efeito de bap e 2,4 – d na formação de calos em diferentes

EFEITO DE BAP E 2,4 – D NA FORMAÇÃO DE CALOS EM DIFERENTES
EXPLANTES DE FEIJÃO-CAUPI
A. L. OLIVEIRA1 , L. M. HOULLOU-KIDO1, E. A. KIDO1 e A. M. BENKO-ISEPPON1
Resumo - O feijão-caupi (Vigna unguiculata), por ser uma planta de valor significativo para a cultura de
subsistência no Brasil, foi utilizado no presente trabalho com o objetivo de verificar o efeito dos hormônios
BAP e 2,4 – D na formação de calos com potencial regenerativo para a cultura in vitro. As sementes de
feijão-caupi cv. IPA207 foram utilizadas como fonte dos explantes (eixo embrionário e cotilédones) que
foram isolados e colocados em meio MS com diferentes suplementações hormonais. Durante o cultivo
pôde-se observar diferentes respostas aos hormônios utilizados. No meio I (sem hormônio) houve
predomínio da regeneração dos eixos embrionários (formação de ápices caulinares e raízes), no meio II
(2,4 – D) e III (2,4 – D e BAP) observou-se formação de calos nos eixos embrionários. Em relação aos
cotilédones, não foi observada uma resposta representativa da formação de calos nos meios II e III. Já
no meio IV (BAP) não houve formação de calos em nenhum dos explantes testados. Estes resultados
indicam que melhor explante para indução de calos em feijão-caupi são os eixos embrionários. Os
resultados indicam também que a associação dos fitorreguladores BAP e 2,4 – D favoreceram a formação
de calos com características organogênicas.
Palavras-chave: reguladores de crescimento, células responsivas, cultura de tecidos de plantas.
BAP AND 2,4 – D EFFECT IN A CALLUS FORMATION IN DIFFERENTS
EXPLANTS OF COWPEA
Abstract - Cowpea (Vigna unguiculata), that have a significant value in Brazilian subsistence agriculture,
was used with the aim to study BAP and 2,4-D effect in regenerative callus induction. The cowpea
seeds (cv. IPA-207) were used as explants source (embrionary axis and cotyledons). These explants
were inoculated in MS mediums, with different hormonal supplementation. Different hormonal responses
were observed during culture. In medium I (hormone free) was observed axis embrionary regeneration
(shoot tips and root formation), in medium II (2,4 – D) and III (2,4 – D and BAP) was observed callus
formation in embrionary axis. Cotyledon callus formation was not significant in medium II and III. Callus
formation was not observed in any explants tested in medium IV (BAP). These results suggests that
embrionary axis is the best explants for callus induction in cowpea. These result also indicates a
favorable effect of BAP and 2,4-D association on cowpea beans organogenic callus induction.
Keywords: growth regulator, responsive cells, plant tissue culture.
1
Universidade Federal de Pernambuco, CEP: 50670-901, Recife, PE.
E-mail:[email protected]; [email protected]; [email protected];
[email protected]
Introdução
O feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] é uma importante leguminosa cultivada nas regiões
Norte e Nordeste do Brasil. Sua importância deriva do seu alto valor nutritivo (proteínas, aminoácidos
essenciais, carboidratos, vitaminas, minerais, fibras dietéticas e baixo teor de gordura), além de sua
capacidade de se adaptar bem em todos os tipos de solos. O feijão-caupi atua como base alimentar para
populações de baixa renda do nordeste brasileiro, devido a suas características apropriadas ao plantio,
tais como ciclo curto, baixa exigência hídrica e rusticidade para se desenvolver em solos de baixa
fertilidade (Embrapa, 2003). Além do uso para consumo humano, o feijão-caupi também é utilizado na
alimentação animal, adubação verde e proteção do solo. A cultura in vitro de tecidos vegetais é uma das
áreas da biotecnologia que mais contribuiu, nos últimos anos, para o desenvolvimento de novas cultivares
com importantes características agronômicas (resistência a pragas e doenças, precocidade, modificação
do porte da planta, etc). A capacidade de indução da desdiferenciação celular é uma das mais importantes
características exploradas no cultivo in vitro das plantas e encontra-se associada às principais técnicas
de melhoramento não convencional (Maluszinsky, 2001; Fehér et al. 2002).Dentre as técnicas mais
utilizadas, a seleção in vitro de mutantes induzidos ou provenientes da variação somaclonal e a produção
de transgênicos destacam-se no desenvolvimento de novas cultivares. No entanto, para a utilização
destas metodologias, faz-se necessário o prévio estabelecimento das condições necessárias para a
regeneração de plantas via calos (principal tipo de explante utilizado para obtenção de variação somaclonal
e de transgênicos). Nesse experimento foram utilizadas sementes de feijão-caupi cv IPA207, com o
objetivo de analisar o efeito dos hormônios BAP (6-Benzilaminopurina) e 2,4–D (Ácido 2,4Diclorofenoxiacético) na formação de calos, com potencial regenerativo, a partir de dois tipos de explantes
vegetais (eixos embrionários e cotilédones).
Material e Métodos
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Genética Molecular do Departamento de
Genética da UFPE. Foram utilizadas sementes de feijão-caupi cv IPA207 fornecidas pelo IPA. Inicialmente,
neste experimento, foi adotada a seguinte metodologia de desinfestação: três lavagens em água destilada
por 5 minutos cada; imersão em solução de álcool 70% por 1 min, seguida pela imersão em solução de
hipoclorito de sódio (NaOCl) a 10% por 20 minutos, seguida de três lavagens com água esterilizada,
sendo que, na terceira água, foi adicionada uma cápsula de antibiótico (Keflex). As sementes
permaneceram no antibiótico por aproximadamente 18 horas, sendo que, após esse período, os cotilédones
e eixos embrionários foram isolados, sob condições assépticas e inoculados em 40 frascos contendo
25 ml de meio de cultura para regeneração de feijão-caupi [sais e vitaminas de MS acrescido de sacarose
(30 g.L-1) e Agar (6,0 g.L-1)] . Em cada frasco, havia dois cotilédones e um segmento de eixo embrionário.
Esse experimento foi montado com quatro tratamentos contendo 10 frascos cada: tratamento I – meio
controle sem adição de hormônio; tratamento II – adição de 2,4 – D 1 mg.L-1; tratamento III – adição de
2,4 – D 1 mg.L-1 e de BAP 0,2 mg. L-1; tratamento IV – adição de BAP 0,2 mg. L-1. Os frascos foram
mantidos em sala de crescimento com fotoperíodo de 16 h e temperatura controlada (±26o C). Durante
o cultivo foram avaliados o desenvolvimento e o aspecto dos calos formados a partir dos diferentes
explantes e meios de cultura.
Resultados e Discussão
Foram observados os efeitos do BAP e 2,4 – D tanto isolados quanto associados. No tratamento
I (meio de cultura sem hormônios), verificou-se que apenas 40% dos eixos embrionários apresentaram
sinais de formação de pequenos calos em uma das extremidades do explante. Nos eixos embrionários
restantes (60%) foi observada regeneração direta (sem a formação de calo) de ápices caulinares e/ou
raízes (Figuras 1 e 2). Nesse mesmo tratamento, nenhum dos cotilédones apresentou sinais de regeneração
ou de formação de calos. Já no tratamento II, foi observada a formação de calos em 100% dos eixos
embrionários. No entanto, 20% dos explantes formaram pequenos calos em uma das extremidades,
enquanto que nos 80% restante houve formação de calo em todo explante (Figuras 1 e 3). Matsumoto
& Yamaguchi (1991) sugerem que esse tipo de resultado pode ser causado pela existência de
heterogeneidade fisiológica dos explantes durante o cultivo in vitro. Estes resultados também indicam
que os eixos embrionários apresentam o melhor nível de resposta ao 2,4 – D para a formação de calos
com potencial organogênico. A diferença na resposta ao fitorregulador provavelmente está correlacionada
a diferenças na quantidade de células responsivas existentes entre os dois tipos de explantes testados
(eixos embrionários e cotilédones). Segundo dados da literatura, um dos melhores tecidos para a formação
de calos é a epiderme de embriões.No entanto, o desenvolvimento de células e calos embriogênicos é
positivamente influenciado pela composição do meio de cultura (Meijer et al., 1999).
Figura 1. Formação de calos sob efeito de diferentes tratamentos.
Figura 2. Regeneração dos tecidos vegetais no tratamento I.
Figura 3. Formação de calo em todo o eixo embrionário.
Apenas 20% dos cotilédones apresentaram algum sinal da formação de calos na extremidade em
que o embrião estava ligado. Esse resultado pode ser devido à presença de restos da epiderme do
embrião no cotilédone. No tratamento III, o qual apresenta uma combinação entre BAP e 2,4 – D,
verificou-se a formação de calos em 100% dos eixos embrionários. Nesse tratamento foi observada a
conversão de todo o eixo embrionário em calo, não havendo a restrição deste a apenas uma região do
explante. Com relação aos cotilédones, a resposta foi de 25% para início da formação de calos
(Figuras 1 e 4). Infere-se então que a associação entre esses dois hormônios age de forma positiva
tanto no nível de respostas de eixo embrionário quanto de cotilédones. No tratamento IV (meio de
cultura suplementado apenas com BAP), nenhum dos explantes iniciou a formação de calos. Houve
apenas a regeneração direta de ápices caulinares e/ou de raízes em 10% dos eixos embrionários. Nesse
tratamento, foi observado também que 70% dos eixos embrionários apresentaram intumescimento dos
tecidos (Figura 1 e 5) sem a ocorrência de regeneração ou formação de calo. Este resultado indica que
o BAP sozinho não consegue induzir a formação de calos.
Figura 4. Início da formação de calo em cotilédone.
Figura 5. Eixo embrionário intumescido.
Conclusões
O 2,4 - D sozinho ou em associação com o BAP tem a capacidade de induzir a formação de calos
com aspecto organogênico.
O eixo embrionário apresenta-se como o melhor tipo de explante a ser utilizado por ser mais
susceptível a formação de calo.
O BAP sozinho não cumpre o papel de indutor de formação de calos, porém apresenta resposta
positiva no que diz respeito à regeneração dos explantes.
Agradecimentos
Ao IPA – Empresa Pernambucana de Pesquisa Agropecuária – por fornecer a cv IPA207 e assim
facilitar o nosso trabalho, ao Professor Dr. Éderson A. Kido responsável pelo laboratório de Genética
Molecular do Departamento de Genética da Universidade Federal de Pernambuco, e à Dra. Laureen
Michelle H. Kido pelas orientações.
Referências
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