32 Microbilogia de Alimentos I - Curso de Engenharia de Alimentos

Microbilogia de Alimentos I - Curso de Engenharia de Alimentos
Profª Valéria Ribeiro Maitan
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PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS – PUC Goiás
ESCOLA DE ENGENHARIA
CURSO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
Aula nº 7 e 8 – Quantificação de Microrganismos: Diluição e Plaqueamento
“Spreader Plate” e “Pour Plate”
Introdução
A presença de microrganismos nos alimentos pode ser considerada prejudicial
em alguns casos, enquanto que em outros são considerados benéficos, como certos
microrganismos que são necessários na preparação de alimentos tais como queijos,
iogurte, chucrute, etc. e por isso são intencionalmente adicionados. No entanto, alguns
microrganismos prejudiciais podem ser adicionados através do manuseio do alimento
durante o empacotamento e a estocagem. Estes podem alterar as características como
aroma, textura, sabor e cor de muitos alimentos. No caso da presença de
microrganismos patogênicos ou seus produtos em um alimento como toxinas, podem
levar a pessoa consumidora a sérios casos de infecção ou mesmo intoxicação, e em
alguns casos à morte.
Estudos envolvendo a análise de materiais tais como alimentos, água, leite e em
alguns casos o ar, requerem a enumeração quantitativa de microrganismos nestes
materiais. Na quantificação do tamanho das populações destes microrganismos, é
necessário o uso de esquemas de diluição. Isto porque o tamanho da população pode ser
tão grande que sua enumeração direta em meio sólido torna-se impossível.
O método também é conhecido como contagem do número de células viáveis em
uma determinada população, também denominada Contagem em Placa. Trata-se de um
método indireto que se baseia no princípio de que cada célula viável, quando presente
no meio sólido, pode se multiplicar repetidas vezes e origina uma colônia visível a olho
nu.
A técnica se baseia no princípio de que quando se espalha uma quantidade
suficientemente pequena de material, pode-se obter células individuais, separadas uma
das outras, permitindo que o crescimento de uma célula não interfira com o da outra.
Provavelmente cada colônia isolada é descendente de uma única célula e portanto, uma
cultura pura. No caso de isolamento de estafilococos e estreptococos, em que as células
formam grupamentos característicos, as colônias se desenvolvem a partir de um grupo
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de células do mesmo tipo, representando, também, uma cultura pura. A morfologia das
colônias formadas em meio sólido pode auxiliar na diferenciação do microrganismo.
As diluições são feitas pipetando-se as amostras e adicionando-as a um
líquido diluente que pode ser cloreto de sódio 0,85%, água peptonada ou outro diluente
conforme o tipo de alimento. Dos frascos com diluições são tiradas alíquotas e
semeadas em meio de cultura sólido.
Partindo da suposição de que as células com as quais estamos
trabalhando não se agregam, cada uma dará origem a uma colônia. Contando as
colônias que cresceram nas placas, teremos o número de bactérias da cultura que
estamos ensaiando. Porém, como algumas bactérias formam agrupamentos ou arranjos,
não é possível fazer esta relação, ou seja, estabelecer o n.º de colônias e o n.º de
células. Por isso, o resultado deve ser expresso em UFC (Unidades Formadoras de
Colônias).
Tipos de Plaqueamento
Existem duas técnicas de contagem: a Contagem em superfície ou
“Spreader Plate” e a Contagem em Profundidade ou mistura ou “Pour Plate”.
Em ambas as técnicas, a suspensão microbiana é diluída em série (normalmente uma
diluição decimal) e uma alíquota de volume conhecido de cada diluição é transferida
para a placa com posterior derramamento do meio fundido ou no próprio meio de
cultura na placa de Petri.
A escolha da técnica depende da análise de qual grupo ou microrganismos,
apresentando vantagens ou desvantagens. A técnica “Pour Plate”, é mais trabalhosa,
dificulta a visualização de microrganismos que produzem micélio (fungos filamentosos
– bolores e actinobactérias), porém é mais exata.
Técnica "Spreader Plate": é um método comumente empregado na análise de
alimentos. Amostras de alimentos são maceradas e diluições do produto são pipetadas
em placas de Petri esterilizadas contendo o meio de cultura requerida para a análises.
Após incubação, as colônias bacterianas são contadas em um contador de colônias que
pode ser manual ou digital.
O método de contagem total de microrganismos de alimentos por meio de placas
baseia-se no plaqueamento de alíquotas do alimento homogeneizado e de suas diluições,
onde é utilizado o meio de cultura Ágar Padrão para Contagem. A mudança de
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temperatura e tempo de incubação permite a contagem de grupos diferentes de
microrganismos como: psicrotróficos, mesófilos, termófilos e termodúricos.
Esta metodologia também se aplica para análises de estafilococos, bolores e
leveduras, variando-se o meio de cultura e a temperatura de incubação.
Para determinar o número de microrganismos na amostra original são
selecionadas placas com o número de colônias entre 25 e 250. Menos de 25 colônias o
resultado não é confiável, uma vez que contaminantes podem causar ao menos 4% de
erro. No caso de uma placa com mais de 250 colônias, a contagem é mais difícil e
portanto mais trabalhosa.
A contagem é expressa em número de bactérias por mililitro do meio de
cultura ou UFC/mL. Este número de bactérias na amostra original é calculado usando a
seguinte equação:
Bactérias/mL = Nº de Colônias
(UFC/mL)
Diluição*
*Diluição refere-se a diluição da amostra. Por exemplo, se 37 colônias estão presentes
em uma placa com diluição 1:100, o cálculo pode ser:
Bact./mL ou UFC/mL=37 = 37 x 102 = 3700 = 3,7 x 103 bact/mL ou UFC/mL
10-2
Como muitas bactérias ocorrem em arranjos característicos e não
isoladas como células únicas, pode ocorrer que a colônia seja formada desse arranjo ou
unidade. Neste caso, o mais apropriado de se expressar será 3,7 x 103 UFC/mL. (UFCUnidade Formadora de Colônia).
Técnica em Mistura (técnica da placa derramada ou “Pour plate”): é também
conhecida como técnica em profundidade. Nesta a amostra é diluída em tubos diluentes
e adicionadas alíquotas em uma placa de Petri esterilizada vazia, onde posteriormente
será adicionado ágar liquefeito (fundido), e após solidificação, as placas serão
incubadas. Como alguns microrganismos são retidos abaixo da superfície do ágar
durante a solidificação, a placa mostrará colônias na superfície e colônias situadas logo
abaixo da mesma. Esta técnica é recomendada para isolamento de microrganismos
móveis ou quando há suspeita de microrganismos anaeróbios e também muito utilizado
para a contagem microbiana em diferentes diluições, em uma análise de alimento.
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1,0 mL
Cultura mista
1,0 mL
10-1
1,0 mL
10-2
10-3
**15-20 mL
de
meio
sólido
Esquema do plaqueamento “Pour Plate”.
**
A forma de se obter a contagem é a mesma da técnica de plaqueamento
“Spreader Plate”. Essa técnica se aplica a diferentes grupos microbianos, considerando
o meio de cultura e a temperatura.
Parte Experimental para o Plaqueamento “Spreader Plate”
- Com as condições mais assépticas possíveis, pesar 25g ou medir 25 mL do alimento
selecionado para a análise;
- Transferir para o saquinho do "stomacher", contendo 225 mL de água peptonada ou
salina esterilizada e bater por alguns minutos. Isto cria a diluição 1:10 (10-1);
- Transferir 1,0 mL desta diluição para um frasco contendo 9,0 mL do diluente (diluição
1:100 – 10-2).e assim por diante, conforme o esquema do professor;
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- Pipetar 0,1mL (100μl) de cada diluição e transferir para uma placa contendo meio de
cultura esterilizados e espalhar a alíquota com o auxílio da alça de Drigalsky até que o
líquido tenha sido absorvido pelo meio;
- Incubar as placas em posição invertida a 35 oC por 24h.
Parte Experimental para o Plaqueamento “Pour Plate”
- Com as condições mais assépticas possíveis, pesar 25g ou medir 25 mL do alimento
selecionado para a análise;
- Transferir para o saquinho do "stomacher", contendo 225 mL de água peptonada ou
salina esterilizada e bater por alguns minutos. Isto cria a diluição 1:10.
- Transferir 1,0 mL desta diluição para um frasco contendo 9,0 mL do diluente (diluição
1:100).e assim por diante, conforme o esquema da aula anterior;
- Pipetar 1,0mL de cada diluição e transferir para uma placa esterilizada (fazer em
duplicata) e verter 15-20 mL de meio sólido fundido e homogeneizar a placa em
movimentos em “8” por 10 vezes e esperar solidificar;
- Incubar as placas em posição invertida a 35 oC por 24h.
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