaco atravessar adequadamente a membrana do macrófago e atuar muito bem em pH ácido (em torno de 5,5). A sua atuação está relacionada à sua capacidade de destruir os bacilos no interior dos macrófagos (DOLEZAL et al., 2002). 46 Figura 09 – Estrutura Molecular da PZA O N NH2 N Fonte: AUTOR, 2013 A pirazinamida tornou-se um importante componente da terapia de curta duração (6 meses) com múltiplos fármacos para a tuberculose. Um dos principais efeitos colaterais é a lesão hepática. Dessa forma, todos os pacientes tratados com pirazinamida devem ser submetidos a provas de função hepática antes da administração do fármaco. A PZA não deve ser administrada em indivíduos com qualquer grau de disfunção hepática, a não ser que seja absolutamente necessária (MANDELL; PETRI-JR., 1996). Existem poucos trabalhos na literatura sobre métodos analíticos para a pirazinamida. Akyuz et al. (2007) apresentaram um estudo de espectroscopia vibracional para compostos de pirazinamida. Nesse estudo usou-se a espectroscopia Raman e o infravermelho distante, observando que os compostos têm estruturas semelhantes. Zhou et al. (2010) determinaram simultaneamente a pirazinamida, isoniazida, rifampicina e acetilisoniazida em plasma humana utilizando a técnica de HPLC. O método mostrou-se seletivo, sensível e confiável. Bergamini et al. (2013) estudaram o comportamento eletroquímico e determinaram a pirazinamida em amostras de urina humana usando um eletrodo de impresso de carbono modificado com polihistidina juntamente com a voltametria cíclica e impedância. 2.2.1.4.1 Mecanismo de ação Seu mecanismo de ação é desconhecido, mas sabe-se que pode atuar como bacteriostático ou bactericida. É efetiva em pH 5,6. Salfinger, Crowle e Reller (1990) propuseram que o responsável pela atividade antibacteriana da Pirazinamida é o ácido pirazinóico, o qual é formado pela ação da enzima pirazinamidase, sintetizada pelo bacilo. A formação do ácido combinada com o ingresso do bacilo ao macrófago abaixariam o pH até níveis tóxicos para o mesmo (MARTINDALE, 2002). O ácido pirazinóico também depleta a energia reserva da membrana (WADE et al., 2004). 47 2.2.1.4.2 Farmacocinética Verifica-se o rápido desenvolvimento de resistência se a PZA for utilizada isoladamente. A meia-vida plasmática é de 9-10 h em pacientes com função renal normal. A pirazinamida é hidrolisada em ácido pirazinóico e, subsequentemente em ácido 5-hidroxipirazinóico, o principal produto de excreção (MANDELL; PETRI-JR., 1996). 2.3 ELETROANALÍTICA A eletroanalítica compreende um grupo de métodos analíticos qualitativos e quantitativos baseados nas propriedades elétricas de uma solução contendo o analito quando essa faz parte de uma célula eletroquímica. As técnicas eletroanalíticas têm como ponto principal a interação entre a eletricidade e a química, ou seja, as características elétricas como corrente, potencial ou a variação destes e a relação com os parâmetros químicos. Com o uso de métodos eletroquímicos, foi encontrada uma vasta quantidade de aplicações, desde monitoramento ambiental e industrial, incluindo também controle de qualidade e análises biológicas (WANG, 2006). Com os avanços desde a década de 80, incluindo o desenvolvimento de ultramicrosensores, monofilmes, multifilmes, técnicas de voltametria de ultratraços ou alta resolução, entre outros, há um crescimento do interesse na eletroanálise, assim expandindo para novos campos e ambientes. 2.3.1 Voltametria A voltametria compreende um grupo de métodos eletroanalíticos nos quais as informações a respeito do analito são obtidas através da medida de corrente em função de um potencial aplicado sob condições que promovem a polarização de um eletrodo indicador ou eletrodo de trabalho. Baseia-se na medida da corrente em uma célula eletroquímica sob condições de completa polarização de concentração, na qual a velocidade de oxidação ou redução do analito é limitada pela velocidade de 48 transferência de massa do analito para a superfície do eletrodo (SKOOG et al, 2006). Os métodos voltamétricos são amplamente empregados por químicos analíticos, inorgânicos, físico-químicos e bioquímicos para estudos fundamentais de processos de oxidação e redução em vários meios, processos de adsorção às superfícies e mecanismos de transferência de elétrons em superfícies modificadas de eletrodos. Na voltametria, a voltagem no eletrodo de trabalho varia sistematicamente enquanto a resposta de corrente é medida. Várias funções voltagem-tempo, chamadas sinais de excitação, podem ser aplicadas ao eletrodo. A mais simples delas é a varredura linear, na qual o potencial no eletrodo de trabalho muda linearmente com o tempo. Outras formas de onda que podem ser aplicadas são as ondas pulsadas e triangulares. As formas de onda de quatro dos sinais de excitação mais comuns empregados na voltametria são mostradas na Figura 10. Figura 10 – Sinais de excitação de tensão versus tempos empregados na voltametria. Fonte: SKOOG et al, 2006. 2.3.1.1 Voltametria de pulso diferencial Voltametria de pulso diferencial é uma técnica extremamente útil para medir e rastrear os níveis de espécies orgânicas e inorgânicas. Na voltametria de pulso diferencial, dois valores de corrente são obtidos de forma alternada. A diferença de corrente por pulso é registrada em função do aumento linear do potencial de 49 excitação. A curva diferencial resultante consiste em picos cuja altura é proporcional à concentração do analito. Geralmente, o limite de detecção obtido com a voltametria de pulso diferencial é duas ou três ordens de magnitude menor quando comparado com os valores obtidos por voltametria clássica. A maior sensibilidade para a voltametria de pulso diferencial pode ser atribuída a dois fatos. O primeiro está relacionado ao aumento da corrente faradaíca, e o segundo, a uma diminuição da corrente de carga, ou nãofaradaíca (SKOOG et al, 2006). A seleção da amplitude de pulso e velocidade de varredura normalmente requer um equilíbrio entre sensibilidade, resolução e velocidade. Por exemplo, amplitude de pulso maior resulta em picos maiores e mais amplos. Sistema redox irreversível resulta em picos de corrente mais baixos e mais amplos (isto é, sensibilidade e resolução inferiores) em comparação com os valores previstos para os sistemas reversíveis. Além das melhorias na sensibilidade e resolução, a técnica pode fornecer informações sobre a forma química em que o analito é exibida (estados de oxidação, complexação, etc.) (SKOOG et al, 2006). 2.3.1.2 Voltametria cíclica Voltametria cíclica (CV) é a técnica mais utilizada para a aquisição qualitativa de informações sobre as reações eletroquímicas. A CV resulta da sua capacidade de fornecer rapidamente informações consideráveis sobre a termodinâmica de processos redox e a cinética de reações heterogêneas de transferência de elétrons em reações químicas acopladas ou processos de adsorção. A CV é muitas vezes o primeiro experimento realizado em um estudo eletroanalítico. Em particular, ela oferece uma localização rápida de potenciais redox das espécies eletroativas e a avaliação do potencial de meia onda sobre o processo redox (SKOOG et al, 2006). Na CV a resposta de corrente para um pequeno eletrodo estacionário e imerso em uma solução em repouso é obtida em uma função de um sinal de excitação na forma triangular. Como por exemplo, se o potencial inicial aplicado é de -0,1 V e o potencial final é de 1 V, isso significa que quando o potencial final é alcançado, ocorre uma inversão na direção da varredura e o potencial sempre volta a -0,1 V. 50 Os dados importantes em CV são o potencial de pico catódico Epc, o potencial de pico anódico Epa, a corrente de pico catódico ipc e a corrente de pico anódico ipa. Para reações reversíveis de eletrodo, as correntes de pico anódica e catódica são aproximadamente iguais em valores absolutos, mas com sinais opostos. Para uma reação reversível de eletrodo a 25 °C, a diferença de potencial de pico, ΔEp, é dado por (SKOOG et al, 2006): Eq. (01) Onde n é o número de elétrons envolvidos na reação. Reações irreversíveis tornam lenta a cinética de transferência de elétrons, resultando em valores de ΔEp que excedem o valor esperado. Embora uma reação de transferência de elétrons possa parecer reversível para baixas velocidades de varredura, o aumento da velocidade de varredura pode levar ao aumento dos valores de ΔEp, o que seguramente indica que a reação é irreversível. Assim, para obter a constante de velocidade, ΔEp é medida em várias velocidades de varredura (SKOOG et al, 2006). Além de fornecer os dados falados anteriormente, a voltametria cíclica pode revelar a presença de um intermediário na reação de oxirredução. 2.4 ELETRODOS DE TRABALHO A realização do procedimento voltamétrico é fortemente influenciada pelo material do eletrodo de trabalho. O eletrodo de trabalho deve proporcionar boas características de ruído e sinal, bem como uma resposta reprodutível. Assim, a sua seleção depende principalmente de dois fatores: o comportamento redox do analitoalvo e a corrente ao longo da região de potencial necessário para a medição. Outras considerações incluem a janela de potencial, condutividade elétrica, reprodutibilidade da superfície, propriedades mecânicas, custo, disponibilidade e toxicidade. Tem se encontrado grande variedade de materiais que podem ser usados como eletrodos de trabalho para eletroanalítica. Os mais populares são os que envolvem o mercúrio, carbono, ou metais nobres (especialmente platina e ouro). 51 2.4.1 Diamante dopado com boro O eletrodo de diamante dopado com boro (BDD) é um material inovador, emergindo como um eletrodo alternativo devido à sua inegável boa condutividade elétrica, baixa capacitância de dupla camada, ampla janela de potencial eletroquímico e de sua biocompatibilidade (SZUNERITS et al., 2010). A janela de potencial dos eletrodos de diamante é incomparavelmente mais alta do que qualquer outro material, podendo alcançar até 3 volts (algumas vezes até mais). A vantagem da largura da janela de potencial é que tem um menor background da corrente quando comparado a outros materiais carbonados (carbono vítreo, grafite, pasta de carbono, etc.) ou platina, que são materiais muito usados como eletrodos (PLESKOV, 2011). A ampla janela de potencial ocorre da sobretensão elevada da decomposição do solvente. As reações de formação de hidrogênio ou oxigênio ocorrem nos eletrodos e sua cinética é muito sensível, provocando a sua adsorção na superfície do eletrodo. O diamante é um adsorvente pobre, por conseguinte, o seu efeito catalítico é um pouco fraco para estas reações. Assim, dentro da janela de potencial, o solvente é estável e o eletrodo de diamante é apropriado para os estudos com reações, pois não reage nem com o solvente, nem com a substância. No entanto, ao contrário de outros materiais a base de carbono, que há muito tempo encontraram aplicações práticas, o estudo eletroquímico de diamante foi iniciado recentemente, em 1987, quando o primeiro artigo sobre a fotoeletroquímica dos eletrodos de diamante foi publicado. Nesse estudo, Pleskov et al. (1987) estudaram as propriedades eletroquímicas dos eletrodos de diamante e provaram que o diamante é eletroquimicamente estável, estudando algumas propriedades com fotocorrente, capacidade diferencial, corrente de fundo (ou ruido) vs. curvas de potencial. Os autores Natishan e Morrish (1989) estudaram o comportamento eletroquímico do diamante revestido com molibdênio e, durante os anos 90, Pleskov et al. (1992) continuaram estudando a aplicação do diamante na eletroquímica. Eles analizaram a impedância da condução do diamante revestido com policristais, comparando os resultados com os obtidos estudando o diamante na sua forma pura (sem modificação). Patel et al. (1992) investigaram a fotoeletroquímica dos eletrodos de diamante dopado com boro, observando que a fotocorrente é gerada pela 52 polarização catódica, concluindo que o BDD é um semicondutor. Swain et al. (1993) estudaram a atividade eletroquímica do BDD usando voltametria cíclica, cronoamperometria e impedância sem contato com a luz externa. Eles observaram que o eletrodo BDD apresentou baixa capacitância de camada dupla e resistência relativamente alta à polarização para a oxidação da superfície. Segundo esse autores, o eletrodo de BDD apresentou estabilidade após um período de 2 meses comparado com um recém polido eletrodo de carbono vítreo. Tenne et al. (1993) exploraram o sobrepotencial devido à evolução do hidrogênio para reduzir o nitrato para amônia usando o eletrodo de BDD. Ramesham et al. (1993) estudaram os eletrodos de carbono vítreo e grafite revestido por um filme de diamante dopado com boro utilizando microscopia eletrônica de varredura (MEV) e espectroscopia de Raman. Observou-se que os eletrodos de carbono vítreo e grafite com esse tipo de revestimento podem ser usados em eletroanálises, uma vez que os filmes de BDD são eletricamente condutores, resistentes à erosão e quimicamente inertes. O eletrodo de BDD continua sendo estudado desde então. Métodos eletroquímicos que usam esse tipo de eletrodo têm sido aplicados com sucesso para a análise de compostos farmacêuticos. Oliveira et al. (2007) determinaram lidocaína, princípio ativo de alguns produtos analgésicos, utilizando voltametria cíclica e de onda quadrada. Os autores Dogan et al. (2007) determinaram fluvastatina, princípio que reduz o colesterol e triglicerídeo presentes no sangue, em formulações e soro humano usando voltametria cíclica, onda quadrada e pulso diferencial. Uslu et al. (2008) propuseram utilizar a eletro-oxidação para determinar pefloxacina, usada no tratamento de infecções causadas por germes sensíveis a esse princípio ativo, em farmacêuticos e soro humano com as técnicas de voltametria cíclica, pulso diferencial, onda quadrada e linear. Os autores Souza et al. (2008) quantificaram a sulfadiazina e sulfametoxazol em produtos farmacêuticos usando a voltametria de onda quadrada. Radovan et al. (2008) determinaram simultaneamente L-ácido ascórbico e acetaminofeno por várias técnicas, incluindo voltametria cíclica, cronoamperometria e voltametria de pulso diferencial. A aplicabilidade da voltametria de pulso diferencial usando o método de adição de padrão mostrou-se eficaz para a quantificação dos dois princípios ativos. Ribeiro et al. (2008) investigaram a oxidação eletroquímica do cloridrato de prometazina usando voltametria de onda quadrada. Constatou-se que o 53 método é preciso e reprodutível, podendo ser usado para quantificação do fármaco em formulações farmacêuticas devido à estabilidade, especificidade, recuperação e precisão. Sartori et al. (2009) determinaram ácido acetilsalicílico (AAS) em formulações farmacêuticas juntamente com a voltametria de onda quadrada. O diferencial foi a determinação desse fármaco sem a necessidade da hidrólise alcalina, sendo aplicado com sucesso na determinação do AAS em várias formulações. Os autores Andrade et al. (2009) propuseram a determinação simultânea de sulfametoxazol e trimetoprima usando a voltametria de pulso diferencial, conseguindo baixos limites de detecção e quantificação quando comparado com o método padrão de HPLC. Szunerits et al. (2010) produziram um detector de lectinas livres em carboidratos, apresentando um baixo limite de detecção (5 ± 0,5 nM). Os autores Bartosová et al. (2011) utilizaram o HPLC com um detector amperométrico para determinar sildenafil e vardenafil, fármacos utilizados no tratamento da disfunção erétil. Song et al. (2012) determinaram a dopamina na presença de ácido ascórbico utilizando um sensor com o eletrodo de diamante dopado com boro modificado com nanocompósitos de ouro. O método apresentou alta seletividade, sensibilidade, baixo limite de detecção e boa faixa linear para a determinação do fármaco. Ardila et al. (2013) determinaram bezafibrato em composições farmacêuticas utilizando a voltametria de onda quadrada. O método mostrou-se eficaz para a determinação quando comparado com o método espectrofotométrico. Com as melhoras das técnicas analíticas com o passar dos anos, a eletroanálise tem sido uma ferramenta muito importante na química analítica contemporânea devido às diversas possibilidades de aplicação. Em comparação com outros métodos instrumentais, a química eletroanalítica oferece uma variedade de vantagens, dentre elas alta sensibilidade, simplicidade da técnica, rapidez, baixo custo e detecção relativamente fácil (SIANGPROH et al., 2011). Muitos outros estudos foram feitos, mas todos puderam confirmar que os eletrodos de diamante dopado com boro podem ser usados para determinar muitos princípios ativos em vários compostos farmacêuticos. Os métodos propostos apresentaram excelentes performances e um grande potencial na aplicação em processos de controle. 54 2.4.2 Carbono vítreo O carbono vítreo (GC) é muito popular por causa de suas excelentes propriedades mecânicas e elétricas, ampla janela de potencial, inércia química (resistência ao solvente), e performance reprodutível. O material é preparado por meio de um programa cuidadoso de controle de aquecimento de um pré-modelado polimérico (fenolformaldeído) em uma atmosfera inerte. O processo de carbonização do produto é muito lento, com o intervalo de temperatura de 300-1200 °C, para assegurar a eliminação de oxigênio, nitrogênio e hidrogênio. A estrutura de carbono vítreo envolve finas fitas emaranhadas de grafite, como se fossem folhas. Devido à sua alta densidade e tamanho dos poros ser pequeno, não é necessário qualquer processo de impregnação. No entanto, o pré-tratamento da superfície é usualmente empregado para criar eletrodos de carbono vítreo reprodutíveis e ativos, como também para melhorar seu desempenho analítico. Esse pré-tratamento é geralmente obtido por polimento com partículas de alumina menores (até 0.05 μm). O elétrodo deve então ser lavado com água deionizada antes do uso (WANG, 2006). Existem muitos trabalhos na literatura em que o eletrodo de carbono vítreo é usado como detector. Os autores Bodoki et al. (2007) validaram um método eletroquímico quantitativo para a colchicina usando eletrodo de GC. Foram validados alguns parâmetros como seletividade, linearidade, acurácia, confiabilidade, limite de detecção e quantificação. O método mostrou-se um sucesso para a determinação de colchicina em comprimidos sem a interferência dos excipientes. Salimi et al. (2007) determinaram a ranitidina e metronidazol em comprimidos utilizando um eletrodo de carbono vítreo modificado com uma simples camada de nanotubos de carbono. Mostrou-se um método com alta sensibilidade, estabilidade e tempo de vida. Heli et al. (2007) estudaram adsorção da albumina no soro humano utilizando o eletrodo de GC e as técnicas de voltametria cíclica e impedância. Esse estudo proporcionou um melhor entendimento sobre as interações da albumina nesse meio. Zhu et al. (2009) determinaram simultaneamente ácido úrico, dopamina e ácido ascórbico utilizando eletrodo de GC modificado com uma simples camada de nanocarbono. Os resultados se mostraram satisfatórios usando o método de adição de padrão. Muna et al. (2011) estudaram a oxidação eletrocatalítica de compostos fenólicos estrogênicos utilizando o eletrodo de GC modificado com níquel. Com esse eletrodo, 55 eles obtiveram alta sensibilidade, faixa linear, limite de detecção e resposta estáveis. Dessa forma, ele pode ser usado para a detecção desses compostos em amostras reais. Rajith et al. (2011) estudaram a oxidação da trimetoprima utilizando um eletrodo de carbono vítreo juntamente com a voltametria de pulso diferencial e métodos computacionais. Quan et al. (2011) determinaram a dopamina na presença de ácido ascórbico e ácido úrico utilizando um eletrodo de carbono vítreo modificado com Nafion/simples camada de nanocarbono/poli-3-metiltiofeno. O método desenvolvido teve simples preparação, alta sensibilidade, baixo limite de detecção e excelente reprodutibilidade. Tesio et al. (2013) estudaram a oxidação eletroquímica do flavonoide buteína utilizando as voltametrias cíclica e de onda quadrada com o eletrodo de GC. Foram usados soluções padrão de fosfato e citrato como eletrólitos com diferentes valores de pH. Como pode-se perceber, o eletrodo de carbono vítreo também é um material muito usado para o estudo eletroquímico e determinação quantitativa de alguns fármacos conhecidos na literatura. 56 3 OBJETIVOS 3.1 OBJETIVO GERAL Verificar a aplicabilidade da técnica de voltametria de pulso diferencial na quantificação dos princípios ativos usados no tratamento da tuberculose em medicamentos. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS · Estudar usando a voltametria cíclica e voltametria de pulso diferencial o comportamento redox dos princípios ativos; · Determinar as condições experimentais para quantificar cada um dos princípios ativos: isoniazida, etambutol, rifampicina e pirazinamida; · Estudar as variáveis experimentais que afetam na quantificação de cada um dos princípios ativos; · Aplicar o método para quantificação dos fármacos estudados em fórmulas farmacêuticas. 57 4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 4.1 MATERIAL 4.1.1 Reagentes Os reagentes de grau analítico utilizados ao longo do trabalho experimental, foram: ácido sulfúrico (QEEL Ltda.), ácido nítrico (QELL Ltda.), hidróxido de sódio (Proquímios, Ltda.), cloreto de potássio (Proquímicos Ltda.), pirazinamida (sigmaaldrich Ltda.), isoniazida, etambutol e rifampicina. Os padrões de rifampicina e etambutol foram obtidos por doação da Prof. Dra. Maria de Fátima Vitória de Moura e o padrão de isoniazida foi obtido por doação do Prof. Dr. Oderlei, ambos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Os comprimidos do combinado farmacêutico utilizados nos estudos foram obtidos na rede de saúde pública do município de Fortaleza. 4.1.2 Soluções utilizadas 4.1.2.1 Soluções de limpeza As soluções de limpeza utilizadas foram ácido sulfúrico (0,5 mol L-1) e ácido nítrico (0,5 mol L-1). A solução de ácido sulfúrico foi preparada a partir da adição de 13,3 mL (0,25 mol) em 500 mL de água destilada e a solução de ácido nítrico foi preparada adicionando 4 mL (0,1 mol) em 100 mL de água destilada. 4.1.2.2 Eletrólitos Os eletrólitos utilizados foram solução de cloreto de potássio 0,1 mol L-1 (pH 4 e pH 8) e as soluções tampão de fosfato de potássio – hidróxido de sódio (pH 8) e solução de Sörensen (pH 8). A solução de cloreto de potássio foi preparada dissolvendo 3,73 g (50 mmol) em 500 mL de água destilada. O pH final da solução 58 foi medido com pHmetro de bancada Edutec, modelo EEQ-9025 e eletrodo de vidro Edutec. A solução tampão de fosfato de potássio – hidróxido de sódio (pH 8) foi preparada a partir da adição de 250 mL de solução de fosfato de potássio 0,1 mol L-1 (25 mmol) e 234 mL de solução de hidróxido de sódio 0,1 mol L-1 (25 mmol) em um balão volumétrico de 500 mL, aferindo-o com água destilada. A escolha do pH 4 foi devido ao valor do primeiro pKa da isoniazida ser 3,9 (próximo de 4). Enquanto que a escolha do pH 8 foi devido à necessidade de estudar o comportamento da isoniazida em pH básico; Sendo que esse valor é favorável ao estudo da rifampicina, que possui pKa de 7,9. A solução tampão de Sörensen (pH 8) foi preparada a partir da adição 475 mL de solução de fosfato de sódio M/15 (40 mmol) e 25 mL de solução de fosfato de potássio M/15 (30 mmol) em um balão volumétrico de 500 mL (Morita et al., 2007). 4.1.2.3 Soluções padrão A solução padrão de isoniazida (0,05 mol L-1) foi preparada dissolvendo 0,0686 g (0,50 x10-3 mol) de padrão isoniazida em 10 mL de cloreto de potássio 0,1 mol L-1. A solução padrão de etambutol (0,05 mol L-1) foi preparada dissolvendo 0,102 g (0,50 x 10-3 mol) de padrão de etambutol em 10 mL de cloreto de potássio 0,1 mol L-1. A solução padrão de rifampicina (6,2 x 10-3 mol L-1) foi preparada dissolvendo 0,2055 g (0,25 x 10-3 mol) de padrão de rifampicina em 50 mL de cloreto de potássio 0,1 mol L-1 e deixado em agitação por 24 horas. A solução padrão de pirazinamida (0,05 mol L-1) foi preparada dissolvendo 0,0615 g (0,50 x 10-3 mol) de padrão de pirazinamida em 10 mL de cloreto de potássio 0,1 mol L-1. A solução de concentração conhecida de isoniazida foi preparada dissolvendo 0,0187 g (0,14 x 10-3 mol) em 25 mL de cloreto de potássio 0,1 mol L-1. Foi escolhido esse valor porque é da proporção existente no comprimido para a isoniazida, que é de 0,075 g. A solução de concentração conhecida de etambutol foi preparada dissolvendo 0,0687 g (0,34 x 10-3 mol) em 25 mL de cloreto de potássio 0,1 mol L-1. Foi escolhido esse valor porque é que é de 0,275 g. da proporção existente no comprimido para o etambutol, 59 4.1.2.4 Amostra do comprimido O comprimido inicialmente foi macerado em almofariz. A solução da amostra de comprimido foi preparada pesando-se 0,2848 g ( do comprimido) em 50 mL de cloreto de potássio 0,1 mol L-1. Foi deixado em agitação por 24 horas para uma melhor solubilização dos princípios ativos. A concentração esperada para os fármacos são: 0,0375 g de rifampicina, 0,0188 g de isoniazida, 0,100 g de pirazinamida e 0,0687 g de etambutol. 4.2 EQUIPAMENTOS E SISTEMA DE ELETRODOS 4.2.1 Medidas voltamétricas As medidas voltamétricas foram realizadas utilizando-se o Potenciostato/Galvanostato modelo PGSTAT 302N da Autolab/Eco Chemie e monitorado pelo software GPES 4,9 (Figura 11). Os estudos voltamétricos foram realizados em uma célula eletroquímica com capacidade de 100 mL, tendo o uso do sistema de três eletrodos: trabalho, referência e auxiliar. O software Origin 6,0 foi utilizado para o tratamento de dados. Figura 11 – Potenciostato/Galvanostato modelo PGSTAT 302N da Autolab/Eco Chemie Fonte: AUTOR, 2013 Para cada fármaco, foram feito diversos estudos como podem ser visualizados nos fluxogramas a seguir. Para o estudo da isoniazida, como 60 apresentados nas Figura 12.a.I e 12.a.II, foi composto pela análise da solução padrão utilizando a CV e DPV com os eletrodos de BDD e GC, e pela análise da solução do comprimido utilizando o DPV e o método de adição de padrão. Figura 12.a.I – Fluxograma do estudo realizado com a solução padrão de isoniazida Fonte: AUTOR, 2013 Figura 12.a.II – Fluxograma do estudo realizado com a solução do comprimido, com ênfase na isoniazida Fonte: AUTOR, 2013 Para o estudo do etambutol, como apresentado na Figura 13.b, foi composto pela análise da solução padrão utilizando a CV e DPV com o eletrodo de BDD e pela análise da solução do comprimido utilizando o DPV e o método de adição de padrão. 61 Figura 12.b – Fluxograma do estudo realizado com a solução padrão de etambutol e da solução do comprimido Fonte: AUTOR, 2013 Para o estudo da rifampicina, como apresentado na Figura 12.c, foi composto pela análise da solução padrão utilizando a CV e DPV com o eletrodo de BDD e pela análise da solução do comprimido utilizando o DPV e o método de adição de padrão. Figura 12.c – Fluxograma do estudo realizado com a solução padrão de rifampicina e da solução do comprimido Fonte: AUTOR, 2013 62 Para o estudo da pirazinamida, como apresentado na Figura 13.d, foi composto pela análise da solução padrão utilizando a CV e DPV com os eletrodos de BDD e GC. Figura 12.d – Fluxograma do estudo realizado com a solução padrão de pirazinamida Fonte: AUTOR, 2013 Para a obtenção dos perfis eletroquímicos dos fármacos pirazinamida, isoniazida, etambutol e rifampicina, foram utilizados os parâmetros segundo a Tabela 02, para a voltametria cíclica e, Tabela 03, para a voltametria de pulso diferencial. Para a obtenção dos perfis eletroquímicos usando as voltametria cíclica e voltametria de pulso diferencial, as medidas foram feitas no eletrólito de suporte de cloreto de potássio 0,1 mol L-1 em pH 4. Para o ajuste do pH foi necessário o uso das soluções de HCl 0,1 mol L-1 e NaOH 0,05 mol L-1. Utilizou-se a adição de 400 μL da solução padrão para a obtenção dos perfis usando a voltametria cíclica e voltametria de pulso diferencial; isso corresponde a 1,93 x 10-3 mol L-1 de pirazinamida, isoniazida e etambutol, e 0,121 x 10-3 mol L-1 de rifampicina. Tabela 02 – Parâmetros Para a Voltametria Cíclica PZA EMB RIF INH 10 mL 20 mL 20 mL 20 mL Volume do Eletrólito de Suporte 63 Potencial Inicial - 0,700 V - 0,250 V - 0,250 V - 0,250 V Potencial Final + 0,700 V + 1,70 V + 1,70 V + 1,70 V Velocidade de Varredura 0,100 Vs-1 0,100 Vs-1 0,100 Vs-1 0,100 Vs-1 Tabela 03 – Parâmetros para a Voltametria de Pulso Diferencial PZA EMB RIF INH 10 mL 20 mL 20 mL 20 mL Potencial Inicial - 0,700 V - 0,250 V - 0,250 V - 0,250 V Potencial Final + 0,700 V + 2,10 V + 1,70 V + 1,70 V 0,050 V 0,050 V 0,050 V 0,050 V Volume do Eletrólito de Suporte Modulação de Amplitude Para a quantificação da isoniazida e do etambutol foram preparadas curvas de calibração utilizando o método de adição de padrão em cloreto de potássio 0,1 mol L-1 cujo pH estudado foram 4 e 8. Para ajustar o eletrólito de suporte foi necessário o uso das soluções de HCl 0,1 mo lL-1 e NaOH 0,05 mol L-1. Os padrões rifampicina e pirazinamida não foram possíveis fazer a quantificação, pois não teve uma comportamento linear esperado entre as triplicatas. As adições foram de 100 a 800 μL, que correspondem a 0,250 a 1,90 x 10-3 mol L-1 para os padrões de isoniazida, etambutol e pirazinamida, e 0,310 a 2,40 x 104 mol L-1 para o padrão de rifampicina. Quanto às adições do método de adição de padrão foram de 50, 100 e 150 μL, que correspondem a 1,20 a 3,60 x 10-4 mol L-1 para os padrões de isoniazida e etambutol, e 1,50 a 4,40 x 10-5 mol L-1 para o padrão de rifampicina. Para a utilização dos resultados foi avaliada a reprodutibilidade das medidas voltamétricas. Para isto, os estudos foram feitos em triplicata usando a voltametria de pulso diferencial. 4.2.2 Sistema de eletrodos Os eletrodos de trabalhos utilizados foram: 1 – Eletrodo de Diamante Dopado com Boro foi montado no próprio laboratório com filmes de diamante sintético dopado com 3500 ppm de boro, θ = 0.85 cm2, feito prétratamento catódico com aplicação de -3000 mV por 900 s numa solução de ácido 64 nítrico. A limpeza é feita por tratamento eletroquímico, usando a técnica de voltametria cíclica durante 30 ciclos com intervalo de potencial entre 500 e 2100 mV numa solução de ácido sulfúrico. Posteriormente lavado com água destilada, antes de cada medida, somando um total de 15 minutos para cada limpeza. 2 – Eletrodo de Carbono Vítreo, marca Metrohn, θ = 0.2 mm2, foi tratado por polimento com alumina. Posteriormente lavado com água destilada antes de cada medida. Os eletrodos de referência e auxiliar, foram usados Ag/AgCl, KClsat. e fio de platina, respectivamente. Estes eletrodos foram lavados com água destilada antes de cada medida. 4.2.3 Célula eletroquímica Os estudos voltamétricos foram realizados em uma célula eletroquímica com capacidade para 100 mL, contendo um eletrodo de trabalho, um eletrodo de referência de prata/cloreto de prata e um eletrodo auxiliar de platina (Figura 13). Figura 13 – Célula eletroquímica Fonte: AUTOR, 2013 65 5 RESULTADOS E DISCUSSÕES 5.1 ISONIAZIDA 5.1.1 Perfil eletroquímico O estudo inicial do fármaco isoniazida foi feito utilizando a voltametria cíclica em cloreto de potássio 0,1 mol L-1 em pH 4, aplicando a faixa de potencial de -0,250 a 1,70 V para o eletrodo de BDD e de -0,200 a 1,20 V para o eletrodo de GC. A Figura 14 e 15 apresentam os voltamogramas cíclicos para a isoniazida com os eletrodos de trabalho de BDD e GC, respectivamente. O fármaco apresenta apenas um pico de oxidação em 1,19 V indicando um processo irreversível com o eletrodo de BDD, no entanto, com o eletrodo de GC, apresenta um pico de oxidação em 0,790 V apresentando deslocamento de 0,400 V devido à natureza do material usado como eletrodo de trabalho. Cabe ressaltar que o sinal em corrente mostrado pela isoniazida usando o eletrodo de BDD, é maior do que aquele obtido em GC. Figura 14 – Voltamograma cíclico da solução padrão de INH 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de BDD. Velocidade de varredura: 0,100 Vs-1 -4 1,0x10 1,19 -5 i/A 5,0x10 0,0 -5 -5,0x10 -4 -1,0x10 -0,5 0,0 0,5 1,0 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 1,5 66 -3 -1 -1 Figura 15 – Voltamograma cíclico da solução padrão de INH 1,92 x 10 mol L em 0,1 mol L KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de GC. Velocidade de varredura: 0,100 Vs-1. -5 6,0x10 0,79 -5 4,0x10 -5 i/A 2,0x10 0,0 -5 -2,0x10 -5 -4,0x10 0,0 0,5 1,0 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Na literatura tem alguns trabalhos que apresentam estudos eletroquímicos da isoniazida com diferentes eletrodos de trabalho e condições, como eletrólito, região de potencial aplicado, entre outros. Tong et al (1997) estudaram a oxidação eletroquímica catalisada pelo 2,2,6,6-tetrametil-4-acetilpiperidin-1-oxi (TMAPO) usando eletrodo de carbono vitreo. A voltametria cíclica da INH apresentou um pico de oxidação irreversível bem definido em 0,700 V na presença do TMAPO. Hamman et al. (2004) determinaram a isoniazida em formulações farmacêuticas usando o eletrodo de pasta de carbono. A voltametria cíclica da INH apresentou um pico de oxidação em 0,750 V. Gao et al, (2006) estudaram a oxidação eletroquímica catalisada pelo (ferrocenilmetil)trimetilamônio [(FcM)TMA]. A voltametria cíclica da isoniazida apresentou um pico de oxidação irreversível em 0,600 V na presença do (FcM)TMA. Majiri et al. (2006) determinaram a isoniazida em fórmulas farmacêuticas usando o eletrodo de carbono vítreo modificado com polipirrol. A voltametria cíclica do composto INH apresentou um pico de oxidação em 0,450 V pouco definido. Porém, quando utilizou-se o eletrodo modificado com polipirrol, o pico de oxidação apresentou-se bem definido e deslocado para 1,05 V. Yang et al. (2008) 67 determinaram a isoniazida em comprimidos e injeção usando o eletrodo de carbono vítreo modificado com ácido aminosulfônico. A voltametria cíclica do composto farmacêutico apresentou um pico anódico em 0,400 V. foi observado também que a corrente de pico é proporcional à velocidade de varredura. Bergamini et al. (2010) determinaram a isoniazida em urina humana usando eletrodo de carbono impresso modificado com poli-L-histidina como eletrodo de trabalho. A voltametria cíclica da isoniazida apresentou um pico catódico em -0,980 V. Yan et al. (2011) determinaram isoniazida em comprimidos utilizando a cronoamperometria com eletrodo de carbono vítreo modificado com carbono mesoporoso ordenado e Nafion (Nafion-OMC). Nesse trabalho, a voltametria cíclica da isoniazida apresentou dois picos de oxidação em 0,220 e 0,490 V. Vale salientar, que vários trabalhos existentes na literatura sobre a voltametria cíclica da isoniazida foram obtidos utilizando eletrodos quimicamente modificados. Enquanto que para a obtenção dos voltamogramas cíclicos da INH nesse trabalho, não foi necessário a modificação da superfície do eletrodo de trabalho. Apesar disso e baseados nesses trabalhos da literatura, o potencial observado em ambos os eletrodos a base de carbono (carbono vítreo e diamante) correspondem à oxidação da isoniazida. No caso do eletrodo de carbono vítreo, o potencial obtido nesse trabalho é similar àqueles reportados na literatura. Por outro lado, o eletrodo de diamante apresenta um potencial de oxidação da isoniazida parcialmente deslocado em 0,400 devido à morfologia da superfície do diamante sintético. Considerando esses resultados e os parâmetros cinéticos reportados por Mellado e colaboradores (1993) o mecanismo proposto para a oxidação da isoniazida, como processo irreversível, é: considerando que a reação (2) é a etapa que determina a velocidade da reação, como sugerido por Mellado et al. (1993). Estudos preliminares da isoniazida utilizando a técnica de voltametria de pulso diferencial (DPV) em cloreto de potássio 0,1 molL-1 em pH 4, aplicando a faixa de potencial de -0,250 a 1,70 V para o eletrodo de BDD e de -0,250 a 1,30 V para o eletrodo de GC, foram desenvolvidos. As Figuras 16 e 17 apresentam os 68 voltamogramas de pulso diferencial para a isoniazida com os eletrodos de trabalho de BDD e GC, respectivamente. Durante a varredura da DPV, a presença do fármaco em solução apresentou um pico, aparecendo em 1,16 V para o BDD e em 0,854 V no GC, apresentando um deslocamento de 0,302 V neste ultimo material, devido à natureza do material usado como eletrodo de trabalho. Figura 16 – Voltamograma de pulso diferencial da solução padrão de INH 0,980 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de BDD. Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 1,0x10 -4 5,0x10 -5 1,16 i/A 1,5x10 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Figura 17 – Voltamograma de pulso diferencial da solução padrão de INH 0,980 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de GC. Modulação de amplitude: 0,050 V. -5 1,5x10 0,854 -5 i/A 1,0x10 -6 5,0x10 0,0 0,0 0,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 1,0 69 A fim de demonstrar a eficiência do BDD em relação ao carbono vítreo, foram sobrepostos os dois voltamogramas da DPV do fármaco isoniazida, como apresentado na Figura 18. Este resultado indica novamente que a isoniazida é mais eletroativa a superfície do BDD, melhorando seu sinal devido ao efeito da área. Figura 18 – Voltamograma de pulso diferencial da solução padrão de INH 0,980 x 10-3 mol L-1 em -1 0,1 mol L KCl pH 4 usando o eletrodo de (a) GC e (b) BDD. Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 1,0x10 b -5 8,0x10 -5 i/A 6,0x10 -5 4,0x10 -5 2,0x10 a 0,0 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Antes de estudar a relação da concentração da isoniazida usando a técnica de DPV; o comportamento voltamétrico da isoniazida aos valores de pH 4 e 8, usando o eletrodo de BDD, foi estudado como mostrado na Figura 19. Assim, os voltamogramas mostraram um deslocamento do sinal da isoniazida para potenciais menos positivos, quando o meio aquoso se encontrava em pH 8, antecipando o potencial de oxidação observado a pH 4. Além disso, alturas em correntes correspondentes aos picos produzidos em ambos os valores de pH, foram similares; sugerindo que o pH não altera a eletroatividade. 70 -3 -1 -1 Figura 19 – Voltamogramas cíclicos da solução padrão de INH 1,92 x 10 mol L em 0,1 mol L KCl (a) pH 4. (b) pH 8.Velocidade: 0,100 V s-1. -4 2,0x10 -4 1,5x10 -4 i/A 1,0x10 b a -5 5,0x10 0,0 -5 -5,0x10 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 E / V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 O efeito da velocidade de varredura também foi investigado em ambos os valores de pH. Na Figura 20 é apresentado os voltamogramas obtidos com o aumento da velocidade de varredura (de 0,050 a 0,400 V s-1). Os resultados mostraram que não há uma relação linear entre a corrente do pico e a taxa de velocidade. O comportamento apresentado é que nas três primeiras velocidades (0,050, 0,100 e 0,150 Vs-1) a corrente de pico decresce linearmente, mas quando atinge a velocidade de 0,200 Vs-1, a corrente de pico aumenta linearmente. Este comportamento evidencia uma dependência de dois mecanismos de transporte de massa: migração e difusão. Nas velocidades de varredura menores, a transferência de massa até a superfície do eletrodo é controlada principalmente pela migração rápida das moléculas de isoniazida; entretanto, a taxas de velocidade maiores, o transporte de massa é predominantemente afetado pela difusão das espécies. 71 -3 -1 -1 Figura 20 – Voltamogramas cíclicos da solução padrão de INH 1,92 x 10 mol L em 0,1 mol L KCl (pH4), com a velocidade de varredura variando de 50 a 400 mV s-1 e o gráfico da relação de corrente vs. velocidade de varredura. -4 4,0x10 0,22 0,20 -4 3,0x10 i/mA 0,18 0,16 -4 2,0x10 0,14 8 12 16 0,5 i/A u 20 -3 (10 V) -4 -1 1,0x10 0,050 Vs -1 0,100 Vs -1 0,150 Vs -1 0,200 Vs -1 0,250 Vs -1 0,300 Vs -1 0,350 Vs -1 0,400 Vs 0,0 -4 -1,0x10 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Por outro lado, foi observado que a área do pico decresce exponencialmente com o aumento da velocidade, como apresentado na Figura 21, confirmando que com o aumento da velocidade de varredura, uma determinada concentração de isoniazida se encontra na superfície do eletrodo, produzindo uma resposta menor em termos de corrente. 72 Figura 21 – Gráfico da taxa de velocidade vs. área dos voltamogramas cíclicos da solução padrão de INH 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) 1,8 1,6 A (Adimensional) 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 6 8 10 12 u 14 0,5 16 18 20 -3 (10 V) Fonte: AUTOR, 2013 Para o pH 8, a isoniazida apresentou resultados similares, tanto para os valores de corrente, como para os valores de área, como apresentado na Figura 22. Figura 22 – Gráfico da taxa de velocidade vs. área dos voltamogramas cíclicos da solução padrão de INH 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl (pH 8) 1,8 1,6 A (Adimensional) 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 6 8 10 12 u 14 0,5 -3 (10 V) Fonte: AUTOR, 2013 16 18 20 73 Todavia, quando a concentração de isoniazida foi incrementada dentro da solução através de adições externas de padrão, o sinal em termos de corrente elétrica aumentou linearmente, como observado na Figura 23. Este resultado também foi observado para o valor de pH 8, confirmando o potencial da técnica como ferramenta para quantificar a isoniazida em amostras reais. -1 Figura 23 – Voltamogramas cíclicos da solução padrão de INH em 0,1 mol L KCl (pH4), com adição de a até e: 0,495, 0,980, 1,46, 1,92 e 2,38 x 10-3 mol L-1 de INH. Velocidade: 0,100 V s-1. -4 3,5x10 160 e 140 -4 3,0x10 120 i/mA 100 -4 2,5x10 d 80 60 c -4 i/A 2,0x10 40 y = 126x + 7,70 R² = 0,992 20 0,2 -4 0,4 0,6 0,8 -3 1,5x10 1,0 1,2 b -1 CINH/10 molL -4 1,0x10 a -5 5,0x10 0,0 0,5 1,0 1,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 5.1.2 Voltametria de pulso diferencial Estudos preliminares da técnica de DPV foram desenvolvidos usando o eletrodo de BDD em ambos os valores de pH, previamente estudados na voltametria cíclica. Comparando os voltamogramas obtidos em pH 4 e pH 8, apresentados na Figura 24, observa-se um deslocamento de 0,143 V para regiões de corrente mais positivas devido a forma protonada presente no pH 4 ou da forma não protonada presente no pH 8 da isoniazida em solução, mostrando maior eletroatividade para a superfície do eletrodo. 74 Figura 24 – Voltamogramas de pulso diferencial da solução padrão de INH 0,980 x 10-3 mol L1 em 0,1 mol L-1 KCl: linha preta – pH 4; linha vermelha – pH 8. Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 2,0x10 -4 1,5x10 1,110 i/A -4 1,0x10 1,253 -5 5,0x10 0,0 0,5 1,0 1,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 5.1.2.1 Curva analítica em pH 4 A obtenção da curva analítica através da adição de padrão para a quantificação do fármaco isoniazida em pH 4 foi feita utilizando a DPV em cloreto de potássio 0,1 mol L-1, aplicando a faixa de potencial de -0,250 a 1,70 V para o eletrodo de BDD. As curvas foram feitas em triplicata. A Figura 25 apresenta os voltamogramas de DPV para a isoniazida. A partir da Figura observa-se um incremento da corrente na medida em que a concentração de isoniazida aumenta. Os valores da corrente foram usados para obter a curva analítica (corrente de pico vs. concentração) e observou-se uma boa linearidade, pois o fator de correlação linear (R2) foi próximo de 1. As repetições da curva analítica da isoniazida também tiveram comportamentos similares, como observado na Figura 26, e proporcionando bons fatores de correlação linear, como apresentado na Tabela 04. 75 -1 Figura 25 – Voltamogramas de pulso diferencial de solução padrão de INH em 0,1 mol L KCl pH 4 com adição de (a) 0 mol L-1; (b) 0,249 mmol L-1; (c) 0,495 mmol L-1; (d) 0,739 -1 -1 -1 -1 mmol L ; (e) 0,980 mmol L ; (f) 1,22 mmol L ; (g) 1,46 mmol L ; (h) 1,69 mmol L 1 -1 ; (i) 1,92 mmol L de INH. Modulação de amplitude: 0,050 V. 2,0x10 -4 160 140 120 1,5x10 i/mA 100 -4 80 i 60 40 i/A 20 1,0x10 y = 75,4x + 4,73 R² = 0,998 0 -4 0,0 0,5 1,0 1,5 -3 CINH/10 molL 5,0x10 2,0 -1 -5 a 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Figura 26 – Curvas de calibração das repetições das medidas voltamétricas da solução padrão de INH em 0,1 mol L-1 KCl pH 160 140 120 i/mA 100 80 60 40 20 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 -3 4 1,2 -1 CINH/(10 molL ) Fonte: AUTOR, 2013 1,4 1,6 1,8 2,0 76 -1 Tabela 04 – Fatores de correlação linear das curvas de calibração obtidas para a INH em 0,1 mol L KCl pH 4 Curva Fator de Correlação Linear (R2) Primeira 0,997 Segunda 0,998 Terceira 0,998 5.1.2.2 Curva analítica em pH 8 A obtenção da curva analítica para a quantificação do fármaco isoniazida em pH 8 foi feita utilizando a DPV em cloreto de potássio 0,1 mol L-1, aplicando a faixa de potencial de -0,250 a 1,70 V para o eletrodo de BDD. As curvas foram obtidas em triplicata. A Figura 27 apresenta os voltamogramas de DPV para a isoniazida. Observa-se que, diferentemente do que ocorre em pH 4, a isoniazida não mantêm a relação de linearidade nas duas últimas adições, 700 e 800 μL (1,69 e 1,92 mmol L-1, respectivamente). Dessa forma, a curva analítica foi construída considerado os seis primeiros pontos. Embora a isoniazida apresente boa linearidade, pois os fatores de correlação linear (R2) são próximos de 1, como apresentado na Tabela 05. 77 -1 Figura 27 – Voltamogramas de pulso diferencial de solução padrão de INH em 0,1 mol L KCl pH 4 com adição de (a) 0 mol L-1; (b) 0,249 mmol L-1; (c) 0,495 mmol L-1; (d) 0,739 -1 -1 -1 -1 mmol L ; (e) 0,980 mmol L ; (f) 1,22 mmol L ; (g) 1,46 mmol L ; (h) 1,69 mmol L 1 -1 ; (i) 1,92 mmol L de INH. Modulação de amplitude: 0,050 V. 1,5x10 -4 80 1,0x10 -4 i/mA 60 i 40 i/A 20 y = 66,9x + 4,46 R² = 0,993 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 -3 5,0x10 1,0 1,2 1,4 -1 CINH/10 molL -5 a 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Tabela 05 – Fatores de correlação linear das curvas de calibração obtidas para a INH em 0,1 mol L-1 KCl pH 8 Curva Fator de Correlação Linear (R2) Primeira 0,993 Segunda 0,992 Terceira 0,993 Foi observado que com o aumento da concentração aumenta a corrente do pico, mantendo uma boa dependência linear, em ambos os valores de pH, gerando as seguintes equações de reta das curvas de calibração: pH 4 = (r = 0,998); pH 8 = (r = 0,993); Os limites de detecção e quantificação foram calculados utilizando as equações matemáticas apresentadas no Apêndice I. Os limites de detecção obtidos para o pH 4 e pH 8 foram 1,85 μ mol L-1 (0,253 ppm) e 1,23 μmol L-1 (0,169 ppm), 78 respectivamente. Enquanto que os limites de quantificação obtidos para o pH 4 e pH 8 foram 0,00615 m mol L-1 (0,844 ppm) e 0,00408 mmol L-1 (0,560 ppm), respectivamente. Na literatura foram obtidos valores de limite de detecção utilizando outros eletrodos de trabalho. Majidi et al. (2006) obteve o limite de detecção de 3,15 μmol L-1 com o eletrodo de carbono vítreo modificado com polipirrol. Yan et al. (2011) obteve o limite de detecção de 0,00850 μmol L-1 com o eletrodo de carbono vítreo modificado com carbono mesoporoso e Nafion. Vale salientar, que ambos trabalhos obteve esses limites de detecção baixos utilizando eletrodos modificados, e os limites de detecção obtidos no presente trabalho, de 1,85 e 1,23 μmol L-1 para os pH 4 e 8, respectivamente, pode ser mais econômica, sem a necessidade da modificação da superfície. Após essa análise, amostras sintéticas contendo isoniazida foram selecionadas para proceder a quantificação da concentração do principio ativo mediante o uso da técnica de DPV. 5.1.3 Determinação de INH em solução de concentração conhecida 5.1.3.1 Amostra sintética em pH 4 Utilizando o mesmo método de adição de padrão, uma amostra sintética foi preparada pesando 0,0187 g de isoniazida, quantidade similar presente em um comprimido de tratamento de tuberculose. Dessa forma, foi analisada uma solução de concentração previamente conhecida. Os voltamogramas de pulso diferencial obtidos da solução estão apresentados na Figura 28. Pode-se observar que, as adições da solução padrão mantêm uma relação linear entre as curvas facilitando a quantificação de isoniazida na amostra sintética. 79 -1 Figura 28 – Voltamogramas de pulso diferencial da solução de INH em 0,1 mol L KCl (pH 4) usando o método de adição de padrão. (a) 800 μL da amostra sintética. (b) 0,122 mmol L-1 de -1 -1 solução padrão. (c) 0,244 mmol L de solução padrão. (d) 0,365 mmol L μL de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V. 6,0x10 -5 45 40 d i/mA 35 30 25 4,0x10 -5 20 y = 73,8x + 18,3 R² = 0,999 15 0,0 0,1 0,2 -3 0,3 0,4 -1 i/A CINH/10 molL 2,0x10 -5 a 0,0 0,5 1,0 1,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Os resultados da recuperação da isoniazida, na amostra sintética, são apresentados na Tabela 06. A isoniazida apresentou uma recuperação de 128,23 a 137,28 % em relação à quantidade esperada de isoniazida na solução. -1 Tabela 06 – Teste de Recuperação da INH na solução de concentração conhecida em 0,1 mol L KCl pH 4 Medida pH 4 (%) Primeira 130,05 Segunda 137,28 Terceira 128,23 Assim, já que valores maiores do que 100% da quantidade esperada de isoniazida na solução foram encontrados; realizou-se o mesmo teste utilizando água deionizada com o objetivo de minimizar alguns possíveis interferentes (íons dissolvidos) presentes na água destilada. 80 Na Figura 29 podem ser observados os voltamogramas da amostra sintética de isoniazida em água deionizada. Os resultados foram similares aos apresentados na Figura 28, descartando possíveis interferentes na água destilada. Os valores de recuperação da isoniazida são apresentados na Tabela 07. Figura 29 – Voltamogramas de pulso diferencial da solução de INH em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) em água deionizada usando o método de adição de padrão. (a) 800 μL da solução sintética. (b) 0,122 mmol L-1 de solução padrão. (c) 0,244 mmol L-1 de solução padrão. (d) 0,365 mmol L-1 de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V. -5 6,0x10 45 d 40 i/mA 35 30 -5 4,0x10 25 y = 69,6x + 20,5 R² = 0,999 20 0,0 0,1 0,2 0,3 -3 0,4 -1 i/A CINH/(10 molL ) -5 2,0x10 a 0,0 0,5 1,0 1,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Tabela 07 – Teste de Recuperação da INH na solução em 0,1 mol L-1 KCl pH4 em água deionizada Medida pH 4 (%) Primeira 135,85 Segunda 137,48 Terceira 127,33 5.1.3.2 Amostra sintética em pH 8 Usando o mesmo método aplicado anteriormente, na Figura 30 estão os voltamogramas de DPV obtidos da solução em pH 8. Pode-se observar que, de forma semelhante à amostra sintética em pH 4, as adições da solução padrão 81 mantêm uma relação linear em função da corrente elétrica, tanto em água destilada assim como em água deionizada. Figura 30 – Voltamogramas de pulso diferencial da solução de INH em 0,1 mol L-1 KCl (pH 8) usando o -1 método de adição de padrão. (a) 800 μL da amostra sintética. (b) 0,122 mmol L de solução -1 -1 padrão. (c) 0,244 mmol L de solução padrão. (d) 0,365 mmol L de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V. 32 30 -5 28 4,0x10 d 26 i/mA 24 22 20 18 -5 3,0x10 y = 43,5x + 15,4 R² = 0,999 16 14 0,0 0,1 0,2 -3 0,3 0,4 -1 i/A CINH/(10 molL ) -5 2,0x10 a -5 1,0x10 0,0 0,5 1,0 1,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Entretanto, os resultados da recuperação da isoniazida, apresentados na Tabela 08, foram de 98,95 a 102,64 % em relação à quantidade esperada de isoniazida na solução. Tabela 08 – Teste de Recuperação da INH na solução de concentração conhecida em 0,1 mol L-1 KCl pH 8 Medida pH 8 (%) Primeira 101,13 Segunda 98,950 Terceira 102,64 82 Comparando os valores obtidos nos pH 4 e 8, observa-se que em pH 8 os valores estão em torno de 100%, enquanto que em pH 4, os valores apresentados na Tabela 06 chegam a atingir um erro acima de 30%. 5.1.4 Estabilidade da INH A estabilidade da isoniazida foi analisada por DPV usando o método de adição de padrão, fazendo uma medida por semana da mesma solução de padrão durante um mês. Observou-se que as curvas apresentaram o mesmo comportamento, não havendo grandes diferenças entre os valores de corrente, como mostrado na Figura 31. Os valores obtidos correspondentes à recuperação da INH ficaram entre 82,02 e 91,06 %, como mostrado na Tabela 09, em relação à quantidade esperada de isoniazida na solução. Figura 31 – Curvas de calibração das quatro medidas obtidas durante um mês da solução padrão de INH 1,92 x10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4. Primeira Curva Segunda Curva Terceira Curva Quarta Curva 35 30 i/mA 25 20 15 10 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 -3 0,25 -1 CINH/(10 molL ) Fonte: AUTOR, 2013 0,30 0,35 0,40 83 Tabela 09 – Valores de Recuperação de INH na solução padrão durante um mês Semana Recuperação de INH (%) Primeira 91,06 Segunda 82,07 Terceira 90,41 Quarta 84,65 5.1.5 Determinação da INH em comprimidos Após a otimização e padronização da metodologia de DPV, uma amostra real de um combinado farmacêutico, composta pelos quatro fármacos – isoniazida, etambutol, rifampicina e pirazinamida – foi analisada pelo método de adição de padrão. O voltamograma do comprimido, que é apresentado na Figura 32, apresenta três picos em 0,436, 1,025 e 1,322 V. O primeiro e o segundo picos são atribuídos ao fármaco rifampicina, devido aos resultados que serão apresentados posteriormente, enquanto que o terceiro pico é atribuído à isoniazida. Como primeira indicação, cabe ressaltar que comparando os voltamogramas de pulso diferencial do eletrólito em pH 4 e pH 8, observa-se que o voltamograma da solução em pH 8 apresenta picos parcialmente mais definidos do que o voltamograma da solução em pH 4. 84 -1 Figura 32 – Voltamogramas de pulso diferencial do comprimido em 0,1 mol L KCl (1) pH 4 e (2) pH 8. (a) e (b) RIF. (c) INH. Modulação de amplitude: 0,050 V. -5 3,0x10 2 -5 2,5x10 1 -5 2,0x10 c i/A -5 1,5x10 b -5 1,0x10 b a a -6 5,0x10 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 O método de análise utilizado foi o método de adição de padrão, consistindo em adicionar um volume conhecido de amostra na célula eletroquímica e depois fazer três adições de solução padrão de concentração conhecida. A Figura 33 apresenta os voltamogramas de DPV do comprimido em pH 8. Observa-se que há o aumento linear do pico (c) com o aumento da concentração da solução padrão de isoniazida, comprovando-se que o pico realmente corresponde ao processo irreversível da isoniazida. 85 -1 Figura 33 – Voltamogramas de pulso diferencial do comprimido em 0,1 mol L KCl (pH 8) usando o método de adição da solução padrão da INH. (a) sem presença da solução padrão de -1 -1 INH. (b) 0,122 mmol L de solução padrão. (c) 0,244 mmol L de solução padrão. (d) -1 0,365 mmol L de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V. -5 3,5x10 -5 d -5 c 3,0x10 i/A 2,5x10 -5 b 2,0x10 a -5 1,5x10 -5 1,0x10 -6 5,0x10 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 E / V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Os resultados da recuperação da isoniazida, em ambos valores de pH, são apresentados na Tabela 10. A isoniazida apresentou uma recuperação de 65,71 a 110,8% dependendo o pH usado, em relação à quantidade esperada de isoniazida na amostra. Tabela 10 – Teste de Recuperação da INH na amostra de comprimido em 0,1 mol L-1 KCl Medida pH 4 (%) pH 8 (%) Primeira 66,10 71,99 Segunda 81,90 110,8 Terceira 65,71 95,73 Os dados mostraram que os melhores resultados foram obtidos com o eletrólito em pH 8. Diante deste comportamento, o método proposto pode ser usado para a determinação da isoniazida em formulações farmacêuticas, preferencialmente em pH 8. Contrária aos resultados que até tem sido apresentados, uma vez que na amostra em pH 4 há uma grande perda de material, que pode ser devido aos 86 interferentes, baixa solubilização, ou influência das outras espécies ativas (protonadas/não-protonadas) na forma farmacêutica em pH 4, interferindo com o sinal correspondente a isoniazida. Na literatura tem alguns trabalhos sobre a determinação de isoniazida em formulações farmacêuticas usando métodos eletroquímicos. Tong et al. (1997) determinaram a isoniazida em comprimidos usando o método coulométrico utilizando o eletrodo de carbono vítreo como eletrodo de trabalho. A recuperação da isoniazida foi entre 87,0 e 95,0 % da quantidade esperada do fármaco, enquanto que pelo método espectrofotométrico de absorção na região do ultravioleta foi entre 86,0 e 91,0 %. Hamman et al. (2004) determinaram a isoniazida em formulações farmaceuticas usando a voltametria de onda quadrada com eletrodo de pasta de carbono. A recuperação da isoniazida foi 101% utilizando o método de curva analítica e de 99,5% da quantidade esperada de isoniazida usando o método de adição de padrão. Gao et al. (2006) determinaram a isoniazida em injeção e comprimido usando a voltametria de onda quadrada com eletrodo de platina modificado com (FcM)TMA. A recuperação da isoniazida foi entre 99,7 e 101% da quantidade esperada de fármaco para a injeção e, entre 98,9 e 101% da quantidade esperada do fármaco para o comprimido. Majidi et al. (2006) determinaram a isoniazida em formulas farmacêuticas usando a voltametria cíclica e amperometria. A recuperação foi de 98,5% para o método voltametrico e, de 98,9% para o método amperometrico. Yang et al. (2008) determinaram a isoniazida em comprimido e injeção usando eletrodo de carbono vítreo modificado com ácido aminosulfônico. Com o método proposto, obteve-se a recuperação da isoniazida entre 95,2 e 103% da quantidade esperada de INH para o comprimido e, entre 98,6 e 102% da quantidade esperada do fármaco para a injeção. Bergamini et al. (2010) determinaram a isoniazida em urina humana usando a voltametria de pulso diferencial com eletrodo de carbono impresso modificado com poli-L-histidina. A recuperação da isoniazida foi entre 96,8 e 104% da quantidade esperada do fármaco. Yan et al. (2011) determinaram a isoniazida usando um método cronoamperométrico com eletrodo de carbono vítreo modificado com OMC-Nafion. A recuperação do fármaco foi entre 96,4 e 102 %. O que pode ser observado é que os métodos eletroquímicos mostram-se eficientes na determinação da isoniazida quando comparado ao método padrão da 87 farmacopeia brasileira, que é a espectroscopia de absorção direta na região do ultravioleta com o comprimento de onda de 265 nm (BRASIL, 2010). 5.1.6 Interferentes Devido a pouca recuperação da isoniazida na amostra da forma farmacêutica em pH 4, foi investigado se algum principio ativo no comprimido pode estar interferindo durante a medida. Na Figura 32 é possível observar que a isoniazida e rifampicina têm picos que podem afetar seus sinais entre eles. Dessa forma, foi estudado se a rifampicina pode causar interferência na determinação da isoniazida, e vice-versa, como apresentado nas Figuras 34 e 35. Figura 34 – Voltamogramas de pulso diferencial da solução padrão de INH 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) juntamente com a curva analítica, (a) na ausência de RIF e com as concentrações de RIF de b até f: 0,308, 0,614, 0,916, 1,21 e 1,51 x 10-4 mol L-1. Modulação de amplitude: 0,050 V. 3,0x10 -5 1,2 2,5x10 1,0 -5 a bc d 2,0x10 -5 i / mA 0,8 0,6 0,4 e f i/A 0,2 1,5x10 -5 0,0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 -3 0,5 0,6 -1 CINH / (10 molL ) 1,0x10 -5 5,0x10 -6 0,0 0,0 0,5 1,0 E / V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 1,5 88 -4 -1 Figura 35 – Voltamogramas de pulso diferencial da solução padrão de RIF 1,21 x 10 mol L em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) juntamente com a curva analítica, (a) na ausência de INH e com -3 -1 concentrações de INH de b até f: 0,495, 0,980, 1,46, 1,92 e 2,38 x 10 mol L . Modulação de amplitude: 0,050 V. -5 4,0x10 35 f 30 -5 3,5x10 25 3,0x10 i / mA -5 e 20 d 15 -5 i/A 2,5x10 10 5 y = 48,5x + 0,686 R² = 0,998 -5 2,0x10 c 0 0,0 0,1 -5 0,2 0,3 0,4 -3 1,5x10 0,5 0,6 Fonte: 0,7 -1 CINH / (10 molL ) AUTOR, 2013 b -5 1,0x10 -6 a 5,0x10 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 E / V (vs. Ag/AgCl) Quando há adição do padrão de rifampicina à solução de isoniazida, representado na Figura 34, não aparece o segundo pico atribuído à rifampicina, porém o primeiro pico aumenta linearmente, mas depois se estabiliza. Porém quando há adição de padrão de isoniazida a solução de rifampicina, como apresentado na Figura 35, o segundo pico da rifampicina é totalmente encoberto pelo pico da isoniazida, havendo uma relação linear entre a corrente e a concentração de isoniazida. Assim, altas concentrações de rifampicina podem afetar a detecção de isoniazida devido à instabilidade da corrente; assim como, adições de isoniazida em solução favorecem uma recuperação mais eficiente a pH 4, devido à interferência da rifampicina presente no comprimido. 89 5.1.7 Degradação da INH Depois de um período de mais ou menos seis meses, a isoniazida degrada quando não armazenada de maneira correta. Na Figura 36 apresenta os voltamogramas de três soluções padrão de isoniazida feitas em diferentes períodos. -3 -1 Figura 36 – Voltamograma de pulso diferencial das soluções padrão de INH 1,92 x 10 mol L em 0,1 mol L-1 KCl. (a) no início dos experimentos; (b) depois de seis meses; (c) novo padrão sólido. Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 1,5x10 -4 1,2x10 a -5 9,0x10 i/A c -5 6,0x10 b -5 3,0x10 0,0 0,5 1,0 1,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Pode-se observar que quando a isoniazida está degradada (b) apresenta um pico deslocado para valores mais positivos de potencial, chegando a ter um deslocamento de 0,239 V em relação ao voltamograma da solução de isoniazida (a) usada no início das análises. Devido a esse problema, a amostra do padrão de isoniazida foi substituída, obtendo-se um voltamograma semelhante (c) ao apresentado no início das análises. 90 5.2 ETAMBUTOL 5.2.1 Perfil eletroquímico O estudo inicial do fármaco etambutol foi realizado utilizando a voltametria cíclica em cloreto de potássio 0,1 mol L-1 em pH 4, aplicando a faixa de potencial de -0,250 a 1,70 V para o eletrodo de BDD. A Figura 37 apresenta o voltamograma cíclico para o etambutol. O fármaco apresenta um processo irreversível, com um pico de oxidação em 1,422 V. Não foi possível fazer esse mesmo estudo com um eletrodo de carbono vítreo devido ao processo ocorrer em valores muito positivos de potencial. Figura 37 – Voltamograma cíclico da solução padrão de EMB 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de BDD. Velocidade de varredura: 0,100 Vs-1. -4 1,00x10 -5 7,50x10 -5 i/A 5,00x10 1,422 -5 2,50x10 0,00 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Um segundo estudo do etambutol foi realizado utilizando a voltametria de pulso diferencial em cloreto de potássio 0,1 mol L-1 em pH 4, aplicando a faixa de potencial de -0,250 a 2,10 V para o eletrodo de BDD. A Figura 38 apresenta o voltamograma de pulso diferencial para o etambutol. O fármaco apresenta um pico em 1,789 V. Como o etambutol apresenta um processo de oxidação com valor de 91 potencial muito alto positivamente, não foi possível analisá-lo com o eletrodo de carbono vítreo, pois a reação de formação de oxigênio, favorecida em valores superiores de potencial, impede a visualização do processo. -3 Figura 38 – Voltamograma de pulso diferencial da solução padrão de EMB 1,92 x 10 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de BDD. Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 4,0x10 -4 3,0x10 i/A -4 2,0x10 1,789 -4 1,0x10 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 5.2.2 Voltametria de pulso diferencial 5.2.2.1 Curva analítica em pH 4 A curva analítica para a quantificação do fármaco etambutol em pH 4 foi obtida utilizando a DPV em cloreto de potássio 0,1 mol L-1, aplicando a faixa de potencial de -0,250 a 2,10 V para o eletrodo de BDD. As curvas foram realizadas em triplicata. A Figura 39 apresenta os voltamogramas de pulso diferencial para o etambutol e observou-se que as adições de 100 e 200 μL (0,249 e 0,495 mmol L-1) não apresentavam picos referentes ao etambutol, assim só começou a ser observado a partir da adição de 300 μL (0,739 mmol L-1). As curvas de calibração para o etambutol apresentaram boa linearidade, como apresentado na Tabela 11. 92 Figura 39 – Voltamogramas de pulso diferencial de solução padrão de EMB em KCl 0,1 mol L-1 pH 4 -1 -1 -1 com adição de (a) 0,249 mmol L ; (b) 0,495 mmol L ; (c) 0,739 mmol L ; (d) 0,980 -1 -1 -1 -1 mmol L ; (e) 1,22 mmol L ; (f) 1,46 mmol L ; (g) 1,69 mmol L ; (h) 1,92 mmol L-1 de EMB. Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 6,0x10 40 35 30 -4 4,0x10 i/mA 25 20 15 y = 20,4x - 3,25 R² 0,993 i/A 10 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 -3 1,6 1,8 2,0 h -1 CEMB/(10 molL ) -4 2,0x10 a 0,0 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Tabela 11 – Fatores de correlação linear das curvas de calibração obtidas para o EMB em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 Curva Fator de Correlação Linear (R2) Primeira 0,992 Segunda 0,981 Terceira 0,988 5.2.2.2 Curva analítica em pH 8 A obtenção da curva analítica para a quantificação do fármaco etambutol em pH 8 foi obtida utilizando a DPV em cloreto de potássio 0,1 mol L-1, aplicando a faixa de potencial de -0,250 a 2,10 V para o eletrodo de BDD. As curvas foram feitas em triplicata. A Figura 40 apresenta os voltamogramas de pulso diferencial para o 93 etambutol. Enquanto que no pH 4, o pico começa a ser observado a partir da adição de 300 μL (0,739 mmol L-1), em pH 8, este sinal começa a ser observado a partir de 200 μL (0,495 mmol L-1). Dessa forma, para a curva analítica foi considerado mais um ponto em relação à curva em pH 4. Embora o EMB apresente boa linearidade, como apresentado na Tabela 12, os fatores de correlação linear obtidos em pH 4 foram melhores do que os fatores obtidos em pH 8. Figura 40 – Voltamogramas de pulso diferencial de solução padrão de etambutol 0,05 mol L-1 em 0,1 -1 -1 -1 mol L KCl pH 8 com adição de (a) 0,249 mmol L ; (b) 0,495 mmol L ; (c) 0,739 mmol -1 -1 -1 -1 -1 L ; (d) 0,980 mmol L ; (e) 1,22 mmol L ; (f) 1,46 mmol L ; (g) 1,69 mmol L ; (h) 1,92 -1 mmol L de EMB. Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 4,0x10 40 35 30 -4 3,0x10 i/mA 25 20 15 10 i/A -4 2,0x10 5 y = 22,7x - 5,34 R² = 0,993 0 0,0 0,4 0,8 1,2 -3 1,6 h 2,0 -1 CEMB/(10 molL ) -4 1,0x10 a 0,0 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Tabela 12 – Fatores de correlação linear das curvas de calibração obtidas para o EMB em 0,1 mol L-1 KCl pH 8 Curva Fator de Correlação Linear (R2) Primeira 0,974 Segunda 0,993 Terceira 0,985 94 Foi observado que com o aumento da concentração aumenta o valor da corrente do pico, mantendo uma boa dependência linear em ambos valores de pH, gerando as seguintes equações da reta das curvas de calibração: pH 4 = (r = 0,993); pH 8 = (r= 0,993); Os limites de detecção e quantificação foram calculados utilizando as equações matemáticas apresentadas no Apêndice I. Os limites de detecção obtidos para o pH 4 e pH 8 foram 1,40 μmol L-1 (0,283 ppm) e 1,91 μmol L-1 (0,390 ppm), respectivamente. Enquanto que os limites de quantificação obtidos para o pH 4 e pH 8 foram 0,00463 mmol L-1 (0,944 ppm) e 0,00637 mmol L-1 (1,30 ppm), respectivamente. Após essa analise, amostras sintéticas contendo etambutol foram selecionadas para quantificar a concentração do principio ativo mediante do uso da técnica de DPV. 5.2.3 Determinação de EMB em solução de concentração conhecida 5.2.3.1 Solução em pH 4 Uma amostra sintética foi preparada pesando 0,0687 g de etambutol, quantidade similar ao presente num comprimido de tratamento de tuberculose. Dessa forma, foi analisada uma amostra sintética de concentração previamente conhecida, a fim de aperfeiçoar a metodologia. Os voltamogramas de pulso diferencial obtidos da amostra sintética são apresentados na Figura 41 e pode-se observar que, as adições da solução padrão aumentam fracamente a corrente. 95 -1 Figura 41 – Voltamogramas de pulso diferencial da solução de EMB em 0,1 mol L KCl (pH 4) usando o método de adição de padrão. (a) 800 μL da solução-amostra. (b) 0,122 -1 -1 -1 mmol L de solução padrão. (c) 0,244 mmol L de solução padrão. (d) 0,365 mmol L de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 3,0x10 18 16 14 12 -4 2,0x10 i/mA 10 8 6 4 i/A 2 y = 35,6x + 2,92 R² = 0,976 d 0 0,0 0,1 0,2 -3 0,3 0,4 -1 CEMB/(10 molL ) -4 1,0x10 a 0,0 1,5 2,0 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Os resultados da recuperação de etambutol são apresentados na Tabela 13. O etambutol apresentou uma recuperação de 22,65, 16,27 e 31,97 % em relação à quantidade esperada de etambutol na amostra sintética. -1 Tabela 13 – Teste de Recuperação do EMB na solução de concentração conhecida em 0,1 mol L KCl pH 4 Medida pH 4 (%) Primeira 22,65 Segunda 16,27 Terceira 31,97 5.2.3.2 Solução em pH 8 Usando o mesmo método aplicado anteriormente, na Figura 42 estão os voltamogramas de pulso diferencial obtidos da solução em pH 8. Pode-se observar 96 que, de forma semelhante à amostra sintética em pH 4, as adições da solução padrão aumenta a corrente. Figura 42 – Voltamogramas de pulso diferencial da solução de EMB em 0,1 mol L-1 KCl (pH 8) usando o método de adição de padrão. (a) 800 μL da solução-amostra. (b) 0,122 -1 -1 mmol L de solução padrão. (c) 0,244 mmol L de solução padrão. (d) 0,365 mmol L 1 de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 2,0x10 10 9 8 7 -4 i/mA 1,5x10 6 5 d 4 i/A 3 1,0x10 -4 y = 18,2x + 2,70 R² = 0,998 2 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 -3 -1 0,30 0,35 0,40 CEMB/(10 molL ) 5,0x10 a -5 0,0 1,25 1,50 1,75 2,00 2,25 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Os resultados da recuperação do etambutol são apresentados na Tabela 14. O etambutol apresentou uma recuperação de 41,03, 31,08 e 51,66 % em relação à quantidade esperada de etambutol na solução. -1 Tabela 14 – Teste de Recuperação do EMB na solução de concentração conhecida em 0,1 mol L KCl pH 8 Medida pH 8 (%) Primeira 41,03 Segunda 31,08 Terceira 51,66 97 Comparando os valores obtidos nos pH 4 e 8, observa-se que os melhores resultados foram os obtidos em pH 8, porém os valores de recuperação do etambutol em relação à quantidade de etambutol na solução são muito baixos. Assim, o método não se mostrou eficaz na quantificação de etambutol na solução. 5.2.3 Determinação de EMB em comprimidos A amostra do combinado farmacêutico, composta pelos quatro fármacos – isoniazida, etambutol, rifampicina e pirazinamida – foi analisada pelo método de adição de padrão. Como o etambutol tem valor de potencial positivo muito alto, o sinal devido ao etambutol mostrou correntes baixas, como pode ser observado na Figura 43, voltamogramas de DPV obtidos nos pH 4 e 8 sobrepostos. Figura 43 – Voltamogramas de pulso diferencial da amostra do comprimido em 0,1 mol L-1 KCl (1) pH 4 e (2) pH 8. (a) e (b) RIF; (c) INH; (d) EMB. Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 3,0x10 -4 2,0x10 i/A 1 -4 d 1,0x10 2 b a c 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 O método de análise utilizado foi o método de adição de padrão, similarmente ao método usado com a isoniazida. A Figura 44 apresenta os voltamogramas de pulso diferencial da amostra do comprimido em pH 4. Observa-se que há um aumento linear do pico do EMB, em termos de corrente, conjuntamente com o 98 aumento da concentração da solução padrão, assim comprova-se que o pico realmente corresponde ao processo irreversível do etambutol. Figura 44 – Voltamogramas de pulso diferencial do comprimido em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) usando o método de adição de padrão EMB. (a) sem presença de padrão EMB. (b) 0,122 mmol L 1 -1 -1 de solução padrão. (c) 0,244 mmol L de solução padrão. (d) 0,365 mmol L de solução padrão. Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 4,0x10 25 20 15 -4 i/mA 3,0x10 10 5 i/A d y = 30,5x + 4,19 R² = 0,978 -4 2,0x10 0 0,0 0,2 0,4 -3 0,6 0,8 -1 CEMB/(10 molL ) -4 1,0x10 a 0,0 1,50 1,75 2,00 2,25 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Os resultados da recuperação da etambutol são apresentados na Tabela 15, sendo que valores entre 61,05 a 64,42 % em pH 4 foram obtidos, em relação à quantidade esperada de etambutol na solução. Valores baixos de recuperação foram obtidos em pH 8, indicando que o sinal deveria ser aperfeiçoado em termos de altura ou área do pico, a fim de aumentar a sensibilidade do método. Tabela 15 – Teste de Recuperação do EMB na amostra de comprimido em 0,1 mol L-1 KCl Medida pH 4 (%) pH 8 (%) Primeira 61,05 32,11 Segunda 63,08 68,69 Terceira 64,42 30,78 99 Os dados mostraram que os melhores resultados foram obtidos com o eletrólito em pH 4. Porém, a quantidade de recuperação do etambutol na amostra foi muito baixa, assim o método não é eficiente para a quantificação do fármaco na solução utilizando o eletrodo de diamante dopado com boro. 5.3 RIFAMPICINA 5.3.1 Perfil eletroquímico O estudo inicial do fármaco rifampicina foi feito utilizando a voltametria cíclica em cloreto de potássio 0,1 mol L-1 em pH 8, aplicando a faixa de potencial de -0,250 a 1,70 V para o eletrodo de BDD. A Figura 45 apresenta o voltamograma cíclico para a rifampicina. O fármaco apresenta dois processos irreversíveis, dos quais o primeiro pico em 0,490 V e o segundo em 1,051 V. Figura 45 – Voltamograma cíclico da solução padrão de rifampicina 6,2 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 8 com eletrodo de trabalho de BDD. Velocidade de varredura: 0,100 Vs-1. -5 6,0x10 -5 i/A 4,0x10 -5 2,0x10 1,05 0,490 0,0 0,0 0,5 1,0 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 1,5 100 Um segundo estudo preliminar da rifampicina foi desenvolvido utilizando a DPV em cloreto de potássio 0,1 mol L-1 em pH 4 e pH 8, aplicando a faixa de potencial de -0,250 a 1,70 V para o eletrodo de BDD. A Figura 46 apresenta o voltamograma de pulso diferencial para a rifampicina em pH 8. O fármaco apresenta dois picos em 0,422 e 0,960 V, respectivamente; como já observado na voltametria cíclica. O mesmo comportamento foi observado em soluções com pH 4, destacandose um pequeno deslocamento de ambos os picos para valores menos positivos de potencial. Figura 46 – Voltamograma de pulso diferencial da solução padrão de rifampicina 6,2 -3 -1 -1 x 10 mol L em 0,1 mol L KCl pH 8 com eletrodo de trabalho de BDD. Modulação de amplitude: 0,050 V. -5 1,2x10 -5 1,0x10 0,960 -6 8,0x10 i/A 0,422 -6 6,0x10 -6 4,0x10 -6 2,0x10 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00 1,25 1,50 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Baseados nos resultados obtidos durante a detecção de rifampicina e testes de solubilidade, o pH 8 foi preferencialmente escolhido para os experimentos de quantificação devido maior solubilidade e próximo ao pKa da rifampicina, 7,9. 101 5.3.2 Voltametria de pulso diferencial 5.3.2.1 Curva analítica em pH 8 Como o fármaco rifampicina apresentou melhor solubilidade em pH 8, o estudo da curva analítica para a sua quantificação foi feita apenas nesse pH. Esse estudo foi desenvolvido utilizando a DPV em cloreto de potássio 0,1 mol L-1, aplicando a faixa de potencial de -0,250 a 1,80 V para o eletrodo de BDD, como apresenta a Figura 47. Figura 47 – Voltamogramas de pulso diferencial de solução padrão de rifampicina 6,2 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 8 com adição de (a) 0,308 x 10-4 mol L-1; (b) 0,614 x 10-4 mol L-1; (c) 0,916 x 10-4 mol L-1; (d) 1,21 x 10-4 mol L-1; (e) 1,51 x 10-4 mol L-1; (f) 1,81 x 10-4 mol L-1; (g) 2,10 x 10-4 mol L-1; (h) 2,38 x 10-4 mol L-1. Juntamente com a curva analítica: pontos pretos – primeiro pico; pontos vermelhos – segundo pico. Modulação de amplitude: 0,050 V. -5 2,5x10 6 5 y = 23,9x + 0,685 R² = 0,997 -5 2,0x10 i/mA 4 3 2 -5 1,5x10 y = 17,3x + 0,162 R² = 0,997 i/A 1 0 0,00 -5 h 0,04 0,08 1,0x10 0,12 -3 0,16 0,20 -1 CRIF/10 molL -6 5,0x10 a 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 As adições foram feitas de 100 μL (0,0308 mmol L-1) a 800 μL (0,238 mmol-1) de solução padrão de rifampicina. As duas primeiras curvas apresentaram boa linearidade até 700 μL (0,210 mmol L-1). Porém a partir dessa adição de padrão, o voltamograma apresentou um comportamento decrescente. A corrente diminui com o aumento da concentração, o que caracteriza que o composto está adsorvendo-se 102 na superfície do eletrodo. Os dois picos apresentaram comportamentos semelhantes, como pode ser observado na curva analítica obtida a partir da relação entre a concentração e a altura de pico em termos de corrente elétrica, conforme mostrada na Figura 47. 5.3.3 Determinação de RIF em comprimidos A amostra do combinado farmacêutico, composta pelos quatro fármacos – isoniazida, etambutol, rifampicina e pirazinamida – foi analisada pelo método de adição de padrão. A rifampicina apresenta dois picos distintos no perfil da amostra. Como a rifampicina apresentou melhor solubilidade em meio básico, foi realizado a análise apenas em pH 8. Na Figura 48 apresenta o voltamograma de pulso diferencial obtido em pH 8. Figura 48 – Voltamograma de pulso diferencial da amostra de comprimido em 0,1 mol L-1 KCl pH 8. (a) RIF. Modulação de amplitude: 0,050 V. -5 2,0x10 -5 i/A 1,5x10 -5 1,0x10 a a -6 5,0x10 0,0 0,0 0,5 1,0 1,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 Com a adição de solução padrão de rifampicina, a espécie ativa apresentou um comportamento oposto ao que era esperado. Esperava-se que com o aumento da concentração, houvesse o aumento da corrente pico. No entanto, conforme visto 103 na Figura 49, isso não acontece. Quando aumenta a concentração, o pico apresenta um menor valor de corrente em relação ao ponto medido anteriormente. Isso é indicativo de que o composto está adsorvendo na superfície do eletrodo. Dessa forma, não foi possível quantificar a rifampicina. Esta característica é típica de compostos com uma estrutura química consideravelmente grande, em que alguns grupos funcionais são parcialmente oxidados e outros mostram alta eletroatividade pela superfície do eletrodo, adsorvendo-se rapidamente, passivando totalmente sua superfície para possíveis detecções. Alem disso, este resultado confirma o efeitointerferente que a rifampicina pode desenvolver durante a quantificação de isoniazida em altas concentrações. Figura 49 – Voltamogramas de pulso diferencial do comprimido em 0,1 mol L-1 KCl (pH 4) usando o método de adição de padrão de RIF. Linha azul – sem presença de padrão RIF. Linha preta – 0,308 x 10-4 mol L-1 de solução padrão de RIF. Linha vermelha – 0,614 x 10-4 mol L-1 de solução padrão de RIF. Linha verde – 0,916 x 10-4 mol L-1 de solução padrão de RIF. Modulação de amplitude: 0,050 V. 2,4 -5 2,0x10 2,2 i/mA 2,0 -5 1,5x10 1,8 1,6 i/A 1,4 1,2 -5 0 1,0x10 10 20 30 -6 40 50 -1 CRIF/(10 molL ) -6 5,0x10 0,0 0,0 0,5 1,0 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 1,5 104 5.4 PIRAZINAMIDA 5.4.1 Perfil eletroquímico O estudo inicial do fármaco pirazinamida foi feito utilizando a voltametria cíclica em cloreto de potássio 0,1 mol L-1 em pH 4, aplicando a faixa de potencial de -0,700 a 1,00 V para o eletrodo de BDD e de -0,900 a 0,900 V para o eletrodo de GC. As Figuras 50 e 51 apresentam os voltamogramas cíclicos para a pirazinamida com os eletrodos de trabalho de BDD e GC, respectivamente. O fármaco apresenta um processo irreversível de oxidação, em que no eletrodo de BDD está em 0,126 V e no eletrodo de GC é observado em 0,177 V, apresentando deslocamento de 0,051 V devido à natureza do material usado como eletrodo de trabalho. Figura 50 – Voltamograma cíclico da solução padrão de PZA 1,92 x 10-3 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de BDD. Velocidade de varredura: 0,100 Vs-1. 2,0x10 -4 0,126 i/A 0,0 -2,0x10 -4 -4,0x10 -4 -6,0x10 -4 -0,5 0,0 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 0,5 1,0 105 -3 -1 Figura 51 – Voltamograma cíclico da solução padrão de PZA 1,92 x 10 mol L em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de GC. Velocidade de varredura: 0,100 Vs-5 1,0x10 0,177 -6 5,0x10 0,0 -6 -5,0x10 i/A -5 -1,0x10 -5 -1,5x10 -5 -2,0x10 -5 -2,5x10 -5 -3,0x10 -0,5 0,0 0,5 1,0 E/V (vs. Ag/AgCl) 1 . Fonte: AUTOR, 2013 Um segundo estudo da pirazinamida foi feito utilizando a voltametria de pulso diferencial em cloreto de potássio 0,1 mol L-1 em pH 4, aplicando a faixa de potencial de -0,600 a 0,600 V para o eletrodo de BDD e de -0,900 a 0,900 V para o eletrodo de GC. A Figura 52 apresenta o voltamograma de pulso diferencial para a pirazinamida com o eletrodo de trabalho de BDD, sendo observado um pico de oxidação em 0,082 V. 106 -3 Figura 52 – Voltamograma de pulso diferencial da solução padrão de PZA 1,92 x 10 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com eletrodo de trabalho de BDD. Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 1,0x10 -5 8,0x10 0,082 i/A -5 6,0x10 -5 4,0x10 -5 2,0x10 -0,5 0,0 0,5 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 5.4.2 Determinação da faixa de concentração Para a determinação da faixa de concentração para o estudo da pirazinamida foi utilizada a voltametria de pulso diferencial em cloreto de potássio 0,1 mol L-1 em pH 4 com adições de 200 a 3000 μL da solução padrão de pirazinamida 0,05 mol L-1. A Figura 53 ilustra a curva analítica das adições de 200 (0,980 mmol L-1) a 3000 μL (11,5 mmol L-1) de solução padrão. A curva é dividida em duas partes distintas: região linear, formada pelas adições de 200 a 600 μL (2,83 mmol L-1); e a região constante, formada pelas demais adições. Dessa forma, a superfície do eletrodo mostra-se saturada a partir da adição de 800 μL (3,70 mmol L-1). 107 -3 -1 Figura 53 – Curva analítica das adições de 0,980 a 11,5 x 10 mol L de solução padrão de PZA em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 90 75 i/mA 60 45 30 15 0 0 2 4 6 -3 8 10 12 -1 CPZA/10 molL Fonte: AUTOR, 2013 Em um segundo estudo, usando a faixa de adições de 50 a 400 μL, foi possível obter a faixa de trabalho utilizada no trabalho. A Figura 54 apresenta os voltamogramas de pulso diferencial obtidos a partir das adições de 50 a 400 µL da solução padrão da pirazinamida e sua respectiva curva analítica. Esse estudo foi feito em triplicata. A pirazinamida apresenta o comportamento linear a partir da adição de 50 μL (0,249 mmol L-1) a 200 μL (0,980 mmol L-1). Dessa forma, a partir da adição de 250 μL (1,22 mmol L-1), a superfície do eletrodo já começou a apresentar saturação. Esse estudo permitiu determinar também as adições dos demais padrões trabalhados. 108 Figura 54 – Voltamogramas de pulso diferencial de solução padrão de pirazinamida 0,05 mol L-1 em 0,1 mol L-1 KCl pH 4 com adição de (a) 0 mol L-1; (b) 0,249 mmol L-1; (c) 0,495 mmol L-1; -1 -1 -1 -1 -1 (d) 0,739 mmol L ; (e) 0,980 mmol L ; (f) 1,22 mmol L ; (g) 1,46 mmol L ; (h) 1,69 mmol L ; -1 (i) 1,92 mmol L . Modulação de amplitude: 0,050 V. -4 1,4x10 80 70 60 -4 1,2x10 -4 1,0x10 i/mA 50 40 30 20 -5 10 i 8,0x10 0 i/A 0,0 0,5 1,0 1,5 -3 2,0 -1 CPZA/(10 molL ) -5 6,0x10 -5 4,0x10 -5 2,0x10 a 0,0 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 E/V (vs. Ag/AgCl) Fonte: AUTOR, 2013 5.4.3 Comportamento da pirazinamida no pH 8 Após os testes realizados com o fármaco pirazinamida em pH 4 usando o cloreto de potássio 0,1 mol L-1 como eletrólito de suporte, foram feitos experimentos com este fármaco em pH 8 usando-se o mesmo eletrólito de suporte. A Figura 55 apresenta os voltamogramas obtidos nessa condição e sua respectiva curva analítica. Observa-se que o fármaco pirazinamida apresentou melhor comportamento linear em pH 8 em relação ao pH 4, como apresentado na Figura 56. Porém, esse resultado não foi reproduzível, já que a repetição da curva analítica não foi mais possível. Após a obtenção do sinal correspondente da pirazinamida em pH 8, este comportamento pode ser devido a uma forte adsorção da espécies nãoprotonada da pirazinamida na superfície do eletrodo. Baseados na literatura existente, compostos aromáticos tem mostrado adsorção na superfície do BDD, após a aplicação de potenciais relativamente baixos, devido à formação eletroquímica de um polímero que é fortemente adsorvido. A formação deste filme 109 polimérico promove a desativação da superfície, e somente através de uma forte oxidação da superfície do BDD em elevados valores de potenciais, pode ser retirado mediante a formação de radicais hidroxilas. Por outra parte, se o filme não for eliminado, somente mediante um tratamento mecânico com isopropanol e ultrasonicação pode ocorrer a degradação. Diante deste quadro, o comportamento observado durante a detecção de pirazinamida, pode ser atribuído a formação deste filme polimérico. Foram utilizados outros eletrólitos de suporte em pH 8 como a solução-tampão de fosfato de potássio – hidróxido de sódio e a solução-tampão de Sörensen (Na2HPO4 – KH2PO4). Porém, o fármaco pirazinamida não apresentou processo eletroquímico. 110 6 CONCLUSÕES Com as técnicas de voltametria cíclica e de pulso diferencial é possível observar o perfil eletroquímico dos fármacos estudados. Com a voltametria cíclica, a isoniazida apresentou um deslocamento do sinal para potenciais mais negativos quando o meio aquoso encontrava-se em pH 8, usando o eletrodo BDD. Quando usado a VDP, a isoniazida apresenta um deslocamento de 0,143 V para regiões de corrente de pico mais positivas quando comparado os pHs de 4 e 8. Em pH 4, as curvas de calibração para a INH apresentaram boa linearidade, enquanto que em pH 8, a isoniazida não mantêm a linearidade em altas concentrações (> 1,69 x 10-3 molL-1). Os limites de quantificação obtidos para o pH 4 e pH 8 foram 0,00615 mmol L-1 (0,844 ppm) e 0,00408 mmol L-1 (0,560 ppm), respectivamente, usando o eletrodo BDD. Foi possível determinar INH em uma amostra sintética de concentração conhecida, havendo uma recuperação acima de 100% para o pH 4, chegando a atingir um erro acima de 30%. Enquanto que em pH 8 os resultados foram próximos de 100%. A isoniazida mostrou-se estável durante 4 semanas, porém é observada a degradação após 6 meses quando não armazenada de forma adequada. O método proposto para a determinação de INH em fármacos apresentou-se eficaz, pois apresentou recuperação em torno de 100%. Porém, em pH 8 obteve-se os melhores resultados. Para o etambutol, foi possível obter as medidas voltamétricas apenas com o eletrodo de diamante, devido à corrente de pico do processo de oxidação do fármaco acontecer em valores de corrente muito positivos. Obteve-se as curvas de calibração, porém observou-se que as adições de 100 e 200 μL não apresentaram picos referentes ao etambutol, no pH 4; e a adição de 100 μL não apresentou pico, no pH 8. As curvas de calibração apresentaram boa linearidade para ambos pH estudados, porém o pH 4 apresentou melhores resultados. Os limites de quantificação obtidos para o pH 4 e pH 8 foram 0,00463 mmol L-1 (0,944 ppm) e 0,00637 mmol L-1 (1,30 ppm), respectivamente, usando o eletrodo BDD. O método não se mostrou eficaz para determinar EMB em amostra sintética, nem em comprimidos, pois houve uma recuperação muito baixa em relação à 111 quantidade esperada de EMB, principalmente para o pH 4 (abaixo de 32%). Enquanto que a recuperação no comprimido foi apenas de 65%. A rifampicina apresentou dois processos de oxidação e foi possível obter as curvas de calibração em pH 8, pois em pH 4 apresentou baixa solubilidade. As curvas de calibração para a RIF apresentou boa linearidade. A determinação da RIF em comprimidos utilizando a VDP não foi possível devido à diminuição da corrente de pico com o aumento da concentração. A pirazinamida apresentou melhor linearidade em pH 8, porém não foi reprodutível devido à formação de um filme polimérico. Não foi possível observar um processo de oxidação relativo à PZA nos voltamogramas da amostra do comprimido, por isso não foram obtidos resultados quanto à determinação desse fármaco em formulações farmacêuticas. 112 7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS Diante dos resultados obtidos com esse trabalho, pode-se pensar em alguns pontos para serem estudados e otimizados futuramente: · Verificar a influência do eletrólito, podendo utilizar outros como fosfato e acetato, por exemplo; · Melhorar os parâmetros para possibilitar a determinação de etambutol em comprimidos; · Fazer novos testes com a rifampicina, solubilizando-o em um solvente orgânico como acetonitrila, por exemplo; · Mudar as condições para possibilitar a determinação da pirazinamida no comprimido. 113 REFERÊNCIAS AKYUZ, S.; ANDREEVA, L.; MINCEVA-SUKAROVA, B.; BASAR, G. Vibrational spectroscopic study of two dimensional polymer compounds of pyrazinamide. Journal of Molecular Structure, v. 834-836, p. 399-402, 2007. 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O limite de detecção pode ser expresso pela equação abaixo: Na qual: LD = limite de detecção; s = desvio-padrão da resposta; S =. coeficiente angular da curva analítica O desvio-padrão é calculado pela seguinte equação: Na qual: regressão; = resposta; = média das respostas; = números de pontos da = números de parâmetros da regressão (para regressão linear o = 2). I.2. LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO O limite de quantificação é definido como a menor concentração do analito que pode ser quantificada na amostra, com exatidão e precisão aceitáveis sob as condições experimentais adotadas. O limite de quantificação pode ser expresso pela equação abaixo: Na qual: LQ = limite de quantificação; s = desvio-padrão da resposta; S = coeficiente angular da curva analítica.
