Utilização de plasmídeos vegetais derivados de vírus no
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Utilização de plasmídeos vegetais derivados de vírus no melhoramento genético e proteção de cultivos Prof. Dr. Felipe dos Santos Maraschin Laboratório de Fisiologia Vegetal – Instituto Biociências UFRGS Porto Alegre, RS Plasmídeos vegetais • Sistema de expressão transiente de amplo espectro – – – – – Simples administração Não transgênico Sem necessidade de cultura in vitro ou agentes de seleção Superexpressão constitutiva ou induzível, estável e duradoura Não herdável e não transmissível TYLCV • • • • Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) Geminivirus (ssDNA circular) Patógeno de diversas culturas pelo mundo Transmitido por Bemisia tabaci “whitefly” Ciclo de um Geminivirus TYLCV • Genoma circular ssDNA 6 ORFs • Região intergênica (IR) contém elementos para replicação pelo hospedeiro e funciona como um promotor bidirecional • Proteínas do hospedeiro geram novas cópias dsDNA • A proteína C1 é essencial para a produção de novos genomas ssDNA por replicação “rolling circle” • A proteína V1 codifica o capsídeo (CP) e é essencial para transmissibilidade • As proteínas V2, C2, C3 e C4 estão envolvidas na mobilidade viral, aparição de sintomas e na severidade da doença • Em suma, cinco ORFs não estão envolvidas na replicação e expressão do vírus Modificação do vírus • As proteínas do capsídeo viral V1, V2 estão envolvidas no movimento do vírus dentro da planta • TYLCV inoculados mecanicamente não causam infecção • Um isolado israelense (GenBank X15656) é capaz de causar infecção com inoculação mecânica • Remoção de 20 aa (60nt) N-terminais da proteína V1 (CP) tornou o vírus incapaz de gerar sintomas. Entretanto esta versão que é capaz de multiplicar-se e espalhar-se nos tecidos vegetais foi denominada IL-60 • TYLCV é funcional somente com pequenos insertos O sistema de expressão • Uma célula expressando V1,V2 replica autonomamente dsDNA contendo a IR. • Um plasmídeo contendo IR é capaz de se auto-propagar em células vegetais como um plasmídeo • ssDNA não é produzido e capsídeos virais não podem ser produzidos • O vetor pode ser propagado em E coli • O gene de interesse é colocado em um plasmídeo “satélite” que possui a região IR como promotor (p-IR). • A administração plasmídeo helper p1470 “ativa” a propagação do plasmídeo satélite Satélite (expressão) helper Ciclo do plasmídeo vegetal X X X X Outras células Expressão de genes exógenos • Inicialmente a expressão é limitada ao floema, e após alguns dias passa a espalhar-se para outros tecidos. DNA Silenciamento gênico • Expressão de dsRNA formando hairpin para silenciamento do gênico. • Expressão do operon prnABCD de Pseudomonas fluorescens em tomate. • Formação de um único mRNA policistrônico e acúmulos do composto funcional pyrrolnitrina. • O acúmulo de pyrrolnitrina confere resistência à infecção por R. solani. Vantagens do sistema • Facilidade: miniprep de 2 plasmídeos administrados mecanicamente na planta hospedeira. Somente uma clonagem é necessária • Altos níveis de expressão: comparáveis a CaMV::35S • Universalidade de hospedeiros • Estratégia não transgênica e com reduzidos riscos de biossegurança. USDA – Non GMO!!! • Limitação de fluxo gênico • Aplicação em espécies de difícil transformação • Expressão de operons sem a necessidade de transformação plastidial, rotas metabólicas co-expressas Resultados preliminares - UFRGS Tabaco Arroz Macieira Eucalipto Videira Projetos em colaboração • Embrapa Uva e Vinho, Bento Gonçalves, RS • Resistência à sarna da maçã (Apple scab) MSc.Roberta Cusin Sarna da maçã • • • • Causada pelo ascomiceto Venturia inaequalis Predominante em clima úmido temperado Causa perdas de até 100% nos pomares Quatro aplicações de fungicidas mais tratos culturais perfazem 20% do custo de produção • Fuji, Gala e Golden delicious são muito sucetíveis. Variedades resistentes à sarna • Vários acessos de germoplasma de Malus são resistentes à sarna • A resistência já foi mapeada e um gene, Vf2 oriundo de Malus floribunda, foi demonstrado como o responsável pelo fenótipo resistente • A introgressão genética nas variedades cultivadas pode levar décadas (até 20 anos) Mecanismo de resistência • Interação gene-a-gene • Proteínas R reconhecem efetores do patógeno (Avr genes) • Reconhecimento por uma proteína LRR identificada como Vf2 Viabilizar a introgressão imediata do gene de resistência nas variedades suscetíveis Fuji e Gala • Clonagem do gene Vf2 de Malus floribunda • Tratamento plantas Fuji e Gala com o gene de resistência • Genotipagem • Análise da expressão • Testes de patogenicidade Resultados Amostragens Abril 2015 15 e 30 dias – detecção DNA plamidial 240 dias – análise expressão gênica Expressão do gene de resistência nas plantas tratadas Macierias Gala e Fuji resistentes à sarna Modulação da expressão de gênica para obtenção de uvas apirênicas • Jaiana Malabarba – Doutoranda PPGBCM-UFRGS Orientação Giancarlo Pasquali e Luis Fernando Revers Fator de transcrição MADS • Presente em um QTL para apirenia em videira • MADS Box, gene candidato Modulação da expressão gênica • Superexpressão: Variedades apirênicas • Silenciamento:Variedades com sementes Resultados • A superexpressão restaurou parcialmente a formação de sementes em variedades apirênicas 100-200 fold increase! Resultados • O silenciamento por RNAi suprimiu a produção de sementes em variedades com sementes Agradecimentos • • • • Roberta Cusin Jonata Ribeiro Jaiana Malabarba Vitor Falavigna • Luis Fernando Revers, Embrapa • Sílvio André Meirelles Alves, Embrapa • Diogo Porto, Embrapa • Márcia Margis, UFRGS • Rogério Margis, UFRGS MUITO OBRIGADO! Felipe dos Santos Maraschin [email protected]
