ESTUDO IN SILICO DE DERIVADOS DA PRIMAQUINA - PUC-Rio

Departamento de Química
ESTUDO IN SILICO DE DERIVADOS DA PRIMAQUINA
TIAZOLIDINONA
Aluna: Érika Murce Silva
Orientador: André Silva Pimentel
Introdução
A malária é uma doença causada pelos protozoários do gênero Plasmodium (P.
falciparum, P. vivax, P. ovale, P. malariae, P. Knowlesi) que provoca a morte de milhares de
pessoas por ano. Ocorre principalmente em regiões tropicais e subdesenvolvidas, frequentemente
na forma endêmica. As drogas do grupo das 8-Aminoquinolinas são utilizadas no tratamento da
doença, atuando como gametocitocidas, bloqueando a transmissão do parasita, ou como
esquizonticidas sanguíneos, destruindo o parasita no sangue. Dente elas, a Primaquina se destaca
devido à sua eficiência e menor toxicidade, e é administrada na profilaxia e no tratamento contra
a doença. Quando administrada juntamente com a Cloroquina, outro membro do grupo das 8Aminoquinolinas, seu efeito terapêutico é ainda mais eficaz. Houve, porém, um aumento da
resistência dos protozoários contra antimaláricos, sendo a Primaquina uma das poucas drogas à
qual os parasitas ainda não exibem resistência [1].
O mecanismo de cura da Primaquina não é conhecido por completo, mas acredita-se que
ela aja por meio de geração de estresse oxidativo, formando espécies oxigenadas reativas, ou por
meio de interferência no transporte eletrônico do parasita. São os metabólitos deste fármaco,
porém, os responsáveis pelo seu efeito. A toxicidade provém dos metabólitos hidroxilados, dentre
os quais as espécies 5-hydroxyprimaquina e 6-methoxy-8-aminoquinolina são representativas. O
principal efeito colateral do estresse oxidativo no corpo humano é o aumento da formação de
metemoglobinas (MHb), forma da hemoglobina incapaz de transportar oxigênio, que em altas
concentrações leva à morte por cianose. Além disso, a toxicidade pode causar anemia hemolítica
nos pacientes, e estes efeitos são acentuados em indivíduos que apresentam a condição genética
de deficiência em Glicose-6-fosfato-desidrogenase (G6PD) [2].
Devido ao aumento da resistência parasítica e à toxicidade dos fármacos, há interesse em
sintetizar novos derivados de antimaláricos para o combate à malária. Uma estratégia de síntese é
agregar grupos que possuam atividade farmacêutica conhecida ao composto original.
Pesquisadores brasileiros sintetizaram derivados da Primaquina com a agregação do anel
heterocíclico Tiazolidinona, amplamente utilizado em aplicações medicinais. Derivados de outros
antimaláricos com este anel demonstraram previamente atividade antimalárica significativa, in
vitro, justificando o interesse por este grupo [3].
É necessário, porém, realizar um estudo in silico destes compostos para avaliar qual é o
candidato mais propício como antimalárico, pois é inviável realizar testes pré-clínicos em todos
os derivados. Neste projeto, planeja-se utilizar técnicas de ancoramento molecular e dinâmica
molecular para selecionar o composto mais promissor, de forma a focar futuros testes pré-clínicos
em cima deste. Para isto, selecionou-se da proteína humana Quinona Redutase II (PDB: 4FGJ)
como alvo dos compostos, pois sofre inibição pela Primaquina. Além disso, estudou-se a
interação com o cofator FAD, pois o anel 8-aminoquinolina da Primaquina e o anel isoaloxazina
do cofator interagem via empilhamento π-π. Esta interação é importante no mecanismo de ação
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do fármaco na proteína [4].
Metodologia
Ancoramento Molecular Rígido
Os derivados da Primaquina Tiazolidinona foram inicialmente modelados no programa
GaussView 4.1.2, de acordo com as suas estruturas que estão presentes no Anexo 1. Após a
modelagem, as moléculas passaram por uma minimização energética no programa Ghemical
3.0.0, na qual o método de Monte Carlo foi aplicado com 100 passos, de forma a obter estruturas
iniciais energeticamente mais estáveis. Utilizou-se estas estruturas para realizar um ancoramento
molecular rígido com o programa AutoDockTools [5]. O ancoramento foi simulado em ambos os
sítios equivalentes da proteína homodimérica, porém separadamente, devido às restrições do
programa. A proteína foi importada sem a modificação de suas cargas originais pelas cargas
assinaladas pelo programa. Os sítios foram mapeados por meio do algoritmo AutoGrid, que gera
um mapa para cada elemento da proteína, além de mapas de potencial eletrostático e de
dessolvatação. O número de pontos da área mapeada foi 100x100x100, com espaçamento de
0.375 Å entre cada um.
Utilizou-se o algoritmo AutoDock para o ancoramento com o algoritmo genético (GA)
como método de busca, no qual parte-se de um pequeno grupo de estruturas, onde as melhores
são selecionadas de forma a otimizar os resultados, usando técnicas computacionais que se
assemelham à biologia evolutiva (mutação, recombinação, etc.). Este algoritmo foi rodado 100
vezes, com uma população inicial de 150 e taxa de mutação de 0.2. A energia eletrostática interna
foi também calculada. Os resultados são apresentados na forma de clusters, organizados por
similaridade conformacional e energética. A estrutura da Primaquina serviu como modelo para a
seleção da melhor conformação de cada derivado, e buscou-se as de menor energia e com melhor
orientação no sítio semelhante à do modelo.
Ancoramento Molecular Flexível
Realizou-se então o ancoramento molecular flexível no programa Molegro Virtual Docker
(MVD) [6]. A utilização de um programa diferente garante maior confiança nos resultados, e
além disso, o ancoramento flexível é mais preciso do que o rígido. Assim, avaliaram-se as
diferenças energéticas entre cada composto com maior exatidão. O programa incialmente
detectou as cavidades disponíveis na proteína, e a região onde ocorre o ancoramento foi então
manualmente selecionada. Os aminoácidos flexíveis foram definidos a partir da proximidade
espacial em relação a um ligante de referência (no caso, a Primaquina). Foi selecionada uma
região esférica de raio de 12 Å, que engloba a cavidade e os resíduos flexíveis para o
ancoramento. O algoritmo evolutivo MolDock, usado para o ancoramento, foi rodado 30 vezes
com uma população inicial de 50 indivíduos. A Imagem 1 mostra o sítio de ancoramento com os
aminoácidos flexibilizados, representados por esferas cinzas, e a cavidade em verde.
Os resultados são organizados a partir de um algoritmo de Tabu clustering, que retorna
apenas uma conformação para cada vez que o algoritmo é rodado. As poses retornadas são
limitadas por um valor numérico de desvio da raíz média quadrática (DRMQ) de 2.00 Å, que leva
em consideração a energia da conformação, fornecendo assim melhores resultados energéticos. É
recomendável usar este algoritmo no caso de ancoramentos flexíveis, pois ele garante maior
diversidade na simulação. O procedimento foi reproduzido sete vezes, e os compostos foram
ordenados energeticamente e comparados entre si. Aqueles que apresentaram as menores
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energias foram selecionados para a dinâmica molecular no programa Gromacs [7].
Imagem 1: Representação do procedimento realizado no Molegro. A região esverdeada é a
cavidade detectada, com a molécula de Primaquina em seu interior. As esferas ao seu redor
representam os aminoácidos flexíveis.
Dinâmica Molecular
No servidor de geração de topologias Automated Topology Builder (ATB), foram gerados
os arquivos .itp dos compostos selecionados para a dinâmica (arquivos de mapeamento da
molécula). A proteína também foi mapeada e obteve-se o arquivo de .itp para o cofator FAD, já
que espera-se que haja interação entre este e os derivados. Para cada sistema, os compostos foram
adicionados duas vezes, uma em cada sítio de ligação. O procedimento e a ordenação foram
feitos por meio de um script programado manualmente. O sistema da Primaquina foi montado
como modelo para comparação dos resultados.
A dinâmica foi feita por meio do programa Gromacs [7]. A caixa cúbica 5.9 x 5.4 x 7.1
nm para o sistema foi criada de forma que suas faces distanciassem no mínimo 1 nm dos
extremos da proteína, e foi então preenchida por água. Devido ao fato de o sistema possuir cargas
negativas, provenientes da proteína, adicionou-se átomos de sódio para neutralizá-lo. O cofator e
o derivado correspondente tiveram suas posições restritas dentro do limite do sítio ativo.
Realizaram-se então quatro minimizações energéticas: Steepest Descent, com e sem restrição de
posição; Gradientes conjugados e Quasi-Newton, as duas últimas sem restrição de posição.
Inicialmente, 500ps de dinâmica foram rodados com restrição de posição, para estabilizar
o sistema. Seguiu-se a dinâmica sem restrição de posição, de 20ns (com tempo de integração
entre cada passo de 2 fs). A temperatura do sistema foi mantida constante à 310K por meio de um
acoplamento de temperatura velocity rescale, e a pressão mantida a 1 bar por meio de um
acoplamento de Berendsen isotrópico utilizando o ensemble NpT. As interações eletrostáticas de
longa distância foram avaliadas pela técnica de PME com raio de corte de 10 Å. Geraram-se
gráficos de desvio da raíz média quadrática e de número de ligações de hidrogênio entre cada
derivado e a proteína, para comparar a interação e a estabilidade no sítio.
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Resultados
Ancoramento Molecular Rígido
Analisou-se os resultados para cada composto por meio dos clusters formados e por
comparação com a conformação da Primaquina ancorada na estrutura cristalina da proteína. De
forma a avaliar a energia, foi realizado um ancoramento com a própria Primaquina. Como
resultado, obtiveram-se dois clusters bem definidos, um em -9.4 kcal/mol com 42 conformações,
e um em -9.6 kcal/mol com 34 conformações. As conformações de cada cluster se diferenciaram
muito pouco e foi selecionado o de melhor energia (-9.6 kcal/mol) como referencial. Este valor
energético calculado pelo programa é relativo, justificando o uso de um referencial. Valores
menores indicam maior estabilidade da conformação no sítio.
Para todos os derivados, obtiveram-se vários clusters, com menor número de
conformações e pouca diferença energética entre si, entre a região de -7 a -11 kcal/mol. Os
clusters mais abundantes apresentaram em torno de 15 conformações, apesar de não serem os de
melhor energia. Como prioridade, buscou-se conformações nos clusters de melhor energia que se
assemelhassem à da Primaquina. Por serem maiores, notadamente devido a presença de um anel
aromático adicional, já esperava-se que não houvesse a sobreposição total dos derivados. As
conformações ideais foram, pois, aquelas nas quais o anel 8-Aminoquinolina se sobrepôs, já que
é conhecida a interação deste anel com o cofator.
Em alguns casos, houve a sobreposição total dos anéis, mas em outros, não houve
sobreposição satisfatória dos derivados. A Imagem 2 mostra alguns casos de sobreposição entre
a melhor conformação encontrada para o derivado, e a Primaquina. A energia destas
conformações é em torno de -10, mostrando que a estabilidade destes derivados é semelhante à
da Primaquina. Este comportamento ocorreu no ancoramento em ambos os sítios homodiméricos.
Imagem 2: Comportamento geral das conformações encontradas após o ancoramento rígido. As
conformações apresentadas correspondem aos derivados 5b, 5i e 5m. A estrutura esverdeada
corresponde à Primaquina, enquanto que as acinzentadas são os derivados correspondentes.
Não houve nenhum derivado que se sobressaísse em relação aos outros em termos de
sobreposição exata ou de melhor energia. Portanto, o ancoramento foi pouco conclusivo e não foi
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possível selecionar o melhor candidato para a dinâmica molecular. Optou-se então pelo
ancoramento molecular flexível, de forma a distinguir melhor os derivados entre si.
Ancoramento Molecular Flexível
Os resultados energéticos do ancoramento flexível são exibidos pelo programa para todos
os derivados e a Primaquina em uma única tabela, facilitando a comparação. Inicialmente, notouse que a energia relativa de todos os derivados era muito menor do que a da Primaquina, um
resultado favorável, mostrando uma maior estabilidade destes compostos. De forma a comparar
os compostos entre si, o melhor valor energético para cada um foi escolhido e tabelado, para cada
um dos ancoramentos que foi realizado. Finalmente, foram distinguidos os cinco derivados que
apresentaram melhor desempenho (melhor energia) em todos os ancoramentos. Estes compostos
são os derivados 5i, 5j, 5m, 5n e 5o, os quais foram submetidos à dinâmica molecular.
Na Imagem 3, é apresentada a sobreposição de um dos derivados (5o) com a Primaquina.
Verifica-se, como no ancoramento rígido, que não houve a sobreposição total, apenas a parcial,
dos anéis. Na segunda parte da imagem, porém, observa-se que os anéis 8-Aminoquinolina do
derivado estão paralelos aos anéis do cofator FAD. Este indício da interação via empilhamento ππ é importante para justificar que os derivados atuam via mecanismo semelhante ao da
Primaquina.
Imagem 3: Representação do derivado 5o, sobreposto à molécula de primaquina, e representação
deste mesmo derivado com sua posição relativa ao cofator FAD.
Dinâmica Molecular
O desvio da raíz média quadrática (DRMQ), apresentado na Imagem 4, mostra a
estabilidade da interação entre derivados e sítio de ligação. Valores menores indicam que houve
menos flutuação na posição do ligante no sítio. Todos os cinco derivados possuem DRMQ menor
do que 1 nm, sendo assim estáveis. Para a Primaquina, este valor é em média 0.7 nm. O derivado
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5n apresentou menor valor para o desvio (em média 0.2 nm), e o maior valor médio foi o do 5o.
Este valor, porém, é similar ao da Primaquina, mostrando que todos os derivados são mais
estáveis ou igualmente estáveis do que o fármaco original.
Imagem 4: Desvio da raíz média quadrática dos derivados 5i, 5j, 5m, 5n e 5o em relação ao sítio
de ligação da proteína, durante a dinâmica molecular de 20 ns.
As ligações de hidrogênio entre ligantes e proteína, representadas na Imagem 5, mostram
também a força da interação entre ambos. A Primaquina possui em média sete ligações de
hidrogênio durante o período simulado. Para todos os derivados, este valor é menor: o composto
5i, que em média possui mais ligações de hidrogênio do que os outros, possui quatro. Já o 5o
possui apenas duas. Isto demonstra que o grupo Tiazolidinona adicionado não é um bom grupo
formador de ligações de hidrogênio.
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Imagem 5: Número de ligações de hidrogênio formadas entre os derivados 5i, 5j, 5m, 5n e 5o, e o
sítio de ligação da proteína, durante a dinâmica molecular de 20 ns.
Por outro lado, os derivados podem interagir de forma diferente (com resíduos de
aminoácidos diferentes daqueles com os quais a Primaquina interage). Dessa forma, haveria
menos ligações de hidrogênio devido à interação com aminoácidos que não possuem os grupos
corretos para este tipo de interação. Esta hipótese também justificaria porque o DRMQ dos
derivados é menor do que o do fármaco (os ‘novos’ resíduos estabilizariam os derivados mais do
que os resíduos originais estabilizam a Primaquina). Tal formulação é plausível pois, como visto
nos ancoramentos, não houve sobreposição total entre derivados e Primaquina. Seriam
necessários, porém, testes adicionais para comprovar esta teoria.
Conclusão
Quinze compostos já sintetizados para o combate à malária foram modelados e testados in
silico, de forma a avaliar os melhores candidatos para futuros testes clínicos. Estes candidatos
foram testados por meio de ancoramento molecular e dinâmica molecular. Por serem derivados
do fármaco Primaquina, os resultados das simulações foram comparados entre si, de forma a
verificar se os compostos tem potencial para tornarem-se fármacos mais potentes do que o
disponível. Além disso, foi utilizada a proteína humana Quinona Redutase 2 nas simulações, pois
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se trata do alvo da Primaquina no corpo humano.
A partir do ancoramento molecular, foi possível destacar cinco dentre os quinze
compostos (5i, 5j, 5m, 5n, 5o). Estes derivados possuem maior estabilidade no sítio alvo da
proteína, o que é representado por um menor valor energético. De forma a avaliar como o sistema
derivado-proteína se comporta ao longo do tempo, submeteu-se os cinco compostos à dinâmica
molecular. Em todos os sistemas, o derivado foi capaz de se estabilizar no sítio de forma
semelhante, superior à da Primaquina. Estes compostos apresentaram, porém, uma perda de
estabilidade representada na forma de um menor número de ligações de hidrogênio formadas com
a proteína, em comparação com a Primaquina.
Dessa forma, não foi possível apontar qual dos cinco derivados se sobressaiu em relação
aos outros. Testes computacionais adicionais podem ser realizados nos compostos para melhor
caracterizar suas propriedades, porém, também é possível implementar uma metodologia in vitro
para testar os derivados. O caminho selecionado para a continuidade do projeto dependerá de
uma colaboração com o grupo de pesquisadores brasileiros responsável pela síntese [3].
Referências
[1] VALE, N., MOREIRA R., GOMES P. Primaquine revisited six decades after its discovery.
European Journal of Medical Chemistry, 44(3), 937-953, 2009.
[2] PYBUS, B.S. et al. CYP450 phenotyping and accurate mass identification of metabolites of
the 8-aminoquinoline, anti-malarial drug primaquine. Malaria Journal, 11:259, 2012.
[3] NEUENFELDT, P.D. et al. Multicompnent Syntehis of New Primaquine Thiazolidinone
Derivatives. Synthesis, 2011.
[4] LEUNG, K.K.; SHILTON B.H. Chloroquine Binding Reveals Flavin Redox Switch Function
of Quinone Reductase 2. J Biol Chem, 288, 11242-11251, 2013.
[5] Morris, G. M., Huey, R., Lindstrom, W., Sanner, M. F., Belew, R. K., Goodsell, D. S. and
Olson, A. J. (2009) Autodock4 and AutoDockTools4: automated docking with selective receptor
flexiblity. J. Computational Chemistry, 16, 2785-91, 2009.
[6] THOMSEN, R.; CHRISTENSEN, M. H. MolDock: A New Technique for High-Accuracy
Molecular Docking. J. Med. Chem, 49(11), 3315-3321, 2006.
[7] PRONK, et al. GROMACS 4.5: a high-throughput and highly parallel open source molecular
simulation toolkit. Bioinformatics, 29, 845-854, 2013.
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Anexo 1: Estruturas dos derivados da Primaquina Tiazolidinona [3]
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