Avaliação da Eficiência de uma Estação de Tratamento de Efluente

Avaliação da Eficiência de uma Estação de Tratamento de
Efluente Hospitalar através da Detecção e Caracterização
Molecular de Pseudomonas aeruginosa,
na Cidade do Rio de Janeiro
Rosa Maria Pinto de Novaes
Curso de Especialização em Controle da Qualidade de Produtos, Ambientes e Serviços Vinculados à Vigilância Sanitária.
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em
Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Orientadora: Maysa Beatriz Mandetta Clementino
Rio de Janeiro
2009
CAPA / LOMBADA
Rosa Maria Pinto
de Novaes
Avaliação da
Eficiência de
uma Estação de
Tratamento de
Efluente
Hospitalar
através da
Detecção e
Caracterização
Molecular de
Pseudomonas
aeruginosa na
Cidade do Rio de
Janeiro.
PPGVS/ INCQS
FIOCRUZ
2009
ii
FOLHA DE ROSTO
Avaliação da Eficiência de uma Estação de
Tratamento de Efluente Hospitalar na Cidade do Rio
de Janeiro, através da Detecção e Caracterização
Molecular de Pseudomonas aeruginosa
Rosa Maria Pinto de Novaes
Curso de Especialização em Controle da Qualidade
de Produtos, Ambientes e Serviços Vinculados à
Vigilância Sanitária
Instituto Nacional de Controle de Qualidade em
Saúde
Fundação Oswaldo Cruz
Maysa Beatriz Mandetta Clementino
Rio de Janeiro
iii
FOLHA DE APROVAÇÃO
Avaliação da Eficiência de uma Estação de Tratamento de Efluente
Hospitalar através da Detecção e Caracterização Molecular de Pseudomonas
aeruginosa na Cidade do Rio de Janeiro.
Rosa Maria Pinto de Novaes
Monografia submetida à Comissão Examinadora composta pelos
professores e tecnologistas do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em
Saúde da Fundação Oswaldo Cruz e por professores convidados de outras
instituições, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de
Especialização em Controle da Qualidade em Produtos, Ambientes e Serviços
Vinculados à Vigilância Sanitária.
Aprovado:
_______________________________________________________
Dr. Célia Maria Carvalho Pereira Araújo Romão, Tecnologista sênior, INCQS,
FIOCRUZ.
______________________________________________________
Dr. Alessandra Silva Morilla Gonzalez, Bolsista de Pós-Doutorado Júnior, Instituto
de Biologia, UFRJ.
______________________________________________________
Dr. Ivano Raffaele Victorio de Filippis Capasso, Tecnologista sênior, INCQS,
FIOCRUZ.
____________________________________________________
Dr. Maysa Beatriz Mandetta Clementino, Tecnologista sênior, INCQS, FIOCRUZ.
(Orientador)
iv
Rio de Janeiro
FICHA CATALOGRÁFICA
Novaes, Rosa Maria Pinto de
Avaliação da Eficiência de uma Estação de Tratamento de
Efluente Hospitalar através da Detecção e Caracterização
Molecular de Pseudomonas aeruginosa na Cidade do Rio de
Janeiro/ Rosa Maria Pinto de Novaes. Rio de Janeiro: INCQS/
FIOCRUZ, 2009.
xii, 51 f., il., tab., graf.
Trabalho de conclusão de Curso (Especialização em
Vigilância Sanitária) – Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Nacional
de Controle de Qualidade em Saúde, Programa de PósGraduação em Vigilância Sanitária, Rio de Janeiro, 2009.
Orientador: Maysa Beatriz Mandetta Clementino
1. Esgoto hospitalar. 2. Pseudomonas aeruginosa.
3. Bactérias multirresistentes I. Título.
v
RESUMO
O ambiente hospitalar é alvo de preocupação por parte da sociedade devido ao
grande número de doentes em um mesmo local e pela diversidade de microrganismos encontrados, que estariam presentes também nos resíduos gerados. Os hospitais liberam, em seu esgoto, uma variedade de substâncias tais como fármacos,
antibióticos, desinfetantes, anestésicos, metais pesados e drogas não metabolizadas por pacientes, que podem provocar um aumento das populações bacterianas
multirresistentes. A Pseudomonas aeruginosa, devido à sua natureza ubíqua, é
comumente encontrada no ambiente hospitalar, sendo considerada um dos patógenos mais relevantes. Este estudo abrange a discussão sobre as características
microbiológicas de esgotos hospitalares, bem como os impactos do lançamento
destes efluentes sem um pré-tratamento adequado em corpos receptores, cujos
riscos associados incluem a disseminação de microrganismos patogênicos no ambiente. Desta forma, estudou-se a eficiência de um sistema de tratamento de esgoto hospitalar localizado na cidade do Rio de Janeiro através da identificação bioquímica e molecular dos isolados de P. aeruginosa, a determinação de seus perfis
de sensibilidade aos antimicrobianos e o comportamento das mesmas ao longo do
sistema. Foi detectada a presença de P. aeruginosa em todas as etapas do tratamento, cepas sensíveis e resistentes a cefepime, imipeném, aztreonam, gentamicina, ciprofloxacina, e norfloxacina, refletiram a diversidade dos isolados. Concluiu-se que o sistema de tratamento estudado não foi capaz de eliminar a P. aeruginosa do efluente tratado; que o método molecular foi mais sensível e eficiente
que o convencional na identificação dos isolados e que cepas de P. aeruginosa
multirresistentes estão sendo lançadas no meio ambiente. Estes resultados poderão permitir uma avaliação da influência do tratamento no comportamento de patógenos resistentes, evitando a disseminação desses organismos nos recursos hídricos.
Palavras chave: Esgoto hospitalar, Pseudomonas aeruginosa, bactérias multirresistentes, gene 16S rRNA.
vi
ABSTRACT
The hospital environment is causing concerning to the society, due the high number of patients in the same area and because of microbial diversity that have been
found in its wastes. The hospitals release in their sewage a variety of substances
including drugs, antibiotics, disinfectants, anesthetics, heavy metals and non-metabolized drugs, that can provide the development of multi-resistant bacterial communities. Pseudomonas areruginosa, due to et ubiquitous nature, is commonly
found in the hospital environment, being considered one of the most relevant
pathogen. This study includes the discussion about microbiological characteristics
of hospital wastes, as the impact of the release of these effluents without adequate
preliminary treatment into hydric resources, which associated risks include pathogenic
microorganism
spread
in
the
environment.
We
analyzed
a
wastewater treatment plant in the Rio de Janeiro city efficiency by biochemical and
molecular identification of P. aeruginosa isolates; the determination of their antimicrobial susceptibility and their behavior during the treatment process. We detected
the presence of P. aeruginosa during all the treatment steps, and a number of susceptible and resistant strains against cefepime; imipeném; aztreonam; gentamicin;
ciprofloxacina; and norfloxacina, reflecting the diversity of the isolates. We concluded
that
a)
the
treatment
plant
was
not
able
to
eliminate
P. aeruginosa strains from the treated effluent b) the molecular approach was
more sensible and efficient than conventional methodology for the isolates
identification and c) the multresistant P. aeruginosa strains are currently
released into the environment. These results will allow the assessment of the
influence of treatment on resistant pathogens performance, avoiding their
dissemination in water resources.
Key-words:
Hospital
waste,
Pseudomonas
aeruginosa,
multi-resistent
bactéria, 16S rRNA gene.
vii
LISTA DE SIGLAS
ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AIDS - Acquired Immunodeficiency Syndrome (Síndrome da Imunodeficiência
Adquirida)
ATCC - American Type Culture Collection
bp - Bases par ( Pares de Base)
CDC - Centers for Disease Control and Prevention
CLSI - Clinical and Laboratory Standard Institute
CNES - Cadastro Nacional de Estabelecimentos de Saúde
CONAMA - Conselho Nacional de Meio Ambiente
DNA - Ácido desoxirribonucléico
ETE - Estação de Tratamento de Esgotos
FIOCRUZ - Fundação Instituto Osvaldo Cruz
HIV - Human Immunodeficiency Vírus (Vírus Humano da Imunodeficiência)
HMLJ - Hospital Municipal Lourenço Jorge
IBGE - Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
INCQS - Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
MLD - Maternidade Leila Diniz
NBR - Norma Brasileira Regulamentadora
NNISS - National Nosocomial Infections Surveillance Systen
PCR - Polymerase chain reaction (Reação em cadeia pela Polimerase)
rDNA - DNA ribossomal
Rio-Águas - Subsecretaria de Águas Municipais
RSS - Resíduos de Serviços de Saúde
SENTRY - Programa de Vigilância Epidemiológica e de Resistência
Antimicrobiana
SUS - Sistema Unificado de Saúde
UTI - Unidade de Tratamento Intermediário
TBE - Tris-borato EDTA
TAE - Tris-acetato EDTA
vii
Lista de Tabelas
Tabela 1. Resultados das Provas Bioquímicas.
Tabela 2. Susceptibilidade aos antimicrobianos.
ix
Lista de Gráficos
Gráfico 1. Resultado das Provas Bioquímicas
Gráfico 2. Resultado da identificação molecular dos isolados.
x
Lista de Ilustrações
Figura 1 A - Panorâmica da estação de Tratamento
Figura 1 B - Panorâmica da estação de Tratamento
Figura 2 - Crescimento bacteriano em Agar Cetrimide
Figura 3 - Crescimento bacteriano no Caldo Letheen
Figura 4 - Gráfico com resultados das provas bioquímicas
Figura 5 A - Especificidade dos iniciadores para o gênero Pseudomonas
Figura 5 B - Especificidade dos iniciadores para P. aeruginosa
Figura 6 - PCR dos isolados do ponto 1 ETE
Figura 7 - PCR dos isolados dos pontos 2 ETE, 3 ETE e 4 ETE
Figura 8 - PCR dos isolados dos pontos 5 ETE e 5c ETE
xi
Sumário
RESUMO...............................................................................................................vi
Gráfico 1. Resultado das Provas Bioquímicas........................................................x
Figura 4 - Gráfico com resultados das provas bioquímicas...................................xi
1. Introdução..............................................................................................................1
1.1. Resíduos de Serviços de Saúde....................................................................................1
1.2. Resíduos Líquidos dos Serviços de Saúde e a Legislação Brasileira..........................3
1.3. Características Microbiológicas dos RSS....................................................................5
1.4. Pseudomonas aeruginosa.............................................................................................7
1.5. Identificação Fenotípica ............................................................................................10
1.6. Identificação Molecular.............................................................................................11
1.7. Estação de Tratamento de Esgotos do Complexo hospitalar Lourenço Jorge/ Leila
Diniz..................................................................................................................................12
2. Objetivos..............................................................................................................15
2.1. Objetivo geral.............................................................................................................15
2.2. Objetivos Específicos.................................................................................................15
3. Materiais e Métodos............................................................................................16
3.1. Local de Estudo:.........................................................................................................16
3.2. Coleta:........................................................................................................................17
3.3 Identificação Fenotípica.....................................................................................17
3.3.1. Condições de cultivo:..............................................................................................17
3.3.2. Identificação:...........................................................................................................17
3.4. Identificação Molecular.....................................................................................18
3.4.1. Extração do DNA genômico:..................................................................................18
3.4.2. Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR):............................................................18
3.5. Preservação dos isolados................................................................................19
3.6. Avaliação da susceptibilidade aos antibióticos................................................19
4. Resultados...........................................................................................................19
4.1. Cultivo e Isolamento de Pseudomonas aeruginosa:...................................................19
4.2. Caracterização Fenotípica dos isolados:....................................................................21
Figura 4. Resultados das Provas bioquímicas. SIM (S – Sulforeto, I – Indol, M –
Motilidade)............................................................................................................22
4.3. Caracterização Molecular dos isolados:.....................................................................23
5 ETE - os 2 isolados do ponto 5 ETE também apresentaram os fragmentos
correspondentes ao gênero Pseudomonas e à espécie aeruginosa (Figura 8).......26
5c ETE - 5c ETE A e B não apresentaram fragmentos correspondentes ao gênero
Pseudomonas e à espécie aeruginosa, 5c ETE E e F apresentaram fragmentos de
xii
618 e 956 bp correspondentes ao gênero Pseudomonas e a espécie aeruginosa
respectivamente e 5c ETE C apresentou fragmento para o gênero Pseudomonas
(Figura 8)...............................................................................................................26
4.4. Avaliação da susceptibilidade aos antibióticos................................................28
5. Discussão............................................................................................................29
11. Conclusões........................................................................................................33
12. Referências bibliográficas:................................................................................35
8. ANEXO 1.............................................................................................................47
1. Meios de Cultura e Condições de Cultivo....................................................................47
2. Provas Bioquímicas.......................................................................................................49
Meio de gelatina nutriente.........................................................................53
Meio Básico de Moeller............................................................................54
Reagente de Kovacs..................................................................................57
Inoculação e cultivo..............................................................................................58
3. Métodos de Preservação................................................................................................58
4. Preparo de Géis e Tampões...........................................................................................59
xii
Aos meus adorados pais por todos os dias de minha vida.
Agradecimentos
À minha orientadora Maysa, pelos ensinamentos, pela paciência e por ter me
aceitado como sua aluna.
À minha irmã Teresa, pela força.
À Coordenação de Ensino da pós-graduação, pela oportunidade.
À Ana Paula (Aninha), pela paciência, tranqüilidade e meiguice ao me ajudar no
desenvolvimento do meu trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Microrganismos de Referência, Ivano, Cátia,
Claudia Paula, Claudia, Jandira e Carlos, meu muito obrigado.
xiv
xv
“Recomendo-lhes paixão e coragem no desempenho de seu trabalho”
Professor Darcy Fontoura de Almeida
xvi
1. Introdução
1.1. Resíduos de Serviços de Saúde
As civilizações sempre identificaram a água como fonte de vida e energia e
os povoados humanos sempre se estabeleceram próximos aos locais que
fornecessem
este
recurso
natural.
O
crescimento
desses
povoados
transformando-os em cidades e grandes metrópoles despertaram ainda mais a
necessidade da água, uma vez que ela se caracteriza como fator essencial para
sustento e a evolução da vida. Hoje, se não se respeitar a água em todas as suas
ocorrências, a sobrevivência humana estará seriamente ameaçada (Bustos,
2003).
Além da preocupação com a água, a humanidade se deparou com outras
necessidades, dentre elas a busca de soluções para os problemas de saúde.
Para isso, construíram locais de assistência médica onde as enfermidades passaram a ser controladas a partir do atendimento aos doentes, graças aos recursos
tecnológicos e farmacológicos cada vez mais sofisticados e eficientes. Com o início da assistência hospitalar, certamente houve o início de geração de Resíduos
de Serviços de Saúde (RSS), entretanto somente há pouco mais de uma década
este vêm se tornando um assunto bastante discutido, devido ao grande impacto
ocorrido no campo da infecção hospitalar e no meio ambiente (Ribeiro, 2005).
Os RSS são aqueles gerados em hospitais, clínicas, ambulatórios e similares. Apresentam como principal característica o potencial de estarem contaminados com agentes patogênicos (Associação Brasileira de Normas Técnicas - NBR
7.501, 1989). Eles representam cerca de 1% da quantidade total dos resíduos gerados no país e têm um papel importante no cenário da saúde pública por serem
uma fonte potencial de organismos patogênicos, pelo caráter infectante de alguns
de seus componentes e pela heterogeneidade de sua composição, que pode conter substâncias tóxicas, radioativas, perfurantes e cortantes (Agência Nacional de
Vigilância Sanitária, 2005).
1
A Pesquisa Nacional de Saneamento Básico, do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2000), mostra que apesar de 63% de um total de 5.507
municípios brasileiros pesquisados realizarem a coleta dos RSS, a maioria dos
municípios brasileiros não utiliza um sistema apropriado para efetuar a coleta, tratamento e a disposição final dos RSS,.
Em relação aos riscos há , no Brasil, várias classificações de resíduos, entre as quais destacam-se as da Associação Brasileira de Normas Técnicas –
ABNT, do Conselho Nacional do Meio Ambiente – CONAMA e da Agência Nacional de Vigilância Sanitária – ANVISA. Quanto aos riscos potenciais ao meio ambiente e à saúde publica, os resíduos são classificados segundo as Normas Brasileiras Regulamentadoras (NBR) 10004 da ABNT (ABNT- NBR 7.500, 1994) em três
classes: classe I, II e III, sendo que os resíduos de saúde são enquadrados na
classe I - resíduos perigosos e, respectivamente, nas classes II e III, os “não inertes (e não perigosos)” e os “inertes”. No que se refere aos resíduos de serviços de
saúde, a ABNT (NBR 12.807, 1993) os classifica em A, B e C. Na classe A estão
incluídos os resíduos infectantes, que são subdivididos em biológico, sangue e hemoderivados, cirúrgico anatomopatológico e exsudativo, pérfuro-cortante, animalcontaminado e aqueles provenientes da assistência ao paciente. A classe B inclui
resíduos especiais, subdivididos em rejeito radioativo, resíduo farmacêutico e resíduo químico perigoso. A classe C é constituída pelos resíduos comuns.
Até o início dos anos 80 não havia no Brasil uma preocupação efetiva com
relação ao gerenciamento e ao descarte adequado dos resíduos sólidos gerados
pelos estabelecimentos de assistência à saúde bem como suas águas residuais.
Com o aumento da carga poluidora nos corpos hídricos e devido às condições favoráveis no país à propagação de doenças veiculadas pela água, cada vez mais
vem sendo dada ênfase à necessidade do controle ambiental em face à pesada
interferência que tem sobre a saúde pública. A avaliação das características dos
diferentes tipos de efluentes, os impactos que o descarte inadequado ou o não tratamento dos mesmos possam causar no ecossistema aquático e o procedimento
adequado de controle dessas questões é o que têm direcionado as atuais pesquisas (Agência Nacional de Vigilância Sanitária, 2005).
2
1.2. Resíduos Líquidos dos Serviços de Saúde e a Legislação Brasileira
No contexto de legislação, o Governo Federal através do Conselho
Nacional de Meio Ambiente (CONAMA) e da Agência Nacional de Vigilância
Sanitária (ANVISA), órgãos de meio ambiente e de saúde pública, têm traçado
normas objetivando minimizar os efeitos desastrosos do manejo incorreto dos
rejeitos líquidos de qualquer origem. Assim sendo, o CONAMA editou a Resolução
nº 283, de 12 de julho de 2001(Brasil, 2001) em complementação aos
procedimentos contidos na Resolução CONAMA nº 05, de 5 de agosto de
1993(Brasil,1993), relativos ao tratamento e destinação final dos resíduos dos
serviços de saúde, com vistas a preservar a saúde pública e a qualidade do meio
ambiente, hoje CONAMA nº 358/05(Brasil,2005). A seguir, a ANVISA fez publicar
a Resolução da Diretoria Colegiada - RDC 306 de 7 de dezembro de 2004, que
estabeleceu no seu item 11.18.3, que: “Resíduos no estado líquido podem ser
lançados na rede coletora de esgoto ou em corpo receptor, desde que atendam
respectivamente as diretrizes estabelecidas pelos órgãos ambientais gestores de
recursos hídricos e de saneamento competentes". E ainda no seu item 13.3.1 que
“Os resíduos líquidos provenientes de esgoto e de águas servidas de
estabelecimentos de saúde devem ser tratados antes do lançamento no corpo
receptor ou na rede coletora de esgoto, sempre que não houver sistema de
tratamento de esgoto coletivo atendendo a área onde está localizado...” (Brasil,
2004).
Na Cidade do Rio de Janeiro, existe um programa que objetiva adequar os
sistemas de tratamento de esgoto nos hospitais da Prefeitura, administrado pela
Subsecretaria de Águas Municipais (Rio-Águas) em parceria com a Secretaria
Municipal de Saúde. As obras incluem a construção de estações próprias de
tratamento, recuperação de redes de coleta e modernização dos equipamentos. A
iniciativa impede que os resíduos hospitalares sejam jogados sem tratamento nos
rios e lagoas da cidade, o que compromete a saúde pública e desrespeita as leis
3
ambientais. Este programa foi criado para atender a Lei Estadual n° 2.661, de 27
de dezembro de 1996 (Rio de janeiro,1996)que Regulamentou o disposto no art.
274 da Constituição do Estado do Rio de Janeiro no que se refere à exigência de
níveis mínimos de tratamento de esgotos sanitários, antes de seu lançamento em
corpos d’água e dá outras providências. Dentre outros artigos destacamos o Art.
8º - “Os efluentes de hospitais, laboratórios, clínicas e estabelecimentos similares,
em áreas que não disponham de sistema público de tratamento, deverão sofrer
tratamento especial na origem, que impossibilite a contaminação dos corpos
receptores por organismos patogênicos”. E o seu parágrafo 2º - “Cabe aos
hospitais, laboratórios, clínicas ou estabelecimentos similares a responsabilidade
técnica e econômica pelo projeto, construção e operação das instalações de
tratamento necessárias ao cumprimento do disposto no caput”. Sendo que tanto
os serviços públicos de saúde quanto os da rede privada , obrigatoriamente,
deverão cumprir tais exigências.
É importante destacar que, de acordo com a Resolução CONAMA 20/86
(Brasil, 1986), o tratamento dos efluentes pode variar muito dependendo do tipo
de efluente tratado e da classificação do corpo de água que irá receber esse
efluente. Quanto à classificação, o efluente deve ser devolvido ao rio tão limpo ou
mais limpo do que ele próprio, de forma que não altere suas características físicas,
químicas e biológicas. Em alguns casos, como por exemplo, quando a bacia
hidrográfica está classificada como sendo de classe especial, nenhum tipo de
efluente pode ser jogado ali, mesmo que tratado. Isso porque esse tipo de classe
se refere aos corpos de água usados para abastecimento. A Resolução 20/86, foi
em 2005 revogada pela Resolução CONAMA 357/05(BRASIL, 2005), e depois
alterada pela Resolução CONAMA 370/06 (BRASIL, 2006), sendo, porém,
mantido o que anteriormente fora previsto
4
1.3. Características Microbiológicas dos RSS
Entre os principais microrganismos presentes em esgotos estão as
bactérias,os fungos, os vírus e as algas. As bactérias constituem um dos
elementos mais importantes deste grupo de organismos, responsáveis pela
decomposição e estabilização da matéria orgânica, tanto na natureza como nas
unidades de tratamento biológico. No entanto, a presença de microrganismos
patogênicos e compostos químicos nos recursos hídricos é um importante meio de
transmissão de várias doenças, sendo o despejo de esgoto sem tratamento o mais
freqüente fator de contaminação. As doenças veiculadas pela água estão entre
uma das causas comuns de morte no mundo e afetam especialmente países em
desenvolvimento. Estima-se que 25% dos leitos hospitalares no mundo estejam
ocupados por pacientes com doenças transmitidas por veiculação hídrica (Straub
& Chandler, 2003). Portanto, o ambiente hospitalar é alvo de preocupação por
parte da sociedade devido ao grande número de doentes em um mesmo local e
pela diversidade de microrganismos encontrados, que estariam presentes também
nos resíduos gerados (Coelho, 2000).
O efluente hospitalar demonstra características similares ao esgoto
doméstico e industrial por apresentar entre seus componentes patógenos como
vírus, bactérias, protozoários e helmintos, que ocasionam muitas doenças com
implicações em saúde pública.
Segundo Morel e Bertussi Filho (1997) os primeiros estudos realizados com
o intuito de caracterizar as unidades geradoras de RSS, em termos qualitativos e
quantitativos, foram realizados em 1978, quando foi identificada uma série de microorganismos presentes na massa de resíduos indicando-lhes o potencial de risco, recomendando cuidados de gerenciamento como acondicionamento e coleta.
Neste estudo, foram identificados: Salmonella typhy, Shigella sp., Pseudomonas
aeruginosa e Candida albicans. A possibilidade de sobrevivência de vírus na massa de resíduos sólidos foi comprovada para o vírus da poliomielite tipo I, vírus da
hepatite A e B, influenza, vaccínia e vírus entéricos.
5
Tsai, et al. (1998) detectaram no efluente hospitalar a presença de
coliformes
totais,
coliformes
fecais,
estreptococos
fecais,
Pseudomonas
aeruginosa e Salmonella sp. Além disso, os hospitais liberam, em seu esgoto, uma
variedade de substâncias tais como fármacos, antibióticos, desinfetantes,
anestésicos, metais pesados e drogas não metabolizadas por pacientes
(Kummerer, 2001; Emmanuel et al, 2005). A disposição conjunta dos resíduos
contendo microrganismos e substâncias químicas, no ambiente, pode provocar um
aumento das populações bacterianas resistentes a certos antibióticos, detectadas
no esgoto de hospitais (Kümmerer, 2003). Os microrganismos presentes
contaminam o solo, inclusive os lençóis subterrâneos águas superficiais e os
ambientes aquáticos, sendo responsáveis pelas doenças de veiculação hídrica. P.
aeruginosa Escherichia coli, e Staphylococcus aureus são microrganismos de
grande interesse por estarem geralmente envolvidos na infecção hospitalar
(Garcia e Zanetti-Ramos 2004). Bidone (2001) ressalta que esses microrganismos
são os mais freqüentemente encontrados em análises microbiológicas dos
resíduos de serviços de saúde.
A presença de microrganismos resistentes em efluentes hospitalares é
preocupante quando se avalia o potencial de risco relacionado à disseminação de
genes de resistência aos antimicrobianos (Prado, 2007). Quiteira & Peixe (2006)
detectaram genes de resistência aos antibióticos beta-lactâmicos em cepas de P.
aeruginosa isoladas de fonte não hospitalar, sugerindo que os mesmos são
provavelmente de origem nosocomial.
Assim, o esgoto deve ser considerado
como uma fonte relevante de espécies bacterianas com diferentes perfis de
resistência e possui um grande potencial para contaminação de rios e águas
costeiras quando não tratado devidamente.
É importante esclarecer que o tratamento de esgoto seja domiciliar ou
hospitalar, pode ser separado em 4 níveis básicos: nível preliminar, tratamento
primário e tratamento secundário que tem quase a mesma função, e tratamento
terciário ou pós-tratamento. Cada um deles tem, respectivamente, o objetivo de:
remover os sólidos suspensos (lixo, areia), remover os sólidos dissolvidos, a
matéria orgânica, e os nutrientes e organismos patogênicos sendo que o nível
6
terciário varia de acordo com o tipo de estação de tratamento, podendo ser,
basicamente, o uso de um recurso físico ou químico (Borsoi, 1997). No Brasil, as
características de efluentes hospitalares e os dados da eficiência dos sistemas de
tratamento que operam em escala real ainda são pouco conhecidos.
1.4. Pseudomonas aeruginosa
Em 1894, Migula, citado por Palleroni (2005), propôs o gênero Pseudomonas para classificar as bactérias inicialmente incluídas no gênero Monas. Primitivamente, o gênero Pseudomonas continha uma única espécie Pseudomonas violaceae que foi descrita como uma espécie móvel graças a único flagelo polar (Migula, 1900). De fato a Pseudomonas violaceae (hoje, Chromobacterium violaceum) é
móvel graças a um flagelo polar e a 1, 2, 3 ou 4 flagelos laterais. Ele incluiu no gênero Pseudomonas, bactérias possuidoras de cílio monotríquio ou multitríquios na
espécie Pseudomonas pyocyaneae (hoje, Pseudomonas aeruginosa) (Ibid). Posteriormente, o gênero Pseudomonas incluiu um grande número de espécies (294 espécies são citadas na 8 ª Edição do “Bergey's Manual of Determinative Bacteriology"). Ele é constituído de bastonetes Gram negativos, móveis (cílio polar) ou imóveis e com metabolismo oxidativo (Palleroni, 2005)
P. aeruginosa pertence à família Pseudomonadaceae (PalleroniI, 1973), caracteriza-se como bastonete Gram-negativo reto ou ligeiramente curvo, aeróbio
estrito, podendo ser observado como células isoladas, aos pares, ou em cadeias
curtas, revelando mobilidade através de flagelo polar monotríqueo (Pollack, 1995).
A pioverdina e a piocianina são pigmentos fluorescentes difusíveis no meio de cultura produzidos por este microrganismo. Algumas cepas produzem um pigmento
avermelhado (piorrubina) ou preto (piomelanina) (Ibid.).
É um dos microrganismos mais ubiquitários, pois é encontrado no solo, na
água, nos vegetais causando patologias (Franco; Landgraf, 2003), nos animais,
nos alimentos (Forsythe, 2002), no esgoto, no intestino dos mamíferos, nos fluidos
de infusão, desinfetantes, cosméticos (Balows et al, 1991) e nos mais diversos
7
ambientes hospitalares, incluindo equipamentos médicos e farmacêuticos. Um
estudo identificou a presença desse microrganismo nas águas das torneiras de
uma unidade de terapia intensiva (Trauttman et al, 2001). Devido a sua natureza
ubíqua, sua habilidade de sobreviver em condições adversas e a afinidade por
ambientes úmidos, Pseudomonas aeruginosa é comumente encontrado no
ambiente hospitalar, sendo um dos patógenos mais importantes, especialmente
em unidades de pacientes queimados e
imunocomprometidos (Mokaddas;
Sanyal, 1999).
Um estudo envolvendo um surto de bacteriemia em um Centro de
Hemodiálise de um hospital de Campinas, São Paulo, Brasil (Pisani et al, 2000)
identificou a presença da P. aeruginosa em 80% das amostras de água coletadas
em diferentes pontos do sistema de hemodiálise e das amostras dos pacientes
dialisados. Infecções causadas por esse microrganismo são de difícil tratamento
em função da sua virulência, da resistência intrínsica e adquirida aos antibióticos
e,
relativamente,
a
pouca
disponibilidade
de
agentes
antimicrobianos
(Chuanchuen et al, 2002; Zavascki et al 2005). Além disto são particularmente
resistentes aos biocidas (anti-sépticos, desinfetantes, preservantes) (Mac Donnell
& Russell, 1999; Higgins et al, 2001; Stickler, 2004).
Informações sobre os patógenos envolvidos em casos de infecção hospitalar são importantes, e para tal existem sistemas de vigilância para este monitoramento. Em 1996, o sistema National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS),
conduzido pelo programa de infecções hospitalares do Centers for Disease Control and Prevention (CDC), nos Estados Unidos descreveu a P. aeruginosa como a
principal causa de infecção hospitalar dentre todos os patógenos relacionados
com a pneumonia em Unidades de Terapia Intensiva (Richards et al, 1999). A P.
aeruginosa aparece ainda, como o 4º agente de infecção de sítio cirúrgico, o 5º de
infecções hospitalares em geral e o 6º de infecções da corrente sangüínea
(NNISS, 1996).
Na América Latina, o sistema SENTRY – Programa de Vigilância
Epidemiológica e de Resistência Antimicrobiana , fornece dados sobre a
ocorrência de P. aeruginosa em infecções hospitalares, tendo sido este o
8
microrganismo mais freqüentemente detectado entre os patógenos bacterianos de
pacientes com pneumonia, internados em 10 centros médicos de seis países da
América Latina (Sade et al, 1998). O SENTRY reportou, no tocante à sensibilidade
antimicrobiana, uma reduzida sensibilidade à ceftazidima, que tendo apresentado
em 1997, um percentual de 66.6, em 2001 passou a 59,5 %. Quanto às
fluoroquinonas, apenas 50 a 60% das amostras se mostraram sensíveis assim
como para os aminoglicosídios; 62,1 % dos isolados foram sensíveis à amicacina
e 55% à gentamicina. Um fato preocupante foi a diminuída sensibilidade ao
imipenem (69,8%), antibiótico de ultima geração com amplo espectro de atividade
antibacteriana, muitas vezes utilizado, como última alternativa terapêutica, em
casos considerados extremos (Trabulsi & Althertun, 2004).
Um estudo epidemiológico realizado em Hospital Universitário da cidade do
Rio de Janeiro mostrou que dentre as 24 espécies bacterianas identificadas nos
casos de infecção hospitalar (agosto de 1995 a julho de 1997), a P. aeruginosa foi
o segundo agente mais predominante com uma freqüência de 18,5% no total dos
isolados clínicos, sendo superado apenas pelo Staphylococcus aureus de freqüência igual a 21,0% (Aseni et al, 2000).
A patogenicidade dos bastonetes Gram negativos não fermentadores
depende da aderência a células hospedeiras, produção de polissacarídeos
(alginato), toxinas extracelulares, resistência aos fatores bactericidas do soro e
presença de lipopolissacarídeo de parede celular (endotoxina) (Arnow & Flaherty,
1996). As fímbrias ou Pili que se estendem a partir da superfície celular são
responsáveis pela aderência da bactéria aos receptores do gangliosídeo GM-1,
que estão presentes na superfície das células epiteliais do hospedeiro (Irvin et al,
1989). Dentre os fatores de virulência extracelulares, que facilitam o rompimento
da integridade epitelial, podem ser citadas as elastases, protease alcalina,
fosfolipase C, neuraminidase, exoenzima S, lectina e as proteases como
hemolisinas e exotoxinas (Jaffar-Bandjee et al, 1995).
A resistência natural e adquirida da P. aeruginosa aos diversos
antibacterianos de uso comum deve-se: à produção de uma ß-lactamase
cromossomial, à impermeabilidade da membrana, à capacidade de colonizar
9
superficies em forma de biofilme, à presença de sistemas de efluxo e à aquisição
de plasmídios de resistência transferidos por processo de transdução e
conjugação. Todos esses fatores, que podem ser expressos de forma individual ou
combinados, fazem com que poucos antibióticos sejam eficientes. Recentemente,
tem-se dado importância ao aparecimento de ß-lactamase de amplo espectro de
atividade, bem como o surgimento de carbapenemases que degradam o imipenem
e/ou meropenem, que são antibiòticos do grupo dos carbapênicos, que teriam a
propriedade de inativar as ß-lactases. Embora restrito a alguns países, no Brasil,
já têm sido reportados casos esporádicos, como é o caso do estudo desenvolvido
por Santos Filho et al (2001) em amostras de P. aeruginosa na capital do estado
da Paraíba (2001) e ainda o estudo desenvolvido na cidade de Uberlândia, Minas
Gerais por Cezario et al (2005).
1.5. Identificação Fenotípica
Técnicas fenotípicas são definidas como técnicas que analisam as características expressas pelos microrganismos, ou seja, que resultam da expressão de
genes que podem sofrer variações, baseados em mudanças nas condições de
crescimento, fase de crescimento e mutação espontânea (Tenover, 1995). Para
realizar as análises de identificação vários métodos clássicos têm sido empregados, destacando-se a biotipagem, sorotipagem, fagotipagem, tipagem de piocinas,
perfis de resistência a antimicrobianos, entre outras técnicas fenotípicas (Arbeit,
1995; Tenover et al,1995; Lipuma, 1998).
Para a classificação da espécie P. aeruginosa, devem ser consideradas algumas características metabólicas. Ela é um microrganismo não fermentador de
carboidratos, é produtora de citocromo-oxidase, utiliza o nitrato em substituição ao
oxigênio como aceptor final de elétrons (portanto é anaeuróbico facultativo) produzindo também arginina-dehidrolase e ornitina-descarboxilase. Porém alternativamente, é capaz de utilizar outras fontes de carbono, como o acetato, por exemplo.
Pode crescer rapidamente nos meios mais simples de cultura numa ampla faixa
10
de temperaturas (4°C a 42°C), em face à sua versatilidade nos requerimentos nutricionais e energéticos. Cresce formando colônias iridescentes irregulares. Outra
importante característica é produção de odor adocicado de frutas (semelhante a
uvas ou milho), produto de uma aminoacetona liberado pelo microrganismo (Trabulsi & Althertun, 2004).
A P. aeruginosa é facilmente reconhecida nos meios de isolamento primário
com base na sua morfologia colonial característica com colônias que é geralmente
plana e espalhada com bordas irregulares e brilho metálico (associado com autólise da colônia). Podem apresentar outras morfologias, incluindo lisas, mucóides e
anãs (pequenas colônias variantes). Podem apresentar certas variações no fenótipo, uma vez que isolados sem atividade oxidativa têm sido reportados ocasionalmente, no entanto, eles exibem outras características típicas (Blonder-Hill et al,
2007). Terapias com agentes antimicrobianos que afetam a síntese protéica podem causar o aparecimento de fenótipos aberrantes. Isolados mucóides, como os
freqüentemente encontrados em pacientes com fibrose cística, podem sofrer várias mudanças fenotípicas, incluindo crescimento lento, perda de mobilidade e perda da produção de pigmento (Ibid).
Ainda como característica importante é a formação em meio de cultura líquido e sólido, de uma camada de aspecto mucóide denominada “slime”, que é um
elemento essencial na formação de biofilmes (Trabulsi & Althertun, 2004).
1.6. Identificação Molecular
Os métodos microbiológicos tradicionais baseados em características
fenotípicas,
como
propriedades
morfológicas,
fisiológicas
e
bioquímicas,
governaram por décadas a taxonomia microbiana e forneceram informação
descritiva para a estruturação de diversos taxa bacterianos.
Com o advento da taxonomia numérica (Sneath & Sokal, 1962) e o
surgimento da computação, dados fenotípicos começaram a ser analisados por
coeficientes numéricos que expressam similaridade entre linhagens com o auxílio
11
de um computador. Nos últimos 40 anos, com o desenvolvimento nas áreas de
química, biologia molecular, estatística e informática, a taxonomia de procariotos
sofreu profundas alterações na direção de um sistema que refletisse as relações
evolutivas entre os organismos aproximando a classificação microbiana o melhor
possível da realidade biológica.
Busch & Nitschko (1999) relataram que as metodologias que
envolvem
ácidos
nucléicos
foram
reconhecidas
como
ferramentas
para
identificação de microrganismos por oferecerem resultados rápidos, precisos e
reprodutíveis quando comparados aos métodos baseados nas características
fenotípicas. Uma das principais estratégias de identificação bacteriana consiste,
na análise do gene codificador da subunidade 16S ribossomal. A amplificação pela
reação em cadeia pela polimerase (PCR) desse gene oferece a possibilidade de
identificação bacteriana através de um único par de iniciadores, específicos para
regiões conservadas do rDNA (Drancourt, 2000). Este método pode implementar e
concluir a identificação bacteriana fenotípica, por ser um gene de distribuição
universal entre as bactérias e por apresentar regiões variáveis espécie específicas
(Weisburg et al, 1991). Esta abordagem tem sido extensivamente adotada, e
possui atualmente um dos maiores bancos de dados, o que possibilita a
identificação de um grande número de organismos (Van de Peer et al, 1996).
Embora tenha sido bastante utilizado por muitos laboratórios, sua
implementação requer um investimento inicial alto envolvendo a aquisição de
equipamentos sofisticados e reagentes caros, o que limita sua ampla utilização
(De Boer; Beumer, 1999).
1.7. Estação de Tratamento de Esgotos do Complexo hospitalar Lourenço
Jorge/ Leila Diniz
O Hospital Municipal Lourenço Jorge, que tem perfil de grande emergência
possui 258 leitos, distribuídos entre os setores de cirurgia geral, bucomaxilofacial,
e ortopediatraumatologia; clinica geral, neonatologia e de AIDS, UTI adulto,
12
unidade intermediária neonatal, unidade de isolamento, unidade intermediária, UTI
neonatal, obstetrícia clinica e cirúrgica, pediatria clinica, tisiologia e psiquiatria. A
Maternidade Leila Diniz, por sua vez, possui 105 leitos distribuídos nos setores de
cirurgia geral e ginecológica, clinica geral e neonatologia, UTI neonatal, unidade
intermediária neonatal, obstetrícia clínica e cirúrgica. As duas unidades totalizam
363 leitos (Cadastro Nacional Estabelecimentos de Saúde - CNESNet-MS, 2004).
A Estação de Tratamento de Esgotos do complexo Lourenço Jorge-Leila
Diniz realiza o tratamento classificado como terciário, ou seja, além de realizar a
fase primária e secundária, completa o tratamento com uma fase terciária que, no
caso específico desta estação, se trata da adição de um processo químico.
Na fase de tratamento primário, os dejetos do complexo HLJ/MLD chegam
por canalizações, passivamente por efeito gravitacional, à estação de tratamento e
são direcionados a um poço situado abaixo do nível da edificação, onde ocorre a
remoção, através de grades, dos sólidos grosseiros e da areia, para que sejam
protegidas as demais unidades de tratamento, além dos dispositivos de transporte
(bombas e tubulações) e os corpos receptores. Neste poço, cujas mensurações
permitem o acesso das equipes de inspeção e operação da unidade, o afluente
percorre por calhas (abertas), e por uma em especial, calha Parshall, onde é
medida, por períodos pré-determinados, a vazão do líquido. Com o auxílio de
bombas de recalque, a massa líquida é transferida para tanques de aeração, onde
é injetado, por um período pré-determinado, oxigênio puro em grande quantidade
para que seja estimulada a multiplicação da flora bacteriana aeróbica, iniciando-se
a fase de tratamento secundário. Nessa fase há uma intensa multiplicação
bacteriana com a síntese da matéria orgânica. Após a fase em que é feita a
degradação biológica, os sólidos produzidos são depositados no fundo dos
tanques formando o lodo (lodo primário), a parte líquida é dirigida aos tanques de
decantação e o sobrenadante flui vagarosamente pelos decantadores e destes
para os tanques de esgoto tratado. No fundo dos tanques de decantação também
há formação de um lodo que juntamente com o lodo primário, retornam ao tanque
de aeração para mais uma vez refazer o ciclo e ter melhor rendimento do efluente.
13
O esgoto tratado é então encaminhado a um tanque de passagem de
dimensões menores que os anteriores, localizado na área externa à estação onde
é adicionado, por gotejamento, Hipoclorito de sódio, que é a fase terciária de
tratamento. A quantidade do Hipoclorito é calculada de acordo com a vazão de
saída do efluente e provém de uma “bomba dosadora”, instalada no núcleo central
de operações da estação de tratamento. O efluente clorado, ainda percorre um
trecho composto por chicanas que servem para misturar o liquido e é então
incorporado à bacia lagunar da região. O lodo resultante de todo o processo de
tratamento é estocado e retirado periodicamente por caminhões-tanque, sendo o
destino final, as indústrias de fertilizantes.
Conforme abordado, o descarte dos efluentes hospitalares, por exigência
legal, deverá sofrer tratamento prévio, com a finalidade de minimizar a contaminação dos corpos receptores e evitar o descumprimento das leis ambientais e o comprometimento da saúde pública. Este novo estudo propõe a avaliação da eficiência desse tratamento através da detecção e monitoramento de Pseudomonas aeruginosa nas diferentes etapas de uma planta de tratamento de esgoto de hospitalar, com objetivo de colaborar para o aprimoramento dos serviços de vigilância
ambiental e epidemiológica, e da prevenção de doenças advindas dos recursos hídricos.
14
2. Objetivos
2.1. Objetivo geral
Avaliar a eficiência de uma planta de tratamento de esgoto hospitalar através da detecção e caracterização da Pseudomonas aeruginosa em uma Unidade
de Saúde do Município do Rio de Janeiro
2.2. Objetivos Específicos
•
Realizar a coleta de amostras em seis pontos da estação de tratamento de
esgoto hospitalar, no complexo do Hospital Municipal Lourenço Jorge e
Maternidade Leila Diniz, Rio de Janeiro;
•
Realizar o cultivo e o isolamento de cepas de P. aeruginosa em meio de
cultura seletivo;
•
Identificar os isolados do meio seletivo por meio de provas bioquímicas
convencionais;
•
Realizar identificação molecular do gênero Pseudomonas e da espécie
Pseudomonas aeruginosa, pela reação em cadeia pela polimerase do gene
16S rRNA, através de iniciadores específicos;
•
Analisar a susceptibilidade das cepas de P. aeruginosa isoladas frente a
representantes de algumas classes de antibióticos;
•
Avaliar o comportamento microbiológico da P. aeruginosa nas diferentes
etapas do tratamento do efluente;
•
Avaliar a eficiência da estação com objetivo de alertar para o aprimoramento
dos serviços de vigilância ambiental e epidemiológica e a prevenção de
doenças advindas dos recursos hídricos.
15
3. Materiais e Métodos
3.1. Local de Estudo:
Hospital Municipal Lourenço Jorge e Maternidade Leila Diniz, na Barra da
Tijuca:
Possuem um total de 360 leitos e 1800 funcionários. Neles são realizados
cerca de 30 mil atendimentos mensais e são lavadas 300 kg de roupa por dia. A
estação de tratamento que atende as duas unidades tem capacidade para tratar
220 metros cúbicos de esgoto por dia, evitando que ele seja despejado sem tratamento nos rios da região (Figura 1 A e 1B).
A
A
B
B
Figura 1: Vista panorâmica da estação de Tratamento (A, B).
16
3.2. Coleta:
Foram coletadas 6 amostras correspondentes a cada uma das etapas da
estação de tratamento : amostra 1 - ETE 1 (chegada do esgoto); amostra 2 - ETE
2 (tanque de aeração); amostra 3 - ETE 3 (tanque de decantação); amostra 4 ETE
- 4 (sedimento tanque de decantação), amostra 5 - ETE 5 (esgoto tratado) e
amostra 6 - ETE 5c (esgoto tratado e clorado). As amostras foram coletadas em
frascos estéreis e mantidas no gelo e transportadas ao laboratório em recipiente
isotérmico.
3.3 Identificação Fenotípica
3.3.1. Condições de cultivo:
As amostras coletadas foram semeadas em caldo nutriente, ágar nutriente
e ágar cetrimide, incubados por 24h a 37°C (Anexo1). Os microrganismos de
referência foram cultivados nas condições e meios de cultivo recomendados pela
ATCC( American Type Culture Collection).
3.3.2. Identificação:
Todas as colônias isoladas foram submetidas à coloração de Gram e às
provas bioquímicas convencionais: OF glicose, xilose, manitol, lactose, lisina,
arginina, ornitina descarboxilase, gelatina, SIM, incubação a 42°C, oxidase e
catalase (Anexo 1).
17
3.4. Identificação Molecular
3.4.1. Extração do DNA genômico:
Após o crescimento das colônias suspeitas nas condições estabelecidas, o
DNA genômico foi extraído e purificado segundo o Appendix D: Purification of
Genomic DNA from Gram-Negative Bactéria do Dnaeasy Tissue Kit (Qiagen). Uma
alça bacteriológica do crescimento bacteriano foi ressuspendida no tampão
indicado e seguiram-se todos os procedimentos de acordo com as instruções do
fabricante.
3.4.2. Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR):
A mistura para o PCR teve um volume total de 50 µl por reação, contendo
os seguintes reagentes: iniciadores para o gênero Pseudomonas: PA-GS-F 5’GACGGGTGAGTAATGCCTA e PA-GS-R CACTGGTGTTCCTTCCTATA, iniciadores para P. aeruginosa PA-SS-F 5’-GGGGATCTTCGACCTCA-3’ e PA-SS-R 5’TCCTTAGAGTGCCACCCG-3’, (50 pmol cada) (Spilker et al., 2004); 5,0 µl de 10x
PCR Buffer (500mM KCl, 100mM Tris HCl [pH 9.0]); 200µM (cada) dATP, dCTP,
dGTP e dTTP; 1U Taq polimerase, 2mM MgCl2 e água deionizada q.s.p 50 µ l. A
esta mistura foi adicionado ~30 ng do DNA a ser analisado e a amplificação ocorreu nas seguintes condições: desnaturação inicial a 95°C por 2 minutos; 25 ciclos:
94°C por 20 segundos, 55°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 1 minuto, uma
extensão adicional a 72°C por 7 minutos. Os produtos do PCR foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose, a 1.5% (p/v) em tampão TBE 0,5 X; o gel foi revelado com brometo de etídio (3 mg/ml), analisado e documentado pelo sistema de
video documentação "ImageMaster VDS" (Pharmacia).
18
3.5. Preservação dos isolados
Logo após o isolamento, as cepas foram preservadas em glicerol 20% e
estocadas a – 20°C. Após as identificações fenotípica e molecular, os isolados
foram preservados por liofilização e armazenados na Coleção de Microrganismos
do INCQS/FIOCRUZ (Anexo1).
3.6. Avaliação da susceptibilidade aos antibióticos
A avaliação da susceptibilidade aos antibióticos foi realizada de acordo com
o Método de Difusão de discos em ágar de Kirby-Bauer modificado segundo o
CLSI (Clinical and Laboratory Standard Institute – 2005). Os antibióticos
escolhidos, segundo o CLSI, foram: cefepime (30 µg); imipeném (10 µg);
aztreonam (30 µg); gentamicina (10 µg); ciprofloxacina (5 µg) e norfloxacina (10
µg); O controle da qualidade dos discos de antibióticos foi realizado frente à P.
aeruginosa INCQS 00099, lote 1107099 (ATCC 27853) .
4. Resultados
4.1. Cultivo e Isolamento de Pseudomonas aeruginosa:
Foram coletadas amostras em seis diferentes pontos da estação de
tratamento assim definidas; ponto 1 – esgoto da saída do hospital, ponto 2 –
tanque de aeração, ponto 3 – tanque de decantação, ponto 4 – lodo, ponto 5 –
efluente tratado, e ponto 5C - efluente tratado e clorado. As amostras
correspondentes aos 6 pontos da estação de tratamento, que passaram a ser
denominadas 1 ETE , 2 ETE , 3 ETE , 4 ETE , 5 ETE e 5c ETE, foram semeadas
em ágar nutriente e ágar cetrimide e apresentaram crescimento após 24h de
incubação. Para prosseguimento das análises foram utilizados os crescimentos
bacterianos do ágar cetrimide, por ser o meio de cultura seletivo para a P.
aeruginosa. A amostra da etapa 1, correspondente ao esgoto antes da entrada na
19
estação, apresentou colônias brancas e de cor creme, no ágar nutriente, e
ausência total de crescimento no ágar cetrimide. Ao contrário, as amostras das
outras 5 etapas apresentaram coloração que variou do amarelo claro ao verde
intenso. (Figura 2). O crescimento bacteriano em caldo nutriente, da etapa 1 ETE,
foi inoculado no meio de cultura líquido letheen, onde apresentou crescimento
após 72h de incubação. Este crescimento foi semeado em agar cetrimide,
resultando em um crescimento amarelado. (Figura 3)
Figura 2: Crescimento bacteriano em Ágar Cetrimide. 1. 1 ETE; 2. 2 ETE; 3. 3 ETE; 4. 4 ETE; 5. 5
ETE e 5c. 5c ETE.
A
B
Figura 3: Crescimento bacteriano A. Caldo Nutriente; B. Caldo Letheen
20
4.2. Caracterização Fenotípica dos isolados:
A partir do cultivo em ágar cetrimide, foram isoladas um total de 25 colônias
das 6 diferentes etapas da estação de tratamento. Inicialmente, essas colônias
foram submetidas à Coloração de Gram e apresentaram células Gram negativas
na forma de pequenos bastonetes. Posteriormente os isolados foram submetidos
às provas bioquímicas (Tabela 1). A figura 4 mostra o gráfico correspondente às
porcentagens de positividade frente aos testes realizados.
De acordo com os resultados das provas bioquímicas 14 cepas (56%)
foram identificadas como P. aeruginosa: 1 (ETE 1), 2 (ETE 2), 2 (ETE 3), 2 (ETE
4), 2 (ETE 5) e 5 (ETE 5c).
TABELA I – Resultados das Provas Bioquímicas
Tabela 1. Resultados das Provas Bioquímicas. OF - oxidação/fermentação; SIM - H2S/ Indol/
Mobilidade.
21
Figura 4. Resultados das Provas bioquímicas. SIM (S – Sulforeto, I – Indol, M – Motilidade)
22
4.3. Caracterização Molecular dos isolados:
A especificidade dos iniciadores para o gênero Pseudomonas e para a
espécie aeruginosa foi demonstrada pelas reações da PCR frente a 8 espécies do
gênero Pseudomonas : P aeruginosa INCQS 00311, P. aeruginosa INCQS 00025,
P.aeruginosa INCQS 00026, P. alcaligenes INCQS 00069, P. fluorescens INCQS
00077, P. putida INCQS 00113, P. stutzeri INCQS 00520 e Stenotrophomonas
maltophilia INCQS 00103. Todas as espécies analisadas apresentaram fragmento
de 600 bp correspondente ao gênero Pseudomonas, a Escherichia coli INCQS
00310 não apresentou amplificação (Figura 5A). Em relação à espécie, as três P.
aeruginosa de referência utilizadas apresentaram fragmento de 956 bp
correspondente a P. aeruginosa e as cepas de espécies diferentes não
apresentaram amplificação (Figura 5B)
A
bp
PM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1.500
600
Figura 5A. Especificidade dos iniciadores para o gênero Pseudomonas. PM. peso molecular 100
bp; 1. P aeruginosa INCQS 00031; 2. P. aeruginosa INCQS 00025; 3. P.aeruginosa INCQS 00026;
4. P. alcaligenes INCQS 00069; 5. P. fluorescens INCQS 00077; 6. P. putida INCQS 00113; 7. P.
stutzeri INCQS 00520; 8. Stenotrophomonas maltophilia INCQS 00103; 9. H2O.
23
B
bp
PM
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1.500
600
Figura 5B. Especificidade dos iniciadores para P.aeruginosa. PM. peso molecular 100 bp; 1. P
aeruginosa INCQS 00031; 2. P. aeruginosa INCQS 00025; 3. P.aeruginosa INCQS 00026; 4. P.
alcaligenes INCQS 00069; 5. P. fluorescens INCQS 00077; 6. P. putida INCQS 00113; 7. P.
stutzeri INCQS 00520; 8. Stenotrophomonas maltophilia INCQS 00103.
Ponto de coleta 1 ETE : Foram isoladas 7 colônias do ponto 1 ETE, sendo que 1
delas foi obtida após cultivo no caldo letheen. O isolado 1 ETE F1 e o 1 ETE F2
apresentaram fragmento de 600 bp na PCR relativa ao gênero Pseudomonas,
porém não apresentaram o fragmento de 1000 bp na PCR relativa a espécie
aeruginosa, os isolados 1ETE E, 1ETE F e 1ETE A não apresentaram nenhum
fragmento nas duas reações e foram considerados negativos para o gênero
Pseudomonas e para a espécie P. aeruginosa, enquanto que o 1 ETE E1
apresentou fragmentos de 600 e 1000 bp correspondentes ao gênero
Pseudomonas e a espécie aeruginosa respectivamente (Figura 6).
24
1500
pb
Gênero Pseudomonas
PM 1
9
PM
7
Erro! Indicador não definido.P.
aeruginosa
1
8
2
3
2
4
5
3
6
4
7
8 9
5
6
9
1500
600
PM
PM111 222 333 444 555666 777 888 9 99
PM
9
600
Figura 6. PCR dos isolados do ponto 1ETE. Parte Superior: gênero Pseudomonas; Parte
inferior: P. aeruginosa. PM. Peso Molecular 100 bp; 1. P. aeruginosa; INCQS 00031; 2. 1 ETE F1 ;
3. 1 ETE F2; 4. 1 ETE E; 5. 1 ETE F; 6. 1 ETE A; 7. 1ETE A; 8. 1 ETE E1; 9. H2O.
2 ETE - os 2 isolados do ponto 2 ETE apresentaram os fragmentos de 618 e
956(?) bp correspondentes ao gênero Pseudomonas e a espécie aeruginosa
respectivamente (Figura 7).
3 ETE - dos 7 isolados do ponto 3 ETE, os isolados 3 ETE B1, B2, E, C e D
apresentaram
amplificação
para
o
gênero
Pseudomonas,
porém
não
apresentaram amplificação para a espécie aeruginosa; 3 ETE F e A apresentaram
fragmentos de 618 e 956 bp correspondentes ao gênero Pseudomonas e a
espécie aeruginosa respectivamente (Figura 7).
25
4 ETE - Os 2 isolados do ponto 4 ETE apresentaram amplificações tanto para o
gênero Pseudomonas como para a espécie e foram consideradas P. aeruginosa
(Figura 7).
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Gênero Pseudomonas
1500 600 -
PM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
P. aeruginosa
1500 600 -
Figura 7. PCR dos isolados dos pontos 2 ETE, 3 ETE e 4 ETE. Parte Superior: gênero
Pseudomonas; Parte inferior: PM. Peso molecular 100 bp; 1. P. aeruginosa INCQS 00031; 2. 3
ETE B1; 3. 3 ETE B2; 4. 3 ETE E; 5. 3 ETE C; 6. 3 ETE D; 7. 3 ETE F; 8. 3 ETE A; 9. 2 ETE A; 10.
2 ETE B; 11. 4 ETE A; 12. 4 ETE B; 13. H2O.
5 ETE - os 2 isolados do ponto 5 ETE também apresentaram os fragmentos
correspondentes ao gênero Pseudomonas e à espécie aeruginosa
(Figura 8).
5c ETE - 5c ETE A e B não apresentaram fragmentos correspondentes ao gênero
Pseudomonas e à espécie aeruginosa, 5c ETE E e F apresentaram
fragmentos de 618 e 956 bp correspondentes ao gênero Pseudomonas e
a espécie aeruginosa respectivamente e 5c ETE C
apresentou
fragmento para o gênero Pseudomonas (Figura 8).
26
PM
Gênero Pseudomonas
1
2
3
4
5
PM 1
2
3
4
5
6
7
8
9
7
8
9
1500 600 -
6
1500 -
P. aeruginosa
600 -
Figura 8. PCR dos isolados do ponto 5 e 5c ETE. Parte Superior: gênero Pseudomonas; Parte
inferior: P. aeruginosa. PM. Peso Molecular 100 bp; 1. P. aeruginosa INCQS 00031; 2. 5 ETE A ;
3. 5 ETE B; 4. 5c ETE A; 5. 5c ETE B ; 6. 5c ETE C; 7. 5c ETE E; 8. 5 ETE F; 9. H2O.
Dos 25 isolados, 5 isolados (20%) não apresentaram amplificação em
nenhuma das duas reações e foram consideradas negativas para o gênero
Pseudomonas e para a espécie P. aeruginosa., 9 isolados (36%) apresentaram
amplificação para o gênero Pseudomonas, porém não apresentaram amplificação
para a espécie aeruginosa, sendo assim consideradas positivas para o gênero
Pseudomonas. 11 isolados (44%) apresentaram amplificações tanto para o gênero
Pseudomonas como para a espécie aeruginosa e foram consideradas P.
aeruginosa (Figura 9).
27
Figura 9. Resultado da identificação molecular dos isolados.
4.4. Avaliação da susceptibilidade aos antibióticos
Foram selecionados aleatoriamente 5 isolados, certificados como P.
aeruginosa, para a realização da avaliação da susceptibilidade aos antibióticos.
Os selecionados foram: 2 ETE A, 3 ETE A, 3 ETE F, 4 ETE B e 5c ETE F,
além da P. aeruginosa INCQS 00099. Nas análises de susceptibilidade aos
antimicrobianos: 60% (2 ETE A, 3 ETE A, 3 ETE F ) dos isolados foram
sensíveis aos 6 antibióticos analisados; 20% (4 ETE B) foi resistente a
todos os anibióticos e 20% (5c ETE F) foi resistente a 1 antibiótico (gentamicina).
(Tabela 2).
28
Tabela 2. Susceptibilidade aos antimicrobianos. NOR. norfloxacina (10 µg); GEN. gentamicina (10
µg); CIP. ciprofloxacina (5 µg); CPM. cefepime (30 µg); IMP. imipeném (10 µg); ATM. aztreonam
(30 µg).
5. Discussão
A Lei Orgânica da Saúde define a Vigilância Sanitária como “um conjunto
de ações capaz de eliminar, diminuir, ou prevenir riscos à saúde e de intervir nos
problemas sanitários decorrentes do meio ambiente, da produção e circulação de
bens e da prestação de serviços de interesse da saúde” (ANVISA, 1998). Desta
forma, verificamos a importância da Vigilância Sanitária no controle das infecções
hospitalares, e em continuidade a isto, sua interferência na preservação do meio
ambiente no tocante à manutenção da qualidade dos recursos hídricos.
Atualmente, há uma necessidade de controlar o meio ambiente, em face do
aumento da carga poluidora nos corpos hídricos e das condições favoráveis, no
Brasil, à propagação de doenças de veiculação hídrica, sendo crescente o interesse nas pesquisas que são focadas na avaliação das características dos efluentes gerados pelos estabelecimentos assistenciais de saúde e na avaliação dos
impactos reais que o descarte inadequado ou o não tratamento dos efluentes poderiam causar no ecossistema aquático. .
Rutala (1997) relata que o descarte dos RSS nos Estados Unidos tem representado um dos maiores problemas de saúde pública nos últimos dez anos. O
problema veio à tona quando os RSS começaram a aparecer, entre 1987 e 1988,
em algumas praias de estados costeiros, e percebeu-se que estes poderiam ser
uma fonte de transmissão do HIV – Human Immunodeficiency Virus.
Os hospitais norte-americanos segundo Daschner (1997) contribuem muito
para a existência da poluição ambiental. Aproximadamente 6.700 toneladas de resíduos são geradas diariamente, representando um montante de 6,9 Kg de resíduos por paciente /dia em unidades de terapia intensiva.
29
Um estudo envolvendo a diversidade de Enterococcus spp em duas
estações de tratamento de esgoto em um hospital público de Antofagasta, Chile,
demonstrou a presença de 5 diferentes espécies E. faecalis (65%), E. faecium
(14%), E. hirae (13%), E. durans (6%) e E. gallinarum (2%). Os isolados
apresentaram alta resistência à gentamicina e
resistência
à
ampicilina,
cloranfenicol
,
estreptomicina, moderada
tetraciclina
e
ciprofloxacina
e
suscetibilidade moderada a vancomicina. O estudo conclui que o esgoto pode ser
uma via importante na transmissão destes organismos (Silva, 2005).
No Brasil, a eficiência de uma planta de tratamento de esgoto hospitalar foi
analisada e demonstrou a presença de Klebsiella pneumoniae multirresistente no
efluente
tratado.
A
planta
foi
considerada
ineficiente
na
remoção
de
microrganismos patogênicos, permitindo a disseminação dessas bactérias no
ambiente (Prado 2007).
Na América Latina, o sistema SENTRY - Programa de Vigilância de Resistência - fornece dados sobre a ocorrência de P. aeruginosa em infecções hospitalares, tendo sido este o microrganismo mais freqüentemente detectado entre os
patógenos bacterianos de pacientes com pneumonia internados em 10 centros
médicos de seis países da América Latina (Sader , 1998).
A alta incidência da P. aeruginosa pode ser atribuída a diversas propriedades como fácil adaptação às condições ambientais de nutrição, temperatura e umidade e sua capacidade de receber e transmitir fatores de resistência a antimicrobianos (Fávero,1971). A possibilidade de sobreviver por períodos prolongados em
ambientes úmidos, permite que equipamentos e utensílios hospitalares – respiradores e nebulizadores – bem como, soluções anti-sépticas, desinfetantes e de uso
terapêutico, lhe sirvam de reservatório (Grundmann, 1995; Moolenar, 2000). Este
conjunto de fatores propicia a infecção de pacientes internados, principalmente em
Unidades de Terapia Intensiva onde os indivíduos muitas vezes encontram-se
imunodeprimidos e submetidos a procedimentos invasivos (Ibid.).
Stover e colaboradores (2000) seqüenciaram o genoma completo da linhagem da P. aeruginosa PAO1; com 6,3 milhões de pares de base, é o maior genoma bacteriano já seqüenciado. Ela contém a maior proporção de genes regulató30
rios observados em um genoma bacteriano e um grande número de genes envolvidos no catabolismo, transporte e efluxo de compostos orgânicos, bem como
quatro sistemas potencialmente quimiotáticos. Os autores propõem que o tamanho e a complexidade do genoma de P.aeruginosa reflitam uma adaptação evolucionária permitindo-lhe crescer em diversos ambientes e resistir ao efeito de
uma variedade de substâncias antimicrobianas.
Um fato intrigante neste estudo foi a ausência de cepas sugestivas de P.
aeruginosa na amostra nº 1 do efluente hospitalar (ponto 1 ETE) que, pode ser
justificada pela provável inibição do crescimento bacteriano pela ação de
desinfetantes e outros produtos químicos utilizados na unidade de saúde, que
naquele ponto inicial da estação de tratamento, ainda se encontravam ativos. Essa
hipótese foi posteriormente verificada através da presença de crescimento
bacteriano em meio de cultivo cuja formulação inibe alguns princípios destes
produtos, propiciando o metabolismo microbiano. Embora essa inibição possa ser
considerada como fator positivo no ambiente hospitalar, o mesmo não ocorre em
relação ao ambiente, pois demonstramos que as cepas possivelmente inibidas
tornam-se ativas ao longo das etapas do tratamento e são lançadas no meio
ambiente, comprometendo a saúde pública. Muitos estudos têm apontado que
efluentes hospitalares possuem altas concentrações de substâncias tóxicas, tais
como antibióticos, agentes citostáticos, metais pesados, desinfetantes, hormônios
e microrganismos resistentes que podem disseminar no meio ambiente
(Kummerer, 2001; Reinthaler et al, 2003; Schwartz et al, 2003; Emanuel, 2005).
A preocupação com a disseminação de bactérias resistentes aos
antibióticos se refere, sobretudo, à infecção hospitalar. Estudos realizados em
hospitais brasileiros têm detectado altas taxas de infecção hospitalar no país
(Gales et al, 1997; De Morais et al, 2000; Villas Boas et al, 2004; Silva & Oliveira,
2006).
As análises de identificação de P. aeruginosa tem sido realizadas por métodos bioquímicos convencionais e pelo uso de kits comerciais baseados no padrão
da utilização de fonte de carbono, e em características morfológicas e fisiológicas.
Entretanto, os dados para Pseudomonas utilizados nestes sistemas são baseados
31
principalmente em amostras de isolados clínicos e não em amostras ambientais,
restringindo inclusive, em alguns casos, a sua utilização. O uso destes Kits requer
habilidade, pois apresenta limitação significativa para a distinção de amostras de
uma mesma espécie (Medeiros, 2008).
Nas
últimas
décadas,
verificou-se
aumento
significativo
no
desenvolvimento de técnicas moleculares para a detecção, identificação e
caracterização de microrganismos. Dentre essas, destaca-se a reação em cadeia
da polimerase (polymerase chain reaction –PCR) (Bôer et al, 1999). Esta técnica,
apresenta, conforme o observado por Busch e Nitschko (1999), diversas
vantagens em relação aos métodos convencionais, como maior poder de
tipificação e discriminação, maior rapidez, bom limite de detecção, maior
seletividade, especificidade, entre outras. Essas observações foram comprovadas
em nossas análises, enquanto a metodologia convencional resultou na
identificação de 14 P. aeruginosa a PCR do gene 16S rRNA confirmou a
identificação de 11 cepas, Além de mais rápida, a PCR demonstrou maior
especificidade na identificação de P. aeruginosa.
A P. aeruginosa em face à sua grande resistência aos antibióticos e aos
desinfetantes vem nas últimas décadas adquirindo grande importância como
agente de infecções hospitalares (COSTAS et al, 1992), sendo um dos principais
microrganismos recuperados de efluentes hospitalares (FUENTEFRIA, 2008).
Existem relatos destes organismos crescendo em detergentes, anti-sépticos e
sabões (COSTAS et al, 1992; DUBOIS et al, 2001).
Dentre os onze isolados de P.aeruginosa, cinco foram aleatoriamente
selecionados e avaliados em relação à sensibilidade a diferentes classes de
antibióticos. Embora alguns isolados tenham apresentado sensibilidade aos
antibióticos testados, verificamos a presença de uma cepa resistente a todos os
antimicrobianos. Estes resultados reafirmam a preocupação com a disseminação
de patógenos multirresistentes no ambiente.
Os antimicrobianos podem ser classificados segundo sua estrutura química
(derivados de aminoácidos, derivados de açúcares, derivados de acetatos e
propionatos e outro), tipos de microrganismos sobre os quais atuam ou ainda,
32
efeito provocado no microrganismo (MANRIQUE, 1997). Em relação ao
mecanismo de ação dos antimicrobianos, descreve-se a interferência na síntese
da parede celular; alterações na permeabilidade da membrana citoplasmática;
interferência na replicação do cromossomo; interferência na síntese protéica (Ibid).
A constatação da presença de P. aeruginosa no efluente hospitalar reforça
a necessidade de conscientização das autoridades governamentais e dirigentes
hospitalares em relação ao cumprimento da legislação, proporcionando o tratamento adequado dos esgotos hospitalares, evitando a contaminação dos corpos
receptores por organismos patogênicos.
11. Conclusões
De acordo com os resultados apresentados foi possível concluir que:
•
Todas as amostras coletadas nas diferentes etapas da estação de trata-
mento do esgoto, dos hospitais Lourenço Jorge e Leila Diniz, apresentaram
crescimento microbiano em meio de cultura;
•
A interpretação das provas bioquímicas demonstrou a presença de 14
cepas de P. aeruginosa;
•
A reação da PCR do gene 16S rRNA resultou na identificação de 11 cepas
de P. aeruginosa, demonstrando maior especificidade e tipificação que a identificação fenotípica;
•
O isolamento de uma cepa de P. aeruginosa após cultivo no meio letheen
sugere que os uso de desinfetantes, antibióticos e outros biocidas, pode estar
exercendo uma atividade bacteriostática nas cepas de P. aeruginosa do efluente hospitalar;
•
Foi constatada a presença de P. aeruginosa em todas as amostras analisa-
das, inclusive naquela correspondente à fase terciária do tratamento;
33
•
O resultado das análises de susceptibilidade aos antimicrobianos, demons-
trou a presença de cepas sensíveis e uma multirresistente, refletindo a diversidade dos isolados analisados;
•
O sistema de tratamento analisado necessita de uma avaliação no sentido
de ajustar os parâmetros necessários para uma maior eficiência na eliminação
de patógenos multirresistentes.
A presença de microrganismos resistentes no efluente tratado reforça a
necessidade do desenvolvimento de procedimentos para monitorar os resíduos
hospitalares como forma de controle da saúde ambiental dos ecossistemas. Esperamos com este estudo, colaborar para o desenvolvimento de tais procedimentos
que,
certamente,
irão
contribuir
para
o
desenho
de
ações
preventivas aos impactos desses efluentes no ambiente e na saúde pública.
34
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46
8. ANEXO 1
1. Meios de Cultura e Condições de Cultivo
1.1. Caldo Nutriente
Na Cl........................5g
Peptona....................10g
Extrato de carne ......3g
H2O q.s.p.................1000 ml
.Pesar cada um dos reagentes separadamente;
.Despejar os reagentes no Erlenmeyer maior solubilizando-os com água sob a
placa de agitação e aquecimento, até o volume final de 1000 ml;
.Ajustar o pH para 7.4 com NaOH ou HCl;
.Autoclavar durante 15 minutos a 121º C.
Inoculação e cultivo
.O meio líquido foi distribuído no volume de 5 ml em tubos de ensaio 18x160mm;
.A inoculação e semeadura foram realizadas em capela de fluxo laminar.
1.2. Agar Nutriente
Na Cl........................5g
Peptona....................10g
Extrato de carne ......3g
Agar.........................20g
47
H2O q.s.p.................1000 ml
.Pesar cada um dos reagentes separadamente;
.Despejar os reagentes no Erlenmeyer maior solubilizando-os com água sob a
placa de agitação e aquecimento, até o volume final de 1000 ml;
.Solubilizar por último o agar, caso faça meio sólido;
.Ajustar o pH para 7.4 com NaOH ou HCl;
.Autoclavar durante 15 minutos a 121º C.
Inoculação e cultivo
.O meio sólido foi distribuído no volume de 20 ml em placas de Petri;
.A inoculação e semeadura foram realizadas em capela de fluxo laminar.
1.3. Agar Cetrimide
Peptona ------------------------------- 20g
Cloreto de magnésio ---------------- 14g
Sulfato de potássio ------------------ 10g
Cetrimide ----------------------------- 0,3g
Agar ----------------------------------- 13,6g
Glicerol ------------------------------- 10ml
Água destilada ----------------------- 1000ml
.Suspender os componentes em água destilada.
.Dissolver por aquecimento à ebulição.
.Autoclavar a 121o C por 15 minutos.
.Resfriar a 50o C.
.Distribuir em placas de Petri (15x100mm). pH final = 7,1 +/- 0,2.
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1.4. Agar Muller Hinton
Oxoid Código: CM337B Lote: 579019
Preparado de acordo com as instruções do fabricante. pH final = 7,1 +/- 0,2.
Distribuído 20 ml em cada placa de Petri (15x100mm).
1.5. Caldo Letheen
DifcoTM Ref 268110 Lote 5089519
Preparado de acordo com as instruções do fabricante. pH final = 7,1 +/- 0,2.
Distribuído 10 ml em tubos 18X 160mm.
2. Provas Bioquímicas
2.1. Método de Gram:
Reagentes:
Cristal Violeta (Seg. Hucker)
Solução A:
Cristal Violeta ----------------------------- 2g
Álcool etílico ------------------------------ 20ml
Solução B:
Oxalato de amônio ------------------------ 0,8g
Água destilada ----------------------------- 80ml
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.Misturar soluções A e B;
.Deixar em repouso por 24 horas;
.Filtrar em papel wathmamn no 1;
.Armazenar em frasco escuro.
Solução de Lugol:
Iodo ------------------------------ 1g
Iodeto de potássio -------------- 2g
Água destilada ------------------ 300ml
.Macerar o iodo e o iodeto de potássio em um gral;
.Adicionar água aos poucos e misturar bem.Completar o volume com água
destilada; Armazenar em frasco escuro.
Descorante:
Agente intermediário: álcool - acetona (álcool etílico 95%, 100ml; acetona, 100ml)
Fucsina Fenicada: (Seg. Ziehl)
Fucsina básica -------------------------- 1g
Álcool etílico 95% --------------------- 10ml
Fenol fundido --------------------------- 5g
Água destilada -------------------------- 100ml
. Dissolver em um gral a fucsina no álcool;
. Juntar aos poucos o fenol;
. Homogeneizar até completa dissolução;
. Juntar a água aos poucos, lavando o gral;
. Filtrar após 24 h de repouso.
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Procedimento:
⋅Esfregaço bem homogêneo fixado ao calor;
⋅Corar durante 1 minuto com solução de cristal violeta;
⋅Escorrer o corante e cobrir durante 1 minuto com solução de lugol;
⋅Lavar em água corrente;
⋅Diferenciar com um dos descorantes descritos acima;
⋅Lavar em água corrente;
⋅Contrastar durante trinta segundos com fucsina de Ziehl;
⋅Lavar em água corrente;
⋅Secar a preparação (entre duas tiras de papel de filtro).
Interpretação:
Microrganismos Gram positivos: cor roxa
Microrganismos Gram negativos: cor vermelha
2.3. Glicose OF/ Xilose/ Manitol/ Lactose
Difco TM OF Basal Médium Ref: 268820 Lote: 5081491
Preparado de acordo com as instruções do fabricante. Após a autoclavação foi
acrescentado
1%
do
carboidrato
desejado
que
deverá
ser
preparado
separadamente e esterilizado por filtração (membrana 0,22 µm)
Inoculação e Incubação:
Inocular 2 tubos com a cultura pura de 18-24h de incubação;
Semear por picada central atingindo até uma profundidade de 1 cm;
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Acrescentar 0,5 ml de óleo mineral estéril em um dos tubos inoculados
Interpretação:
Teste positivo: Oxidador: tubo aberto: amarelo; Tubo fechado: inalterado (verde)
Fermentador: Tubos fechado e aberto: amarelo
.
2.4. Meio de SIM (Sulfeto Indol Mobilidade Agar)
Extrato de carne ----------------------------- 3g
Bacto peptona ------------------------------- 10g
Trypticase ----------------------------------- 10g
Sulfato ferroso amoniacal ----------------- 0,2g
Tiosulfato de sódio ------------------------ 0,2g
Cloreto de sódio ---------------------------- 5g
Agar ------------------------------------------ 4g
Água destilada ------------------------------ 1000ml
Suspender os componentes em água destilada;
Dissolver por aquecimento à ebulição;
Distribuir em tubos 13x100mm, em volumes de 4 a 5ml;
Esterilizar a 121oC por 15 minutos;
Esfriar e estocar em refrigerador (4-10oC); pH final = 7,2 ± 0,2.
Inoculação e Incubação:
Inocular com cultura pura de 18-24h de incubação;
Semear por picada central atingindo até uma profundidade de 1 cm;
Retirar a agulha seguindo a linha de entrada;
Incubar a 35-37o C por 24 -48h.
52
Interpretação:
Teste positivo: qualquer escurecimento no meio, ao longo da linha de inoculação
ou por todo o interior do meio.
Teste negativo: meio permanece na cor original.
2.5. Hidrólise da Gelatina
Meio de gelatina nutriente
Extrato de carne ----------------------------- 3g
Peptona --------------------------------------- 5g
Gelatina -------------------------------------- 120g
Água destilada ------------------------------ 1000ml
.Aquecer a água (50o C), colocar a gelatina e deixar descansar por 15 a 30
minutos;
.Adicionar o extrato de carne e a peptona;
.Aquecer novamente para dissolver todos os componentes;
.Ajustar o pH a 6,8-7,1;
.Distribuir em porções de 4 a 5ml por tubo com tampa de rosca (frouxas);
.Autoclavar a 121o C por 15 minutos;
.Resfriar na posição horizontal, apertar as tampas e estocar em refrigerador (4-10o
C);
.pH final = 6,8  0,2.
Inoculação e Incubação:
53
. Cultura pura com 18-24h de incubação; semear por picada, com uma agulha de
fio níquel-cromo, até uma profundidade de 1cm;
. Foi utilizado inoculo pesado;
. Foi a colocado um tubo controle, sem inoculo para correr paralelo com a amostra
a ser testada;
. Após o inoculo os tubos foram incubados a 35o C, por 7 dias;
. No final de cada período de 24h, os tubos foram colocados no refrigerador por
2h, e analisados quanto a liquefação da gelatina;
Interpretação:
Teste positivo: Organismo teste: meio liquefeito
Teste negativo: Organismo teste: meio continua sólido e deve ser reincubado por
um período adicional de até 14 dias.
2.6. Lisina /Arginina /Ornitina
Meio Básico de Moeller
Peptona ---------------------------------------- 5g
Extrato de carne ------------------------------ 5g
Púrpura de bromocresol --------------------- 0,1g
Vermelho de cresol -------------------------- 0,005g
Piridoxal -------------------------------------- 0,5g
Glicose (dextrose) --------------------------- 0,5g
Água destilada ------------------------------- 1000ml
Indicador de pH
Púrpura de bromocresol:
Ácido - cor amarela, pH = 5,2.
54
Alcalino - cor púrpura, pH = 6,8.
. Suspender os componentes em água destilada;
. Dissolver por aquecimento à ebulição;
. Distribuir o meio pronto em quatro porções iguais;
. Adicionar a três delas os aminoácidos (L - lisina, L - arginina e L - ornitina), na
concentração final de 1%, deixando uma como controle;
. Homogeneizar as soluções e distribuir em porções de 3 ml em tubos 13x100 mm;
. Autoclavar a 121o C por 10 minutos;
. Estocar em refrigerador (4-10o C); pH final = 6,0.
Inoculação e Incubação:
. Cultura pura com 18-24h de incubação;
. Foi realizado inóculo leve, com alça de fio níquel-cromo;
. O tubo controle (sem aminoácido) foi inoculado em cada bateria de aminoácido
sob investigação;
. Todos os tubos, inclusive o controle, foram cobertos com 0,5ml de óleo mineral
estéril;
.Os tubos foram Incubados por 48h a 37o C, e examinandos diariamente;
Interpretação:
Fermentadores da Glicose
Teste positivo: cor púrpura
Teste negativo: cor amarela
Tubo controle: cor amarela (glicose fermentada)
Não Fermentadores da Glicose
Teste positivo: cor púrpura escuro
Teste negativo: cor púrpura clara a cinza azulado
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Tubo controle: cor púrpura clara a cinza azulado
2.7. Agar Mac Conkey
Peptona ----------------------------- 17g
Protease peptona ------------------ 3g
Lactose ----------------------------- 10g
Sais de bile ------------------------ 1,5g
Cloreto de sódio ------------------ 5g
Agar -------------------------------- 13,5g
Vermelho neutro ----------------- 0,03g
Cristal violeta --------------------- 0,001g
Água destilada -------------------- 1000ml
.Suspender os componentes em água destilada.
.Dissolver por aquecimento à ebulição.
.Autoclavar a 121o C por 15 minutos.
.Resfriar a 50o C.
.Distribuir em placas de Petri (15x100mm). pH final = 7,1 +/- 0,2.
Inoculação e Incubação
Inóculo em estria, a partir de uma cultura pura de 18-24h.
Incubar a 35-37o C por 24-48h.
Interpretação:
Lactose negativa (Lac -): Colônias transparentes
Lactose positiva (Lac +): Colônias escuras
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2.8. Oxidase
Reagente de Kovacs
Dicloridrato de tetrametil-p-fenilenodiamina ---------------------- 1g
Água destilada ---------------------------------------------------------- 100ml
. Dissolver 1g do reagente em menos de 100ml de água destilada.
. Aquecer para solubilizar.
. Transferir para um balão volumétrico e q.s.p. 100ml.
. Deixar descansar por 15 minutos antes de usar.
. Estocar em frasco escuro para evitar exposição à luz.
Procedimento indireto (Reagente de Kovacs)
. Colocar um pedaço de papel de filtro Whatman em uma placa de Petri.
. Adicionar 2 a 3 gotas do reagente de Kovacs no centro do papel.
. Colocar uma alça de platina cheia com uma colônia suspeita sobre o papel
impregnado de reagente.
. Observar a reação
Interpretação
Teste positivo: cor rosa a púrpura em 10 segundos.
Teste negativo: ausência de troca de cor.
2.9. Crescimento 42°C
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Caldo Nutriente
Na Cl........................5g
Peptona....................10g
Extrato de carne ......3g
H2O q.s.p.................1000 ml
. Pesar cada um dos reagentes separadamente;
. Despejar os reagentes no Erlenmeyer maior solubilizando-os com água sob a
placa de agitação e aquecimento, até o volume final de 1000 ml;
. Ajustar o pH para 7.4 com NaOH ou HCl;
. Autoclavar durante 15 minutos a 121º C.
Inoculação e cultivo
O meio líquido foi distribuído no volume de 5 ml em tubos de ensaio 18x160mm;
A inoculação e semeadura foram realizadas em capela de fluxo laminar e
incubada a 42°C por 24 horas.
3. Métodos de Preservação
3.1. Liofilização (Freeze-drying)
As culturas foram semeadas em meios de cultivo apropriados e após a
incubação o crescimento foi coberto com "Skim Milk" (DIFCO 0001) a 10%,
retirado com o auxílio de uma alça de "Drigalsky" e transferido para ampolas
estranguladas, em volumes de 0.3 a 0.5 ml por ampola. Após a distribuição da
suspensão em ampolas, estas foram colocadas em um banho de gelo seco e
etanol absoluto, para congelamento rápido, onde a temperatura do banho chega a
-70oC. Em 30 - 60 segundos de imersão no banho gelado, a suspensão estava
58
congelada e foi transferida para um freezer a -70°C, onde permaneceu por 24-48
horas, antes de ser liofilizada. Este congelamento rápido é importante para evitar a
formação de cristais de gelo entre as membranas dos microrganismos, o que
poderia inviabilizar as células, levando a ruptura de estruturas vitais das células.
Após 72h a -70°C as ampolas foram colocadas no liofilizador com o objetivo
de retirar toda água da amostra por meio do congelamento à vácuo. O processo
acontece por conta da pressão que o vácuo ocasiona no material fazendo com
que haja a passagem da água em estado sólido para o estado gasoso. Após 18h,
as ampolas foram transferidas para uma “árvore”, que permite a finalização do
processo e o fechamento das ampolas com auxílio de um maçarico de chama
dupla. Foram liofilizadas 10 ampolas de cada microrganismo.
4. Preparo de Géis e Tampões
4.1.Tampão
Tris-Borato – EDTA 10X (TBE 10X)
TRIS base ____________________________________________121.1g
Acido Bórico __________________________________________61.8 g
NA2 EDTA ___________________________________________ 3.7g
Água MilliQ esterilizada q.s.p.____________________________ 1000 mL
Tampão TBE 0.5X
Tampão TBE 10X ____________________________________125 μL
Água MilliQ esterilizada q.s.p.___________________________2500 mL
4.2. Gel de agarose (Sambrook, 1989).
.Agarose (sigma A-0169)--------------1,5 g
.TBE (0,5 x)------------------------------100 ml
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.Brometo de etídio (10mg/ml)---------3,0 μl
5 Esquema da Estação de tratamento de Esgotos das Unidades de Saúde:
Hospital Municipal Lourenço Jorge e Maternidade Leila Diniz
HLJ
MLD
Solução
Esgoto de Hipoclorito
Tratado
de Sódio
(ET)
O2
LODO
2º
Tratamento secundário
biológico
Pontos de coleta
3º
ET. +
NaOCl
Cloração
Rede
Pluvial
60