PapilloCheck® Instruções de Utilização - Greiner Bio-One
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4° 8° IVD Fabricado na Áustria HPV DNA-Chip PapilloCheck® Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience Revisão: BQ-013-08 Maio 2015 GLOSSÁRIO DE SÍMBOLOS en Store in the dark Use by Consult instructions For Use Catalog Number Manufacturer in Vitro Dianostic Medical Device Temperature limitation Contents sufficient for <n> tests D N A - Cimportant hip irritant H P VBatch code Note de im Dunkeln lagern Mindestens haltbar bis Vor Gebrauch anweisung lesen Katalognummer Hersteller in-VitroDiagnostika Medizinprodukt Temperaturbegrenzung inhalt ausreichend für <n> Tests Reizend Chargenbezeichnung Wichtiger Hinweis fr À stocker à l‘abri de la lumière Date limite de conservation jusqu’au lire les instructions avant utilisation Numéro de référence Fabricant Produit médical de diagnostic in-vitro limite de température Contenu suffisant pour <n> tests irritant No de lot Note importante es Conservar en un lugar oscuro a utilizar preferiblemente antes de antes de usar, lea las instrucciones Número de catálogo Fabricante Producto medicinal de diagnóstico in vitro limitación de temperatura Contenido suficiente para <n> ensayos irritante Código de lote Nota importante it Conservare al buio Da utilizzare entro e non oltre leggere le istruzioni prima dell’uso Numero catalogo Produttore Dispositivo medicodiagnostico in-vitro limitazione temperatura Contenuto sufficiente per test <n> irritante Codice del lotto Nota importante pt Conservar num local escuro a utilizar de preferência antes de antes de usar, leia as instruções Número de catálogo Fabricante Dispositivo médico de diagnóstico in vitro limitação de temperatura Conteúdo suficiente para <n> ensaios irritante Código do lote aviso importante nl Donker bewaren Tenminste houdbaar tot Gebruiksaanwijzing lezen Catalogusnummer PapilloCheck Fabrikant in vitro diagnostisch medisch product Temperatuurbeperking Voldoende inhoud voor <n> tests irriterend lot nummer Belangrijke opmerking da Instruções de Utilização anvendes senest Læs brugsanvisningen Katalognummer Producent in vitro meskdicin doagnoseapparat Temperaturbegraensær indeholder nok til <n> test lokalirriterende lotnummer Vigtig henvisning sv Förvaras mörkt. Sista förbrukningsdag läs bruksanvisningen före användning Katalognummer Tillverkare in vitromedicinsk doagnostisk apparatur Temperatur-begränsning innehållet räcker till <n> tester irriterande lot nummer Viktigt meddelande pl Przechowywa ć w ciemności Termin zydatności Przed Numer użyciem kataloprzeczytać gowy para diagnóstico instrukcję Producent no el DiagOgraniZawartość drażniący Kod partii Ważne nostyka czenie wystarcza in vitro temperana <n> para a genotipagem Produkt turydos tipos testówdo vírus do papiloma 35, 39, 40, 42,yw43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, Equipamento humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, Oppbevatil les cervicais katalog73, 82 emholdbar amostras res mørkt REF 465 060 Xn ® Opbevares mørkt 4° 8° IVD Fabricado na Áustria ! bruksanvisning før bruk nummer produsent Para utilização inΠαραγωγός vitro in vitro Αποθηκεύεται το λιγότερο em πρινdiagnóstico την Αριθμός στα σκοτεινά διατηρείται χρήση Καταλόγου διαγνωστικά apenas por pessoal de laboratório profissional διαβάστε τις ιατρικά οδηγίες tr in vitro-diagnostisk medisinsk utstyr Karanlık yerde saklayınız Son kullanma tarihi: Kullanma- Katalog Üretici dan önce numarası firma talimatı Greinerokuyun Bio-One Gmbh προϊόντα in vitro diagnostik tıbbi tanı ürünü temperaturbegrensning innhold tilstrekkelig for <n> tester irriterende περιoριoμός θερμοκραο ίας Περιεχόμενο αροκετό για <n> τεοτ ερεθιστικό Sıcaklık sınırlaması İçeriği <n> test için yeterlidir Tahriş edici Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 batch nr. Viktig merknad Revisão: BQ-013-06 κωδικός Σημαντική παρτίδας υπόδειξη Abril 2011 Parti kodu Önemli Not 2 ÍNDICE 1. CONTEÚDO DO EQUIPAMENTO ................................................................................. 5 H P V D N A - C h i p6 2. CONSUMÍVEIS, EQUIPAMENTO E MATERIAL NECESSÁRIO .................................. 3. ENVIO E CONSERVAÇÃO ............................................................................................ 8 4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA .................................................................................. 8 5. ELIMINAÇÃO DE RESÍDUOS ....................................................................................... 9 6. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 10 6.1 Utilização prevista.......................................................................................................................... 10 6.2 Tipos de VPh detectáveis com o PapilloCheck® ......................................................................... 10 6.3 Princípio do ensaio ........................................................................................................................ 11 4° 8° IVD Fabricado na Áustria 6.4 Desenho da microplaca PapilloCheck® ........................................................................................ 13 6.4.1 Disposição da microplaca PapilloCheck®............................................................................ 13 6.4.2 Controlos na microplaca ...................................................................................................... 14 7. INSTRUÇÕES PARA O FLUXO DE TRABALhO DO PaPillOChECk®................... 15 7.1 Instruções gerais ........................................................................................................................... 15 7.2 Separação de salas ........................................................................................................................ 15 7.3 Avisos e precauções...................................................................................................................... 16 ® 7.3.1 Prevenção de contaminação ............................................................................................... 16 7.3.2 instruções de manuseamento de microplacas para aDN .................................................... 16 7.3.3 Precauções gerais ............................................................................................................... 16 7.3.4 Trabalhar em segurança ...................................................................................................... 17 PapilloCheck Instruções de Utilização 8. PROCEDIMENTO PAPILLOChECk®.......................................................................... 18 8.1 Colheita de amostras e extracção de ADN .................................................................................. 18 8.1.1 Colheita de amostras ........................................................................................................... 18 8.1.2 Extracção de aDN................................................................................................................ 20 Xn 8.2 Reacção em cadeia da polimerase (PCR) .................................................................................... 21 8.2.1 Preparação do ciclador térmico ........................................................................................... 21 Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma 8.2.2 6, Tratamento da31, Uracilo-N-Glicosilase ........................................................................ 22 humano 11, 16, 18, 33, 35, 39, 40, 42,(UNG) 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, reacção de PCR .......................................................................................... 23 73,8.2.3 82 emPreparação amostras da cervicais 8.3 hibridação e lavagem .................................................................................................................... 25 REF 465 060 8.3.1 Preparação e disposição ..................................................................................................... 25 Revisão: BQ-013-06 8.3.2 Hibridação 27 Para utilização em ............................................................................................................................ diagnóstico in vitro Abril 8.3.3 por lavagem e secagem ............................................................................................................ 29 2011 apenas pessoal de laboratório profissional 8.4 Varrimento e avaliação da microplaca PapilloCheck® ................................................................. 31 Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 3 9. RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS................................................................................. 32 10. ASSISTÊNCIA TÉCNICA............................................................................................. 33 11. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENhO DO PaPillOChECk® ............................. 34 HPV DNA-Chip 11.1 Desempenho analítico do PapilloCheck® .................................................................................... 34 11.1.1 Sensibilidade analítica ......................................................................................................... 34 11.1.2 Especificidade analítica – tipos de VPH .............................................................................. 35 11.1.3 Especificidade analítica – Organismos Não-VPH ................................................................ 35 11.2 Repetibilidade................................................................................................................................. 36 11.3 Reprodutibilidade........................................................................................................................... 37 11.4 Robustez ......................................................................................................................................... 38 11.5 Desempenho clínico do PapilloCheck® ....................................................................................... 39 12. PROTOCOLO CURTO PAPILLOChECk® .................................................................. 41 12.1 Sala 2: PCR - Preparação da mistura de reacção ....................................................................... 41 12.2 Sala 2: PCR - Adição do modelo de ADN / Reacção da PCR ..................................................... 42 12.3 Sala 3: hibridação - Preparação / Reacção de hibridação ......................................................... 43 4° 8° IVD Fabricado na Áustria 12.4 Sala 3: Lavagem e Secagem / Varrimento e avaliação ............................................................... 44 PapilloCheck® Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 4 1. CONTEÚDO DO EQUIPAMENTO 1 2 4° 8° IVD Fabricado na Áustria 3 Equipamento de ensaio PapilloCheck®1 Conteúdo Quantidade PCR MasterMix 5 x PapilloCheck® PCR MasterMix2 5 x 300 µl Caixa de lâminas, 5 x 12 arrays 1 x PapilloCheck® Caixa de lâminas com 5 microplacas3 PapilloCheck® 5 x 12 arrays Tampão de Hibridação 2 x PapilloCheck® Tampão de Hibridação 2 x 1000 µl TaMP a conc. 2 x PapilloCheck® Tampão a concentrado 2 x 40 ml TaMP B conc. 1 x PapilloCheck® Tampão B concentrado 1 x 15 ml HPV DNA-Chip Um equipamento de ensaio PapilloCheck® é suficiente para a análise de 60 amostras. Contém todos os componentes necessários para PCR excepto para a Taq Polimerase de aDN e a Uracilo-N-Glicosilase. Uma microplaca PapilloCheck® contém 12 microarrays PapilloCheck®. PapilloCheck® Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 5 2. CONSUMÍVEIS, EQUIPAMENTO E MATERIAL NECESSÁRIO Recomenda-se a utilização de PapilloCheck® em combinação com os consumíveis, equipamento e material indicados e apenas por pessoal profissional. Consumíveis Cat. Greiner Bio-One N.º Quantidade HPV DNA-Chip Equipamento de ensaio PapilloCheck® 465 060 Equipamento de ensaio para 60 reacções Equipamento de Extracção de aDN oCheck® / Preparação com Uma Coluna 515 040 Equipamento de ensaio para 50 preparações 765 288 774 288 772 288 739 288 750 288 96/960 96/960 96/960 96/960 60/600 Tubo de reacção de 1,5 ml Tubo de reacção de 0,2 ml2 8 x tiras de 0,2 ml para PCR Tiras com tampa para 8 x tiras de 0,2 ml para PCR 616 201 683 201 673 210 373 270 500/4000 500/1000 125/1250 125/1250 Tubo de polipropileno de 50 ml3 210 261 25/450 607 180 ou 607 160 760 180 ou 760 160 786 180 ou 768 160 1/200 1/200 1/200 Pontas com filtro sem DNase para micropipetas, esterilizadas1 Pontas com filtro de 0,5-10 µl Pontas com filtro de 0,5-20 µl Pontas com filtro de 10-100 µl Pontas com filtro de 10-200 µl Pontas com filtro de 100-1000 µl IVD Fabricado na Áustria Tubos de reacção sem DNase Pipetas de plástico para pipetador PapilloCheck® 4° 8° Pipeta de 10 ml Pipeta de 25 ml Pipeta de 50 ml 1 2 3 Instruções de Utilização alguns dos tamanhos de pontas mencionados são opcionais dependendo das micropipetas disponíveis. Em princípio, recomenda-se a utilização de tiras de 8 tubos para PCR. Os tubos de reacção simples (0,2 ml) são opcionais se as tiras não estiverem disponíveis. apenas necessário se não estiver disponível uma centrifugadora de lâminas. Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 6 Equipamento Cat. Greiner Bio-One N.º Quantidade CheckScannerTM 862 070 1 CheckReportTM Software Basic 862 080 1 CheckReportTM Software PapilloCheck® plugin 862 081 1 Câmara de Hibridação oCheck® com suporte de lâminas 447 070 1 Pega para suporte de lâminas 447 001 1 Caixa de lavagem oCheck®4 447 020 1 HPV DNA-Chip Enzimas necessárias • Taq Polimerase: 5 U/µl da Polimerase do aDN HotStarTaq® (Qiagen; 203203, 203205, 203207, 203209) • Uracilo-N-Glicosilase: 1 U/µl da Uracilo-aDN Glicosilase (Fermentas; #EN0361, #EN0362) Consumíveis adicionais necessários • Água de grau PCR • Água destilada ou desionizada • luvas descartáveis Equipamento adicional necessário IVD Fabricado na Áustria • Microcentrifugadora para tubos de reacção de 1,5 e 2 ml • Centrifugadora para tubos de polipropileno de 50 ml (por ex. BeckmanCoulter; Centrifugadora allegra X-22; Rotor de Ângulo Fixo C0650) ou centrifugadora de lâminas (por ex. labnet: Slide Spinner; VWR international: Galaxy Miniarray Centrifuge) • Microcentrifugadora para tubos de reacção simples de 0,2 ml ou tiras de 8 tubos para PCR (por ex. labnet: Spectrafuge Mini Centrifuge) • Ciclador térmico para PCR: Geneamp® PCR system 9700 (applied Biosystems) Ciclador Térmico Veriti™ de 96 Poços (applied Biosystems) ® peqSTaR 96X Universal (PEQlaB Biotechnology GmbH) • Banho-maria (50 °C) • Micropipetas (diferentes gamas de 1 a 1000 µl) • Multipipeta de 8 canais (gama: 5 - 50 µl), por ex. Brand Transferpette®-8 (Brand) • Pipetador para pipetas de vidro e de plástico • agitador vortex • Racks para diferentes tubos de reacção PapilloCheck 4° 8° Instruções de Utilização Material adicional necessário • Computador (relativamente aos requisitos do sistema, consulte as instruções de Utilização do CheckSannerTM e CheckReportTM Software) 4 5 Para o processo de lavagem de PapilloCheck® são necessárias três caixas de lavagem oCheck®. apenas necessário em combinação com Cat. N.º 515 050. Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 7 3. ENVIO E CONSERVAÇÃO O envio do equipamento de ensaio PapilloCheck® é feito à temperatura ambiente. No entanto, o equipamento tem de ser conservado imediatamente após a recepção a 4-8 °C e deve ser protegido da luz. Sendo conservado correctamente, o equipamento de ensaio PapilloCheck® e os seus componentes podem utilizar-se até à data de validade indicada. além disso, nestas condições, a duração não diverge HPV DNA-Chip do prazo de validade após a primeira abertura do equipamento e dos seus componentes. 4. INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA O equipamento de ensaio PapilloCheck® destina-se apenas a utilização no laboratório, não para utilização como medicamento, em casa, ou outras finalidades. Use sempre uma bata de laboratório adequada, luvas descartáveis e óculos de protecção e cumpra as instruções de segurança fornecidas nesta secção. 4° 8° IVD Fabricado na Áustria Os componentes seguintes do equipamento de ensaio PapilloCheck® contêm substâncias nocivas e perigosas. Componente do kit Conteúdo perigoso (Quantidade) Classificação em conformidade com o regulamento (CE) N.º 1272/2008 Tampão de hibridação PapilloCheck® Tiocianato de guanidina (20-60%) toxicidade aguda - oral (categoria 4) N.º CaS 593-84-0 toxicidade aguda - inalação (categoria 4) toxicidade aquática cróni® 3) ca (categoria PapilloCheck corrosividade cutânea (categoria 1c) Pictograma GHS e palavra-sinal PERIGO Advertências de perigo e recomendações de prudência H302 Nocivo por ingestão H332 Nocivo se inalado H314 Provoca queimaduras na pele e lesões oculares graves H412 Nocivo para os organismos aquáticos com efeitos duradouros. P273 Evitar a libertação para o ambiente P280 Usar luvas de proteção/vestuário de proteção/proteção ocular/proteção facial Instruções de Utilização P305+P351+ P338 SE ENTRaR EM CONTaCTO COM OS OlHOS: lavar cuidadosamente com água durante vários minutos. Retire as lentes de contacto, se as tiver. Continue a lavar. Contacte um CENTRO DE iNFORMaÇÃO aNTiVENENOS ou um médico Xn informações de perigo suplementares (EU): Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus doácidos papiloma Em contacto com liberta EUH032 muito tóxicos humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51,gases 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, Tampão irritação H315 73,de82 emDodecil amostras cervicais hibridação cutânea sulfato ® PapilloCheck (categoria 2) de sódio H318 REF 465 060 (<20%) PERIGO lesões oculares P280 Para utilização in vitro graves CaS N.ºem diagnóstico (categoria 1) 151-21-3 apenas por pessoal de laboratório profissional P305+P351+ P338 Provoca irritação cutânea 70, Provoca lesões oculares graves Usar luvas de proteção/proteção Revisão: BQ-013-06 ocular/proteção facial Abril 2011 SE ENTRaR EM CONTaCTO COM OS OlHOS: lavar cuidadosamente com água durante vários minutos. Retire as lentes de contacto, se as tiver. Continue a lavar. a versão actual daGreiner Ficha de DadosGmbh de Segurança para este produto pode ser descarregada a partir Bio-One Maybachstr. 2 • 72636www.gbo.com/bioscience/biochips_download Frickenhausen • alemanha do sítio da internet Greiner Bio-One: Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 8 5. ELIMINAÇÃO DE RESÍDUOS 4° 8° IVD Fabricado na Áustria após a lavagem e a secagem da microplaca PapilloCheck®, as soluções de lavagem i, ii e iii podem ser eliminadas sem quaisquer precauções especiais. Elimine a microplaca PapilloCheck® utilizada, os componentes não utilizados do equipamento e a mistura de hibridação não utilizada com os resíduos químicos do laboratório. Cumpra todos os regulamentos nacionais, estatais e HPV DNA-Chip locais relativos à eliminação. PapilloCheck® Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 9 6. INTRODUÇÃO a infecção persistente com um vírus do papiloma humano cancerígeno (VPH) verifica-se virtualmente em todos os casos de cancro cervical – o segundo cancro mais comum nas mulheres a nível mundial.1 até à data, identificaram-se mais de 100 tipos de VPH, dos quais cerca de 40 tipos são transmitidos sexualmente e infectam a mucosa genital. Os tipos de VPH cervical estão classificados HPV DNA-Chip como um grupo de alto risco (VPH de alto risco, VPHar) e de baixo risco (VPH de baixo risco, VPHbr). ao passo que os tipos de VPH de alto risco estão associados a um aumento do risco de desenvolver cancro cervical, os tipos de VPH de baixo risco causam sobretudo verrugas genitais benignas.2 Contudo, mesmo dentro do grupo de alto risco, o risco relativo para o desenvolvimento de cancro ou de lesões intraepiteliais cervicais (CiN) depende do tipo.3 Cerca de 70 % de todos os casos de cancro cervical está associado a uma infecção persistente com VPH 16 ou 18. Os tipos de baixo risco mais prevalecente são VPH 6 e 11. Com base na ligação etiológica quase absoluta entre o VPH cancerígeno e o cancro cervical, o teste ao VPHbr está agora a ser considerado para o rastreio primário do cancro cervical.4 6.1 Utilização prevista O PapilloCheck®cumpre os requisitos da Directiva 98/79/CE, relativa aos dispositivos médicos para diagnóstico in vitro, e, portanto, exibe a marca CE de conformidade. Qualquer resultado de diagnóstico obtido, utilizando o PapilloCheck® deve ser interpretado em conjunto com outras descobertas clínicas ou laboratoriais. PapilloCheck® 6.2 4° 8° IVD Fabricado na Áustria O PapilloCheck® é um equipamento para diagnóstico e destina-se a ser utilizado para a detecção qualitativa e a genotipagem de 24 tipos do vírus do papiloma humano nas preparações de aDN provenientes de esfregaços cervicais humanos. O equipamento destina-se a ser utilizado apenas por pessoal habilitado. Tipos de VPh detectáveis com o PapilloCheck® Instruções de Utilização O PapilloCheck® permite a identificação de 18 tipos de vírus do papiloma humano (VPH) de alto e 6 de baixo risco (Tabela 1). risco Tabela 1: Tipos de VPh detectáveis com o PapilloCheck® VPh 16 VPh 45 VPh 59 VPh 6 VPh 18 VPh 51 VPh 66 VPh 11 VPh 56 VPh 73 VPh 43 Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma VPh 31 VPh18, 52 31, 33, 35, VPh 40 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, humano 6, 11, 16, 39,6840, 42, 43, VPh 44/55, 73, 33 82 em amostras VPh VPh 53cervicais VPh 70 VPh 42 REF35465 VPh 060 Xn VPh 39utilizaçãoVPh 82 Para em 58 diagnósticoVPh in vitro VPh 44 / VPh 55* apenas por pessoal de laboratório profissional * O PapilloCheck® não permite a diferenciação entre o VPH 44 e o VPH 55. 1 2 3 4 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 Walboomers, J. et al (1999). Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol. 189(1):12-9. Burd EM. Human papillomavirus and cervical cancer. Clin Microbiol Rev. 2003;16:1–17. Bosch F.X. et al. (2008). Epidemiology and natural history of human papillomavirus infections and type-specific Greiner Bio-One Gmbh implications in cervical neoplasia. Vaccine. 26 Suppl 10:K1-16. Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Meijer, C.J. et al. (2009). Guidelines for human papillomavirus DNa test requirements for primary cervical cancer +49older. (0) 7022 +49 (0) 7022 948-514 screening in womenTelefone: 30 years and int J 948-0 Cancer.• Fax 124(3):516-20. [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 10 6.3 Princípio do ensaio O PapilloCheck® é um equipamento de ensaio baseado em microarray para a detecção e genotipagem de um fragmento do gene E1 do genoma vírus do papiloma humano (VPH). O procedimento de ensaio é resumido na Figura 1. HPV DNA-Chip de esfregaço antes da análise PapilloCheck®, o aDN tem de ser extraído de uma amostra cervical. a colheita de amostras e a extracção de aDN não fazem parte do equipamento de ensaio PapilloCheck®. Os produtos dedicados para a colheita de amostra (PapilloCheck® Collection Kit) e a Extracção de aDN (Equipamento de Extracção de aDN oCheck®) também estão disponíveis da Greiner Bio-One e têm de ser adquiridos em separado (consulte as informações sobre encomendas no Capítulo 2). 4° 8° IVD Fabricado na Áustria após a extracção do aDN genómico viral e humano de uma amostra cervical, um fragmento 350 bp do gene viral E1 é amplificado pela reacção em cadeia da polimerase (PCR) na presença de um conjunto de iniciadores específicos do VPH. Na mesma reacção, um fragmento do gene humano de cópia simples aDaT1 (adenosina deaminase 1 específica de taRN humano) é amplificado para vigiar a presença de material de amostra humano na amostra cervical (controlo da amostra) e um modelo de controlo interno presente no PapilloCheck® PCR MasterMix é amplificado para vigiar o desempenho da PCR (controlo da PCR). além disso, o PapilloCheck® PCR MasterMix contém dUTP. assim, a potencial contaminação cruzada de reacções de PCR anteriores pode ser eliminada através da utilização do tratamento com Uracilo-N-Glicosilase (UNG) (consulte o capítulo 8.2.2). Os produtos para PCR são então hibridados para sondas específicas de aDN e controlos na microplaca associados à superfície da microplaca PapilloCheck®. Cada microplaca contém 12 microarrays de aDN, que permitem a análise simultânea de 12 amostras cervicais. Durante a hibridação, o aDN ligado é etiquetado fluorescentemente e o aDN não ligado é removido nos passos de lavagem subsequentes. Controla-se a eficácia da hibridação (controlo da hibridação). PapilloCheck® Por último, a microplaca PapilloCheck® é varrida, analisada e avaliada automaticamente utilizando o CheckScannerTM e o CheckReportTM Software, respectivamente (consulte as informações sobre encomenda no Capítulo 2). O CheckScannerTM é um scanner a laser bicolor (comprimentos de onda de excitação de 532 nm e 635 nm), que permite a detecção do sinal fluorescente gerado pela presença dos produtos de amplificação específicos do VPH bem como dos controlos (consulte o capítulo 6.4.2). O CheckReportTM Software permite a visualização, análise e avaliação dos resultados e mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos tipos de VPH detectados como dos controlos num relatório detalhado. Instruções de Utilização O relatório indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de VPH detectáveis e os controlos abrangentes na microplaca tornam a análise altamente fiável. Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 11 1. Reacção da PCR HPV DNA-Chip 4° 8° IVD Fabricado na Áustria 2. hibridação 3. Lavagem e secagem PapilloCheck® ou Instruções de Utilização 4. Lavagem e secagem Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro ® por de laboratório profissional Figura apenas 1: Processo depessoal ensaio PapilloCheck Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 1. Reacção da PCR: após a extracção de aDN, um fragmento 350 bp do gene viral E1 e os fragmentos de dois objectivos de controlo são amplificados através de PCR. Os produtos de amplificação são então hibridados para sondas de aDN complementares na microplaca. 2. hibridação: cada tipo de VPH é detectado por uma sonda de aDN específica presente em cinco réplicas. Durante a hibridação, introduz-se a etiquetagem fluorescente. 3. Lavagem e secagem: o aDN não ligado é removido nos passos de lavagem subsequentes. ® Greiner Bio-OnePapilloCheck Gmbh é varrida, analisada e avaliada utilizando o CheckScannerTM e o 4. Varrimento e análise: a microplaca Maybachstr. • 72636 Frickenhausen • alemanha É criado2 um relatório que indica claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 CheckReportTM Software. tipos de VPH detectáveis. Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 12 6.4 Desenho da microplaca PapilloCheck® 6.4.1 Disposição da microplaca PapilloCheck® Cada microplaca PapilloCheck® contém 12 microarrays concebidos como poço a1 - B6. Cada microarray PapilloCheck® é composto por 28 sondas diferentes e está rodeado por um rebordo HPV DNA-Chip elevado. Cada sonda é colorida em cinco réplicas. a disposição do microarray PapilloCheck® é ilustrada na Figura 2 e os controlos na-microplaca são explicados no Capítulo 6.4.2. canal vermelho (635 nm) controlo da orientação a) VPH 6 VPH 45 VPH 11 VPH 51 VPH 16 VPH 52 VPH 18 VPH 53 VPH 31 VPH 56 VPH 33 VPH 58 VPH 35 VPH 59 VPH 39 VPH 66 VPH 40 VPH 68 VPH 42 VPH 70 VPH 43 VPH 73 controlo da hibridação controlo da orientação PapilloCheck® canal verde (532 nm) 4° 8° IVD Fabricado na Áustria VPH 44/55 b) Instruções de Utilização c) controlo da PCR VPH 82 controlo da amostra controlo da PCR VPH 6 VPH 45 VPH 11 VPH 51 VPH 16 VPH 52 VPH 18 VPH 53 VPH 31 VPH 56 VPH 33 VPH 58 VPH 35 VPH 59 VPH 39 VPH 66 VPH 40 VPH 68 VPH 42 VPH 70 VPH 43 VPH 73 VPH 44/55 VPH 82 controlo da hibridação controlo da amostra Xn Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, Figura 2: Desenho da microplaca PapilloCheck® 73, 82daem amostras cervicais®. b) e c) imagens exibidas pelo CheckReportTM Software para os dois a) Esquema microplaca PapilloCheck comprimentos de onda de excitação diferentes utilizados para varrimento (b) canal vermelho: 635 nm; c) canal verde: 532 REF 465da060 nm) e esquemas disposição do microarray PapilloCheck®. indicam-se as sondas específicas para o tipo do VPH e os controlos na microplaca. Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 13 6.4.2 Controlos na microplaca O desenho da microplaca de aDN PapilloCheck® inclui controlos abrangentes na microplaca. Vários sistemas de controlo vigiam todos os passos mais importantes tanto do ensaio como do processamento da microplaca, incluindo a qualidade das amostras e a extracção de aDN (controlo da amostra), a qualidade de reacção da PCR (controlo da PCR), a eficácia da hibridação (controlo HPV DNA -Chip da hibridação), bem como a homogeneidade da coloração e a qualidade de impressão (controlo da orientação e controlo da impressão). Para além da presença ou ausência de tipos de VPH, o CheckReport™ Software mostra automaticamente os valores correspondentes tanto dos controlos como dos tipos de VPH detectados num relatório detalhado. Para a leitura dos diferentes controlos, utilizam-se os dois comprimentos de onda de excitação do CheckScanner™. Para o controlo do desempenho do ensaio (controlo da amostra e da PCR), utiliza-se o canal vermelho (comprimento de onda de excitação de 635 nm), enquanto a qualidade da hibridação e da microplaca (controlo da hibridação, da orientação e da impressão) é avaliada no canal verde (comprimento de onda de excitação de 532 nm). 4° 8° IVD Fabricado na Áustria Controlo da amostra O PapilloCheck® vigia a qualidade da amostra e/ou da extracção de aDN amplificando um fragmento do gene humano de cópia simples aDaT1 (adenosina deaminase 1 específica de taRN humano). Se estiver presente aDN humano numa quantidade adequada no aDN extraído da amostra cervical, é gerado um sinal fluorescente nas colorações de controlo da amostra. Se não ocorrer amplificação de aDaT1, ou se for insuficiente, o CheckReport™ Software indica que o controlo da amostra “falhou” e tem de repetir-se a análise devido à quantidade insuficiente de células na amostra cervical e/ou desempenho insuficiente na extracção (consulte o Capítulo 9). Controlo da PCR O PapilloCheck® também vigia a qualidade de reacção da PCR. a amplificação de um modelo ® PCR MasterMix gera um sinal nas colorações de de controlo interno presente no PapilloCheck ® ® controlo da PCR na microplaca PapilloCheck . a qualidade da reacção de amplificação também é automaticamente avaliada pelo CheckReport™ Software. Se o desempenho da PCR se situar abaixo de um limite predefinido, o CheckReport™ Software indica que o controlo da PCR “falhou” e tem de repetir-se a análise (consulte o Capítulo 9). PapilloCheck Instruções de Utilização Se a quantidade de aDN do VPH na amostra for muito elevada, o sinal fluorescente das colorações de controlo da PCR pode ser baixo ou mesmo não estar presente devido à concorrência durante a reacção da PCR. Neste caso, o sinal fluorescente para, pelo menos, uma sonda de aDN específica tem de exceder um limite predefinido para o ensaio ser considerado válido. Xn Controlo da hibridação O PapilloCheck® vigia a eficácia da hibridação através da utilização de uma sonda fluorescente Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma etiquetada no Tampão de Hibridação PapilloCheck®, que hibrida para sequências específicas humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, de aDN na microplaca PapilloCheck®. Uma eficácia de hibridação adequada resulta em sinais 73, 82 em amostras cervicais fluorescentes em cada coloração de array. Os resultados de cinco colorações de controlo da hibridação na microplaca PapilloCheck® também são avaliados pelo CheckReportTM Software. REF 465 060 Revisão: BQ-013-06 Parada utilização emediagnóstico in vitro Controlo orientação da impressão Abril 2011 apenas por pessoal da de orientação laboratóriodaprofi ssional PapilloCheck® geram sinais fluorescentes as colorações de controlo microplaca independentemente da eficácia do processo de hibridação. Estas colorações são utilizadas no CheckReportTM Software como pontos de orientação para uma detecção correcta da coloração, o que é um pré-requisito para a análise correcta dos sinais. Para além disso, a qualidade do processo de impressão é controlada através da presença de um sinal fluorescente em cada coloração da Greiner Bio-One Gmbh microplaca (controlo da impressão). Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 14 7. 7.1 INSTRUÇÕES PARA O FLUXO DE TRABALhO DO PaPillOChECk® Instruções gerais H P molecular V D N A - C hnum ip Quando se implementam as técnicas modernas actualmente utilizadas em biologia laboratório, devem ter-se em conta as instruções seguintes para garantir a máxima segurança do pessoal do laboratório e resultados de elevada qualidade. a execução de técnicas de biologia molecular, como extracção de aDN, amplificação e detecção dos produtos de amplificação, requer pessoal devidamente habilitado. Para além disso, é necessário um fluxo de trabalho limpo e bem estruturado para prevenir resultados errados, tais como os que ocorrem devido à degradação ou contaminação de aDN através dos produtos de amplificação. Para garantir isto, é necessário separar as áreas de extracção, amplificação e detecção conforme descritas no Capítulo 7.2. Cada área deve estar equipada com equipamento, consumíveis, batas e luvas em separado. Nunca transfira batas, luvas ou equipamento de laboratório de uma área para outra. Separação de salas a Figura 3 mostra um exemplo de como um laboratório pode ser separado em três secções distintas. Uma utiliza-se apenas para a extracção de aDN, outra para a preparação e realização de reacções de PCR e a última destina-se a hibridação e análise. Cada sala utiliza-se exclusivamente para a aplicação ou técnica indicada, para evitar a contaminação de amostras. a utilização de codificação de cores pode ser vantajosa para evitar a troca acidental de equipamento e consumíveis entre as áreas. ® PapilloCheck Instruções Sala 1 de Utilização Sala 2 4° 8° IVD Fabricado na Áustria 7.2 Sala 3 Xn Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, Figura 73, 3: Separação de salas cervicais 82 em amostras Sala 1: Todo o processo de extracção de aDN tem de executar-se nesta sala. Sala 2:REF Nesta465 sala,060 prepara-se e divide-se a mistura de reacção para PCR em alíquotas (de preferência sob uma protecção para PCR). a adição das amostras de aDN extraídas na sala 1 tem de efectuar-se num espaço separado dentro da sala 2. Sala 3: Na terceira sala de laboratório, ocorre a reacção de hibridação e realizam-se os passos de lavagem e secagem Revisão: BQ-013-06 Para utilização em diagnóstico in vitro da microplaca. Para além disso, utiliza-se o CheckScannerTM em conjunto com o CheckReportTM Software para a análise Abril 2011 por pessoal ® final doapenas ensaio PapilloCheck . de laboratório profissional ! Não se deve trocar nem equipamento nem consumíveis entre as diferentes salas de laboratório e espaços. Portanto, as duplicações de equipamento e consumíveis são uma necessidade e devem ter sido consideradas ao equipar o laboratório. Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 15 7.3 Avisos e precauções 7.3.1 Prevenção de contaminação • as batas de laboratório têm de ser usadas durante o procedimento e são necessários conjuntos diferentes de batas para cada sala de laboratório. HPV DNA-Chip • as luvas têm de ser usadas durante cada passo da análise e têm de ser mudadas com frequência. especialmente durante a extracção de aDN. • O local de trabalho tem de ser descontaminado com um produto de limpeza apropriado. • Nunca toque no interior da tampa do tubo de reacção. Para evitar contaminação cruzada, abra um tubo de cada vez. • Têm de utilizar-se pontas com filtro adequadas para micropipetas com protecção contra aerossóis (sem DNase, RNase e aDN humano). as pontas das pipetas devem ser sempre mudadas entre transferências de líquidos. 7.3.2 Instruções de manuseamento de microplacas para ADN • as microplacas para aDN devem utilizar-se num ambiente sem poeiras. Deve evitar-se a deposição de poeiras e de outras partículas na superfície das microplacas. • Não toque na zona de hibridação na superfície da microplaca. 4° 8° IVD Fabricado na Áustria • apenas o lado etiquetado da microplaca se destina a hibridação. • Não utilize canetas marcadoras para a identificação de microplacas de aDN, pois causam fluorescência não específica na microplaca. • Os arrays de aDN destinam-se a uma única utilização. as microplacas hibridadas não podem ser reutilizadas. PapilloCheck • Guarde as microplacas não utilizadas ® na caixa original dentro do saco com fecho fornecido com dessecante. 7.3.3 Instruções Precauções gerais de Utilização Xn • Este equipamento destina-se exclusivamente a diagnóstico in vitro e deve ser utilizado apenas por pessoal treinado na prática de laboratório de diagnóstico in vitro. • No momento da chegada, verifique se os componentes do equipamento têm danos. Se um dos componentes estiver danificado (por ex. frascos de tampão), contacte o seu distribuidor local Greiner Bio-One. Não utilize componentes do equipamento danificados, pois a sua utilização pode levar a um fraco desempenho do equipamento. Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma • Não utilize o equipamento de ensaio PapilloCheck® após o prazo de validade. humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, • Não utilize reagentes fora do prazo de validade. 73, 82 em amostras cervicais • Não misture reagentes de diferentes lotes. REF 465 060 • Utilize apenas equipamento/reagentes fornecidos com o equipamento e os recomendados pelo Revisão: BQ-013-06 fabricante. Para utilização em diagnóstico in vitro Abril 2011 apenas por pessoal de laboratório profi ssional • Deve efectuar-se a calibração/manutenção regular das micropipetas, do banho-maria e do bloco de aquecimento. • a pipetagem de quantidades pequenas de líquido na gama do microlitro é um desafio. Portanto, tenha cuidado para pipetar com a maior precisão possível. • Para evitar a contaminação microbiana dos reagentes, tenha cuidado ao retirar as alíquotas dos Greiner Bio-One Gmbh tubos de reagentes. Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022devem 948-0 •efectuar-se Fax +49 (0) 7022 948-514 ambiente (18-25 °C). • Todos os passos da centrifugação à temperatura [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 16 7.3.4 Trabalhar em segurança • Tenha cuidado quando manusear amostras biológicas que contenham materiais humanos potencialmente infecciosos. Para minimizar o risco de infecção de material potencialmente infeccioso, recomenda-se trabalhar em condições de fluxo de ar laminar até a lise das amostras estar concluída. Manuseie e elimine todas as amostras biológicas como se fossem capazes de HPV DNA-Chip transmitir agentes infecciosos. • Nunca pipete soluções com a boca. • Não coma, beba, fume nem aplique produtos cosméticos nas áreas de trabalho. • Evite o contacto directo com as amostras biológicas, bem como salpicar ou pulverizar as amostras. • Use sempre uma bata, luvas e óculos de protecção quando trabalha com amostras humanas. 4° 8° IVD Fabricado na Áustria • lave as mãos cuidadosamente após manusear amostras e reagentes. PapilloCheck® Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 17 8. PROCEDIMENTO P apilloCheck® O capítulo seguinte descreve pormenorizadamente os diferentes passos de trabalho que por último ocasionam a realização de um relatório detalhado, indicando claramente a presença ou ausência de um ou mais dos 24 tipos de VPH detectáveis em cada amostra cervical analisada. A Figura 4 mostra os diferentes passos de trabalho necessários. Também indica o subcapítulo correspondente que descreve o passo do ensaio específico. Os passos de trabalho têm de ser executados pela ordem descrita neste capítulo. Cada passo específico com intervenção é indicado por uma seta azul ➠. ! A colheita de amostras, a extracção de ADN e a análise com o CheckReportTMSoftware não fazem parte do equipamento de ensaio PapilloCheck®. Portanto, a descrição destes passos de trabalho é abreviada neste capítulo. Para informações mais detalhadas, consulte as Instruções de Utilização correspondentes, por exemplo, do PapilloCheck® Collection Kit, do Equipamento de Extracção de ADN oCheck® e do CheckReportTMSoftware. 8.1 Colheita de amostras e extracção de ADN 8.1.1 Colheita de amostras A colheita de amostras não faz parte do equipamento de ensaio PapilloCheck®. O equipamento de ensaio dedicado a amostras cervicais (PapilloCheck® Collection Kit) também está disponível na Greiner Bio-One (consulte as informações sobre encomendas no Capítulo 2). O PapilloCheck® foi validado utilizando o ADN preparado com o Equipamento de Extracção de ADN oCheck® proveniente de esfregaços cervicais humanos colhidos através de um dos sistemas ou meios de colheita seguintes: • PapilloCheck® Collection Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Alemanha) • PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, EUA) • Surepath™ (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) • STMTM (Qiagen, Hilden, Alemanha) • Easyfix (Labonord, Templemars, France) • Cyt-All (Alphapath, Mauguio, France). Para mais informações sobre os meios de transporte adequados ou os sistemas de extracção de ADN, contacte o seu distribuidor local Greiner Bio-One ou consulte o sítio da Internet Greiner Bio-One: www.gbo.com/bioscience/biochips_download 18 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Capítulo 8.1.2 Extracção de ADN Capítulo 8.2 PCR Capítulo 8.3.2 Hibridação Capítulo 8.3.3 Lavagem e secagem ou Capítulo 8.4. Varrimento e avaliação Figura 4: Apresentação dos diferentes passos de trabalho do PapilloCheck® 19 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 8.1.2 Extracção de ADN A extracção de ADN não faz parte do equipamento de ensaio PapilloCheck®. Deve realizar-se a extracção de ADN antes da análise PapilloCheck® utilizando o Equipamento de Extracção de ADN oCheck®, também fornecido pela Greiner Bio-One (consulte as informações sobre encomendas no Capítulo 2). Cumpra rigorosamente as Instruções de Utilização quando usar o Equipamento de Extracção de ADN oCheck®. Para a extracção de ADN com o Equipamento de Extracção de ADN oCheck®, devem utilizar-se 250 µl de solução de amostra. As amostras de esfregaços cervicais humanos que são colhidas • com o PapilloCheck® Collection Kit (Greiner Bio-One; Cat. N.º 465 070) • em meio de colheita PreservCyt® (Hologic, Bedford, MA, EUA) podem ser processadas directamente. As amostras cervicais que são colhidas em • meio de colheita SurepathTM (BD, Franklin Lakes, NJ, EUA) têm de ser lavadas antes da utilização: centrifugue 250 µl da amostra durante 5 minutos a 11 000 g e volte a suspender a pellet em 250 µl de água destilada. Posteriormente, podem processar-se os 250 µl com o Equipamento de Extracção de ADN oCheck®. As amostras cervicais que são colhidas em • meio de colheita STMTM (Qiagen, Hilden, Alemanha) têm de ser diluídas: utilize 100 µl da amostra e adicione 150 µl de água destilada. Podem processar-se os 250 µl de amostra diluída com o Equipamento de Extracção de ADN oCheck®. Regra geral, se a amostra do esfregaço cervical parecer ser muito concentrada e já estiver agregada, a amostra tem de ser diluída e homogeneizada antes de se iniciar a extracção de ADN! As amostras de esfregaços cervicais que sejam muito diluídas e não apresentem células visíveis devem ser concentradas para se obter um rendimento mais elevado de células para extracção de ADN: centrifugue até 250 µl da amostra durante 5 minutos a 11 000 g e volte a suspender a pellet em 250 µl de água destilada. Posteriormente, podem processar-se os 250 µl com o Equipamento de Extracção de ADN oCheck®. ! Este passo de concentração só é adequado para amostras de esfregaços cervicais que foram colhidas com o PapilloCheck® Collection Kit, em meio de colheita PreservCyt® ou em meio de colheita SurepathTM. Se se utilizou o meio de colheita STMTM, não é possível uma concentração através de centrifugação. 20 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 8.2 Reacção em cadeia da polimerase (PCR) A PCR é um método muito sensível que pode detectar quantidades extremamente pequenas de ADN. Devem tomar-se precauções especiais para evitar a contaminação da reacção (consulte o Capítulo 7). A Polimerase HotStarTaq® e a Uracilo-N-Glicosilase são necessárias mas não são fornecidas com o equipamento de ensaio PapilloCheck® e têm de ser adquiridas em separado (consulte o Capítulo 2). ! O equipamento de ensaio PapilloCheck® foi validado utilizando Polimerase HotStarTaq® da Qiagen e Uracilo-N-Glicosilase da Fermentas (consulte as informações sobre encomendas no Capítulo 2). A utilização destas enzimas é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido. 8.2.1 Preparação do ciclador térmico O equipamento de ensaio PapilloCheck® foi validado com os cicladores térmicos seguintes: • GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems) • Ciclador Térmico Veriti™ de 96 Poços (Applied Biosystems) • peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH).. ! É imprescindível utilizar um dos cicladores térmicos mencionados acima para se obter o desempenho estabelecido. O programa do ciclador térmico de PCR PapilloCheck® encontra-se resumido na Tabela 2. Tabela 2: Programa do ciclador térmico de PCR PapilloCheck® Tempo Temp. °C N.º de ciclos 20 min 37 °C 1 15 min 95 °C 1 30 s 25 s 45 s 95 °C 55 °C 72 °C 40 30 s 45 s 95 °C 72 °C 15 Pausa 10 °C Para além disso, têm de definir-se os parâmetros de execução seguintes para cada ciclador térmico. Para uma descrição sobre como definir estes parâmetros, consulte as Instruções de Utilização do respectivo ciclador térmico. GeneAmp® PCR system 9700 (Applied Biosystems) Defina o volume de reacção para 26 µl, a velocidade de rampa para “9600” e utilize uma temperatura da tampa de 103 °C. Ciclador Térmico Veriti™ de 96 Poços (Applied Biosystems) Utilize a ferramenta Método de Conversão do Ciclador Térmico Veriti™ de 96 Poços para entrar no programa PCR PapilloCheck® e seleccione “9600 Emulation Mode”. Defina o volume de reacção para 26 µl e a temperatura da tampa para 103 °C. peqSTAR 96X Universal (PEQLAB Biotechnologies GmbH) Utilize o programa PCR pré-programado PapilloCheck® “PapilloCheck.js” fornecido em conjunto com o ciclador térmico. Normalmente o programa pode ser aberto usando o seguinte caminho: local/Scripts/GreinerBioOne/PapilloCheck.js. PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 21 8.2.2 Tratamento da Uracilo-N-Glicosilase (UNG)5 O PapilloCheck® PCR MasterMix contém dUTP que se inclui nos produtos de amplificação durante a PCR PapilloCheck®, tornando os produtos da PCR susceptíveis à degradação pela UNG. A UNG cliva o produto da PCR em locais onde se incluiu um resíduo de desoxiuridilato. Os produtos da PCR clivados não serão amplificados numa reacção posterior. Assim, pode utilizar-se um tratamento da UNG para eliminar a potencial contaminação cruzada de reacções de PCR anteriores.6 ➠➠ Dilua a Uracilo-N-Glicosilase 1:200 em água de grau PCR. Utilize uma diluição fresca de UNG para cada preparação de reacção de PCR PapilloCheck® (consulte o Capítulo 8.2.3). Não volte a utilizar a UNG diluída. ➠➠ Misture a diluição de UNG cuidadosamente com o agitador vortex durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes. A concentração original da Uracilo-N-Glicosilase é 1 U/µl. Portanto, a concentração da diluição é 0,005 U/µl. ! Validou-se o equipamento de ensaio PapilloCheck® utilizando a Uracilo-N-Glicosilase da Fermentas (consulte o Capítulo 2). A utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido. ➠➠ Adicione 1 µl desta diluição a cada reacção de PCR PapilloCheck® (consulte o Capítulo 8.2.3, Tabela 3). Esta quantidade é suficiente para eliminar a contaminação cruzada de PCR. Tenha cuidado para não utilizar uma solução de UNG concentrada mais elevada, pois isso poderia ter efeito adverso sobre o desempenho da PCR, resultando numa sensibilidade reduzida do PapilloCheck®. Regra geral, para o tratamento da UNG, a mistura de reacção de PCR é incubada durante 20 minutos a 37 °C. Posteriormente, a UNG é inactivada por um passo de incubação adicional de 15 minutos a 95 °C. Estes dois passos já estão incluídos na PCR PapilloCheck® e correspondem aos dois primeiros passos do programa do ciclador térmico (consulte a Tabela 2). Durante o segundo passo (15 minutos a 95 °C) ocorre tanto a inactivação da Uracilo-N-Glicosilase como a activação da Polimerase HotStarTaq®. ! O sistema UNG incorporado da PCR PapilloCheck® eliminará apenas a contaminação cruzada com produtos da PCR provenientes de reacções anteriores da PCR. Não se consegue eliminar outra contaminação, por exemplo que ocorra durante a preparação da amostra, extracção de ADN ou adição de modelo de PCR. Portanto, ainda é necessário cumprir as instruções e precauções especiais para evitar a contaminação descrita no Capítulo 7. A aquisição de PapilloCheck® faz-se acompanhada de uma licença limitada com os Números de Patentes Norteamericanas 5 035 996, 5 683 896, 5 945 313, 6 287 823 e 6 518 026, e as patentes estrangeiras correspondentes. 6 Longo, M.C., et al., Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions, Gene, 93, 125-128, 1990. 5 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 22 8.2.3 Preparação da reacção de PCR Com a excepção da Polimerase HotStarTaq® e da Uracilo-N-Glicosilase, o PapilloCheck® PCR MasterMix já contém todos os componentes necessários para executar a reacção de PCR (tampão de PCR, MgCl2, dNTP, iniciadores, modelo de controlo da PCR). ! Validou-se o equipamento de ensaio PapilloCheck® utilizando a Polimerase HotStarTaq® da Qiagen (consulte o Capítulo 2). A utilização desta enzima é obrigatória para se obter o desempenho estabelecido. A preparação da mistura de reacção é executada da melhor forma num ambiente protegido, por exemplo, com uma protecção para PCR, para evitar a contaminação da reacção. ➠➠ Prepare a mistura de reacção (que consiste em PapilloCheck® PCR MasterMix, Polimerase HotStarTaq® e Uracilo-N-Glicosilase) para a quantidade necessária de reacções de PCR, conforme descrito na Tabela 3. Para analisar amostras múltiplas, a mistura de reacção deve ser preparada num lote (na quantidade necessária para todas as análises). Para ajustar atendendo às variações de volume durante a pipetagem, recomenda-se aumentar o número de reacções (n) por 1 por cada microplaca (=n+1), por exemplo, prepare um volume de mistura de reacção para 13 reacções de amplificação, se for necessário testar 12 amostras (consulte a Tabela 3). Utilize sempre um frasco de MasterMix para as reacções de uma microplaca. ! Recomenda-se incluir um controlo negativo para cada lote de PapilloCheck® PCR MasterMix preparado. Como controlo negativo, pode utilizar-se o tampão de eluição de ADN do equipamento de extracção de ADN apropriado ou água de grau PCR. ➠➠ Misture a mistura de reacção cuidadosamente com o agitador vortex durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes. ➠➠ Divida a mistura de reacção em alíquotas através de pipetagem de 21 µl da mistura de reacção para cada reacção de PCR para um tubo de reacção de PCR de 0,2 ml, de parede fina. Efectue a adição do ADN modelo num espaço de trabalho separado do da preparação da mistura de reacção (consulte o Capítulo 7.2). ➠➠ Adicione 5 µl de extracto de ADN a cada reacção de PCR e misture com o agitador vortex durante 2 segundos, e depois reduzindo a rotação, ou através de pipetagem várias vezes. O volume total de uma reacção de PCR é 26 µl. ➠➠ Coloque os tubos de reacção no ciclador térmico e inicie a reacção de PCR utilizando o programa do ciclador térmico descrito no Capítulo 8.2.1 (Tabela 2). ! Após a conclusão da PCR, os produtos de amplificação devem ser utilizados imediatamente para hibridação ou conservados no escuro a -20 °C durante uma semana. 23 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Tabela 3: Preparação da reacção de PCR PapilloCheck® 1 reacção 13 reacções (1 microplaca) 26 reacções (2 microplacas) 39 reacções (3 microplacas) 52 reacções (4 microplacas) PapilloCheck® PCR MasterMix 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl Polimerase HotStarTaq® (5 U/µl) 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl Uracilo-N-Glicosilase (Diluição de 1:200, 0,005 U/µl) 1 µl 13 µl 26 µl 39 µl 52 µl Volume total antes da adição de ADN da amostra 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl Extracto de ADN proveniente da amostra cervical (modelo de ADN) 5 µl Volume total por reacção 26 µl 24 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 8.3 Hibridação e lavagem 8.3.1 Preparação e disposição A hibridação deve ser efectuada à temperatura ambiente (20-25 °C). Inicie os preparativos necessários para a hibridação e os passos de lavagem com pelo menos 30 minutos de antecedência antes de começar o processo de hibridação. ➠➠ Para dissolver os potenciais precipitados na hibridação e nos tampões de lavagem, exponha-os à temperatura ambiente (20-25 °C) durante 30 minutos e misture bem antes de utilizar. Conservar o equipamento de ensaio PapilloCheck® a 4-8 °C pode resultar em precipitação de SDS no Tampão de Hibridação e no Tampão B. Deixe as soluções equilibrarem à temperatura ambiente e depois agite o tubo no agitador vortex ou agite o frasco até qualquer precipitado ficar dissolvido. ➠➠ Prepare a Câmara de Hibridação oCheck®: coloque um toalhete de papel húmido na Câmara de Hibridação e feche a tampa para criar uma atmosfera saturada de humidade. Para evitar a evaporação do pequeno volume de mistura de hibridação utilizada na microplaca, é necessário executar a hibridação numa atmosfera saturada de humidade. Uma Câmara de Hibridação dedicada para a análise PapilloCheck® está disponível da Greiner Bio-One (consulte o Capítulo 2). ➠➠ Incube a quantidade necessária de microplacas PapilloCheck® na Câmara de Hibridação preparada à temperatura ambiente (20-25 °C) durante, pelo menos, 10 minutos. ! O suporte magnético de lâminas da Câmara de Hibridação contém um íman apenas numa das duas extremidades. Se menos de quatro microplacas PapilloCheck® forem hibridadas em paralelo, tenha o cuidado de encher o suporte de lâminas com microplacas PapilloCheck® a partir do lado oposto do íman. Caso contrário, as microplacas PapilloCheck® não ficarão cobertas com líquido durante o processo de lavagem. ➠➠ Prepare as soluções de lavagem I, II e III de acordo com as instruções seguintes. Preparação das soluções de lavagem I, II e III: ➠➠ Prepare a mistura da solução de lavagem para as soluções de lavagem I, II e III adequada ao número de microplacas PapilloCheck® que são analisadas, como ilustrado na Tabela 4. ➠➠ Divida em alíquotas três volumes iguais da mistura da solução de lavagem em três caixas de lavagem separadas oCheck® e identifique-as no rótulo como solução de lavagem I, II e III. Cada caixa de lavagem oCheck® contém uma escala gravada, que indica a quantidade correcta de solução de lavagem necessária para até 4 microplacas. Utilize esta escala para verificar a quantidade de tampão. ➠➠ Pré-aqueça a solução de lavagem II a 50 °C em banho-maria com a temperatura controlada durante, pelo menos, 20 minutos antes de utilizar. Certifique-se de que o nível de enchimento do banho-maria seja igual ao nível de enchimento da solução de lavagem II. 25 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Tabela 4: Preparação da mistura da solução de lavagem Os volumes resumidos nesta tabela são suficientes para os três passos de lavagem (soluções de lavagem I, II e III) para o número indicado de microplacas PapilloCheck®. Número de microplacas PapilloCheck® Componentes 1 2 3 4 Água destilada ou desionizada 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml PapilloCheck® Tampão A 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml PapilloCheck® Tampão B 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml Volume total ! Nunca utilize novamente as soluções de lavagem, pois isto pode originar uma acumulação do produto de lavagem da PCR que possivelmente interfere com os resultados do PapilloCheck®. Utilize soluções de lavagem novas para cada ensaio. A mistura da solução de lavagem preparada pode conservar-se até uma semana à temperatura ambiente. Verifique se ocorreu precipitação de SDS. Caso tenha ocorrido, aqueça a mistura da solução de lavagem até que o precipitado esteja dissolvido e novamente equilibrado à temperatura ambiente. Em seguida, prepare a experiência de hibridação seguinte. 26 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 8.3.2 Hibridação A hibridação deve ser efectuada à temperatura ambiente (20-25 °C). Os principais passos de trabalho para a hibridação dos produtos da PCR da reacção de PCR PapilloCheck® para a microplaca PapilloCheck® são ilustrados na Figura 5. ➠➠ Misture os produtos da PCR antes de utilizar. Centrifugue brevemente. Se os produtos da PCR foram conservados a -20 °C até à hibridação, primeiro descongele os produtos da PCR antes de misturar e, em seguida, continue conforme descrito. ➠➠ Agite o Tampão de Hibridação no agitador vortex antes de utilizar. Centrifugue brevemente. ➠➠ Misture 30 µl do Tampão de Hibridação PapilloCheck® num tubo de reacção fresco de 8 x tira para PCR com 5 µl do produto da PCR quer com o agitador vortex quer através de pipetagem várias vezes. ➠➠ Centrifugue brevemente. ➠➠ Transfira 25 µl da mistura de hibridação para cada poço da microplaca utilizando os seis canais de uma pipeta multicanal. Evite a formação de bolhas! Recomenda-se processar seis amostras em paralelo utilizando uma multipipeta de 8 canais e 8 x tiras para PCR (consulte a Figura 5). Isto aumenta a eficiência de manuseamento, a velocidade, reduzindo, assim, o risco de evaporação. Se for necessário processar mais de uma lâmina de uma vez, é obrigatória a utilização de uma multipipeta para se conseguir um tempo de hibridação correcto. Se possível, hibride todos os 12 poços de uma microplaca. Caso se processem menos de 12 amostras, deixe vazios os poços não utilizados. Os poços não utilizados numa microplaca processada não podem ser utilizados para amostras no futuro. ! Manuseie a microplaca cuidadosamente para evitar derramar a mistura de hibridação. O derrame pode originar contaminação cruzada das amostras e resultados falso positivos. Incube a microplaca durante exactamente 15 minutos à temperatura ambiente (20-25 °C) dentro da Câmara de Hibridação preparada numa atmosfera escura saturada de humidade. Tenha cuidado para não mover a Câmara de Hibridação durante a hibridação. ! Nunca altere o tempo ou a temperatura de incubação da reacção de hibridação, pois isso pode ocasionar a perda de intensidade do sinal fluorescente ou um aumento da fluorescência não específica. Não exponha as microplacas hibridadas à luz solar directa. 27 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 ➠➠ ➠➠ Prepare uma atmosfera saturada de humidade na Câmara de Hibridação. Incube a quantidade necessária de microplacas PapilloCheck® na Câmara de Hibridação à temperatura ambiente (20-25 °C) (consulte o Capítulo 8.3.1). ➠➠ Misture 30 µl do Tampão de Hibridação PapilloCheck® num tubo de reacção de 0,2 ml de uma tira para PCR com 5 µl de produto para PCR. Misture cuidadosamente. ➠➠ Transfira 25 µl da mistura de hibridação para cada poço da microplaca PapilloCheck® utilizando uma pipeta multicanal ➠➠ Feche a Câmara de Hibridação e incube a microplaca PapilloCheck® durante exactamente 15 minutos à temperatura ambiente (20-25 °C). Figura 5: Passos de trabalho do processo de hibridação 28 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 8.3.3 Lavagem e secagem O equipamento especial fornecido pela Greiner Bio-One permite a lavagem paralela de até quatro microplacas PapilloCheck® (consulte o Capítulo 2). O equipamento adicional necessário para o processamento das microplacas PapilloCheck® inclui três caixas de lavagem oCheck® e uma pega para o suporte magnético de lâminas da Câmara de Hibridação. Os diferentes passos de trabalho são mostrados na Figura 6. ➠➠ Retire cuidadosamente o suporte magnético de lâminas que contém as lâminas hibridadas da Câmara de Hibridação. ➠➠ Coloque o suporte de lâminas directamente na caixa de lavagem oCheck® que contém a solução de lavagem I. Certifique-se de que o lado magnético esteja virado para cima. ➠➠ Fixe a Pega oCheck® ao suporte de lâminas e dê início ao primeiro dos três passos de lavagem. ➠➠ Lave a microplaca à temperatura ambiente (20-25 °C) na solução de lavagem I movimentando-a rapidamente para cima e para baixo durante 10 segundos. Os arrays devem permanecer sempre cobertos com solução de lavagem. ➠➠ Lave a microplaca durante 60 segundos na solução de lavagem II a 50 °C movimentando vigorosamente para cima e para baixo o suporte de lâminas. ➠➠ Lave a microplaca à temperatura ambiente (20-25 °C) na solução de lavagem III movimentando-a rapidamente para cima e para baixo durante 10 segundos. ➠➠ Retire imediatamente qualquer líquido da superfície da microplaca através de centrifugação. Se utilizar uma microcentrifugadora especial para microarrays, centrifugue durante 1 minuto. Se utilizar uma microcentrifugadora aplicável aos tubos de 50 ml, coloque cada microplaca PapilloCheck® lavada num tubo de 50 ml e centrifugue à temperatura ambiente durante 3 minutos a 500 g. A microplaca PapilloCheck® está, então, pronta para varrimento e deve ser varrida de imediato. Para a limpeza das caixas de lavagem oCheck®, enxagúe várias vezes com água após cada procedimento de lavagem e secagem estar concluído. 29 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Primeiro passo da lavagem ➠➠ ➠➠ ➠➠ ➠➠ Retire cuidadosamente o suporte magnético de lâminas da Câmara de Hibridação. Coloque rapidamente o suporte de lâminas na Caixa de Lavagem oCheck® com solução de lavagem I Fixe a pega oCheck® Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® na solução de lavagem I à temperatura ambiente durante 10 segundos movimentando o suporte de lâminas para cima e para baixo Segundo passo da lavagem ➠➠ Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® na solução de lavagem II em banho-maria a 50 °C durante 60 segundos movimentando o suporte de lâminas para cima e para baixo. Terceiro passo da lavagem ➠➠ Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® na solução de lavagem III à temperatura ambiente durante 10 segundos movimentando o suporte de lâminas para cima e para baixo Secagem ➠➠ ou Retire imediatamente qualquer líquido da superfície das microplacas PapilloCheck® através de centrifugação 3 minutos 500 g 1 minuto velocidade máx. Figura 6: Passos de trabalho do processo de lavagem Diferentes passos de lavagem e processo de secagem antes da análise da microplaca PapilloCheck® com o CheckScannerTM e o CheckReportTM Software. 30 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 8.4 Varrimento e avaliação da microplaca PapilloCheck® Coloque a(s) microplaca(s) PapilloCheck® no CheckScannerTM e continue com o varrimento conforme descrito em detalhe no Guia do Utilizador do CheckReportTM Software. Para informações mais detalhadas sobre a instalação do CheckScannerTM e do CheckReportTM Software, bem como os requisitos de sistema do computador, consulte as Instruções de Utilização correspondentes do CheckScannerTM e do CheckReportTM Software. Sempre que analisar dados utilizando o CheckReportTM Software, certifique-se de que a versão do CheckReportTM Software instalada no seu computador corresponde à versão indicada no equipamento PapilloCheck® utilizado actualmente. Se as versões não corresponderem, actualize o CheckReportTM Software. A versão mais recente do Software pode ser descarregada a partir do sítio da Internet Greiner Bio-One: www.gbo.com/bioscience/biochips_download 31 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 9. RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS Se ocorrer uma das mensagens de erro seguintes durante o varrimento da microplaca ou se a análise PapilloCheck® falhar devido a controlos específicos na microplaca, continue conforme descrito abaixo. Não hesite em contactar o seu distribuidor local Greiner Bio-One se tiver dúvidas ou dificuldades durante a utilização do PapilloCheck®. HPV DNA-Chip PROBLEMA e causa Comentários e sugestões MENSAGEM DE ERRO "COULD NOT READ BARCODE” (NÃO FOI POSSÍVEL LER O CÓDIGO DE BARRAS) Código de barras danificado Verifique se o código de barras está danificado. introduza o código de barras manualmente quando aparecer a janela apropriada. A microplaca não foi carregada correctamente Verifique a orientação da microplaca e faça o varrimento da microplaca na orientação correcta. 4° 8° IVD Fabricado na Áustria MENSAGEM DE ERRO "MISSING SPOTS” (COLORAÇÕES EM FALTA), CONTROLO DA IMPRESSÃO FALhOU OU CONTROLO DA ORIENTAÇÃO FALhOU Poeira na microplaca Repita a hibridação do(s) produto(s) da PCR noutra microplaca. Formação de bolhas de ar durante a transferência de líquido na microplaca Repita a hibridação do(s) produto(s) da PCR noutra microplaca. Pipete cuidadosamente para evitar a formação de bolhas. PapilloCheck® CONTROLO DE hIBRIDAÇÃO FALhOU Temperatura incorrecta da solução de lavagem II O segundo passo da lavagem tem de ser realizado a 50 °C. Certifique-se de que a solução de lavagem ii seja aquecida a 50 °C. Temperatura incorrecta do banho-maria O segundo passo da lavagem tem de ser realizado a 50 °C. Verifique a temperatura do banho-maria. Certifique-se de que a temperatura do banho-maria esteja a 50 °C. Se necessário, comprove a temperatura com um termómetro. Preparação errada da mistura de hibridação Repita a preparação da mistura de hibridação com os volumes correctos e hibride os produtos da PCR noutra microplaca. Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 32 PROBLEMA e causa Comentários e sugestões 4° 8° IVD Fabricado na Áustria CONTROLO DA PCR FALhOU Não existe adição da Polimerase do ADN hotStarTaq® a MasterMix Repita a análise PapilloCheck® começando a preparação da reacção da PCR. Adição de uma Polimerase do ADN hotStarTaq® que não funciona correctamente a MasterMix Repita a análise PapilloCheck® começando a preparação da reacção da PCR. Adição de Uracilo-N-Glicosilase não diluída a MasterMix Repita a análise PapilloCheck® começando a preparação da reacção da PCR. Mistura de reacção não foi misturada o suficiente Repita a análise PapilloCheck® começando a reacção da PCR. Tenha cuidado para misturar cuidadosamente a mistura de reacção. Inibidores da PCR presentes na amostra Repita a extracção de aDN e a análise PapilloCheck®. hibridação executada sem adição de produto da PCR Repita a hibridação. Mistura de hibridação não foi misturada o suficiente Repita a hibridação. Problemas com o ciclador térmico Verifique o desempenho do ciclador térmico e se a respectiva programação está correcta (passos da PCR, rampa de aquecimento, volume). atenção: utilize o ciclador térmico Geneamp® PCR System 9700 (applied Biosystems) ou o Ciclador Térmico Veriti™ de 96 Poços (applied Biosystems) em combinação com PapilloCheck®. HPV DNA-Chip CONTROLO DA AMOSTRA FALhOU PapilloCheck® Não existe adição de ADN da amostra à reacção da PCR Repita a análise PapilloCheck® começando a reacção da PCR. Instruções de Utilização Preparação do ADN falhou Repita a extracção do aDN. Não existe material suficiente da amostra a colheita da amostra falhou. a amostra é muito clara. Concentre a amostra de acordo com a descrição do Capítulo 9.1 e repita a extracção de aDN ou repita a colheita da amostra. PCR E/OU CONTROLOS DA AMOSTRA NÃO FALhARAM MAS EXIBEM UM VALOR DE RELAÇÃO SINAL/RUÍDO DE 0 Este resultado é classificado como válido se o CheckReportTM Software detectar pelo menos um tipo de VPH na amostra com um sinal acima de um limite definido. a amostra e/ou o controlo da PCR podem então mostrar sinais de fluorescentes baixos ou mesmo ausentes devido a competição durante a PCR. Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn 10. REF ASSISTÊNCIA TÉCNICA 465 060 BQ-013-06 Para Bio-One utilização em diagnóstico in vitro de assistência técnica que contaRevisão: a Greiner dispõe de um departamento com cientistas Abril 2011 apenascom por uma pessoal deexperiência laboratórioteórica profissional experientes, vasta e prática em biologia molecular e nos produtos oCheck®. Se tiver quaisquer dúvidas ou dificuldades relativamente aos produtos oCheck®, não hesite em contactar o seu distribuidor local Greiner Bio-One. Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 33 11. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPENhO DO PaPillOChECk® 11.1 Desempenho analítico do PapilloCheck® 11.1.1 Sensibilidade analítica HPV DNA-Chip Estabeleceu-se o limite de detecção (lD) utilizando plasmídeos de referência para cada tipo de VPH detectável que contém a região E1 visada pelo PapilloCheck®. Os lD encontram-se resumidos na Tabela 8. 4° 8° IVD Fabricado na Áustria Tabela 8: Limites de detecção para os tipos de VPh detectáveis Genótipo do VPh Cópias / reacção pg/ml** VPh 6 30* 0,052 VPh 11 150* 0,26 VPh 16 50* 0,086 VPh 18 300* 0,516 VPh 31 300* 0,522 VPh 33 300* 0,519 VPh 35 750* 1,29 VPh 39 30* 0,052 VPh 40 30* 0,052 VPh 42 30* 0,052 VPh 43 100* 0,175 VPh 44 30* 0,052 PapilloCheck® Instruções de Utilização VPh 45 50* 0,087 VPh 51 30* 0,051 VPh 52 100* 0,174 VPh 53 30* 0,052 VPh 56 30* 0,052 VPh 58 150* 0,255 VPh 59 50* 0,087 REF 465 060 VPh 70 30* 0,052 Xn Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma VPh 66 100* 0,171 humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, cervicais VPh82 68 em amostras 30* 0,052 VPh 73utilização em diagnóstico 200* 0,338 Para in vitro apenas de laboratório profi VPh 82 por pessoal30* 0,052ssional Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 * a concentração validada de cada plasmídeo de referência do VPH foi preparada em 2 séries de diluição independentes e mediu-se em 3 repetições da concentração ensaiada (ou seja, um total de 6 repetições por concentração). Para além disso, cada ensaio continha 10 ng de aDN humano. No caso de uma variação dos dados validados, as concentrações do plasmídeo específico foram aumentadas ou diminuídas e novamente ensaiadas (6 repetições a partir de 2 séries de diluição independentes). O limite de detecção foi a concentração mais baixa em que todas as 6 repetições foram Greiner Bio-One Gmbh positivas. Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha ** analisado directamente, sem considerar a preparação do aDN. a quantidade refere-se ao aDN do VPH contido no Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 plasmídeo. [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 34 11.1.2 Especificidade analítica – tipos de VPH Os plasmídeos de referência para os tipos de VPH indicados foram ensaiados com 2,12 x 106 cópias/reacção da PCR. VPH 6b, VPH 11, VPH 13, VPH 16, VPH 18, VPH 26, VPH 30, VPH 31, VPH 33, VPH 34, VPH 35, P V 54, DNA - C h 55, ip VPH 39, VPH 40, VPH 42, VPH 43, VPH 44, VPH 45, VPH 51, VPH 52, VPH 53, HVPH VPH VPH 56, VPH 58, VPH 59, VPH 61, VPH 66, VPH 67, VPH 68, VPH 69, VPH 70, VPH 71, VPH 73, VPH 74, VPH 81, VPH 82, VPH 84, VPH 85, VPH 91. Detectaram-se as hibridações cruzadas seguintes: O VPH 55 dá um sinal na sonda do VPH 44. Por conseguinte, o CheckReportTM Software exibe um resultado combinado VPH 44/VPH 55. O VPH 13 pode reagir de forma cruzada com a sonda do VPH 11, mas não resulta num sinal falso positivo pois o VPH 13 não está presente nas amostras cervicais. 11.1.3 Especificidade analítica – Organismos Não-VPH 4° 8° IVD Fabricado na Áustria Os organismos Não-VPH seguintes foram ensaiados com PapilloCheck® (5-10 ng de aDN genómico). Não se detectaram sinais positivos. Acinetobacter baumannii, Acinetobacter calcoaceticus, Acinetobacter lwoffii, Actinobacillus actinomycetemcomitans Serovar c, Actinomyces odontolyticus, Actinomyces viscosus, Bacillus subtilis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium breve, Campylobacter concisus, Campylobacter gracilis, Campylobacter rectus, Candida albicans, Capnocytophaga gingivalis, Capnocytophaga ochracea, Capnocytophaga sputigena, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter freundii, Citrobacter freundii, Citrobacter koseri, Citrobacter koseri, Clostridium difficile, Clostridium perfringens, Eikenella corrodens, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Enterobacter sakazakii, Enterococcus durans, Enterococcus faecali, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Eubacterium nodatum , Fusobacterium nucleatum, Gardnerella vaginalis, Hafnia alvei, Kingella denitrificans, Klebsiella® oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Lactobacillus casei, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus iners, Lactobacillus rhamnosus,Lactobacillus vaginalis, Mogibacterium timidum, Morganella morganii, Mycoplama hominis, Mycoplasma buccale, Mycoplasma faucium, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma genitalium, Mycoplasma orale, Mycoplasma pirum, Mycoplasma salivrium, Mycoplosma pneumoniae, Neisseria elongata, Neisseria gonorrhoeae, Peptoniphilus asaccharolyticus, Peptostreptococcus anaerobius, Peptostreptococcus micros, Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens, Proteus hauseri, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Serratia marcescens, Staphylococcus aureus ssp. aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus haemolyticus, Staphylococcus saprophyticus, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus agalactiae, Streptococcus constellatus, Streptococcus criceti, Streptococcus cristatus, Streptococcus gordonii, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus salivarius, Streptococcus sanguinis, Streptococcus sobrinus, Tannerella forsythensis (anteriormente: Bacteroides forsythus), Treponema denticola, Ureaplasma uralyticum, Veillonella parvula. PapilloCheck Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 35 11.2 Repetibilidade Para avaliar a repetibilidade do ensaio, analisaram-se cinco amostras, cada uma contendo três modelos de referência de VPH diferentes e aDN genómico humano, com o PapilloCheck®. Os números de cópias dos diferentes alvos de VPH presentes nas amostras variaram, bem como a referência de aDN humano (consulte a Tabela 9). analisou-se cada amostra com PapilloCheck® HPV DNA-Chip em cinco réplicas independentes. as réplicas foram ensaiadas pelo mesmo técnico no espaço de três dias. IVD Fabricado na Áustria Tabela 9: Composição de amostras para ensaio de repetibilidade ID da amostra Tipo de VPh Quantidade de ADN modelo x limite de detecção amostra 1 VPH 16 VPH 18 VPH 31 aDN genómico humano 180 cópias 1500 cópias 1400 cópias 1 ng 3 10 30 amostra 2 VPH 16 VPH 18 VPH 31 aDN genómico humano 180 cópias 1500 cópias 1400 cópias 5 ng 3 10 30 amostra 3 VPH 16 VPH 18 VPH 45 aDN genómico humano 1800 cópias 450 cópias 300 cópias 5 ng 30 3 10 amostra 4 VPH 16 VPH 18 VPH 45 ® aDN genómico humano 10 000 cópias 5000 cópias 20 000 cópias 2,5 ng - VPH 18 VPH 31 VPH 45 aDN genómico humano 4500 cópias 500 cópias 90 cópias 2,5 ng 30 10 3 PapilloCheck 4° 8° amostra 5 Instruções de Utilização Para as cinco amostras e cada análise repetida, detectaram-se os três tipos de VPH correctos e a análise foi negativa para o tipo não incluído. assim, 75 dos 75 resultados de ensaios individuais (5 amostras x 5 réplicas x 4 modelos de VPH diferentes utilizados) estavam correctos. Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 36 11.3 Reprodutibilidade Determinou-se a reprodutibilidade do equipamento de ensaio PapilloCheck® utilizando 22 amostras clínicas (consulte a Tabela 10) com concentrações de VPH próximas do limite de detecção. a determinação utilizando o mesmo método, com material de amostra idêntico, foi executada por pessoal diferente e em laboratórios diferentes com instrumentação diferente. Os resultados foram HPV DNA-Chip classificados de acordo com as amostras positivas, se foram detectados tipos de VPH idênticos em infecções simples ou duplas, ou se dois ou três tipos de VPH idênticos foram detectados em infecção múltipla com três ou quatro tipos, respectivamente. 4° 8° IVD Fabricado na Áustria Tabela 10: Resultados do ensaio de reprodutibilidade N.º da amostra Resultado Laboratório 1 Resultado Laboratório 2 Concordância 1 VPH 33 VPH 33 + 2 VPH 35 VPH 35 + 3 negativo negativo + 4 VPH 45 VPH 45 + 5 VPH 51, VPH 52 VPH 51, VPH 52 + 6 VPH 51, VPH 56 VPH 51, VPH 56 + 7 VPH 16, VPH 39, VPH 68 VPH 16, VPH 39, VPH 68, VPH 82 + 8 VPH 39, VPH 68 VPH 39, VPH 68 + 9 VPH 16 VPH 16 + PapilloCheck 10 negativo negativo + 11 VPH 56, VPH 44/55 VPH 56, VPH 44/55 + 12 negativo negativo + 13 VPH 11, VPH 18, VPH 56 VPH 11, VPH 18, VPH 56 + 14 VPH 51, VPH 44/55 VPH 51, VPH 44/55 + 15 VPH 53, VPH 58, VPH 43 VPH 53, VPH 58, VPH 68, VPH 43 + 16 negativo negativo + 17 VPH 16 VPH 16 + 18 VPH 16 VPH 16 + ® Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico do vírus do papiloma 19 VPH 45 para a genotipagem dos VPHtipos 45 + humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, VPH 16 VPH 16 + 73,2082 em amostras cervicais 21 VPH 53, VPH 58 VPH 53, VPH 58 + 22 VPH 31 VPH 31 + Xn REF 465 060 Revisão: BQ-013-06 Para utilização em diagnóstico in vitro Abril 2011 apenas por pessoal de laboratório profissional Para todas as amostras clínicas, obtiveram-se resultados concordantes. Os sinais de tipos adicionais detectados pelo laboratório 2 para as amostras múltiplas infectadas 7 (VPH 82) e 15 (VPH 68) ficaram mesmo acima do limite definido e os resultados discordantes foram classificados como não problemáticos. Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 37 11.4 Robustez Para avaliar a robustez do sistema de ensaio PapilloCheck® consideraram-se variações dos parâmetros seguintes: • Temperatura de hibridação HPV DNA-Chip • Tempo de hibridação • Temperatura de lavagem • Tempo de lavagem Todos os ensaios foram executados em réplicas de 3 com concentrações elevadas de modelo (1 ng plasmídeo de referência do VPH ou aprox. 200 x 106 cópias por amostra). Os intervalos dos valores dos parâmetros determinados nos quais é possível uma detecção robusta do VPH com PapilloCheck® encontram-se resumidos na Tabela 11. 4° 8° IVD Fabricado na Áustria Tabela 11: Robustez do PapilloCheck® Parâmetro Intervalo Temperatura de hibridação 20-25 °C Tempo de hibridação Temperatura de lavagem 13-17 minutos 48-52 °C 1.º passo da lavagem 10-15 segundos PapilloCheck® 2.º passo da lavagem 60-75 segundos Tempo de lavagem Instruções de Utilização 3.º passo da lavagem 10-15 segundos Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais Xn REF 465 060 Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional Greiner Bio-One Gmbh Maybachstr. 2 • 72636 Frickenhausen • alemanha Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 38 11.5 Desempenho clínico do PapilloCheck® Para determinar o desempenho clínico do ensaio PapilloCheck® em termos de sensibilidade e especificidade clínicas, realizou-se um estudo comparativo utilizando o PapilloCheck® e o ensaio GP5+/6+-PCR Eia.7 Para este estudo, analisaram-se amostras de 1437 mulheres representativas com citologia normal (grupo de controlo) com mais de 40 anos de idade (idade média, 49 anos; faixa HPV DNA-Chip etária dos 40 aos 60 anos) e 192 mulheres representativas (idade média, 34 anos; faixa etária dos 30 aos 60 anos) com lesões CiN3+ histologicamente confirmadas (grupo de casos). Todas as amostras utilizadas neste estudo foram colhidas originalmente durante a fase do estabelecimento da linha de base a partir de mulheres no grupo de intervenção do ensaio de implementação, POBaSCaM, aleatório e com controlo, baseado na população.8 após restringir a análise PapilloCheck® aos 14 tipos de VPH de alto risco visados pelo GP5+/6+PCR-Eia, o PapilloCheck® teve uma sensibilidade clínica para ≥ CiN3 de 95,8 % (184/192; 95 % iC 92,8-98,8) e uma especificidade clínica para ≥ CiN2 de 96,7 % (95 % iC 95,7-97,7). Em comparação, estes valores foram 96,4 % (185/192; 95 % iC: 93,9-98,9) e 97,7 % (95 % iC: 96,998,5), respectivamente, para GP5+6+-PCR-Eia (consulte a Tabela 5 e 6). Fabricado na Áustria Tabela 5: Comparação dos resultados de PapilloCheck® (14 tipos de VPh de alto risco) e GP5+/6+ PCR-EIA estratificados para controlos e casos. - + - + total 1386 (96,5 %) 18 (1,3 %) 1404 (97,7 %) 4 (0,3 %) 29 (2,0 %) 36 (2,3 %) 1390 (96,7 %) 47 (3,3 %) 1437 - 4 (2,1 %) 3 (1,6 %) 7 (3,6 %) 4 (2,1 %) 181 (94,3 %) 185 (96,4 %) 8 (4,2 %) 184 (95,8 %) 192 Controlos IVD 8° 4° PapilloCheck® (14 tipos de VPh de alto risco) Casos PapilloCheck ®+ total GP5+/6+-PCR/EIA Total Instruções de Utilização Tabela 6: Sensibilidade e especificidade clínicas de PapilloCheck® e GP5+/6+-PCR-EIA (resultados para um ou mais dos 14 tipos de VPh de alto risco: VPh 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, ou 68). 14 VPh de alto risco PapilloCheck® GP5+/6+ Sensibilidade Clínica para ≥ CIN3 95,8 % 96,4 % Especificidade Clínica para ≥ CIN2 96,7 % 97,7 % Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 73, 82 em amostras cervicais REF 465 060 Xn Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional 7 8 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 Comparison of the clinical performance of PapilloCheck® human papillomavirus detection with that of the GP5+/6+PCR-enzyme immunoassay in population-based cervical screening. Hesselink aT, Heideman Da, Berkhof J, Topal F, Pol RP, Meijer CJ, Snijders PJ. J Clin Microbiol. 2010 Mar;48(3):797-801. Epub 2009 Dec 30. Bulkmans, N. W., l. Rozendaal, P. J. Snijders, F. J. Voorhorst, a. J. Boeke, G. R. Zandwijken, F. J. van Kemenade, R. Greiner Bio-One Gmbh H. Verheijen, K. Groningen, M. E. Boon, H. J. Keuning, M. van Ballegooijen, a. J. van den Brule, and C. J. Meijer. 2004. Maybachstr. 2randomized • 72636 Frickenhausen alemanha POBaSCaM, a population-based controlled trial• for implementation of high-risk HPV testing in cervical Telefone:and +49 (0) 7022 • Faxwomen. +49 (0) 948-514 screening: design, methods baseline data948-0 of 44,102 int.7022 J. Cancer 110:94–101. [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 39 Para avaliar a prevalência dos tipos de VPH detectados pelo PapilloCheck®, efectuou-se o rastreio de esfregaços cervicais de 881 mulheres.9 Todas as amostras cervicais foram colhidas em meio de colheita STMTM (Qiagen, Hilden, alemanha). O mais comum foi o VPH 16 com uma taxa de detecção de 19,4 %. Os tipos seguintes mais frequentes foram: VPH 31, VPH 39, VPH 51 e VPH 52. as prevalências para todos os tipos detectáveis são apresentadas na Tabela 7. HPV DNA-Chip IVD Fabricado na Áustria Tabela 7: Prevalência específica por tipo de tipos de VPH detectados pelo PapilloCheck Genótipo do VPh Prevalência por PapilloCheck® VPh 16 19,40 % VPh 31 14,40 % VPh 39 9,30 % VPh 51 9,10 % VPh 52 7,50 % VPh 56 7,40 % VPh 58 6,10 % VPh 53 6,10 % VPh 42 5,80 % VPh 66 5,90 % VPh 68 5,60 % VPh 45 4,50 % ® PapilloCheck® VPh 33 4,40 % VPh 18 4,00 % VPh 70 4,10 % VPh 44/55 3,10 % VPh 59 2,50 % VPh 82 1,90 % VPh 35 1,60 % VPh 73 1,50 % VPh 43 0,80 % 4° 8° Instruções de Utilização Equipamento para diagnóstico para a genotipagem dos tipos do vírus do papiloma VPh 6 0,60 % humano 6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 40, 42, 43, 44/55, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 70, 11 amostras cervicais 0,60 % 73, VPh 82 em VPh 40 REF 465 060 0,40 % Xn Para utilização em diagnóstico in vitro apenas por pessoal de laboratório profissional 9 Revisão: BQ-013-06 Abril 2011 Greiner Bio-One Gmbh Evaluation of the performance of the novel PapilloCheck® HPV genotyping test by comparison with two other genotyping Maybachstr. 2 •B,72636 Frickenhausen • alemanha systems and the HC2 test. Schopp Holz B, Zago M, Stubenrauch F, Petry KU, Kjaer SK, iftner T. J Med Virol. 2010 apr;82(4):605-15. Telefone: +49 (0) 7022 948-0 • Fax +49 (0) 7022 948-514 [email protected] • www.gbo.com/bioscience PapilloCheck® - instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 40 12. PROTOCOLO CURTO P apilloCheck® 12.1 Sala 2: PCR - Preparação da mistura de reacção ➠➠ ➠➠ Dilua a Uracilo-N-Glicosilase 1:200 em água de grau PCR ➠➠ Prepare a mistura de reacção para a quantidade necessária de reacções da PCR Misture cuidadosamente a diluição da UNG 1 reacção 13 reacções (1 microplaca) 26 reacções (2 microplacas) 39 reacções (3 microplacas) 52 reacções (4 microplacas) PapilloCheck® PCR MasterMix 19,8 µl 257,4 µl 514,8 µl 772,2 µl 1029,6 µl Polimerase HotStar Taq® (5 U/µl) 0,2 µl 2,6 µl 5,2 µl 7,8 µl 10,4 µl Uracilo-N-Glicosilase (Diluição de 1:200, 0,005 U/µl) 1 µl 13µl 26 µl 39 µl 52 µl Volume total antes da adição da amostra de ADN 21 µl 273 µl 546 µl 819 µl 1092 µl ➠➠ Misture cuidadosamente a mistura de reacção ➠➠ Divida em alíquotas a mistura de reacção: adicione 21 µl da mistura de reacção a cada reacção da PCR num tubo de reacção da PCR de 0,2 ml de uma tira para PCR PCR Sala 2 P R O T O C O L O C U R T O 41 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 12.2 Sala 2: PCR - Adição do modelo de ADN/ Reacção da PCR ➠➠ ➠➠ Adicione 5 µl do modelo de ADN a cada reacção da PCR ➠➠ Inicie a reacção da PCR com o programa do ciclador térmico preparado Misture cuidadosamente Tempo Temp. °C N.º de ciclos 20 min 37 °C 1 15 min 95 °C 1 30 s 25 s 45 s 95 °C 55 °C 72 °C 40 30 s 45 s 95 °C 72 °C 15 Pausa 10 °C PCR Sala 2 P R O T O C O L O C U R T O 42 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 Hibrid. e Lavagem 12.3 Sala 3: Hibridação - Preparação/ Reacção de hibridação ! ➠➠ ➠➠ Sala 3 Inicie os preparativos pelo menos 30 minutos antes da hibridação. Dissolva os potenciais precipitados na hibridação e nos tampões de lavagem e misture bem Prepare a mistura da solução de lavagem para a quantidade de microplacas PapilloCheck® que vão ser analisadas. Número de microplacas PapilloCheck® Componentes 1 2 3 4 Água destilada/desionizada 140 ml 280 ml 420 ml 560 ml PapilloCheck® Tampão A 14 ml 28 ml 42 ml 56 ml PapilloCheck® Tampão B 1,75 ml 3,5 ml 5,25 ml 7 ml 155,75 ml 311,50 ml 467,25 ml 623 ml Volume total ➠➠ Divida em alíquotas a mistura da solução de lavagem em três caixas de ➠➠ lavagem oCheck® Pré-aqueça a solução de lavagem II em banho-maria a 50 °C ➠➠ Incube a quantidade de microplacas PapilloCheck® que vão ser analisadas numa Câmara de Hibridação preparada à temperatura ambiente ➠➠ ➠➠ ➠➠ Misture os produtos da PCR e centrifugue brevemente ➠➠ Misture cuidadosamente e centrifugue brevemente ➠➠ ➠➠ ➠➠ Misture o Tampão de Hibridação e centrifugue brevemente Misture 30 µl de Tampão de Hibridação PapilloCheck® com 5 µl de produto da PCR Transfira 25 µl da mistura de hibridação para cada poço da microplaca PapilloCheck® utilizando uma pipeta multicanal Evite a formação de bolhas Incube a microplaca PapilloCheck® durante exactamente 15 minutos à temperatura ambiente (20-25 °C) P R O T O C O L O C U R T O 43 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015 12.4 Sala 3: Lavagem e Secagem/ Varrimento e avaliação ➠➠ ➠➠ Retire o suporte magnético de lâminas da Câmara de Hibridação ➠➠ ➠➠ Fixe a pega oCheck® Hibrid. e Lavagem Sala 3 Coloque o suporte de lâminas na caixa de lavagem oCheck® com solução de lavagem I Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em solução de lavagem I à temperatura ambiente durante 10 segundos ➠➠ Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em solução de lavagem II pré-aquecida em banho-maria a 50 °C durante 60 segundos ➠➠ Lave a(s) microplaca(s) PapilloCheck® em solução de lavagem III à temperatura ambiente durante 10 segundos ➠➠ Retire qualquer líquido da superfície da microplaca PapilloCheck® através de centrifugação 1 minuto 3 minutos ou velocidade 500 g máx. ➠➠ ➠➠ Faça o varrimento da(s) microplaca(s) PapilloCheck® com o CheckScannerTM ➠➠ Crie relatórios Faça o varrimento e a análise conforme descrito no Guia do Utilizador do CheckReportTM Software P R O T O C O L O C U R T O 44 PapilloCheck® - Instruções de Utilização Revisão: BQ-013-08 / Maio 2015
