ufvjm inaê mariê de araújo silva efeito do déficit hídrico sobr

UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E
MUCURI - UFVJM
INAÊ MARIÊ DE ARAÚJO SILVA
EFEITO DO DÉFICIT HÍDRICO SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA
E MORFOFISIOLOGIA EM Eucalyptus spp.
DIAMANTINA – MG
2013
INAÊ MARIÊ DE ARAÚJO SILVA
EFEITO DO DÉFICIT HÍDRICO SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA
E MORFOFISIOLOGIA EM Eucalyptus spp.
Dissertação apresentada à
Universidade Federal dos Vales
do Jequitinhonha e Mucuri,
como parte das exigências do
programa de Pós-Graduação
em Ciência Florestal, área de
concentração Ciência Florestal,
para obtenção do título de
“Mestre”.
Orientador: Prof. Dr. Marcelo Luiz de Laia - UFVJM
DIAMANTINA – MG
2013
EFEITO DO DÉFICIT HÍDRICO SOBRE A EXPRESSÃO GÊNICA
E MORFOFISIOLOGIA EM Eucalyptus spp.
INAÊ MARIÊ DE ARAÚJO SILVA
Dissertação apresentada à
Universidade Federal dos Vales
do Jequitinhonha e Mucuri,
como parte das exigências do
programa de Pós-Graduação
em Ciência Florestal, área de
concentração Ciência Florestal,
para obtenção do título de
“Mestre”.
APROVADA em 02 de agosto de 2013
Dr. Edival Ângelo Valverde Zauza – SUZANO
Prof. Dr. Israel Marinho Pereira – UFVJM
Profª. Drª. Miranda Titon – UFVJM
Prof. Dr. Marcelo Luiz de Laia – UFVJM
Presidente
DIAMANTINA – MG
2013
Ao meu senhor Jesus Cristo,
que na figura da minha familia e amigos
me proporcionou o amor verdadeiro!
Dedico
Aos meus queridos pais Anselmo e Diva,
A minha irmã Morgana,
A minha vovó Joaninha
e ao meu bem Rodrigo.
Ofereço
AGRADECIMENTOS
Agradeço sobretudo a DEUS, que traçou o meu caminho de Sergipe a Minhas
Gerais, me concedendo todos os dias o livre arbítrio de poder voltar. E novamente a
ELE, pela vida e exatamente por tudo, eu agradeço.
A minha mainha Diva e meu painho Anselmo, pela crença em mim, pelo amor
incondicional, pela paciência e espera, pelo colo e aconchego.
A meu anjo Morgana, que em forma de gente veio me proteger nesse mundo.
A minha vovó Joaninha, que mesmo com a memória longe me conserva no seu
coração.
A meu vovô Raimundo, que lá do céu vigia meus passos.
Ao meu amor Rodrigo, meu amigo, companheiro, incentivador, meu grande
bem.
Ao meu grande amigo Michael, pela amizade abençoada e pela ajuda
imensurável.
A meu velho amigo Audenis, pelo grande auxílio e incentivo.
As minhas companheiras de labuta, Kamilla e Marcele, pelas angústias e
gargalhadas compartilhadas no viveiro e laboratório.
A Ana Flávia que me auxíliou como ninguém.
Ao Programa de Pós-Graduação em Ciência Florestal, por ter me acolhido e me
dado os fundamentos necessários para que eu pudesse me tornar uma Mestra. Agradeço
a CAPES pelo fomento a minha pesquisa através da bolsa de auxílio à pesquisa, a qual
foi fundamental para que a minha dedicação fosse exclusivamente do meu mestrado.
Ao meu orientador Marcelo Laia, pela confiança depositada, dedicação no
enriquecimento de meus conhecimentos e exemplo profissional.
E por fim, a todos aqueles que lá na betoneira ou mesmo em pensamento,
contribuíram para a realização de mais este sonho, proporcionando a mim a sensação de
mais uma missão cumprida.
MUITO OBRIGADA!!!!!
i
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS ..............................................................................................................iii
LISTA DE TABELAS .............................................................................................................. vi
RESUMO.................................................................................................................................vii
ABSTRACT ...........................................................................................................................viii
1 INTRODUÇÃO GERAL ...................................................................................................... 1
CAPÍTULO 1: Comportamento morfofisiológico de dois clones de Eucalyptus spp. sob
déficit hídrico ............................................................................................................................ 6
1
INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 6
2
MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 12
2.1
Época e ambiente experimental ..................................................................................... 12
2.2
Material vegetal, recipientes e substratos utilizados ..................................................... 12
2.3
Aplicação dos tratamentos e delineamento estatístico .................................................. 14
2.4
Características avaliadas ................................................................................................ 15
2.4.1
Características morfológicas ...................................................................................... 15
2.4.2
Características ecofisiológicas ................................................................................... 17
2.5
3
Análises estatísticas ....................................................................................................... 20
RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 21
3.1
Sintomatologia ............................................................................................................... 21
3.2
Características morfológicas ......................................................................................... 22
3.2.1
Altura das plantas e diâmetro de coleto ..................................................................... 22
3.2.2
Matéria seca, relação matéria seca raiz/parte aérea e razão da massa foliar .......... 26
3.2.3
Área foliar, área foliar específica e razão de área foliar ........................................... 32
3.3
Características ecofisiológicas ....................................................................................... 38
3.3.1
Condutância estomática e transpiração..................................................................... 38
3.3.2
Fotossíntese e concentração interna de CO2 ............................................................. 41
3.3.3
Eficiência no uso da água .......................................................................................... 45
3.3.4
Temperatura foliar...................................................................................................... 47
3.3.5
Índice de clorofila total .............................................................................................. 48
3.3.6
Variáveis da clorofila a .............................................................................................. 51
4
CONCLUSÕES ........................................................................................................ 60
ii
CAPÍTULO 2: Construção de uma Biblioteca Subtrativa contendo genes
diferencialmente expressos em Eucalyptus spp. sob estresse hídrico ................................. 61
1
INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 61
2
MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 64
2.1
Coleta e acondicionamento do material vegetal ............................................................ 64
2.2
Extração e Purificação de RNA total ............................................................................. 64
2.2.1
Extração de RNA total ................................................................................................ 64
2.2.2
Purificação de RNA total ............................................................................................ 65
2.3
Hibridação Subtrativa Supressiva .................................................................................. 65
2.3.1
Síntese dos cDNAs tester e driver ............................................................................. 66
2.3.2
Digestão dos cDNAs com a enzima de restrição RsaI ............................................... 67
2.3.3
Ligação dos adaptadores ao cDNA tester digerido com RsaI ................................... 68
2.3.4
Hibridações ................................................................................................................. 68
2.4
3
Amplificações por PCR ................................................................................................. 69
RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 71
3.1
Extração e Purificação de RNA total ............................................................................. 71
3.2
Produção da biblioteca subtrativa .................................................................................. 73
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 74
APÊNDICE ............................................................................................................................. 95
APÊNDICE A.......................................................................................................................... 96
APÊNDICE B.......................................................................................................................... 97
iii
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1.1 - Mudas clonais dos genótipos 224 (Eucalyptus grandis vs. Eucalyptus urophylla)
e 953 (Eucalyptus camaldulensis vs. Eucalyptus grandis) submetidas a um período de
aclimatação (30 dias), em casa de sombra. ............................................................................... 13
Figura 1.2 - Visão geral do experimento após aleatorização das mudas clonais dos genótipos
224 (Eucalyptus grandis vs. Eucalyptus urophylla) e 953 (Eucalyptus camaldulensis vs.
Eucalyptus grandis) e início do teste. ....................................................................................... 15
Figura 1.3 - Procedimentos para determinação da matéria seca total e de cada parte da planta.
Visão geral (A). Retirada das folhas (B). Corte do caule (C). Raízes a serem lavadas (D). .... 17
Figura 1.4 - Clorofilômetro utilizado para determinação do índice de clorofila total (IFC). .. 18
Figura 1.5 - Determinação das variáveis da fluorescência da clorofila a. Fluorímetro PAM
portátil (JUNIOR-PAM, Heinz Walz GmbH) (A). Obtenção das variáveis da fluorescência da
clorofila a (B). .......................................................................................................................... 19
Figura 1.6 - Determinação das variáveis de trocas gasosas. Medidor portátil de fotossíntese,
do tipo analisador infravermelho de gases (Infrared Gas Analyser) (IRGA) (A). Avaliação das
variáveis de trocas gasosas (B). ................................................................................................ 20
Figura 1.7 - Sintomatologia verificada em mudas clonais dos genótipos 224 (Eucalyptus
grandis vs. Eucalyptus urophylla) e 953 (Eucalyptus camaldulensis vs. Eucalyptus grandis)
no 6° (1) e 15° (2) dias após a diferenciação dos tratamentos hídricos. Clone 224 não irrigado
(A), clone 224 irrigado (B), clone 953 não irrigado (C) e clone 953 irrigado (D). .................. 22
Figura 1.8 - Média de altura de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto. Segundo o
teste F, as médias diferem estatisticamente a 5% de significância. .......................................... 23
Figura 1.9 - Diâmetro de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto. Segundo o teste F, as
médias diferem estatisticamente a 5% de significância............................................................ 24
Figura 1.10 - Diâmetro de plantas jovens de eucalipto, sob dois regimes hídricos, em
diferentes tempos de avaliação. ................................................................................................ 25
Figura 1.11 - Matéria seca total (folha, caule e raiz) de plantas jovens de eucalipto
(comparação entre genótipos). Segundo o teste F, as médias diferem estatisticamente a 5% de
significância. ............................................................................................................................. 27
Figura 1.12 - Matéria seca total (folha, caule e raiz) de plantas jovens de eucalipto
(comparação entre regimes hídricos). Segundo o teste F, as médias diferem estatisticamente a
5% de significância. .................................................................................................................. 28
iv
Figura 1.13 - Relação matéria seca de raiz e parte aérea (MSR/PA) de plantas de dois
genótipos de eucalipto, sob dois regimes hídricos. Letras minúsculas diferentes indicam
diferença significativa entre os genótipos em cada regime hídrico e letras maiúsculas
diferentes indicam diferença significativa entre os regimes hídricos, dentro de cada genótipo,
pelo teste F a 5% de significância. ........................................................................................... 29
Figura 1.14 - Razão de massa foliar (RMF) de dois genótipos de eucalipto, sob dois regimes
hídricos. Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os genótipos em
cada regime hídrico e letras maiúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os
regimes hídricos, dentro de cada genótipo, pelo teste F a 5% de significância........................ 31
Figura 1.15 - Área foliar de plantas jovens de eucalipto, sob dois regimes hídricos, em
diferentes tempos de avaliação. ................................................................................................ 32
Figura 1.16 - Área foliar de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto, sob dois regimes
hídricos. Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os genótipos em
cada regime hídrico e letras maiúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os
regimes hídricos, dentro de cada genótipo, pelo teste F a 5% de significância........................ 33
Figura 1.17 - Área foliar específica (AFE) de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto,
sob dois regimes hídricos. Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre
os genótipos em cada regime hídrico e letras maiúsculas diferentes indicam diferença
significativa entre os regimes hídricos, dentro de cada genótipo, pelo teste F a 5% de
significância. ............................................................................................................................. 35
Figura 1.18 - Razão de área foliar (RAF) de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto,
sob dois regimes hídricos. Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre
os genótipos em cada regime hídrico e letras maiúsculas diferentes indicam diferença
significativa entre os regimes hídricos, dentro de cada genótipo, pelo teste F a 5% de
significância. ............................................................................................................................. 37
Figura 1.19 - Condutância estomática (Gs) de plantas jovens de eucalipto, sob dois regimes
hídricos. .................................................................................................................................... 38
Figura 1.20 - Transpiração (E) de plantas jovens de eucalipto, sob dois regimes hídricos. .... 40
Figura 1.21 - Fotossíntese (A) de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto, sob dois
regimes hídricos. Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os
genótipos em cada regime hídrico e letras maiúsculas diferentes indicam diferença
significativa entre os regimes hídricos, dentro de cada genótipo, pelo teste F a 5% de
significância. ............................................................................................................................. 41
Figura 1.22 - Concentração interna de CO2 (Ci) de plantas jovens de eucalipto, sob dois
regimes hídricos. ....................................................................................................................... 43
Figura 1.23 -Eficiência no uso da água (EUA) de plantas jovens de eucalipto, sob dois
regimes hídricos. ....................................................................................................................... 46
v
Figura 1.24 - Temperatura foliar (T) de plantas jovens de eucalipto, sob dois regimes
hídricos. .................................................................................................................................... 47
Figura 1.25 - Índice de clorofila total de plantas de clones de eucalipto, sob dois regimes
hídricos, em diferentes tempos de avaliação. ........................................................................... 49
Figura 1.26 - Fluorescência mínima (Fo) de plantas de eucalipto, sob dois regimes hídricos,
em diferentes tempos de avaliação. .......................................................................................... 52
Figura 1.27 -Fluorescência máxima (Fm) de plantas de eucalipto, sob dois regimes hídricos,
em diferentes tempos de avaliação. .......................................................................................... 54
Figura 1.28- Eficiência quântica do FSII, expressa pela razão Fv/Fm, de plantas de eucalipto,
sob dois regimes hídricos, em diferentes tempos de avaliação. ............................................... 56
Figura 1.29 - Eficiência quântica do FSII, expressa pela razão Fv/Fm, de plantas de dois
genótipos de eucalipto, sob dois regimes hídricos. Letras minúsculas diferentes indicam
diferença significativa entre os genótipos em cada regime hídrico e letras maiúsculas
diferentes indicam diferença significativa entre os regimes hídricos, dentro de cada genótipo,
pelo teste F a 5% de significância. ........................................................................................... 57
Figura 1.30 - Eficiência quântica do FSII, expressa pela razão Fv/Fm, de plantas de eucalipto,
sob dois regimes hídricos em diferentes tempos de avaliação. ................................................ 59
Figura 2.1 - Gel de agarose 1% carregado com amostras do genótipo tolerante - clone 953
(T1, T2, T3) e do genótipo sensível - clone 224 (S1, S2, S3) para a verificação da qualidade das
amostras extraídas. A primeira banda estreita corresponde ao DNA genômico e as duas bandas
maiores ao centro correspondem, respectivamente, as subunidades 28S e 18S do rRNA.. ..... 72
Figura 2.2 - Gel de agarose 1% carregado com amostras do genótipo tolerante - clone 953 (T)
e do genótipo sensível - clone 224 (S) para a verificação da qualidade e concentração do
mRNA....................................................................................................................................... 73
vi
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 2.1 - Quantificação das amostras obtidas por espectofotometria ................................. 71
Tabela 1A - Resumo da análise de variância para matéria seca de raiz (MSR), matéria seca de
caule (MSC), matéria seca de folha (MSF) e matéria seca total (MST) de plantas jovens de
dois genótipos de eucalipto, sob dois regimes hídricos. ........................................................... 96
Tabela 2A - Resumo da análise de variância para relação de matéria seca raiz e parte aérea
(MSR/PA), razão de massa foliar (RMF), área foliar específica (AFE) e razão de área foliar
(RAF) de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto, sob dois regimes hídricos. .............. 96
Tabela 3A - Resumo da análise de variância para condutância estomática (Gs), transpiração
(E), fotossíntese (A), concentração interna de CO2 (Ci), eficiência no uso da água (EUA) e
temperatura foliar (T) de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto, sob dois regimes
hídricos. .................................................................................................................................... 96
Tabela 1B - Valores da estatística F e valor-p para altura (H), diâmetro (D), área foliar (Af) e
índice de clorofila total (Ct), fluorescência mínima (Fo), fluorescência máxima (Fm) e
eficiência quântica do FSII (Fv/Fm) de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto, sob dois
regimes hídricos. ....................................................................................................................... 97
vii
RESUMO
SILVA, Inaê Mariê de Araújo: Efeito do déficit hídrico sobre a expressão gênica e
morfofisiologia em Eucalyptus spp., 2013. 97p. (Dissertação - Mestrado em Ciência
Florestal) – Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Diamantina, 2013.
Atualmente, devido as limitações de expansão das tradicionais áreas de plantio de eucalipto,
vários grupos de pesquisa têm buscado estratégias para ampliar as fronteiras florestais
brasileiras. Entretanto, a baixa disponibilidade hídrica dessas regiões fronteiriças tem limitado
o desenvolvimento de alguns genótipos de eucalipto. Á vista disso, objetivou-se: i) avaliar as
respostas morfofisiológicas de dois genótipos de eucalipto contrastantes quanto à suas
capacidades de tolerar o déficit hídrico e ii) construir uma biblioteca gênica diferencial do
genótipo tolerante à seca, de maneira a possibilitar à compreensão dos mecanismos
subjacentes à tolerância ao déficit hídrico do ponto de vista genético-molecular. O
experimento foi conduzido, em casa de vegetação na UFVJM, em Diamantina, MG. As
plantas dos dois genótipos, clones 953 (Eucalyptus camaldulensis vs. Eucalyptus grandis) e
224 (Eucalyptus grandis vs. Eucalyptus urophylla), modelo de tolerância e sensibilidade ao
déficit hídrico, respectivamente, foram aclimatadas em casa de sombra, com irrigação,
durante 30 dias. Após esse período, foram submetidos a dois diferentes regimes hídricos
(irrigado e não irrigado), quando, então, foram avaliados, ao longo do período experimental, o
crescimento em altura e diâmetro, área foliar, índice de clorofila total, variáveis da
fluorescência da clorofila a, variáveis de trocas gasosas, matéria seca de todos os
compartimentos da planta e suas relações derivadas (relação matéria seca raiz e parte aérea,
razão de massa foliar, área foliar específica e razão de área foliar), além da sintomatologia do
estresse. O experimento foi conduzido em um Delineamento Inteiramente Casualizado, em
esquema fatorial 2 (genótipos) x 2 (regimes hídricos), totalizando quatro tratamentos (25
repetições cada). As análises estatísticas foram realizadas mediante análise de variância. Para
o estudo da expressão gênica, concomitantemente a aplicação do estresse hídrico, folhas
foram coletadas, congeladas em N2 líquido e armazenadas a - 80 °C. Em seguida, procedeu-se
com as extrações e purificações do RNA total e, posterior, construção da biblioteca subtrativa.
A deficiência hídrica não limitou o crescimento em altura dos genótipos estudados, embora,
tenha reduzido o diâmetro e a produção de matéria seca total. As demais variáveis
morfofisiológicas e todas as variáveis de trocas gasosas foram negativamente afetadas pelo
déficit hídrico. O clone 224 mostrou-se menos eficiente em termos fotossintéticos e mais
sensível à restrição hídrica para a maioria das variáveis analisadas. Em contrapartida, o 953
apresentou maior tolerância à falta d'água. Possivelmente, área foliar reduzida, aumentos no
teor de clorofila e aparelho fotossintético mais eficiente podem ter sido determinantes nessa
maior tolerância encontrada no clone 953. Essas estratégias, podem, portanto, serem alvos em
programas de seleção de materiais genéticos mais tolerantes à seca. Nesse sentido, a eficiência
quântica do Fotossistema II mostrou-se uma característica a ser considerada num processo de
seleção para tolerância à falta d'água. A biblioteca de cDNA construída permitirá identificar
quais genes estão envolvidos nesse processo de tolerância no genótipo 953. Futuramente,
esses genes candidatos poderão ser transferidos para genótipos de interesse econômico, por
meio de transgenia.
Palavras-chave: Deficiência hídrica; eucalipto; respostas morfofisiológicas; biblioteca
gênica; tolerância.
__________________
* Orientador: Marcelo Luiz de Laia, Dr.- UFVJM.
viii
ABSTRACT
SILVA, Inaê Mariê de Araújo: Effect of water stress on gene expression and
morphophysiology in Eucalyptus spp., 2013. 97p. (Dissertation - Master in Forest Science) Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Diamantina, 2013. *
Currently, due to the limitations of expanding areas traditional of eucalyptus, several research
groups have pursued strategies to expand the boundaries Brazilian forest. However, the low
water availability of these border regions has limited the development of some genotypes of
eucalyptus. Therefore, we aimed to: i) evaluate the morphological and physiological
responses of two contrasting genotypes of eucalyptus as to their ability to tolerate drought and
ii) build a library differential gene genotype drought tolerant, in order to enable the
understanding molecular mechanisms underlying tolerance to water deficit. The experiment
was conducted in a greenhouse at UFVJM in Diamantina, MG. The plants of the two
genotypes, 953 clones (Eucalyptus camaldulensis vs. Eucalyptus grandis) and 224
(Eucalyptus grandis vs Eucalyptus urophylla) model of tolerance and sensitivity to water
stress, respectively, were acclimated in the shade, irrigated for 30 days. After this period,
underwent two different water regimes (irrigated and non-irrigated), when then were
evaluated over the experimental period, the growth in height and diameter, leaf area, total
chlorophyll index, chlorophyll a fluorescence variables, gas exchange variables, dry matter of
all plant parts and their relations derived (shoot/root dry weight ratios, leaf weight ratio,
specific leaf area and leaf area ratio) and the symptoms of stress. The experiment was
conducted in a completely randomized design in a factorial 2 (genotypes) x 2 (water regimes),
totaling four treatments (25 replicates each). Statistical analyzes were performed by analysis
of variance. For the study of gene expression, concomitant application of water stress, leaves
were collected, frozen in liquid N2 and stored at - 80 °C. Then proceeded with the extraction
and purification of total RNA and subsequent construction of the subtractive library. Water
stress did not limit the growth in height of the genotypes studied, although it reduced the
diameter and total dry matter production. The other morphophysiological variables and all gas
exchange variables were negatively affected by drought. Clone 224 was less efficient
photosynthetic and more sensitive to water restriction for most variables. In contrast, the 953
was more tolerant to lack of water. Possibly, reduced leaf area, increases in chlorophyll
content and photosynthetic apparatus more efficient may have been determinant to increase
tolerance found in clone 953. These strategies can be targeted in selection programs of genetic
materials more drought tolerant. In this sense, the quantum efficiency of Photosystem II
showed a characteristic to be considered in the selection process for tolerance to water
shortage. A cDNA library constructed will allow to identify which genes are involved in the
process of tolerance on the genotype 953. In the future, these candidate genes may be
transferred to genotypes of economic interest through transgenesis.
Keywords: Water deficiency; Eucalyptus spp.; morphophysiological responses; gene library;
tolerance.
__________________
*Advisor: Marcelo Luiz de Laia, Dr. - UFVJM.
1
1 INTRODUÇÃO GERAL
O gênero Eucalyptus é nativo da Austrália e de ilhas adjacentes, pertence à divisão
Angiospermae, classe Dicotyledonea, ordem Myrtales, família Myrtaceae e compreende mais
de 600 espécies descritas, com ampla plasticidade genotípica e dispersão mundial (SANTOS;
AUER; GRIGOLETTI JÚNIOR, 2001; FONSECA et al., 2010). O gênero destaca-se como
sendo o mais plantado no mundo, sendo os seus maiores produtores Índia, Brasil, África do
Sul, Portugal, Espanha, China, Uruguai e Chile. As espécies mais cultivadas no mundo são
Eucalyptus grandis, Eucalyptus urophylla, Eucalyptus globulus, Eucalyptus camaldulensis e
E. tereticornis (FONSECA et al., 2010).
No Brasil, o eucalipto foi introduzido, para fins comercias, por volta de 1904, por
Edmundo Navarro de Andrade, com o intuito de atender a demanda crescente de lenha como
fonte energética para as locomotivas a vapor da até então, Companhia Paulista de Estrada de
Ferro, bem como de toras para dormentes das linhas férreas. Nos anos subsequentes, mais
especificamente a partir de 1965, com a Lei dos incentivos fiscais ao reflorestamento, a
eucaliptocultura brasileira ganhou um grande impulso, aumentando significativamente a área
plantada no país (LIMA, 1996; HASSE, 2006; VALVERDE, 2007).
Desde então, esse gênero tem sido extensivamente utilizado em plantios florestais em
função de vários fatores, como o seu rápido crescimento, a versatilidade de propagação, a
fácil adaptabilidade às diferentes condições edáfico-climáticas brasileiras e a alta
produtividade, dentre outros. Essas boas características foram, em grande parte, fruto do
melhoramento genético e do manejo adequados (LIMA, 1996; MORA; GARCIA, 2000;
ANGELI, 2005; ABRAF, 2011; ABREU, 2011).
Nos últimos anos houve uma considerável expansão dos plantios, o que têm suprido
parte da crescente demanda de matéria-prima para a produção de celulose e papel, carvão
vegetal (biomassa energética) para siderurgia, óleos essenciais, madeira sólida para serraria,
postes de eletricidade, lenha, mourões, dormentes, entre outros (LIMA, 1996; ALFENAS et
al., 2004). Além de contribuir com uma parcela importante para a economia nacional,
fornecendo matéria-prima e produtos para a exportação e gerando impostos e empregos, a
eucaliptocultura ainda contribui de maneira direta na esfera ambiental, aliviando a pressão
sobre a vegetação nativa remanescente (LIMA, 1996; SANT'ANNA; FREITAS, 2004;
ABRAF, 2012) e na fixação de carbono, o que tem chamado à atenção do setor privado para o
uso do eucalipto para essa finalidade (ALFENAS et al., 2004; ABRAF, 2012).
2
No Brasil, o eucalipto destaca-se como o gênero florestal mais plantado, representando
mais de 50% da área com florestas exóticas implantadas (ABRAF, 2012). O País lidera o
ranking mundial de produtividade desse gênero, chegando a atingir valores da ordem de 45 60 m³ por hectare (MORA; GARCIA, 2000). O País é o 3º maior produtor mundial de
celulose e o 1º entre os produtores que comercializam celulose no mercado (ABRAF, 2012).
Apesar desse desempenho notável em termos de produtividade do eucalipto e da sua grande
extensão territorial, o Brasil ainda está muito aquém em termos de área plantada,
apresentando menos de 1% do seu território ocupado por florestas plantadas (FRANCO,
2011; RIBEIRO, 2011).
Dada a importância e em função da elevada produtividade e a área plantada, da
crescente demanda interna e externa por produtos florestais e das limitações de crescimento
das tradicionais áreas de plantio (Sul e Sudeste) devido à escassez de terras disponíveis para
plantios e o seu custo elevado quando comparado ao restante do país, vários grupos de
pesquisa têm buscado estratégias para ampliar as fronteiras florestais brasileiras,
principalmente para os estados do Centro-Oeste e Nordeste, os quais desfrutam de grandes
extensões de terras desocupadas ou subutilizadas e com preços atraentes (LEITE, 2011; REIS,
2011).
Em contrapartida, o regime pluviométrico irregular e escasso, associado às altas
temperaturas e elevada evaporação e os diferentes tipos de solos dessas regiões fronteiriças,
podem tornar-se limitantes à produtividade econômica e até mesmo à sobrevivência de
algumas espécies que possam vir a ser introduzidas nessas regiões, o que aumenta os riscos
para o sucesso da atividade florestal. Isso tem levado à pesquisa e ao desenvolvimento de
genótipos tolerantes a essas adversidades, ampliando, dessa forma, as fronteiras do
desenvolvimento tecnológico de florestas plantadas (REIS, 2011). Ademais, a frequência da
ocorrência de eventos de seca tem aumentado de forma significativa na última década,
provavelmente associados às mudanças climáticas (NEPOMUCENO; NEUMAIER; FARIAS,
2012), aumentando, assim, à exigência de genótipos adaptados a essa condição.
Por outro lado, a seleção de genótipos tolerantes à seca pode levar anos, dada as
particularidades do melhoramento clássico florestal. Contudo, a utilização dos genótipos
existentes, já melhorados, porém não adaptados a condições de seca, pode ser viabilizada se
houver uma maneira de torná-los tolerantes a esse estresse. Nesse sentido, a biotecnologia
pode ser uma ferramenta útil ao melhoramento clássico, representando um importante recurso
a ser explorado.
3
Dentro dessa conjuntura, o melhor entendimento sobre a influência do estresse hídrico
no comportamento morfológico, fisiológico e genético-molecular do eucalipto é de grande
importância para garantir a expansão desta cultura com menores riscos, favorecendo a seleção
e o desenvolvimento de material genético capaz de se estabelecer e se desenvolver em
condições de deficiência hídrica no solo.
Segundo Passioura (1996) e Aussenac (2000), a falta de água é uma das limitações
mais importantes ao crescimento das plantas e à produtividade dos ecossistemas ao redor do
mundo. Existe um conflito entre a conservação da água pela planta e a taxa de assimilação de
dióxido de carbono (CO2) para produção de carboidratos (TAIZ; ZEIGER, 2009). Para
resolver esse conflito, a planta desenvolve mecanismos morfofisiológicos, que as conduzem a
economizar água para uso em períodos futuros (MCCREE; FERNÁNDEZ, 1989). Larcher
(2006) ainda afirma que a água é o principal constituinte dos vegetais, logo, uma pequena
redução no teor de água no solo pode afetar de maneira drástica o metabolismo das plantas
(HSIAO; ACEVEDO, 1974; TAIZ; ZAIGER, 2009).
Em eucaliptos, assim como em outras culturas, as respostas ao déficit hídrico são
altamente complexas, dependem da intensidade e duração do déficit, da espécie, do genótipo e
do estádio de desenvolvimento da planta (SANTOS; CARLESSO, 1998; PIMENTEL, 2004;
RODRIGO, 2007; TAIZ; ZEIGER, 2009) e abrangem vários aspectos, incluindo mudanças
morfológicas (altura, diâmetro basal, biomassa total, área foliar, razão entre raiz e parte aérea,
razão entre área foliar e caule e densidade da área foliar) e mudanças fisiológicas (eficiência
no uso da água, potencial osmótico, condutância estomática, taxa de crescimento,
transpiração, fotossíntese, potencial hídrico foliar) (LI; WANG, 2003; MERCHANT et al.,
2007; COOPMAN et al., 2008; PEREIRA et al., 2010). As mudanças morfológicas e
fisiológicas têm uma base genético-molecular, assim como todo e qualquer fenótipo. Deste
modo, genótipos que diferem em termos de tolerância ao déficit hídrico, devem diferir
qualitativa e quantitativamente em expressão gênica. Estas respostas específicas ao déficit
hídrico representam, na realidade, a combinação de vários eventos moleculares prévios, que
foram ativados pela percepção do sinal de estresse (BRAY, 1993). A identificação e a
compreensão de como esses eventos são ativados/desativados e como interagem entre si são
fundamentais no desenvolvimento de novos genótipos comerciais mais tolerantes a períodos
de seca (NEPOMUCENO et al., 2001). Um passo importante para tal fim consiste na
identificação e análise da expressão gênica diferencial entre plantas tolerantes e suscetíveis ao
déficit hídrico. Para isso, a construção de bibliotecas subtrativas supressivas (SSH)
(DIATCHENKO et al. 1996) permite analisar a expressão gênica diferencial entre duas
4
amostras de cDNA. Essas bibliotecas podem ser sequenciadas e os genes presentes no
genótipo tolerante podem ser identificados. Por fim, genes relacionados a tolerância ao déficit
hídrico poderão ser transferidos para genótipos sensíveis, mas, de alto valor comercial.
A SSH tem sido aplicada com sucesso em diferentes gêneros florestais, como pinus
(HIRAO; FUKATSU; WATANABE, 2012; SANTOS; VASCONCELOS, 2012), álamo (BAE
et al., 2010; BAE et al., 2012), carvalho (DERORY et al., 2006; LE PROVOST et al., 2012) e
seringueira (LI et al., 2010; GARCIA et al., 2011). Em Eucalyptus, a técnica foi empregada
com êxito na identificação de genes diferencialmente expressos durante a formação da
madeira (PAUX et al., 2004; FOUCART et al., 2006; RENGEL et al., 2009), bem como na
identificação de genes envolvidos na simbiose com micorrizas (VOIBLET et al., 2001) e de
genes responsivos ao Cylindrocladium quinqueseptatum (FENG et al., 2012).
Vale ressaltar que os mecanismos de tolerância à seca têm sido descritos com detalhes
em nível molecular tanto para culturas anuais quanto perenes, como o Arabidopsis
(LEFEBVRE; KIANI; DURAND-TARDIF, 2009; WILKINS; BRAUTIGAM; CAMPBELL,
2010; HARB; PEREIRA, 2011) e Populus (CARUSO et al., 2008; HAMANISHI et al., 2010;
SONG et al., 2012). No entanto, pouco se sabe sobre as bases moleculares de tolerância à
seca em Eucalyptus.
Em face ao exposto, este trabalho teve como objetivo avaliar o desempenho de dois
genótipos de eucalipto contrastantes quanto às suas capacidades de tolerar ao estresse hídrico.
Visando, dessa forma, a identificação e compreensão dos mecanismos subjacentes à tolerância
à seca, que podem, posteriormente, subsidiar a seleção e desenvolvimento de materiais
genéticos tolerantes a falta d’água via melhoramento florestal e ferramentas biotecnológicas.
Como modelo de tolerância foi selecionado o clone 953 (Eucalyptus camaldulensis vs.
Eucalyptus grandis), híbrido conhecido por combinar rápido crescimento com tolerância à
seca. O clone 224 (Eucalyptus grandis vs. Eucalyptus urophylla) foi adotado como modelo de
genótipo pouco eficiente sob estresse hídrico. A escolha do híbrido 224 deu-se pela
importância que ele exerce no setor florestal brasileiro, sendo os seus clones considerados
ideais para o atendimento do setor industrial, em termos quantitativos e qualitativos,
destacando-se também pela alta capacidade de enraizamento e resistência ao cranco
(FONSECA et al., 2010; PIRES et al., 2011).
Para melhor compreensão do trabalho, esta dissertação está dividida em dois capítulos.
O capítulo I descreve as respostas morfológicas (altura, diâmetro do coleto, área foliar,
matéria seca total, relação entre raiz e parte aérea) e ecofisiológicas (trocas gasosas, eficiência
no uso da água, teor de clorofila, fluorescência da clorofila a) dos dois genótipos de eucalipto
5
quando submetidos a estresse hídrico. O capítulo II apresenta a biblioteca subtrativa com os
genes diferencialmente expressos no genótipo tolerante submetido à falta d’água.
6
CAPÍTULO 1
Comportamento morfofisiológico de dois clones de Eucalyptus spp. sob déficit hídrico
1
INTRODUÇÃO
Com uma participação significativa no Produto Interno Bruto (PIB) nacional e
gerando milhões de empregos (diretos, indiretos e resultantes do efeito-renda), com três
setores em destaque: celulose e papel, carvão vegetal a siderurgia e madeira e móveis, é
inquestionável a importância do setor florestal na economia brasileira. O Brasil detém uma
das mais avançadas tecnologias de florestas plantadas do mundo, tendo o eucalipto como seu
principal componente (PINTO JÚNIOR; AHRENS, 2010). A eucaliptocultura brasileira se
destaca, principalmente, em função do seu rápido crescimento, da sua boa adaptabilidade às
diferentes condições edafo-climáticas e devido à expansão e ao direcionamento de novos
investimentos (ABRAF, 2011; ABREU, 2011).
Apesar da liderança mundial em termos de produtividade do eucalipto, o Brasil ainda
está muito aquém dos atuais líderes mundiais em área de florestas plantadas. A China (77,157
milhões de ha), os Estados Unidos (25,363) e a Rússia (16,991) possuem as maiores áreas
reflorestadas, enquanto o Brasil apresenta menos de 1% do seu território ocupado por
florestas plantadas (FRANCO, 2011; RIBEIRO, 2011). No Brasil, os plantios florestais com
Eucalyptus e Pinus concentram-se, principalmente, nas regiões Sul e Sudeste do país (73,8%),
o que é justificado pela localização das principais unidades industriais dos segmentos de papel
e celulose, painéis de madeira industrializada, siderurgia a carvão vegetal e madeira
mecanicamente processada (ABRAF, 2012).
No entanto, o cenário atual da eucaliptocultura no país tem revelado aumentos
significativos das áreas plantadas nos estados situados nas novas fronteiras do setor (CentroOeste e Nordeste), em detrimento das áreas plantadas nos principais estados produtores
localizados nas regiões Sudeste e Sul do país. Essa expansão para áreas fronteiriças pode ser
justificada, tanto pela dificuldade de aquisição de novas áreas nas regiões tradicionais de
plantio, quanto pela crescente demanda por produtos florestais, como celulose e papel
(ABRAF, 2012).
Por outro lado, a expansão das fronteiras florestais tem se esbarrado em algumas
limitações intrínsecas a essas áreas fronteiriças, principalmente as condições climáticas dessas
regiões, onde o regime pluviométrico irregular e escasso, associado às altas temperaturas e
7
elevada evaporação são fatores limitantes à produtividade e até mesmo à sobrevivência de
algumas espécies que possam vir a ser introduzidas nessas áreas. Portanto, a seleção de
genótipos aptos a regiões mais áridas deve ter lugar de destaque na pesquisa florestal
nacional.
Sendo assim, compreender como o estresse hídrico influencia o comportamento
morfofisiológico do eucalipto é de grande relevância para garantir a expansão desta cultura
sem maiores entraves, favorecendo a seleção e o desenvolvimento de material genético capaz
de se estabelecer e de se desenvolver em condições de deficiência hídrica no solo.
A produtividade das culturas varia consideravelmente e vários são os fatores que
contribuem para isso, entre eles, radiação solar, disponibilidade de água, temperatura e
umidade do ar (PEREIRA; ANGELOCCI; SENTELHAS, 2002). Dentre esses fatores, a
disponibilidade de água merece destaque, uma vez que, todos os processos fisiológicos das
células vegetais são direta ou indiretamente afetados pelo fornecimento de água, sendo
considerada o principal constituinte dos vegetais e o recurso mais limitante para a
produtividade agrícola (TAIZ; ZAIGER, 2009). Logo, uma pequena diminuição na
disponibilidade de água no solo pode causar danos drásticos no metabolismo da planta
(HSIAO; ACEVEDO, 1974; LARCHER, 2006; TAIZ; ZAIGER, 2009), afetando
negativamente o seu crescimento, desenvolvimento e produtividade (SINCLAIR; LUDLOW,
1986; SANTOS; CARLESSO, 1998; CHAVES; FLEXAS; PINHEIRO, 2009).
A água desempenha diversas funções com grande significância fisiológica na planta,
como por exemplo, afeta a viscosidade e a permeabilidade do protoplasma e a atividade das
enzimas envolvidas; afeta a divisão e o crescimento (expansão) celular; é reagente e produto
da atividade fotossintética; é fonte de elétrons, após a ativação da clorofila pela luz para
produzir energia química; é reagente básico nas reações de hidrólise e de ionização; é produto
final da atividade respiratória; é meio de transporte de solutos e gases; influi na turgescência;
participa nos processos de abertura e fechamento dos estômatos; atua na termorregulação e
afeta a translocação de assimilados (KRAMER; BOYER, 1995; CASTRO; KLUGE; PERES,
2005; MARENCO; LOPES, 2005; KERBAUY, 2008; TAIZ; ZAIGER, 2009; VIEIRA et al.,
2010).
Segundo Taiz e Zeiger (2009), o déficit hídrico pode ser definido como todo o
conteúdo de água de um tecido ou célula que está abaixo do conteúdo de água mais alto
exibido no estado de maior hidratação. O seu efeito sobre o vegetal é muito variado e depende
do genótipo, da duração, da intensidade e do estádio de desenvolvimento da planta
8
(KRAMER; BOYER, 1995; BRAY, 1997; SANTOS; CARLESSO, 1998; PIMENTEL, 2004;
RODRIGO, 2007; TAIZ; ZEIGER, 2009).
Três mecanismos podem auxiliar a planta a resistir à deficiência hídrica: 1) retardo da
desidratação (adiamento da diminuição dos valores de potencial hídrico do protoplasma), o
que pode ser conseguido através do aperfeiçoamento da absorção de água (sistemas
radiculares dispersos e profundos) e da capacidade de condução de água (alargamento da área
do sistema vascular e redução da distância de transporte), pela redução da perda de água
(folhas cutinizadas, adequado controle estomático da transpiração) e pelo armazenamento de
água (suculência); 2) tolerância à desidratação (capacidade de manter suas funções mesmo
sob potenciais hídricos baixos), nesse caso específico, a planta depende fortemente de sua
capacidade de ajuste osmótico (mecanismo que facilita um gradiente osmótico favorável para
manutenção do turgor da célula por meio do acúmulo de solutos) (KOPPENAAL et al.,
1991), associada a alterações na elasticidade da parede celular e 3) escape a seca, que engloba
espécies que programam o crescimento e reprodução, de maneira que ambos ocorram em
períodos com suficiente disponibilidade de água (LARCHER, 2006; TAIZ; ZEIGER, 2009).
Conforme Lima (1996), as espécies do gênero Eucalyptus podem diferir em termos de
resistência à seca. Algumas, simplesmente, toleram à seca, suportando potenciais hídricos
bastantes severos, outras, no entanto, não desenvolvem nenhuma capacidade, ou desenvolvem
apenas uma capacidade limitada de controle de transpiração, sendo assim, altamente
vulneráveis à limitação hídrica.
Quando o déficit hídrico apresenta evolução lenta, o seu primeiro efeito biofísico
significante consiste na redução da turgescência celular, caracterizada pela diminuição do
volume celular, contração das células, afrouxamento das suas paredes e o consequente,
murchamento foliar. Esse primeiro efeito compromete o crescimento da planta, uma vez que a
diminuição do turgor afeta diretamente a expansão foliar e alongamento das raízes e controla
a abertura estomática necessária para o influxo de CO2, requerido no processo fotossintético e
no crescimento (GHOLZ, 1990; LARCHER, 2006; TAIZ; ZEIGER, 2009).
A redução da área foliar, por sua vez, diminui a transpiração, conservando, um
suprimento de água limitado no solo por um período mais longo. Em contrapartida, há uma
redução da fotossíntese, já que a mesma é proporcional à área foliar. Quando comparado com
a expansão foliar, o crescimento do caule tem sido menos estudado, mas é bem provável que
ele seja afetado pelas mesmas forças que limitam o crescimento das folhas durante o estresse
(TAIZ; ZEIGER, 2009).
9
Já o déficit hídrico moderado também afeta o desenvolvimento do sistema radicular. A
razão da biomassa de raízes para a parte aérea parece ser influenciada por um balanço
funcional entre absorção de água pelas raízes e fotossíntese pela parte aérea, sendo este
balanço funcional modificado caso o suprimento hídrico decresça (TAIZ; ZEIGER, 2009).
Reduções da expansão foliar, altura e diâmetro, assim como modificações na relação
raiz/parte aérea, com consequente diminuição da biomassa total da planta, têm sido relatadas
em espécies de eucalipto submetidas a déficit hídrico (ALVARENGA et al., 1994;
GONÇALVES; PASSOS, 2000; LI et al., 2000; LI; WANG, 2003; PEREIRA et al., 2006;
PEREIRA et al., 2010).
A água está intimamente ligada às trocas gasosas, tanto nos processos fotossintéticos,
quanto na própria regulação estomática. A condutância estomática caracteriza-se como o
principal mecanismo de controle das trocas gasosas nas plantas superiores. Por meio dos
estômatos ocorre o influxo de CO2, necessário ao processo fotossintético e ao crescimento, e o
efluxo de água, por meio da transpiração (LARCHER, 2006; TAIZ; ZEIGER, 2009;). Sob
condições de baixa disponibilidade de água, a redução da condutância estomática constitui
uma das estratégias mais comumente utilizada pelas plantas para manter a turgescência e para
diminuir a taxa de transpiração (HSIAO, 1973; REIS; REIS, 1997). Essa redução, embora
represente uma vantagem imediata para prevenir a desidratação dos tecidos, pode afetar
diretamente o balanço de calor sensível sobre o vegetal, aumentando a temperatura foliar, e a
absorção de CO2, podendo levar à paralisação de crescimento das plantas e à perda de
produtividade (BRUNINI; CARDOSO, 1998; PIMENTEL, 2004; SOUZA, et al. 2004;
LIBERATO et al., 2006).
Dessa maneira, o movimento estomático desempenha um papel crucial no controle do
equilíbrio entre a conservação da água pela planta e a taxa de assimilação de CO2 para
produção de carboidratos. Portanto, a compreensão de seu funcionamento pode ter um
importante significado prático (LIMA, 1996). Além da disponibilidade de água, a luz,
umidade do ar, concentração de gás carbônico, potencial hídrico foliar, temperatura, vento e
hormônios influem, significativamente, na condutância estomática (REICHARDT, 1985;
MARENCO; LOPES, 2005; LARCHER, 2006; KERBAUY, 2008; TAIZ; ZEIGER, 2009).
Segundo Lima (1996), a maioria das espécies de eucalipto desenvolveu um mecanismo
bastante efetivo de controle estomático das perdas de água em resposta a fatores ambientais, o
que tem sido verificado em vários trabalhos (KALLARACKAL; SOMEN, 1997; ALMEIDA;
SOARES, 2003; LIMA; JARVIS; RHIZOPOULOU, 2003; MARTINS et al., 2008; SHEM;
CATHERINE; ONG, 2009).
10
A transpiração pode ser considerada o processo mais dominante na relação águaplanta, exercendo uma importância crucial no balanço hídrico do vegetal, uma vez que é
responsável pela liberação de um grande volume de água, em torno de 95% de toda a água
absorvida pela planta, o que ocorre, principalmente, através dos estômatos (KRAMER;
BOYER, 1995; KERBAUY, 2008). A redução da transpiração é considerada um mecanismo
que ajuda a diminuir o consumo de água pelos vegetais (LARCHER, 2006). Segundo Pereira
et al. (2006), sob condições idênticas, diferenças na taxa de transpiração podem ser um
indicativo de uma maior ou menor eficiência do mecanismo estomático, implicando na
economia de água pela planta.
A fotossíntese, por sua vez, é muito sensível à disponibilidade hídrica. O estresse
hídrico pode ocasionar redução da atividade fotossintética, tanto pelo fechamento dos
estômatos, o que gera decréscimos na assimilação de CO2 e suprime a formação e expansão
foliar (TAIZ, ZEIGER, 2009), quanto por danos nos cloroplastos. Em condições de baixa
disponibilidade hídrica, o controle estomático tem sido apontado como principal limitante da
fotossíntese (CHAVES, 1991; CORNIC, 2000; GRASSI; MAGNANI, 2005; PEEVA;
CORNIC, 2009; TAIZ; ZEIGER, 2009; KEENAN; SABATE; GRACIA, 2010).
Além dos efeitos estomáticos, o estresse hídrico afeta o processo fotossintético,
principalmente sob condições severas de déficit, mediante ajustes internos não-estomáticos,
os quais estão relacionados às perturbações nos processos fotoquímicos, com a redução da
capacidade fotossintética do Fotossistema II (FSII), mediante alterações no teor de clorofila e
redução no transporte de elétrons, que, por sua vez, afeta a formação de ATP e NADPH, e nos
processos bioquímicos, com a redução na eficiência carboxilativa e, ou, na quantidade e
atividade da RUBISCO e de outras enzimas do metabolismo fotossintético (FLEXA;
MEDRANO, 2002; CHAVES; MAROCO; PEREIRA, 2003; FLEXAS et al., 2004;
CHAVES; FLEXAS; PINHEIRO, 2009; PINHEIRO; CHAVES, 2011).
Nesse contexto, o teor de clorofila e a fluorescência da clorofila a são importantes
variáveis na identificação de danos causados por estresse hídrico, em nível de cloroplastos.
Este último pode fornecer informações sobre alterações no aparelho fotossintético em
condições estressantes, permitindo analisar qualitativa e quantitativamente a absorção e
aproveitamento da energia luminosa através do FSII e possíveis relações com a capacidade
fotossintética (FARQUHAR; SHARKEY, 1982; PERCIVAL; SHERIFFS, 2002; NETTO et
al., 2005; RONG-HUA et al., 2006).
Outra característica a ser considerada é a emissão da fluorescência, que representa a
quantidade de energia luminosa não utilizada pelo aparelho fotossintético. Modificações nos
11
padrões de emissão significam presença de lesões no aparelho fotossintético da planta
(KRAUSE; WEIS, 1991). O principal parâmetro utilizado na avaliação dessas lesões ao
sistema fotossintético é a relação entre a fluorescência variável e a fluorescência máxima
(Fv/Fm) que é uma medida da eficiência intrínseca ou máxima do FSII, ou seja, a eficiência
quântica de todos os centros do FSII quando estão abertos. Valores entre 0,75 e 0,85 indicam
que a planta apresenta seu aparato fotossintético em perfeito estado. Mas, o declínio dessa
relação é um excelente indicador de dano fotoinibitório, quando as plantas estão sujeitas a
estresses ambientais, incluindo o hídrico (BJÖRKMAN; POWLES, 1984; BOLHÀRNORDENKAMPF et al., 1989).
Outra variável fisiológica importante a ser considerada em estudos das respostas das
plantas à disponibilidade hídrica é a eficiência no uso da água (EUA), denominada como a
capacidade da planta de limitar a perda de água e, ao mesmo tempo permitir absorção
suficiente de CO2, expressa pela razão entre a taxa fotossintética e a taxa de transpiração
(KERBAUY, 2008). Segundo Larcher (2006), a eficiência no uso da água é um parâmetro
fisiológico que expressa quantitativamente o comportamento momentâneo das trocas gasosas
na folha, variando entre e dentro das espécies vegetais. Olbrich, Roux e Poulter (1993)
ressaltam a importância do conhecimento dessa variável no processo de seleção de espécies
de eucalipto para determinadas condições.
Diante
do
exposto,
pode-se
verificar
que
as
características
e
variáveis
morfofisiológicas apresentadas acima são de extrema importância na seleção de genótipos
para plantios em áreas com alguma taxa de supressão hídrica e para entender como os
genótipos de eucalipto modulam essas mesmas características. Logo, com o intuito de
contribuir para o acúmulo de informações dessa natureza, bem como para identificar e melhor
compreender os mecanismos subjacentes a tolerância falta d’água, avaliou-se as respostas
morfológicas (altura, diâmetro do coleto, área foliar, matéria seca total, relação entre raiz e
parte aérea) e fisiológicas (trocas gasosas, eficiência no uso da água, teor de clorofila,
fluorescência da clorofila a) de dois genótipos de eucaliptos, um tolerante e outro sensível à
falta d’água, submetidos a estresse hídrico.
12
2
MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Época e ambiente experimental
O experimento foi desenvolvido no período de 9 de dezembro de 2012 a 23 de janeiro
de 2013, em casa de vegetação localizada no Centro Integrado de Propagação de Espécies
Florestais (CIPEF), nas dependências do Departamento de Engenharia Florestal da
Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Diamantina – MG, situadas nas
coordenadas geográficas de 18° 12’ 9.76’’ S, 43° 34’ 46.13’’ W e altitude de 1400 m.
Segundo a classificação de Köppen, a região é caracterizada pelo clima “Cwb”, ou
seja, temperado úmido, com inverno seco e chuvas no verão, precipitação anual média de
1.082 mm e temperatura média de 19,4 °C.
Durante o período experimental as condições ambientais no interior da casa-devegetação, representadas pela temperatura média e umidade relativa média do ar, medidas
diariamente com termohigrógrafo, foram 21,9 °C e 76,9%, respectivamente.
2.2 Material vegetal, recipientes e substratos utilizados
O experimento foi conduzido com mudas de eucalipto dos clones comerciais 224
(Eucalyptus grandis vs. Eucalyptus urophylla) e 953 (Eucalyptus camaldulensis vs.
Eucalyptus grandis), oriundas de propagação clonal.
As mudas foram produzidas pelo método de miniestaquia, no viveiro florestal da
empresa Aperam Bioenergia Ltda., localizado no município de Itamarandiba, região Nordeste
de Minas Gerais. Os clones selecionados são materiais genéticos utilizados em larga escala
em plantios localizados no Vale do Jequitinhonha, Estado de Minas Gerais. As mudas foram
selecionadas, aos 45 dias de idade, quanto à uniformidade de altura, diâmetro e condição
fitossanitária. No dia 09 de dezembro de 2012, quando as mudas estavam com 56 dias de
idade, foram transplantadas para sacos plásticos com capacidade para 2,0 l, com perfurações
laterais de 4 mm de diâmetro (para permitir melhor aeração das raízes e escoar o excesso de
água), com 1,5 l de substrato. Inicialmente, todas as mudas (uniformes) foram submetidas a
um período de aclimatação por 30 dias, em casa de sombra, com sombrite 50% de
sombreamento (Figura 1.1). Para garantir o estabelecimento e a sobrevivência das mesmas,
13
receberam irrigação diária, suficiente para manter o substrato em condições próximas a 60%
da capacidade de campo. Após essa adaptação, iniciou-se a aplicação dos tratamentos.
Figura 1.1 - Mudas clonais dos genótipos 224 (Eucalyptus grandis vs. Eucalyptus urophylla) e 953 (Eucalyptus
camaldulensis vs. Eucalyptus grandis) submetidas a um período de aclimatação (30 dias), em casa de sombra.
O substrato utilizado para o enchimento dos sacos plásticos foi constituído de
vermiculita (40%), casca de arroz carbonizada (30%) e fibra de coco (30%). A adubação do
substrato foi realizada antes do enchimento dos sacos, de acordo com as recomendações de
Barros e Novais (1999). Foram aplicados 640 g de superfosfato simples por m³, 160 g de
sulfato de amônio por m³ e 160 g de cloreto de potássio por m³. Para melhor homogeneização
do substrato adubado, utilizou-se uma betoneira.
14
2.3 Aplicação dos tratamentos e delineamento estatístico
Após 30 dias de aclimatação na casa de sombra, iniciaram-se os regimes hídricos
diferenciados, que duraram 15 dias.
O experimento (Figura 1.2) foi conduzido em Delineamento Inteiramente Casualizado
(DIC), em esquema fatorial 2 x 2: o fator regime hídrico teve dois níveis, irrigado e não
irrigado, e o fator genótipo teve dois níveis, tolerante (953) e sensível (224). Cada tratamento
teve 25 repetições (mudas) e cada uma dessas repetições foi considerada uma unidade
experimental, totalizando 100 plantas avaliadas. Os quatro tratamentos podem ser descritos da
seguinte maneira:
T1: plantas irrigadas e clone 224
T2: plantas irrigadas e clone 953
T3: plantas não irrigadas e clone 224
T4: plantas não irrigadas e clone 953
Os tratamentos irrigados foram mantidos próximos à 60% da capacidade de campo.
Diariamente, cada um dos sacos com mudas a serem irrigadas eram pesados, individualmente,
e a massa de água perdida e, ou, utilizada era reposta para cada unidade experimental. Os
tratamentos não irrigados não receberam água em nenhum momento após o início do
experimento.
15
Figura 1.2 - Visão geral do experimento após aleatorização das mudas clonais dos genótipos 224 (Eucalyptus
grandis vs. Eucalyptus urophylla) e 953 (Eucalyptus camaldulensis vs. Eucalyptus grandis) e início do teste.
2.4 Características avaliadas
2.4.1
Características morfológicas
As variáveis altura (medida tomada do substrato até a inserção da última folha em
cm), diâmetro do coleto (mm) e área foliar (cm²) foram obtidas de 16 plantas, logo após a
instalação na casa de vegetação e imediatamente antes do início dos tratamentos (tempo zero)
(08 de janeiro de 2013) e nos 6°, 11° e 15° dias seguintes. O experimento foi avaliado até que
as plantas apresentassem sinais de murcha permanente, caracterizada por folhas com
tonalidade palha e secamento total da planta (ALFENAS et al., 2004). As outras nove plantas
restantes foram utilizadas para coleta de folhas para a confecção das bibliotecas de cDNA,
descritas no próximo capítulo.
A altura total das plantas foi medida com o auxílio de uma régua graduada em
centímetros e o diâmetro medido com auxílio de um paquímetro digital (Starrett, Digital
Capiper 300 nm). A área foliar foi determinada por análise não destrutiva, com medidor laser
de área foliar (marca CID-Bio Science, modelo CI-203). As medições foram efetuadas na
primeira folha totalmente expandida (no sentido do ápice para a base da planta) e
devidamente identificada com fios de lã brancos. Foram feitas três leituras e o valor médio da
área foliar foi utilizado para comparação.
16
A sintomatologia apresentada pelas mudas foi devidamente acompanhada, ao longo do
experimento, por meio de registro fotográfico em todos os tratamentos.
Ao final do experimento determinou-se a massa de matéria seca de raiz, folhas e caule
para cada um dos tratamentos. Individualmente, separaram-se as folhas, galhos e raízes em
cada planta (Figura 1.3). A parte radicular das mudas foi lavada em água corrente, para a
retirada do substrato, procurando-se manter intactas todas as suas raízes. Em seguida, as
respectivas partes foram acondicionadas, individualmente, em sacos de papel e devidamente
identificados. O material contido em cada embalagem permaneceu em estufa de circulação
forçada de ar a 65 ± 3 ºC, até atingir peso constante. Após a secagem, o material foi pesado,
com auxílio de uma balança analítica, para a obtenção da matéria seca total (MST) e de cada
uma das partes da muda (raiz - MSR, folha - MSF e caule - MSC), bem como a relação entre
matéria seca de raiz e parte aérea (MSR/PA). Calculou-se, também: 1) a razão de massa foliar
(RMF), dada pela relação entre matéria seca de folhas e matéria seca total; 2) a área foliar
específica (AFE), obtida por meio do quociente entre a área foliar (uma única lâmina foliar) e
a matéria seca de folhas; e 3) a razão de área foliar (RAF), expressa pela relação entre área
foliar (uma única lâmina foliar) e a matéria seca total da planta (metodologia adaptada
FLOSS, 2011).
17
Figura 1.3 - Procedimentos para determinação da matéria seca total e de cada parte da planta. Visão geral (A).
Retirada das folhas (B). Corte do caule (C). Raízes a serem lavadas (D).
2.4.2
Características ecofisiológicas
O índice de clorofila total e as variáveis da fluorescência da clorofila a foram obtidos
de 16 plantas, logo após a instalação na casa de vegetação e imediatamente antes do início dos
tratamentos (tempo zero) (08 de janeiro de 2013) e nos 6°, 11° e 15° dias seguintes. As
variáveis de trocas gasosas foram analisadas em dez plantas de cada tratamento ao décimo dia
após o início da supressão hídrica.
O índice de clorofila total foi quantificado indiretamente (método não-destrutível) com
clorofilômetro marca ClorofiLOG, modelo CFL 1030 (Figura 1.4), conforme as instruções do
fabricante e expresso em uma unidade adimensional, chamada Índice de Clorofila Falker
(ICF) (FALKERAUTOMAÇÃO AGRÍCOLA, 2008). As medições foram efetuadas na
primeira folha totalmente expandida (no sentido do ápice para a base da planta) e
devidamente identificada com fios de lã brancos. Foram feitas três leituras, evitando-se
regiões de nervura e danificadas por pragas ou patógenos, sendo utilizado para análise o valor
médio (metodologia adaptada SANTIAGO et al., 2009).
18
Figura 1.4 - Clorofilômetro utilizado para determinação do índice de clorofila total (IFC).
As variáveis da fluorescência da clorofila a foram determinadas na primeira folha
totalmente expandida (no sentido do ápice para a base da planta) e devidamente identificada
com fios de lã brancos, utilizando um fluorímetro PAM portátil (JUNIOR-PAM, Heinz Walz
GmbH). A partir dos valores de Fo (mínima intensidade da fluorescência), quando os centros
de reação do FSII estão abertos, e de Fm (máxima intensidade da fluorescência), quando os
centros de reação do FSII estão fechados, calculou-se a fluorescência variável (Fv), obtida por
Fm-Fo. Em seguida, determinou-se a eficiência quântica potencial do FSII (Fv/Fm)
(MAXWELL; JOHNSON, 2000). As leituras foram realizadas com o auxílio de clipes foliares
magnéticos acoplados ao fluorímetro, colocados na região mediana, no lado adaxial do limbo
foliar, evitando-se a nervura central (Figura 1.5). As medições foram efetuadas entre 20 e 22
horas, com emissão de um pulso de luz saturante de 0,3 s, sob frequência de 0,6 KHz. Os
valores de fluorescência obtidos foram automaticamente armazenados no fluorímetro e,
posteriormente, transferidos para um computador, utilizando-se o programa Wincontrol.
19
Figura 1.5 - Determinação das variáveis da fluorescência da clorofila a. Fluorímetro PAM portátil (JUNIORPAM, Heinz Walz GmbH) (A). Obtenção das variáveis da fluorescência da clorofila a (B).
As variáveis de trocas gasosas foram obtidas por meio de um medidor portátil de
fotossíntese, do tipo analisador infravermelho de gases (Infrared Gas Analyser - IRGA),
modelo LI-6400 (Figura 1.6), em sistema aberto, sob luz saturante de 900 a 950 mmol de
fótons m-2 s-1 e concentração ambiente de CO2, cedido pelo Professor Antonio Alberto da
Silva, do Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de Viçosa. A irradiância de
saturação baseou-se nos valores determinados pela curva de saturação luminosa para o
eucalipto, situando-se entre 800 e 1000 mmol de fótons m-2 s-1, conforme descrito por SILVA
et al. (1998).
As medições foram realizadas entre 10 e 11 horas, na superfície adaxial de folhas
totalmente expandidas e com bom estado fitossanitário, situadas no terço médio de cada
unidade experimental, totalizando três medições por folha. Foram determinadas: condutância
estomática (Gs – mol.m-2 s-1), taxa de transpiração (E – mmolH2O. m-2 s-1), taxa fotossintética
(A – µmolCO2.m-2 s-1), carbono interno (Ci – µmol.mol-1) e temperatura foliar (T - oC).
Posteriormente, calculou-se a eficiência no uso da água (EUA - µmolCO2.mmol H2O-1) pela
relação entre quantidade de CO2 fixado pela fotossíntese e quantidade de água transpirada
(KERBAUY, 2008).
20
Figura 1.6 - Determinação das variáveis de trocas gasosas. Medidor portátil de fotossíntese, do tipo analisador
infravermelho de gases (Infrared Gas Analyser) (IRGA) (A). Avaliação das variáveis de trocas gasosas (B).
2.5 Análises estatísticas
O conjunto de dados obtido foi submetido às pressuposições necessárias para a análise
de variância (ANOVA). Caso não atendidas as pressuposições para a ANOVA, os dados foram
adequadamente transformados. Satisfeitas as pressuposições necessárias, procedeu-se a
ANOVA com o auxílio do programa R (R CORE TEAM, 2013).
A influência dos tratamentos sobre matéria seca de raiz, matéria seca de caule, matéria
seca de folha, matéria seca total, relação matéria seca raiz e parte aérea, razão de massa foliar,
área foliar específica, razão de área foliar e nas variáveis de trocas gasosas foi estudada
mediante análise de variância (ANOVA), sendo o Teste F conclusivo ao nível de significância
de 5%.
Uma vez que a obtenção das variáveis altura, diâmetro, área foliar, índice de clorofila
total e variáveis da clorofila a foram realizadas nas mesmas unidade experimentais e com os
mesmos tratamentos em quatro tempos sucessivos, as análises estatísticas foram realizadas
mediante a utilização do pacote nlme, que possibilita o ajuste de modelos lineares mistos a
dados de medidas repetidas (PINHEIRO et al., 2013).
21
3
RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Sintomatologia
O sintomas de deficiência hídrica, embora tenham sido os mesmos em ambos os
clones, diferenciou-se em termos de tempo de surgimento e intensidade.
No 4° dia após o início da supressão hídrica, o clone 224 apresentou uma leve, porém
notável murcha foliar em folhas da porção mediana da planta. No dia seguinte, este mesmo
clone apresentou uma murcha mais pronunciada, inclusive de ponteiros. No sexto dia após a
aplicação do déficit, o clone 224 apresentava-se visualmente debilitado, com murcha foliar e
enrolamento de ponteiras. Já o clone 953 foi manifestar uma leve murcha somente no nono
dia de déficit hídrico. Nos dias seguintes, a sintomatologia apresentada pelo 953 progrediu até
atingir um estado semelhante ao apresentado pelo 224 no sexto dia de estresse. A
manifestação tardia de sintomas pelo clone 953 é um forte indício de maior tolerância ao
déficit hídrico, comparativamente ao 224. O experimento foi mantido até o décimo quinto dia,
quando as plantas com supressão hídrica de ambos os clones apresentaram sinais de murcha
permanente, caracterizada por folhas com tonalidade palha e secamento total da planta (Figura
1.7). No entanto, os sintomas apresentados, no 15º dia, pelas mudas do clone 224 foram muito
mais severos do que aqueles apresentados pelas mudas do clone 953 (Figura 1.7).
22
Figura 1.7 - Sintomatologia verificada em mudas clonais dos genótipos 224 (Eucalyptus grandis vs. Eucalyptus
urophylla) e 953 (Eucalyptus camaldulensis vs. Eucalyptus grandis) no 6° (1) e 15° (2) dias após a diferenciação
dos tratamentos hídricos. Clone 224 não irrigado (A), clone 224 irrigado (B), clone 953 não irrigado (C) e clone
953 irrigado (D).
3.2 Características morfológicas
A análise de variância referente às características matéria seca de raiz, matéria seca de
caule, matéria seca de folha, matéria seca total, relação matéria seca raiz/parte aérea, razão de
massa foliar, área foliar específica e razão de área foliar encontra-se no Apêndice A. Os
valores da estatística F e o valor-p referentes às características altura, diâmetro e área foliar
encontram-se no Apêndice B.
3.2.1
Altura das plantas e diâmetro de coleto
Os resultados demonstraram que, em relação à altura das plantas, houve diferenças
significativas somente entre genótipos (Figura 1.8). Em relação ao diâmetro de coleto,
verificou-se diferenças significativas entre genótipos e na interação regime hídrico vs. tempo
(Figura 1.9).
Conforme observado na Figura 1.8, o clone 953 destaca-se por apresentar uma altura
superior ao clone 224, independente do regime hídrico e do tempo de avaliação. Em relação
aos regimes hídricos, observou-se que a deficiência hídrica não causou prejuízo ao
23
crescimento em altura de todas as plantas não irrigadas, embora tenha promovido a
desaceleração no crescimento em termos de produção de matéria seca total.
Figura 1.8 - Média de altura de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto. Segundo o teste F, as médias
diferem estatisticamente a 5% de significância.
Há na literatura relatos controversos, no que se refere aos efeitos da limitação hídrica
sobre o crescimento em altura de plantas de diferentes espécies de eucalipto. Osório et al.
(1998) verificaram reduções no crescimento em altura de três clones de E. globulus sob déficit
hídrico no solo. Silva et al. (2000), ao avaliarem a altura de plantas de E. citriodora e E.
grandis cultivadas sob três teores de água no solo, junto a quatro populações de Brachiaria
brizantha, verificaram que, independente da densidade da população de Brachiaria brizantha,
a diminuição no teor de água no solo reduziu o crescimento em altura de ambos os clones.
Reduções na altura de plantas de eucalipto sob déficit hídrico também foram relatadas por Li
et al. (2000), em E. microtheca e por Gutierrez et al. (2002), em E. nitens. Merchant et al.
(2007) relataram que a altura de plantas de seis diferentes espécies de eucalipto foram
significativamente menores quando comparadas as plantas do tratamento irrigado, após 10
semanas de déficit hídrico. Coopman et al. (2008) verificaram uma redução na altura de 3 e
7%. Estudos realizados por Tatagiba et al. (2009) e por Warren, Aranda e Cano (2011) em
Eucalyptus spp. revelaram que o crescimento em altura foi negativamente afetado por
variações nos regimes hídricos.
24
Por outro lado, Reis et al. (1989) não encontraram diferenças significativas no
crescimento em altura em mudas de três espécies de eucalipto cultivadas em recipientes com
restrição do sistema radicular (60 e 500 ml) e submetidas a restrição hídrica. Todavia, os
autores justificaram o fato em função dos ciclos de seca não terem sido suficientemente
longos para promover substancial redução no turgor, com consequente redução do
crescimento das plantas. Reis et al. (2006), ao avaliarem o crescimento radicular e da parte
aérea de clones híbridos de Eucalyptus spp. sob dois regimes de irrigação no campo, não
encontraram diferença significativa para a altura entre os tratamentos irrigado e não irrigado.
Resultado similar também foi relatado por Thomas (2009), que não verificou reduções
significativas no crescimento em altura de mudas de E. pilularis sob estresse hídrico.
Tatagiba, Pezzopane e Reis (2007) afirmam que a ausência de efeitos significativos do déficit
hídrico sobre o crescimento em altura e diâmetro de clones de eucalipto pode ser devido a
curta duração do experimento.
O crescimento em diâmetro, assim como em altura, variou estatisticamente entre os
genótipos (Figura 1.9), independente do regime hídrico e do tempo, com destaque para o
clone 953.
Figura 1.9 - Diâmetro de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto. Segundo o teste F, as médias diferem
estatisticamente a 5% de significância.
O efeito dos regimes hídricos sobre o diâmetro dependeu do tempo em que as
avaliações foram realizadas, uma vez que a interação regime hídrico vs. tempo foi
25
significativa a 1% de significância. O efeito do regime hídrico não irrigado sobre o
crescimento em diâmetro só foi significativo aos 11° e 15° dias após a supressão hídrica
(Figura 1.10), promovendo uma redução de 11,66% e 11,86%, respectivamente, em relação ao
diâmetro das plantas irrigadas. Nota-se, também, que o diâmetro das plantas irrigadas
observado no último dia de experimento (15°) foi estatisticamente maior que o diâmetro das
plantas no início do experimento. Esse crescimento verificado nas plantas com ótima
disponibilidade hídrica ao longo do tempo é devido à maior abertura dos estômatos, que
propiciaram uma maior taxa fotossintética e, consequentemente, uma maior produção de
fotoassimilados, proporcionando, assim, o crescimento da planta ao longo do tempo.
Resultado semelhante foi descrito por Coopman et al. (2008), que embora não tenham
verificado interação significativa entre regime hídrico e tempo e nem efeito significativo dos
tratamentos hídricos para esta variável, esses autores relataram que houve incremento
significativo no diâmetro de plantas de E. globulus com o tempo de exposição de 15 dias.
Figura 1.10 - Diâmetro de plantas jovens de eucalipto, sob dois regimes hídricos, em diferentes tempos de
avaliação.
Vários trabalhos têm relatado a redução do crescimento em diâmetro de diferentes
espécies de eucalipto sob condições hídricas estressantes (REIS; REIS; MAESTRI, 1988;
SASSE; SANDES, 1996; NGUGI et al., 2003a,b; MERCHANT et al., 2007; TATAGIBA et
al., 2009). Embora o efeito do déficit hídrico sobre o diâmetro só tenha sido verificado com
maiores tempos de exposição, o crescimento em diâmetro foi proporcionalmente mais afetado
que o crescimento em altura quando a disponibilidade hídrica diminuiu para as plantas. Reis
26
et al. (2006), avaliando o comportamento de clones de híbridos de Eucalyptus grandis vs. E.
urophylla e de E. camaldulensis vs. Eucalyptus spp. submetidos a dois regimes de irrigação
no campo, observaram que o crescimento em altura, aos 38 meses de idade, não variou
significativamente entre os tratamentos de irrigação, enquanto em diâmetro foi
significativamente superior nas plantas do tratamento irrigado em relação ao não-irrigado. O
mesmo foi verificado por Vellini et al. (2008), estudando o desempenho de 18 clones de
Eucalyptus spp. em diferentes regimes hídricos, durante 75 dias.
De acordo com Gonçalves e Passos (2000), a deficiência hídrica pode afetar
diretamente o crescimento em altura e em diâmetro da planta, uma vez que restringe a
expansão celular e a formação da parede celular e, indiretamente, diminui a disponibilidade de
carboidratos ou influencia a produção de reguladores de crescimento. Segundo Taiz e Zeiger
(2009), o crescimento de plantas é definido como o aumento irreversível de volume, sendo a
expansão celular, governada pela pressão de turgor, o maior componente do crescimento
vegetal.
3.2.2
Matéria seca, relação matéria seca raiz/parte aérea e razão da massa
foliar
Tanto a matéria seca total, de raiz, de caule, quanto a matéria seca de folhas não
apresentaram interação significativa entre genótipo e regime hídrico (Figura 1.11 e 1.12),
sendo, portanto, estudados os efeitos de cada um isoladamente. Já a razão matéria seca
raiz/parte aérea (MSR/PA) e razão da massa foliar (RMF) apresentaram interação significativa
entre os fatores estudados, sendo, dessa forma, necessário desmembrar a interação (Figura
1.13 e Figura 1.14, respectivamente).
Para a matéria seca total, tanto os genótipos quanto os regimes hídricos apresentaram
diferença estatística significativa a 1% de significância (Figura 1.11 e 1.12). O fator genótipo
para matéria seca total apresenta o clone 224 como estatisticamente superior ao clone 953.
Para o fator regime hídrico, a limitação de água reduziu em 28,90% a matéria seca total em
relação ao tratamento irrigado, ou seja, a deficiência hídrica promoveu a desaceleração no
crescimento, refletindo negativamente na produção total de matéria seca.
Soares e Leite (2000), assim como Santana et al. (2008), ao estudar a produção de
biomassa de diferentes genótipos de eucalipto para diferentes regiões do Brasil, também
observaram que a produção de biomassa foi menor nas regiões com baixa disponibilidade
hídrica. Os resultados aqui obtidos também coincidem com os obtidos por Ngugi et al.
27
(2003b), em E. cloeziana e E. argophloia, por Silva et al. (2004b) e Coopman et al. (2008),
com E. globulus, e por Pereira et al. (2010). Estes últimos autores verificaram redução da
matéria seca total de um clone de E. grandis, quando submetido à umidade do solo próxima
do ponto de murcha permanente em relação ao tratamento próximo da capacidade de campo,
enfatizando dessa forma, a ocorrência de um maior incremento em matéria seca total de
mudas de eucalipto quando estas se desenvolvem em condições de ótima disponibilidade
hídrica. Vários outros estudos, inclusive, com outros gêneros florestais, têm mostrado que a
produção de matéria seca total é linearmente proporcional à quantidade de água usada (LI et
al., 2000; SILVA; NOGUEIRA, 2003; SILVA et al., 2004b; SUSILUOTO; BERNINGER,
2007; SILVA et al., 2008b; VELLINI et al., 2008; MARTINS et al., 2010).
Figura 1.11 - Matéria seca total (folha, caule e raiz) de plantas jovens de eucalipto (comparação entre
genótipos). Segundo o teste F, as médias diferem estatisticamente a 5% de significância.
O efeito do déficit hídrico sobre a matéria seca pode ter sido consequente da
diminuição da condutância estomática, como mecanismo de prevenção da desidratação. O
fechamento parcial ou total dos estômatos diminui as perdas de água, ao passo que, influencia
negativamente o crescimento das plantas. Os principais efeitos são o decréscimo na produção
de fotoassimilados, uma vez que ocorre redução da entrada de CO2 (LARCHER, 2006), bem
como um acréscimo na atividade de enzimas oxidantes, decorrente da elevação da
temperatura da planta, que aumentam a respiração e o consumo de fotoassimilados e,
consequentemente, diminuem o crescimento (TAIZ; ZEIGER, 2009).
28
A análise dos dados de matéria seca de raiz, matéria seca de caule e matéria seca de
folhas revela diferenças entre os genótipos estudados e entre os regimes hídricos aplicados
(Figura 1.11 e 1.12). Ao analisar o fator genótipo, o clone 224 destaca-se por apresentar
superioridade na produção de matéria seca em quase todos os compartimentos da planta,
exceto no compartimento foliar. A raiz foi o compartimento que mais contribuiu para o
acúmulo de matéria seca total dos clones, independente do regime hídrico, representando
52,53% da matéria seca total para o clone 224 e 42,75% para o clone 953.
Figura 1.12 - Matéria seca total (folha, caule e raiz) de plantas jovens de eucalipto (comparação entre regimes
hídricos). Segundo o teste F, as médias diferem estatisticamente a 5% de significância.
O clone 224 apresentou maior MSR/PA tanto no regime hídrico com água quanto sem,
comparativamente ao clone 953. No entanto, a MSR/PA do clone sensível não diferiu
estatisticamente entre os regimes hídricos, o que significa dizer que o maior valor dessa
relação observado para este clone provavelmente não foi induzido pela deficiência hídrica.
Este resultado é indicativo de que um sistema radicular aperfeiçoado é uma característica
inerente ao clone 224, independente da disponibilidade hídrica no solo. Embora, os dados
revelem que o clone 224 apresenta um sistema radicular mais desenvolvido, este clone é
conhecido por sua alta sensibilidade à seca, o que indica que a estratégia desenvolvida talvez
não seja eficiente para garantir o seu desenvolvimento em condições de baixo suprimento de
água. Por outro lado, para o clone 953, o regime hídrico sem água, diferente do esperado, não
promoveu o aumento da sua capacidade de enraizamento sob condição de estresse hídrico.
29
Provavelmente, este clone, conhecido por ser tolerante à limitação hídrica, apresenta outros
mecanismos mais eficientes de tolerância.
O regime hídrico não irrigado reduziu em 29,80%, 32,32% e 19,42%,
respectivamente, a matéria seca de raiz, caule e folha. Como observado, os componentes da
planta mais afetado e menos afetado, respectivamente, pelo déficit hídrico, foram o caule e as
folhas. Conforme Taiz e Zeiger (2009), a redução da matéria seca da folha deve-se ao fato que
o estresse hídrico reduz, tanto a fotossíntese, quanto o consumo de fotoassimilados nas folhas
em expansão. Outra possível causa para essa redução pode ter sido a abscisão foliar observada
no final do experimento, embora, não tenha sido tão expressiva. Ainda, segundo Taiz e Zeiger
(2009), o crescimento do caule tem sido menos estudado do que a expansão foliar, mas
possivelmente, ele é afetado pelas mesmas forças que limitam o crescimento das folhas
durante o estresse hídrico. A menor produção de matéria seca em todos os compartimento das
plantas sob restrição hídrica também foi relatada por Singh e Singh (2003), em Dalbergia
sissoo Roxb, por Tatagiba, Pezzopane e Reis (2007), em Eucalyptus spp. e por Martins et al.
(2010), em plantas jovens de nim-indiano (Azadirachta indica a. juss.).
Para a proporção matéria seca raiz/parte aérea (MSR/PA), como observado na Figura
1.13, todos os efeitos foram significativos, resultando na necessidade de desmembrar a
interação genótipo vs. regime hídrico.
Figura 1.13 - Relação matéria seca de raiz e parte aérea (MSR/PA) de plantas de dois genótipos de eucalipto, sob
dois regimes hídricos. Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os genótipos em cada
regime hídrico e letras maiúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os regimes hídricos, dentro de
cada genótipo, pelo teste F a 5% de significância.
30
Segundo Taiz e Zeiger (2009), a maior contribuição do sistema radicular, numa
condição hídrica limitante, é explicada devido a inibição da expansão foliar reduzir o
consumo de fotoassimilados e energia, de tal forma que uma proporção maior de assimilados
pode ser distribuída ao sistema radicular, podendo levar, assim, ao incremento da razão
matéria seca de raiz/parte aérea. Esses autores afirmam, ainda, que essa razão parece ser
governada por um balanço funcional entre absorção de água pelas raízes e fotossíntese pela
parte aérea, em que a parte aérea continuará a crescer até que a absorção de água pelas raízes
torne-se limitante. Por outro lado, as raízes crescerão até que a demanda por fotoassimilados
da parte aérea iguale-se ao suprimento, sendo este balanço funcional modificado, caso a
disponibilidade de água decresça.
O aumento da MSR/PA em função do déficit hídrico não foi verificado neste trabalho,
concordando com o encontrado por Osório et al. (1998), em E. globulus e Gutierrez et al.
(2002), em E. nitens e em contraste ao relatado por outros autores, em eucalipto e em outros
gêneros florestais (BARROS; BARBOSA, 1995; DIAS-FILHO, 1995; LI, 2000; LI; WANG,
2003; MORONI; WORLEDGE; BEADLE, 2003; ZHANG; WU; LI, 2005; TATAGIBA;
PEZZOPANE; REIS, 2007; SUSILUOTO; BERNINGER, 2007; SILVA et al., 2008b;
THOMAS, 2009). Segundo Osório et al. (1998) o controle genético sobre a MSR/PA é muito
forte em algumas espécies de eucalipto.
Para a razão da massa foliar (RMF), também foi verificada interação significativa
entre genótipo e regime hídrico, sendo dessa forma, necessário desmembrar a interação
(Figura 1.14). Nos dois regimes hídricos, o clone 953 apresentou uma maior razão da massa
foliar, comparativamente ao clone 224. Os resultados revelam que esta variável foi
influenciada pela restrição hídrica, ocorrendo aumento na RMF das plantas do clone tolerante,
que sofreram estresse hídrico, o mesmo não sendo observado para o clone 224.
31
Figura 1.14 - Razão de massa foliar (RMF) de dois genótipos de eucalipto, sob dois regimes hídricos. Letras
minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os genótipos em cada regime hídrico e letras
maiúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os regimes hídricos, dentro de cada genótipo, pelo
teste F a 5% de significância.
A razão da massa foliar expressa a relação entre a matéria seca de folhas e a matéria
seca total da planta, de tal forma que, quanto maior a proporção de folhas em relação a massa
da planta, maior a capacidade de realizar fotossíntese (FLOSS, 2011). Ainda, segundo
Benincasa (2003), esta variável representa a fração de matéria seca não-exportada das folhas
para as outras partes da planta, onde uma maior ou menor exportação de material da folha
pode ser uma característica genética a qual está sob a influência de variáveis ambientais,
como a disponibilidade hídrica no solo.
A superioridade em termos de RMF apresentada pelo clone 953 em comparação ao
224, indica que este clone apresenta maior capacidade fotossintética, corroborando com o
discutido na seção 3.3.2, e que investiu mais a sua produção, via fotossíntese, para as folhas
(BRANT et al., 2009), evidenciado por ele apresentar 20,99% mais matéria seca no
compartimento foliar, independente do regime hídrico, que o clone 224. Por outro lado, a
baixa RMF observada no clone 224 indica que mais matéria seca foi distribuída para outras
partes da planta, como para o compartimento radicular, em detrimento dos órgãos
fotossintéticos, o que é apoiado pelos altos valores de MSR/PA.
O aumento desta variável para o clone 953, sob déficit hídrico, mostra que a limitação
hídrica afetou a translocação de fotoassimilados, promovendo uma maior alocação de
fitomassa para as folhas, em detrimento dos demais compartimentos da planta. Resultados
32
contrários foram encontrados por Laebourge et al. (1998), em variedade de pinus negro e por
Suassuna et al. (2012), em genótipos de citros, os quais verificaram decréscimos nessa
variável sob limitação hídrica.
3.2.3
Área foliar, área foliar específica e razão de área foliar
A área foliar apresentou interação significativa entre os fatores regime hídrico vs.
tempo e entre genótipo vs. regime hídrico.
Ao desdobrar esta primeira interação, observa-se que o déficit hídrico afetou a área
foliar das plantas, independente do genótipo em questão, no 11° e 15° dias após a supressão
hídrica (Figura 1.15). Comportamento semelhante foi relatado por Coopman et al. (2008), em
E. globulus. Estes autores verificaram que esta variável não foi afetada pela seca até o 11° dia,
quando houve um decréscimo significativo da área foliar devido, principalmente, a um intensa
desfolha.
Figura 1.15 - Área foliar de plantas jovens de eucalipto, sob dois regimes hídricos, em diferentes tempos de
avaliação.
Ao analisar a interação genótipo vs. regime hídrico, verificou-se que o tratamento não
irrigado reduziu em 44,30% a área foliar do clone 224, diferente do verificado para o clone
953, que manteve sua área foliar praticamente inalterada (Figura 1.16). Estes resultados
confirmam a alta sensibilidade do clone 224 ao déficit hídrico. Comportamento similar foi
33
verificado por Pita e Pardos (2001) em diferentes clones de E. globulus. Estes autores
observaram que os clones que apresentaram maior área foliar sob condições de ótima
disponibilidade hídrica, apresentaram maior queda proporcional nesta variável sob condições
de seca. Eles, então, concluíram que os clones com folhas grandes devem ser classificados
como clones de alto risco para o plantio em áreas propensas à seca.
A redução da área foliar em plantas sob condições de estresse hídrico tem sido relatada
por vários autores em diversas espécies de eucalipto (METCALFE; DAVIES; PEREIRA,
1989; STONEMAN; TURNER; DELL, 1994; OSÓRIO et al., 1998; LI et al., 2000;
CHAVES
et
al.,
2004;
TATAGIBA;
PEZZOPANE;
REIS,
2007;
SUSILUOTO;
BERNINGER, 2007; COOPMAN et al., 2008; PEREIRA et al., 2010), inclusive em espécies
de outros gêneros florestais (SANTIAGO; NOGUEIRA; LOPES, 2001; MARRON et al.,
2003; FIGUEIRÔA; BARBOSA; SIMABUKURO, 2004; VILLAGRA; CAVAGNARO,
2006; MARTINS et al., 2010) e tem por objetivo reduzir a perda de água por transpiração,
como um mecanismo de defesa à seca.
Figura 1.16 - Área foliar de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto, sob dois regimes hídricos. Letras
minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os genótipos em cada regime hídrico e letras
maiúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os regimes hídricos, dentro de cada genótipo, pelo
teste F a 5% de significância.
Taiz e Zeiger (2009) apresentam a redução de área foliar como a primeira linha de
defesa contra redução da disponibilidade hídrica, como consequência da diminuição do
conteúdo de água da folha, contração das células e afrouxamento da parede celular. Como a
34
expansão foliar é alavancada, principalmente, pela pressão de turgor, em condições de déficit
hídrico as folhas não têm como manter a sua expansão normal. Além de reduções na expansão
foliar, declínio na área foliar em função da perda de folhas têm sido comumente relatado
como uma estratégia contra a seca (GONÇALVES; PASSOS, 2000; CHAVES et al., 2004;
COOPMAN et al., 2008). No presente experimento, foi verificado a partir do 11° dia de
estresse hídrico uma visível desfolha dos clones, embora não tão expressiva.
Lopes, Guerrini, Saad (2007) também verificaram diminuição de área foliar associada
à menor disponibilidade de água em mudas de E. grandis. Resultados semelhantes foram
encontrados por Pereira et al. (2006), Merchant et al. (2007), Martins et al. (2008) e Vellini et
al. (2008). Thomas (2009), ao aplicar tratamentos hídricos diferenciados em clones de E.
pipularis com o objetivo de rustificá-los, observou redução da área foliar de plantas que
receberam menor irrigação. Mokotedi (2010) também relatou redução na área foliar de um
clone de E. nitens vs. E. nitens ao longo de vários ciclos de seca.
Na ausência de restrição hídrica, os genótipos apresentaram desempenhos distintos,
em termos de área foliar, com valores mais elevados para o clone 224. A superioridade no
incremento em área foliar é um fator significativo, uma vez que quanto maior a área foliar,
melhor a interceptação da radiação solar e maior a capacidade fotossintética, com consequente
produção de biomassa (LARCHER, 2006; TAIZ; ZEIGER, 2009). No entanto, nem sempre
essa superioridade é um indicativo de maior potencial fotossintético, assim como, uma
característica favorável ao desenvolvimento do vegetal em determinadas condições
(VILLAGRA; CAVAGNARO, 2006), o que é corroborado neste trabalho. A superioridade em
termos de área foliar apresentada pelo clone 224 no regime hídrico irrigado não lhe garantiu
um maior potencial fotossintético, uma vez que neste regime, o clone 953 apresentou maior
taxa de fotossíntese (ver seção 3.3.2). O mesmo foi verificado por Pinzón-Torres e
Schiavinato (2008), ao avaliarem o crescimento, a eficiência fotossintética e a eficiência no
uso da água de quatro leguminosas arbóreas. Os autores verificaram que a espécie que
apresentou os maiores valores quanto à área foliar específica não apresentou a maior taxa
fotossintética, como consequência do maior investimento em área foliar. Além do mais, a
elevada área foliar das plantas do clone 224 implica em um aumento na perda de água por
transpiração, o que, em condições hídricas limitantes, pode comprometer o desenvolvimento
da planta. Genótipos adaptados à áreas secas, geralmente têm folhas menores do que
genótipos de habitats mais úmidos, que é uma estratégia para evitar a perda excessiva de água
(VILLAGRA; CAVAGNARO, 2006). Nesse contexto, a reduzida área foliar do clone 953, em
35
ambos regimes hídricos, garante a maior tolerância deste clone a condições hídricas
limitantes.
A área foliar específica (AFE) apresentou interação significativa entre os fatores
estudados, sendo dessa forma, necessário desmembrar a interação (Figura 1.17).
Figura 1.17 - Área foliar específica (AFE) de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto, sob dois regimes
hídricos. Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os genótipos em cada regime hídrico
e letras maiúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os regimes hídricos, dentro de cada genótipo,
pelo teste F a 5% de significância.
Em ambos os regimes hídricos, o clone 953 apresentou uma menor área foliar
específica, comparativamente ao clone 224 (Figura 1.17). No entanto, a AFE do clone
tolerante não diferiu estatisticamente entre os regimes hídricos, o que significa dizer que o
clone 953 já apresentava uma área foliar específica menor, independente da aplicação dos
tratamentos hídricos. Por outro lado, o clone 224 teve uma redução de 40,96% da área foliar
específica em função do regime hídrico sem água.
Esta variável é um componente morfológico (área foliar) e anatômico da folha
(espessura do mesófilo) e é expressa pela razão entre a área foliar e a matéria seca de todas as
lâminas foliares (FLOSS, 2011). Segundo Barreiro et al. (2006), a área foliar é um
componente morfofisiológico e a matéria seca é um componente anatômico de uma espécie
vegetal, pois está relacionado à composição interna (número e tamanho) das células do
mesofilo. Benincasa (2003) infere que, o inverso da AFE reflete a espessura das folhas. Ainda,
36
de acordo com Silva e Nogueira (2003), a área foliar específica fornece a ideia de quanto foi
retido ou exportado de fotoassimilados no centro de produção, que é a folha.
O fato do clone 953, em ambos regimes hídricos, ter apresentado uma menor área
foliar específica implica dizer que este clone apresenta células do mesofilo maiores e em
maior número, ou seja, uma maior espessura do mesofilo foliar (FLOSS, 2011) em relação ao
clone 224. Isso permite ao clone 953 diminuir a taxa de transpiração, mediante a redução da
superfície de perda de água (menor área foliar), mantendo, simultaneamente, uma alta
capacidade fotossintética (ver seção 3.3.2). O que, provavelmente, corresponde a um dos
mecanismos que lhe confere maior tolerância a baixa disponibilidade hídrica. Liu e Stützel
(2004) confirmam esse raciocínio ao afirmar que, com o aumento da espessura (aumento do
número e, ou tamanho das células mesofílicas por unidade de área foliar), as folhas tendem a
aumentar a assimilação de CO2 e, consequentemente, há um aumento da eficiência
fotossintética. Portanto, um mecanismo de redução das taxas transpiratórias.
Para o clone 224, verificou-se que o déficit hídrico promoveu a redução da AFE, o que
corrobora com o observado em vários outros trabalhos com eucalipto (LI et al., 2000; PITA;
PARDOS, 2001; NGUGI et al., 2003b; MERCHANT et al., 2007; COOPMAN et al., 2008).
Comportamento semelhante também foi verificado por Marron et al. (2003), em clones de
Populus vs. Canadensis e por Dias-Filho (1995), em quatro espécies da Amazônia. Segundo
este último autor, o decréscimo desta variável em resposta ao suprimento hídrico reduzido
revela a habilidade de otimizar o uso da água em condições hídricas limitantes. Os resultados
também coincidem com o verificado por Silva e Nogueira (2003) em Prosopis juliflora. Estes
autores afirmam que a redução da área foliar específica observada em Prosopis juliflora
indica que esta espécie tende a exportar mais fotoassimilados para outros órgãos do que retêlos nas folhas. Em contraste, Pereira et al. (2010) verificaram maiores valores de AFE em
plantas de eucalipto tratadas com restrição hídrica.
Assim como a AFE, a razão de área foliar (RAF) também apresentou interação
significativa entre os fatores estudados (Figura 1.18). A razão de área foliar expressa a área
útil do aparelho fotossintético e é dada pelo quociente entre a área foliar responsável pela
interceptação de energia luminosa e CO2 e a matéria seca da planta, resultado da fotossíntese
(FLOSS, 2011). De acordo com Magalhães (1979), esta variável é a medida do aparelho
assimilador e funciona como parâmetro adequado para avaliar efeitos genotípicos, climáticos
e do manejo de comunidades vegetais.
37
Figura 1.18 - Razão de área foliar (RAF) de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto, sob dois regimes
hídricos. Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os genótipos em cada regime hídrico
e letras maiúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os regimes hídricos, dentro de cada genótipo,
pelo teste F a 5% de significância.
Observou-se que no regime hídrico irrigado, o clone 224 apresentou uma RAF 59,01%
superior ao clone 953 (Figura 1.18). Este resultado indica que o clone sensível apresenta uma
maior área foliar útil para a fotossíntese em comparação ao clone tolerante (FLOSS, 2011), o
que, necessariamente, não é um indicativo de maior eficiência fotossintética, como
previamente discutido. Por outro lado, não foram verificadas diferenças para esta variável
entre os clones sob limitação hídrica. A escassez d'água reduziu a razão de área foliar em
36,17% para o clone 224 e aumentou em 33,16% para o clone 953. Esse aumento ocorrido no
clone 953 decorre de uma maior redução na matéria seca total da planta (37,93%) que na área
foliar (6,5%), o oposto foi observado para o clone 224. Pereira et al. (2010) também não
verificaram decréscimos na RAF em plantas de eucalipto sob déficit hídrico.
A redução da RAF verificada no clone 224 sob déficit hídrico está em perfeita
concordância com o relatado por Dias-Filho (1995), que verificou essa redução em três
espécies lenhosas da Amazônia, quando submetidas a estresse hídrico induzido por suspensão
de irrigação. Esse autor afirma que a redução da RAF em condições hídricas limitantes
demonstra a capacidade para melhor aproveitar o uso da água em situações em que baixos
potencias hídricos do solo concorrem com alta demanda evaporativa. O mesmo foi verificado
por Silva e Nogueira (2003), em Prosopis juliflora. Segundo estes dois últimos autores, as
plantas que conseguem utilizar uma menor área foliar para produzir uma mesma quantidade
38
de fitomassa seca, quando em estresse, demostram maior eficiência foliar. Paz, Vera e Páez
(2003) estudaram Barleria lupulina e constataram redução na razão de área foliar sob
diminuição do suprimento hídrico no solo.
3.3 Características ecofisiológicas
Os resultados da análise de variância referente às características ecofisiológicas
(condutância estomática, transpiração, fotossíntese, concentração interna de CO2, eficiência
no uso de água e temperatura foliar) encontram-se no Apêndice A.
3.3.1
Condutância estomática e transpiração
Em relação a condutância estomática (Gs) e a transpiração (E), não houve efeito de
interação entre genótipo e regime hídrico, mas, o efeito de regime hídrico foi significativo
(Figura 1.19 e 1.20).
O tratamento não irrigado reduziu significativamente a condutância estomática para
valores abaixo de 0,05 mol H2O. m-2s-1, considerado por Flexas e Medrano (2002) valores
típicos de um estresse hídrico muito severo.
Figura 1.19 - Condutância estomática (Gs) de plantas jovens de eucalipto, sob dois regimes hídricos.
39
A importância do estômato nos mecanismos de trocas gasosas, efluxo de água e
influxo de CO2 está relacionada com a extrema sensibilidade desta estrutura, tanto ao estresse
ambiental quanto a fatores fisiológicos internos (produção de ácido abscísico, por exemplo).
Em condições de baixa disponibilidade hídrica do solo, os estômatos abrirão menos ou até
mesmo permanecerão fechados, permitindo à planta evitar sua desidratação. A redução da
condutância estomática nos estágios iniciais do estresse hídrico pode levar ao aumento da
eficiência no uso da água (ou seja, mais CO2 pode ser absorvido por unidade de água
transpirada), uma vez que o fechamento estomático inibe a transpiração que, por sua vez,
diminui as concentrações intercelulares de CO2 (TAIZ; ZEIGER, 2009). No entanto, quando o
estresse torna-se severo, a desidratação de células do mesofilo inibe a fotossíntese, o
metabolismo do mesofilo é prejudicado e a eficiência no uso de água declina.
A diminuição da condutância estomática dos clones de eucalipto coincide com o
comportamento observado em plantas jovens de buriti (Mauritia vinifera) e açaí (Euterpe
oleracea) cultivadas em vasos e submetidas a estresse hídrico pela suspensão da irrigação
(CALBO; MORAES, 1997; 2000) e em plantas de pupunheira (Bactris gasipaes), aroeira-dosertão (Myracrodruon urundeuva) e aroreira (Schinus terebinthifolius) também sob limitação
hídrica (OLIVEIRA et al., 2002; QUEIROZ; GARCIA; FILHO, 2002; SILVA et al., 2008b).
Comportamento similar foi relatado por Oliveira, Gualtieri e Bocchese (2011) em mudas de
ipê (Tebebuia aurea) submetidas a estresse hídrico por supressão da irrigação. Carneiro et al.
(2008), verificaram reduções da condutância estomática em período seco para híbridos de E.
urophylla vs E. grandis. Esse declínio da condutância estomática com a diminuição da
disponibilidade hídrica tem sido relatado em plantas de eucalipto por vários outros autores
(KALLARACKAL; SOMEN, 1997; GUTIERREZ et al., 2002; ALMEIDA; SOARES, 2003;
LIMA; JARVIS; RHIZOPOULOU, 2003; GINDABA; ROZANOV; NEGASH, 2005;
TATAGIBA et al., 2007; VELLINI et al., 2008; NAVARRETE-CAMPOS et al., 2013). Estes
resultados demonstram que o eucalipto exerce controle estomático eficiente em condições de
suprimento limitado de água no solo. Em contrapartida, Chaves et al. (2004) não verificaram
diferença significativa entre clones de eucalipto plenamente irrigado e sob deficiência hídrica.
Segundo Lima (1996), a maioria das espécies de eucalipto desenvolveu um
mecanismo bastante efetivo de controle estomático para perdas de água em resposta a fatores
ambientais, que possibilita tolerar uma amplitude de variação do potencial de água foliar sem
alterar significativamente a condutância estomática. Todavia, quando o valor crítico de
potencial hídrico na folha é atingido, os estômatos começam a se fechar substancialmente, até
quase o fechamento total.
40
A transpiração foliar (Figura 1.20) seguiu a mesma tendência de comportamento da
condutância estomática (Figura 1.19), conforme tem sido observado por outros autores em
estudos com plantas de eucalipto (MIELKE et al., 1999; LIMA, JARVIS, RHIZOPOULOU,
2003; CHAVES et al., 2004; SILVA et al., 2004b; TATAGIBA et al., 2007; VELLINI et al.,
2008; MARTINS et al., 2008). Essa tendência comportamental é explicada por Larcher
(2006), ao afirmar que a medida que a disponibilidade de água no solo diminui, a taxa de
transpiração decresce, como resultado do fechamento dos estômatos.
A transpiração exerce uma importância crucial no balanço hídrico do vegetal, uma vez
que é responsável pela liberação de um grande volume de água, principalmente, através dos
estômatos (KRAMER; BOYER, 1995). Logo, a redução da condutância estomática através do
fechamento dos estômatos constitui uma importante e conhecida estratégia de tolerância das
plantas à deficiência hídrica, que proporciona a diminuição da taxa de transpiração, mantém o
conteúdo hídrico foliar, reduz o risco de desidratação e eventual morte por dessecação
(HSIAO, 1973; REIS; REIS, 1997; LARCHER, 2006; TAIZ; ZEIGER, 2009).
Figura 1.20 - Transpiração (E) de plantas jovens de eucalipto, sob dois regimes hídricos.
Gwenzi et al. (2012), ao avaliar as respostas hídricas de uma vegetação lenhosa perene
em um ecossistema artificial construído sob condições de seca sazonal, verificaram valores
menores de condutância estomática no verão e negativamente correlacionados com o
potencial hídrico da planta, que indica forte controle estomático da transpiração em resposta a
limitação hídrica. Comportamento semelhante foi observado por David et al. (2002), em
41
estudos com Quercus rotundifolia e por Silva et al. (2003), em três espécies lenhosas
(Mimosa caesalpiniifolia, Enterolobium contortisiliquum e Tabebuia áurea) sob estresse
hídrico.
3.3.2
Fotossíntese e concentração interna de CO2
Para a fotossíntese (A), houve interação significativa entre genótipo e regime hídrico
(Figura 1.21). Observou-se que mesmo no regime hídrico irrigado, os genótipos apresentaram
diferenças em suas taxas de fotossíntese líquida. O clone 953 apresentou uma taxa
fotossintética 21,49% superior ao clone 224, o que seria uma evidência de que os clones
diferem naturalmente entre si, no que diz respeito à fotossíntese, sendo aquele mais eficiente
em termos fotossintéticos que este. Considerando que este clone, 953, apresentou uma maior
matéria seca no compartimento foliar e menor área foliar, provavelmente ele apresenta maior
espessura do seu mesófilo, conforme indicado pelos menores valores de AFE, de maneira a
compensar a área foliar reduzida e por isso, porta-se como mais eficiente fotossinteticamente.
Ou seja, é tanto eficiente em termos de uso de água (folha reduzida implica em menor
transpiração), quanto fotossinteticamente, embora apresente lâminas pequenas, elas
provavelmente, possuem células do mesofilo maiores e em maior número.
Figura 1.21 - Fotossíntese (A) de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto, sob dois regimes hídricos.
Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os genótipos em cada regime hídrico e letras
maiúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os regimes hídricos, dentro de cada genótipo, pelo
42
teste F a 5% de significância.
A suspensão da irrigação causou declínio na fotossíntese líquida nos dois genótipos,
atingindo valores próximos a zero, não sendo verificada diferença estatística entre eles. A
redução das taxas fotossintéticas promovida por limitação hídrica em eucalipto tem sido
relatada na literatura (PEREIRA et al., 1986; STONEMAN; TURNER; DELL, 1994;
GUTIERREZ et al., 2002; LIMA; JARVIS; RHIZOPOULOU, 2003; TATAGIBA et al., 2007,
2009; WARREN; ARANDA; CANO, 2011; NAVARRETE-CAMPOS et al., 2013).
A fotossíntese é um dos principais processos a serem afetados por falta de água, tanto
por meio da redução da difusão do CO2 para o cloroplasto, quanto por restrições metabólicas.
O impacto relativo dessas limitações varia com a intensidade do estresse, com o estágio de
desenvolvimento da planta e idade da folha, com a ocorrência (ou não) de estresses
sobrepostos e com a espécie estudada (CHAVES; MAROCO; PEREIRA, 2003; PINHEIRO;
CHAVES, 2011). Vários artigos de revisão têm discutido os efeitos do déficit hídrico sobre a
fotossíntese de uma forma abrangente (CORNIC, 2000; FLEXAS; MENDRANO, 2002;
LAWLOR; CORNIC, 2002; CHAVES; FLEXAS; PINHEIRO, 2009).
No momento da medição, a concentração interna de CO2 (Ci) não apresentou efeitos
de interação entre genótipo vs. regime hídrico, sendo significativos somente efeitos de regime
hídrico (Figura 1.22). A concentração interna de CO2 foi, significativamente, maior no regime
hídrico não irrigado. Este aumento na Ci, segundo alguns autores, é um indicativo de
predominância de limitações não estomáticas ou metabólicas ao processo fotossintético. Com
o fechamento dos estômatos, a concentração de CO2 no interior da folha diminui com o
aumento do estresse, mas, aumenta à medida que o déficit hídrico torna-se mais severo
(LAWLOR, 1995). Flexas e Medrano (2002) complementam que, na maioria dos casos, o
ponto em que Ci começa a aumentar, conhecido como ponto de inflexão, ocorre em um Gs a
cerca de 0,05 H2O.m-2s-1, ou seja, ocorre em um estágio de déficit hídrico muito severo.
43
Figura 1.22 - Concentração interna de CO2 (Ci) de plantas jovens de eucalipto, sob dois regimes hídricos.
Reduções nas taxas fotossintéticas de plantas sob condições de déficit hídrico paralelas
ao aumento das concentrações internas de CO2 tem sido atribuídas, em parte, a fatores não
estomáticos em nível dos cloroplastos, como problemas no transporte de elétrons e na
fotofosforilação (KAISER; 1987). Para Ni e Pallardy (1992), o alto valor de Ci associado à
baixa condutância estomática seria um indicativo de decréscimo na eficiência de
carboxilação. Machado, Medina e Gomes (1999) explicam que este aumento da concentração
interna de CO2, quando associado a baixos potenciais hídricos, pode estar relacionado à queda
na atividade de enzimas envolvidas no processo de fixação de CO2. Macfarlane, White e
Adams (2004) atribuíram o aumento da Ci no interior de folhas de Eucalyptus globulus
acompanhado pelo decréscimo na condutância estomática, a limitações não estomáticas a
fotossíntese. Segundo Lawlor (2002), esta redução na fotossíntese de plantas submetidas à
deficiência hídrica podem estar relacionadas à limitação da regeneração de ribulose-1,5bifosfato (RuBP), e não a inibição das enzimas no ciclo de Calvin. E esta limitação,
provavelmente, está ligada à redução na síntese de ATP, devido a uma progressiva inativação
de fatores de acoplamento, resultante do aumento da concentração iônica (Mg+2) também
defendido por Rao, Sharp e Boyer (1987), e não à redução da capacidade do transporte de
elétrons ou de prótons.
44
Flexas e Medrano (2002), em uma revisão sobre as causas da inibição fotossintética
em plantas C3 sob condições de deficiência hídrica, utilizaram a Ci como um indicador da
predominância de limitações estomáticas ou não estomáticas no processo fotossintético ao
longo do desenvolvimento do estresse hídrico. Estes autores verificaram alterações
metabólicas prejudiciais à atividade fotossintética em condições de deficiência hídrica leve a
moderada, caracterizadas pela síntese prejudicada de ATP e a consequente redução da
regeneração da RuBP. Também verificaram reduções progressivas na atividade da enzima
ribulose bi-fosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco), assim como diminuições da eficiência
fotoquímica na medida que o déficit hídrico torna-se mais acentuado. Ainda, segundo Flexas e
Medrano (2002), numa condição extrema de deficiência hídrica, caracterizada por um
fechamento quase que completo dos estômatos, uma fotoinibição permanente pode vir a
ocorrer. Embora estes autores tenham verificado diminuição da capacidade destes processos
metabólicos, a diminuição da Ci confirma a predominância de limitação estomática na
restrição da taxa fotossintética na fase precoce de déficit hídrico, enquanto que os altos
valores de Ci seriam um indicativo de predominância de limitação a nível não estomático ou
metabólico, típicos de uma condição grave de deficiência hídrica.
Angelopoulos, Dichio e Xiloyannis (1996), Cornic (2000), Flexas e Medrano (2002),
Lawlor e Cornic (2002), Lawlor (2002), Grassi e Magnani (2005) amenizam o impacto do
efeito metabólico sobre a atividade fotossintética em plantas sob condições de deficiência
hídrica, o qual somente ocorreria em condições severas de estresse. Dessa forma, esses
autores afirmam que a limitação da fotossíntese é, principalmente, devido à menor difusão de
CO2 atmosférico para os sítios de carboxilação (menor Ci e menor disponibilidade de CO2
para a Rubisco), causada pelo fechamento estomático. Ainda, para Centritto, Loreto e
Chartzoulakis (2003) e Flexas et al. (2008) a limitação a difusão de CO2 inclui componentes
estomáticos e do mesofilo.
Uma linha argumentativa contrária afirma que a limitação da atividade fotossintética é
mais um efeito metabólico, como defendido por Ghannoum et al. (2003). Lauer e Boyer
(1992) mediram a Ci em plantas sob restrições hídricas e não detectaram redução desta, sob
condições de seca, o que mostra que a limitação da atividade fotossintética pode não estar
necessariamente associada à condutância estomática. Von Caemmerer e Farquhar (2004)
verificaram que a condutância estomática não está fortemente ligada à capacidade
fotossintética em plantas de tabaco. Leidi et al. (1993) trabalhando com plantas de algodão,
não observou relação direta entre a Ci e a condutância estomática, resultado semelhante foi
observado por Calbo e Moraes (1997) em plantas de buriti. Tezara et al. (1999) concluíram
45
que a assimilação fotossintética de CO2 por folhas estressadas de girassol não é limitada pela
difusão de CO2, mas através da inibição da síntese de RuBP, relacionada com menor teor de
ATP resultante do decréscimo na produção de ATP sintase.
Vale ressaltar que parte da controvérsia mencionada acima pode ser devido ao fato das
análises de A-Ci terem sido frequentemente usadas para descrever limitações não estomáticas
a fotossíntese (FLEXAS et al., 2004). No entanto, existem incertezas no cálculo da Ci sob
condições de seca, decorrentes do fechamento heterogêneo dos estômatos (TERASHIMA,
1992; BUCKLEY; FARQUHAR; MOTT, 1997) e da interferência da condutância cuticular
(BOYER et al., 1997). Este último pode provocar uma superestimava da Ci e, assim,
mascarar o efeito estomático na redução da A. Segundo Cornic (2000), estes dois problemas
dificultam, ou até mesmo impossibilitam, a obtenção de um valor correto da Ci em condições
de baixo potencial hídrico foliar, através de um sistema de troca de gás padrão. Além disso, as
mudanças induzidas pela seca na condutância do mesofilo para CO2 também pode invalidar a
interpretação das análises A-Ci (Flexas et al., 2002).
Desconsiderando a problemática subjacente a interpretação das análises A-Ci, os
resultados das trocas gasosas indicaram que as alterações nas taxas fotossintéticas dos
genótipos estudados, observadas no 10° dia de déficit hídrico, foram causadas por limitações
metabólicas, tendo em vista que sob deficiência hídrica as reduções das taxas de fotossíntese
líquida ocorreram concomitantemente ao aumento da Ci e à diminuição da condutância
estomática. Vale ressaltar que em função da disponibilidade do aparelho, as medições foram
efetuadas no 10° dia de aplicação do estresse hídrico, onde as mudas já apresentavam-se
debilitadas, com o substrato consideravelmente seco. Logo, valores altos de Ci obtidos estão
coerentes com a severidade do déficit hídrico manifestada pelos sintomas, da ausência de
água visível no substrato utilizado e da condutância estomática relativamente baixa (> 0,05
mol H2O.m-2s-1) observada no dia da avaliação.
3.3.3
Eficiência no uso da água
Com relação à eficiência no uso da água (EUA) (Figura 1.23), os resultados revelaram
que somente o efeito simples de regime hídrico foi significativo, não sendo possível
diferenciar os dois genótipos quanto a necessidade do consumo de água para cada unidade de
matéria seca produzida. Quando analisado o efeito dos regimes hídricos, o tratamento não
irrigado promoveu uma redução de 62,25% na EUA. Essa redução indica que os clones na
46
condição hídrica limitada apresentam menor assimilação de CO2 e, assim, produzem menos
matéria seca por unidade de volume de água consumida.
Figura 1.23 - Eficiência no uso da água (EUA) de plantas jovens de eucalipto, sob dois regimes hídricos.
Pereira et al. (1986) também constataram, em um plantio de E. globulus, maiores
valores da eficiência no uso da água durante a época de maior suprimento hídrico no solo.
Resultados semelhantes foram relatados por Stape et al. (2004) em híbridos de E. urophylla
vs. E. grandis. De acordo com Pereira et al. (2006), embora o eucalipto apresente altas taxas
de crescimento, e portanto altos valores de transpiração, o que leva ao aumento do consumo
de água, espécies do gênero apresentam altos valores de eficiência no uso da água.
A eficiência no uso de água dada pela razão entre a taxa fotossintética e a taxa de
transpiração é uma importante variável na avaliação dos efeitos do manejo da água, do solo e
da planta sobre o consumo de água e produção da cultura (LARCHER, 2006). Nas espécies
florestais, a eficiência no uso da água auxilia a compreensão das relações hídricas em plantas,
representando uma relação entre o incremento de biomassa e o volume de água utilizada no
período (HATFIELD; SAUER; PRUEGER, 2001). Há grande evidência de que a eficiência
no uso de água depende de cada espécie ou variedade vegetal e do estágio de
desenvolvimento, das condições ambientais e, sobretudo, da disponibilidade hídrica e da
capacidade de evaporação do ar (LINDROTH; CIENCIALA, 1995; LARCHER, 2006).
Segundo Whitehead e Beadle (2004), muitos estudos têm examinado a eficiência no
uso da água no cultivo de eucalipto em diferentes ambientes e sob diferentes tratamentos
47
silviculturais. Olbrich, Roux, Poulter (1993) ressaltam a importância do conhecimento dessa
variável no processo de seleção de espécies de eucalipto para determinadas condições. Por
outro lado, Tatagiba, Pezzopane e Reis (2008) relataram que a eficiência no uso da água
demonstrou ser uma estratégia ineficiente na seleção de clones para ambientes com
diferenciada disponibilidade hídrica no solo. Já para Navarrete-Campos et al. (2013), a
eficiência no uso de água não é uma variável adequada, por si só para selecionar genótipos
tolerantes à seca, mas pode fornecer evidências para descartar genótipos sensíveis à seca.
3.3.4
Temperatura foliar
Os resultados revelaram que somente o efeito simples de regime hídrico foi
significativo (Figura 1.24), não sendo possível estabelecer diferenças entre os dois genótipos
estudados para esta variável.
Figura 1.24 - Temperatura foliar (T) de plantas jovens de eucalipto, sob dois regimes hídricos.
Nas plantas do tratamento não irrigado foi observado um aumento da temperatura
foliar (T). Esse aumento, possivelmente, foi decorrente da redução da condutância estomática,
consequência do fechamento dos estômatos nas plantas sob estresse hídrico, o qual levou a
redução da transpiração foliar, e consequentemente, comprometeu a dissipação de calor das
folhas das plantas (TAIZ; ZEIGER, 2009). Ademais, quando a temperatura da folha é
analisada, comparando-se com outras variáveis, observa-se uma tendência comportamental
48
inversamente proporcional a condutância estomática e a transpiração, fortalecendo as
evidências de que o processo de resfriamento foliar mediante do fluxo transpiratório foi
comprometido pelo estado hídrico do mesofilo foliar. Embora o fechamento parcial ou total
do poro estomático amenize a perda de água através da transpiração, ele limita, não só a
difusão de CO2 para a câmara subestomática, mas, também, a dissipação de calor da folha,
afetando diretamente o balanço de calor sensível sobre o vegetal (BRUNINI; CARDOSO,
1998). Por outro lado, deve-se atentar ao fato de que a ventilação em casas de vegetação e em
viveiros experimentais pode ser afetada, dificultando, assim, a dissipação de calor pelas folhas
das plantas nesses ambientes.
Os resultados obtidos aqui coincidem com os obtidos por Pereira et al. (2006) ao
estudar o comportamento morfofisiológico de clones de eucalipto sob diferentes níveis de
água no solo. Estes autores verificaram que a deficiência hídrica promoveu a redução dos
valores da condutância estomática e transpiração concomitante ao aumento da temperatura
foliar de dois clones avaliados. A elevação da temperatura foliar decorrente do estresse hídrico
também foi relatado por Nogueira et al. (2001) em plantas jovens de acerola (Malpighia
emarginata) e por Silva et al. (2004a) em espécies da caatinga. Esses autores justificam a
elevação da temperatura foliar nas plantas submetidas a déficit hídrico em razão da menor
transpiração foliar nessas plantas, considerando que a transpiração é o principal mecanismo de
dissipação do calor dos vegetais (KRAMER; BOYER, 1995; BRUNINI; CARDOSO, 1998).
Ainda, alguns estudos têm relacionado a temperatura foliar como indicador do estresse
hídrico, diretamente. Oliva, Lopes e Façanha (1984) avaliaram a resistência à seca de três
espécies de eucalipto por meio da variação da temperatura foliar relacionada com a resistência
estomática e as variações do teor relativo de água. Segundo Testi et al. (2008), nas mesmas
condições ambientais, uma planta sob condições de estresse hídrico apresenta temperatura
foliar superior quando comparada àquela cultivada sob condições de plena disponibilidade
hídrica, sendo, portanto, um bom indicativo do “status” hídrico da planta. Para Silva et al.
(2003), a temperatura foliar de três espécies lenhosas não se mostrou um bom indicador dos
efeitos do estresse hídrico.
3.3.5
Índice de clorofila total
Os resultados demonstraram que, em relação ao índice de clorofila total, todas as
interações (genótipo vs. regime hídrico, genótipo vs. tempo, regime hídrico vs. tempo e
49
genótipo vs. regime hídrico vs. tempo) foram significativas. Vale ressaltar que, não é de
interesse o desdobramento da interação genótipo vs. tempo.
O índice de clorofila total do clone 224, considerando a interação genótipo vs. regime
hídrico vs. tempo foi, significativamente, afetado pelo déficit hídrico no último dia do
experimento (15°). Neste dia, a deficiência hídrica provocou um declínio de 33,99% no índice
de clorofila total para este clone (Figura 1.25). Para o clone 953, já no 6° dia de estresse,
verificou-se efeito significativo do déficit hídrico. Desse dia até o final do experimento, a
limitação hídrica, diferente do observado para o clone 224, incrementou o índice de clorofila
total do clone 953. Ressalta-se, também, que no 11° dia de estresse foram verificadas
diferenças no teor de clorofila entre os genótipos no regime hídrico irrigado, com destaque
para o clone 953. Analisando o comportamento dos genótipos dentro do regime hídrico não
irrigado, em todos os dias de avaliação, excetuando-se o primeiro dia de aplicação do estresse,
foi verificada diferença estatística no teor de clorofila do clone 953 em relação ao 224, com
maiores teores de clorofila total para o 953.
Figura 1.25 - Índice de clorofila total de plantas de clones de eucalipto, sob dois regimes hídricos, em diferentes
tempos de avaliação.
Os pigmentos fotossintéticos estão estreitamente relacionados com estresses
ambientais (CARTER; KNAPP, 2001; SPITALE, 2009; XUE et al., 2011) e, estes estresses,
estão associados, tipicamente, com degradação de clorofilas e declínio na capacidade
fotossintética (MARENCO; LOPES, 2005; HATFIELD et al., 2008). Redução no teor de
clorofila tem sido considerado uma reação comum a estresse hídrico (GRZESIAK et al.,
50
2007; ANJUM et al., 2011; DUTRA et al., 2012; EBRAHIMIYAN et al., 2013; HUANG et
al., 2013), assim como uma limitação direta ao processo fotossintético e, portanto, a produção
primária da planta (HUANG et al., 2013).
Os dados obtidos mostram que a imposição de até 11 dias de deficiência hídrica não
foi capaz de levar a mudanças no conteúdo de clorofila no genótipo sensível, sendo
verificadas reduções somente a partir do 15° dia de estresse (Figura 1.25). Similarmente,
Nautiyal, Negi e Kumar (1996) verificaram decréscimos no conteúdo de clorofila em plantas
de Pongamia pinnata somente em condições hídricas mais severas. De acordo com esses
autores, isso mostra que a espécie em questão é capaz de sobreviver e manter-se
fotossinteticamente ativa em condições moderadas de déficit hídrico. No entanto, condições
mais severas têm efeito adverso sobre o conteúdo de clorofila. Segundo Huang et al. (2013), o
decréscimo substancial ou mudanças no conteúdo de clorofila durante o déficit hídrico
depende da intensidade, severidade e duração do déficit.
A severidade do estresse verificado no 15° dia de avaliação, confirmada pelos
sintomas, pela secura visível do substrato utilizado e pela condutância estomática
consideravelmente baixa (> 0,05 mol H2O m-2s-1), provavelmente, favoreceu a formação e
acúmulo de espécies reativas de oxigênio, que danificam as plantas oxidando pigmentos
fotossintéticos, lipídeos de membrana, proteínas e ácidos nucleicos (AGASTIAN;
KINGSLEY; VIVEKANANDAN, 2000; RAOUDHA et al., 2007; XUE et al., 2011). Essas
espécies reativas de oxigênio são responsáveis pela degradação das membranas dos tilacoides
nos cloroplastos, por meio da peroxidação de seus lipídeos (MARENCO; LOPES, 2005); fato
observado em plantas de trigo submetidas à limitação hídrica nas quais essas taxas de
peroxidação aumentaram consideravelmente com a severidade do estresse (TATAR;
GEVREK, 2008). O decréscimo no teor de clorofila sob estresse hídrico tem sido apontado,
portanto, como um sintoma característico de estresse oxidativo e pode ser o resultado de fotooxidação do pigmento e degradação da clorofila (XUE et al., 2011).
Em contrapartida, o clone 953 incrementou o seu conteúdo de clorofila ao longo da
aplicação do déficit hídrico. Resultado similar foi encontrado por Silva, Klar e Passos (2004),
em E. grandis e por Yanqiong et al. (2007) em quatro espécies arbustivas sob restrição
hídrica. Alguns autores têm observado incremento no teor de clorofila em condições de
estresse moderado e o tem justificado em razão de uma possível desaceleração do crescimento
celular em relação à síntese de clorofila. Ebrahimiyan et al. (2013), por exemplo, encontraram
uma relação entre o conteúdo de clorofila e a produção de matéria seca em condições de
51
estresse hídrico moderado, indicando que a perda de peso foliar após o estresse moderado
pode resultar em aumento relativo do teor de clorofila.
Por outro lado, alguns autores não têm verificado diferença significativa no conteúdo
de clorofila total de algumas espécies sob diferentes regimes hídricos, como Egert e Tevini
(2002), em plantas de Allium schoenoprosum e Shvaleva et al. (2006), em E. globulus.
Embora a degradação de pigmentos fotossintéticos devido a dano oxidativo seja um sintoma
comum em plantas expostas a estresse hídrico severo, as plantas podem, segundo Egert e
Tevini (2002), proteger-se sintetizando moléculas antioxidantes (carotenóides, ascorbato, atocoferol, glutationa e flavonóides) ou, ainda, aumentando a síntese de enzimas antioxidantes
(peroxidases, superóxido dismutase e catalases).
Mediante o exposto, o incremento observado no teor de clorofila no clone 953, desde
os estágios iniciais do estresse até o último dia de aplicação da deficiência hídrica, pode ter
sido devido à desaceleração do crescimento em relação a síntese de clorofila nos estágios
iniciais do estresse, associada a presença de um mecanismo antioxidante eficiente sob
restrição hídrica severa.
3.3.6
Variáveis da clorofila a
Para a variável fluorescência mínima (Fo), as interações genótipo vs. regime hídrico,
genótipo vs. tempo e genótipo vs. regime hídrico vs. tempo foram significativas (Figura 1.26).
Já para a variável fluorescência máxima (Fm), além das citadas acima, foi também
significativa a interação regime hídrico vs. tempo (Figura 1.27). Para a variável eficiência
quântica do FSII, expressa pela relação Fv/Fm, os resultados revelaram que as interações
genótipo vs. regime hídrico, genótipo vs. tempo e regime hídrico vs. tempo foram
significativas (Figura 1.28). Ressalta-se que não é de interesse o desdobramento da interação
genótipo vs. tempo, quando significativa.
A análise do desdobramento da interação genótipo vs. regime hídrico vs. tempo revela
que a deficiência hídrica causou efeitos significativos nos valores de fluorescência mínima de
ambos os clones no 15° dia após a aplicação do estresse. Neste dia, o regime hídrico não
irrigado diminuiu em 37,76% a Fo do clone 224, enquanto que aumentou a do clone 953 em
39,52%.
52
Figura 1.26 - Fluorescência mínima (Fo) de plantas de eucalipto, sob dois regimes hídricos, em diferentes
tempos de avaliação.
Os efeitos do déficit hídrico sobre a fluorescência mínima (Fo), caracterizada pela luz
emitida pelas moléculas de clorofilas a excitadas, antes da energia ser dissipada para o centro
de reação do FSII (KRAUSE; WEISS, 1991; BAKER; ROSENQVST, 2004), têm sido objeto
de controvérsia na literatura. Alguns autores consideram que a redução encontrada para essa
variável pode estar associada com a ocorrência de comprometimentos no centro de reação do
FSII ou, ainda, a prejudicada transferência da energia de excitação do complexo antena para
os centros de reação, indicando maior sensibilidade às condições hídricas limitantes (SILVA et
al., 2006; TATAGIBA; PEZZOPONE, 2007; MICHELOZZI et al., 2011). Dentro dessa linha
de raciocínio, o aumento da Fo estaria relacionado a uma maior possibilidade de adaptação às
condições fotoinibitórias provenientes do déficit hídrico. Incremento na fluorescência mínima
foi relatado por Tatagiba e Pezzopone (2007) em plantas de eucalipto na estação seca. Estes
autores atribuíram esse incremento a capacidade dos clones de eucalipto tolerarem a
deficiência hídrica encontrada no solo.
Por outro lado, vários outros autores têm considerado o incremento da Fo um efeito
negativo do déficit hídrico, como o relatado por Zlatev e Yordanov (2004), em plantas de
feijão e por Calatayud, Roca e Martínez (2006), em roseiras. Segundo estes dois últimos
autores, o nível mais elevado observado da Fo pode ser atribuído a um aumento na fração de
centros de reação do FSII, em um estado fotoinativado, o que levaria a uma diminuição na
capacidade fotoquímica do FSII. Efeoğlu, Ekmekçi e Çiçek (2008), em estudos com plantas
de milho, também verificaram incremento da Fo sob restrição hídrica, o que, de acordo com
53
eles, poderia ser consequência de uma variedade de causas. Uma delas seria uma dissociação
do complexo de coleta de luz do Fotossistema II (Light-Harvesting Complex II – LHCII) dos
centros de reação. Outra possível causa seria a fotoinibição dos centros de reação, ou ainda, à
redução do “pool” da plastoquinona (PQ) de folhas que passaram por adaptação ao escuro.
Matos et al. (2010) atribuíram o aumento da fluorescência mínima em plantas de Cicer
arietinum sob restrição hídrica à maiores perdas da energia de excitação durante sua
transferência da antena para o centro de reação. Incremento desta variável também foi
relatado por Bączek-Kwinta, Kozieł e Seidler-Łożykowska (2011) em plantas de Chamomilla
recutita. Considerando esta segunda linha de raciocínio, o genótipo 224 respondeu melhor à
limitação hídrica no 15° dia de estresse, embora essa resposta não tenha sido refletida no
aumento da eficiência quântica do FSII.
Ao analisar a variável fluorescência máxima, mediante o desdobramento da interação
genótipo vs. regime hídrico vs. tempo, verifica-se que, diferente do relatado para a variável
discutida acima, já no 6° dia de estresse, o déficit hídrico promoveu uma redução de 36,90%
na Fm das plantas do clone 224 e esta redução tornou-se mais evidente nos 11° (74,89%) e
15° (85,36%) dias de estresse (Figura 1.27). Já para o clone 953, só foram verificados efeitos
do regime hídrico não irrigado sobre a Fm nos 11° e 15° dias de déficit hídrico, sendo
reduzida em 64,51% e 64,20%, respectivamente. Além do mais, no 11° dia de estresse os
quatro tratamentos apresentaram uma queda visível para esta variável. No entanto, manteve-se
os efeitos proporcionais do déficit hídrico sobre os genótipos.
54
Figura 1.27 -Fluorescência máxima (Fm) de plantas de eucalipto, sob dois regimes hídricos, em diferentes
tempos de avaliação.
A fluorescência máxima indica a completa redução da quinona A (QA) a partir da
incidência de um pulso de luz saturante no centro de reação da QA. Durante a aplicação desse
pulso, o rendimento quântico do processo fotoquímico diminui consideravelmente, ou seja, os
centros de reação do sistema fotossintético se fecham e a emissão de fluorescência atinge o
seu valor máximo (Fm) (MAXWELL; JOHNSON, 2000; BAKER; ROSENQVST, 2004).
De acordo com Silva et al. (2006), esta redução da Fm observada no regime hídrico
não irrigado, em ambos os genótipos estudados, caracteriza, de maneira geral, deficiências de
fotorredução da quinona A (QA), principal aceptor de elétrons do Fotossistema II. Essas
deficiências podem estar associadas à inativação do FSII nas membranas tilacoidais, afetando,
diretamente, o fluxo de elétrons entre os fotossistemas. Comportamento similar foi relatado
por estes mesmos autores em diferentes espécies forrageiras submetidas à restrição hídrica.
O efeito mais tardio e menos intenso da deficiência hídrica observado sobre o clone
953 sugere menor sensibilidade desse genótipo à maior intensidade e duração do déficit
hídrico aplicado (SILVA et al., 2006), indicando maior tolerância à seca, comparativamente ao
clone 224. Os resultados obtidos coincidem também com o relatado por Zlatev e Yordanov
(2004), em plantas de feijão, e por Bączek-Kwinta, Kozieł e Seidler-Łożykowska (2011), em
plantas de Chamomilla recutita. Em contraste, Tatagiba e Pezzopone (2007) verificaram
incremento para esta variável em plantas de eucalipto na estação seca. De acordo com eles,
este incremento durante a época seca mostra que o baixo suprimento hídrico não causou
55
deficiência na fotorredução da quinona A (QA) e nem no fluxo de elétrons entre os
fotossistemas dos clones estudados.
O declínio da fluorescência máxima verificado em ambos os genótipos pode estar
correlacionado com o aumento das taxas de degradação das proteínas D1, ocasionada pela
ação das espécies reativas de oxigênio, um subproduto da restrição hídrica (GIARDI et al.,
1996; PIETERS; TEZARA; HERRERA, 2003; ZLATEV; YORDANOV, 2004; RIVERO et
al., 2010). As proteínas D1 desempenham um papel importante para o funcionamento do
Fotossistema II, uma vez que o fluxo de elétrons do centro de reação é transferido para
quinona A, a qual, ao atingir sua completa redução, emite a fluorescência em seu nível
máximo (ARAÚJO; DEMINICIUS, 2009; RIVERO et al., 2010). Dessa forma, com o
aumento das taxas de degradação dessas proteínas pelo déficit hídrico, menos energia seria
transferida do centro de reação do Fotossistema II para a quinona A, resultando em baixos
níveis de fluorescência máxima.
Quanto a eficiência quântica do FSII (Fv/Fm), segundo a análise da interação regime
hídrico vs. tempo, até o 6° dia após a suspensão da irrigação não havia ocorrido declínio nesta
variável para os genótipos estudados. Nesse período, os valores estavam dentro do
considerado ótimo (0,75 a 0,85) (Figura 1.28). A partir do 6° dia, foi verificado efeito do
déficit hídrico na razão Fv/Fm, o qual tornou-se mais evidente nos 11° e 15° dias de estresse.
Nestes últimos dias de experimento, a suspensão da irrigação causou declínio na relação
Fv/Fm, para valores próximos a zero. Segundo Bolhàr-Nordenkampf et al. (1989), essa queda
significativa pode estar correlacionada com danos ao aparato fotossintético das plantas, uma
vez que plantas com aparelho fotossintético em perfeito estado, típico de condições ótimas de
desenvolvimento, apresentam uma eficiência quântica do FSII, expressa pela razão Fv/Fm,
variando entre 0,75 e 0,85.
56
Figura 1.28- Eficiência quântica do FSII, expressa pela razão Fv/Fm, de plantas de eucalipto, sob dois regimes
hídricos, em diferentes tempos de avaliação.
A análise do rendimento da fluorescência da clorofila revela o nível de excitação da
energia no sistema de pigmentos que dirige a fotossíntese e permite mostrar a extensão da
inibição ou do dano no processo de transferência de elétrons do FSII, decorrente dos estresses
ambientais,
inclusive
o
hídrico
(BJÖRKMAN;
POWLES,
1984;
BOLHÀR-
NORDENKAMPF et al., 1989; KRAUSE; WEIS, 1991).
O desdobramento da interação genótipo vs. regime hídrico revela que a restrição
hídrica alterou a eficiência quântica do FSII de ambos os clones, para valores inferiores a 0,75
(Figura 1.29). A queda mais drástica da relação Fv/Fm foi verificada no clone 224, que teve
sua eficiência quântica reduzida em 56,27% e para valores abaixo de 0,40. Ao analisar os
genótipos dentro de cada regime hídrico, não foram verificadas diferenças na eficiência
quântica entre dois clones no regime hídrico irrigado e os valores foram superiores a 0,75.
Entretanto, no regime hídrico não irrigado, o clone 224 apresentou uma relação Fv/Fm
31,13% inferior ao clone 953, indicativo de ter sofrido um efeito mais severo do estresse,
salientado ser, de fato, mais sensível ao déficit hídrico.
Reduções na eficiência quântica do FSII, indicativas de uma regulação fotoprotetora
reversível ou de uma inativação irreversível do FSII, têm sido relatadas para várias espécies
vegetais como consequência da deficiência hídrica do solo (PIETERS; SOUKI, 2005; SILVA
et al., 2006; PAKNEJAD et al., 2007; DITMAROVÁ et al., 2010; ARAÚJO et al., 2010;
MICHELOZZI et al., 2011; WANG et al., 2012).
57
Figura 1.29 - Eficiência quântica do FSII, expressa pela razão Fv/Fm, de plantas de dois genótipos de eucalipto,
sob dois regimes hídricos. Letras minúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os genótipos em
cada regime hídrico e letras maiúsculas diferentes indicam diferença significativa entre os regimes hídricos,
dentro de cada genótipo, pelo teste F a 5% de significância.
O declínio da relação Fv/Fm dos clones de eucalipto sob déficit hídrico coincide com
o comportamento observado por Rolando e Little (2003), em mudas de E. grandis, e por
Lima, Jarvis e Rhizopoulou (2003), em cinco espécies de Eucalyptus (E. grandis, E.
urophylla, E. camaldulensis, E. torelliana e E. phaeotrica). Estes últimos autores ainda
relataram que o E. camaldulensis portou-se como o menos sensível à fotoinibição, quando
comparado às plantas controles. Embora, essa razão normalmente decresça em plantas
submetidas a algum tipo de estresse, Epron e Dryer (1990) e Tatagiba e Pezzopone (2007) não
detectaram reduções na eficiência fotoquímica do FSII em plantas de carvalho e eucalipto
submetidas a déficit hídrico. Palanisamy (1999) também não observaram reduções nesta
variável em plantas de E. cladocalyx no regime hídrico estressado, o que, segundo eles, é um
indicativo de insensibilidade à alterações na disponibilidade hídrica. Rolando e Little (2008)
também não verificaram alterações na fluorescência da clorofila em mudas de E. grandis sob
déficit hídrico. Segundo estes autores, a surpreendente falta de alterações nos parâmetros
mensuráveis da fluorescência pode ter sido devido a utilização de mudas mais tolerantes à
seca ou ainda devido ao curto período experimental. Em contrapartida, Susiluoto e Berninger
(2007) verificaram que a resposta de E. Microtheca à seca em casa-de-vegetação
incrementava a relação Fv/Fm sob condições hídricas estressantes.
58
Há, também, evidências de que os efeitos do estresse hídrico sobre o Fotossistema II
podem ser mediados pela produção e acumulação de espécies reativas de oxigênio, devido a
uma maior exposição dos cloroplastos ao excesso de energia de excitação, consequente, da
redução na fixação do CO2, tanto por limitação estomática, quanto não estomática. Estes
compostos causam extensivos danos às membranas, mediante peroxidação de lipídios, com
consequente degradação de pigmentos e queda na atividade fotossintética (SMIRNOFF,
1993). Queiroz, Garcia e Filho (2002) completam afirmando que o déficit hídrico intensifica a
formação de radicais livres em plantas por limitar o "pool" de NADP+ disponível para aceitar
elétrons do Fotossistema I. Isso aumenta a probabilidade de transferência de energia de
excitação para O2. Assim, espécies reativas de oxigênio teriam suas taxas aumentadas
(SMIRNOFF, 1993; REDDY et al., 2004), criando oportunidade para a ocorrência de danos
oxidativos nas membranas dos tilacoides dos cloroplastos, onde estão localizados os
fotossistemas, resultando na destruição, por exemplo, das proteínas D1 e D2 do centro de
reação do FSII (CHAVES; MAROCO; PEREIRA, 2003; REDDY et al., 2004; LIU et al.,
2006). O resultado dessa ação seria refletido pelos baixos valores de rendimento quântico.
Segundo Reddy et al. (2004), além das proteínas D1 e D2, as enzimas do ciclo de CalvinBenson e as enzimas que contêm Fe2+, são as mais afetadas pelas espécies reativas de
oxigênio.
Certamente, os efeitos negativos do déficit hídrico sobre a integridade estrutural e
funcional do FSII, ocorridos neste experimento, foi consequente da degradação de outros
componentes do FSII, que não as clorofilas, uma vez que no 6° dia de experimento o teor de
clorofila do clone 224 não foi alterada pelo déficit hídrico, embora, neste mesmo dia, tenha
ocorrido redução da relação Fv/Fm (Figura 1.30). Para este mesmo clone, a queda no
conteúdo de clorofila só coincide com o declínio da eficiência quântica do FSII no 15° dia de
estresse. Já para o clone 953, foram verificados aumento no teor de clorofila ao longo de todo
o experimento sob condições hídricas limitantes.
Embora, a interação genótipo vs. regime hídrico vs. tempo não tenha sido significativa
a 5% de significância, observa-se que no 6° dia de estresse hídrico somente o clone 224 foi
afetado negativamente pelo regime hídrico não irrigado (Figura 1.30). Provavelmente, esse
fato deveu-se ao decréscimo da fluorescência máxima (Figura 1.27). Neste mesmo dia, as
plantas do clone 953 apresentaram valores acima de 0,75 para relação Fv/Fm e nenhum
sintoma visível em resposta a deficiência hídrica. Segundo Silva et al. (2007), esta habilidade
em manter valores semelhantes de Fv/Fm sob estresse hídrico pode indicar alta eficiência no
uso da radiação, possivelmente, pelas reações de assimilação de carbono. Logo, o
59
aparecimento mais tardio e menos intenso de dano ao FSII verificado no clone 953 pode ser
um indicativo de um aparelho fotossintético mais eficiente que o do 224, quanto à tolerância
às condições fotoinibitórias decorrentes da baixa disponibilidade hídrica.
Vários autores têm considerado a eficiência quântica do FSII uma variável sensível e
útil na identificação de genótipos tolerantes à seca em diferentes espécies vegetais
(ROLANDO; LITTLE, 2003; SILVA et al., 2006; GONÇALVES et al., 2010; ARAÚJO et
al., 2010), com destaque para o trabalho realizado por SILVA et al. (2007) que confirmam a
confiabilidade dessa variável para este fim, tendo a vantagem adicional de possibilitar uma
avaliação rápida e não destrutiva.
Figura 1.30 - Eficiência quântica do FSII, expressa pela razão Fv/Fm, de plantas de eucalipto, sob dois regimes
hídricos em diferentes tempos de avaliação.
60
4
CONCLUSÕES
O presente estudo permite concluir que:

Todas as variáveis morfológicas, com exceção da altura, e todas as variáveis de
trocas gasosas foram negativamente afetadas pelo déficit hídrico, com destaque
para a fotossíntese que atingiu valores próximos a zero, devido a efeitos não
estomáticos.

O clone 224 mostrou-se mais sensível à restrição hídrica para a maioria das
variáveis analisadas. Ademais, este clone portou-se como menos eficiente em
termos fotossintéticos, comparativamente ao clone 953.

A maior tolerância à seca do clone 953 foi confirmada mediante a manifestação
mais tardia de sintomas de deficiência hídrica e através da adoção de algumas
estratégias, como área foliar reduzida e menos sensível ao déficit hídrico, aumento
no teor de clorofila e aparelho fotossintético mais eficiente quanto à tolerância às
condições fotoinibitórias decorrentes da baixa disponibilidade hídrica. Essas
estratégias podem, portanto, serem alvos em programas de melhoramento florestal,
visando a seleção de materiais genéticos tolerantes à seca.

A eficiência quântica do FSII, expressa pela razão Fv/Fm, mostrou-se uma
ferramenta confiável na seleção para tolerância à seca, tendo a vantagem adicional
de possibilitar uma avaliação precisa, econômica, rápida e não destrutiva.
61
CAPÍTULO 2
Construção de uma Biblioteca Subtrativa contendo genes diferencialmente expressos em
Eucalyptus spp. sob estresse hídrico
1 INTRODUÇÃO
Os vegetais, frequentemente, são expostos a fontes ambientais externas que causam
condições de estresse. Seca ou excesso de água, alta salinidade, baixas ou altas temperaturas,
pouca ou muita luminosidade, baixa disponibilidade nutricional são exemplos importantes de
fatores abióticos comumente enfrentados pelas plantas em seus ambientes nativos. Tais
fatores, geralmente, promovem limitações no crescimento, desenvolvimento e produtividade
das plantas. Para transpor tais limitações impostas por estes fatores, as plantas desenvolveram
diversas adaptações genéticas, bioquímicas e fisiológicas (NEPOMUCENO et al., 2001;
ZHU, 2002; BARTELS; SUNKAR, 2005; MENESES et al., 2006). Diante destes estímulos
estressantes, muitos genes são induzidos e os produtos codificados por eles têm sido
relacionados com diversas funções.
A resposta ao estresse inicia-se quando a planta o reconhece a nível celular (BRAY;
BALLEY-SERRES; WERETILNIK, 2000). Os mecanismos de percepção do estresse ativam
as vias de transdução de sinais, que são rotas de sinalização interconectadas na forma de uma
rede e que transmitirão informações para o interior das células, bem como por toda a planta.
Em último plano, estes sinais irão promover mudanças no padrão de expressão gênica basal
da planta, desencadeando uma cascata de eventos moleculares que é finalizada em vários
níveis de respostas fisiológicas, metabólicas e de desenvolvimento (BRAY, 1993;
SHINOZAKI;
YAMAGUCHI-SHINOZAKI,
1997;
BRAY;
BALLEY-SERRES;
WERETILNIK, 2000; ZHU, 2002). A nível didático, a complexa rede de respostas celulares a
estresses ambientais pode ser dividida em três etapas: a percepção e transmissão do estímulo
agressor; a ativação de fatores de transcrição; e, por último, a ativação dos mecanismos
específicos de resposta ao estresse. Logo, a resposta final, de tolerância/resistência ou de
sensibilidade/suscetibilidade ao fator abiótico, nada mais é que o produto da expressão gênica
diferencial a ocorrer no organismo, naquela célula, e, ou, tecido. Ser sensível/suscetível ou
tolerante/resistente irá depender de quais genes o organismo em questão possui e da
velocidade de resposta ao estímulo. Logo, para escapar ao estresse, primeiro há que se ter os
62
genes necessários à defesa, depois, expressá-los na velocidade adequada a contenção do
estímulo agressor.
Dentro deste contexto, o estresse hídrico configura-se como uma das limitações mais
importantes ao crescimento das plantas e à produtividade dos ecossistemas ao redor do mundo
(PASSIOURA, 1996; AUSSENAC, 2000). Uma diversidade de genes, com diferentes
funções, tem sido relacionada à resposta ao estresse hídrico em várias espécies vegetais.
Dentre essas funções, destacam-se: proteção das células contra a deficiência hídrica por meio
da produção de proteínas metabólicas importantes, aumento da absorção de água mediante
alterações no potencial osmótico celular, controle da acumulação de íons, metabolização de
compostos alterados pelo sinal de estresse e regulação da expressão gênica (BRAY, 1993;
1997; NEPOMUCENO et al., 2001; RAMANJULU; BARTELS, 2002; ZHU, 2002).
O controle genético da tolerância à seca é, portanto, considerado uma função
poligênica, envolvendo vários loci distribuídos em diferentes regiões do genoma da planta.
Então, genótipos que diferem em tolerância ao déficit hídrico devem apresentar diferenças
qualitativas e quantitativas em expressão gênica (CASAGRANDE et al., 2001).
Em eucalipto, assim como em outras culturas, as respostas ao déficit hídrico também
são altamente complexas, dependem de uma gama de fatores e abrangem vários aspectos,
incluindo mudanças no comportamento morfológico e fisiológico da planta (CLAYTONGREENE, 1983; MYERS; NEALES, 1986; MYERS; LANDSBERG, 1989; NAUTIYAL et
al., 1994; STONEMAN; TURNER; DELL, 1994; LI, 1998; LI, 2000; LI; WANG, 2003;
NGUGI et al., 2003a,b; COOPMAN et al., 2008; VELLINI et al., 2008). Tais mudanças
morfológicas, fisiológicas e de desenvolvimento têm uma base genético-molecular que pode
ser elucidada.
A intensidade da resposta a uma condição hídrica estressante varia de acordo com a
duração, a severidade e as taxas com que o estresse é imposto (KRAMER; BOYER, 1995;
BRAY, 1997; SANTOS; CARLESSO, 1998; PIMENTEL, 2004; TAIZ; ZEIGER, 2009;
RODRIGO, 2007), bem como com a capacidade de percepção do sinal, da transdução desse
mesmo sinal, e com a resposta que ocorre ao nível da expressão gênica, ou, ainda, ao nível de
outros processos metabólicos, que possam ser exclusivos de alguns genótipos, como por
exemplo, os tolerantes à seca (BARTELS; SUNKAR, 2005).
Entender, portanto, como genótipos considerados tolerantes à seca respondem ao
estresse geneticamente é fundamental para o conhecimento do controle genético desta
característica, além de poder ser útil à seleção e desenvolvimento de genótipos capazes de
tolerar diferentes níveis de estresse hídrico em curto espaço de tempo.
63
Recentemente, várias técnicas têm sido empregadas para identificar os genes cuja
expressão é diferencialmente regulada em resposta a vários dos estresses abióticos. Tais
métodos incluem a análise diferencial em reação de cadeia de polimerase (DDPCR –
Differential Display PCR), análise serial da expressão gênica (SAGE), chips de DNA e
microarranjos, cDNA-AFLP (cDNA Amplified Fragment Length Polymorphism) e construção
de bibliotecas subtrativas por hibridação (SSH - Suppression Subtractive Hybridization),
(FREEMAN;
ROBERTSON;
VRANA,
2002;
RODRÍGUEZ;
CANALES;
BORRÁSHIDALGO, 2005).
Esta última técnica, Supression Subtractive Hybridization, desenvolvida por
Diatchenko et al. (1996), têm se destacado como uma ferramenta poderosa na análise da
expressão gênica diferencial entre plantas tolerantes e sensíveis a diferentes tipos de estresses.
Esta ferramenta biotecnológica permite analisar a expressão diferencial entre duas amostras
de cDNA, subtraindo os transcritos comuns e isolando transcritos presentes exclusivamente
em uma das amostras, o que possibilita a clonagem de genes diferencialmente expressos, para
posterior sequenciamento, identificação e caracterização. Embora a SSH envolva múltiplos
passos, seja um tanto laboriosa e de alto custo, é uma técnica relativamente rápida e poderosa,
capaz de gerar um valioso conjunto de dados de expressão gênica diferencial entre genótipos
contrastantes (DIATCHENKO et al., 1996).
Na literatura há relatos do emprego dessa técnica com êxito no gênero Eucalyptus para
a identificação de genes diferencialmente expressos durante a formação da madeira (PAUX et
al., 2004; FOUCART et al., 2006; RENGEL et al., 2009), bem como na identificação de
genes envolvidos na simbiose com micorrizas (VOIBLET et al., 2001) e de genes responsivos
ao Cylindrocladium quinqueseptatum (FENG et al., 2012).
Ressalta-se que, embora os mecanismos de tolerância à seca têm sido descritos com
detalhes em nível molecular para culturas anuais e perenes, como o Arabdopsis e Populus
(PLOMION et al., 2006; BOGEAT-TRIBOULOT et al., 2007; CARUSO et al., 2008;
LEFEBVRE; KIANI; DURAND-TARDIF, 2009; HAMANISHI et al., 2010; WILKINS;
BRAUTIGAM; CAMPBELL, 2010; HARB; PEREIRA, 2011; SONG et al., 2012), ainda são
poucos os conhecimentos sobre as bases moleculares de tolerância à seca em Eucalyptus.
À vista do exposto, este trabalho objetivou construir uma biblioteca subtrativa
supressiva contendo genes diferencialmente expressos em um genótipo de Eucalyptus
tolerante à seca, em contraste a outro genótipo sensível.
64
2
MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Coleta e acondicionamento do material vegetal
As folhas mais jovens de 12 plantas submetidas a déficit hídrico provenientes do
experimento descrito na seção 2 do capítulo anterior foram coletadas no 5° dia (13 de janeiro
de 2013) e 10° dia (18 de janeiro de 2013), após a supressão hídrica. As folhas coletadas
foram acondicionadas em sacos plásticos, adequadamente identificados, congeladas sob
nitrogênio líquido e armazenadas a -80 oC.
2.2 Extração e Purificação de RNA total
Para a construção da biblioteca SSH, foram selecionadas amostras de folhas do
genótipo tolerante e do genótipo sensível (seis plantas de ambos os genótipos, sendo três
plantas coletadas em cada tempo) submetidos ao regime hídrico não irrigado.
2.2.1
Extração de RNA total
A extração de RNA total das amostras foi conduzida com o reagente PureLink® Plant
RNA (Invitrogen), de acordo com as recomendações fornecidas pelo fabricante. Utilizou-se o
procedimento indicado para isolamento de RNA total em pequena escala. Para tal, realizou-se
a maceração de aproximadamente 100 mg do tecido vegetal (folha), com auxílio de nitrogênio
líquido, em um grau e pistilo de porcelana.
O material macerado foi transferido para um tubo de microcentrífuga, previamente
resfriado com nitrogênio líquido, onde adicionaram-se 0,5 ml do reagente Pure Link Plant
RNA à 4 °C. A mistura, totalmente ressuspendida, foi mantida por 5 minutos à temperatura
ambiente. Centrifugou-se a amostra à 12.000 x g, por 2 minutos, à temperatura ambiente
(Centrífuga: Beckman Coulter Modelo: Allegra X-22R) e o sobrenadante foi transferido para
um novo tubo de microcentrífuga. Adicionou-se 0,1 ml de NaCl (5M), homogeneizou-se a
mistura e procedeu-se a adição de 0,3 ml de clorofórmio, homogeneizando-se, novamente, por
meio de inversão dos tubos. Após centrifugar as amostras à 12.000 x g, por 10 minutos, a 4
°C, a fase aquosa (sobrenadante) foi transferida para um novo tubo de microcentrífuga. A cada
amostra foi adicionado um volume de álcool isopropílico, homogeneizado e mantida a mistura
em repouso por 10 minutos à temperatura ambiente. Realizou-se uma nova centrifugação nas
65
mesmas condições descritas anteriormente. Removeu-se, cuidadosamente, o sobrenadante,
sem perder o precipitado, e adicionou-se 1 ml de etanol 75%. Posteriormente, centrifugou-se à
12.000 x g, por 1 minuto à temperatura ambiente e removeu-se o sobrenadante
cuidadosamente para não perder o precipitado. Logo após, realizou-se uma breve
centrifugação, retirando-se o líquido residual com auxílio da micropipeta. O RNA extraído foi
ressuspendido em 30 µl de água livre de RNase e armazenado à temperatura de -80 °C até o
momento da sua utilização.
Antes do armazenamento, a qualidade e a concentração do RNA foram determinadas
através da leitura das amostras em comprimento de onda de 260 nm (para ácidos nucléicos) e
280 nm (para proteínas), em espectofotômetro Lambda Bio (Perkin Elmer, Wellesley, MA).
Posteriormente, uma alíquota de cada amostra de RNA foi submetida a eletroforese em gel de
agarose 1%, em cuba horizontal, corado com 2 µl de brometo de etídio, para visualização do
padrão de qualidade e quantidade de cada amostra extraída. A imagem do gel foi visualizada e
digitalizada, sob luz ultravioleta, em transiluminador Loccus Biotecnologia, modelo L-PIXHE.
2.2.2
Purificação de RNA total
Para o isolamento do mRNA foi utilizado o kit para purificação de mRNA
“NucleoTrap® mRNA mini purification Kit”, segundo recomendações do fabricante
(MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG).
Para verificação da qualidade e concentração do mRNA, uma alíquota de 2 µl de cada
amostra foi submetida a eletroforese e visualizada em gel de agarose 1%, corado com 1 µl
brometo de etídio. O restante do mRNA foi armazenado em freezer -80 °C.
2.3 Hibridação Subtrativa Supressiva
Para identificação dos genes induzidos pelo déficit hídrico nas folhas dos dois
genótipos em estudo, utilizou-se a técnica de Hibridação Subtrativa Supressiva
(DIATCHENKO et al., 1996). Para a obtenção da biblioteca subtraída, que deve conter os
genes diferencialmente expressos no genótipo tolerante em decorrência do tratamento não
irrigado, foi utilizado o conjunto de reagentes “PCRSelect ™cDNA Subtraction Kit (Clontech
Laboratories, EUA)”, conforme instruções do fabricante. A biblioteca subtrativa foi construída
66
considerando-se as plantas do genótipo tolerante (clone 953), submetidas ao tratamento
hídrico não irrigado, como tester e as plantas do genótipo sensível (clone 224), submetidas ao
mesmo tratamento, como driver.
2.3.1
Síntese dos cDNAs tester e driver
Para produção das bibliotecas de cDNAs que foram utilizadas nas reações de
subtração, foi utilizado o protocolo descrito para o kit “PCR SelectTM cDNA Subtraction
Kit” produzido pela Clontech Laboratories Inc., EUA. O kit utilizado para a obtenção das
biblioteca subtraída requer que duas bibliotecas sejam construídas, uma denominada tester e
outra denominada driver. A biblioteca tester foi preparada a partir da população de mRNA
obtida das folhas das plantas do genótipo tolerante submetidas ao regime hídrico não irrigado.
A biblioteca denominada driver foi preparada a partir da população de mRNA oriunda das
folhas das plantas do genótipo sensível submetidas ao regime hídrico não irrigado. Sendo,
portanto, construída apenas uma biblioteca subtraída.
Para a síntese da 1ª fita de cDNA foi colocado em um microtubo de 0,5 ml, 3 l de
mRNA e 1 l do primer (10 M) para a síntese de cDNA, incubando-se a 70 ºC em
termociclador por 2 minutos, resfriando-se em seguida em gelo por mais 2 minutos,
centrifugando-se rapidamente. Foram adicionados 2 l do tampão da 1ª fita de cDNA (5X),
1l do Mix dNTP (10 mM cada), 1l de água estéril e 1 l da enzima SMARTScribe
transcriptase reversa (100 Ul-1), homogeneizando-se gentilmente através de leves “tapas” no
fundo do tubo e incubando-se por 1,5 horas a 42 ºC em banho-maria. Logo após, os
microtubos foram colocados em gelo para finalização da síntese da 1ª fita de cDNA.
Para a síntese da 2ª fita de cDNA, foram adicionados aos microtubos de reação da
síntese da 1ª fita dos cDNAs tester e driver, 48,4 l de água estéril, 16 l de tampão da 2ª fita
de cDNA (5X), 1,6 l do Mix dNTP (10 Mm) e 4 l do coquetel da enzima da 2ª fita (20X),
homogeneizando-se gentilmente e centrifugando-se rapidamente, incubando-se em seguida
por 2 h a 16 ºC no termociclador. Foram adicionados 2l (6 u) de T4 DNA Polimerase,
homogeneizando-se bem, incubando-se em seguida por 30 minutos a 16 ºC no termociclador.
Depois da incubação, foram adicionados 4 l da mistura EDTA/Glicogênio (20X) para
finalizar a síntese da 2ª fita. Para a limpeza dos cDNAs sintetizados, foram adicionados 100
L de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), misturando-se bem. Depois, foi
misturado por vórtex e centrifugado por 10 minutos a 14.000 rpm à temperatura ambiente,
67
proporcionando a separação das fases. Cuidadosamente, a camada aquosa (superior) foi
removida e transferida para outro microtubo estéril, descartando-se a interfase e fase inferior.
Foram adicionados 100 l de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1), misturando-se e
centrifugando-se por 10 minutos a 14.000 rpm à temperatura ambiente. A camada aquosa foi
removida e transferida para um microtubo, descartando-se a interfase e a fase inferior. Foram
adicionados 40 l de acetato de amônio (NH4OAc) (4M) fornecido juntamente com o kit, e
300 l de etanol 95% gelado. O microtubo foi agitado no vórtex rapidamente e centrifugado
por 20 minutos a 14.000 rpm à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido
cuidadosamente e o precipitado foi ressuspendido em 500 L de etanol 80% gelado e
centrifugado por 10 minutos a 14.000 rpm. O sobrenadante foi removido e o precipitado
secado no dessecador a vácuo, por aproximadamente 10 minutos. O precipitado foi
ressuspendido em 50 l de água estéril e armazenado a -20 ºC. Para avaliação do rendimento
e tamanho dos cDNAs sintetizados, foram transferidos 6 l para um microtubo para posterior
eletroforese em gel de agarose.
2.3.2
Digestão dos cDNAs com a enzima de restrição RsaI
Em microtubos estéreis, foram adicionados 43,5 l do cDNA fita dupla, 5l do tampão
de Restrição RsaI (10X) e 1,5 l da enzima RsaI (10 U l-1), misturando-se, centrifugando-se
rapidamente e incubando-se por 1,5 horas a 37 ºC em banho-maria. Foram separados 5 l da
digestão para posterior análise da sua eficiência em gel de agarose 1%. Foram adicionados 2,5
L da mistura EDTA/glicogênio (20X) para finalizar a digestão. Para limpeza de
contaminantes, foram adicionados 50 l de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1)
misturando-se rapidamente, centrifugando-se em seguida a 14.000 rpm, por 10 minutos à
temperatura ambiente, removendo-se cuidadosamente a camada aquosa superior e
transferindo-se para um novo microtubo estéril. Foram adicionados 50
l de
clorofórmio:álcool isoamílico (24:1), misturando-se e centrifugando-se por 10 minutos a
14.000 rpm. A camada aquosa superior foi removida cuidadosamente e transferida para outro
microtubo. Foram adicionados 25 l de NH4OAc (4M) fornecido juntamente com o kit e
187,5 l de etanol 95% gelado, misturando-se rapidamente e centrifugando-se por 10 minutos
a 14.000 rpm, à temperatura ambiente. O sobrenadante foi removido cuidadosamente e
descartado. O precipitado foi recoberto gentilmente com 200 l de etanol 80% gelado e
centrifugado por 5 minutos a 14.000 rpm, removendo-se o sobrenadante e descartando-o. O
68
precipitado foi seco em dessecador a vácuo por 10 minutos, ressuspendido em 5,5 l de água
estéril, e armazenando a -20 ºC.
A avaliação da eficiência da digestão com RsaI foi feita por eletroforese em gel de
agarose, comparando-se as amostras dos cDNAs sintetizados, antes e depois da digestão. Os
cDNAs digeridos (5 l) e não digeridos (2,5 l retirados dos 6 l, previamente separados)
foram visualizados em gel de agarose 1%, corado com 1 µl de brometo de etídio, junto a
padrão de 1 kb de DNA, dispostos lado-a-lado. Após a eletroforese realizada a 100 V durante
1 hora, o gel foi visualizado e fotografado sob luz ultravioleta, em transiluminador Loccus
Biotecnologia®, modelo L-PIX-HE.
2.3.3
Ligação dos adaptadores ao cDNA tester digerido com RsaI
A população tester foi subdividida em duas alíquotas, sendo que uma recebeu o
adaptador 1 e a outra o adaptador 2R. Os cDNAs driver não foram ligados aos adaptadores.
Para a ligação, um Mix de ligação foi preparada combinando-se 3 l de água estéril, 2 l de
tampão de ligação (5X) e 1 l de T4 DNA ligase (400 U l-1). Um microtubo foi identificado
para cada cDNA tester e em cada tubo foram combinados os seguintes componentes: 2 l do
cDNA tester diluído, 2 l de adaptador 1 (10 M) (alíquota 1) e 2lde adaptador 2R (10 M)
(alíquota 2) e 6 l do Mix de ligação em todos os dois microtubos perfazendo um volume de
10 l. Em seguida, adicionou-se 2 l de ambos os microtubos em um tubo fresco de 0,6 ml,
caracterizando o controle tester não subtraído. Após rápida centrifugação, a mistura foi
incubada em termociclador a 16 ºC por uma noite. A reação de ligação foi interrompida
adicionando-se 1 L da mistura EDTA/Glicogênio, sendo em seguida aquecidas por 5
minutos a 72 ºC para inativar a DNA ligase. Para realização da PCR subsequente, removeu-se
1l do controle tester não subtraído, o qual foi diluído em 1 ml de água. As amostras foram
armazenadas a -20 °C.
2.3.4
Hibridações
Foram realizadas duas hibridações, a primeira com objetivo de equalizar e enriquecer
as seqüências diferencialmente expressas e a segunda hibridização a fim de gerar moldes para
amplificação por PCR a partir das seqüências diferencialmente expressas. As reações foram
preparadas em microtubos, contendo 1,5 l de cDNA driver digerido com RsaI, 1,5 l da
69
população tester ligada ao adaptador, 1,5 l da população tester ligada ao adaptador 2R e 1 l
do tampão de hibridização (4X). Foi realizada uma incubação por 1,5 minutos a 98 ºC em
termociclador e após este tempo, as amostras foram incubadas novamente por 8h a 68 ºC. Na
segunda hibridização, inicialmente, o cDNA driver de todas as amostras foi desnaturado,
adicionando-se nos microtubos, 1l de cada cDNA driver, 1 l de tampão de hibridização
(4X) e 2 l de água estéril. Em seguida, 1 l desta mistura foi incubada por 1,5 minutos a 98
ºC em termociclador. O microtubo contendo o cDNA driver recém-desnaturado foi retirado do
termociclador. O cDNAs driver foram misturados simultaneamente ao cDNAs tester ligados
ao adaptador 1 e 2R. Este passo foi feito rapidamente e os microtubos da primeira
hibridização permaneceram no termociclador durante todo tempo. A reação foi incubada por
uma noite a 68 ºC. Para finalizar a segunda hibridização, foram adicionados 200 l do tampão
de diluição, homogeneizando-se e aquecendo-se por 7 minutos a 68 ºC e os produtos obtidos
foram armazenados a -20 ºC.
2.4 Amplificações por PCR
Realizou-se duas amplificações por PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). A
primeira sendo um PCR supressiva com o objetivo de se obter somente as sequências
diferencialmente expressas amplificadas exponencialmente. A segunda amplificação foi
realizada com o objetivo de reduzir o “background” e enriquecer ainda mais as sequências
diferencialmente expressas. Para a primeira amplificação por PCR, preparou-se um Master
Mix contendo os seguintes reagentes para cada reação de amplificação: 19,5 l de água
estéril, 2,5 l de tampão de reação de PCR (10X), 0,5 l do Mix dNTP (10 M), 1,0 l de
oligonucleotídeo iniciador 1 (10 M) e 0,5 l do Mix cDNA polimerase Advantage (50X).
Transferiu-se para um microtubo estéril 1 l da amostra subtraída proveniente da segunda
hibridização e para outro microtubo estéril, transferiu-se 1 l do controle tester não subtraído.
Em seguida, adicionou-se 24 l do Master Mix em cada microtubo. As reações foram
inicialmente incubadas em um termociclador por 5 minutos a 75 ºC, para estender o
adaptador. Imediatamente, foram iniciados os 27 ciclos de amplificação, sendo 94º C por 25
segundos, seguido de 27 ciclos de 94 ºC por 10 segundos, 66 ºC por 30 segundos e 72º C por
1,5 minutos. Separou-se 8 l de cada tubo para posterior análise da eficiência desta primeira
reação de PCR em gel de agarose 2%.
70
Para realizar a segunda PCR, 3 l de cada reação proveniente da primeira PCR foram
diluídos em 27 l de água estéril. Transferiu-se 1 l de cada reação diluída em um tubo
apropriado. Logo após, preparou-se um Mix para a segunda PCR contendo os seguintes
reagentes, para cada reação de amplificação: 18,5 l de água estéril, 2,5 l de tampão de
reação de PCR (10X), 1,0 l de oligonucleotídeo iniciador 1 “nested” (10 M), 1,0 l
oligonucleotídeo iniciador 2R “nested” (10 M), 0,5 l de Mix dNTP (10 M) e 0,5 l do
Mix cDNA polimerase Advantage (50X). Foram transferidos 24 l do Mix para cada
microtubo de PCR, adicionando-se em seguida 1 l do produto da primeira amplificação
diluído (previamente separado) referente ao cDNA de cada amostra. Foram realizados 12
ciclos de 94 ºC por 10 segundos, 68 ºC por 30 segundos e 72 ºC por 1,5 minutos.
Para avaliação e visualização dos produtos gerados, foram aplicados 8 l de cada
reação provenientes da primeira (separados previamente) e da segunda PCR em gel de
agarose 2%, corando-se com 1 l de brometo de etídio, junto a padrão de 1 kb de DNA. Após
a eletroforese realizada a 100 V durante 1 hora, o gel foi visualizado e fotografado sob luz
ultravioleta, em transiluminador Loccus Biotecnologia®, modelo L-PIX-HE. O restante da
segunda reação de PCR foi armazenado a -20 ºC.
O produto da segunda PCR compõe a biblioteca subtrativa contendo os genes
diferencialmente expressos no genótipo tolerante, comparado ao sensível.
71
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Extração e Purificação de RNA total
A extração do RNA total das amostras de folhas do clone 953 e 224 sob déficit hídrico
coletadas no 5° e 10° dia de estresse foi realizada com sucesso. Tanto a qualidade quanto a
quantidade de RNA obtido foram adequados (Tabela 2.1, Figura 2.1).
No total, foram realizadas 24 extrações de RNA total, sendo 12 extrações de folhas do
genótipo tolerante e 12 extrações de folhas do genótipo sensível.
Tabela 2.1- Quantificação das amostras obtidas por espectofotometria
Identificação da amostra
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
T11
T12
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
ng/μl
1176
1760
3096
1724
2440
1316
3428
1976
2667
2388
3228
2260
2440
1272
2284
1572
1856
2840
2968
2440
3500
1532
2604
1834
260/280
1,771
1,798
1,921
1,664
1,584
1,759
1,717
1,652
1,734
1,901
1,506
1,896
1,584
1,582
1,543
1,434
1,628
1,655
1,623
1,584
1,778
1,773
1,543
1,702
260/230
1,393
1,346
1,444
1,064
1,503
1,275
1,982
0,814
1,301
1,222
0,834
1,305
0,964
1,056
0,843
0,804
1,190
1,117
1,011
0,961
1,075
1,115
1,025
0,923
72
Figura 2.1 - Gel de agarose 1% carregado com amostras do genótipo tolerante - clone 953 (T1, T2, T3) e do
genótipo sensível - clone 224 (S1, S2, S3) para a verificação da qualidade das amostras extraídas. A primeira
banda estreita corresponde ao DNA genômico e as duas bandas maiores ao centro correspondem,
respectivamente, as subunidades 28S e 18S do rRNA.
Em geral, as extrações de RNA total apresentaram um excelente rendimento (Tabela
2.1). A quantidade mínima extraída foi 1176,0 ng/μl e a máxima 3500 ng/μl, com a média
geral girando em torno de 2275,042 ng/μl a cada extração. As razões 260/280 e 260/230
fornecidas pelo espectrofotômetro, que devem variar numa faixa ótima de 1,8 - 2,1
(LOGEMANN; SCHELL; WILLMITZER, 1987; ASIF et al., 2006; ZHEN et al., 2011),
sugeriram contaminação do RNA total com proteínas e outros possíveis contaminantes (como
sais, polissacarídeos e compostos orgânicos, como fenol). Mas, a análise das amostras em gel
de agarose 1% revelou uma boa qualidade das amostras, caracterizada por bandas de rRNA
bem definidas e sem rastros consideráveis (Figura 2.1).
A análise do gel de agarose 1% também confirma as altas concentrações de RNA
provenientes das extrações. Ressalta-se, portanto, para fins de análise de qualidade e
concentração de RNA, a necessidade de se utilizar o conjunto, espectofotometria e
eletroforese em gel, evitando-se a interpretação equivocada, devido a especificidades de cada
método de análise.
Quanto a purificação do mRNA das amostras, os resultados foram satisfatórios (Figura
2.2). Não obstante as duas bandas visualizadas indicarem a presença de rRNA, o gel revela
uma concentração considerável de mRNA nas amostras purificadas.
73
Figura 2.2 - Gel de agarose 1% carregado com amostras do genótipo tolerante - clone 953 (T) e do genótipo
sensível - clone 224 (S) para a verificação da qualidade e concentração do mRNA.
3.2 Produção da biblioteca subtrativa
A partir das amostras de mRNAs purificadas de ambos os genótipos (Figura 2.2),
procedeu-se com os passos necessários a realização da biblioteca subtrativa. As sequências
diferencialmente expressas no genótipo tolerante (produtos da segunda PCR) compõem os
genes de interesse, ou seja, aqueles que foram responsivos ao déficit hídrico e ausentes no
genótipo sensível.
Os próximos passos demandam a clonagem desses fragmentos em um vetor
apropriado e o seu respectivo sequenciamento.
74
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95
APÊNDICE
96
APÊNDICE A
Tabela 1A - Resumo da análise de variância para matéria seca de raiz (MSR), matéria seca de caule (MSC),
matéria seca de folha (MSF) e matéria seca total (MST) de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto, sob
dois regimes hídricos.
F.V.
Quadrados Médios
G.L.
Genótipo (G)
1
MSR
234,128**
MSC
39,848**
MSF
7,3984**
MST
356,97**
Regime hídrico (Rh)
1
119,11**
69,931**
6,225**
473,99**
G*Rh
1
13,625
0,09
0,3422
15,81
Resíduo
60
3,555
0,95
0,3503
7,97
Total
63
CV (%)
24,2
17,98
20,41
17,52
* e ** = Significativo pelo teste F, a 5 % e a 1 % de significância, respectivamente.
Tabela 2A - Resumo da análise de variância para relação de matéria seca raiz e parte aérea (MSR/PA), razão de
massa foliar (RMF), área foliar específica (AFE) e razão de área foliar (RAF) de plantas jovens de dois genótipos
de eucalipto, sob dois regimes hídricos.
F.V.
Quadrados Médios
G.L.
Genótipo (G)
1
MSR/PA
2,44063**
RMF
0,169641**
AFE
1368,19**
RAF
8,8164**
Regime hídrico (Rh)
1
0,4072
0,018191**
169,27**
0,5845
G*Rh
1
0,43497**
0,010226**
273,69**
7,4393**
Resíduo
60
0,03906
0,000577
17,19
0,3535
Total
63
CV (%)
21,33
12,53
42,65
37,02
* e ** = Significativo pelo teste F, a 5 % e a 1 % de significância, respectivamente.
Tabela 3A - Resumo da análise de variância para condutância estomática (Gs), transpiração (E), fotossíntese (A),
concentração interna de CO2 (Ci), eficiência no uso da água (EUA) e temperatura foliar (T) de plantas jovens de
dois genótipos de eucalipto, sob dois regimes hídricos.
F.V.
Quadrados Médios
G.L.
Genótipo (G)
1
Gs
0,06561
E
1,478
A
40,28*
Ci
0
EUA
1,739
T
1,482
Regime hídrico (Rh)
1
1,69744**
307,415**
2602,74**
128767**
35,683*
37,752**
G*Rh
1
0,07396
2,545
37,75*
46
0,795
0,016
Resíduo
36
0,02405
2,032
5,58
9398
5,601
2,449
Total
39
CV (%)
69,39
43,4
28,34
28,67
* e ** = Significativo pelo teste F, a 5 % e a 1 % de significância, respectivamente.
113,24
5,13
97
APÊNDICE B
Tabela 1B - Valores da estatística F e valor-p para altura (H), diâmetro (D), área foliar (Af) e índice de clorofila total (Ct), fluorescência mínima (Fo), fluorescência máxima
(Fm) e eficiência quântica do FSII (Fv/Fm) de plantas jovens de dois genótipos de eucalipto, sob dois regimes hídricos.
F.V.
G.L.
H
D
F
p
F
Af
p
Ct
Fo
Fm
F
p
F
p
F
p
<0,0001
277,9905
<0,0001
116,1639
<0,0001
35,1959
<0,0001
62,7456
<0,0001
3,2233
0,0747
0,9322
0,3359
3,7459
0,0147
7,6579
0,0002
80,6771
<0,0001
F
Fv/Fm
p
F
p
0,001
0,9746
11,86587
0,0007
210,4869
<0,0001
4,22124
0,0417
121,2374
<0,0001
8,56712
0,0001
14,311
0,0002
0,62817
0,4293
Genótipo (G)
1
303,316
<0,0001
51,113
Regime hídrico (Rh)
1
0,223
0,6374
46,485
Tempo (T)
3
2,077
0,1108
1,982
<0,0001
0,1242
GxRh
1
5,867
0,0167
1,791
0,183
88,8969
<0,0001
32,5375
<0,0001
21,9493
<0,0001
GxT
3
0,093
0,9638
0,523
0,6672
0,2071
0,8913
6,4628
0,0004
12,2007
<0,0001
5,0721
0,0023
3,66958
0,0138
RhxT
3
0,272
0,8454
13,254
0,0241
3,3679
0,0204
0,1668
0,9186
47,0605
<0,0001
2,0508
0,1094
GxRhxT
3
0,176
0,9125
1,115
<0,0001
0,3452
3,2353
1,1677
0,3243
7,4855
0,0001
9,7293
<0,0001
5,426
0,0015
0,69853
0,5544