associação de polimorfismos dos genes casp8 (-652 6n del), hla-g
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Universidade Federal do Pará Instituto de Ciências Biológicas Faculdade de Biomedicina Ana Paula Gomes Castro ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DOS GENES CASP8 (-652 6N DEL), HLA-G (14 PB IN/DEL), MTHFR (677 C>T) E SLC11A1 (1729 +55 DEL 4) COM VITILIGO. Belém – PA 2011 ii ANA PAULA GOMES CASTRO ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DOS GENES CASP8 (-652 6N DEL), HLA-G (14 PB IN/DEL), MTHFR (677 C>T) E SLC11A1 (1729 +55 DEL 4) COM VITILIGO. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina. Orientador: Prof. Dr. Eduardo José Melo dos Santos Belém – PA 2011 iii ANA PAULA GOMES CASTRO ASSOCIAÇÃO DE POLIMORFISMOS DOS GENES CASP8 (-652 6N DEL), HLA-G (14 PB IN/DEL), MTHFR (677 C>T) E SLC11A1 (1729 +55 DEL 4) COM VITILIGO. Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal do Pará, como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina. Belém, 19 de dezembro de 2009. Banca Examinadora: __________________________________ Prof. Dr. Eduardo José Melo dos Santos ICB-UFPA (Orientador) __________________________________ Prof. Dr. Leonardo dos Santos Sena (ICB-UFPA) __________________________________ M.Sc Janaína Mota de Vasconcelos (ICB-UFPA) __________________________________ Prof. Dra. Greice de Lemos Cardoso (ICB-UFPA) (Suplente) iv “Tudo tem o seu tempo determinado, e há tempo para todo o propósito debaixo do céu. Há tempo de nascer, e tempo de morrer; tempo de plantar, e tempo de arrancar o que se plantou” Eclesiastes 3:1-2 v A todos os pacientes que aceitaram participar deste estudo e a todas as pessoas que me apoiaram. vi Agradecimentos Agradeço primeiramente a Deus, por toda força e paz e por ter me ajudado a chegar até aqui. À minha família, por todo amor e carinho que ela sempre me ofereceu. Meu pai, por conseguir me fazer enxergar os problemas e me ensinar a procurar soluções. Minha mãe, por me dar força e a base necessária durante toda minha vida. Minha irmã, por me ajudar em todos os momentos possíveis e imagináveis, me dando apoio tanto nas horas calmas quanto nas de desespero. Ao meu orientador, prof. Eduardo Santos, pelo exemplo de perseverança, inteligência, humildade e paciência, valores que pretendo levar para toda a minha vida. Ao prof. Leonardo Sena, pelas orientações e apoio. À Prof. Dra. Regina Carneiro, por fornecer o contato com os pacientes e permitir que eu obtivesse as amostras. Aos amigos da biomedicina 2008, Bárbara, Felipe e Geison, companheiros de anos, que aguentaram comigo todos os momentos, sem os quais eu não teria chegado até aqui. Obrigada pelo apoio, alegria, trabalhos, risos, discussões e toda a ―adrenalina‖ que enfrentamos nesses anos. A toda a família LGHM, Maria Helena, Clayton e Paloma, pelo acolhimento no laboratório desde o início. Janaína, Danuta, Bruna, Larysse, Yukari e Layanna por todo o apoio e conhecimento que vocês me deram e pela amizade formada ao longo desses anos, nas tardes agradáveis no laboratório. Dafne, Jean, Lílian e Andreza, que sempre foram ótimas companhias, na bancada ou fora dela, pelas ajudas sinceras e por se mostrarem pessoas com quem eu sempre posso contar. Aos novatos do laboratório, Alene, Valéria e Marcus, sejam bem-vindos e espero que possam aprender tanto quanto ou mais do que eu aprendi, agradeço pela ajuda que vocês já em pouco tempo me deram. Ao Rai, pessoa maravilhosa que apareceu na minha vida com quem sempre posso contar. Até mesmo nos momentos de desespero em que nem o cérebro e nem o coração conseguiam suportar mais, era nele que encontrava abrigo. A todos os professores que contribuíram de forma positiva para a minha formação. A todos que me apoiaram de alguma forma e torceram pra que esse dia chegasse. À UFPA e à diretoria da faculdade de Biomedicina. vii SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS E TABELAS........................................................................... ix RESUMO.................................................................................................................. xi 1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 1 1.1. VITILIGO........................................................................................................ 1 1.2. CLASSIFICAÇÃO DO VITILIGO.................................................................... 1 1.3. DIAGNÓSTICO.............................................................................................. 2 1.4. TRATAMENTO............................................................................................... 3 1.5. EPIDEMIOLOGIA........................................................................................... 5 1.6. ETIOPATOGENIA.......................................................................................... 6 1.7. RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS NO VITILIGO.............................................. 8 1.7.1. Imunidade celular......................................................................................... 8 1.7.2. Imunidade humoral...................................................................................... 8 1.7.3. Apoptose...................................................................................................... 10 1.8. ASSOCIAÇÕES GENÉTICAS...................................................................... 11 1.9. CASPASE-8.................................................................................................. 12 1.10. HLA-G........................................................................................................... 14 1.11. MTHFR.......................................................................................................... 15 1.12. SLC11A1....................................................................................................... 17 2. JUSTIFICATIVA............................................................................................ 19 3. OBJETIVOS.................................................................................................. 20 3.1. OBJETIVO GERAL....................................................................................... 20 viii 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS......................................................................... 20 4. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................ 21 4.1. AMOSTRAGEM E EXTRAÇÃO DE DNA..................................................... 21 4.2. GENOTIPAGEM........................................................................................... 21 4.2.1. CASP8.......................................................................................................... 21 4.2.2. HLA-G........................................................................................................... 22 4.2.3. MTHFR.......................................................................................................... 22 4.2.4. SLC11A1....................................................................................................... 23 4.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA............................................................................... 23 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 25 6. CONCLUSÕES............................................................................................. 32 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 33 ix LISTA DE FIGURAS E TABELAS Página FIGURA 1: Representação dos mecanismos imunológicos celular e 10 humoral contra os melanócitos. FIGURA 2: Ativação da Caspase-8 através da ligação do FasL no 13 receptor Fas. FIGURA 3: Via principal de metabolismo de homocisteína. FTHF: formiltetrahidrofolato; MTHF: metilenotetrahidrofolato; 16 MTHFR: metilenotetrahidrofolato redutase; SAM: s-adenosilmetionina; SAH: sadenosilhomocisteina; THF: tetrahidrofolato; 5-MTHF: 5- metilenotetrahidrofolato; 5,10-MTHFR: 5,10-metilenotetrahidrofolato. FIGURA 4: Proteína SLC11A1 é recrutada para a membrana de 18 fagossomos maduros. Acredita-se que ele execute a excreção de íons bivalentes do interior da vesícula, inibindo assim a reprodução de microorganismos por privação de elementos essenciais. FIGURA 5: O sítio de restrição da enzima Hinf I e as sequências dos 23 primers forward (F) e reverse (R). Sequências intrônicas são distinguidas pelas letras minúsculas. FIGURA 6: Frequência dos genótipos do gene CASP8 nas amostras de 26 pacientes e controles. FIGURA 7: Frequência dos genótipos do gene HLA-G nas amostras de 26 pacientes e controles. FIGURA 8: Frequência dos genótipos do gene MTHFR nas amostras de 27 pacientes e controles. FIGURA 9: Frequência dos genótipos do gene SLC11A1 nas amostras 27 de pacientes e controles. A freqüência do genótipo DD foi praticamente de 0% em ambas as populações. FIGURA 10: Correlação entre a idade de início do vitiligo e a quantidade de alelos mutantes (HLA-G*del e/ou MTHFR*677T) nos pacientes. Nota- 29 x se que quanto mais alelos mutantes, menor a idade de início do vitiligo. Esse dado foi estatisticamente significante (p=0,009). A equação mostrada no gráfico refere-se à análise de regressão linear, podendo-se usá-la para prever a idade de início de acordo com o número de alelos HLA-G*del e/ou MTHFR*677T. TABELA 1: Distribuição das freqüências alélicas dos marcadores 25 testados em controles e pacientes e comparação das mesmas feita por teste de qui-quadrado. TABELA 2: Equilíbrio de Hardy-Weinberg demonstrado nas populações de pacientes e controles para cada marcador genético. 28 xi RESUMO O vitiligo é um distúrbio hipomelanótico adquirido, onde a perda de melanócitos funcionais e de melanina da epiderme gera o aparecimento de máculas ou placas despigmentadas circunscritas, com tendência a aumentar centrifugamente de tamanho. As principais hipóteses atualmente em discussão sobre a etiopatogenia da doença são a teoria neural, que sugere o acúmulo de substâncias químicas nas terminações nervosas que agem como uma toxina para os melanócitos; a teoria bioquímica, que sugere a produção de substâncias autocitotóxicas durante a melanogênese, causando um colapso na defesa de radicais livres e com isso destruindo os melanócitos; a teoria genética, que supõe que o vitiligo seja uma doença hereditária, causada por um componente multifatorial; e a teoria autoimune, que sugere que a destruição dos melanócitos seria causada pela ação do sistema imunológico, que é a teoria que mais apresenta evidências clínicas e mais amplamente discutida. Vários genes já foram associados com o vitiligo e os principais candidatos a associação são os genes participantes da pigmentação e os reguladores da resposta imune. Nesse estudo, alguns marcadores da resposta imunológica foram escolhidos para verificar a presença de associação. A caspase-8 é uma proteína iniciadora da apoptose, mecanismo responsável pela morte dos melanócitos, o polimorfismo -652 6N Del no gene CASP8 interfere nos níveis de transcrição do gene e na atividade da enzima. O HLA-G é uma molécula de HLA de classe I não clássica, que normalmente se liga a receptores inibitórios de leucócitos e células NK, o polimorfismo 14 pb ins/del interfere na expressão da molécula. O gene MTHFR codifica a enzima metileno-tetrahidrofolato redutase, que participa do metabolismo do folato e está ligado à proliferação e dano celular, o polimorfismo C677T produz uma enzima termolábil com uma eficiência diminuída, que está associada com uma maior eficiência do tratamento com metotrexato. O SLC11A1 produz uma proteína transportadora de cátions bivalentes, que participa da ativação dos macrófagos, o 1729 +55 del 4 é um polimorfismo in/del que regula a expressão do gene e a atividade da enzima. Foram genotipadas um total de 350 amostras de indivíduos controles e 61 de pacientes. Não foi encontrada diferença estatisticamente significante nas frequências alélicas e nos genótipos observados entre pacientes e controles, mas houve uma correlação entre a presença dos alelos HLA-G*del e/ou MTHFR*677T, indicando que quanto maior a quantidade desses alelos, menor a idade de início dos pacientes, e essa associação teve um p=0,009. Estudos mais aprofundados sobre as vias apoptóticas, ativação dos macrófagos e vias metabólicas do folato no vitiligo também podem ajudar na elucidação dos mecanismos responsáveis pelo surgimento da doença, bem como estudos com maior tamanho amostral. 1 1. INTRODUÇÃO 1.1. VITILIGO O vitiligo é um distúrbio hipomelanótico adquirido, onde a perda de melanócitos funcionais e de melanina da epiderme gera o aparecimento de máculas ou placas despigmentadas circunscritas, com tendência a aumentar centrifugamente de tamanho (Lerner & Nordlund, 1978; Nordlund & Majumder, 1997). As manchas hipocrômicas geralmente se localizam em áreas fotoexpostas como a face, dorso das mãos e ao redor de orifícios corporais (olhos, narinas, boca, mamilos, umbigo e genitália). A doença tem um curso com disseminação rápida e estabiliza após alguns meses, ou uma disseminação lenta e progressiva, podendo desenvolver-se por anos (Schwartz & Janniger, 1997). Os locais sujeitos a trauma, como os cotovelos, podem desenvolver vitiligo (fenômeno de Köebner). Estudos mostram que esse fenômeno está presente em proporção que varia de 21 a 60% dos pacientes com vitiligo, apesar de não ser específico dessa doença (Schwartz & Janniger, 1997; Barona, 1995). Os pêlos podem ser eventualmente acometidos (leucotriquia), incluindo sobrancelhas, cílios e pêlos pubianos (Steiner et al., 2004). O vitiligo foi observado pela primeira vez em 1500 a.C. Acredita-se que o termo vitiligo derive de vitelius (vitelo), do grego, e indica a semelhança das manchas brancas do vitiligo com aquelas do pêlo de um bezerro. Atribui-se o uso pioneiro do termo ao médico romano Celsus, no século II (Zhang et al., 2004; Schwartz & Janniger, 1997). 1.2. CLASSIFICAÇÃO DO VITILIGO Nos últimos 50 anos foram propostos sistemas de classificação por se reconhecer que nem todos os casos de vitiligo se comportam da mesma forma ou têm as mesmas características (Bellet & Prose, 2005). O vitiligo é mais frequentemente classificado clinicamente de acordo com a extensão e a distribuição da despigmentação, podendo ser localizado, generalizado ou universal (Steiner et al., 2004). 2 i) Vitiligo localizado: pode ser subdivido em focal e segmentar. O vitiligo focal é caracterizado por uma ou mais máculas na mesma área, não distribuídas de forma segmentar. Enquanto que o vitiligo segmentar acomete um segmento unilateral do corpo, ocorrendo geralmente na região de um dermátomo, dificilmente atinge outras áreas do corpo, tem início precoce (mais freqüente em crianças do que em adultos) e uma evolução rápida, que tende a cessar após um curto período de tempo (Steiner et al., 2004; Bellet & Prose, 2005; Kovacs, 1998; Njoo & Westerhof, 2001). ii) Vitiligo generalizado: é o tipo mais comum, afetando igualmente crianças e adultos, sua característica principal é a distribuição simétrica ou bilateral das manchas, ou seja, acometimento em ambos os lados do corpo, aproximadamente na mesma região, também é chamado de não-segmentar. Seus subtipos são o vitiligo acrofacial, que afeta orifícios faciais, como boca e olhos, e as extremidades corporais, como a parte distal dos dedos; o vulgar, que apresenta distribuição aleatória das manchas; e a forma mista, que é uma junção de acrofacial e vulgar ou de segmentar e acrofacial e/ou vulgar. Comparadas com as formas focal e segmentar, as não-segmentares tem início mais tardio e maior associação com autoimunidade (Steiner et al., 2004; Kovacs, 1998; Njoo & Westerhof, 2001). iii) Vitiligo universal: nesse caso, a superfície corporal é quase ou totalmente afetada, o vitiligo pode ser considerado universal quando atinge mais de 50% da área de superfície da pele (Steiner et al., 2004; Kovacs, 1998; Njoo & Westerhof, 2001). 1.3. DIAGNÓSTICO A história clínica e o exame físico, considerando-se o desenvolvimento e aspecto característico das manchas, constituem-se na base para o diagnóstico de vitiligo. A lâmpada de Wood é muito útil para caracterizar a extensão da despigmentação, pois o vitiligo apresenta um padrão de despigmentação completa, com bordas bem delimitadas e ressaltando uma fluorescência branco-azulada na pele lesada, permitindo diferenciá-lo de outras doenças que apresentem lesões mais claras e limites irregulares. É importante investigar alguma outra enfermidade que possa estar associada à presença do vitiligo, como algumas doenças auto-imunes (Lopes, 2006). 3 Raramente é necessário fazer uma biopsia diagnóstica. Caso seja feito um exame histopatológico, observa-se uma ausência de melanócitos epidérmicos e melanina na lesão, sendo encontrados apenas na pele marginal às manchas, esses melanócitos apresentam-se aumentados, com processos dendríticos alongados. O aparecimento de células T e macrófagos na pele marginal coincide com o desaparecimento de melanócitos (Schwartz & Janniger, 1997; Crowson et al., 2004). O diagnóstico diferencial deve ser feito com hanseníase, piebaldismo, hipomelanose de Ito, esclerose tuberosa, melanoma associado à leucodermia, micose fungóide, lúpus eritematoso, sarcoidose, líquen escleroso, nevo halo, pitiríase versicolor, hipomelanose pós-inflamatória e hipomelanose gutatta idiopática (Steiner et al., 2004; Lopes, 2006). 1.4. TRATAMENTO O tratamento para vitiligo ainda é um grande desafio, uma vez que existem várias teorias que sugerem a etiopatogenia da doença, mas nenhuma delas ainda é confirmada, além do fato de que cada paciente responde de forma diferente a vários tipos de tratamento. Estudos mostram que apenas 16 – 36% dos dermatologistas alcançam um bom resultado terapêutico ao tratar pacientes com vitiligo (Njoo et al., 1999; Ongenae et al., 2004). O objetivo dos tratamentos propostos até agora é estimular a repigmentação das áreas lesadas, embora em alguns casos de vitiligo universal a melhor saída seja a despigmentação das áreas normais restantes (Steiner et al., 2004, Kakourou, 2009). Starricco, em 1959, demonstrou que os melanócitos presentes nas lesões não sintetizavam melanina em condições normais, porém tornavam-se ativos quando estimulados pela luz ultravioleta ou pela dermoabrasão. O autor concluiu que os melanócitos eram capazes de se mover ao longo da epiderme e tornarem-se morfológica e funcionalmente maduros. Mais tarde, Cui et al. (1991) estudaram os diferentes estágios de repigmentação e confirmaram a existência de uma reserva de melanócitos nos folículos pilosos. Segundo Drake et al. (1996), esses melanócitos juntamente com os da pele marginal pigmentada são atuantes no tratamento e recuperação dos pacientes. Por isso, lesões no rosto e no pescoço respondem melhor aos tratamentos do que aquelas localizadas no tronco e especialmente nas 4 extremidades distais e nas proeminências ósseas, onde há baixa densidade ou mesmo ausência de folículos pilosos (Kakourou, 2009). Alguns dos tratamentos mais utilizados são: i) Corticosteróides: é frequentemente o primeiro tratamento de escolha principalmente nos casos de vitiligo localizado. Sua ação pode diminuir o efeito de anticorpos contra os melanócitos, pode ser utilizado por via oral, tópica, intralesional ou intramuscular, mas tem a desvantagem de poder causar alguns efeitos colaterais como epigastralgia, aumento de peso, erupções acneiformes, estrias, insônia e osteoporose. ii) Imunomoduladores: a ação destes medicamentos é baseada na teoria de que existe uma agressão do sistema imune aos melanócitos, nesse sentido a utilização de drogas imunomoduladoras e imunossupressoras parece bastante promissora e tende a evoluir à medida que crescem os conhecimentos sobre a fisiopatologia da doença. iii) PUVA terapia: é a fotoquimioterapia com utilização de componentes psoralênicos e subsequente exposição aos raios UVA. É um tratamento demorado que requer muito cuidado com relação aos tempos de exposição. A resposta terapêutica depende do local anatômico da lesão, máculas na face costumam responder melhor, mas esse tratamento apresenta uma grande gama de efeitos colaterais. iv) UVB de banda estreita: A radiação ultravioleta B é conhecida como importante fator de estimulação para a síntese de melanina na pele pelo aumento da atividade da tirosinase e do estímulo na proliferação de melanócitos. O uso de uma faixa monocromática de 311 nm diminui os efeitos colaterais presentes na PUVA terapia, mas ainda apresenta resultados variados dependendo do local da lesão. Uma variação da UVB de banda estreita é a microfototerapia, que tem a vantagem de direcionar o feixe apenas para as áreas afetadas pelo vitiligo. v) Luz monocromática de excimer: A aplicação do excimer laser com 308 nm no tratamento do vitiligo e outras doenças inflamatórias tem demonstrado resultados superiores a outros tratamentos convencionais, apresentando repigmentação com menor número de sessões, maior tempo de remissão e menor número de efeitos colaterais, no entanto, ainda é um tratamento de custo elevado. vi) Tratamentos cirúrgicos: Apesar da grande variedade de terapias clínicas existentes para o vitiligo, um grande número de pacientes não respondem a 5 elas. Assim, o enxerto ou transplante de melanócitos pode ser uma alternativa de tratamento para esses casos mediante a deposição de grupamentos de células funcionantes no local afetado. Essa modalidade terapêutica, entretanto, só é válida para doença estável (sem aparecimento de novas lesões ou aumento das já existentes). vii) Antioxidantes: as vitaminas C e E tem sido usadas para tratar vitiligo devido às suas propriedades antioxidantes, com base na teoria de que a produção de radicais livres nos melanócitos poderia causar a sua destruição, levando assim à despigmentação cutânea. Muitos desses tratamentos podem ser usados em associação (terapia combinada), apresentando melhores resultados que quando usados separadamente (Steiner et al., 2004; Kakourou, 2009; Bellet & Prose, 2005; Metelmann, 2005). 1.5. EPIDEMIOLOGIA O vitiligo é considerado a hipomelanose adquirida mais freqüente, principalmente em crianças. A prevalência da doença varia de 0,5 a 2% na população mundial, no entanto essa prevalência varia consideravelmente entre os grupos étnicos nas diferentes regiões do planeta. No Japão ela alcança de 2 a 4%, 1% nos EUA e 0,14% na Rússia, segundo dados de Nordlund e Majumder (1997). No Brasil ainda há uma escassez de dados sobre o perfil epidemiológico da população de pacientes com vitiligo. Estima-se que a população total de vitiligo no mundo seja de 40 a 50 milhões de pessoas (Ruiz-Argüelles et al., 2007). A ocorrência da doença é levemente maior no sexo feminino, alguns estudos sugerem que a maior preocupação estética das mulheres e maiores consequências psicossociais originadas pelo vitiligo seriam a causa deste fato, no entanto esses dados não são significantes, uma vez que estudos mostram que o acometimento é igual entre os sexos (Sehgal & Srivastava, 2007; Liu et al., 2005). O vitiligo também não depende de etnia ou idade, mas na população mundial, em torno de 50% dos casos aparecem antes dos 20 anos de idade, em 25% dos casos a idade de início é antes dos 14 anos e 23 a 26% das crianças afetadas têm menos de 12 anos de idade (Kovacs, 1998; Handa & Dogra, 2003; Jaisankar, 1992). 6 Casos familiares de vitiligo são comuns, em torno de 6 a 38% dos pacientes tem membros da família com a doença, o que indica um fator hereditário atuante. No entanto, estudos indicam que o vitiligo não é transmitido por um padrão mendeliano simples, sendo mais provavelmente uma herança poligênica (Majumder, 1993). 1.6. ETIOPATOGENIA O mecanismo responsável pela formação e desenvolvimento das lesões características do vitiligo ainda não está totalmente elucidado. Muitas teorias foram e tem sido propostas para explicar a patogênese da doença e embora todas elas apresentem evidências convincentes, nenhuma delas é considerada como única responsável ou necessária para a ocorrência da doença (Ongenae et al., 2002). Existem três principais teorias atualmente em discussão que tentam explicar a etiologia do vitiligo, a teoria neural, teoria bioquímica e a teoria autoimune. A teoria genética não está entre as três principais, mas ainda é bastante discutida (Ongenae et al., 2003; Passeron & Ortonne, 2005; Kemp et al., 2007). i) Teoria neural: essa teoria sugere que o acúmulo de uma substância química liberada pelas terminações nervosas ou produzida por elas haja como uma toxina, causando danos aos melanócitos e prejudicando a produção de melanina. Essa teoria é mais frequentemente relatada para os casos de vitiligo segmentar, devido a sua distribuição característica, afetando regiões de dermátomos. O fato de os melanócitos serem originados da mesma linhagem embriológica que o sistema nervoso, ou seja, da crista neural, corrobora essa teoria, pois assim é possível supor que qualquer processo que seja danoso aos melanócitos pode também afetar células do sistema nervoso central (Reedy et al., 1998; Barnes, 1988; Rezaei et al., 2007; Ongenae et al., 2003). ii) Teoria bioquímica: sugere que durante a melanogênese, os melanócitos produziriam substâncias autocitotóxicas causadoras de danos aos melanócitos, gerando um desequilíbrio bioquímico complexo. Essas substâncias causariam um colapso na defesa de radicais livres, produzindo uma grande quantidade de peróxido de hidrogênio. O estresse oxidativo gerado, prejudicial aos melanócitos, levaria a sua autodestruição. Essa teoria é corroborada pelo fato de que o aumento de agentes pro-oxidantes, bem como a diminuição de agentes anti- 7 oxidantes tem sido relatados em pacientes com vitiligo. Além disso, vários estudos detectaram evidências de dano induzido pelo estresse oxidativo na epiderme de áreas afetadas pelo vitiligo (Kemp et al., 2007; Koca et al., 2004). iii) Teoria genética: devido aos vários casos de vitiligo familiar encontrados na população, acredita-se que o vitiligo seria uma doença hereditária. Estudos em famílias permitem sugerir três modelos genéticos de herança do vitiligo. Nath et al. (1994) sugerem que há um componente multifatorial, que seria responsável pela apresentação clínica variável que é característica da doença. Outro estudo sugere que há dois modelos de herança coexistentes para o desenvolvimento do vitiligo, que dependem da idade de início da doença. Em pacientes com idade de início precoce (antes dos 30 anos), a herança se assemelha mais com o modelo de dominância com penetrância incompleta, enquanto que idade de início depois dos 30 anos estaria mais associada com um modelo recessivo multilocular juntamente com fatores ambientais (Arcos-Burgos et al., 2002). iv) Teoria autoimune: de todas, essa é a teoria que mais apresenta evidências clínicas descritas na literatura e a mais amplamente aceita e discutida. Vários estudos sugerem que o vitiligo é uma doença autoimune que tem como alvo as células pigmentares. A freqüente associação do vitiligo com algumas doenças autoimunes tais como doença de Addison, lúpus eritematoso sistêmico, anemia perniciosa, diabetes mellitus tipo I e doenças da tireóide, permite supor que o vitiligo faça parte de uma síndrome autoimune maior. Além disso, a presença de autoanticorpos contra os melanócitos e a infiltração de linfócitos T citotóxicos em volta das áreas de despigmentação, a eficácia da utilização de tratamentos imunomoduladores, bem como a associação da doença com diversos genes relacionados à resposta imunológica, como alguns genes do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) de classe II, são evidências que corroboram esta teoria. Alguns estudos utilizando modelos animais também indicam uma imunopatogênese para o vitiligo (Ongenae et al., 2003; Rezaei et al., 2007; Passeron & Ortonne, 2005; Wang & Erf, 2004). Embora todas essas hipóteses tenham evidências clínicas convincentes, nenhuma delas consegue explicar sozinha a patogênese do vitiligo. Por isso, outros estudos sugerem que todos esses fatores podem agir conjuntamente para a obtenção do mesmo efeito, a destruição dos melanócitos, essa é a proposta da ―teoria da convergência‖. Por exemplo, o estresse oxidativo dos melanócitos pode 8 ativar células dendríticas, fazendo com que a autoimunidade surja como um fenômeno secundário na destruição dos melanócitos, aumentando os danos a essas células (Le Poole & Luiten, 2008). 1.7. RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS NO VITILIGO 1.7.1. Imunidade celular A descoberta de células T infiltradas na margem de lesões inflamatórias de vitiligo foi a primeira indicação de participação da imunidade celular na patogênese do vitiligo. Uma proporção significativa de pacientes apresenta aberrações nos perfis de células T e células natural killer (NK) (Ongenae et al., 2003). Estudos imuno-histoquímicos da área perilesional de lesões de vitiligo detecta principalmente células T CD4 e CD8, com uma relação CD8/CD4 aumentada, mostrando que as células T CD8+ são mais freqüentes nas lesões. Além disso, altas frequências de células T CD8+ específicas para Melan-A (uma proteína antigênica específica de melanócitos) têm sido encontradas em pacientes com vitiligo, fato que parece estar correlacionado com a extensão e severidade da doença (Ogg et al., 1998; Lang et al., 2001; Ongenae et al., 2003). Também é importante ressaltar que muitos dos linfócitos T que se infiltram nas lesões expressam o antígeno linfocítico cutâneo (CLA), que é típico dos linfócitos T residentes na pele, indicando que há um recrutamento de células participantes da resposta imune que circulam ao redor das áreas afetadas (Hann et al., 1993). Os macrófagos também têm sido demonstrados nas lesões de vitiligo, principalmente na pele perilesional, supõe-se que os macrófagos estejam envolvidos na fagocitose de melanócitos que teriam sofrido apoptose através da ação de linfócitos T citotóxicos (Rezaei et al., 2007). 1.7.2. Imunidade humoral Muitos autoanticorpos circulantes já foram encontrados no soro de pacientes com vitiligo, no entanto apenas alguns deles são específicos para os melanócitos. Os autoanticorpos devem se ligar a antígenos de superfície para que possam levar à destruição dos melanócitos, e apenas a TRP 1 (Proteína 1 Relacionada à Tirosinase) foi encontrada expressa na superfície de células 9 pigmentares. Estudos realizados em camundongos mostraram que a injeção de anticorpos monoclonais para TRP 1 induz a regressão de melanoma e a uma despigmentação similar ao vitiligo (Takechi et al., 1996; Hara et al., 1995). Experimentos utilizando imunofluorescência mostraram que a ligação de anticorpos IgG de pacientes com vitiligo a melanócitos cultivados aumenta com a extensão e atividade da doença, embora outros estudos indiquem que a atividade da doença está relacionada aos níveis de anticorpos antimelanócitos IgA (Yu et al., 1993; Aronson & Hashimoto, 1987). No entanto, esses dados não podem provar um envolvimento direto desses anticorpos com a perda de melanócitos observada em pacientes com vitiligo, uma vez que nenhum dos vários antígenos identificados como alvo dos autoanticorpos mostrou ser de importante participação na doença. O mecanismo de surgimento dos autoanticorpos ainda não está elucidado. Uma predisposição genética que leve a uma desregulação dos níveis de linfócitos T e B, reação cruzada com antígenos expressos em outras células-alvo ou em microorganismos, resposta imune a melanócitos lesionados, podendo resultar na produção de anticorpos antimelanócitos e assim agravando a perda dessas células, são algumas das hipóteses em discussão. Ainda não se sabe se os autoanticorpos são a causa ou o resultado da doença, mas alguns estudos sugerem que a resposta imune humoral seria um fenômeno secundário ao efeito primário de linfócitos T CD8+ citotóxicos (Passeron & Ortonne, 2005; Rezaei et al., 2007). Muitos dados apresentados sobre os autoanticorpos e a participação das células B e T na patogênese do vitiligo são controversos, no entanto existem evidências de que ambas as respostas imune celular e humoral possam agir juntas na patogênese da doença. Alguns pacientes com baixa idade de início da doença têm tanto células T como células B ativadas aos arredores da lesão, além do fato de que tanto autoanticorpos quanto linfócitos reduziram o número de células pigmentares em experimentos in vitro de maneira dose-dependente (Abdel-Naser et al., 1994; Hann et al., 1993). Os mecanismos imunológicos possivelmente causadores do vitiligo estão ilustrados na Figura 1. 10 Figura 1: Representação dos mecanismos imunológicos celular e humoral contra os melanócitos. (Adaptado de: Applied Biosystems by Life Technologies <http://www5.appliedbiosystems.com/tools/pathway/review.php?pathway=Autoimmu ne%20Mechanism%20Causing%20Vitiligo>). 1.7.3. Apoptose A apoptose é uma morte celular programada caracterizada pela condensação do núcleo, clivagem do DNA e remoção das células mortas por fagocitose, sem geração de resposta inflamatória. Esse processo é de fundamental importância na homeostase, no desenvolvimento embrionário, na tolerância imunológica e na eliminação de células infectadas por vírus e células tumorais através da atividade de células T CD8+ (Vermes & Haanen, 1994). A indução anormal de apoptose gera complicações patogênicas e por isso já foi associada com doenças autoimunes como esclerose múltipla e tireoidite de Hashimoto (D’Souza et al., 1996; Giordano et al., 1997), doenças que também já foram associadas ao vitiligo (Steiner et al., 2004; Ongenae et al., 2003). 11 Estudos mostram que a apoptose está intimamente relacionada ao desaparecimento dos melanócitos no vitiligo, tanto em modelos animais como em humanos. Wang & Erf demonstraram que em galinhas da linha Smyth com vitiligo, células apoptóticas foram encontradas na mesma região de corpos celulares de melanócitos, indicando que a apoptose possa ser o mecanismo de morte dos melanócitos nessas galinhas afetadas. No mesmo estudo, foi mostrado que a relação entre o aparecimento de células T CD8+ e a apoptose, bem como a localização dessas células, próximas aos melanócitos, sugerem fortemente que o aumento das células apoptóticas esteja relacionado a citotoxicidade mediada por linfócitos T citotóxicos que se infiltram nas lesões, principalmente o T CD8+. Em um estudo envolvendo humanos, há fortes indícios de que a morte dos melanócitos no vitiligo se deva à ligação de autoanticorpos a antígenos específicos dos melanócitos, levando-os à apoptose, baseados na observação de que os pacientes apresentavam tanto autoanticorpos na circulação quanto marcadores apoptóticos nos melanócitos residuais, ambos ausentes na população controle (Ruiz-Argüelles et al., 2007). 1.8. ASSOCIAÇÕES GENÉTICAS Estudos de triagem genômica em genealogias já ressaltaram várias regiões ligadas ao vitiligo, em especial à sua patogênese, e muitos genes candidatos já foram propostos. A principal região associada ao vitiligo é a do MHC/HLA (Antígeno Leucocitário Humano). Desses, a principal associação foi feita com o gene do HLA-DR4, que já foi demonstrada em diferentes populações. Outras associações envolvendo o HLA-G, HLA-DRB1 e o HLA-DQB1 também já foram descritas associadas inclusive com a idade de início da doença (Rezaei et al., 2007; Kim et al., 2011). Além deles, o gene do antígeno 4 de linfócitos T citotóxicos (CTLA-4), que está envolvido da regulação e ativação das células T, bem como do controle de apoptose das mesmas, e mutações no gene regulador autoimune (AIRE) já foram descritas associadas com vitiligo e outras doenças autoimunes, sendo mais uma evidência do papel da resposta imunológica no desenvolvimento da doença (Rezaei et al., 2007). Existem mais de 120 genes reguladores da pigmentação de mamíferos, e esses, juntamente com os genes reguladores e participantes da resposta imunológica, são potenciais candidatos para associação com vitiligo, podendo ajudar 12 a elucidar sua patogênese (Passeron & Ortonne, 2005). Nesse sentido, alguns marcadores da resposta imunológica foram selecionados como objetos de estudo nesse trabalho, de acordo com suas funções, com o objetivo de verificar se existe alguma associação entre eles e o desenvolvimento do vitiligo. 1.9. CASPASE-8 A família Caspase é constituída por proteases citoplasmáticas (cisteína específicas para aspartato) que tem um importante papel na regulação e execução da apoptose, elas apresentam uma cisteína essencial em seus sítios ativos e clivam proteínas-alvo em resíduos específicos de aspartato. São normalmente expressas no citoplasma na forma de precursores inativos, chamados procaspases ou zimógenos, que sofrem ativação de modo proteolítico (Belkacemi et al., 2009), por outras caspases. Devido a isso, as caspases podem ativar-se entre si numa cascata proteolítica auto-amplificadora. Até agora já foram identificadas 14 caspases. As caspases -8 (via extrínseca) e -9 (via intrínseca ou mitocondrial) frequentemente são as primeiras a se tornar ativas durante a resposta apoptótica, ativando outras caspases efetoras (Abbas, 2005; Parslow, 2004). As caspases, quando ativadas, atacam e degradam proteínas celulares, como, por exemplo, proteínas estruturais da matriz nuclear do citoesqueleto, resultando em colapso do núcleo e do citoplasma; bem como proteínas de adesão celular, que permitem que a célula se desprenda de outras e se torne mais arredondada e mais fácil de fagocitar; as caspases também ativam uma endonuclease que degrada o DNA e impede que haja reparos; fatores de transcrição e moléculas sinalizadoras também são degradados, impedindo a realização das funções vitais da célula (Parslow, 2004). A ativação da caspase-8 começa com a ligação do Fas Ligante ou FasL no receptor Fas, localizado na superfície da membrana celular. Com a ligação ocorre a trimerização do receptor e o recrutamento da proteína FADD (Fas-Associated Death Domain) e da procaspase-8 para o domínio intracelular do receptor Fas. A procaspase-8 é dimerizada pelo FADD, tornando-se então a caspase-8 ativada. Uma vez ativada, a caspase-8 pode ativar outros membros efetores da família caspase, levando a destruição celular. Essa é a via extrínseca da apoptose, que envolve ativação de receptores de morte (Abbas, 2005; Olson, 2001). 13 Figura 2: Ativação da Caspase-8 através da ligação do FasL no receptor Fas. (Olson, 2001). A caspase-8, que inicia a sinalização da morte celular na via extrínseca (mediada por receptores de morte), é codificada pelo gene CASP8, o qual está localizado no braço longo do cromossomo 2 na posição 2q33. A deleção de seis nucleotídeos no promotor desse gene (-652 6N Del) destrói o sítio de ligação da proteína 1, o que diminui a transcrição do gene, enquanto que a inserção de seis nucleotídeos aumenta a quantidade de cópias de RNA transcrito e a atividade da caspase-8 (Sun et al., 2007). No sistema imune a morte por apoptose contém a proliferação de linfócitos para alcançar um balanço homeostático que permite uma resposta potente contra patógenos, mas prevenindo a auto-imunidade (Chun et al., 2002). Aberrações nesse balanço podem interferir (susceptibilidade/resistência) no desenvolvimento de doenças (Sun et al., 2007). Nesse sentido, a caspase-8 já foi associada a algumas doenças autoimunes como esclerose múltipla, artrite reumatóide, diabetes mellitus e tireoidite autoimune (Camiña-Tato et al., 2010; Byun et al., 2008; Liadis et al., 2007; Bossowski et al., 2008), e também com alguns tipos de câncer (Wang et al., 2009). Devido ao seu importante papel na apoptose, o polimorfismo -652 6N Del do gene CASP8 poderia estar associado ao vitiligo, uma vez que há fortes evidências de que a morte dos melanócitos na doença ocorra por esse processo. 14 1.10. HLA-G O antígeno leucocitário humano (HLA) possui um importante papel na regulação do sistema imune. Os genes que codificam as moléculas de HLA de classe I estão localizados na região telomérica do cromossomo 6p21 e são subdivididos em dois grupos: genes HLA de classe Ia ou clássicos (HLA-A, B, C) e genes HLA de classe Ib ou não-clássicos (HLA-E, F, G). O HLA-G é uma molécula de HLA de classe I não-clássica (Hviid, 2006; Janeway et al., 2008). A sua expressão ocorre principalmente em células do trofoblasto, sendo expresso em baixas quantidades no adulto em tecidos como, o timo, a córnea, células de Langerhans, eritrócitos e células percussoras do endotélio (Carossela et al., 2008). A organização do gene HLA-G é similar a dos genes HLA de classe Ia, possuindo oito éxons que codificam um peptídeo sinal (éxon 1), o domínio α1 (éxon 2), o domínio α2 (éxon 3), o domínio α3 (éxon 4), o domínio transmenbrana (éxon 5), a cauda citoplasmática (éxons 6 e 7) e uma região não traduzida (éxon 8) (Kirisits et al.,1991). O HLA-G possui 7 isoformas geradas por splicing alternativo do transcrito primário, quatro delas são ligados à membrana (HLA-G1,G2, G3 e G4) e 3 isoformas são solúveis (G5, G6 e G7) (Donadi et al., 2011). O HLA-G é mais expresso no trofoblasto porque essas células não expressam os principais HLA de classe I clássicos (HLA-A e -B), no sentido de suprimir a resposta imune materna, elas expressam HLA-G, -C e -E, com isso se ligando a receptores inibitórios. Os receptores já descritos para o HLA-G são os inibidores de leucócitos (LILRs), que se ligam ao domínio α3, LILRB1, que é expresso nas células B, células NK, células mielomonocíticas e o único da família LILR a ser expresso em células T, LILRB2, limitado a linhagem mielóide, que inclui monócitos, macrófagos e células dendríticas, além do KIR2DL4, que é um receptor imunoglobulina-símile de células NK, o qual apresenta efeito inibitório (Shiroishi et al., 2006; Brown et al., 2004; Borges et al.,1997; Donadi et al., 2011). O gene HLA-G tem 36 alelos e dois polimorfismos de significância funcional (Harrison et al., 2003), um deles é um SNP (Single Nucleotide Polymorphism) na região promotora do gene (rs1736936), na posição -1202, que é uma troca de base T/C e já foi associado ao vitiligo (Kim et al., 2011). O outro polimorfismo é uma deleção de 14pb na região 3’ não traduzida (3’UTR) na posição 3741 do éxon 8. O alelo da inserção de 14 pb está relacionado a uma menor 15 produção de mRNA para a maioria das isoformas e esse polimorfismo tem sua importância na autoimunidade, assim como em infecções virais e na gravidez (Yan et al., 2006; Hviid & Christiansen, 2005). Nesse trabalho estudamos apenas a ins/del de 14pb, com o objetivo de verificar se esse polimorfismo também está relacionado ao vitiligo. 1.11. MTHFR O gene MTHFR está localizado no braço curto do cromossomo 1 (1p36.3) e codifica a 5,10-Metilenotetrahidrofolato redutase. Essa enzima catalisa a síntese de 5-metiltetrahidrofolato a partir de 5,10-metilenotetrahidrofolato, etapa fundamental no metabolismo do folato (Fukino et al., 2007), os mesmos são participantes da metilação durante a síntese de DNA. O 5-metiltetrahidrofolato é também um doador de carbono para remetilação de homocisteína em cisteína (Figura 3). Assim, as vias metabólicas do folato estão relacionadas à proliferação e dano celular (Frosst et al.,1995). O folato representa uma grande família de compostos químicos. O ácido fólico é o análogo estável sintético dos folatos e compõe a estrutura básica de vitaminas coenzimas transportadoras de unidades químicas. Dentro da família dos folatos existe o 5,10-metilenotetrahidrofolato, que quando transformado em 5metiltetrahidrofolato, sofre ação do catalisador cobalamina (vitamina B12) e doa um radical metil, convertendo cobalamina em metilcobalamina, que juntamente com a ação da metionina sintase, repassa o radical metil à homocisteína (Figura 3). Esse processo é dependente de cobalamina e na deficiência deste fator, ou na inibição da 5,10-metilenotetrahidrofolato redutase por mutações no gene responsável por sua síntese, ocorre hiperhomocisteinemia (Miyaki, 2010). Deficiências severas e moderadas da MTHFR vêm sendo descritas e junto com elas, amplo espectro de manifestações clínicas relacionadas a alterações na atividade enzimática. Na deficiência hiperhomocisteinemia e homocisteinúria, severa da MTHFR, com as características clínicas incluem neuropatias periféricas, retardo do desenvolvimento mental, hipotonia, ataques apopléticos e trombose (Goyette et al., 1995). A termolabilidade da MTHFR que leva a deficiência moderada se deve a um polimorfismo comum, C677T, que consiste na transição de citosina para timina no nucleotídeo 677, no éxon 4, originando um 16 resíduo de valina ao invés de alanina, o que forma um sítio de clivagem para a endonuclease de restrição Hinf I (Frosst et al., 1995). Os heterozigotos CT têm uma redução de 30% na atividade enzimática, enquanto os homozigotos TT tem uma redução de 60% na atividade enzimática. Sabe-se que a frequência do alelo T chega em torno de 30% em muitos grupos étnicos (Wilcken et al., 2003). Figura 3: Via principal de metabolismo de homocisteína. FTHF: formiltetrahidrofolato; metilenotetrahidrofolato MTHF: redutase; metilenotetrahidrofolato; SAM: s-adenosilmetionina; MTHFR: SAH: s- adenosilhomocisteina; THF: tetrahidrofolato; 5-MTHF: 5-metilenotetrahidrofolato; 5,10-MTHFR: 5,10-metilenotetrahidrofolato (Adaptado de Juo, 2007). A presença do alelo polimórfico MTHFR*677T tem sido associada com risco a diversas doenças complexas, como doença arterial coronariana e artérias periféricas (Frosst et al.,1995), neoplasias (Skibola et al., 1999) e artrite reumatóide (Kato et al., 2011) além de estar associado à toxicidade do Metotrexato (Berkun et al., 2003). Este alelo encontra-se, ainda, associado a marcadores de inflamação e a pelo menos dois processos inflamatórios distintos: a formação da placa de ateroma e a mucosite, uma inflamação de mucosas por ação tóxica do metotrexato (Naidu et al., 2004). Estas evidências nos levam a supor que outras patologias tratadas por 17 imunossupressão com metotrexato possam estar associadas a este polimorfismo. Nesse sentido o MTHFR pode ser considerado um bom marcador para doenças autoimunes. O metotrexato não é um dos tratamentos de escolha para o vitiligo, no entanto pacientes portadores de artrite reumatóide e vitiligo tratados com metotrexato tiveram repigmentação das manchas, indicando que o papel imunossupressor do metotrexato atua no vitiligo (Sandra et al., 1998). A investigação de associação do MTHFR com vitiligo pode ajudar a esclarecer o papel da autoimunidade no vitiligo. 1.12. SLC11A1 O gene SLC11A1 também conhecido como NRAMP1, está localizado a posição 35 do braço longo do cromossomo 2 e codifica uma proteína de mesmo nome, possui aproximadamente 14kb distribuídos em pelo menos 15 éxons (Cellier et al., 1994). A proteína SLC11A1 (solute carrier family 11 member 1) é uma proteína transportadora de prótons/cátions dependente de pH, que está localizada na membrana de endossomos/lisossomos de macrófagos e está envolvida na sua homeostase, ela regula e é regulada pela concentração de cátions bivalentes no meio, especialmente o ferro (Blackwell et al., 2001). Uma grande quantidade de parasitas intracelulares depende da disponibilidade de ferro para sua patogenicidade, a SLC11A1 contribui com a função antimicrobiana dos macrófagos por expelir íons metálicos essenciais através de canais de co-transporte de íons, privando assim os microorganismos de elementos essenciais para o crescimento (Figura 4; O’Brien et al., 2008). Estudos funcionais demonstraram que a SLC11A1 executa importante função na via de ativação do macrófago, além de ter efeitos pleiotrópicos na sua função, que incluem regulação de quimiocinas, aumento da expressão de óxido nítrico sintetase indutível (iNOS) e liberação de óxido nítrico, regulação positiva da expressão de MHC de classe II e acentuação da apresentação de antígenos para células T, aumento na produção de citocinas pro-inlamatórias como IL-1β e fator de necrose tumoral α (TNF-α) (Blackwell & Searle, 1999). 18 Figura 4: Proteína SLC11A1 é recrutada para a membrana de fagossomos maduros. Acredita-se que ele execute a excreção de íons bivalentes do interior da vesícula, inibindo assim a reprodução de microorganismos por privação de elementos essenciais (Adaptado de: Fortier et al., 2005). Polimorfismos no gene SLC11A1 têm sido associados com doenças autoimunes entre elas o diabetes tipo 1, artrite reumatóide, esclerose múltipla e sarcoidose. A associação com tuberculose, leishmaniose, hanseníase, HIV e meningite meningocal tem sido relatada frequentemente. Já foi relatada a associação do polimorfismo na região promotora do SLC11A1 com o câncer esofageal na África do Sul (Zhaal et al., 2005). Pedroza et al. (2011) encontraram uma associação da deleção 1729 +55 del 4N no gene SLC11A1 com lúpus eritematoso sistêmico em um total de 111 pacientes na população de Belém – PA. Alelos de SLC11A1 que aumentam sua expressão estão normalmente associados a doenças autoimunes e câncer, mas protegem contra doenças infecciosas. Ao contrário, alelos que diminuem a expressão de SLC11A1 estão associados à suscetibilidade a doenças infecciosas e ao mesmo tempo são associados à proteção contra o desenvolvimento de autoimunidade e câncer (Awomoyi, 2007). O polimorfismo 1729 +55 del 4 do gene SLC11A1 pode estar associado ao vitiligo devido ao seu papel na ativação de macrófagos, na expressão de moléculas do MHC de classe II e na apresentação de antígenos para as células T, além de seu papel na produção de óxido nítrico, relacionado à teoria bioquímica que envolve o estresse oxidativo na etiologia do vitiligo. 19 2. JUSTIFICATIVA Cerca de 40 a 50 milhões de pessoas em todo o mundo têm vitiligo e, embora sua forma primária não seja uma ameaça à vida, os efeitos estéticos e psicológicos da doença demandam para uma terapia eficaz, que depende de um melhor entendimento da sua patogênese (Ruiz-Argüelles et al., 2007). Estudos em genes candidatos têm sido pontuais, destacando primariamente genes envolvidos na resposta imune celular e humoral. Neste cenário, pode-se propor estudar genes candidatos, localizados em regiões previamente descritas e/ou envolvidos nesses processos. Esse tipo de estudo pode ajudar a determinar se o vitiligo trata-se, de fato, de uma doença autoimune. Determinados fatores genéticos e os ambientais, inclusive, têm sido estabelecidos, entretanto nenhum dos dois emerge como necessário ou suficiente para o desenvolvimento da doença. A busca por marcadores genéticos que possam elucidar a etiopatologia do vitiligo, bem como sua evolução clínica, pode fornecer interessantes achados na explicação do intrincado mecanismo por trás desta patologia. 20 3. OBJETIVOS 3.1. OBJETIVO GERAL Investigar a associação dos polimorfismos dos genes CASP8 (-652 6N Del), HLA-G (14 pb ins/del), MTHFR (C677T) e SLC11A1 (1729 +55 del 4) com o desenvolvimento do vitiligo e sua evolução em populações de pacientes e indivíuos saudáveis da cidade de Belém – PA. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS a) Descrever a variabilidade genética dos polimorfismos citados acima na população de pacientes e na população de controles representativos de Belém – PA. b) Determinar as frequências alélicas de cada polimorfismo em ambas as populações. c) Avaliar a influência dos alelos e genótipos dos genes candidatos na idade de início nos pacientes com vitiligo. 21 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. AMOSTRAGEM E EXTRAÇÃO DE DNA A população de pacientes foi constituída de 61 indivíduos clinicamente diagnosticados com vitiligo, dados como idade de início da doença e tratamentos utilizados foram obtidos do paciente, bem como dados demográficos e socioeconômicos. A população de controles foi constituída de 350 indivíduos nãoportadores da doença representativos da população de Belém – PA. As amostras foram obtidas por coleta de sangue venoso periférico em tubo contendo o anticoagulante EDTA e tiveram o DNA extraído utilizando o protocolo estabelecido pelo Kit Biopur (Biometrix, Curitiba – PR). 4.2. GENOTIPAGEM Todos os marcadores foram investigados nas amostras através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e eletroforese em gel de poliacrilamida, corado com nitrato de prata e hidróxido de sódio. 4.2.1. CASP8 O polimorfismo de 6pb ins/del na região promotora do gene CASP8 foi investigado por PCR com o volume final 15 µl, constituído de 8,3 µl de água destilada, 1,5 µl de tampão (10x); 1,0 µl de MgCl2 (50 mM); 1,0 µl de dNTP (1,25 mM), 1.0 µl de cada primer (5,0 mM); 0,2 µl de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 1,0 µl de DNA. As sequências 5’-3’, dos primers utilizados foram: forward primer, 5’CTGCATGCCAGGAGCTAAGT-3’, e reverse primer 5’- GCCATAGTAATTCTTGCTCTGC-3’ de acordo com o descrito em Sun et al. (2007). O alelo da deleção tem um fragmento de 171 pb, enquanto que o da inserção tem 177 pb. 22 4.2.2. HLA-G Cada reação de PCR para o polimorfismo de 14 pb ins/del no éxon 8 do gene HLA-G teve um volume final de 25 µl de solução, sendo constituídos de 17,55 µl de água destilada, 2,5 µl de tampão (10x); 0,75 µl de MgCl2 (50 mM); 2,0 µl de dNTP (5 mM), 0.5 µl de cada primer (5,0 mM); 0,2 µl de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 1,0 µl de GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC-3’), DNA. O O foward reverse primer primer (5’(5’- GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA-3’) e as condições de PCR utilizadas estão de acordo com o protocolo previamente descrito (Hviid et al., 2002). A genotipagem mostra um alelo com 210 pb (deleção) e outro com 224 pb (inserção). 4.2.3. MTHFR A identificação do alelo MTHFR*677T foi feita por PCR com cada solução contendo 13,8 µl de água destilada; 2,5 µl de tampão (10x); 1,5 µl de MgCl2 (50 mM); 2 µl de dNTP (1,25 mM); 2 µl de cada primer (5 mM); 0,2 µl de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e 1 µl de DNA. As sequências dos primers utilizadas foram: forward primer 5’-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3’ e reverse primer 5’AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’. As sequências dos primers e as condições de PCR foram as descritas por Frosst et al. (1995). A PCR foi seguida de digestão enzimática utilizando a endonuclease de restrição Hinf1 (Figura 5). O produto da amplificação que não sofreu clivagem, correspondente ao alelo MTHFR*677C, tem um fragmento de 198 pb, enquanto que o produto que corresponde ao alelo MTHFR*677T é clivado pela enzima de restrição e gera dois fragmentos, um de 175 pb e outro de 23 pb, sendo que o último não é visualizado na eletroforese. 23 Figura 5: O sítio de restrição da enzima Hinf I e as sequências dos primers forward (F) e reverse (R). Sequências intrônicas são distinguidas pelas letras minúsculas (Adaptado de Yi, 2002). 4.2.4. SLC11A1 A PCR foi constituída de 25 µl de volume final, sendo 15,3 µl de água destilada; 2,5 µl de tampão de reação (10x); 1 µl de MgCl2 (50 mM); 2 µl de dNTP (1,25 mM); 1,5 µl de cada primer (5 mM); 0,2 µl de Taq DNA polimerase e 1 µl de DNA. O foward primer teve a sequência de 5’-GCATCTCCCCAATTCATGGT-3’ e o reverse primer de 5’-AACTGTCCCACTCTATCCTG-3’, as condições de PCR foram as descritas no protocolo de Liu et al (1995). A inserção apresenta um fragmento de 244 pb, enquanto que a deleção apresenta um de 240 pb. A visualização dos fragmentos obtidos de cada gene foi feita por eletroforese em gel de poliacrilamida. Para os genes CASP8, HLA-G e MTHFR o gel teve concentração de 6%, enquanto que para SLC11A1 a concentração foi de 8%. Todos foram revelados com coloração de nitrato de prata e hidróxido de sódio. 4.3. ANÁLISE ESTATÍSTICA As freqüências alélicas e fenotípicas foram obtidas por contagem direta e a comparação das mesmas foi feita por teste de qui-quadrado, seguido de correção para múltiplos testes. As populações foram testadas quanto ao equilíbrio de HardyWeinberg (HW) para todos os polimorfismos. Para a comparação entre os genótipos 24 observados nas populações foi utilizado o teste Exato de Fisher. A influência dos genótipos com a idade de início da doença foi testada por correlação de Spearman. Adicionalmente, análise de regressão linear foi aplicada para avaliar o potencial preditivo dos genótipos na idade de inicio da doença. Todos os testes foram feitos no programa BioEstat 5.0 (Ayres, 2007). 25 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram genotipadas um total de 350 amostras de indivíduos controles e 61 de pacientes. Para o gene CASP8, a frequência do alelo CASP8*del na população de pacientes foi de 37,7% e na população controle foi de 43,3%. Com relação ao HLA-G a frequência do alelo HLA-G*del foi de 55% na população de pacientes e de 60% na população controle. O alelo MTHFR*677T (alelo mutante) teve frequência de 37% nos pacientes e de 34,6% nos controles. O alelo SLC11A1*del teve baixa freqüência em ambas as populações, nos pacientes de 10,8%, enquanto que nos controles a frequência foi de 9%. As comparações estatísticas das frequências alélicas dos marcadores genéticos estudados nas amostras de pacientes e controles não foram estatisticamente significantes (Tabela 1). Tabela 1: Distribuição das freqüências alélicas dos marcadores testados em controles e pacientes e comparação das mesmas feita por teste de qui-quadrado. Marcador genético Controles (%) Pacientes (%) 387 (56,7) 76 (62,3) X² / p Frequências alélicas CASP8*ins 1,305 / 0,2533 CASP8*del 295 (43,3) 46 (37,7) HLA-G*ins 277 (40) 54 (45) HLA-G*del 413 (60) 66 (55) MTHFR*677T 242 (34,6) 45 (37) MTHFR*677C 458 (65,4) 77 (63) SLC11A1*ins 592 (91) 107 (89,2) SLC11A1*del 58 (9) 13 (10,8) 0,997 / 0,3180 0,245 / 0,6208 0,442 / 0,5063 A frequência dos genótipos homozigotos para o alelo mutante de cada marcador foi comparada entre as populações de pacientes e controles, utilizando o teste exato de Fisher. Nenhuma das comparações foi estatisticamente significante. 26 As frequências genotípicas e os valores de p obtidos estão representados nas figuras 6, 7, 8 e 9. 60,0% 52,5% 54,8% 50,0% 40,0% p=0,29 36,0% 29,3% 30,0% Pacientes Controles 20,0% 15,8% 11,5% 10,0% 0,0% II ID DD Figura 6: Frequência dos genótipos do gene CASP8 nas amostras de pacientes e controles. 60,0% 56,8% 52,5% p=0,37 50,0% 40,0% 33,6% 30,0% 20,0% 26,6% Pacientes Controles 16,6% 13,9% 10,0% 0,0% II ID DD Figura 7: Frequência dos genótipos do gene HLA-G nas amostras de pacientes e controles. 27 60,0% 48,6% 50,0% p=0,08 44,3% 37,7% 40,0% 41,1% 30,0% 20,0% Pacientes Controles 18,0% 10,0% 10,3% 0,0% TT CT CC Figura 8: Frequência dos genótipos do gene MTHFR nas amostras de pacientes e controles. 90,0% 80,0% 82,5% 78,3% p=0,47 70,0% 60,0% 50,0% Pacientes 40,0% Controles 30,0% 21,7% 17,2% 20,0% 10,0% 0,0% II ID Figura 9: Frequência dos genótipos do gene SLC11A1 nas amostras de pacientes e controles. A freqüência do genótipo DD foi praticamente de 0% em ambas as populações. Com relação ao equilíbrio de Hardy-Weinberg, observou-se um leve aumento de heterozigotos para o gene CASP8 na população controle, com um p=0,0306. Para os demais marcadores, ambas as populações encontraram-se em equilíbrio (Tabela 2). No entanto este resultado foi considerado espúrio, pois se corrigido para o número de testes conduzidos, ele perde a significância. 28 Tabela 2: Equilíbrio de Hardy-Weinberg demonstrado nas populações de pacientes e controles para cada marcador genético. Equilíbrio de HW (X²/p) Equilíbrio de HW (X²/p) Pacientes Controles CASP8 0,8308 / 0,3620 4,6761 / 0,0306 HLA-G 1,2577 / 0,2621 2,9002 / 0,0886 MTHFR 2,2065 / 0,1374 1,8989 / 0,1682 SLC11A1 0,8857 / 0,3467 1,1744 / 0,2785 Locus Também foi realizado um teste de correlação entre os genótipos e a idade de início da doença na população de pacientes e observou-se uma correlação negativa para os genes HLA-G e MTHFR, quando analisados individualmente indicando que quanto maior a quantidade de alelos mutantes (HLA-G*del e MTHFR*677T) menor a idade de início do vitiligo. Nesse sentido, pode-se sugerir que a presença desses genótipos pode predispor ao aparecimento precoce do vitiligo, no entanto a correlação não foi estatisticamente significante. Com base nessas observações, os genótipos dos polimorfismos do HLAG e MTHFR foram analisados conjuntamente e comparados com a idade de início dos pacientes. Os pacientes foram separados em grupos de acordo com os genótipos (DDxTT; IDxTT; IIxTT; DDxCT e assim por diante) e obteve-se a média de idade de início da doença para cada grupo. A tendência à correlação entre a quantidade de alelos mutantes (HLA-G*del e MTHFR*677T) e a idade de início se manteve nos pacientes e foi estatisticamente significante (p=0,009), utilizando correlação de Spearman (Figura 10). 29 45 40 y = -5,458x + 37,24 35 30 25 20 15 10 5 0 0 1 2 3 4 5 Figura 10: Correlação entre a idade de início do vitiligo e a quantidade de alelos mutantes (HLA-G*del e/ou MTHFR*677T) nos pacientes. Nota-se que quanto mais alelos mutantes, menor a idade de início do vitiligo. Esse dado foi estatisticamente significante (p=0,009). A equação mostrada no gráfico refere-se à análise de regressão linear, podendo-se usá-la para prever a idade de início de acordo com o número de alelos HLA-G*del e/ou MTHFR*677T. Esse é o primeiro estudo que tenta correlacionar polimorfismos desses marcadores com vitiligo. No que diz respeito à apoptose, ainda há poucos estudos sobre as vias apoptóticas causadoras da destruição dos melanócitos no vitiligo. Alguns estudos sugerem que esse mecanismo pode ser ativado pela via perforina/granzima ou pela via do Fas/Fas-ligante (Ongenae et al., 2003). No entanto, esses dados são controversos. Sabe-se que as células T CD4+ podem destruir células que expressam MHC de classe II, como é o caso dos melanócitos, através da ligação do receptor Fas com seu ligante FasL, que induz à apoptose com ativação da caspase-8. A importância da sinalização via Fas-FasL na mediação da morte de melanócitos é enfatizada pela alta incidência de células de melanoma que escapam do sistema imunológico através de uma baixa regulação de Fas e alta regulação de FasL (Lambe et al., 2006). O polimorfismo -652 6N del do gene CASP8 não foi diferente estatisticamente entre pacientes e controles, o que indica que não há redução ou aumento da atividade da caspase-8 nos pacientes com vitiligo. No entanto, a apoptose é considerada como o mecanismo responsável pela morte dos melanócitos da doença. Nesse sentido, polimorfismos envolvendo outros 30 participantes da ativação da via dos receptores de morte, como nos genes FAS e FASL, podem ser investigados no vitiligo, para que se possa confirmar ou não a participação dessa via apoptótica na destruição dos melanócitos. Além disso, outras vias também podem iniciar o processo apoptótico dos melanócitos, como a via da perforina/granzima ou a via mitocondrial da apoptose, que envolve a ativação da caspase-9 (Abbas, 2005; Ongenae et al., 2003). Tais vias podem ser estudadas nesses pacientes mais profundamente. Devido ao seu papel auxiliar na ativação dos macrófagos, o gene SLC11A1 já foi associado a várias doenças autoimunes e infecciosas, mas aparentemente não tem sua função alterada no vitiligo. É possível que os macrófagos tenham um papel na remoção dos melanócitos, induzida pela citotoxicidade dos linfócitos T (Rezaei et al., 2007), no entanto não foi demonstrado neste trabalho que a expressão e atividade maior ou menor da proteína altera a ativação dos mesmos nos pacientes com vitiligo. Em uma população coreana, um polimorfismo na região promotora do HLA-G (rs1736936) foi associado com o vitiligo e com a idade de início, indicando que esse SNP diminui a expressão do gene e consequentemente a atividade da proteína, reduzindo o efeito inibitório que o HLA-G tem sobre a citotoxicidade de linfócitos T e NK (Kim et al., 2011). O trabalho citado mostrou que os pacientes com vitiligo têm uma expressão alterada de HLA-G, no entanto o polimorfismo 14 pb ins/del, localizado na região 3’UTR, parece não ter um papel efetor nessa baixa expressão do gene, de acordo com os dados obtidos neste estudo. O polimorfismo C677T do gene MTHFR foi pouco associado a doenças autoimunes até agora, tendo seu papel maior em processos inflamatórios (Naidu et al., 2004). Neste trabalho, mostramos que a troca de bases ocorrida nesse polimorfismo pode não predispor ao vitiligo. Considerando que as vias do metabolismo do folato estão associadas à proliferação e dano celular (Frosst et al., 1995), podem-se sugerir estudos mais aprofundados em outros participantes delas, no sentido de verificar o estado da síntese de DNA nos melanócitos. Vários estudos propuseram um papel fundamental da via do folato nos efeitos clínicos do tratamento com metotrexato (MTX) na artrite reumatóide, principalmente devido a variações genéticas no gene MTHFR (Hughes et al., 2006). Recentemente foi identificada uma associação do polimorfismo de 14 pb ins/del do gene HLA-G com a resposta clínica do MTX na artrite reumatóide, 31 mostrando que o genótipo homozigoto para a deleção (14 pb del/del) era mais frequente nos pacientes que respondiam ao tratamento com MTX, por expressarem maior quantidade de HLA-G (Rizzo et al., 2006; Baricordi et al., 2007). Levando em consideração o papel que ambos apresentam nesse tratamento, uma análise conjunta dos dois já foi sugerida para artrite reumatóide. Nesse sentido, considerando que pacientes com vitiligo já responderam positivamente ao MTX (Sandra et al., 1998) e que existem fortes evidências de que o vitiligo seja, como a artrite reumatóide, uma doença autoimune, um estudo envolvendo polimorfismos dos dois genes pode servir como meio de identificação de fatores prognósticopreditivos para a doença. Neste trabalho, não foi encontrada uma diferença significativa entre os genótipos desses genes com o desenvolvimento do vitiligo ou com a idade de início, quando analisados separadamente. No entanto, quando analisados em conjunto mostrou-se que a idade de início é menor nos pacientes que apresentam maior quantidade de alelos HLA-G*del e MTHFR*677T, indicando que esse perfil genotípico pode predispor ao desenvolvimento precoce do vitiligo. Segundo Kim et al. (2011), o HLA-G está associado com a idade de início do vitiligo, corroborando nossos dados. A equação mostrada na Figura 10 refere-se à análise de regressão linear, podendo-se usá-la para prever a idade de início de acordo com o número de alelos HLA-G*del e/ou MTHFR*677T. 32 6. CONCLUSÕES 1. A etiopatogenia do vitiligo permanece pouco esclarecida, mas há fortes evidências que indicam um papel da autoimunidade nessa doença. Nesse sentido, estudos em genes responsáveis pela pigmentação da pele, bem como os relacionados à resposta imunológica podem fornecer bons marcadores prognósticopreditivos sobre a doença e ajudar no esclarecimento sobre sua patogenia. 2. Não foi observada diferença estatisticamente significante com relação às freqüências alélicas e à variabilidade genética dos polimorfismos estudados em pacientes e controles. 3. A idade de início da doença está associada com a presença conjunta dos alelos HLA-G*del e MTHFR*677T, de forma inversamente proporcional, mas não foi encontrado nenhum tipo de associação da idade de início com os polimorfismos dos genes CASP8 e SLC11A1. 4. Estudos mais aprofundados sobre as vias apoptóticas, ativação dos macrófagos e vias metabólicas do folato no vitiligo também podem ajudar na elucidação dos mecanismos responsáveis pelo surgimento da doença, bem como estudos com maior tamanho amostral. 33 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H. Imunologia Celular e Molecular. Rio de Janeiro 5ª Ed. Elsevier, 2005. ABDEL-NASER, M.B.; KRUGER-KRASAGAKES, S.; KRASAGAKIS, K. et al. Further evidence for involvement of both cell mediated and humoral immunity in generalised vitiligo. Pigment Cell Res 1994; 7: 1–8. Applied Biosystems by Life Technologies. Gene Assist™ Pathway Atlas. 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