Andressa Sodre.cdr - BVS MS

ESTUDO DA ATIVAÇÃO CONDICIONAL DE
LINFÓCITOS TRANSDUZIDOS COM RECEPTORES
QUIMÈRICOS (CAR) ATIVADORES
ANDRESSA SODRÉ (ME); LEONARDO CHICAYBAM; MARTIN BONAMINO
Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva , Coordenação de Pesquisa, RJ, Brasil
INTRODUÇÃO
RESULTADOS
Os Receptores Quiméricos de Antígeno (CARs) são utilizados como uma estratégia de imunoterapia para redirecionar a especificidade
de linfócitos T contra o tumor. Os CARs são compostos de uma unidade extracelular de reconhecimento (Fab na forma de scFv), uma
região transmembrana e um domínio intracelular de sinalização. Os CARs reconhecem o antígeno-alvo na superfície tumoral com alta
afinidade e independente de MHC, ativando os linfócitos através de endodomínios de sinalização, como a cadeia ζ (sinal 1), e de
domínios coestimulatórios, como 4-1BB (sinal 2). Moléculas de
superfície compartilhadas entre tumores e tecidos saudáveis
não são alvos ideais para as construções de CARs utilizadas
atualmente, pois elas podem promover respostas auto-imunes
devido ao estímulo via os sinais 1 e 2. Uma forma de contornar
esta limitação é condicionar a ativação dos CARs à presença de
mais de um antígeno de membrana, dividindo a ativação em
dois receptores: um ativando o sinal 1 e outro, o sinal 2. Neste
sistema, a resposta completa só deve ser alcançada quando
ambos os CARs interagem com seus antígenos-alvo. A ativação
condicional baseada na resposta a um painel de antígenos
pode tornar os linfócitos mais específicos contra o tumor,
poupando células normais, como no caso de precursores B
saudáveis (CD19+/CD20-) e células B em linfomas
Figura 1. Receptor Quimérico de Antígeno.
(CD19+/CD20+).
Figura 4. Trandução das linhagens
Jurkat 4.30 e K562. À esquerda,
marcação do CAR 20z na linhagem Jurkat
transduzida com o receptor 20z ou com
ambos os CARs, após pressão seletiva por
antibiótico. À direita, citometria de fluxo
da linhagem K562 transduzida com CD19,
CD20 ou ambos os antígenos-alvo.
Figura 5. Gráficos representando (a) a
expressão de luciferase após 8 horas de
incubação da linhagem Jurkat com
células K562, conforme descrito em
métodos, e (b) o percentual de células
CD69+ após co-cultivo de 4 horas. Tanto a
ativação através da translocação de NFAT
para o núcleo quanto a presença do
marcador CD69 foram observadas após a
incubação de Jurkat 20z com K5-20 e
Jurkat 20z/19BB com K5-20 ou K5-19/20,
mas não após o co-cultivo de Jurkat 19BB
com K5-19.
Control
Day 2
Figura 2. Hipótese do sistema de ativação condicional de linfócitos T.
OBJETIVOS
Figura 6. Viabilidade e expressão de
GFP após eletroporação de PBMC
através do sistema Sleeping Beauty.
Células mononucleares do sangue
periférico transfectada com GFP
expandem e persistem in vitro por até 13
dias, mantendo 34% de células positivas.
! Geração de linfócitos T expressando dois CARs: um scFv anti-CD20 contendo o domínio intracelular da cadeia ζ e outro, anti-CD19,
contendo o domínio intracelular da molécula co-estimulatória 4-1BB.
! Avaliação da ativação de células T transduzidas com os CARs complementares, através de ensaio de luciferase e análise da expressão do
marcador de ativação CD69.
! Utilização do sistema Sleeping Beauty baseado em transposon para a co-transfecção dos CARs em linfócitos T primários.
Day 13
METODOLOGIA
Os CAR 20z e 19BB foram gerados por SOE-PCR e clonados em vetores retrovirais com resistência a G418 ou Puromicina. Células da
linhagem Jurkat que expressam luciferase sob controle de um promotor responsivo a NFAT foram transduzidas com os CARs 20z e
19BB. Os linfócitos Jurkat expressando apenas um ou ambos os CARs foram co-cultivados com a linhagem leucêmica de K562
previamente modificada para expressar CD19 (K5-19), CD20 (K5-20) ou ambas as moléculas (K5-19/20) e, posteriormente,
avaliados por bioluminescência e expressão de CD69 in vitro. Para transfecção de linfócitos T primários, os CARs 20z e 19BB foram
sintetizados e clonados em um plsmídeo transposon, o qual é capaz de integrar no genoma das células T com o auxílio de uma
transposase Sleeping Beauty.
Figura 7. Eletroporação de PBMC
com os CARs complementares. Células
mononucleares do sangue periférico
transfectadas com 20z, 19BB ou ambos os
CARs são positivas para o transgene dois
dias após a eletroporação através do
sistema Sleeping Beauty.
CONCLUSÃO E PERSPECTIVAS
! Dados preliminares sugerem que o CAR 20z promove ativação de células T da linhagem Jurkat após estimulação com seus
antígenos-alvo.
! Linfócitos T primários podem ser modificados com os CARs através do sistema Sleeping Beauty baseado em
transposon/transposase.
! Ensaios in vitro e in vivo devem ser realizados para avaliar a resposta funcional e
citotoxidade contra o tumor em modelos in vivo.
Figura 3. Esquema da transdução da linhagem Jurkat com os CARs para posterior incubação com a linhagem leucêmica K562, modificada para
expressar os antígenos-alvo.
Apoio financeiro: Ministério da Saúde, CNPq, FAPERJ e CAPES.
Projeto Gráfico: Serviço de Edição e Informação Técnico-Científica / CEDC / INCA
Day 1