Lipossomas
Propaganda
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA LABORATÓRIO DE IMUNOPATOLOGIA KEIZO-ASAMI Nereide Stela Santos Magalhães Recife, 2004 EVOLUÇÃO DA NANOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA CONVENCIONAL LIPOSSOMAS LIPOSSOMAS, NANOPARTÍCULAS NANOPARTÍCULAS LIPOSSOMAS NANOPARTÍCULAS SÍTIO-ESPECÍFICOS STEALTH® - Metacrilatos - Alquilcianoacrilatos - Biodegradáveis Polímeros pré-formados •PLA •PLGA •PCL Nanocápsulas Nanoesferas Polimerização in situ Nanopartículas 1970 1980 PLA-PEG PLGA-PEG PCL-PEG Nanocápsulas Nanoesferas Lipossomas Lipossomas-PEGLectina Nanocápsulas Nanoesferas 2000 Dex- PLA 1990 Dex- PCL Groupo SLC/UFPE Convencional Nanocápsulas Lipossomas DextranaPCL-Lectina ? Lipossomas Descritos inicialmente em 1965 Alec D. Bangham Vesículas esféricas formadas por bicamadas lipídicas com capacidade de incorporar compostos hidrofílicos e hidrofóbicos. LIPOSSOMAS Estrutura das Membranas Biológicas Figura 1. Arquitetura supramolecular das membranas Leningher, 2000 Fosfolipídeos Agregação em água Estruturas Lipídicas Figura 2. Agregados de lipídeos anfipáticos dispersos em água Leningher, 2000 Movimentos dos Lipídeos na Estrutura das Membranas Biológicas Leningher, 2000 Estruturas Lipídicas • Monocamadas e micelas Em meio aquoso, os lipídeos formam espontaneamente estruturas. – Monocamadas (baixas concentrações) – Micelas (altas concentrações) • CMC = concentração crítica micelar) – Bicamadas lipídicas – Vesículas • Lipossomas Lipossomas Compartimento interno aquoso Micela Bicamada Lipossoma www.cm.utexas.edu/.../overheads-2/ ch12_lipid-bilayer.jpg Interações não covalentes nas bicamadas lipídicas • As bicamadas lipídicas possuem tendência inerente a serem extensas • As bicamadas lipídicas podem fecharem-se sobre si mesmas e formar vesículas. • As bicamadas lipídicas são auto-selantes, pois um “orifício” na bicamada é energeticamente desfavorável. Interações não covalentes nas bicamadas lipídicas • Hidrofóbicas • Forças atrativas de van der Waals – Caudas hidrocarbonadas • Atrações eletrostáticas • Pontes de hidrogênio – Cabeças polares – água Moléculas de água são liberadas das caudas hidrocarbonadas dos lipídeos quando essas caudas ficam sequestradas no interior apolar da bicamada. Transição de Fases em Bicamadas • As transições de fases são sempres endotérmicas; o calor é absorvido enquanto a temperatura aumenta durante a transição. • Fosfolipídeos apresentam temperaturas de transição de fase específicas Tm: aumenta com o comprimento da cadeia alifática, diminui com a insaturação e depende da natureza do grupo polar da cabeça. Transição de Fases em Membranas • T<Tm – Bicamada organizada com cadeias alifáticas relativamente imobilizadas (conformação extendida máxima), – Área superficial / lipídeo é mínima – Espessura da bicamada é máxima • T>Tm – Fase cristalina líquida (mobilidade das cadeias alifáticas é intermediária entre os estados sólido e líquido de alcanos). – Área superficial / lipídeo aumenta. – Espessura da bicamada diminui de 10 a 15%. Transição de Fases em Bicamadas • Em bicamadas de fosfolipídeos puros, a transição ocorre em faixa estreita de temperatura. Ex: – Tm dimiristoilfosfatidilcolina = 0,2oC. • Membranas biológicas apresentam faixa larga de transição de fase e dependem fortemente da composição dos lipídeos e proteínas. Transição de Fases em Bicamadas • Para certas bicamadas de lipídeos, uma modificação no estado físico, chamada de pré-transição, ocorre de 5 a 15oC abaixo da Tm. Estas pré-transições envolvem inclinação das cadeias hidrocarbonadas. • Geralmente a fase de transição está relacionada com uma modificação de volume. • A transição de fase da bicamada é muito sensível à presença de solutos que interagem com os lipídeos, tais como cátions divalentes, substâncias lipossolúveis, peptídeos e proteínas. Lipossoma Internalização de lipossomas por células LIPOSSOMAS • DEFINIÇÃO São vesículas aquosas, de diâmetro entre 0,1 e 0,5 µm, contituídas de uma ou mais membranas fosfolipídicas de origem natural. O princípio ativo pode estar encapsulado na fase aquosa (hidrofílico) ou ser retido pela membrana (lipofílico). GLICEROFOSFOLIPÍDEOS • FOSFOLIPÍDEOS Principais constituintes das membranas biológicas – Ácido fosfatídico – Fosfatidilcolina (lecitina) – Fosfatidiletanolamina – Fosfatidilglicerol – Difosfatidilglicerol (cardiolipina) – Fosfatidilserina – Fosfatidilinositol COMPOSIÇÃO DOS LIPOSSOMAS • Lipídeos Características Fosfatidilcolina de ovo Diestearilfosfatidilcolina Dipalmitoilfosfatidilcolina constituinte principal e o mais utilizado menos permeável à fase aquosa fosfolipídeo sintético totalmente saturado utilizado em imunolipossomas aumenta a permeabilidade lipossomal pode aumentar a fusão lipossoma-célula reduz a permeabilidade dos lipossomas Incorporação máxima: 50 mol% com relação aos fosfolipídeos totais confere carga positiva aos lipossomas confere carga negativa aos lipossomas confere carga negativa aos lipossomas utilizado em imunolipossomas lipídeos antigênicos utilizados em imunolipossomos Fosfatidiletanolamina Lisofosfatidilcolina Colesterol Estearilamina Dicetilfosfato Ácido fosfatídico Esfinomielina Cardiolipídeos VANTAGENS • São biodegradáveis • Não possuem antigenicidade • Protegem as drogas contra a ação enzimática • Reduz a toxicidade das drogas • Podem ser direcionados ao local de ação pela adição de sinais moleculares, anticorpos monoclonais, hormônios ou glicolipídeos Classificação SUV LUV 20-100 nm 0,5 a 1,0 > 100 nm 5 a 15 MLV > 0,5µm 35 a 65 Vesículas multilamelares: MLV (Multilamellar Vesicles) Vesículas pequenas unilamelares: SUV (Small Unilamellar Vesicles) Vesículas grandes unilamelares: LUV (Large Unilamellar Vesicles) LIPOSSOMAS www.drugdeliveryparternships.com/html MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE LIPOSSOMAS • Métodos mecânicos de Dispersão de fosfolipídeos – Hidratação de filme lipídico – Homogeneização por ultra-som – Homogeneização por extrusão – Microfluidificação – Dispersão de lipossomas liofilizados – Dispersão de lipossomas congelados MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE LIPOSSOMAS • Métodos mecãnicos de Dispersão de solução orgânica de fosfolipídeos – Evaporação em fase reversa – Injeção em solução etanólica – Infusão em éter • Dispersão de micelas mistas – Eliminação de detergente Metodologia Preparação de Lipossomas Filme lipídico Lipids Solvent evaporation Ultrasound Liposomes MLV’s Aqueous phase SUV’s + α-glu-SO4 Metodologia Preparação de Lipossomas CHCl3 : MeOH Fosfatidilcolina de soja - Epikuron 200 Colesterol Estearilamina (Acido Úsnico) Hidratação com Tampão Fosfato pH 7,4 Filme lipídico MLV’s SUV’s Sonicação www.avantilipids.com/ PreparationOfLiposomes2B Lipossomas Branco Lipossomas Ác.Usnico CONSERVAÇÃO DE LIPOSSOMAS • Métodos de Conservação – Atmosfera de nitrogênio ou argônio – Temperatura 4°C – Abrigo da luz – Liofilização CONSERVAÇÃO DE LIPOSSOMAS • Alterações morfológicas e físicoquímicas – Oxidação e hidrólise de fosfolipídeos – Interações do tipo Van der Waals • Agregação • Presença de cargas negativas ou positivas CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS • Obtenção de uma preparação homogênea • Determinação do tamanho das vesículas • Taxa de encapsulação • Estabilidade físico-química • Cinética de liberação in vitro • Estabilidade em fluidos biológicos • Interação com células • Biodisponibilidade CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS • Estabilidade Físico-química – Aspecto macroscópico – Aspecto microscópico – Diâmetro das partículas – Viscosidade – Condutividade – pH – Potencial de superfície (zeta) – Temperatura de conservação – Doseamento do fármaco CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS • Estabilidade Físico-química – Aspecto macroscópico • Observação visual – Cor – Cremagem – Exsudato – Precipitado – Separação de fase CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS • Estabilidade Físico-química – Aspecto microscópico • Microscopia ótica (LUV, MLV) • Microscopia Eletrônica – Varredura (observação tridimensional da vesícula) – Transmissão (observação de MLV) – Força atômica (caracterização da superfície) TITULO Lipossomas Lipossomas Ácido Usnico Aspecto microscópico de lipossomas contendo ácido úsnico: Partículas uniformes bem distribuídas com tamanho de aproximadamente 130 nm. DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DE VESÍCULAS MICROFOTOGRAFIA DE LIPOSSOMAS TÉCNICA DE CRIOFRATURA CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS • Determinação do tamanho das vesículas – Contador de partículas Nanosizer • Espectroscopia de auto-correlação de fótons • Espalhamento da luz (light scattering) • Determinação do potencial de superfície Potencial zeta ξ (carga) NANOSIZER (PCS) NANOSIZER CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS • Taxa de encapsulação • Doseamento do fármaco • Porcentagem de encapsulação • Massa de substância encapsulada por unidade de massa de lipídeo Metodologia Taxa de encapsulação de fármacos em lipossomas • Determinação indireta A percentagem de incorporação de fármacos em lipossomas pode ser quantificada por HPLC, após separação do fármaco encapsulado do não encapsulado, através de uma ultrafiltração-centrifugação utilizando unidades filtrantes ultrafree® (Millipore). CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS • Influência de diferentes fatores sobre a taxa de encapsulação – Características do fármaco – Métodos deficientes de separação e marcação • Substâncias hidrossolúveis • Substâncias lipossolúveis e anfifílicas • Caso particular de proteínas • DNA ESTABILIDADE DE LIPOSSOMAS • Estabilidade Físico-química – Acelerada • Centrifugação • Ciclos de congelamento-descongelamento (8 h a -18°C e 16 h a 25°C) • Agitação mecânica (150 evoluções/min) – Movimento horizontal ESTABILIDADE DE LIPOSSOMAS • Estabilidade Físico-química – A longo prazo Medida de parâmetros físico-químicos em intervalos de tempo regulares (1, 15, 30, 60, 180, 360, etc dias) • Tamanho das vesículas • Doseamento do fármaco • Viscosidade • Condutividade • pH • Avaliação dos aspectos macroscópico e microscópico Metodologia Avaliação da cinética de liberação in vitro Direta Indireta Diálise Diálise inversa Meio receptor Tampão Meio doador Lipossomas Lipossomas Avaliação da atividade em células % ce ll viability % cell viability 100 80 60 40 20 0 2.5 5 10 20 100 80 60 40 20 0 2.5 Lip Cont Lipos AU Teste de citotoxicidade em células HEp-2 10 20 Conce ntration µg/ml C once ntration µg/ml UA Free 5 UA Free Lip Cont Lipos AU Teste de citotoxicidade em células NCIH-292 Citotoxicidade de lipossomas contendo ácido úsnico LIPOSSOMAS COMO MARCADORES ENDOCITOSE LIPOSSOMAL VIAS DE ADMINISTRAÇÃO VIAS de ADMINISTRAÇÃO DE LIPOSSOMAS • Parenteral (i.v.; i.m.; s.c.;i.c.) • Cutânea • Oftálmica • Nasal • Pulmonar NANOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA • Lipossomas (Injetáveis) – Terapia do Câncer • resistência multi-droga • Cardiotoxicidade – Doenças Infecciosas – Terapia Gênica • Lipossomas (Tópicos) – Farmacêuticos – Cosméticos APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS DE LIPOSSOMAS • Antibioticoterapia • Insuficiência respiratória neonatal (surfactante pulmonar) • Enzimas • Hormônioterapia • Produtos de contraste • Produtos radiofarmacêuticos • DNA • Vacinas APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS DE LIPOSSOMAS • Antiparasitários • Agentes quelantes • Antitumorais • Insulina LIPOSSOMAS ESTERICAMENTE ESTABILIZADOS PRODUTOS LIPOSSOMAIS Produto Fármaco Companhia Status Câncer DaunoXome® Doxil® Daunorubicina Doxorubicina NeXstar Aprovado Europa, US Sequus (Alza) Aprovado Europo, US Evacet® Doxorubicina Liposome Co. Fase III Annamycin Anamicin Aronex Fase I/II Cisplatin Cisplatin Atragen® Tretinoina Edelfosine Edelfosina Aronex Aronex Liposome Co. Fase II Fase I/II Fase I Infecções AmBisome® Amphotericin B NeXstar Aprovado Europa, US Nyotran® Nistatina Aronex Fase III MiKasome® Amikacina NeXstar Fase II/III Targeted www.cwru.edu/menu/research/drugdelivery.htm APLICAÇÕES DE LIPOSSOMAS • Cosmetologia – Vitaminas hidro e lipossolúveis – Agentes hidratantes – Elastina – Colágeno – Ácido hialurônico APLICAÇÕES DE LIPOSSOMAS • Cosmetologia – Anti-radicais livres – Antioxidantes – Agentes rejuvenecedores (remoção de colesterol) APLICAÇÕES DE LIPOSSOMAS • Farmácia de Manipulação – Incorporação de lipossomas pré-fabricados em • Cremes • Protetores solares • Gel • Gel creme • Xampu CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS CONTENDO LIPOSSOMAS • Observação macroscópica – observar a preservação das características iniciais do produto e detectar sinais de instabilidade • Observação microscópica – detectar a presença dos lipossomas na preparação • Determinação do ativo
