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CURSO DE FARMÁCIA
NIVIANE COSTA DE SOUZA
DETECÇÃO DE MOLÉCULAS CALPAÍNA-LIKE EM FORMAS
AMASTIGOTAS AXÊNICAS DE Leishmania amazonensis
IFRJ – CAMPUS REALENGO
1º Semestre - 2013
NIVIANE COSTA DE SOUZA
DETECÇÃO DE MOLÉCULAS CALPAÍNA-LIKE EM FORMAS
AMASTIGOTAS AXÊNICAS DE Leishmania amazonensis
Monografia apresentada à coordenação do curso
de Farmácia, como cumprimento parcial das
exigências para conclusão do curso de
Bacharelado em Farmácia do Instituto Federal
de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de
Janeiro.
Orientadora: Camila Falcão
Coorientadora: Marta Helena Branquinha de Sá
IFRJ – CAMPUS REALENGO
2013
IFRJ- CAMPUS REALENGO
NIVIANE COSTA DE SOUZA
DETECÇÃO DE MOLÉCULAS CALPAÍNA-LIKE EM FORMAS
AMASTIGOTAS AXÊNICAS DE Leishmania amazonensis
Monografia apresentada à coordenação do curso
de Farmácia, como cumprimento parcial das
exigências para conclusão do curso de
Bacharelado em Farmácia do Instituto Federal
de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de
Janeiro.
Aprovada em___ de _________de _____.
Conceito:_________ (_____________).
Banca Examinadora
_______________________________________
Profª. Doutora Camila Falcão (Orientadora/IFRJ)
_______________________________________
Profª. Doutora Débora Rama (IFRJ)
___________
_______
Doutora Lívia de Oliveira Santos (UFRJ)
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, que é o autor e consumador de tudo na minha vida.
A todos os meus familiares em especial os meus pais por toda dedicação durante
anos, por permitir a realização de mais um sonho.
Ao meu amado esposo Wagner, pela paciência e companheirismo, por me apoiar
nos momentos mais difíceis.
As minhas orientadoras Camila Bandeira, Marta Helena e Fernanda Aquino, por
todo tempo dedicado para realização desse trabalho.
A todos os meus amigos do IFRJ, em especial as minhas amigas Géisica Lacerda e
Jéssica Valentim, amizades que certamente levarei para minha vida.
.
DETECÇÃO DE MOLÉCULAS CALPAÍNA-LIKE EM FORMAS
AMASTIGOTAS AXÊNICAS DE Leishmania amazonensis
DETECTION OF MOLECULES CALPAIN-LIKE IN FORMS AXENIC
AMASTIGOTES OF Leishmania amazonensis
Niviane Costa de Souza¹
Camila Falcão²
1 – Bacharelado em Farmácia – Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do
Rio de Janeiro (IFRJ) – Campus Realengo.
E-mail: [email protected]
2 – Bacharel em Farmácia – Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio de
Janeiro (IFRJ) – Campus Realengo.
E-mail: [email protected]
RESUMO
As drogas utilizadas no tratamento das leishmanioses apresentam sérios problemas,
incluindo alta toxicidade, efeitos adversos, a necessidade da hospitalização dos pacientes,
surgimento de cepas resistentes e alto custo dos compostos utilizados no tratamento. Nos
tripanossomatídeos, as cisteína peptidases recebem atenção como alvo para o
desenvolvimento de novos quimioterápicos. A partir disso o presente projeto optou por
detectar moléculas calpaína-like em formas amastigotas axênicas de Leishmania
amazonensis, obtidas a partir de formas promastigotas, sendo confirmadas através dos
ensaios de cinética de diferenciação, citometria de fluxo e microscopia óptica. As formas
amastigotas foram analisadas quanto à expressão de epítopos utilizando o anticorpo 3A1La, expressão de moléculas similares a calpaínas, verificação da atividade enzimática
utilizando um substrato fluorogênico. Os resultados contribuíram na adição de novos
conhecimentos sobre a expressão de moléculas similares às calpaínas em Leishmania,
auxiliando na detecção destas peptidases, o que poderá ajudar na determinação das funções
destas moléculas nos parasitos e na busca de novas drogas, uma vez já confirmado que as
mesmas são bons alvos terapêuticos.
PALAVRAS-CHAVE: Leishmania, amastigota, calpaína, protease.
ABSTRACT
Drugs that are used to treat Leishmaniasis present serious problems, including high
toxicity, adverse effects, the need to hospitalize the patients, arise of resistant strains and
high cost of the compounds used in the treatment. In trypanosomes, the cysteine peptidases
receive attention as a target for the development of new chemotherapeutic agents. As such,
this project aimed to detect calpain-like molecules in axenic amastigotes of Leishmania
amazonensis, obtained from promastigotes, being confirmed by differentiation kinetic
assays, flow cytometry and optical microscopy. The amastigotes were analyzed for the
expression of epitopes using the antibody 3A1-La, expression of molecules similar to
calpain, and verification of enzyme activity using a fluorogenic substrate. The results
contributed to the addition of new knowledge about the expression of molecules similar to
calpain in Leishmania, aiding in the detection of these peptidases, which may help in
determining the functions of these molecules in parasites and in the search for new drugs,
as already confirmed that the same are good therapeutic targets.
KEYWORDS: Leishmania, amastigote, calpain, protease.
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 6
1.1. A Família Trypanosomatidae ....................................................................................... 6
1.2. O gênero Leishmania e as leishmanioses ..................................................................... 9
1.2.1. Tratamento das leishmanioses ............................................................................ 15
1.3. Peptidases: um alvo para o desenvolvimento de quimioterápicos ............................... 16
1.4. Peptidases no gênero Leishmania ................................................................................. 18
1.4.1. Serina-peptidases ................................................................................................ 19
1.4.2. Aspártico-peptidases .......................................................................................... 19
1.4.3. Metalo-peptidases............................................................................................... 20
1.4.4. Cisteína-peptidases ............................................................................................. 21
1.5. Calpaínas ...................................................................................................................... 22
1.5.1 Calpaínas em tripanossomatídeos ....................................................................... 26
2.
OBJETIVO ............................................................................................................................. 30
2.1. Objetivo Geral do Trabalho .......................................................................................... 30
2.2. Objetivos Específicos ................................................................................................... 30
3.
METODOLOGIA .................................................................................................................. 30
3.1. Microrganismo e Condições de Cultivo ....................................................................... 30
3.2. Obtenção das formas amastigotas axênicas .................................................................. 30
3.3. Análise das alterações morfológicas utilizando microscopia óptica. ........................... 31
3.4 Análise da morfologia celular e da expressão de epítopos específicos para formas
promastigotas por citometria de fluxo. ................................................................................ 31
3.5 Análise da expressão de moléculas calpaína-like em formas amastigotas axênicas de L.
amazonensis em citometria de fluxo. .................................................................................. 32
3.6. Análise da atividade enzimática de promastigotas, de formas em diferenciação e de
amastigotas axênicos utilizando substrato fluorogênico para calpaínas .............................. 32
4. RESULTADOS ......................................................................................................................... 33
4.1. Obtenção das formas amastigotas axênicas e análise da morfologia das células ao
longo processo de diferenciação .......................................................................................... 33
4.2. Análise da expressão de epítopos pelas formas promastigotas e amastigotas utilizando
o anticorpo 3A1-La .............................................................................................................. 36
4.3. Análise da expressão de moléculas similares a calpaínas em formas evolutivas ao
longo do processo de diferenciação e em amastigotas axênicos de L. amazonenses .......... 38
4.4. Verificação da atividade enzimática durante o processo de diferenciação utilizando um
substrato fluorogênico específico para calpaínas ................................................................ 39
4. DISCUSSÃO ............................................................................................................................. 42
5. CONCLUSÃO ........................................................................................................................... 44
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................... 45
6
1. INTRODUÇÃO
1.1. A Família Trypanosomatidae
A família Trypanosomatidae classificada na ordem Kinetoplastida, é constituída por
protozoários flagelados e os diferentes gêneros de tripanossomatídeos descritos
compartilham características que podem ser classificadas como comuns (observadas em
outros grupos de organismos) ou singulares (encontradas apenas entre os kinetoplastídeos)
(SIMPSON, 2006). Os tripanossomatídeos são encontrados parasitando vertebrados,
invertebrados (incluindo muitos insetos) e plantas. Estima-se que os tripanossomatídeos
tenham surgido há aproximadamente 100 milhões de anos, e entre eles estão reunidas
espécies de parasitos causadores de doenças em humanos, animais e plantas, podendo
acarretar danos à saúde e prejuízos à economia e à vida social humana (revisto por LOPES
et al., 2010).
Dentre as características singulares deste grupo está a presença de mitocôndria
única e ramificada que percorre todo o corpo celular. Esta organela apresenta uma porção
especializada, localizada dentro da matriz mitocondrial, perpendicular ao eixo do flagelo,
rica em ácido desoxirribonucléico (20–30% do DNA total), identificada como cinetoplasto.
O DNA desta estrutura é denominado k-DNA e se organiza em redes de cadeias circulares,
concatenadas e compactadas. Em muitos tripanossomatídeos, a posição relativa do
cinetoplasto em relação ao núcleo varia de acordo com o ciclo celular (LIU et al., 2005;
LIU & ENGLUND, 2007; DE SOUZA, 2008). O glicossoma também é uma organela
singular dessa família e são distintos dos peroxissomas de organismos eucariotos
superiores. Além de tornar a transformação de glicose em piruvato mais eficiente em
tripanossomatídeos que em outros organismos eucariotos, já que compartimentaliza a via
glicolítica, o glicossoma também possui outras funções relacionadas à biossíntese de
pirimidinas, recuperação de purinas, síntese de éter-lipídios e β-oxidação de ácidos graxos
(revisto por MICHELS, HANNAERT & BRINGAUD, 2000). Dentre as características
comuns, pode-se destacar a presença do citoesqueleto, que é uma estrutura formada por
uma camada de microtúbulos subpeliculares, associados entre si e à membrana plasmática,
garantindo a sustentação da célula. Os microtúbulos subpeliculares estão distribuídos por
todo o corpo do protozoário, exceto na região da bolsa flagelar, que representa o sítio de
endocitose/exocitose de macromoléculas na maioria destes parasitos (CORRÊA et al.,
7
2005). Outro componente comum dos tripanossomatídeos é o flagelo, organela responsável
pela motilidade do parasito, que emerge de um corpo basal no citoplasma através de uma
invaginação proeminente da membrana plasmática chamada de bolsa flagelar
(LANDFEAR & IGNATUSHCHENKO, 2001; GOLL, 2003). Todos os estágios
evolutivos dos tripanossomatídeos apresentam um flagelo por célula, mesmo a forma
amastigota. Além da motilidade, esta estrutura também está envolvida nos processos de
interação parasito-hospedeiro morfogênese celular, divisão celular e evasão do sistema
imune (RALSTON et al., 2009). A representação esquemática da morfologia dos
tripanossomatídeos pode ser observada na Figura 1.
Reservossoma
Golgi
Nucléolo
Núcleo
Microtúbulos
Retículo
subpeliculares
Endoplasmático
Citóstoma
Axonema
Acidocalcissoma
Estrutura Paraflagelar
Mitocôndria
Vacúolo Contrátil
Bolsa Flagelar Glicossoma
Cinetoplasto
Figura 1. Principais estruturas e organelas encontradas em um modelo de tripanossomatídeo (forma
epimastigota de Trypanosoma cruzi). As estruturas e organelas retratadas como detectadas por microscopia
eletrônica de transmissão. (O diagrama foi adaptado de LOPES et al., 2010).
Os
tripanossomatídeos
estão
divididos
em
doze
gêneros
(Leishmania,
Trypanosoma, Endotrypanum, Herpetomonas, Leptomonas, Crithidia, Blastocrithidia,
Phytomonas Wallaceina, Angomonas, Strigomonas e Sergeia), com base em características
morfológicas, filogenéticas e quanto à especificidade do hospedeiro (BORGHESAN et al.,
2013). Neste último caso, podem ser divididos em: monoxênicos, quando desenvolvem
todo o seu ciclo de vida em apenas um hospedeiro (geralmente um invertebrado), ou
heteroxênicos, quando desenvolvem o seu ciclo de vida em hospedeiros diferentes
(invertebrado e planta ou invertebrado e vertebrado) (revisto por LOPES et al., 2010).
8
Durante o seu ciclo de vida, devido a mudanças ambientais, os tripanossomatídeos
podem sofrer modificações morfofisiológicas, apresentando-se sob diferentes estágios de
desenvolvimento do ciclo biológico. Estas formas são caracterizadas pela morfologia do
corpo celular, pela presença ou ausência de membrana ondulante e de flagelo extracelular,
local de emersão do flagelo e pela posição do complexo formado pelo flagelo, bolsa
flagelar, e cinetoplasto em relação ao núcleo (HOARE & WALLACE, 1966; JANOVY,
LEE & BRUMBAUGH, 1974; WALLACE, 1977; YOSHIDA
et al., 1978;
VICKERMAN, 1990, 1994; TEIXEIRA et al., 1997). as formas mais comumente
encontradas dos tripanossomatídeos estão representadas na Figura 2. Além das formas
clássicas de distinção entre os gêneros de tripanossomatídeos, existem as maneiras que
apresentam maior especificidade, como as que avaliam características nutricionais,
bioquímicas, ultraestruturais e genéticas, permitindo a distinção em nível de espécies e até
cepas (revisto por LOPES et al., 2010; BORGHESAN et al., 2013).
Figura 2. As formas mais comumente encontradas dos tripanossomatídeos. A. promastigota; B.
opistomastigota, C. amastigota, D. epimastigota, E. tripomastigota, F. coanomastigota, G. esferomastigota.
(Adaptado de LOPES et al., 2010).
9
1.2. O gênero Leishmania e as leishmanioses
As leishmanioses compreendem um grupo de doenças com ampla diversidade
clínica e epidemiológica. Estas doenças são causadas por mais de 20 espécies de
protozoários parasitas pertencentes à família Trypanosomatidae e ao gênero Leishmania.
As leishmanioses são transmitidas por mais de 30 espécies de Phlebotomus no Velho
Mundo e Lutzomyia no Novo Mundo (revisto por SINGH, KUMAR & SINGH, 2012).
Parasitos do gênero Leishmania apresentam dois estágios básicos em seu ciclo de vida: um
estágio extracelular móvel (promastigotas) encontrado no hospedeiro invertebrado e um
estágio intracelular não móvel (amastigotas) encontrado no hospedeiro vertebrado. No
hospedeiro vertebrado, os parasitos infectam células denominadas fagócitos profissionais
como os neutrófilos, os monócitos e os macrófagos, bem como células dendríticas (DC),
precursores mielóides imaturos, hepatócitos e fibroblastos. No entanto, as principais
células infectadas por parasitos do gênero Leishmania são os macrófagos (revisto por
KOBETS, GREKOV & LIPOLDOVÁ, 2012). O ciclo de vida do parasito e suas formas
evolutivas seguem ilustrados na Figura 3.
Penetração de promastigotas metacíclicos
durante o repasto sanguíneo
Formas promastigotas são
fagocitadas por macrófagos
Divisão, migração e
metaciclogênese no trato
digestivo do vetor
Promastigotas se transformam
em amastigotas dentro dos
macrófagos
Amastigotas transformam-se em
promastigotas no intestino médio do
vetor
Amamstigotas se multiplicam dentro
das células (macrófagos) em vários
tecidos
Ingestão de células
parasitadas
Ingestão de macrófagos infectados com
amastigotas durante o repasto
sanguíneo
Figura 3- Representação esquemática do ciclo de Leishmania sp. no hospedeiro invertebrado e no
hospedeiro vertebrado. Adaptado (http://www.dpd.cdc.gov/dpdx - Acessado em 20/05/2013).
10
Em 1987, LAINSON & SHAW propuseram a divisão do gênero Leishmania em
dois subgêneros, Viannia e Leishmania. Estes dois subgêneros são classificados com base
na localização do parasito no intestino do vetor. Os membros do subgênero Leishmania
desenvolvem-se nas regiões pilórica e do intestino médio (desenvolvimento suprapilário),
enquanto as espécies do subgênero Viannia desenvolvem-se na região posterior do
intestino (desenvolvimento peripilário). Além disso, análises de isoenzimas são utilizadas
para definir os complexos de espécies dentro de cada subgênero (revisto por CORRÊA,
BRAZIL & SOARES, 2005).
A classificação das espécies no gênero Leishmania baseou-se inicialmente em
critérios ecobiológicos, tais como vetores, distribuição geográfica, tropismo, propriedades
antigênicas e manifestações clínicas. No entanto, análises bioquímicas e moleculares
mostraram que a classificação das espécies baseada apenas nestes critérios era insuficiente
para agrupar os flagelados de acordo com as suas similaridades genéticas. Portanto, outros
critérios passaram a ser utilizados para auxiliar a classificação das espécies de Leishmania,
tais como: perfil de isoenzimas, sondas de DNA e anticorpos monoclonais espécieespecíficos, análises de RFLP (“restriction fragment lenght polymorfism”) e perfil de
polimorfismo exibido pelo k-DNA (revisto por BAÑULS, HIDE & PRUGNOLLE et al.,
2007).
As leishmanioses podem ser classificadas tradicionalmente em três formas clínicas
principais: visceral (LV), cutânea (LC) – localizada ou difusa – e mucocutânea (LMC), as
quais diferem quanto à imunopatologia, grau de morbidade e mortalidade (revisto por
SINGH, KUMAR & SINGH, 2012).
A leishmaniose visceral, também conhecida como calazar, é fatal quando o
tratamento não é eficaz. Este tipo de leishmaniose é caracterizado por quadros de febre,
aumento do fígado e do baço, perda de peso e anemia. É altamente endêmica na Índia e no
Leste da África, e pelo menos 200.000 a 400.000 novos casos de leishmaniose visceral
ocorrem no mundo a cada ano. Mais de 90% dos novos casos ocorrem em seis países
principais: Bangladesh, Brasil, Etiópia, Índia, Nepal e Sudão. A forma visceral da doença é
principalmente causada por Leishmania donovani no subcontinente Indiano, Ásia e África;
Leishmania infantum na bacia do Mediterrâneo e Ásia Central e Leishmania chagasi na
América do Sul (revisto por KOBETS, GREKOV & LIPOLDOVÁ, 2012; WHO, 2013).
11
A leishmaniose dérmica pós-calazar ou PKDL é uma sequela da leishmaniose
visceral que aparece como uma erupção cutânea papular ou nodular, normalmente na face,
nos membros superiores e em outras partes do corpo. Esta forma da doença ocorre
principalmente no leste da África e no subcontinente Indiano, onde acima de 50% e de 510% dos pacientes com leishmaniose visceral, respectivamente, desenvolvem esta
condição. Este quadro geralmente se manifesta após seis meses a um ano do
desenvolvimento da leishmaniose visceral e os pacientes com PKDL são considerados
potenciais fontes de infecção (WHO, 2013).
A forma cutânea e a mucocutânea da doença apresentam um amplo espectro
clínico, que varia de lesões cutâneas simples e localizadas a lesões severas, difusas e lesões
na mucosa. No Novo Mundo, a leishmaniose cutânea é causada por uma variedade de
espécies pertencentes aos subgêneros Leishmania e Viannia produzindo diferentes
manifestações clínicas. Contudo, parte da população possui infecções subclínicas. No
subgênero Viannia são encontradas as espécies do complexo braziliensis, que causam
leishmaniose cutânea e mucocutânea no Novo Mundo, como por exemplo, Leishmania
(Viannia) guyanensis, L. (V.) braziliensis e L. (V.) panamensis. No subgênero Leishmania
são encontradas as espécies do complexo mexicana causadoras de leishmaniose cutânea,
como a L.(L.) amazonensis e L. (L.) mexicana. A forma mais frequente da leishmaniose
cutânea apresenta lesões simples ou múltiplas, mas lesões disseminadas também podem ser
observadas. As lesões podem ocorrer em qualquer local do corpo, mas comumente são
originadas no sítio de inoculação, onde inicialmente se formam lesões maculares,
posteriormente papulares e em seguida nodulares que aumentam de tamanho
progressivamente, tornando-se ulcerativas. Estas lesões podem se desenvolver em
semanas, meses ou até anos após a infecção (revisto por REVEIZ et al., 2013).
Algumas lesões causadas por espécies como Leishmania mexicana podem curar
espontaneamente em um período de quatro meses, enquanto lesões causadas por outras
espécies, como Leishmania amazonensis, Leishmania venezuelensis e Leishmania pifanoi
podem causar leishmaniose cutânea difusa, considerada uma forma anérgica, severa e
crônica da doença. Neste caso, a primeira resposta terapêutica é geralmente insatisfatória,
devido às alterações nas condições imunológicas, fisiológicas ou características
nutricionais do paciente, bem como a especificidade dos fatores farmacocinéticos das
drogas utilizadas no tratamento (SILVEIRA et al., 2004; DE SALDANHA et al., 2012;
WHO, 2010).
12
No Velho Mundo, estão as espécies responsáveis pela leishmaniose cutânea como
L. (L.) major, L. (L.) tropica e L. (L.) aethiopica, que taxonomicamente, não se enquadram
em nenhum dos complexos citados. Neste subgênero também se encontram as espécies do
complexo donovani como, por exemplo, Leishmania (L.) donovani e L. (L.) infantum,
responsáveis pela leishmaniose visceral no Velho Mundo, e L. (L.) chagasi, responsável
pela leishmaniose visceral no Novo Mundo (GRIMALDI et al., 1989; GRIMALD &
TESH, 1993; CUNNINGHAM, 2002; FUNASA, 2002; MELBY, 2002). As manifestações
clínicas dos diferentes tipos de leishmaniose podem ser observadas na Figura 4.
Figura 4: Manifestações clínicas dos diferentes tipos de leishmaniose. A partir da esquerda, forma cutânea
simples
(www.cpnoticia.com.br)
cutânea
difusa
(www.praticahospitalar.com.br),mucocutânea
(www.adventurezone.com.br) e visceral (www.vet.uga.edu).
As leishmanioses persistem predominantemente em países marginalizados ou
pobres, sendo, portanto, consideradas doenças negligenciadas. O tipo de patologia que é
causada depende da espécie de Leishmania, do genótipo e do status nutricional do
hospedeiro, do vetor transmissor da doença e de fatores sociais do meio (LIPOLDOVÁ &
DEMANT, 2006). A doença persiste como um problema de saúde pública mundial,
afetando aproximadamente 12 milhões de pessoas em 88 países e cerca de 50.000 pessoas
morrem a cada ano (DUJARDIN et al., 2008; POSTIGO, 2010). A incidência das
leishmanioses visceral e cutânea pode ser observada nas tabelas 1 e 2.
13
Tabela 1. Relatos e estimativa da incidência global da Leishmaniose Visceral (LV).
Casos de LV
Países com 5
Estimativa Anual de
relatados/ano
anos de
incidência de LV
dados
3662
8/11 (73%)
1
3/11 (27%)
Leste Africano
8569
5/8 (63%)
29.400 a 56.700
Mediterrâneo
875
21/26 (81%)
1200 a 2000
2496
14/17 (82%)
5000 a 10.000
Sul da Ásia
42.623
3/6 (50%)*
162.100 a 313.600
Total Global
58.227
54/79(68%)
202.200 a 389.100
Américas
África Sub-Saariana
Oriente
Médio
a
Ásia
4500 a 6800
Central
*3/3 (100%) dos países de alta incidência (Índia, Bangladesh, Nepal) relataram dados de um período de 5
anos. Incompleto para Sri Lanka, Butão e Tailândia; LV (Leishmaniose visceral). (adaptado de ALVAR et
al., 2012).
Tabela 2. Relatos e estimativa de incidência global da Leishmaniose Cutânea (LC).
Casos de LC
Países com 5
Estimativa Anual
relatados/ano
anos de dados
de incidência de LC
66.941
14/20 (70%)
187.200 a 307.800
África Sub-Saariana
155
5/15 (33%)
770 a 1500
Leste Africano
50
0/6 (0%)
35.300 a 90.500
Mediterrâneo
85.555
17/26 (65%)
239.500 a 393.600
Oriente Médio a Ásia Central
61.013
16/18 (89%)
226.200 a 416.400
Sul da Ásia
322
2/2 (100%)*
1900 a 3500
Total Global
214.036
53/87(61%)
690.900 a 1.213.300
Américas
LC (Leishmaniose cutânea). (Adaptado de ALVAR et al., 2012).
No Brasil, o número de casos de leishmaniose cutânea subiu de 6.335 em 1984 para
30.030 em 1996. De 1990 até 2007, 560.000 novos casos de leishmaniose foram
reportados, primariamente leishmaniose cutânea. No entanto, após 2005, o total de número
de casos de leishmaniose cutânea caiu e permaneceu estável, acima dos 20.000
(DIMITRIOS-ALEXIOS et al., 2013). A leishmaniose cutânea é causada por diferentes
subgêneros e espécies de Leishmania, sendo as mais importantes no Brasil: L. (L.)
14
amazonensis, Leishmania (V.) guyanensis e Leishmania (V.) braziliensis (Ministério da
Saúde, 2008). O parasito L. amazonensis é um dos principais causadores de leishmaniose
cutânea em áreas endêmicas. A infecção causada por L. amazonenis pode ser caracterizada
por lesões cutâneas múltiplas e progressivas, resistência à quimioterapia e anergia de
células T específicas (RANGEL & LAINSON, 2003).
A área geográfica onde a leishmaniose cutânea no Brasil se encontra estende-se por
toda a Bacia Amazônica (compreendendo a parte brasileira, e possivelmente países
vizinhos) bem como outros territórios, inclusive Maranhão, Ceará, Bahia, Minas Gerais e
Espírito Santo. A leishmaniose visceral no Brasil é causada principalmente por Leishmania
(L.) chagasi. Um controle efetivo das leishmanioses requer um mapeamento da
distribuição espacial da doença, bem como do número de pessoas afetadas para que os
tratamentos e outras intervenções de controle possam ser implementados (DIMITRIOSALEXIOS et al., 2013). A Figura 5 demonstra as taxas de incidência média de
leishmaniose cutânea e visceral no Brasil em um período de 10 anos (2001-2010).
Figura 5. Taxas de incidência média para leishmaniose cutânea (esquerda) e leishmaniose visceral
(direita) após um período de 10 anos (2001-2010) (DIMITRIOS-ALEXIOS et al., 2013).
15
1.2.1. Tratamento das leishmanioses
O tratamento clássico das leishmanioses inclui a utilização de antimoniais
pentavalentes utilizados desde a década de 1940. No entanto, o seu uso tornou-se obsoleto
nas áreas endêmicas como no estado de Bihar, leste da Índia, em função da resistência dos
parasitos, mas ainda são utilizados em outros locais, como é o caso do estibogluconato de
sódio (Pentostam®), antimoniato de N-metil glucamina (Glucantime®) ou marcas
genéricas com custos reduzidos (CROFT & OLLIARO, 2011).
A anfotericina B (AmB), um polieno antifúngico utilizado no tratamento de
infecções sistêmicas fúngicas, é considerada uma droga de segunda linha no tratamento das
leishmanioses, porém em alguns locais, como no leste da Índia, tem sido usada como de
primeira linha, devido à redução dos efeitos dos antimoniais. A AmB é uma droga de
escolha por apresentar alto grau de afinidade por ergosterol, esterol predominante
membrana celular de fungos e Leishmania. Em leishmaniose visceral, a AmB tem
demonstrado eficácia em mais de 95% dos casos. No entanto, esta droga é considerada
tóxica e seus efeitos colaterais têm sido reportados na literatura. As três formulações
químicas utilizadas no tratamento das leishmanioses são lipídicas e têm apresentado um
alto grau de eficiência, bem como uma redução nos efeitos adversos. No entanto, os altos
custos com a utilização destes compostos no tratamento ainda permanecem como fatores
importantes para serem avaliados (revisto por SINGH, KUMAR & SINGH, 2012).
A pentamidina, uma diamina aromática, também considerada uma droga de
segunda linha, é utilizada principalmente no tratamento da leishmaniose visceral. Porém, é
altamente tóxica, causando hipoglicemia, nefrotoxicidade, hipotensão e em alguns casos
pode levar à resistência, em estágios intracelulares do parasito. A paromomicina, um
antibiótico aminoglicosídico, apresenta atividade antibacteriana e antileishmania, é
utilizada no tratamento da leishmaniose visceral e cutânea de forma mais efetiva, mas tem
apresentado uso limitado nas regiões endêmicas (revisto por SINGH, KUMAR & SINGH,
2012).
A miltefosina, originalmente desenvolvida como agente antineoplásico, tem sido
utilizada no tratamento da leishmaniose visceral e foi considerada um dos maiores avanços
na quimioterapia antileishmania. A atividade da miltefosina ocorre devido à acumulação
intracelular da droga, a qual é regulada por dois transportadores pertencentes à família das
aminofosfolipídeos-translocases (PEREZ-VICTORIA et al., 2003).
16
Adicionalmente, outros grupos também demonstraram a capacidade da miltefosina
de induzir apoptose em promastigotas de L. donovani, que apresentaram condensação do
DNA nuclear (VERMA & DEY, 2004), diminuição do volume celular e externalização de
fosfatidilserina (PARIS et al., 2004). No entanto, a adesão ao uso desta droga no
tratamento das leshmanioses torna-se comprometida devido a sua alta meia-vida
(aproximadamente 152 h), podendo estimular o desenvolvimento de resistência clínica.
Além disso, a miltefosina apresenta efeitos teratogênicos e induz abortos naturais, o que
limita a sua utilização em mulheres grávidas (revisto por SINGH, KUMAR & SINGH,
2012).
As drogas utilizadas no tratamento das leishmanioses apresentam sérios problemas,
incluindo alta toxicidade e efeitos adversos, a necessidade da hospitalização dos pacientes,
surgimento de cepas resistentes e alto custo dos compostos utilizados. Porém como se
tratam de doenças consideradas negligenciadas, não há investimentos suficientes para
descoberta de novas drogas terapêuticas, já que não há um retorno financeiro.
1.3. Peptidases: um alvo para o desenvolvimento de quimioterápicos
Enzimas proteolíticas catalisam a clivagem de ligações peptídicas, as quais ligam
resíduos de aminoácidos em proteínas e peptídeos. Existe um conjunto de termos utilizados
pela comunidade científica para se referirem às enzimas proteolíticas, incluindo:
peptidases, proteases e peptídeo-hidrolases. Todas as proteases ligam seus substratos no
sulco ou fenda, onde ocorre a hidrólise da ligação peptídica (SANTOS, 2011).
Estas enzimas foram inicialmente classificadas, de acordo com a reação catalisada,
em exopeptidases ou endopeptidases. Exopeptidases são capazes de hidrolisar o peptídeo
nas extremidades de uma cadeia polipeptídica única, liberando aminoácidos, resíduos de
dipeptídeos ou de tripeptídeos, enquanto endopeptidases preferencialmente agem sobre as
ligações peptídicas nas regiões internas de um polipeptídeo (BARRETT, 1994; BEYNON
& BOND, 2001). De acordo com a natureza do sítio catalítico, as endopeptidases podem
ser classificadas como aspártico-, cisteína-, metalo-, serina-, treonina-, glutâmico- e
asparagino -peptidases (BARRETT, 1994; BEYNON & BOND, 2001; RAWLINGS et al.,
2012). O esquema de classificação das peptidases quanto ao tipo de reação catalisada e a
natureza química do sítio ativo pode ser observado na Figura 6.
A intensa pesquisa sobre peptidases gera uma quantidade ampla de informações,
exigindo um sistema de classificação compatível com esta diversidade. Um método de
17
classificação pode ser facilmente acessado no servidor de base de dados MEROPS
(RAWLINGS et al., 2012). Neste sistema, peptidases são agrupadas em famílias com base
nas semelhanças estatisticamente significativas e na sequência de aminoácidos do sítio
ativo. Cada família é identificada por uma letra que representa o domínio catalítico, onde A
é utilizado para aspártico, C para cisteína, M para metalo, S para serina, T para treonina, G
para glutâmico, N para asparagina e U para mecanismo de hidrólise desconhecido, seguido
por um número característico. Famílias de homólogos que surgiram a partir de uma origem
evolutiva comum são agrupadas em clãs. O clã representa uma ou mais famílias, que
mostram evidências sobre a relação evolutiva por estruturas terciárias semelhantes, a
ordem dos resíduos no sítio catalítico na cadeia polipeptídica e seu padrão de sequências de
nucleotídeos e aminoácidos. Para a representação do clã, duas letras são usadas, sendo a
primeira relacionada com a família (BARRET, 1997; 2001; 2003; RAWLINGS et al.,
2012).
Figura 6: Esquema da classificação das peptidases quanto ao tipo de reação catalisada e a natureza química
do sítio ativo (adaptado de BOND & BUTLER, 1987).
Em organismos infecciosos, as peptidases desempenham papéis cruciais como
fatores de virulência, além do seu envolvimento em funções celulares básicas. Por
exemplo, peptidases são necessárias para a invasão, colonização, disseminação no
hospedeiro, além de evasão do sistema imune (LOPEZ-OTÍN & BOND, 2008;
VERMELHO et al., 2008). Há uma série de relatos sobre as funções e exploração de
peptidases de tripanossomatídeos como alvos para quimioterápicos. Cisteína- e metalo-
18
peptidases são as classes mais estudadas em tripanossomatídeos, seguidas por serina- e
aspártico-peptidases (YAO, DONELSON & WILSON, 2003; OLIVER et al., 2012;
SANTOS et al., 2013).
Coletivamente, as peptidases participam em diferentes etapas dos eventos de
interação entre estruturas dos micro-organismos e hospedeiros, sendo consideradas,
portanto, fatores de virulência. Consequentemente, a caracterização bioquímica destas
enzimas proteolíticas é de interesse não somente para entender as proteases em geral, mas,
sobretudo para compreender seus papéis em infecções microbianas e desta forma explorálas como potenciais alvos no desenvolvimento de quimioterápicos para doenças
microbianas (SANTOS, 2011). A pesquisa por alvos potenciais para o desenvolvimento de
novas drogas tem sido desenvolvida com base nas vias bioquímicas e metabólicas
essenciais para a sobrevivência do parasito. As enzimas- alvo destas vias deveriam
apresentar significantes diferenças estruturais e funcionais em relação às pertencentes aos
mamíferos, a fim de se obter uma inibição seletiva do sítio-alvo. Além disso, as estratégias
que visam atingir mais do que uma enzima de uma via metabólica pode ser mais útil e
eficaz (SINGH, KUMAR & SINGH, 2012).
1.4. Peptidases no gênero Leishmania
Das seis classes de peptidases descritas na literatura, as classes das metalo- e
cisteína- peptidases têm sido extensivamente estudadas em espécies de Leishmania (SAJID
& MCKERROW, 2002; REYES-URIBE et al., 2012; PERTEGUER et al., 2013). No
entanto, peptidases pertencentes às classes serina, aspártico e treonina também foram
identificadas (BURLEIGH et al., 1997; SILVA-LOPEZ & GIOVANNI-DE-SIMONE,
2004; ALVES et al., 2005; CUERVO et al., 2008; SANTOS et al., 2009; BASTOS et al.,
2010; SANTOS et al. 2013). Uma análise genômica comparativa, realizada entre diferentes
espécies do gênero Leishmania, revelou que um número expressivo de genes de peptidases
é mantido constante nestes tripanossomatídeos. Porém, existe uma alta diversidade destas
enzimas em Leishmania, onde examinando o banco de dados, por exemplo, é revelado que
L. (V.) braziliensis apresenta pelo menos 44 cisteína-peptidases, 23 serina-peptidases e 97
metalo-peptidases (http://tritrypdb.org, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Portanto, devido ao
amplo espectro de atividades das peptidases em Leishmania, torna-se importante a
proposta de correlação da atividade destas enzimas e as manifestações clínicas das
leishmanioses.
19
1.4.1. Serina-peptidases
As serina-peptidases (SPs) têm sido demonstradas como importantes fatores de
virulência e influenciando a resposta imune do hospedeiro durante a infecção por
Leishmania. Estudos têm mostrado que níveis de SPs de superfície diminuem em cepas
atenuadas de L. (L.) donovani e que uma SP de 115 kDa parece estar relacionada com a
habilidade do parasito de infectar a célula hospedeira (CHOUDHURY et al., 2010). Foi
relatado ainda que uma oligopeptidase B, identificada e caracterizada por espectrometria
de massa e deleção do gene, é regulada positivamente durante a diferenciação para a forma
amastigota e participa no revestimento de superfície do parasito juntamente com a enolase.
Sendo assim, os amastigotas são capazes de se replicar sem serem detectados no interior do
macrófago (SWENERTON et al., 2011; revisto por SILVA-ALMEIDA et al., 2012;
BASTOS et al., 2013). Outra classe de SP, a subtilisina, (SUB, clã SB, família S8) foi
clonada em L. (L.) donovani e quando o gene desta SP foi deletado, a habilidade do
parasito submeter-se ao processo de diferenciação in vitro de promastigotas em
amastigotas foi reduzida. Além disso, a atividade desta SP em Leishmania é aumentada
inúmeras vezes em amastigotas, quando comparadas com promastigotas, sugerindo um
importante papel desta enzima nas formas evolutivas encontradas no hospedeiro vertebrado
(SWENERTON et al., 2011). Evidências adicionais da modulação imune por SPs foram
obtidas pela observação da imunização com frações de peptidases solúveis isoladas de uma
mistura de antígenos de L. (L.) amazonensis que foi capaz de aumentar a susceptibilidade
de camundongos a infecções experimentais subsequentes, sendo este efeito eliminado pelo
tratamento da fração de protease com inibidores de SP (PINHEIRO et al., 2005, revisto por
SILVA-ALMEIDA et al., 2012)
1.4.2. Aspártico-peptidases
As aspártico peptidases estão presentes em uma ampla variedade de organismos:
vertebrados, plantas, fungos, protozoários, procariotos e retrovírus (HILL & PHYLIP,
1997; JAMES, 1998; DASH et al., 2003). Essa classe de enzimas atraiu intensa atenção na
comunidade científica devido ao seu potencial de aplicação na indústria alimentar e como
alvo terapêutico para doenças humanas importantes (HILL & PHYLIP, 1997; JAMES,
1998; DASH et al., 2003; VERMELHO et al, 2008; HORIMOTO, DEE & YADA, 2009).
Estas incluem a pepsina na úlcera péptica, renina no tratamento da hipertensão,
20
plasmepsinas na malária, a catepsina D na metástase de vários tipos de células cancerosas,
a peptidase do HIV na síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS), e a enzima de
clivagem da proteína precursora β-amilóide (BACE) na doença de Alzheimer (SCOTT &
COOMBS et al., 2001; COOPER, 2002; VASSAR, 2002; DOMINGUEZ, HARTMANN
& DE STROOPER, 2004; BENES, VETVICKA & FUNSEK, 2008; VERMELHO et al.,
2008).
Há pouco conhecimento sobre as aspártico peptidases em Leishmania. Atualmente,
existem apenas poucos estudos que descrevem a atividade de aspártico peptidases em
frações solúveis de extratos brutos de Leishmania, por meio de substratos seletivos e
inibidores desta classe enzimática (ALVES et al, 2005; VALDIVIESO et al, 2007;
TRUDEL et al, 2008; SANTOS et al, 2009). Porém, com o aumento da incidência das
leishmanioses, associadas com altas taxas de morbidade, a disseminação de algumas
formas da doença em novas áreas geográficas e os casos de co-infecção Leishmania-HIV,
esta peptidase tem sido incluída como alvo de estudo pela comunidade científica.
1.4.3. Metalo-peptidases
A principal proteína de superfície de Leishmania spp. é denominada MSP ou gp63
e é uma metalo-peptidase (MP) dependente de zinco, pertencente à família das peptidases
M8. A primeira descrição desta enzima ocorreu na década de 80, sendo esta caracterizada
geneticamente e bioquimicamente como o principal antígeno de superfície de formas
promastigotas de Leishmania presente em várias espécies. Esta enzima é capaz de degradar
diferentes substratos incluindo caseína, gelatina, albumina, hemoglobina e fibrinogênio.
Uma vez internalizadas, as formas promastigotas se diferenciam em amastigotas no interior
dos fagolisossomas de macrófagos, e a expressão de gp63 em formas amastigotas é menor
quando comparada com formas promastigotas e as modificações pós-translacionais e
localização (ligada à membrana, citosólica ou na bolsa flagelar) difere entre as duas formas
evolutivas. A gp63 foi detectada em todas as espécies de Leishmania nas formas
amastigotas estudadas até agora; contudo, o seu papel exato na sobrevivência intracelular
de amastigotas ainda é objeto de discussão (YAO et al., 2003). A atividade biológica desta
enzima é associada com a proteção dos parasitos contra a ação de enzimas do hospedeiro
no intestino do inseto vetor e nos fagolisossomas dos macrófagos. Adicionalmente, a gp63
é requerida para a resistência à lise mediada pelo complemento em mamíferos hospedeiros,
bem como a presença de uma forma ativa da enzima reduz a fixação de componentes do
21
complemento nos parasitos e aumenta a conversão de C3b para a forma inativa C3bi. A
forma C3bi pode também atuar como uma opsonina, auxiliando o parasito a interagir com
macrófagos completamente através de receptores 1 e 3, favorecendo a sua internalização
(YAO et al., 2003; YAO, 2010; OLIVIER et al., 2012).
A regulação negativa da expressão de gp63 em parasitos aumenta a sua
susceptibilidade à lise mediada pelo complemento e promove o desenvolvimento de uma
resposta tipo Th1 no sítio de inoculação (THIAKAKI et al., 2006). Células Natural Killer
(NK) compreendem outro tipo de célula do sistema imune que tem demonstrado ser
influenciada pela gp63 de Leishmania. A habilidade de promastigotas de suprimir este tipo
celular é dependente da expressão de gp63; por exemplo, uma cepa mutante para gp63 de
L. (L.) major perde a sua habilidade de impedir a proliferação de células NK e a expressão
de fatores de superfície nestas células (LIEKE et al., 2008). A gp63 foi também reportada
por interagir com receptores de fibronectina (FR) e posteriormente ajudar o parasito na
adesão a células hospedeiras. Em L. mexicana, quando estes parasitos entram em contato
com a matriz extracelular do tecido subcutâneo, a gp63 degrada componentes
extracelulares favorecendo uma rápida migração em ensaios in vitro (MCGWIRE &
CHANG, 2003). CHEN e colaboradores demonstraram que a expressão reduzida de gp63
usando RNAs antisenso específicos em promastigotas de L. amazonensis promoveu a
diminuição da taxa de sobrevivência intracelular, confirmando que gp63 parece
desempenhar um papel fundamental na proteção de amastigotas dentro de macrófagos
(CHAUDHURI et al, 1989; SEAY, HEARD & CHAUDHURI, 1996; CHEN et al., 2000;
OLIVIER et al, 2012). A capacidade da gp63 de promover a sobrevivência de Leishmania
é devido à sua propriedade intrínseca de proteção contra o meio fagolisossomal, sendo
evidente a habilidade da gp63 de modificar de maneira rápida e eficiente as diferentes
funções do sistema imune que são de suma importância para o controle destes agentes
infecciosos.
1.4.4. Cisteína-peptidases
As cisteína-peptidases (CPs) são enzimas conhecidas por exercerem papéis
importantes na patogênese de doenças parasitárias e, além disso, destacam-se como
importantes fatores de virulência no desenvolvimento de novas drogas e candidatos a
vacinas. Muitos estudos têm identificado as CPs como prevalentes fatores de virulência em
espécies que são classificadas como pertencentes ao complexo L. (L.) mexicana,
22
especialmente utilizando-se modelos de infecção murina. A eficácia do uso de inibidores
de CPs no controle da infecção pode representar uma evidência da importância destas
enzimas durante o estabelecimento do processo infeccioso no hospedeiro (SELZER et al,
1999; SILVA-ALMEIDA et al., 2012).
As CPs mais estudadas em Leishmania são denominadas CPA, CPB e CPC, e todas
são classificadas como tipo papaína e pertencentes ao mesmo grupo das CPs, clã CA, que é
dividido em famílias: a família C, que inclui a enzima tipo catepsina B (CPC) e as enzimas
tipo catepsina L (CPA e CPB) e a família C2, que inclui as enzimas tipo calpaínas; entre
outras. Os genes responsáveis pela codificação das cisteína-peptidases de baixa massa
molecular cpa, cpb e cpc já foram identificados em diversas espécies de Leishmania.
Através da geração de mutantes nulos para cada um destes genes, foi demonstrado que o
papel da CPB talvez seja facilitar a diferenciação de promastigota para amastigota e/ou
facilitar a evasão do ataque microbicida do macrófago (revisto por FRAME, MOTTRAM
& COOMBS, 2000; MOTTRAM, COOMBS & ALEXANDER, 2004; REBELLO et al.,
2009; LIMA et al., 2009; revisto por SILVA-ALMEIDA et al., 2012). Além disso,
verificou-se que a CPA não é essencial para a replicação de L. infantum, mas é importante
para a interação parasito-hospedeiro (DENISE et al., 2006) e que a remoção dos genes ou
inibição das cisteína-peptidases CPA e CPB em L. mexicana não somente interfere na via
de autofagia que ocorre durante a diferenciação para promastigotas metacíclicos e
amastigotas, como também impede a metaciclogênese e transformação para amastigotas,
fortalecendo a hipótese de que a autofagia é requerida para a diferenciação celular
(WILLIAMS et al., 2006). A CPC de L. infantum também foi identificada com expressão
aumentada em amastigotas, correlacionando-se com uma função potencial na virulência
intracelular (LYNN et al., 2013).
1.5. Calpaínas
Um dos mais importantes sistemas proteolíticos do citosol de células animais é
formado pelas CPs neutras não-lisossomais dependentes de cálcio, as calpaínas, também
denominadas como peptidases dependentes de cálcio (CDPs). De acordo com a
classificação das peptidases pelo sistema MEROPS, as calpaínas são agrupadas na família
C2, no clã CA de CPs, cuja peptidase-tipo é a papaína. O termo calpaína indica justamente
a sensibilidade destas peptidases para o cálcio e sua similaridade com a papaína na região
do domíno catalítico (revisto por NEMOVA, 2010; revisto por SMITH &
23
SCHNELLMANN, 2012). As calpaínas foram identificadas pela primeira vez em 1976,
quando a primeira proteína desta família foi isolada do cérebro de rato (DAYTON et al.,
1976). Desde então, a família das calpaínas encontradas em mamíferos contém 16 genes
conhecidos: 14 são codificadores de proteínas que contêm domínios de CPs, enquanto os
outros dois genes codificam proteínas regulatórias menores, que estão associadas com a
subunidade catalítica, de tal forma que estas enzimas são proteínas heterodiméricas,
formadas por uma subunidade catalítica de 80 kDa e uma subunidade regulatória de 27
kDa. Além disso, existem duas isoformas homólogas da enzima, denominadas - e mcalpaínas, que têm sido distinguidas com base nas diferenças de seus requerimentos in
vitro por cálcio para atividade máxima (níveis micro- e milimolar, respectivamente). Estas
formas encontradas na superfamília das calpaínas são conhecidas como convencionais, e
todas as demais são referidas como não-convencionais (revisto por ONO & SORIMACHI,
2012).
As subunidades catalíticas e regulatórias possuem quatro (DI a DIV) e dois (DV e
DVI) domínios, respectivamente, como observado na Figura 7 (A) (STORR et al., 2011).
O domínio DI é a porção N-terminal da proteína, não apresentando homologia com
nenhum polipeptídeo conhecido. O domínio DI sofre autoproteólise quando as calpaínas
são ativadas por cálcio, mas isso não é um pré-requisito para a ativação. Quando ocorre a
hidrólise autocatalítica deste domínio, a enzima é ativada e, consequentemente, há a
dissociação da subunidade de 27 kDa (YOSHIZAWA et al., 1995). O domínio DII é
subdividido em domínios IIa e IIb, contendo a tríade catalítica Cys-His-Asn, Figura 8 (B);
dados obtidos através de cristalografia mostram que os aminoácidos do domínio IIa (Cys) e
IIb (His e Asn) só formam um sítio ativo funcional na presença de cálcio (revisto por
CARAFOLI & MOLINARI, 1998). O domínio DIII contém domínios C2, que
normalmente estão envolvidos com a ligação a cálcio e fosfolipídeos e, então, com a
interação com membranas (STORR et al., 2011). O domínio DIV é a porção C-terminal da
proteína, e também é conhecido como domínio calmodulina devido à sua homologia
estrutural com esta proteína, especificamente nos cinco sítios de ligação de cálcio,
conhecidos como “EF-hand”, que são essenciais para a enzima e dimerização com a
subunidade menor (HOSFIELD et al., 1999; BERTIPAGLIA & CARAFOLI, 2007). A
subunidade de 27 kDa apresenta dois subdomínios, Figura 7 (A). O domínio DV apresenta
uma sequência de unidades de glicina, que podem permitir a interação com a membrana
plasmática e sofrem autoproteólise durante a ativação das calpaínas, enquanto o domínio
24
DVI é homólogo ao domínio IV da subunidade maior, contendo cinco sítios “EF-hand”, e
participa na dimerização das duas subunidades (STORR et al., 2011).
Embora o domínio DII seja similar entre as calpaínas, existem divergências nos
outros domínios, e como consequência nem todas as calpaínas seriam dependentes de
cálcio ou requerem a presença da subunidade regulatória. Baseado na similaridade de
organização da subunidade de 80 kDa e na presença de motivos “EF-hand” no domínio IV,
as calpaínas são divididas em duas grandes classes: típicas e atípicas, como demonstrado
na Figura 7 (B). Calpaínas típicas (1, 2, 3, 8, 9 e 11 de humanos e CALP A, B e C de
Drosophila) apresentam o domínio DIV com os motivos “EF-hand”, sendo que este
domínio está ausente em calpaínas atípicas (NEMOVA et al., 2010). Calpaínas atípicas
realizam a sua ligação ao cálcio através de estruturas diferentes de motivos “EF-hand”,
além de possíveis acopladores, e por isso é prematuro afirmar que essas calpaínas são
independentes de cálcio. Entre as calpaínas atípicas, são encontrados domínios C-terminais
característicos, como os domínios T, SOL H e PBH, em vez do domínio semelhante à
calmodulina. A presença destes três domínios permite a divisão destas calpaínas nos
grupos TRA-3, SOL e PalB, respectivamente (BONDAREVA & NEMOVA, 2008).
A
µ-calpaína
B
Domínio Típico de Calpaínas (EF-hand)
Domínio Atípico de Calpaína (Não EF-hand)
Dedo de Zn
Figura 7. Estrutura esquemática do heterodímero μ-calpaína e membros da família calpaína: (A) A calpaína
CAPN1 contém domínios DIIa e DIIb (domínios protease), bem como DIII e DIV (domínios “EF-hand”), na
figura em cor lilás. CAPNS1 (a subunidade regulatória de 27 kDa) contém domínios DV e DVI. CAPNS1 se
associa com CAPN1 para formar um heterodímero. Unidades da tríade catalítica (regiões ovais em cor
laranja) das calpaínas estão localizadas dentro do domínio da protease. (B) Membros das calpaínas típicas,
25
apresentando motivos “EF-hand”, e calpaínas atípicas, contendo as isoformas sem os domínios “EF-hand”
(Adaptado de STORR et al., 2011 e SUZUKI, 2004).
Figura 8. Estrutura tridimensional do domínio II da µ-calpaína. (A) Moléculas de cálcio (bolas azuis) ligadas
ao sítio ativo da calpaína. (B) Representação dos aminoácidos que formam a tríade catalítica da enzima:
Asn296, Cys115 e His272 (http://www.calpain.org/index.rb).
O domínio T na estrutura da calpaína TRA-3 de Caenorhabditis elegans e seus
homólogos formam um domínio C-terminal adicional, representando um módulo de
membrana ligado a cálcio, que está envolvido na transdução de sinal e no tráfego de
membranas. Foi demonstrado que o gene tra-3 está envolvido na cascata de determinação
do sexo em C. elegans. A região C-terminal da calpaína SOL (menor proteína dos lobos
ópticos) de Drosophila e seus homólogos contêm o domínio SOL. Em D. melanogaster, a
proteína SOL está envolvida com o desenvolvimento do sistema nervoso, uma vez que o
gene sol defectivo leva a uma degeneração específica nos lobos óticos, resultando numa
redução do tamanho dos lobos óticos e na ausência de certas classes de neurônios. O
domínio PBH está presente na proteína PalB de Aspergillus nidulans e seus homólogos,
sendo responsável pela adaptação a valores alcalinos de pH (revisto por SORIMACHI,
ISHIURA & SUZUKI, 1997).
Como citado acima, múltiplos genes que codificam homólogos das subunidades de
80 kDa das calpaínas foram encontrados em uma grande variedade de organismos, desde
protozoários até mamíferos (SORIMACHI & SUZUKI, 2001; GOLL, 2003). Existem
tanto domínios conservados quanto altamente variáveis na estrutura de calpaínas e
proteínas denominadas “calpaína-like”. A grande variedade de organização estrutural e
mecanismo de regulação indicam a diversidade das funções celulares desempenhadas pelas
calpaínas (ANDRESEN, 1991; DENISON, 1995; BARNES, 1996; FUTAI, 1999;
ERSFELD, 2005). Além disso, alguns representantes da família calpaína (calpaína 6 de
26
vertebrados, calpaínas de cinetoplastídeos, CALP C de Drosophila) têm substituições de
aminoácidos na tríade catalítica, e por isso provavelmente não têm atividade proteolítica. A
existência de calpaínas com essa característica indica que elas têm funções específicas que
ainda não foram estabelecidas (BONDAREVA & NEMOVA, 2008).
Uma vez que as calpaínas requerem concentrações altíssimas de cálcio para
ativação in vitro, o papel fisiológico dessas enzimas em eventos mediados por cálcio tem
sido amplamente discutido. A forma de ativação in vivo pode ser regulada por
autoproteólise e outros fatores como ligação com fosfolipídeos da membrana, inibidores ou
ativadores endógenos que diminuiriam a quantidade de cálcio requerida para ativação
(revisto por JOHNSON & GUTTMANN, 1997).
Pouco é conhecido sobre a identidade do substrato das calpaínas in vivo e, portanto,
suas funções não são bem definidas. A existência de calpaínas e proteínas relacionadas às
calpaínas numa ampla variedade de organismos sugerem uma função básica e essencial em
eventos fisiológicos celulares, tais como remodelação do citoesqueleto, adaptações
ambientais, regulação do ciclo celular e apoptose. Acredita-se que as calpaínas tenham um
papel mais importante no processamento de substratos, ativando-os através da remoção de
domínios auto-inibitórios, do que na degradação completa das proteínas (revisto por
CARAFOLI & MOLINARI, 1998; GOLL et al., 2003). Também se acredita que as
calpaínas estejam fortemente relacionadas com determinadas funções cerebrais. Nesse
contexto, o envolvimento destas moléculas na isquemia foi sugerido por KUWAKI (1989)
e desde então vários relatos associam calpaínas a isquemia (SAIDO et al., 1994; SIMAN et
al., 1996; KAMPFL et al., 1997). Mudanças na atividade das calpaínas também podem
estar envolvidas com a Doença de Alzheimer, pois vários relatos já demonstraram que mcalpaína é mais expressa no cérebro de pacientes com Alzheimer (GRYNSPAN et al.,
1997).
1.5.1 Calpaínas em tripanossomatídeos
No grupo dos tripanossomatídeos monoxênicos, foi descrita a purificação de uma
CP extracelular de uma cepa apossimbiótica de Angomonas deanei (previamente chamada
de Crithidia deanei), que apresentou uma banda de aproximadamente 80 kDa,
completamente inibida por E-64 e EGTA, apresentando desta forma características
semelhantes à família das calpaínas (D’AVILA-LEVY et al., 2003). Recentemente, foi
reportado no genoma de A. deanei e Strigomonas culicis a presença de um grande grupo de
27
famílias de genes de CPs tipo calpaínas, sendo ao todo encontrados 85 membros em A.
deanei e 62 membros em S. culicis. A relativa quantidade de peptidases tipo calpaínas
nestas espécies pode estar relacionada à presença do endosimbionte, o qual requer uma
regulação mais complexa do ciclo celular e distribuição intracelular das organelas, uma vez
que as calpaínas citosólicas foram encontradas regulando a remodelação do citoesqueleto,
eventos de transdução de sinal e diferenciação celular (MOTTA et al., 2013).
PEREIRA e colaboradores (2009) investigaram uma possível participação de
moléculas similares às calpaínas na diferenciação estimulada por dimetilsulfóxido
(DMSO) em Herpetomonas samuelpessoai, um protozoário monoxênico. Os autores
verificaram que parasitos tratados com DMSO expressavam uma molécula de 80 kDa, que
apresentava reatividade cruzada com a calpaína de D. melanogaster, verificada com o uso
do anticorpo específico anti-Dm-calpaína (EMORI & SAIGO, 1994). Além disso, a
detecção desse polipeptídeo aumentou aproximadamente 50% em células diferenciadas
pelo uso do DMSO.
Em protozoários heteroxênicos, foi descrito no gênero Trypanosoma, através de
sequenciamento genético em T. brucei, uma proteína associada ao citoesqueleto (CAP 5.5)
que apresentou similaridade com a região catalítica das calpaínas, entretanto, não foi
verificado se a proteína apresentava atividade enzimática (HERTZ-FOWLER, ERSFELD
& GULL, 2001). Em cepas de T. cruzi resistentes ao benzonidazol, foi identificada a
presença de proteínas tipo calpaínas (ANDRADE et al., 2008). GIESE e colaboradores
(2008) clonaram um gene pertencente à família das calpaínas em T. cruzi, denominado
TcCALPx11, que correspondia a uma proteína hipotética de 80 kDa (XP_816697.1)
específica das formas epimastigotas submetidas ao estresse nutricional que precedia a
metaciclogênese. Nenhuma atividade proteolítica foi identificada para a proteína de 80 kDa
em T. cruzi, e a sua expressão diferenciada sugeria que a proteína poderia exercer um papel
na resposta ao estresse e/ou na transdução de sinal. SANGENITO e colaboradores (2009)
demonstraram a existência de moléculas similares às calpaínas em formas epimastigotas da
cepa Dm28c de T. cruzi, localizadas majoritariamente em compartimentos intracelulares.
Nesse trabalho, uma amostra de T. cruzi recém-isolada de camundongos apresentou maior
expressão de proteínas similares a calpaínas quando comparada a uma cepa mantida sob
condições axênicas ao longo de vários anos, sugerindo uma possível associação destas
moléculas com a patogenicidade em T. cruzi. O inibidor III de calpaínas (MDL28170) foi
capaz de reduzir significativamente a taxa de multiplicação das formas epimastigotas de T.
cruzi após 48 h de incubação (SANGENITO et al., 2009). Além destes dados, uma
28
proteína de citoesqueleto denominada H49, semelhante às calpaínas, foi descrita em T.
cruzi, podendo apresentar um papel estrutural, possivelmente o de assegurar o corpo
celular preso ao flagelo, através do conjunto de microtúbulos subpeliculares
(GALETOVIC et al., 2011).
No gênero Leishmania, o primeiro relato de atividade proteolítica relacionada com
calpaínas em tripanossomatídeos, onde uma CP dependente de cálcio foi detectada,
ocorreu em formas promastigotas de L. donovani. A enzima foi denominada caldonopaína
devido à sua similaridade com a família das calpaínas, embora a reação cruzada ou
homologia com genes de outras calpaínas não tenha sido determinada. Posteriormente foi
demonstrado que a atividade da caldonopaína facilitava a invasão de macrófagos por L.
donovani (BHATTACHARYA, DEY & DATTA, 1993; DEY, BHATTACHARYA &
DATTA, 2006).
Em L. amazonensis, estudos utilizando análise de imunoblotting demonstraram que
o
anticorpo
anti-Dm-calpaína
foi
capaz
de
reconhecer
um
polipeptídeo
de
aproximadamente 80 kDa. Nas técnicas de imunofluorescência e citometria de fluxo
utilizando este mesmo anticorpo, foi possível observar uma intensa marcação no flagelo e
na superfície das células, respectivamente. Tais características sugerem que este
tripanossomatídeo possui moléculas relacionadas a calpaínas. Simultaneamente, nenhum
epítopo comum foi encontrado entre calpaínas de mamíferos e de L. amazonensis
(D’ÁVILA-LEVY et al., 2006).
A análise da sequência de seis clones genômicos demonstrou a existência de
diferenças na expressão de genes em cepas de L. donovani isoladas de pacientes que
haviam desenvolvido calazar e leishmaniose dérmica pós-calazar (PKDL). A expressão foi
aproximadamente duas vezes maior de genes relacionados com moléculas importantes nos
parasitos encontrados em pacientes com PKDL quando comparada com pacientes que
apresentavam o quadro original de leishmaniose visceral. Dentre estas moléculas estão
incluídas a gp63, gp46 e uma proteína tipo calpaína. A proteína tipo calpaína identificada
neste estudo é um polipeptídeo curto, de aproximadamente 14 kDa, similar ao encontrado
em T. brucei (CAB95480) (SALOTRA et al., 2006). VERGNES e colaboradores (2007)
demonstraram que em cepas de L. donovani resistentes a antimoniais pentavalentes ocorria
uma expressão diferenciada de algumas proteínas e o mecanismo de apoptose apresentavase modificado. Neste trabalho, foi reportado que duas proteínas, a HSP83 e uma proteína
relacionada com as calpaínas (SKCRP-14.1), estavam intimamente relacionadas com o
fenótipo de resistência a apoptose induzida pelos antimoniais. A proteína HSP83
29
aumentava a resistência às drogas utilizadas e reduzia a ativação do mecanismo de
apoptose por interferência no potencial da membrana mitocondrial. Por outro lado, a
proteína SKCRP-14.1 protegia contra o mecanismo de apoptose induzido pela miltefosina.
Um estudo recente realizado em pacientes com leishmaniose visceral demonstrou que o
processo de sialoglicosilação de células sanguíneas vermelhas aumenta o estresse
oxidativo, a fragmentação da espectrina induzida por calpaínas e o mecanismo de
hemólise, podendo estar relacionado com o quadro severo de anemia, que agrava o quadro
clínico da doença, além de induzir os pacientes ao sofrimento (SAMANTA et al., 2012).
O envolvimento das calpaínas em diferentes aspectos fisiológicos e bioquímicos
dos parasitos faz com que estas enzimas tornem-se alvos de pesquisa, e através da
caracterização destas enzimas nos tripanossomatídeos monoxênicos e heteroxênicos, será
possível determinar as funções destas moléculas na família Trypanosomatidae.
30
2. OBJETIVO
2.1. Objetivo Geral do Trabalho
O presente trabalho tem como objetivo detectar moléculas calpaína-like em formas
amastigotas axênicas de Leishmania amazonensis.
2.2. Objetivos Específicos

Obtenção das formas amastigotas axênicas in vitro.

Evidenciação se as formas diferenciadas são amastigotas.

Detecção da presença de moléculas calpaína-like em formas amastigotas
diferenciadas.

Verificação da atividade enzimática para calpaínas, utilizando um substrato
fluorogênico específico.
3. METODOLOGIA
3.1. Microrganismo e Condições de Cultivo
Neste trabalho foram usadas formas promastigotas da cepa (IFLA/BR/1967/PH8)
de Leishmania amazonensis. Os parasitos foram mantidos através de repiques semanais em
meio Schneider (Schneider Insect Medium – SIGMA) suplementado com 10% (v/v) de
soro fetal bovino (SFB) e acrescido de gentamicina (40µg/mL) a temperatura de 28°C.
3.2. Obtenção das formas amastigotas axênicas
Formas promastigotas de L. amazonensis foram coletadas na fase log de
crescimento (107 células/ml), lavadas três vezes em PBS (3000 g, 4 min, 4°C) e incubados
em meio Schneider (pH 5,5) suplementado com 2,5% de SFB a 32°C por 6 dias. Alíquotas
diárias foram recolhidas e a determinação do número de células diferenciadas foi realizada
através de contagem em câmara de Neubauer, utilizando como critério a morfologia das
células. Adicionalmente foi determinada a morfologia celular por microscopia óptica e por
31
citometria de fluxo, assim como foi realizado o processo de diferenciação das formas
evolutivas pela detecção de antígenos específicos presentes em promastigotas.
3.3. Análise das alterações morfológicas utilizando microscopia óptica.
Alíquotas diárias contendo 106 células foram obtidas durante os 6 dias de
diferenciação das formas promastigotas em formas amastigotas axênicas. As suspensões
contendo as células foram lavadas 3 vezes com PBS gelado e ressuspensas em 100 µl desta
mesma solução, e posteriormente foram adicionadas em lâminas de vidro para microscopia
óptica. As células foram aderidas às lamínulas, fixadas com metanol absoluto por 5 min e
coradas com Giemsa 36% por 45 min a temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas
exaustivamente em água destilada e após secas foram fotografadas em microscópio óptico
modelo Zeiss Axioplan 2 (Oberkochen, Alemanha) equipado com a câmera digital Color
View XS.
3.4 Análise da morfologia celular e da expressão de epítopos específicos para formas
promastigotas por citometria de fluxo.
Ao longo do processo de diferenciação (6 dias), alíquotas diárias contendo 107
parasitos foram coletadas, lavadas e fixadas por 30 min à temperatura ambiente em
paraformaldeído 0,4% diluído em PBS. Após a fixação, as células foram lavadas três vezes
em PBS gelado e os parasitos foram incubados por 1 h com o anticorpo monoclonal 3A1La, específico para formas promastigotas, diluído a 1:100. Após este período, as células
foram lavadas extensivamente em PBS e incubadas com o anticorpo secundário (anti-IgG)
obtido em coelho, conjugado à isotiocianato de fluoresceína (FITC) na diluição de 1:200.
Finalmente, as células foram lavadas e analisadas por citometria de fluxo. Células não
tratadas e tratadas somente com o anticorpo secundário foram utilizadas como controles
negativos. Formas promastigotas de L. amazonensis foram utilizadas como controle
positivo. Paralelamente, foram realizadas análises da morfologia celular utilizando o
parâmetro FSC (tamanho)  SSC (granulosidade) (Forward Scatter  Side Scatter). As
análises foram realizadas no citômetro FACSCalibur, BD Bioscience, USA.
32
3.5. Análise da expressão de moléculas calpaína-like em formas amastigotas axênicas
de L. amazonensis em citometria de fluxo.
Um total de 107 células/ml de formas evolutivas em diferenciação (1° ao 5° dia) ou
formas amastigotas axênicas (6° dia) da cepa PH8 foram fixadas e lavadas com descrito no
item 3.3. Em seguida, foram incubadas em PBS (pH 7,2) por 1 h com diluição de 1:200 do
anticorpo policlonal anti-Dm-calpaína (específico para a região C-terminal da calpaína de
Drosophila melanogaster), que foi generosamente doado pelo Dr. Yasufumi Emori do
“Department of Biophysics and Biochemistry, Faculty of Science, University of Tokyo”,
Japan (EMORI & SAIGO, 1994). Posteriormente, as células foram processadas para
citometria de fluxo como descrito no item 3.4.
3.6. Análise da atividade enzimática de promastigotas, de formas em diferenciação e
de amastigotas axênicos utilizando substrato fluorogênico para calpaínas .
A atividade enzimática foi determinada através de um substrato específico para
calpaínas
(N-succinil-Leu-Tyr-7-amido-4-metilcumarina, Sigma Aldrich) utilizando
extratos celulares de formas promastigotas e formas em diferenciação (1° ao 6° dia) de L.
amazonensis. Alíquotas contendo 108 células/ml foram centrifugadas (4000 g/3 min),
lavadas duas vezes em PBS gelado, (pH 7,2), e ressupensas em 1 ml de tampão de lise para
atividade de calpaínas (HEPES 10 mM pH 7,5; NaCl 0,15 M; EDTA 1 mM; βmercaptoetanol 10 mM; Chaps 1%). Em seguida, as amostras foram acondicionadas em
tubo de 2 ml contendo pérolas de vidro e lisadas no equipamento Fast Prep (Thermo
Savant Fast Prep FP120 Homogenizer) utilizando cinco ciclos de 30 seg cada, alternando
com 5 min de incubação no gelo. Após este processo, foi verificada a lise das células
através de observação em microscópio óptico Nikon Eclipse E200. As amostras foram
centrifugadas duas vezes (12000 g/15 min) para remoção do sobrenadante e separação das
pérolas de vidro. O sobrenadante foi coletado e utilizado para determinar a atividade
enzimática para calpaínas. A leitura foi monitorada por 2 h, com intervalos de 2 min entre
as leituras no espectrofluorímetro (SpectraMax Gemini XPS, Molecular Devices, USA). O
comprimento de onda de excitação foi de 380 nm e o comprimento de onda de emissão de
460 nm.
33
4. RESULTADOS
4.1 Obtenção das formas amastigotas axênicas e análise da morfologia das células ao
longo processo de diferenciação.
Considerando a detecção de moléculas similares a calpaínas em formas
promastigotas de L. amazonensis pelo nosso grupo (D’AVILA-LEVY et al., 2006), foi
investigada a presença destas moléculas em formas amastigotas axênicas. Para este estudo
foram testados protocolos de diferenciação utilizando a cepa Josefa (D’AVILA-LEVY et
al., 2006). No entanto, não foram obtidos resultados significativos, havendo a necessidade,
portanto, de mudarmos de cepa. A cepa selecionada para os ensaios de diferenciação do
presente trabalho foi a cepa PH8, através da qual foi estabelecido um protocolo de
diferenciação adequado para a obtenção das formas amastigotas axênicas. A concentração
de SFB selecionada para a obtenção das formas amastigotas axênicas in vitro foi de 2,5%
(adaptado de MORAIS-TEIXEIRA et al., 2008). O método usado para a diferenciação de
formas promastigotas de L. amazonensis em formas amastigotas axênicas foi baseado na
elevação da temperatura (32°C), acidificação do pH (pH 5,5), aumento da concentração de
soro no meio de cultura e incubação por 6 dias (adaptado de ALVES et al., 2005; BARAK
et al., 2005). Na Figura 9 é demonstrada a cinética de diferenciação após os 6 dias de
incubação. Durante a indução do processo de diferenciação, as células foram contadas em
câmara de Neubauer e o número de promastigotas (Figura 9 A) e amastigotas (Figura 9
B) foram estimados. Os resultados demonstraram que o número de promastigotas diminuiu
ao passo que, o número de amastigotas aumentou em função do tempo. No 4° dia foi
observada uma população diferenciada em sua totalidade e este perfil permaneceu até o 6°
dia (Figura 9). As células totalmente diferenciadas eram pequenas, apresentavam forma
ovoide ou arredondada, com ausência de motilidade e sem flagelo evidente.
34
Número de Células
7
( 10 )
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
0
1º
2º
3º
4º
5º
6º
Dias de Diferenciação
Figura 9: Cinética do processo de diferenciação de formas promastigotas em formas amastigotas. Ao
longo do processo de diferenciação (6 dias), alíquotas diárias foram recolhidas e a determinação do número
de células diferenciadas foi realizada através de contagem em câmara de Neubauer, utilizando como critério a
morfologia das células. As barras pretas representam o número de promastigotas e as barras brancas
representam o número de amastigotas.
Para confirmar os dados acima, foram realizadas duas metodologias adicionais, a
citometria de fluxo para verificar o tamanho e a granulosidade das células e a microscopia
ótica para verificar a morfologia. A citometria de fluxo demonstrou uma diminuição do
tamanho celular em função do tempo utilizando os parâmetros FSC/SSC, que representam
tamanho/granulosidade, respectivamente (Figura 10 A). No 1°, 2° e 3° dia de
diferenciação as células apresentaram um tamanho maior quando comparadas com as
células no 4°, 5° e 6° dia de diferenciação, corroborando com os dados da cinética de
diferenciação. Os resultados de microscopia ótica demonstraram que os promastigotas
foram transformados em células ovoides ou arredondadas e desprovidas de flagelo (Figura
10 B), como observado inicialmente durante a cinética de diferenciação. Com estes dados
representados nas Figuras 09 e 10, foi possível concluir que as células obtidas a partir do
processo de diferenciação descrito no item 3.3 da metodologia, compartilham
características morfológicas com formas amastigotas.
35
Figura 10: Análise do tamanho e da morfologia celular de L. amazonensis durante o processo de
diferenciação de formas promastigotas em formas amastigotas. Alíquotas diárias foram recolhidas
durante o processo de diferenciação (6 dias) e a determinação do tamanho e morfologia celular foram
realizados por citometria de fluxo (A) e por microscopia óptica (B), respectivamente. As células
diferenciadas apresentaram uma diminuição do volume celular, formas ovoides ou arredondadas e perda do
flagelo.
36
4.2 Análise da expressão de epítopos pelas formas promastigotas e amastigotas
utilizando o anticorpo 3A1-La.
Uma vez determinado o tamanho e a morfologia das células diferenciadas,
demonstrando que as formas obtidas através deste processo compartilhavam características
morfológicas com amastigotas, foi testada a expressão de moléculas específicas utilizando
o anticorpo 3A1-La. O anticorpo 3A1-La é um anticorpo monoclonal estágio-específico
capaz de reconhecer somente formas promastigotas de L. amazonensis (CHAVES et al.,
2003). Sendo assim, formas promastigotas e formas amastigotas diferenciadas (6° dia)
foram lavadas, fixadas em paraformaldeído, incubadas na presença do anticorpo 3A1-La e
analisadas quanto ao perfil de expressão de epítopos. Através do ensaio de citometria de
fluxo, observou-se que as formas promastigotas apresentaram uma maior expressão de
epítopos reconhecidos pelo anticorpo 3A1-La do que as formas amastigotas diferenciadas,
como esperado uma vez que este anticorpo é específico para formas promastigotas (Figura
11 A e B). Estes dados reforçam juntamente com os apresentados nas Figuras 10 e 11, que
as formas obtidas a partir do processo de diferenciação apresentam fortes evidências de
serem amastigotas.
37
A
Eventos
a (2,65%)
b (3,15%)
c (73,98%)
Intensidade de Fluorescência
75
B
*
MFI
50
25
0
AUTO
AMA
PRO
Figura 11: Análise da expressão de epítopos pelas formas amastigotas e promastigotas utilizando o
anticorpo 3A1-La. (A) Parasitos incubados na ausência do inibidor (a), formas amastigotas axênicas (b) e
formas promastigotas (c) de L. amazonensis foram lavadas, fixadas em paraformaldeído e incubadas na
ausência ou na presença do anticorpo 3A1-La na diluição de 1:100. (B) Representação da Média de
Intensidade de Fluorescência (MFI) dos eventos analisados. Auto (autofuorecência), Ama (amastigota) e Pro
(promastigotas). Os dados apresentados nos gráficos são representativos da análise de 10,000 células de
experimentos realizados em duplicata. Os valores representam o percentual de células fluorescentes e os
resultados foram considerados significativos quando P< 0,05 (*).
38
4.3 Análise da expressão de moléculas similares a calpaínas em formas evolutivas ao
longo do processo de diferenciação e em amastigotas axênicos de L. amazonensis.
Para este ensaio, alíquotas foram coletadas, lavadas, fixadas e incubadas na
ausência dos anticorpos (autofluorescência) ou na presença dos anticorpos anti-calpaína de
tripanossomatídeos e anti-Dm-calpaína. Foi possível observar uma diminuição na
expressão de moléculas com similaridades a calpaínas quando incubadas com anticorpos
anti-calpaína e um aumento dessa expressão quando incubadas com anti-Dm-calpaína nas
formas promastigotas (A e B) ao contrário das formas amastigotas (C e D), onde se pode
observar um aumento da expressão quando incubadas com anticorpos anti-calpaína e uma
diminuição com anticorpos anti-Dm-calpaína (Figura 12)
Leishmania Formas
amazonensis
(Cepa pH 8,0)
Promastigotas
Forma promastigota
150
CTR (Controle)
125
MFI
A
A1 (Anticorpo contra calpaínas
de tripanossomatídeos)
A2 (Anticorpo Anti-DM calpaína
contra calpaínas de Drosophila
melanogaster)
B
100
75
50
Controle
A1
A2
25
0
CTR
Leishmania amazonensis (Cepa pH 8,0)
Forma amastigota
C
MFI
60
Controle
Controle
A1
A2
80
70
A2
A1
CTR (Controle)
D
A1 (Anticorpo contra calpaínas
de tripanossomatídeos)
A2 (Anticorpo Anti-Dm calpaína
contra calpaínas de Drosophila
melanogaster)
50
40
30
20
10
0
CTR
A1
A2
Figura 12: Análise da expressão de moléculas similares a calpaínas em formas promastigotas e
amastigotas de L. amazonensis. Formas promastigotas (A e B) e formas amastigotas (C e D) de L.
amazonensis foram fixadas com paraformaldeído e incubadas na ausência dos anticorpos (autofluorescência)
ou na presença dos anticorpos anti-calpaína de tripanossomatídeos (A1) e anti-Dm-calpaína (A2) na
proporção de 1:500 e 1:100, respectivamente. (B) e (D) Representação da Média de Intensidade de
Fluorescência (MFI) dos eventos analisados. Os dados apresentados nos gráficos são representativos da
análise de 10,000 células de experimentos realizados em duplicata.
39
4.4. Verificação da atividade enzimática durante o processo de diferenciação
utilizando um substrato fluorogênico específico para calpaínas
O
substrato
específico
para
calpaínas
(N-succinil-Leu-Tyr-7-amido-4-
metilcumarina) foi utilizado para avaliar a atividade hidrolítica de extratos celulares
obtidos a partir de formas em processo de diferenciação (1° ao 6° dia) (Figura 13 b-g).
Todos os extratos celulares obtidos foram capazes de degradar o substrato para calpaínas
em pH 7,5 (Figura 13 b-g) e tiveram sua atividade aumentada quando íons cálcio (50µM)
foram adicionados, com exceção do extrato celular obtido no 6° dia (Figura 13 g).
Extratos celulares de promastigotas foram utilizados como controle (Figura 13 a). Os
extratos celulares foram incubados sob diferentes condições: na ausência de cálcio,
quelantes e inibidores proteolíticos (sistemas controle) ou na presença de 50 µM cálcio
(Ca2+), de 20 µM inibidor de cisteína-peptidase (E-64), de 20 mM quelante de cálcio
(EGTA), do inibidor de cisteína-peptidase + quelante de cálcio (E-64 + EGTA), de 30 µM
inibidor de calpaínas (MDL28170), de 1 mM inibidor de metalopeptidase (1,10fenantrolina), de 1 mM inibidor de serina-peptidase (PMSF) e de 10 µM inibidor de
aspártico-peptidase (pepstatina A). Os perfis de degradação do substrato para calpaínas
pelos extratos celulares obtidos nos diferentes dias foram comparados. Os resultados
demonstraram um aumento e posterior diminuição da atividade proteolítica dos extratos
celulares ao longo dos dias de diferenciação, quando comparados com os promastigotas. A
atividade enzimática analisada foi relacionada com calpaínas devido ao perfil apresentado
como: o aumento da atividade na presença de cálcio, a inibição da atividade proteolítica
pelos inibidores de cisteína-peptidases, a inibição da atividade por quelante de cálcio e a
manutenção da atividade proteolítica na presença dos inibidores de outras classes de
peptidases. (Figura 13 a-g). Analisando a média das unidades arbitrarias de fluorescência
(UAF) das formas em diferenciação, pode-se observar um aumento da atividade enzimática
entre o 1° e o 3° dia, esta atividade permanece constante no 4° e no 5° dia e apresenta uma
drástica redução no 6° dia (Figura 13 B).
40
A
Pepstatina
Pepstatina
Pepstatina
Pepstatina
(a)
PMSF
PMSF
(b)
PMSF
PMSF
Phenantrolina
1-10 Phe
1-10 Phe
Phenantrolina
MDL28170
MDL28170
MDL28170
MDL28170
E-64
EGTA
E-64 ++EGTA
E-64+EGTA
E-64 + EGTA
EGTA
EGTA
EGTA
EGTA
E-64
E-64
E-64
E-64
Cálcio
Cálcio
Cálcio
Cálcio
Controle
Controle
Controle
Controle
0
1000
2000
3000
4000
5000
0
UAF
1000
2000
3000
4000
5000
UAF
Pepstatina
Pepstatina
Pepstatina
Pepstatina
PMSF
PMSF
(c)
Phenantrolina
1-10 Phe
(d)
PMSF
PMSF
Phenantrolina
1-10 Phe
MDL28170
MDL28170
MDL28170
MDL28170
E-64+EGTA
E-64 + EGTA
E-64+EGTA
E-64 + EGTA
EGTA
EGTA
EGTA
EGTA
E-64
E-64
E-64
E-64
Cálcio
Cálcio
Cálcio
Cálcio
Controle
Controle
Controle
Controle
0
1000
2000
3000
4000
5000
0
1000
UAF
Pepstatina
Pepstatina
3000
4000
5000
UAF
Pepstatina
(e)
PMSF
PMSF
2000
Phenantrolina
1-10 Phe
(f)
Pepstatina
PMSF
PMSF
Phenantrolina
1-10 Phe
MDL28170
MDL28170
MDL28170
MDL28170
E-64 + EGTA
E-64+EGTA
E-64+EGTA
E-64 + EGTA
EGTA
EGTA
EGTA
EGTA
E-64
E-64
E-64
E-64
Cálcio
Cálcio
Cálcio
Cálcio
Controle
Controle
Controle
Controle
0
1000
2000
3000
4000
5000
UAF
Pepstatina
Pepstatina
Phenantrolina
1-10 Phe
MDL28170
MDL28170
E-64+EGTA
E-64 + EGTA
EGTA
EGTA
E-64
E-64
Cálcio
Cálcio
Controle
Controle
0
1000
2000
3000
UAF
1000
2000
3000
UAF
(g)
PMSF
PMSF
0
4000
5000
4000
5000
41
B
Cinética de atividade
proteolítica
5000
*
UAF
4000
3000
*
2000
1000
*
*
0
Pro
1°
2°
3°
4°
5°
6°
Dias de Diferenciação
Figura 13. Perfil comparativo da atividade proteolítica de extratos celulares obtidos a partir de formas
em processo de diferenciação (1° ao 6° dia) contra o substrato fluorogênico específico para
calpaínas.(A) Extratos solúveis obtidos a partir de formas em processo de diferenciação (1° ao 6° dia) foram
avaliados quanto à atividade enzimática por meio de substrato fluorogênico para calpaínas. A atividade
proteolítica dos extratos obtidos a partir de células em diferenciação foi comparada a atividade de
promastigotas. (a) Promastigotas; (b) 1°dia; (c) 2° dia; (d) 3° dia; (e) 4° dia; (f) 5°dia. E (g) 6° Dia. (B)
Comparação entre as unidades arbitrárias de fluorescência (UAF). Os experimentos foram realizados três
vezes em triplicata. Os resultados foram considerados significativos quando P< 0,05 (*).
42
5. DISCUSSÃO
Considerando a detecção de moléculas similares a calpaínas em formas
promastigotas de L. amazonensis pelo nosso grupo (D’AVILA-LEVY et al., 2006), foi
investigada a presença destas moléculas em formas amastigotas, consideradas clinicamente
relevantes. Para este estudo foram testados protocolos de diferenciação utilizando a cepa
Josefa (D’AVILA-LEVY et al., 2006). No entanto, não foram obtidos resultados
significativos, havendo a necessidade, portanto, de mudarmos de cepa. A cepa selecionada
para os ensaios de diferenciação do presente trabalho foi a cepa PH8, através da qual foi
estabelecido um protocolo de diferenciação adequado para a obtenção das formas
amastigotas axênicas. Este protocolo foi baseado na acidificação do meio (pH 5,5),
diminuição da concentração de soro (2,5%) e aumento da temperatura (32°C) (adaptado de
MORAIS-TEIXEIRA et al., 2008). A análise do tamanho e granulosidade das células foi
verificada através de citometria de fluxo e foi demonstrado uma diminuição no tamanho
das células. A presença de alterações morfológicas foi demonstrada através de microscopia
óptica, e foi verificado que, durante a diferenciação, os promastigotas foram transformados
em células ovóides ou arredondadas e desprovidas de flagelo, características de formas
amastigotas (ALVES et al, 2005). Além do tamanho e morfologia, o processo de
diferenciação foi seguido pela análise da expressão de epítopos reconhecidos pelo
anticorpo monoclonal estágio-específico, 3A1-La, que reconhece promastigotas de L.
amazonensis (CHAVES et al., 2003; PINTO-DA-SILVA et al., 2005). Os resultados
demonstraram que as formas promastigotas apresentaram uma maior expressão de epítopos
reconhecidos pelo anticorpo 3A1-La do que as formas amastigotas diferenciadas. ALVES
e colaboradores (2005) demonstraram, através de “imunobloting”, o reconhecimento de
uma banda de 45 kDa pelo anticorpo 3A1-La a partir de lisados de parasitos submetidos ao
processo de diferenciação por diferentes intervalos de tempo (1-72 h). Os autores atribuem
o fato destas formas em diferenciação expressarem moléculas reconhecidas pelo anticorpo
3A1-La devido ao período analisado corresponder à fase inicial do processo de
transformação. No entanto, a análise densitométrica da banda observada em formas
amastigotas obtidas após 72 h de diferenciação representaram apenas 8% da banda que
representa os promastigotas. A partir destes dados, foi sugerido que as formas obtidas
através do processo de diferenciação previamente estabelecido eram amastigotas.
Tem sido reportado que o processo de diferenciação dos parasitos é seguido pela
síntese de peptidases e metabolismo de aminoácidos (COOMBS & MOTTRAM, 1997).
43
ALVES e colaboradores (2005) demonstraram que alterações na temperatura e no pH
ativam um “turnover” de proteínas, que são degradadas ao longo do processo de
diferenciação do parasito, como detectado pela diminuição de proteínas radiomarcadas, as
quais alcançaram 85% após 48 h nas condições que induzem a diferenciação.
Similarmente, diferentes condições de estresse induzem um alto “turnover” de proteínas,
como observado para promastigotas de L. tropica, bem como para células de mamíferos e
células bacterianas (GOLDERG & DICE, 1974; SIMON & MUKKADA, 1983). Nossos
resultados demonstraram diferenças na expressão de moléculas tipo calpaínas em formas
promastigotas e formas amastigotas, além da modulação destas enzimas ao longo do
processo de diferenciação. Móleculas tipo calpaínas foram moduladas negativamente ao
longo do processo de diferenciação e em formas amastigotas. A atividade enzimática
contra um substrato fluorogênico específico para calpaínas foi analisada e os resultados
demonstraram o aumento e posterior diminuição da atividade enzimática ao longo do
processo de diferenciação.
O envolvimento de peptidases durante a transformação morfológica de parasitos tem
sido estabelecido para nematódeos (RICHER et al., 1993) e T. cruzi (HARTH et al., 1993;
MEIRELLES et al., 1992). Estudos demonstraram que a atividade de peptidases são
afetadas pelo processo de diferenciação, como observado através da detecção de atividade
enzimática usando substrato cromogênico e inibidores específicos. A predominância de
atividade de serina-, aspártico- e metalopeptidases foi observada em promastigotas e nos
estágios iniciais de diferenciação, sendo a atividade regulada negativamente em
amastigotas axênicos.
Concomitantemente, observou-se um aumento na atividade de cisteína-peptidases
em formas em diferenciação (ALVES et al., 2005). No entanto, diferentes estudos têm
revelado que a regulação de cisteína-peptidases parece ocorrer devido à degradação ou
processamento específico de proteínas, para a adaptação fisiológica, a sobrevivência e o
crescimento do parasito. Desta forma, as diferenças apresentadas na expressão de
moléculas com similaridade a calpaínas e a modulação da atividade proteolítica podem
ocorrer devido às mudanças na temperatura que ocorrem quando os promastigotas deixam
o inseto vetor e são inoculados no hospedeiro vertebrado (TEICHERT et al., 1989; UEDANAKAMURA et al., 2002; ALVES et al., 2005).
De maneira os resultados apresentados nos permitem inferir possíveis diferenças
existentes na expressão e função de proteínas da família das calpaínas nas formas
evolutivas encontradas no hospedeiro invertebrado e vertebrado do ciclo de vida de
44
Leishmania spp. Estes estudos são capazes de auxiliar na análise das funções gerais destas
moléculas, podendo fornecer novos conhecimentos sobre esta família de proteínas nos
tripanossomatídeos.
6. CONCLUSÃO
Os ensaios de cinética de diferenciação, citometria de fluxo e microscopia óptica
demonstraram que as células diferenciadas a partir do protocolo determinado compartilham
características morfológicas com formas amastigotas de L. amazonensis.
Através da utilização do anticorpo 3A1-La, reativo contra moléculas específicas de
promastigotas, foi demonstrado que as células obtidas após o processo de diferenciação
não compartilhavam epítopos com esta forma evolutiva. Além disso, a expressão de
moléculas capazes de serem reconhecidas por este anticorpo diminui durante a
diferenciação, reforçando que as células diferenciadas são formas amastigotas de L.
amazonenis
A expressão de moléculas com similaridade a calpaínas diminuiu ao longo do
processo de diferenciação, bem como a atividade proteolítica utilizando substrato
fluorogênico específico para calpaínas;
Através dos dados obtidos pode-se concluir que os resultados contribuem na adição
de novos conhecimentos sobre a expressão de moléculas similares às calpaínas em
Leishmania, auxiliando na detecção destas peptidases, o que poderá ajudar na
determinação das funções destas moléculas nos parasitos e na busca de novas drogas, uma
vez já confirmado que as peptidases são bons alvos terapêuticos.
45
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