Avaliação da atividade biológica do Taro [(Colocasia esculenta (L

UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Avaliação da atividade biológica do Taro [(Colocasia
esculenta (L.) Schott)] no ensaio de letalidade com
Artemia salina Leach, no teste antifúngico de
microdiluição em caldo e na hipercolesterolemia em
coelhos
Ouro Preto – Minas Gerais – Brasil
Abril, 2011
UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
Avaliação da atividade biológica do Taro [(Colocasia
esculenta (L.) Schott)] no ensaio de letalidade com
Artemia salina Leach, no teste antifúngico de
microdiluição em caldo e na hipercolesterolemia em
coelhos
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Farmacêuticas, como parte das exigências para
obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dr. Tanus Jorge Nagem
Co-Orientadora: Drª Tânia Toledo de Oliveira
Graciene Dias e Reis
R375a
Reis, Graciene Dias e.
Avaliação da atividade biológica do taro [(Colocasia esculenta (L.) Schott)] no
ensaio de letalidade com Artemia salina Leach, no teste antifúngico de
microdiluição em caldo e na hipercolesterolemia em coelhos [manuscrito] /
Graciene Dias e Reis. – 2011.
vii, 64 f.: il. color.; tabs.
Orientador: Prof. Dr. Tanus Jorge Nagem.
Coorientadora: Profa. Dra. Tânia Toledo de Oliveira.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Escola de
Farmácia. Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos e Medicamentos
1. Plantas medicinais - Teses. 2. Colocasia esculenta - Teses.
3. Hipercolesterolemia - Teses. 4. Antifúngicos - Teses. I. Nagem, Tanus Jorge.
II. Oliveira, Tânia Toledo de. III. Universidade Federal de Ouro Preto. IV. Título.
CDU: 615.282:612.397
Catalogação: [email protected]
Dedico esta dissertação aos meus pais,
meus irmãos e ao Léo.
Pilares da minha fortaleza.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Drº Tanus Jorge Nagem pela seriedade e competência. Além de ser
referência em conhecimento e excelência profissional é também um exemplo de força e superação
pessoal. Tenho orgulho de tê-lo como meu orientador.
À minha co-orientadora, Prof. Drª Tânia Toledo de Oliveira pela sabedoria e atenção. Exemplo de
que dinamismo, competência e feminilidade podem existir em conjunto e harmonia.
À minha mãe pela confiança e amor incondicional. Obrigada, mãe, por me apoiar com tanto carinho
e compreensão, pela paciência e empenho para o meu crescimento pessoal. Te admiro muito!
Ao meu pai, que mesmo não estando mais aqui, é meu exemplo de vida. Saudade!
Aos meus irmãos queridos. Amo muito!
Ao Léo, meu amor, pelo companheirismo, carinho e cumplicidade. Agradeço também pelas buscas
de serragem, por ajudar a cuidar dos coelhinhos, pelos açaís, por estar sempre ao meu lado e por
tantas outras coisas!
À Denise e ao Leonardo por me acolherem com tanto carinho. Obrigada, Denise, pelas palavras de
encorajamento e motivação quando tudo parecia tão difícil.
Ao Willian pela amizade e por ter me ajudado na tradução do artigo.
Ao Prof. Mário Puiatti pela colaboração em ceder o material vegetal.
Aos amigos e toda a equipe do Laboratório de Produtos Naturais da Universidade Federal de Ouro
Preto e do Laboratório de Biofármacos da Universidade Federal de Viçosa pela colaboração,
amizade e disposição em ajudar.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS.........................................................................................................................i
LISTA DE TABELAS........................................................................................................................ii
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS...............................................................................iv
RESUMO...........................................................................................................................................vi
ABSTRACT......................................................................................................................................vii
INTRODUÇÃO..................................................................................................................................1
REVISÃO DA LITERATURA.........................................................................................................2
1. Colocasia esculenta.......................................................................................................................2
1.1.
Constituição do taro........................................................................................4
1.2.
Etnofarmacologia............................................................................................6
1.3.
Atividades biológicas.......................................................................................7
1.3.1. Efeito hipolipemiante..........................................................................7
1.3.2. Efeito antiinflamatório........................................................................8
1.3.3. Efeito anticancerígeno.........................................................................8
1.3.4. Efeito antidiabético.............................................................................9
1.3.5. Efeito modulador do sistema imune................................................10
2. Ensaio de letalidade com Artemia salina..................................................................................10
3. Atividade Antifúngica................................................................................................................11
4. Hipercolesterolemia...................................................................................................................12
OBJETIVOS.....................................................................................................................................19
1. Objetivos específicos.............................................................................................................19
MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................................................19
1. Material vegetal....................................................................................................................19
2. Preparo do vegetal................................................................................................................20
2.1.
Obtenção da tintura de taro....................................................................................20
2.2.
Resíduo seco da tintura de taro..............................................................................21
2.3.
Obtenção do extrato de taro....................................................................................21
3. Ensaio de letalidade com Artemia salina Leach.................................................................21
4. Teste antifúngico de microdiluição em caldo.....................................................................22
5. Hipercolesterolemia in vivo..................................................................................................24
RESULTADOS.................................................................................................................................27
1. Tintura e extrato de taro......................................................................................................27
2. Ensaio de letalidade com Artemia salina Leach.................................................................27
3. Teste antifúngico de microdiluição em caldo....................................................................29
4. Hipercolesterolemia in vivo.................................................................................................31
4.1.
Análise bioquímica ao final do experimento.........................................................31
4.2.
Avaliação do peso corporal dos animais ...............................................................53
4.3.
Avaliação macrosc[opica do fígado dos animais....................................................55
CONCLUSÃO...................................................................................................................................56
REFERÊNCIAS...............................................................................................................................57
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Espécie Colocasia esculenta com identificação das suas partes. Fonte: arquivo pessoal do
pesquisador...........................................................................................................................................2
Figura 2: Esquema da via biossintética do colesterol.......................................................................17
.
Figura 3: Constituintes de C. esculenta: MGDG e DGDG. Fonte: SAKANO et al, 2005...............18
Figura 4: Esquema de diluição do extrato de taro.............................................................................22
Figura 5: Esquema do plaqueamento para teste antifúngico.............................................................24
Figura 6: Placa multipoço com o teste antifúngico do extrato de taro em relação ao fármaco
Fluconazol..........................................................................................................................................30
Figura 7: Placa multipoço com o teste antifúngico do extrato de taro em relação ao fármaco
Cetoconazol........................................................................................................................................31
Figura 8: Valores médios de colesterol total em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28
dias de tratamento...............................................................................................................................33
Figura 9: Valores médios de HDL em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento...........................................................................................................................................35
Figura 10: Valores médios de triglicerídios em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28
dias de tratamento...............................................................................................................................37
Figura 11: Valores médios de glicose em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento...........................................................................................................................................39
Figura 12: Valores médios de AST em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento...........................................................................................................................................41
Figura 13: Valores médios de ALT em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento...........................................................................................................................................42
Figura 14: Valores médios de gama-GT em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias
de tratamento......................................................................................................................................44
Figura 15: Valores médios de fosfatase alcalina em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após
28 dias de tratamento..........................................................................................................................46
Figura 16: Valores médios de albumina em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias
de tratamento......................................................................................................................................48
Figura 17: Valores médios de proteína total em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28
dias de tratamento...............................................................................................................................49
Figura 18: Valores médios de uréia em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento...........................................................................................................................................51
i
Figura 19: Valores médios de creatinina em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias
de tratamento......................................................................................................................................52
Figura 20: Pesagem dos animais. Fonte: arquivo pessoal do pesquisador........................................53
Figura 21: Aspecto macroscópico do fígado dos coelhos após o experimento.................................55
ii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Toxicidade do extrato de taro frente a A. salina................................................................27
Tabela 2: Controle positivo do teste de toxicidade...........................................................................28
Tabela 3: Controle negativo do teste de toxicidade..........................................................................28
Tabela 4: Resultado do teste antifúngico do extrato de taro e do fármaco Fluconazol.....................29
Tabela 5: Resultado do teste antifúngico do extrato de taro e do fármaco Cetoconazol...................30
Tabela 6: Valores médios de colesterol total em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28
dias de tratamento...............................................................................................................................33
Tabela 7: Valores médios de HDL em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento...........................................................................................................................................35
Tabela 8: Valores médios de triglicerídeos em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28
dias de tratamento...............................................................................................................................37
Tabela 9: Valores médios de glicose em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento...........................................................................................................................................39
Tabela 10: Valores médios AST em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento...........................................................................................................................................40
Tabela 11: Valores médios de ALT em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento...........................................................................................................................................42
Tabela 12: Valores médios de gama-GT em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias
de tratamento......................................................................................................................................44
Tabela 13: Valores médios de fosfatase alcalina em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após
28 dias de tratamento..........................................................................................................................46
Tabela 14: Valores médios de albumina em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias
de tratamento......................................................................................................................................47
Tabela 15: Valores médios de proteína total em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28
dias de tratamento...............................................................................................................................49
Tabela 16: Valores médios de uréia em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento...........................................................................................................................................50
Tabela 17: Valores médios de creatinina em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias
de tratamento......................................................................................................................................52
Tabela 18: Avaliação do ganho de massa dos animais.....................................................................54
iii
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
ABST
Co-transportador ácido biliar Na+/bile ileal
ALT
Alanina aminotransferase
ApoB
Apolipoproteína B
AST
Aspartato aminotransferase
BGH
Banco de Germoplasma de Hortaliças
BHT/g
Butilhidroxitolueno
CLSI
Clinical and Laboratory Standards Institute
cmolc
Centimol de carga
CTC (T)
Capacidade de troca catiônica a pH 7,0
CTC(t)
Capacidade de troca catiônica efetiva
Dag
Decagrama
DGDG
Digalactosildiacilglicerol
3
dm
Decímetro cúbico
DMSO
Dimetilsulfóxido
DPPH
1,1-difenil-2-picrilhidrazil
FPP
Farnesil difosfato
gama-GT
Gama glutamil transferase
GPP
Geranil difosfato
H + Al
Acidez potencial
ha
Hectare
HDL
lipoproteína de baixa densidade
HMG-CoA 3-Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl Coenzyme A
INPM
Instituto Nacional de Pesos e Medidas
Kcal
Quilocaloria (s)
KJ
Quilojoule
LDAO
Laurildimetilamina N-óxido
LDL
Do inglês: Low Density Lipoprotein, lipoproteína de baixa densidade
m
Índice de saturação por alumínio
MGDG
Monogalactosildiacilglicerol
MIC
Concentração inibitória mínima
MO
Matéria orgânica
mRNA
Ácido ribonucléico mensageiro
NO
Óxido nítrico
iv
NOS
Óxido nítrico sintase
RPMI
Meio de cultura Roswell Park Memorial Institute
SB
Soma de bases
SCFA
Produto fermentado da mucilagem
TGO
Transaminase glutâmico-oxalacética
TGP
Transaminase glutâmico-pirúvica
UFV
Universidade Federal de Viçosa
U/L
Unidades por litro
V
Índice de saturação por bases
VLDL
lipoproteína de muito baixa densidade
v
RESUMO
A espécie Colocasia esculenta, conhecida como taro, inhame ou cará, é uma planta da
família Araceae e apresenta em sua constituição várias moléculas com atividade farmacológica,
como flavonóides, fitosteróis, saponinas, entre outras. Relatos etnofarmacológicos indicam o seu
potencial como agente terapêutico natural. A busca por tratamentos naturais é de grande interesse já
que a intervenção farmacológica está sempre associada a efeitos colaterais indesejáveis. A partir dos
tubérculos de C. esculenta, pretendeu-se avaliar a ação do taro no bioensaio de letalidade com
Artemia salina Leach para se ter um indicativo preliminar da toxicidade do extrato; no teste
antifúngico de microdiluição em caldo sobre quatro espécies de Candida para verificar possível
ação fungicida; e no teste de hipercolesterolemia in vivo para analisar a atuação sobre o
metabolismo lipídico de coelhos. Como resultado, observou-se que o extrato de taro não apresentou
toxicidade aguda significante, não oferecendo risco toxicológico na utilização do mesmo.
Apresentou atividade antifúngica contra 4 espécies de Candida: C. Albicans, C. tropicalis, C.
parapsilosis, C. krusei. E, a tintura de taro 20% mostrou-se eficaz na redução do perfil lipídico
sérico de coelhos. Assim, considerando que o taro é um alimento bastante nutritivo, a avaliação de
sua ação medicinal associará a ele mais um efeito benéfico, sendo de grande valia incentivar o seu
consumo em prol da saúde, podendo ainda fazer com que o taro se torne um fitoterápico promissor.
vi
ABSTRACT
The species Colocasia esculenta, also known as taro or yam, is a plant of the Araceae family
and presents in its constitution several molecules with pharmacological activity, such as flavonoids,
phytosterols, saponins, among others. Ethnopharmacological reports indicate its potential as a
natural therapeutic agent. The search for natural treatments is of great interest since
pharmacological intervention is always associated with undesirable side effects. From the tubers of
C. esculenta, we sought to assess the action of taro in the bioassay of lethality with Artemia salina
Leach to have a preliminary indication of the extract toxicity; in the microdilution antifungal test
about four Candida species to verify possible fungicidal effect, and in in vivo hypercholesterolemia
test to analyze the performance on the lipid metabolism of rabbits. As a result, it was observed that
the extract of taro showed no significant acute toxicity, offering no toxicological hazard in use.
Showed antifungal activity against four Candida species: C. Albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis,
C. krusei. And dye taro 20% was effective in reducing serum lipid profile of rabbits. Thus,
considering that the tarot is a very nutritious food, the assessment of its medicinal properties
associate him with one more beneficial effect, being very important to encourage consumption for
health and may even cause the taro becomes an herbal promising.
vii
INTRODUÇÃO
O uso de plantas medicinais é uma prática milenar que, por muito tempo, foi baseada no
empirismo e no relato popular. A partir do período medieval até o fim do século XIX, os
medicamentos eram produzidos em farmácias, manipulados artesanalmente e em pequena escala.
Com a consolidação da energia elétrica, da era Industrial e da pesquisa científica, a produção de
medicamentos pelas farmácias deu espaço para a indústria farmacêutica. A partir das plantas, foram
isoladas e sintetizadas diversas substâncias que passaram a ser comercializadas como princípio
ativo isolado. Com o desenvolvimento da química medicinal, moléculas já conhecidas passaram a
ser modificadas estruturalmente com a finalidade de se obter fármacos mais potentes e com menor
toxicidade. Porém, logo surgiram alguns obstáculos: a molécula de interesse quase sempre está
presente no vegetal em pequenas quantidades e, para o isolamento de princípios ativos em escala
industrial, é necessário uma grande quantidade de planta, o que muitas vezes não é viável; e a
síntese de moléculas muito complexas nem sempre é possível metodológica e economicamente.
Diante disso, a partir da década de 60, as atenções retornaram com maior interesse para as
vantagens de se utilizar as plantas medicinais. Assim, houve uma revalorização da fitoterapia, que
busca associar qualidade, eficácia e segurança à matéria-prima vegetal.
Entre as vantagens da utilização de produtos naturais está o fato de que cada planta é
constituída de inúmeros princípios ativos que agem em sinergia, o que torna o efeito do conjunto
mais potente. Como existem várias moléculas atuando juntas, cada uma delas vai estar presente em
menor concentração em relação ao princípio ativo isolado, diminuindo, assim, os efeitos colaterais
associados. Além disso, a grande biodiversidade da flora terrestre favorece e incentiva o estudo de
atividades biológicas presentes nas plantas para a sua utilização no tratamento de doenças.
Relatos etnofarmacológicos e alguns poucos estudos já realizados indicam o potencial da
planta Colocasia esculenta, conhecida como taro ou inhame, em atuar como agente terapêutico. E
considerando que o taro é um alimento bastante nutritivo, a avaliação de sua ação medicinal
associará a ele mais um efeito benéfico, tornando de grande valia o incentivo do seu consumo em
prol da saúde, podendo ainda fazer com que se torne um fitoterápico promissor. Com esse intuito,
então, pretendeu-se avaliar a ação do taro no ensaio de letalidade com Artemia salina Leach para se
ter um indicativo preliminar da toxicidade do extrato; no teste antifúngico de microdiluição em
caldo sobre quatro espécies de Candida para verificar possível ação fungicida; e no teste de
hipercolesterolemia in vivo para analisar a atuação da tintura sobre o metabolismo lipídico.
1
REVISÃO DA LITERATURA
1. Colocasia esculenta (L.) Schott
FOLHA
PSEUDO CAULE
RIZOMA-MÃE
RIZOMA-FILHO
Figura 1: Espécie Colocasia esculenta com identificação das suas partes. Fonte: arquivo pessoal do
pesquisador.
A espécie Colocasia esculenta é uma planta pertencente à família Araceae, mundialmente
denominada de taro, “dasheen” ou “eddoe”. No sudeste, centro e sul do Brasil é conhecida como
inhame, possivelmente em razão da semelhança entre os tipos de tubérculos subterrâneos das
Dioscoreáceas com aqueles das Aráceas. Em razão da confusão quanto à nomenclatura desses
vegetais, estabeleceu-se que o “inhame”, Colocasia esculenta, passa a ter a denominação definitiva
de “taro”, e as Dioscoreáceas, Dioscorea spp., chamadas popularmente no norte/nordeste brasileiro
de “carás” e “inhames” passam a ter a denominação definitiva de “inhame” (PEDRALLI, et al.,
2002). Além disso, há confusão também quanto à taxonomia. É controverso a existência de apenas
uma espécie com duas variedades botânicas, C. esculenta var antiquorum e C. esculenta var.
2
esculenta, ou a existência de duas espécies diferentes, C. esculenta e C. antiquorum
(ONYILAGHA, et al., 1987). Apesar da incerteza, evidências tendem a agrupar o taro em duas
espécies separadas (JIANCHU, et al., 2001).
Dentro da espécie C. esculenta existem diferenças morfológicas e por isso o taro recebe
outras denominações para identificar suas variedades comerciais, entre elas podem-se citar o taro
japonês, taro macaquinho, taro chinês, taro branco, e outras. Entre as características que mais
contribuem para a distinção entre as variedades de taro estão: número máximo de folhas por planta,
modelo da nervura, cor do pecíolo, cor da bainha foliar, comprimento do rizoma principal e peso
médio de rizomas secundários (PUIATTI & PEREIRA, 2002).
As aráceas são conhecidas na China desde 100 anos a.C., são típicas de regiões tropicais e
subtropicais e possuem cerca de 100 gêneros e mais de 3000 espécies. No Brasil existem 35 gêneros
e 400 espécies nativas. Entre as espécies utilizadas como ornamentais cita-se o antúrio, o copo-deleite, o lírio-da-paz, o comigo-ninguém-pode, e outras. E entre as espécies usadas na alimentação
tem-se o taro e a taioba (SOUZA & LORENZI, 2005) e o mangarito (Xanthosoma mafaffa). A
espécie C. esculenta é originária da Ásia, cultivada desde a Antiguidade, onde era alimento de
faraós na Índia e no Egito. A introdução da espécie no Brasil foi promovida provavelmente pelos
portugueses e, desde então, houve expressivo crescimento do seu cultivo. As lavouras concentramse principalmente no sul da Bahia e sudeste brasileiro.
A mais conhecida utilização do taro é na alimentação, mas vem se ampliando os seus usos,
como por exemplo, na extração de amido para a indústria alimentícia. O desenvolvimento de
produtos alimentícios para o consumo humano à base de farinha de taro é crescente e apresenta a
vantagem de não conter glúten, diferentemente do trigo, do centeio, da cevada e da aveia. Assim, a
farinha de taro é uma alternativa para os portadores da doença celíaca, que apresentam intolerância
ao glúten (BROWN & VALIERE, 2004). Outro produto a base de taro com essas mesmas
características é o “Poi”, uma massa de amido feita a partir do taro cozido e amassado, que é
considerado um alimento pró-biótico com inúmeros benefícios para a saúde (BROWN &
VALIERE, 2004). Porém, os problemas de palatabilidade associados ao taro prejudicam a sua
utilização. As causas desses problemas antinutricionais estão relacionadas à presença de cristais de
oxalato de cálcio (ráfides) e outras substâncias acídicas e proteináceas. Ráfides são estruturas em
formato de cristais finos e alongados com funções de proteção e de estoque de cálcio na forma de
oxalato de cálcio. Sua presença nos alimentos provoca acridez (SEFA-DEDEH & SACKEY, 2002);
todavia, alguns tipos de processamento melhoram as características do produto, como por exemplo,
o cozimento, que reduz o conteúdo de oxalato de cálcio, provavelmente por degradação térmica das
estruturas (IWUOHA & KALU, 1995). Outra possível e recente utilidade do taro está na sua
3
atuação em processos de fitorremediação, ou seja, C. esculenta é uma planta promissora para a
recuperação de águas poluídas por chumbo (Pb) e cádmio (Cd). A presença desses metais pesados
na água é um problema ambiental que afeta o sistema aquático e a saúde humana. O processo foi
testado a partir do crescimento hidropônico da planta utilizando água contaminada com esses
metais. Verificou-se acúmulo em altas concentrações nas raízes do vegetal, sugerindo que ocorreu
migração dos metais para as células da planta (BINDU, et al., 2010). Além dessas utilidades, têm-se
relatos sobre as propriedades medicinais do taro, como será apresentado a seguir.
1.1.
Constituição do taro
Sob o ponto de vista nutricional, o taro é superior à batata inglesa, batata doce, mandioca,
cará e arroz. Seus rizomas são ricos em carboidratos, proteínas, vitaminas, minerais e ácidos
orgânicos. Entre as vitaminas cita-se a tiamina ( B1), a piridoxina ( B6) e a vitamina C. Embora de
baixo conteúdo lipídico, o taro apresenta alto nível de ácidos graxos insaturados, como o ácido
linoléico (ômega-6) e ácido linolênico (ômega-3). Possui ainda antocianinas, fitosteróis,
glicolipídios, antioxidantes, e outros. É facilmente assimilado pelo organismo, podendo ser usado
em alimentos para crianças, hipoalergênicos e para celíacos (RAMOS FILHO, et al., 1997).
A composição dos vegetais depende da variedade, local de cultivo, estação do ano, método
de processamento e armazenagem. A constituição do taro apresenta variações decorrentes dos
fatores citados acima, mas tem-se os seguintes valores como referência: (SEFA-DEDEH &
SACKEY, 2004; NEPA-UNICAMP, 2006).
Energia: 97 Kcal e 405 KJ/100g de amostra crua; fibra: 1,7 g/100g de amostra crua;
umidade: 59,30% a 72,06%; proteína: 2,98 a 4,69 g/100g de amostra seca; amido: 17,8 a 32,5
g/100g de amostra seca; lipídio: 0,64 a 0, 97 g/100g de amostra seca; cinzas: 1,56 a 1,88 g/100g de
amostra seca;
Entre os minerais tem-se:
Ca (cálcio): 4,68 a 7,09 mg/100g, Fe (ferro): 2,68 a 3,75 mg/100g, Mg (magnésio): 48,7 a
64,8 mg/100g, Zn (zinco): 17,0 a 28,4 mg/100g, K (potássio): 763 a 1004 mg/100g, Na (sódio):
28,5 a 34,6 mg/100g, P (fósforo): 54,7 a 61,5 mg/100g.
E quanto ao conteúdo de oxalato de cálcio:
Amostras frescas: 459 µg/100g
A quantidade expressiva de oxalato de cálcio (459 µg/100g) é a responsável pela acridez e
toxicidade do taro fresco, já que o limiar para humanos é de 71 µg/100g. Porém, as amostras
processadas têm a quantidade de oxalato de cálcio diminuída. Assim, o taro, principalmente as
4
folhas, não deve ser consumido cru em grandes quantidades. E pacientes com cálculos renais por
oxalato de cálcio devem diminuir o seu uso na alimentação (SEFA-DEDEH & SACKEY, 2004).
Através de ensaios fitoquímicos foi constatada a presença de flavonóides, alcalóides, taninos
e saponinas no taro (MCEWAN, 2008; GOMEZ-BELOZ & RIVERO, 2006). Foram identificados
flavonóides-glicosídeos, sendo seis C-glicosilflavonóides e um O-glicosilflavonóide. São eles,
respectivamente: escaftosídeo, isoescaftosídeo, orientina, isoorientina, vitexina, isovitexina e
luteolina 7-O-soforosídeo. As antocianinas identificadas no taro são pelargonidina-3-glicosídeo,
cianidina-3-ramnosídeo e cianidina-3-glicosídeo. Uma característica importante dessas substâncias
é a sua atividade antioxidante com consequente proteção aos danos causados pelos agentes
oxidantes, principalmente radicais livres, presentes no organismo (LEONG, et al., 2010). No talo do
taro, um pseudocaule, foi identificada outra antocianina, cianidina-3-rutinosídeo, que teve sua
atividade antioxidante investigada utilizando o método DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil). Essa
atividade apresentou o valor de 114 mg, equivalente ao antioxidante sintético padrão BHT/g
(Butilhidroxitolueno) (TERASAWA, et al., 2007). Tem-se também a presença de quantidades
apreciáveis de aminoácidos essenciais como fenilalanina e leucina. Os principais ácidos orgânicos
presentes no taro são o ácido málico, ácido oxálico e ácido cítrico. As principais moléculas de
esteróis presentes são o β-sitosterol, stigmasterol e campesterol (MAGA, 1992). Cita-se ainda a
saponina esteroidal γ-sitosterol, um isômero do β-sitosterol que é conhecido por gerar uma
variedade de atividades biológicas (MCEWAN, 2008).
Outra substância isolada dos rizomas do taro, a fitocistatina, que exibe atividade inibitória da
cisteína protease, revelou forte ação antifúngica, indicando o potencial dessa tarocistatina em se
tornar um agente fungicida (YANG & YEH, 2005; WANG, et al., 2008). Cita-se ainda a presença
de substâncias com atividade antibacteriana em Colocasia esculenta (WEI, et al., 2008, NAIR, et
al., 2005).
Foram identificados, no taro, constituintes considerados antinutricionais, tais como
inibidores de proteases e certos compostos fenólicos, que afetam a digestão das proteínas; inibidores
de amilase e lecitinas que interferem na digestão dos carboidratos; alcalóides que tem ação no
sistema nervoso; oxalato que tem ação irritante para o trato gastrointestinal e pode ocasionar
problemas de cálculo renais; saponinas que são capazes de se ligarem ao colesterol e aos ácidos
biliares; além de fitato e cianogeninas (MCEWAN, 2008). Esses componentes em níveis normais
não são tóxicos, mas contribuem para as propriedades antinutricionais, principalmente no taro não
processado utilizando calor. Não se pode deixar de enfatizar que fatores como espécie, cultivar,
clima, tipo de solo, uso de fertilizantes, maturidade, condições de armazenamento, e outras
5
variáveis, influenciam na composição bruta de qualquer produto agrícola. Assim, rizomas de taro
oriundos de locais diferentes apresentam variações na sua constituição química (MAGA, 1992).
1.2.
Etnofarmacologia
Existem na literatura centenas de relatos sobre os usos medicinais de C. esculenta. No
Brasil, têm-se indicações sobre a utilização do taro, na forma de cataplasma, como antiinflamatório
em processos agudos e crônicos. Cita-se, também, sua ação como energético e depurativo
(CAMPOS, 1993) e no tratamento do reumatismo (BRUNING, 1996). Na comunidade de
Conceição-Açu, Mato Grosso, o taro é considerado um remédio. Para doenças de pele e do tecido
subcutâneo é usado em alergias, prurido e manchas; relacionado às doenças do aparelho circulatório
atua na hipertensão, varizes, hemorróida, malária e hiperuricemia; e para doenças hematológicas e
órgãos hematopoiéticos tem ação na anemia, fraqueza, reumatismo e como depurativo do sangue
(PASA, et al., 2005). No exterior, o taro é base da alimentação de muitos povos. Na Jamaica, por
exemplo, são indicadas atividades medicinais para o taro para as seguintes doenças: asma,
tuberculose e constipação (MITCHELL & AHMAD, 2006). Na Ásia, C. esculenta é considerada
boa para a saúde em geral (PIERONI, et al., 2007). Na Coréia, os usos medicinais do taro incluem
o tratamento de trombose, furúnculos, inflamação, desintoxicação (venenos de cobra e abelha), e
mastite (KIM, et al., 2006). Na China, é indicada para psoríase, queimadura, sudorese noturna,
carbúnculo, úlcera, prolapso uterino e hemorróida (LI, et al., 2006). Na região de Rajasthan, na
Índia, tem-se relatos do seu uso para o crescimento de cabelo, no tratamento de doenças do trato
digestivo, tais como constipação, indigestão, dor abdominal e desinteria; de doenças da pele como
ferimentos, tumores, furúnculos, queimadura de sol e carbúnculo (CHOUDHARY, et al., 2008) e
ainda para fraqueza, tosse e desordens brônquicas (JAIN, et al., 2005).
Cita-se ainda, outros relatos que confirmam os benefícios do taro em desordens digestivas
(MACCAUGHEY, 1917), em alergias a alimentos como cereais, trigo, arroz (DERSTINE &
RADA, 1952; ROTH, et al., 1967), para crianças com baixo desenvolvimento, para recuperação em
pacientes com caquexia e outras condições de perda de massa (GLASER, et al., 1967), para
prevenir inchaço e dor e para reduzir febre (WEI, et al., 2008). Mas, apesar de várias evidências,
ainda são poucos os estudos científicos voltados para a confirmação dos efeitos medicinais de C.
esculenta.
6
1.3.
Atividades biológicas
1.3.1. Efeito hipolipemiante
A espécie Colocasia esculenta, apresenta na sua constituição substâncias com ação
hipolipemiante: fitosteróis, saponinas, ácido linoléico, mucilagem, niacina, ácido oléico, ácido
ascórbico, etc (MCEWAN, 2008; GYLLING, et al, 1995). O conteúdo de fibras solúveis presentes
no taro também contribui para o controle dos níveis de lipídios séricos. A mucilagem isolada dos
rizomas de C. esculenta, arabinogalactana, teve seu efeito hipolipidêmico avaliado. Foi observado
diminuição do colesterol total, da fração VLDL + LDL, triglicerídeos e ApoB (Apolipoproteína B),
a principal apoproteína em VLDL (lipoproteína de muito baixa densidade) e LDL (lipoproteína de
baixa densidade). A dosagem de lipídios a partir dos tecidos hepático e aórtico também apresentou
níveis de colesterol e triglicérides diminuídos e o conteúdo de ácidos biliares e esteróis neutros
fecais aumentaram (BOBAN, et al, 2006).
O tratamento de ratos diabéticos com o extrato etanólico de taro diminuiu o colesterol total
sérico e a glicemia desses animais, quando comparados ao grupo controle normal, demonstrando,
então, seu efeito benéfico tanto na diabete quanto em dislipidemias (GRINDLEY, et al., 2000). Os
constituintes monogalactosildiacilglicerol (MGDG) e digalactosildiacilglicerol (DGDG), presentes
em Colocasia esculenta, causaram inibição da enzima lanosterol sintase, que atua na via
biossintética do colesterol (SAKANO, et al, 2005; TANAKA, et al., 2005). Animais alimentados
com dieta suplementada com taro apresentaram significante redução na concentração de colesterol
hepático total, livre e esterificado, assim como nos níveis de fosfolipídios hepáticos. Esse fato
sugere que dieta a base de taro é recomendada para redução e manutenção de baixas concentrações
lipídicas (IGWE, et al, 2004).
Pessoas que têm o taro como base da alimentação da sua cultura, como ocorre em Nova
Guiné, Oceania, apresentaram níveis séricos de colesterol mais baixos quando comparadas com os
europeus (LUYKEN & JANSEN, 1960). Além do efeito hipolipemiante, o taro atua também na
proteção contra a aterosclerose através de constituintes com ação antioxidante e antiinflamatória.
Constituintes com atividade antioxidante evitam o aparecimento da LDL oxidada que se liga a
macrófagos no endotélio vascular e dá início à formação da placa aterosclerótica. E, a ação
antiinflamatória inibe o processo inflamatório que precede a formação das células espumosas que se
desenvolvem no vaso sanguíneo durante o processo aterosclerótico (POLLAK & KRITCHEVSKY,
1981).
7
1.3.2. Efeito antiinflamatório
Compostos presentes no taro agem em sinergia promovendo uma ação antinflamatória.
Entre eles cita-se fitosteróis e flavonóides, e entre estes as antocianinas. O β-sitosterol apresenta o
benefício da sua propriedade antiinflamatória (BOUIC, 2001; CAMBIE & FERGUSON, 2003). E a
presença de antocianinas no vegetal também está envolvida nesse processo, visto que apresentam
atividade antioxidante e antiinflamatória (SUBARNAS & WAGNER, 2000; OSZMIANSKI, 2001).
O mesmo é observado nos flavonóides-glicosídeos, entre eles o escaftósido, o isoescaftósido, a
orientina, a isoorientina, a vitexina, a isovitexina e a luteolina-7-O-soforosídeo. O grupo catecol
presente no anel B de orientina, isoorientina e luteolina-7-O-soforosídeo apresenta forte atividade
antioxidante (LEONG, et al, 2010).
Em função da atividade antiinflamatória do extrato etanólico das folhas de C. esculenta
houve redução do edema de pata de ratos induzido por carragenina (BIREN, et al 2007). Em testes
de geração de O2 e NO, o extrato clorofórmico de C. esculenta demonstrou ação antioxidativa e
antinitrosativa (MURAKAMI, et al, 2005). E considerando a similaridade de constituição entre
espécies de uma mesma família, outra Araceae, Anthurium cerrocampanense, também apresentou
atividade antiinflamatória nos testes de edema de pata induzido por diferentes agentes flogísticos e
de edema de orelha induzido por óleo de cróton em ratos (SEGURA, et al, 1998).
1.3.3. Efeito anticancerígeno
Dentre os compostos envolvidos na atividade anticâncer de C. esculenta estão incluídos
triterpenos e saponinas esteroidais (BERHOW, et al, 2000; KERWIN, 2004). O β-sitosterol e os
flavonóides também estão envolvidos nessa ação biológica (ROMERO & LICHTENBERGER,
1990; JANEZIC & RAO, 1992; CAMBIE & FERGUSON, 2003). Foi demonstrado que ratos
expostos a agentes carcinogênicos que tiveram sua dieta suplementada com 0,3% de β-sitosterol
apresentaram significativamente menor incidência de desenvolvimento de tumor quando
comparados à ratos com dieta sem β-sitosterol (RAICHT, et al, 1980).
Foi verificado que a fração heptano do extrato das folhas de taro demonstrou forte ação
anticancerígena (BOTTING, et al, 1999). Outra evidência da ação anticâncer do taro envolve as
diferenças de incidência de câncer entre polinésios e europeus. Dados revelaram fortes propriedades
antimutagênicas em várias plantas utilizadas frequentemente como alimento pelos polinésios, entre
elas a C. esculenta (LUO, et al, 2007). A dieta nativa havaiana também tem como base o taro, e
vem sendo associado a isso, a baixa prevalência de câncer intestinal nessa população. Em estudos
8
utilizando pasta de taro, denominada “Poi”, foi observado inibição da proliferação e indução da
apoptose de células intestinais cancerosas. Essa ação ocorreu de forma específica, visto que em
testes com células normais não-cancerosas não foi verificada inibição do crescimento celular, ou
seja, o “Poi” não inibiu a proliferação de todas as células, mas seletivamente inibiu o crescimento
de células cancerosas (BROWN, et al, 2005). Esse efeito é decorrente também do alto conteúdo de
fibra, já que a prevenção do câncer de cólon está associada à dietas ricas em vegetais. O taro possui
uma combinação de substâncias, que em conjunto com os metabólitos de microrganismos
endofíticos, o torna um alimento funcional com características únicas que, ao ser ingerido, mantémse em contato direto com o epitélio intestinal, ao contrário de outras substâncias anticancerígenas
que agem de forma indireta através da circulação sanguínea. A partir disso, constata-se que o
consumo de taro contribui para diminuir a incidência de câncer de intestino por dois principais
mecanismos: indução da apoptose de células de cólon cancerosas e ativação de linfócitos que lisam
células anormais. Além do mais, a relação existente entre inflamação crônica e carcinogênese
sugere que alimentos com atividade antioxidante desempenham importante papel na prevenção do
câncer, sendo esse, então, o caso de C. esculenta (FERGUSON, 1992; KIM, et al, 2002;
MURAKAMI, et al, 2005). É válido citar ainda que Colocasia antiquorum, uma espécie muito
próxima do taro, tem potencial uso como anticancerígeno (NASSR-ALLAH, et al, 2009).
1.3.4. Efeito antidiabético
Ao extrato etanólico de taro foi atribuída propriedade hipoglicêmica decorrente de
diversos mecanismos (GRINDLEY, et al, 2002). O taro apresenta na sua constituição inibidores de
amilases, as α-amilases e as α-glicosidases. As amilases são enzimas de hidrólise de carboidratos.
Com a diminuição da digestão dos carboidratos tem-se a redução da biodisponibilidade da glicose,
caracterizando uma ação antidiabética. Nesse contexto, o taro é um alimento negligenciado, já que
seu consumo beneficia pacientes diabéticos e hipertensos (MCEWAN, 2008). Ratos diabéticos
alimentados com extrato etanólico de taro apresentaram valores próximos de normoglicêmicos,
quando comparados à ratos diabéticos tratados com dieta normal (GRINDLEY, et al, 2001). O taro
conta com outros constituintes com esse potencial, atribuindo-se esse efeito ao β-sitosterol
(IVORRA, et al, 1988).
9
1.3.5. Efeito modulador do sistema imune
Citocinas são importantes compostos orgânicos que atuam na proliferação, diferenciação e
morte celular. Elas são responsáveis pela regulação de proteínas que controlam a sobrevivência, o
crescimento e a função efetora de células teciduais. Algumas plantas possuem substâncias que
mimetizam a função das citocinas na regulação celular, sendo então, considerados compostos com
propriedades citocino-miméticas. Esse processo é decorrente da ligação da citocina no seu receptor
de membrana, que dá início a uma cascata de transdução de sinal até o núcleo celular, levando à
indução da divisão da célula. A propriedade estimulatória do crescimento celular, particularmente
de duas importantes células do sistema imune, sugere que plantas com atividade citocino-mimética
são capazes de aumentar a população de células da imunidade. Entre essas plantas está a Colocasia
esculenta que tem a capacidade de induzir proliferação de células da medula óssea e esplenócitos
(TULIN e ECLEO, 2007).
Além de atuar como mitogênica do sistema imunológico, o taro foi capaz de ativar
linfócitos. A pasta de taro ativou células T, TCD4+ e TCD8+ (BROWN, 2005). Estudos clínicos
sugerem que as saponinas, presentes no taro, atuam como adjuvantes no sistema imune (CHEEKE,
1999), melhorando a resposta à antígenos (BOMFORD, et al; 1992; FRANCIS, et al; 2002).
2. Ensaio de letalidade com Artemia salina
Apesar da comprovada eficiência terapêutica de muitas plantas, os prováveis efeitos tóxicos
que as mesmas podem apresentar quando usadas inadequadamente ainda são desconhecidos ou,
muitas vezes, ignorados. Uma vez que tradicionalmente é disseminado o relato de que o uso de
produtos naturais não é prejudicial à saúde, o cuidado com a utilização desses produtos é
imprescindível e de suma importância no controle dos possíveis efeitos adversos que o uso crônico
e/ou agudo pode acarretar no organismo. Por isso, a toxicidade de plantas medicinais constitui hoje
um problema de saúde pública, sendo um motivo de preocupação crescente nos meios científicos
que envolvem estudos fitoterápicos, pois tem sido comum a ocorrência de adulterações e toxicidade
dos mesmos. Assim, a investigação do potencial tóxico de plantas medicinais pode elucidar
importantes aspectos farmacológicos de seus princípios naturais, permitindo uma utilização segura,
respeitando seus possíveis riscos toxicológicos.
A fim de estabelecer a toxicidade de novos produtos naturais, muitos ensaios podem ser
utilizados, como o ensaio de letalidade com o microcrustáceo Artemia salina, que foi desenvolvido
para detectar compostos bioativos em extratos vegetais (RUIZ et al; 2005). O ensaio de letalidade
10
permite a avaliação da toxicidade aguda e, portanto, é considerado essencial como bioensaio
preliminar no estudo de compostos com potencial atividade biológica. O animal utilizado neste
bioensaio é uma espécie de crustáceo marinho, Artemia salina Leach. (CAVALCANTE et al;
2000).
O ensaio de letalidade com Artemia salina Leach é viável devido à semelhança dos limites
dos efeitos tóxicos produzidos em A.salina com aqueles produzidos no homem, ou seja, com base
na dose por unidade de superfície corporal, os efeitos tóxicos no homem estão consideravelmente
nos mesmos limites que os observados na A.salina, sendo possível descobrir possíveis riscos nos
humanos. A espécie Artemia salina é uma espécie de microcrustáceo marinho da ordem Anostraca.
É considerado um bom indicador devido ao seu reduzido e específico grau de tolerância a um
determinado fator ambiental, de modo que apresente uma resposta nítida em face de pequenas
variações na qualidade do ambiente. A sua utilização tem como vantagem a sua capacidade para
formar cistos dormentes, fornecendo, desse modo, material biológico que pode ser armazenado
durante longos períodos de tempo (superiores a seis meses) sem perda de viabilidade e sem
necessidade de se manter culturas contínuas de organismos-teste, além de ser uma espécie de fácil
manipulação (AMARAL & SILVA, 2008).
3. Atividade Antifúngica
Através de clonagem molecular, foi codificada da espécie C. esculenta uma fitocistatina que
exibiu forte atividade inibitória cisteína protease. Essa tarocistatina, fitocistatina presente no taro,
revelou sua atividade antifúngica por causar um efeito tóxico no crescimento do micélio de fungos
fitopatogênicos tais como Sclerotium rofsii Sacc; e também demonstrou ser capaz de bloquear a
cisteína protease endógena do micélio fúngico. Isso indica que a tarocistatina tem potencial para
desenvolver um agente fungicida (YANG & YEH, 2005).
As infecções hospitalares causadas por fungos tem-se tornado um problema crescente de
saúde publica em muitos países. Segundo o Sistema Nacional de Vigilância das Infecções
Hospitalares dos Estados Unidos, a prevalência de infecções fúngicas passou de 6% em 1980 para
10,4% em 1990. Cerca de 80% dessas infecções foram causadas por leveduras do gênero Candida.
(BECK-SAGUÉ & JARVIS, 1993). Aproximadamente, 200 espécies de Candida são reconhecidas
e cerca de 10% podem causar infecções em seres humanos. Destas, a C. albicans é a espécie mais
frequentemente descrita em casos de infecções hospitalares em vários países. Entretanto, outras
espécies como C. parapsilosis, C. tropicalis e C. glabrata também apresentam altas prevalências.
11
No Brasil, as espécies mais prevalentes são C. albicans, C. parapsilosis e C. tropicalis (MALUCHE
& SANTOS, 2008).
A espécie C. albicans é comum do trato gastrointestinal, genital e cutâneo dos seres
humanos. A espécie C. parapsilosis é encontrada frequentemente na pele, sendo transmitida com
freqüência às crianças e recém-nascidos prematuros internados em unidades de terapia intensiva. Os
fatores de risco associados à sua transmissão são a nutrição parenteral e uso prolongado de
cateteres. A C. tropicalis apresenta uma alta prevalência em casos de candidemia. Considera-se que
50 a 60% dos pacientes colonizados por esta espécie desenvolvam infecções sistêmicas. C. glabrata
representa a quarta causa de infecção hospitalar fúngica por leveduras no Brasil. Esta espécie está
associada tanto a casos de candidemia em pacientes mais idosos quanto em casos de candidúria.
Além disso, esta espécie desenvolve resistência a terapêutica pelo fluconazol com freqüência. As
candidíases são infecções oportunistas e acometem com frequência pacientes com o sistema
imunológico comprometido, pacientes neutropênicos, aidéticos, diabéticos e em casos de câncer e
doenças hematológicas (LIMA et al; 2006; MALUCHE & SANTOS, 2008). Avaliar a ação
antifúngica do extrato de C. esculenta sobre esses patógenos auxiliará na busca por novos
tratamentos, já que é crescente o desenvolvimento de resistência pelos agentes terapêuticos
existentes.
Não existe um consenso sobre o nível de inibição aceitável para produtos naturais quando
comparados com antibióticos padrões, tanto que há relatos na literatura que consideram somente
resultados similares aos de antibióticos, enquanto outros consideram com bom potencial mesmo
aqueles com níveis de inibições inferiores. ALIGIANIS et al. (2001) propuseram uma classificação
para materiais vegetais com base nos resultados de MIC (concentração inibitória mínima),
considerando: forte inibição – MIC até 500 µg/mL; inibição moderada – MIC entre 600 e 1500
µg/mL e como fraca inibição - MIC acima de 1600 µg/mL. Já no trabalho de MAGINA et al.
(2007), foram considerados ativos, os extratos com MIC menor que 1000 µg/mL, e, muito ativos os
extratos com MIC inferior a 100 µg/mL.
4. Hipercolesterolemia
O fato de coelhos serem sensíveis a dietas ricas em colesterol e acumularem grandes
quantidades no plasma faz com que a utilização destes animais como modelo experimental para
avaliar o desenvolvimento de hipercolesterolemia e aterosclerose seja de grande relevância,
trazendo informação sobre fatores que contribuem para progressão e regressão aplicadas a situações
humanas (DORNAS et al; 2010). Para induzir hipercolesterolemia em animais têm-se utilizado
12
dietas contendo colesterol, as quais variam de rações comerciais suplementadas com níveis
substancialmente diferentes de colesterol, assim como modificações nas porções de lipídio e
carboidrato e nas diferentes fontes e conteúdos de gordura, contendo ou não ácido cólico
(LICHTMAN et al; 1999). Coelhos com 1% de suplementação de colesterol na dieta por 8-10
semanas apresentam prejudicada vasodilatação do endotélio na artéria carótida e anormalidades na
síntese do óxido nítrico (NO) demonstradas em vasos ateroscleróticos. Considerando a
hiperlipidemia e aterosclerose, os segmentos aórticos de coelhos hipercolesterolêmicos mostram
redução significante de óxido nítrico sintase (NOS) endotelial em relação aos animais controle
(KAWASHIMA & YOKOYAMA, 2004; JIMÉNEZ et al; 2001).
O aumento de óxido nítrico basal e de vasodilatadores derivados do endotélio é visto em
maior quantidade em anéis aórticos do endotélio de coelhos do sexo feminino do que em machos e
depende da concentração de estradiol circulante; portanto, fêmeas são menos inclinadas à dieta para
indução de lesões ateroscleróticas do que machos, mas dependem do estado do endotélio arterial.
Estradiol inibe a adesão de monócitos sobre células endoteliais com migração transendotelial,
componentes de uma resposta inflamatória que ocorre continuamente através do processo
aterogênico após hipercolesterolemia induzida em coelhos (HOLM et al; 1998; NATHAN et al;
1999). O coelho é uma espécie animal que tem vários aspectos similares aos dos humanos em
relação ao metabolismo de lipoproteínas, exceto pela deficiência de lipase hepática. Várias
características dos coelhos fazem deles um excelente modelo para avaliar os efeitos dos transgenes
humanos sobre metabolismo de lipoproteínas e susceptibilidade para aterosclerose: 1) lipoproteínas
contendo ApoB são similares àquelas vistas em humanos; 2) fígado de coelhos produzem VLDL
contendo ApoB-100, como em humanos; 3) abundância de proteína de transferência de ésteres no
plasma de coelhos (CHAPMAN, 1980; NAGASHIMA et al; 1988; GREEVE et al; 1993).
Pelo menos 4 mecanismos são responsáveis pela homeostase do colesterol e afetam as
concentrações de colesterol plasmático:
• Síntese através do acetato como regulador pela formação de ácido mevalônico para 3hidroxi-3-metilglutaril coenzima A que é catalisada pela enzima taxa limitante HMG-CoA
redutase;
• Expressão de receptores LDL, especialmente no fígado, onde mais da metade dos
receptores estão localizados, com diminuição do colesterol plasmático acompanhado pela
redução dos níveis de LDL;
• Consumo dietético de colesterol;
• Transformação do colesterol em ácido biliar, a maior via catabólica para colesterol que,
13
regulada pela formação da 7 α-hidroxicolesterol, é catalisada pela enzima 7α-hidroxilase
(DORNAS et al, 2010).
Em coelhos, a atividade da 7α-hidroxilase e níveis de mRNA são inibidos após dieta
hipercolesterolêmica com níveis de colesterol plasmático substancialmente elevados. Entretanto,
alimentando coelhos com 0,1% de suplementação de colesterol por 7 meses, estes não produziram
hipercolesterolemia, ao passo que aumentando gradualmente o consumo de colesterol dietético,
aumentou-se o tamanho do pool de ácidos biliares inversamente à atividade da 7α-hidroxilase
(OVERTURF et al; 1989).
A excreção de ácidos biliares aumenta a taxa do clearance, o qual diminui a concentração
efetiva do colesterol intracelular, impedindo que o colesterol exerça influência sobre a expressão do
receptor de LDL, já que os ácidos biliares são predominantemente reabsorvidos pela circulação
êntero-hepática e retornam ao fígado para exercer controle de retroalimentação negativa sobre a
enzima 7α-hidroxilase e para regular o metabolismo do colesterol (POORMAN et al; 1993). Ácidos
biliares são conhecidos por serem reabsorvidos no intestino por mecanismos passivos e ativos.
Passivamente, o consumo ocorre via não iônica, iônica e difusão de micelas conjugadas ou não
conjugadas a ácidos biliares e, ativamente, a absorção saturável ocorre via Na+ dependente de
ácidos biliares conjugados contra o gradiente de concentração. Várias espécies, incluindo coelhos,
demostram possuir ambos os processos de reabsorção de ácidos biliares. E, no entanto, devido à
natureza hidrofílica relativa de ácidos biliares conjugados eles sofrem uma reabsorção intestinal
passiva mínima. O sítio primário de reabsorção de ácido biliar predominantemente é mediado por
co-transportador ácido biliar Na+/bile ileal (ABST) e, a interrupção da circulação êntero-hepática
dos ácidos biliares pela atenuação da reabsorção de ácidos biliares intestinais é considerada uma das
melhores vias de redução dos níveis de colesterol plasmático. Foi demonstrado com inibidor de
ABST redução das quantidades de retorno de ácido biliar para o fígado e aumento da conversão de
colesterol para ácido biliar em coelhos alimentados com colesterol (HIGAKI et al; 1998). O efeito
inibitório do colesterol dietético sobre 7α-hidroxilase em coelhos pode ajudar a explicar porque
alguns indivíduos são mais sensíveis ao colesterol na dieta e aumentam as concentrações
plasmáticas. Esses indivíduos podem responder a dieta hipercolesterolêmica com diminuída síntese
de ácido biliar contribuindo para elevar os níveis de colesterol plasmáticos e reduzir os receptores
de LDL. Alternativamente, outras pessoas respondem para dieta rica em colesterol com a síntese de
ácido biliar sendo estimulada e, assim, os níveis de colesterol plasmáticos não aumentam.
Identificando esses indivíduos, pode-se ajudar a esclarecer seu risco aterogênico e, assim, usar
recomendações dietéticas mais sensíveis para o tratamento (DORNAS et al; 2010).
14
Nesse sentido, o coelho como modelo experimental é uma importante ferramenta para o
estudo da hipercolesterolemia e aterosclerose. Representa, dentre outros animais estudados, como o
rato, o único que tem tendência para exibir hipercolesterolemia pela acumulação de colesterol
exógeno com poucos dias de altas concentrações na dieta, já que não pode aumentar a excreção de
esteróis. No entanto, cuidadosas extrapolações devem ser realizadas em relação ao grau de
hipercolesterolemia produzido em animais de laboratório, uma vez que excedem o que usualmente
encontramos em humanos (DORNAS et al; 2010).
Diante do quadro hipercolesterolêmico é crescente o interesse em se obter tratamentos
alternativos e/ou complementares e, dentro do reino vegetal, existe um grande potencial para
alcançar esse fim. Os quatro grandes grupos de compostos bioativos presentes nas plantas:
substâncias nitrogenadas, terpênicas, fenólicas e compostos com enxofre, são fitoquímicos muito
importantes para a saúde humana. Especificamente, na prevenção de problemas cardiovasculares e
cerebrovasculares esses fitoquímicos atuam nos seguintes processos: (MARTÍNEZ-NAVARRETE
et al; 2008)
•
modificação oxidativa do LDL e seu papel na aterogenia;
•
atenuação dos processos inflamatórios na aterosclerose;
•
redução da trombose;
•
promoção da função normal do endotélio;
•
bloqueio da expressão de moléculas que controlam a adesão celular e
•
aumento da capacidade antioxidante do plasma e reatividade das plaquetas.
Estudos demonstraram que alguns polissacarídeos possuem efeito hipolipemiante,
principalmente os glicoconjugados, moléculas abundantes do taro, em que uma proteína carreia uma
ou mais cadeias de carboidratos ligados covalentemente ao esqueleto polipeptídico usualmente via
ligações N- ou O-. Além do efeito de diminuir o colesterol total plasmático, triglicerídeos, LDL e
aumentar HDL (lipoproteína de baixa densidade), esses polissacarídeos também contribuem para a
inibição da aterosclerose (NIE & XIE, 2011). A arabinogalactana é uma mucilagem presente nos
tubérculos de C. esculenta com potencial para diminuir o nível de colesterol sérico e tissular. Ratos
normocolesterolêmicos alimentados com mucilagem extraída do taro não apresentaram diferença
estatisticamente significativa quanto ao ganho de massa corporal, níveis de AST (Aspartato
aminotransferase, também chamada TGO: Transaminase glutâmico-oxalacética), ALT (Alanina
aminotransferase, também chamada TGP: Transaminase glutâmico-pirúvica), proteína total e razão
albumina:globulina quando comparados ao grupo controle. Porém, em relação ao perfil lipídico
sérico observou-se diminuição do colesterol total, dos triglicerídeos, da fração VLDL+LDL e da
15
ApoB (principal apoproteína presente em VLDL e LDL) e aumento da fração HDL/VLDL+LDL.
Quanto aos lipídios teciduais também observou-se ação hipolipemiante no fígado e na aorta.
Verificou-se que a excreção de ácidos biliares e esteróis fecais aumentaram em relação ao grupo
controle. A diminuição da síntese e secreção de ApoB no fígado desses animais indica redução da
síntese e secreção de partículas de VLDL (BOBAN et al; 2006).
O tratamento de ratos diabéticos com o extrato etanólico de taro diminui o colesterol total
sérico e a glicemia desses animais quando comparados ao grupo controle normal, demonstrando,
então, seu efeito benéfico tanto na diabetes melitus quanto em dislipidemias (GRINDLEY, et al;
2000). Animais alimentados com dieta suplementada com taro apresentaram significante redução na
concentração de colesterol hepático total, livre e esterificado, assim como nos níveis de
fosfolipídios hepáticos. Esse fato sugere que dieta à base de taro é recomendada para redução e
manutenção de baixas concentrações lipídicas (IGWE, et al; 2004).
Além disso, Colocasia esculenta, apresenta na sua constituição outras substâncias com ação
hipolipemiante: fitosteróis, saponinas, ácido linoléico, mucilagem, niacina, ácido oléico, ácido
ascórbico, etc. Os fitosteróis presentes no taro, entre eles o β-sitosterol, desempenham funções
estruturais análogas ao colesterol e reduzem a colesterolemia por diferentes mecanismos
(MCEWAN, 2008; GYLLING, et al; 1995). Relatos sugerem que os níveis de colesterol total e
LDL em animais e humanos diminuem após o consumo de fitosteróis ricos em β-sitosterol
(POLLAK & KRITCHEVSKY, 1981; PELLETIER, et al; 1995; MOGHADASIAN, et al; 1997;
JONES, et al; 1997). Foi demonstrado em animais e em humanos que as saponinas têm efeito
hipolipemiante por formarem complexos com o colesterol e sais biliares diminuindo, então, a
absorção e reabsorção, respectivamente, dessas moléculas (OAKENFULL & SIDHN, 1990;
MATSUURA, 2001; JONES, et al; 1997).
Diferentes mecanismos, que podem agir em conjunto e/ou em sinergia, têm sido sugeridos
para explicar a ação hipolipemiante de fibras solúveis, entre eles:
• Diminuição da reabsorção de ácidos biliares,
• Interferência com o metabolismo lipídico pelo SCFA (produto fermentado da
mucilagem) produzido no cólon pela fermentação microbiana,
• Redução de VLDL, LDL e ApoB associada a essas lipoproteínas plasmáticas,
• Aumento da excreção de colesterol e ácidos biliares nas fezes e
• Diminuição da absorção de colesterol da dieta.
Os fármacos mais utilizados para tratar a hipercolesterolemia, as estatinas, são inibidores de
uma enzima da via biossintética do colesterol (Figura 2), a HMG-CoA redutase.
16
Figura 2: Esquema da via biossintética do colesterol.
A administração em longo prazo desses fármacos está relacionada ao surgimento de efeitos
indesejáveis relacionados à diminuição da produção de metabólitos isoprenóides não-esteroidais
fisiologicamente essenciais, tais como: dolicol, geranil difosfato (GPP) e farnesil difosfato (FPP). A
enzima lanosterol sintase também faz parte da biossíntese do colesterol e se encontra mais no fim da
via, assim um fármaco que atue na sua inibição promoveria menor possibilidade de
desenvolvimento de efeitos colaterais. Em um estudo de inibição da enzima lanosterol sintase foram
testados os extratos etanólicos de 130 amostras de vegetais e a espécie C. esculenta foi a que
demonstrou o maior efeito inibitório chegando a 55% de inibição dessa enzima, com variação entre
cultivares.
Os
constituintes
de
C.
esculenta
identificados
como
ativos
foram
Monogalactosildiacilgliceróis (MGDGs) e Digalactosildiacilgliceróis (DGDGs) (Figura 3).
MGDGs e DGDGs são menos potentes que inibidores conhecidos como laurildimetilamina N-óxido
(LDAO) e lanofilinas, mas não os exclui de se tornarem agentes na prevenção e tratamento auxiliar
da
17
hipercolesterolemia.
Figura 3: Constituintes de C. esculenta: MGDG e DGDG. Fonte: SAKANO et al. (2005).
A capacidade do extrato de taro em inibir a enzima lanosterol sintase sugere que a espécie C.
esculenta tem uma potencial habilidade para reduzir o nível de colesterol sanguíneo. Em
conformidade com isso, estudos relataram que pessoas em Nova Guiné, que têm o taro como base
da sua alimentação possuem o nível de colesterol sérico mais baixo que os europeus e ainda, ratos
alimentados com dieta rica em colesterol suplementada com tubéculos cozidos de taro apresentaram
redução dos níveis séricos de colesterol e triglicerídeos (SAKANO et al; 2005) (TANAKA, et al;
2005).
Além do efeito hipolipemiante, o taro atua também na proteção contra a aterosclerose
através de constituintes com ação antioxidante e antiinflamatória presentes, entre eles os fitosteróis
e flavonídes. Compostos com atividade antioxidante evitam o aparecimento da LDL oxidada que se
liga a macrófagos no endotélio vascular e dá início à formação da placa aterosclerótica. E,
constituintes com atividade antiinflamatória inibem o processo inflamatório que precede a formação
das células espumosas que se desenvolvem no vaso sanguíneo durante o processo aterosclerótico
(POLLAK & KRITCHEVSKY, 1981). Observa-se que existem diversos mecanismos pelos quais o
taro pode agir como hipolipemiante, sendo que estes podem atuar em conjunto e/ou sinergia.
18
OBJETIVOS
a) A partir dos rizomas-filhos de Colocasia esculenta, objetiva-se obter a tintura e o extrato de
taro.
b) Avaliar a ação do extrato de taro no ensaio de letalidade com Artemia salina Leach.
c) Avaliar a ação do extrato de Colocasia esculenta em ensaio antifúngico.
d) Avaliar a ação da tintura de taro na hipercolesterolemia in vivo.
1. Objetivos específicos
•
Preparar a matéria-prima vegetal
•
Produzir a tintura de taro para ser usada no teste da hipercolesterolemia
•
Determinar o resíduo seco da tintura de taro
•
Obter o extrato seco de Colocasia esculenta para ser usado nos testes de letalidade e
antifúngico
•
Avaliar a toxicidade aguda do taro frente ao teste de letalidade com Artemia salina
•
Avaliar a concentração inibitória mínima (MIC) do extrato de taro no teste antifúngico
de microdiluição em caldo sobre quatro espécies de Candida.
•
Induzir hipercolesterolemia e tratar os animais com 3 doses diferentes da tintura de taro.
•
Cálculo de doses da tintura de taro para o teste da hipercolesterolemia
•
Analisar os parâmetros bioquímicos sanguíneos dos animais para verificar a eficácia do
tratamento com a tintura de taro na hipercolesterolemia.
•
Acompanhar o peso dos animais no teste de hipercolesterolemia.
•
Verificar o aspecto macroscópico do fígado dos animais ao final do experimento de
hipercolesterolemia.
MATERIAL E MÉTODOS
1. Material vegetal
Foram utilizados rizomas-filhos de taro [(Colocasia esculenta (L.) Schott)], variedade
Japonês (BGH - Banco de Germoplasma de Hortaliças - 5925), obtidos de cultivo realizado em
sistema orgânico, na Horta de Pesquisas do Departamento de Fitotecnia da Universidade Federal de
19
Viçosa, em Viçosa, MG, durante o período de 10/09/2009 a 10/06/2010. O solo utilizado para o
cultivo é classificado como Argissolo Vermelho-Amarelo, textura argilosa, e apresentou os
seguintes resultados após as análises químicas: pH em H2O = 6,3; P = 90,7 e K = 90,0 mg/dm3;
Ca2+ = 5,3, Mg2+ = 0,9, Al3+ = 0,0, H + Al = 4,13, SB = 6,43, CTC(t) = 6,43 e CTC (T) = 10,56
cmolc/dm3; V = 61 e m = 0,0 %; MO = 3,7 dag/kg; Zn = 12,8, Fe = 59,4, Mn = 235,4, Cu = 3,5 e B
= 1,3 mg/dm3. O plantio foi realizado em sulcos espaçados de 1,0 m e as plantas a cada 0,30 m
dentro da linha, com população de 33.333 plantas/ha. Não foi realizado nenhum tipo de adubação,
nem aplicação de defensivos agrícolas. As capinas, em número de seis ao longo do ciclo, foram
realizadas manualmente, com auxílio de enxada, de acordo com o surgimento das plantas invasoras.
Foram realizadas irrigações semanais, por aspersão, de maneira a fornecer lâmina de água de 40
mm/semana. As irrigações foram suspensas 25 dias antes da colheita. Nove meses após o plantio, a
colheita foi realizada manualmente, com auxílio de enxadão, estando as plantas amadurecidas, ou
seja, com 90 % das folhas senescentes.
2. Preparo do vegetal
Após a aquisição do vegetal, foi realizada a triagem e limpeza dos rizomas de C. esculenta
com descarte daqueles com sinal de deterioração. Aqueles selecionados foram descascados,
lavados, fatiados e colocados em estufa com circulação forçada de ar, à 40°C, até peso constante,
para secagem. Posteriormente, esse material foi triturado em moinho de facas obtendo-se, então, a
droga vegetal pulverizada.
2.1.
Obtenção da tintura de taro
Tintura é uma preparação líquida, resultante da ação dissolvente e/ou extrativa de um
solvente sobre uma determinada droga, animal ou vegetal, considerada uma forma farmacêutica
básica.
A tintura de taro foi preparada por maceração segundo o procedimento descrito na
FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 2° Ed, 1959. A droga pulverizada foi macerada em álcool etílico
de cereais, 93,8°INPM, lote 035-01-10, de origem nacional, fabricado pela AGRO INDL.
TARUMÃ, na proporção de 1:5, durante 8 dias com agitação freqüente. Após filtração, a tintura foi
acondicionada em recipiente bem fechado ao abrigo da luz e do calor.
20
2.2.
Resíduo seco da tintura de taro
O resíduo seco é uma característica específica das tinturas, ou seja, cada tintura possui um
valor diferente de resíduo seco. Para a determinação do resíduo seco, partiu-se de um peso fixo da
tintura, 10,043g, colocada em recipiente tarado, a 100-105°C, para evaporação do solvente, até peso
constante (PRISTA et al; 1979).
2.3.
Obtenção do extrato de taro
Como a tintura é obtida através de um processo de extração, a evaporação do solvente
fornece o extrato seco do vegetal. Assim, o extrato seco do taro foi obtido pela evaporação do
álcool etílico em rotavapor.
3. Ensaio de letalidade com Artemia salina Leach
O ensaio foi realizado segundo o procedimento descrito na literatura por Meyer et al. (1982).
20 mg do extrato de taro foi dissolvido em 2 mL de álcool etílico e dessa solução, amostras de 5,
50, 250 e 500 µL foram transferidas, em triplicata, para frascos de 5 mL. Após a remoção total do
solvente, 5 mL de solução salina 0,38 g/L, foi adicionada em cada um dos frascos, resultando em
soluções do extrato de taro com as seguintes concentrações finais: 10, 100, 500 e 1000 µg/mL,
respectivamente. Larvas de A. salina (10/frasco) foram adicionadas e após 24 h de contato, os
sobreviventes foram contados.
Para a preparação das larvas, os cistos de A. salina foram incubados em um pequeno aquário
contendo a solução salina pH 9,0 (10mg de cistos/100mL de solução). Foi mantida uma iluminação
artificial de 28ºC e o estado de saturação de oxigênio foi conseguido com auxílio de uma bomba.
Após 24 horas, as larvas (náuplio) foram filtradas e recolocadas no aquário, mantendo-as em
incubação por mais 24 horas, nas mesmas condições de luz e de calor mencionados. Após essas
incubações, as larvas atingiram o estágio de metanáuplio do microcrustáceo, que é mais sensível ao
tratamento.
Assim, o bioensaio envolvendo Artemia salina consistiu em distribuir dez larvas em cada
placa de cultura na presença de concentrações graduais do extrato de taro em triplicata. A análise
foi feita comparativamente ao controle positivo e negativo, após 24h e 48h de incubação no escuro.
Foram consideradas larvas mortas todas que não apresentavam qualquer movimento ativo em cerca
de vinte segundos de observação. O resultado foi avaliado a partir da quantidade de larvas mortas:
21
morte inferior a 50%, próximo a 50% e superior a 50%, e ainda, um controle que continha apenas as
larvas e a solução salina (controle negativo) e o controle positivo, com as larvas e lapachol, que é
uma substância conhecidamente tóxica a A. salina.
4. Teste antifúngico de microdiluição em caldo
O teste antifúngico foi realizado segundo o método de microdiluição em caldo preconizado
pelo CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), documento M27-A29. A metodologia para
esse teste é dividida em quatro etapas:
1) Preparo das diluições do extrato de taro;
2) Preparo das diluições dos fármacos (Cetoconazol e Fluconazol);
3) Preparo dos inóculos: 4 espécies de Candida (C. Albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis,
C. krusei);
4) Plaqueamento.
Na etapa 1, 12,0 mg do extrato foram diluídas em 6,0 mL de DMSO (dimetilsulfóxido),
resultando em uma solução com concentração 2000 µg/mL. Dessa solução, retirou-se uma alíquota
de 5,12 mL e adicionou-se 4,88 mL do meio de cultura RPMI (Roswell Park Memorial Institute),
obtendo-se, então, um preparado de 10 mL na concentração de 1024 µg/mL. Esse preparado
representa o tubo inicial para as diluições. Em seguida, foram feitas diluições sucessivas a fim de se
obter as seguintes concentrações: 512,0; 256,0; 128,0; 64,0; 32,0; 16,0; 8,0; 4,0; 2,0 e 1,0 µg/mL.
Para isso, utilizou-se dez tubos de ensaio, cada um contendo 5 mL de meio RPMI, transferiu-se 5
mL do tubo inicial para o tubo 1 obtendo-se 10 ml de preparado na concentração 512 µg/mL, o
procedimento foi repetido, seqüencialmente, até completar as dez diluições diferentes, conforme
esquema abaixo:
5
mL
5
mL
1
Tubo inicial:
solução do
extrato de
Taro em
meio RPMI
1024 µg/mL
512 μg/mL
5
mL
5
mL
2
3
256 μg/mL
128 μg/mL
...
4
64 μg/mL
10
1 μg/mL
Figura 4: Esquema de diluição do extrato de taro.
22
Na etapa 2, para as diluições dos fármacos padrões, procedeu-se igualmente às diluições do
extrato, porém, as concentrações obtidas foram diferentes. Para o fluconazol obteve-se as seguintes
concentrações: 64 µg/mL, 32 µg/mL, 16 µg/mL, 8µg/mL, 4µg/mL, 2 µg/mL, 1 µg/mL, 0,5 µg/mL,
0,25 µg/mL, 0,125 µg/mL. E para o cetoconazol: 32 µg/mL, 16 µg/mL, 8µg/mL, 4µg/mL, 2 µg/mL,
1 µg/mL, 0,5 µg/mL, 0,25 µg/mL, 0,125 µg/mL, 0,0625 µg/mL.
Na etapa 3, 24 horas antes do plaqueamento, os inóculos foram semeados em um tubo
separado. Após o crescimento das colônias, em tubos de ensaio contendo 5 mL de salina, diluiu-se
cada inoculo, separadamente, a fim de se obter uma concentração de 103 células, segundo a Escala
Mcfarland de turvação. Uma alíquota dessa suspensão de células foi diluída em DMSO, formando
um preparado na proporção de 1:1000.
Na etapa 4, o plaqueamento iniciou-se da menor para a maior concentração para minimizar
erros analíticos. Foram feitos dois testes cada um em duplicata, uma placa comparando extrato/
Fluconazol e a outra extrato/ Cetoconazol. Primeiramente, colocou-se o controle negativo que é
formado apenas de 200 µL de RPMI; e depois o controle positivo, composto por 100 µL de RPMI +
100 µL de inóculo. Feito isso, seguiu-se o plaqueamento do extrato, seguido pelo plaqueamento do
fármaco e, por fim, do inóculo. Segue abaixo o esquema da placa:
23
-
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
-
C. Albicans +
A
extrato
C. tropicalis +
B
extrato
C. parapsilosis +
C
extrato
C.
krusei
+
D
C. Albicans +
E
extrato
fármaco
C. tropicalis +
F
fármaco
C. parapsilosis +
G
fármaco
C.
krusei
+
H
fármaco
-
C-
C+
Teste do extrato de taro
C+ Controle positivo
Teste do antifúngico padrão (cetoconazol/fluconazol)
C-
-
Controle negativo
Figura 5: Esquema do plaqueamento para teste antifúngico.
A placa foi mantida em estufa aquecida a 28 °C e a leitura dos resultados foi realizada após
2 dias. A ausência de turvação do meio foi considerada como resultado positivo, ou seja, ocorreu
inibição do crescimento fúngico, e a MIC foi definida como a menor concentração com ação
antifúngica. Como resultado negativo considerou-se a ocorrência de turvação do meio.
5. Hipercolesterolemia in vivo
Utilizou-se 36 coelhos machos da raça Nova Zelândia com idade de 55 dias e peso médio de
2,3 Kg. Os animais foram fornecidos pelo setor de Cunicultura do Departamento de Zootecnia da
Universidade Federal de Viçosa. Durante o experimento, eles foram mantidos na área experimental
24
do Laboratório de Biofármacos da UFV, em gaiolas individuais, com temperatura na faixa de 22 a
24ºC e fotoperíodo de 12 horas. Os animais passaram por um período de adaptação de sete dias e
após esse período o experimento teve duração de 28 dias. Diariamente e concomitantemente, foram
alimentados com 120 g de ração e água ad libitum, sofreram indução de hipercolesterolemia pelo
suplemento de 1% (1,2 g) de colesterol (Vetec®) na dieta e foram tratados com tintura de taro 20%
e o fármaco referência Sinvastatina.
Os coelhos foram pesados no início, após 15 dias e ao final do experimento para avaliar o
ganho de massa corporal. Passados os 28 dias 12h e o sangue obtido pela punção cardíaca foi
submetido à análise bioquímica dos seguintes parâmetros: Colesterol total, frações HDL, LDL,
VLDL e triglicérides para verificar a eficácia do tratamento sobre o perfil lipídico sérico; glicose ,
foram sacrificados. Após a administração dos anestésicos Xilazina (5 mg/kg) e Cetamina (20
mg/kg) por via intramuscular, foi feita a exanguinação (punção cardíaca) e coletou-se o fígado para
análise macroscópica. Antes da eutanásia, os animais foram submetidos a jejum de para avaliar o
perfil glicêmico; uréia e creatinina para ver possíveis influências na função renal; e ALT, AST,
fosfatase alcalina, gama-GT, albumina e proteínas totais para analisar a função hepática. Foram
utilizados Kits reagentes Bioclin – Quibasa e equipamento multiparamétrico – Alizé (Analisador
Automático de Bioquímica). Para a análise da glicose o sangue foi coletado em tubo com fluoreto e
para as demais análises foi utilizado sangue heparinizado.
Diluição e cálculo das doses da tintura de taro
Devido ao alto teor alcoólico das tinturas, para sua utilização, deve-se fazer uma diluição.
Assim, a partir da mistura de tintura de taro/água filtrada na proporção de 20:80 obteve-se a tintura
de taro a 20%.
A concentração das doses da tintura de taro 20% foi calculada a partir do valor do resíduo
seco: 0,49%. Assim têm-se os seguintes valores expressos em miligrama de resíduo vegetal por
mililitro de tintura.
• Dose I (2 mL): 1,9 mg/mL
• Dose II (5 mL): 4,9 mg/mL
• Dose III (10 mL): 9,8 mg/mL
25
Delineamento experimental - Seis grupos com seis animais por grupo.
• G1 – controle normal
o dieta normal (apenas ração)
• G2 – controle doente não tratado
o dieta com colesterol 1% (ração suplementada com colesterol)
• G3 – doente tratado dose I
o dieta com colesterol 1% e 2 mL de tintura de taro 20%
• G4 – doente tratado dose II
o dieta com colesterol 1% e 5 mL de tintura de taro 20%
• G5 – doente tratado dose III
o dieta com colesterol 1% e 10 mL de tintura de taro 20%
• G6 – doente tratado fármaco padrão
o dieta com colesterol 1% e Sinvastatina 20 mg
Análise estatística
O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso, com seis grupos e seis repetições.
Os dados foram apresentados como média ± desvio padrão, com n ≥ 6 para cada grupo
experimental. Os resultados foram submetidos à análise de variância (one-way ANOVA) seguida
do teste de Dunnet, para análise dos grupos testes em relação ao grupo controle e Teste de Tukey
para análise dos grupos entre si. Para todas as análises foi utilizado intervalo de confiança de 95%,
com p ≤ 0,05. O programa utilizado para realizar as análises estatísticas foi o SAEG 9.1.
Aspectos éticos
O presente projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade
Federal de Juiz de Fora.
26
RESULTADOS
1. Tintura e extrato de taro
A tintura produzida caracterizou-se como um líquido límpido, amarelo claro, com cheiro e
sabor fortes. O resíduo seco é 0,49% e representa uma característica específica da tintura de taro.
2. Ensaio de letalidade com Artemia salina Leach
As tabelas abaixo mostram os resultados obtidos.
Tabela 1: Toxicidade do extrato de taro frente a A. salina
EXTRATO DE TARO
LARVAS VIVAS
LARVAS MORTAS
TOTAL
10 µg/mL
10
-
10
10 µg/mL
10
-
10
10 µg/mL
10
-
10
100 µg/mL
9
1
10
100 µg/mL
10
-
10
100 µg/mL
10
-
10
500 µg/mL
7
3
10
500 µg/mL
8
2
10
500 µg/mL
10
-
10
1000 µg/mL
7
3
10
1000 µg/mL
10
-
10
1000 µg/mL
10
-
10
27
Tabela 2: Controle positivo do teste de toxicidade
LAPACHOL
LARVAS VIVAS
LARVAS MORTAS
TOTAL
10 µg/mL
10
-
10
10 µg/mL
7
3
10
10 µg/mL
9
1
10
100 µg/mL
3
7
10
100 µg/mL
1
9
10
100 µg/mL
1
9
10
500 µg/mL
-
10
10
500 µg/mL
-
10
10
500 µg/mL
-
10
10
1000 µg/mL
-
10
10
1000 µg/mL
-
10
10
1000 µg/mL
-
10
10
Tabela 3: Controle negativo do teste de toxicidade
SALINA
LARVAS VIVAS
LARVAS MORTAS
TOTAL
0,38 g/L
10
-
10
0,38 g/L
10
-
10
0,38 g/L
10
-
10
De acordo com os dados obtidos, observou-se que na concentração de 10 µg/mL o extrato de
taro não foi letal, quando em 100 µg/mL ocorreu a morte de 3,3% e nas dosagens de 500 e 1000
µg/mL, 16,6% e 10,0% das larvas morreram, respectivamente (Tabela 1). Assim, o extrato de taro
provocou morte inferior a 50%. Em comparação com os dados obtidos no controle positivo (Tabela
2), o extrato de taro apresentou baixa toxicidade, pois com a utilização do lapachol, substância
conhecidamente tóxica, a letalidade foi de 13,3% na concentração de 10 µg/mL, 83,3% em 100
µg/mL e nas concentrações de 500 e 1000 µg/mL ocorreu morte de 100,0%. O controle negativo,
onde há apenas salina, indica que não há interferência do meio no desenvolvimento das larvas, já
que não houve nenhuma larva morta.
28
3. Teste antifúngico de microdiluição em caldo
As tabelas e fotos abaixo demonstram os resultados obtidos no teste antifúngico.
Tabela 4: Resultado do teste antifúngico do extrato de taro e do fármaco Fluconazol
Poço
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
512
256
128
64
32
16
8
4
2
1
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
nc
nc
nc
c
c
c
c
c
c
c
c
c
nc
nc
nc
c
c
c
c
c
c
c
c
c
nc
nc
nc
c
c
c
c
c
c
c
c
c
nc
nc
nc
c
c
c
c
c
c
c
c
c
32
16
8
4
2
1
0,5
0,25
0,125
0,0625
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
c
c
c
c
nc
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
c
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
c
c
c
c
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
c
c
c
c
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
C C. Albicans
+ extrato
C. tropicalis
+ extrato
C. parapsilosis
+ extrato
C. krusei
+ extrato
CC. Albicans
+ Fluconazol
C. tropicalis
+ Fluconazol
C. parapsilosis
+ Fluconazol
C. krusei
+ Fluconazol
Poço
12
C+
C - : controle negativo; C + : controle positivo; nc: não houve crescimento fúngico; c: houve
crescimento fúngico
29
C+
Figura 6: Placa multipoço com o teste antifúngico do extrato de taro em relação ao fármaco
Fluconazol. Poços brancos: turvação/Poços límpidos: ausência de turvação.
Tabela 5: Resultado do teste antifúngico do extrato de taro e do fármaco Cetoconazol
Poço
Teste Extrato
e Fluconazol
C. Albicans
+ extrato
C. tropicalis
+ extrato
C. parapsilosis
+ extrato
C. krusei
+ extrato
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
512
256
128
64
32
16
8
4
2
1
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
nc
nc
nc
c
c
c
c
c
c
c
c
c
nc
nc
nc
c
c
c
c
c
c
c
c
c
nc
nc
nc
c
c
c
c
c
c
c
c
c
nc
nc
nc
c
c
c
c
c
c
c
c
c
64
32
16
8
4
2
1
0,5
0,25
0,125
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
µg/mL
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
c
nc
nc
nc
nc
c
c
c
c
c
c
c
c
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
c
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
nc
c
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
C -
CC. Albicans
+ Cetoconazol
C. tropicalis
+ Cetoconazol
C. parapsilosis
+ Cetoconazol
C. krusei
+ Cetoconazol
Poço
12
C+
C - : controle negativo; C + : controle positivo; nc: não houve crescimento fúngico; c: houve
crescimento fúngico
30
C+
Figura 5: Placa multipoço com o teste antifúngico do extrato de taro em relação ao fármaco
Cetoconazol. Poços brancos: turvação/Poços límpidos: ausência de turvação.
A concentração inibitória mínima (MIC) verificada no extrato de taro contra as 4 espécies de
Candida foi de 256 µg/mL. A MIC do fluconazol e do cetoconazol é para C. Albicans: 0,5 e menor
que 0,125 µg/mL; para C. tropicalis: maior que 32 e 16 µg/mL; para C. parapsilosis: 0,5 e menor
que 0,125 µg/mL; e para C. krusei: 0,5 e menor que o,125 µg/mL, respectivamente. Em
comparação com as concentrações inibitórias mínimas do fluconazol e do cetoconazol, o extrato de
taro apresentou menor eficácia, mas, segundo a classificação de ALIGIANIS et al. (2001) é
considerado um extrato com forte inibição do crescimento fúngico e, de acordo com MAGINA et
al. (2007) é classificado como um extrato ativo.
4. Hipercolesterolemia in vivo
1.1.
Análise bioquímica ao final do experimento:
Após a indução da hipercolesterolemia, a ação da tintura de taro sobre o perfil lipídico
sanguíneo foi avaliada com a utilização dos seguintes testes: colesterol total, frações HDL, LDL e
VLDL e triglicerídeos. As outras análises realizadas tiveram o objetivo de verificar possíveis
interferências da utilização da tintura de taro sobre o funcionamento do organismo.
A análise do colesterol total permite avaliar o risco aterogênico, já que em níveis elevados se
torna um dos fatores contribuintes para a formação de ateromas. O risco de contrair doença cardíaca
coronariana aumenta proporcionalmente, com o aumento do colesterol total. Assim, a avaliação
dessa substância contribui para detectar e prevenir o desenvolvimento de doenças cardíacas. Dentro
31
do perfil lipídico, a fração HDL do colesterol representa uma proteção para a saúde cardiovascular
do organismo pois remove o colesterol do sangue e o transporta de volta ao fígado para ser
excretado. É chamado de “bom colesterol” e é desejável que seus níveis sejam os mais elevados
possíveis, ao contrário do LDL que é considerado o “mau colesterol” e espera-se que seus níveis
sejam os mais baixos possíveis, pois é ele o responsável pelo transporte do colesterol a partir do
fígado para os tecidos periféricos. O acúmulo de LDL no plasma resulta em hipercolesterolemia e o
aumento de VLDL resulta em hipertrigliceridemia. O VLDL é formado no fígado a partir de
triacilgliceróis oriundos de ác. graxos e carboidratos em excesso na dieta, ele transporta os ác.
graxos para os músculos e adipócitos.
A glicemia foi analisada com o objetivo de verificar se a tintura de taro interfere no índice
glicêmico, pois o taro é um vegetal com elevado índice de carboidratos. As análises de uréia e
creatinina permitem verificar possíveis interferências na função renal. A uréia é a principal fonte de
excreção do nitrogênio, produto do metabolismo das proteínas, e é excretada pelos rins. Desta
forma, a uréia está diretamente relacionada à função excretória renal. E a creatinina é produzida nas
células a partir do catabolismo da creatina e liberada ao plasma para ser posteriormente filtrada nos
glomérulos e excretada na urina. Os outros parâmetros bioquímicos ALT, AST, fosfatase alcalina,
gama-GT (gama glutamil transferase), albumina e proteína total dão indícios do funcionamento
hepático. A enzima AST é encontrada no fígado, músculos e outros órgãos, já a enzima ALT é
encontrada apenas no citoplasma do fígado, tendo maior especificidade para avaliar lesão hepática,
ambas são utilizadas para avaliar lesão hepatocelular. A fosfatase alcalina e a gama-GT inferem
sobre o fluxo biliar e lesão de vias biliares. E as proteínas totais e albumina servem para avaliar a
função de síntese do fígado, já que a albumina é a principal proteína circulante no organismo e é
produzida no fígado (BOBAN et al; 2006).
32
Tabela 6: Valores médios de colesterol total em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28
dias de tratamento
% DE VARIAÇÃO
% DE VARIAÇÃO
MÉDIAS
EM RELAÇÃO
EM RELAÇÃO
(mg/dL)
A G1
A G2
55,85 A/b
---
-91,6%
665.90 B/a
+1092,3%
---
759,93 B/a
+1260,7%
+14,1%
609,73 B/a
+991,7%
-8,4%
178,46 A/b
+219,5%
-73,2%
56,68 A/b
+1,5%
-91,4%
GRUPOS
G1
Controle
normal
G2
Controle
hipercolesterolêmico
G3
Hipercolesterolêmico
tratado 2mL tintura
G4
Hipercolesterolêmico
tratado 5mL tintura
G5
Hipercolesterolêmico
tratado 10mLtintura
G6
Hipercolesterolêmico
tratado Sinvastatina
Testes estatísticos a 5% de significância. Letras maiúsculas representam o Teste de Dunnett e letras
minúsculas representam o Teste de Tukey. Médias que contém a mesma letra não diferem entre si.
800
700
600
500
400
Colesterol total (mg/dL)
300
200
100
0
G1
G2
G3
G4
G5
G6
Figura 8: Valores médios de colesterol total em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28
dias de tratamento
33
A partir do experimento realizado, a indução da hipercolesterolemia foi confirmada pela
elevação do nível de colesterol total no grupo doente em relação ao grupo controle, representando
um aumento cerca de 12 vezes. Isso indica que o modelo experimental utilizado foi adequado,
assim como preconizado por DORNAS et al; 2010.
De acordo com os resultados, os grupos G5 e G6 apresentaram valores estatisticamente
semelhantes ao grupo controle. Foi observado redução do nível de colesterol total nos grupos G4,
G5 e G6 quando comparados ao grupo doente. Entre os grupos tratados com a tintura de taro, o G4
apresentou uma discreta redução do colesterol, 8,4%. Já o grupo G5 demonstrou uma maior
diminuição, 73,2%, porém esse nível não alcançou a mesma marca do grupo G6 tratado com o
fármaco referência, 91,4%. Isso indica que, nas dosagens testadas, apesar da tintura de taro ser
menos eficaz que a sinvastatina, ela é capaz de promover redução do colesterol total sérico.
Provavelmente, uma maior redução da colesterolemia poderia ser obtida com uma dosagem mais
alta ou com a tintura mais concentrada.
O fato do tratamento com o fármaco sinvastatina ter apresentado maior eficácia que o
tratamento com a dose de 10 mL, não impede que a tintura de taro venha a se tornar um
medicamento fitoterápico para a hipercolesterolemia. A sinvastatina é bastante utilizada na terapia
da hipercolesterolemia, mas o seu uso contínuo pode levar à rabdomiólise ou desordens do tecido
muscular e miopatias diversas. Portanto, um fitoterápico que com 28 dias seja capaz de reduzir em
73,2% o nível de colesterol no sangue pode atuar como preventivo ou co-tratamento auxiliando na
terapia da hipercolesterolemia e diminuindo os efeitos colesterais das estatinas.
O efeito hipocolesterolêmico da tintura de taro se deve à presença de MGDG e DGDG que
inibem a atividade da enzima lanosterol sintase na rota biossintética do colesterol (SAKANO et al;
2005; TANAKA et al; 2005). O conteúdo de fibras, mucilagens, fitosteróis e saponinas também
pode contribuir para este efeito. Outro mecanismo envolvido seria o aumento da eliminação de sais
biliares (BOBAN et al; 2006). Assim, pode-se verificar que a tintura de taro possui potencial para se
tornar um agente hipocolesterolêmico com diferentes mecanismos de ação, agindo em conjunto e
em sinergia.
O resultado obtido está de acordo com os estudos de IGWE et al. (2004) que demonstrou
que animais alimentados com dieta suplementada com taro apresentaram redução na concentração
de colesterol; e de LUYKEN & JANSEN (1960) que indicou que pessoas que tem o taro como base
da alimentação da sua cultura, como em Nova Guiné, Oceania, apresentam níveis séricos de
colesterol mais baixos quando comparados com os europeus.
34
Tabela 7: Valores médios de HDL em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento
GRUPOS
% DE VARIAÇÃO
% DE VARIAÇÃO
MÉDIAS
EM RELAÇÃO
EM RELAÇÃO
(mg/dL)
A G1
A G2
37,85 A/a
---
+7,2%
35,30 A/a
-6,7%
---
30,70 B/ab
-18,9%
-13,0%
25,36 B/b
-32,9%
-28,2%
30,68 B/ab
-18,9%
-13,0%
24,81 B/b
-34,4%
-29,7%
G1
Controle
normal
G2
Controle
hipercolesterolêmico
G3
Hipercolesterolêmico
tratado 2mL tintura
G4
Hipercolesterolêmico
tratado 5mL tintura
G5
Hipercolesterolêmico
tratado 10mLtintura
G6
Hipercolesterolêmico
tratado Sinvastatina
Testes estatísticos a 5% de significância. Letras maiúsculas representam o Teste de Dunnett e letras
minúsculas representam o Teste de Tukey.
Médias que contém a mesma letra não diferem entre si.
40
35
30
25
20
15
HDL (mg/dL)
10
5
0
G1
G2
G3
G4
G5
G6
Figura 9: Valores médios de HDL em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento
35
A partir da análise da fração HDL do colesterol, todos os grupos apresentaram diminuição
do nível plasmático de HDL quando comparados ao grupo controle. A maior redução ocorreu no
grupo G6, indicando que a sinvastatina promoveu maior diminuição do HDL do que a tintura de
taro.
A fração HDL é responsável pelo transporte do colesterol das células periféricas para o
fígado, onde ele é transformado em ácidos biliares e assim excretado através das vias biliares para o
intestino. Existe uma correlação inversa entre as concentrações séricas de HDL colesterol e o risco
de doença ateroesclerótica. Concentrações elevadas de HDL protegem contra as cardiopatias
coronárias, enquanto que as concentrações diminuídas, sobretudo as associadas a concentrações
aumentadas de triglicerídeos, aumentam o risco de doença cardiovascular. Por isso, o HDL é
chamado de “bom colesterol”, sendo desejável que seu nível sanguineo seja aumentado.
O tratamento para hipercolesterolemia tem como objetivo baixar o nível de colesterol total,
principalmente através da fração não-HDL composta por LDL e VLDL, e, além disso, busca-se
também elevar o nível da fração HDL. O tratamento com a tintura de taro foi eficaz em reduzir a
colesterolemia, porém não promoveu elevação da fração HDL.
36
Tabela 8: Valores médios de triglicerídeos em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28
dias de tratamento
% DE VARIAÇÃO
% DE VARIAÇÃO
MÉDIAS
EM RELAÇÃO
EM RELAÇÃO
(mg/dL)
A G1
A G2
78,78 A/b
---
-3,2%
81,40 A/ab
+3,3%
---
100,51 B/a
+27,6%
+23,5%
83,28 A/ab
+5,7%
+2,3%
71,51 A/b
-9,2%
-12,1%
74,31 A/b
-5,7%
-8,7%
GRUPOS
G1
Controle
normal
G2
Controle
hipercolesterolêmico
G3
Hipercolesterolêmico
tratado 2mL tintura
G4
Hipercolesterolêmico
tratado 5mL tintura
G5
Hipercolesterolêmico
tratado 10mLtintura
G6
Hipercolesterolêmico
tratado Sinvastatina
Testes estatísticos a 5% de significância. Letras maiúsculas representam o Teste de Dunnett e letras
minúsculas representam o Teste de Tukey.
Médias que contém a mesma letra não diferem entre si.
120
100
80
60
Triglicerídios (mg/dL)
40
20
0
G1
G2
G3
G4
G5
G6
Figura 10: Valores médios de triglicerídeos em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28
dias de tratamento.
37
Triglicerídeos são lipídios compostos por três ácidos graxos ligados a uma molécula de
glicerol e representam a forma de reserva lipídica nos vertebrados, sendo armazenados nos
adipócitos. Eles são ingeridos na dieta, estando presentes em alimentos como óleos vegetais,
laticínios e gordura animal. Além disso, carboidratos ingeridos em excesso são convertidos em
triglicerídeos sendo também estocados no tecido adiposo. A dieta utilizada composta por ração e
suplemento de colesterol não provocou alteração relevante no nível de triglicerídeos dos animais
por não ser rica em ácidos graxos. A elevação dos triglicerídeos sofreu influência da ingestão de
carboidratos presentes na tintura, pois o taro é um vegetal que contém entre 17,8 e 32,5g/100g de
amido (NEPA-UNICAMP, 2006).
Os dados obtidos indicaram que o tratamento com a tintura de taro nos grupos G3 e G4 não
foi capaz de reduzir a trigliceridemia, mas no grupo G5, com a dose de 10 mL, observou-se
diminuição de 9,2% no nível de triglicerídeos em relação ao grupo controle. Essa diminuição foi
maior que a obtida com o fármaco sinvastatina, que reduziu a trigliceridemia em apenas 5,7%. Um
estudo realizado por BOBAN et al. (2006) demonstrou redução de triglicerídeos quando se testou a
mucilagem isolada de C. esculenta. O mesmo efeito foi observado com a utilização da tintura de
taro, caracterizando seu potencial em baixar o nível plasmático de triglicerídeos.
38
Tabela 9: Valores médios de glicose em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento
GRUPOS
% DE VARIAÇÃO
% DE VARIAÇÃO
MÉDIAS
EM RELAÇÃO
EM RELAÇÃO
(mg/dL)
A G1
A G2
252,31 A/ab
---
+8,2%
233,28 A/ab
-7,5%
---
353,36 A/a
+40,0%
+51,5%
357,51 A/a
+41,7%
+53,2%
280,46 A/ab
+11,2%
+20,2%
179,48 A/b
-28,8%
-23,1%
G1
Controle
normal
G2
Controle
hipercolesterolêmico
G3
Hipercolesterolêmico
tratado 2mL tintura
G4
Hipercolesterolêmico
tratado 5mL tintura
G5
Hipercolesterolêmico
tratado 10mLtintura
G6
Hipercolesterolêmico
tratado Sinvastatina
Testes estatísticos a 5% de significância. Letras maiúsculas representam o Teste de Dunnett e letras
minúsculas representam o Teste de Tukey.
Médias que contém a mesma letra não diferem entre si.
Figura 11: Valores médios de glicose em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento
39
O taro é um vegetal que contém entre 17,8 e 32,5g/100g de amido (NEPA-UNICAMP,
2006). Assim, o aumento da glicemia nos animais tratados com a tintura é decorrente da presença
desses carboidratos. Os grupos G3 e G4 apresentaram elevação no nível de glicose em torno de
40% e o grupo G5, apesar de ainda promover hiperglicemia, apresentou uma menor variação,
aumento de apenas 11,2% em relação ao grupo controle. Isso indica que, mesmo sendo constituída
por carboidratos, a tintura de taro, na dose de 10 mL contém ativos em quantidade suficiente para
atuar como hipoglicemiante, assim como indicado por GRINDLEY et al. (2000), que verificou
diminuição do colesterol total e da glicemia em ratos diabéticos tratados com extrato etanólico de C.
esculenta.
Tabela 10: Valores médios AST em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento
GRUPOS
% DE VARIAÇÃO
% DE VARIAÇÃO
MÉDIAS
EM RELAÇÃO
EM RELAÇÃO
(U/L)
A G1
A G2
41,26 A/c
---
+47,3%
28,00 B/d
-32,1%
---
58,00 B/b
+40,5%
107,1%
74,00 B/a
+79,3%
+164,3%
41,68 A/c
+0,9%
+48,8%
51,26 B/b
+24,2%
+83,1%
G1
Controle
normal
G2
Controle
hipercolesterolêmico
G3
Hipercolesterolêmico
tratado 2mL tintura
G4
Hipercolesterolêmico
tratado 5mL tintura
G5
Hipercolesterolêmico
tratado 10mLtintura
G6
Hipercolesterolêmico
tratado Sinvastatina
Testes estatísticos a 5% de significância. Letras maiúsculas representam o Teste de Dunnett e letras
minúsculas representam o Teste de Tukey.
Médias que contém a mesma letra não diferem entre si.
40
Figura 12: Valores médios de AST em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento
Os grupos G3 e G4 apresentaram as maiores porcentagens de variação na atividade da AST,
respectivamente 40,5% e 79,3% em relação ao grupo controle. As menores doses testadas da tintura
de taro aumentaram a atividade desta enzima. O tratamento com o fármaco sinvastatina também
provocou elevação da AST, 24,2%. O estudo de BOBAN et al. (2006) que testou a mucilagem
arabinogalactana isolada de C. esculenta em ratos normocolesteroêmicos não demonstrou alterações
significativas quanto ao nível de AST, o que foi verificado apenas na dosagem de 10 mL da tintura.
A AST catalisa a conversão do ácido oxaloacético + ácido glutâmico para produzir ácido αceto glutárico + ácido aspártico. Ela é encontrada nas mitocôndrias de muitas células, estando
presente no fígado, coração, músculos e outros órgãos. Elevações na atividade dessa enzima podem
ocorrer em hepatites e hepatopatias crônicas, icterícias, infarto do miocárdio. A análise da AST
serve como parâmetro para avaliar a função hepática, assim pode-se dizer que a tintura de taro na
dose de 10 mL não interfere no funcionamento do fígado.
41
Tabela 11: Valores médios de ALT em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento
GRUPOS
% DE VARIAÇÃO
% DE VARIAÇÃO
MÉDIAS
EM RELAÇÃO
EM RELAÇÃO
(U/L)
A G1
A G2
74,26 A/ab
---
29,8%
57,20 B/b
-22,9%
---
77,16 A/ab
+3,9%
+34,9%
84,80 A/a
+14,2%
+48,2%
76,66 A/ab
+3,2%
+34,0%
92,00 B/a
+17,7%
+60,8%
G1
Controle
normal
G2
Controle
hipercolesterolêmico
G3
Hipercolesterolêmico
tratado 2mL tintura
G4
Hipercolesterolêmico
tratado 5mL tintura
G5
Hipercolesterolêmico
tratado 10mLtintura
G6
Hipercolesterolêmico
tratado Sinvastatina
Testes estatísticos a 5% de significância. Letras maiúsculas representam o Teste de Dunnett e letras
minúsculas representam o Teste de Tukey.
Médias que contém a mesma letra não diferem entre si.
Figura 13: Valores médios de ALT em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento
42
A ALT, assim como a AST, também é uma enzima que infere sobre o funcionamento
hepático, porém ela tem um caráter mais específico, pois está presente apenas no citoplasma dos
hepatócitos, enquanto a AST se encontra no interior das mitocôndrias. Assim, a ALT reflete uma
lesão aguda já que diante de um dano primário na membrana do hepatócito ocorrerá primeiramente
a sua liberação na corrente sanguinea.
A maior variação foi observada no grupo G6, tratado com a sinvastatina, que apresentou
elevação de 17,7% no nível de ALT em relação ao grupo controle. Os grupos tratados com a tintura
de taro não apresentaram alterações estatisticamente significativas nos valores de ALT, assim como
verificado no estudo de BOBAN et al. (2006), que testou a mucilagem arabinogalactana isolada de
C. esculenta em ratos normocolesteroêmicos. Esse resultado indica que o tratamento com a tintura
não causou danos ao fígado.
43
Tabela 12: Valores médios de gama-GT em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias
de tratamento
GRUPOS
% DE VARIAÇÃO
% DE VARIAÇÃO
MÉDIAS
EM RELAÇÃO
EM RELAÇÃO
(U/L)
A G1
A G2
15,00 A/abc
---
-11,7%
17,00 A/ab
+13,3%
---
14,16 A/bc
-5,5%
-16,6%
13,83 A/c
-7,7%
-18,6%
17,33 B/a
+15,5%
+1,9%
15,83 A/abc
+5,5%
-6,8%
G1
Controle
normal
G2
Controle
hipercolesterolêmico
G3
Hipercolesterolêmico
tratado 2mL tintura
G4
Hipercolesterolêmico
tratado 5mL tintura
G5
Hipercolesterolêmico
tratado 10mLtintura
G6
Hipercolesterolêmico
tratado Sinvastatina
Testes estatísticos a 5% de significância. Letras maiúsculas representam o Teste de Dunnett e letras
minúsculas representam o Teste de Tukey.
Médias que contém a mesma letra não diferem entre si.
Figura 14: Valores médios de gama-GT em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias
de tratamento
44
Entre os grupos tratados com a tintura de taro, apenas o G5 apresentou elevação no nível de
gama-GT em relação ao grupo controle, 15,5%. O grupo tratado com sinvastatina também
apresentou aumento, porém em menor grau, 5,5%.
No fígado, esta enzima está localizada nos canalículos das células hepáticas e
particularmente nas células epiteliais dos ductos biliares. Devido a esta localização característica, a
enzima aparece elevada em quase todas as desordens hepatobiliares, sendo um dos testes mais
sensíveis no diagnóstico destas condições. Assim, ela é um marcador sensível a agressões hepáticas
induzidas por medicamentos e álcool. Devido aos efeitos do consumo de álcool nos níveis de gama
GT, aceita-se este como um marcador sensível de alcoolismo crônico, embora não seja um
marcador específico, especialmente quando seus aumentos não são acompanhados de aumentos
similares de outras enzimas hepáticas.
Como a dosagem isolada de gama-GT tem pouco significado clínico ela deve ser associada a
outros exames. O fato das outras enzimas hepáticas, AST e ALT, não terem apresentados alterações
significativas indica que o álcool e os outros constituintes da tintura de taro não provocaram danos
aos hepatócitos.
45
Tabela 13: Valores médios de fosfatase alcalina em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após
28 dias de tratamento
GRUPOS
% DE VARIAÇÃO
% DE VARIAÇÃO
MÉDIAS
EM RELAÇÃO
EM RELAÇÃO
(U/L)
A G1
A G2
199,16 A/bc
---
+17,2%
170,00 A/c
-14,6%
---
302,50 B/a
+51,8%
+77,9%
273,83 B/ab
+37,5%
+61,1%
293,66 B/a
+47,4%
+72,7%
205,50 A/bc
+3,2%
+20,9%
G1
Controle
normal
G2
Controle
hipercolesterolêmico
G3
Hipercolesterolêmico
tratado 2mL tintura
G4
Hipercolesterolêmico
tratado 5mL tintura
G5
Hipercolesterolêmico
tratado 10mLtintura
G6
Hipercolesterolêmico
tratado Sinvastatina
Testes estatísticos a 5% de significância. Letras maiúsculas representam o Teste de Dunnett e letras
minúsculas representam o Teste de Tukey.
Médias que contém a mesma letra não diferem entre si.
Figura 15: Valores médios de fosfatase alcalina em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após
28 dias de tratamento
46
A enzima fosfatase alcalina é produzida em diversos órgãos como ossos, fígado e placenta.
No fígado, ela está presente nas células que delineam os ductos biliares. Seu nível no plasma
aumenta com obstruções do ducto biliar, colestase intrahepática ou doenças infiltrativas do fígado.
Os três grupos tratados com a tintura de taro, G3, G4 e G5, apresentaram elevação no nível
da fosfatase alcalina sanguinea.
Tabela 14: Valores médios de albumina em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias
de tratamento
GRUPOS
% DE VARIAÇÃO
% DE VARIAÇÃO
MÉDIAS
EM RELAÇÃO
EM RELAÇÃO
(g/dL)
A G1
A G2
4,53 A/a
---
+1,3%
4,47 A/a
-1,3%
---
4,71 A/a
+3,9%
+5,4%
4,52 A/a
-0,2%
+1,1%
4,62 A/a
+1,9%
+3,3%
4,86 A/a
+7,3%
+8,7%
G1
Controle
normal
G2
Controle
hipercolesterolêmico
G3
Hipercolesterolêmico
tratado 2mL tintura
G4
Hipercolesterolêmico
tratado 5mL tintura
G5
Hipercolesterolêmico
tratado 10mLtintura
G6
Hipercolesterolêmico
tratado Sinvastatina
Testes estatísticos a 5% de significância. Letras maiúsculas representam o Teste de Dunnett e letras
minúsculas representam o Teste de Tukey.
Médias que contém a mesma letra não diferem entre si.
47
Figura 16: Valores médios de albumina em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias
de tratamento
A albumina é uma proteína sintetizada especificamente pelo fígado, sendo o principal
constituinte das proteínas totais sanguíneas. É catabolisada pelos tecidos periféricos sendo a
principal responsável pela manutenção da pressão osmótica intravascular e pela ligação e transporte
de várias substâncias no sangue. Os níveis de albumina estão diminuídos em doenças crônicas do
fígado, como a cirrose; na síndrome nefrótica, na qual a albumina é perdida através da urina e na
desnutrição ou estado de catabolismo de proteína. A hiperalbuminemia tem pouco significado
clínico.
Não houve alterações estatisticamente significativas nos valores de albuminemia entre os
grupos. Isso indica que o fígado e rins não foram afetados com o tratamento.
48
Tabela 15: Valores médios de proteína total em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28
dias de tratamento
GRUPOS
% DE VARIAÇÃO
% DE VARIAÇÃO
MÉDIAS
EM RELAÇÃO
EM RELAÇÃO
(g/L)
A G1
A G2
74,18 A/c
---
-4,5%
77.66 A/c
+4,7%
---
86.33 B/ab
+16,4%
+11,2%
79,56 A/bc
+7,2%
+2,4%
80,15 A/bc
+8,0%
+3,2%
88,88 B/a
+19,8%
+14,4%
G1
Controle
normal
G2
Controle
hipercolesterolêmico
G3
Hipercolesterolêmico
tratado 2mL tintura
G4
Hipercolesterolêmico
tratado 5mL tintura
G5
Hipercolesterolêmico
tratado 10mLtintura
G6
Hipercolesterolêmico
tratado Sinvastatina
Testes estatísticos a 5% de significância. Letras maiúsculas representam o Teste de Dunnett e letras
minúsculas representam o Teste de Tukey.
Médias que contém a mesma letra não diferem entre si.
Figura 17: Valores médios de proteína total em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28
dias de tratamento
49
As proteínas totais sanguíneas são representadas pela albumina e as globulinas. As causas de
alterações de proteínas totais estão relacionadas com mudanças no volume de água no plasma ou a
mudanças na concentração de proteínas no sangue. Em casos de hepatopatias e nefropatias também
são observadas altas variações. Os valores obtidos a partir da análise das proteínas totais sanguineas
não apresentaram variações clinicamente relevantes. Esse resultado é decorrente da inalteração da
albuminemia, caracterizando mais um indicativo de que a tintura de taro não provocou danos ao
fígado e rins. Estes dados estão de acordo com os estudos de BOBAN et al. (2006), que testou a
mucilagem arabinogalactana isolada de C. esculenta em ratos normocolesteroêmicos e verificou
através da análise bioquímica de AST, ALT, proteínas totais e razão albumina:globulina que a
função hepática e renal não foi afetada.
Tabela 16: Valores médios de uréia em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento
GRUPOS
% DE VARIAÇÃO
% DE VARIAÇÃO
MÉDIAS
EM RELAÇÃO
EM RELAÇÃO
(mg/dL)
A G1
A G2
43,53 A/ab
---
+14,9%
37,88 A/b
-12,9%
---
39,66 A/ab
-8,8%
+4,7%
38,00 A/b
-12,7%
+0,3%
45,41 A/ab
+4,3%
+19,8%
49,86 A/a
+14,5%
+31,6%
G1
Controle
normal
G2
Controle
hipercolesterolêmico
G3
Hipercolesterolêmico
tratado 2mL tintura
G4
Hipercolesterolêmico
tratado 5mL tintura
G5
Hipercolesterolêmico
tratado 10mLtintura
G6
Hipercolesterolêmico
tratado Sinvastatina
Testes estatísticos a 5% de significância. Letras maiúsculas representam o Teste de Dunnett e letras
minúsculas representam o Teste de Tukey. Médias que contém a mesma letra não diferem entre si.
50
Figura 18: Valores médios de uréia em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias de
tratamento
No metabolismo de mamíferos, a principal forma de excreção de nitrogênio é a uréia, mas
em herbívoros, como o coelho, é a amônia. Esse animal possui microorganismos no intestino grosso
que podem utilizar o amoníaco e a uréia para promover a atividade proteolítica, hidrolisando-os
como fonte de nitrogênio não-protéico a ser utilizado na síntese protéica microbiana. Há indícios de
que ocorre absorção de aminoácidos no intestino grosso de herbívoros monogástricos ou mesmo de
amônia, sendo esta utilizada como fonte de aminoácidos essenciais. Em coelhos, é bem conhecido o
mecanismo da cecoprofagia, onde a reingestão do bolo alimentar faz com que a proteína microbiana
formada no intestino grosso seja digerida quimicamente no estômago. Este mecanismo pode
influenciar os níveis de uréia, creatinina, AST e ALT.
A análise da uréia serve como parâmetro para a avaliação da função renal. Após sua síntese
no fígado, é liberada na corrente sanguínea, seguindo até os rins, onde é filtrada pelos glomérulos.
A maioria da uréia filtrada é excretada na urina, porém até 40% pode ser reabsorvida por difusão
passiva durante a passagem pelos túbulos renais. A quantidade reabsorvida depende do fluxo
urinário e do estado de hidratação do indivíduo. Pequenas quantidades de uréia são excretadas pelo
trato gastrointestinal e pele. Os níveis plasmáticos de uréia são mantidos por um equilíbrio entre
perfusão e função renal, conteúdo protéico da dieta e catabolismo protéico. A uréia, embora menos
específica para função renal do que a creatinina, é mais sensível a alterações iniciais da função
renal, sendo importante marcador nestas condições.
A partir dos dados obtidos, nenhum dos grupos apresentou alterações estatisticamente
significativas na uréia sanguinea. A maior alteração observada ocorreu no grupo tratado com
sinvastatina com um aumento de 14,5% em relação ao grupo controle. Assim, pode-se dizer que o
tratamento com a tintura de taro não interferiu no funcionamento renal.
51
Tabela 17: Valores médios de creatinina em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias
de tratamento
GRUPOS
% DE VARIAÇÃO
% DE VARIAÇÃO
MÉDIAS
EM RELAÇÃO
EM RELAÇÃO
(mg/dL)
A G1
A G2
1,36 A/a
---
+5,4%
1,29 A/a
-5,1%
---
1,31 A/a
-3,7%
+1,5%
1,39 A/a
+2,2%
+7,3%
1,32 A/a
-2,9%
+2,3%
1,64 A/a
+20,5%
+27,1%
G1
Controle
normal
G2
Controle
hipercolesterolêmico
G3
Hipercolesterolêmico
tratado 2mL tintura
G4
Hipercolesterolêmico
tratado 5mL tintura
G5
Hipercolesterolêmico
tratado 10mLtintura
G6
Hipercolesterolêmico
tratado Sinvastatina
Testes estatísticos a 5% de significância. Letras maiúsculas representam o Teste de Dunnett e letras
minúsculas representam o Teste de Tukey.
Médias que contém a mesma letra não diferem entre si.
Figura 19: Valores médios de creatinina em plasma de coelhos hipercolesterolêmicos após 28 dias
de tratamento
52
A creatinina é produzida nas células a partir do catabolismo da creatina que é um
componente de alto conteúdo energético. O processo se dá em grande parte nas células musculares.
A creatinina é então liberada ao plasma para ser posteriormente filtrada nos glomérulos e excretada
na urina. Pequenas quantidades de creatinina são secretadas no túbulo proximal, e quantidades
mínimas são reabsorvidas nos túbulos renais distais. O equilíbrio entre a produção de creatinina, a
massa muscular do indivíduo e a função renal, determina as concentrações plasmáticas da creatinina
sérica. Geralmente, a massa muscular e as produções de creatina e creatinina tendem a ser mais
estáveis, fazendo desta determinação um bom indicador da função renal.
Os valores obtidos não foram estatisticamente significativos. As variações ocorridas estão
dentro da faixa de valores normais para coelhos em torno de 0,8 a 2,5 mg/dL. Isto indica que o
tratamento com a tintura de taro não provocou desordens renais.
53
1.1.
Avaliação do peso corporal dos animais:
Figura 20: Pesagem dos animais. Fonte: arquivo pessoal do pesquisador.
O peso corporal dos animais foi acompanhado durante o experimento a fim de verificar se o
tratamento com a tintura de taro provocaria o ganho de massa já que o taro é um vegetal calórico.
Tabela 18: Avaliação do ganho de massa dos animais
Peso médio
após 2
semanas
(Kg)
2,59
Ganho de
massa após
2 semanas
G1
Peso
médio
inicial
(Kg)
2,33
G2
2,36
G3
Ganho de
massa nas 3º
e 4º semanas
Ganho de
massa
total
11,1 %
Peso médio
após
4 semanas
(Kg)
2,70
4,2 %
15,9 %
2,58
9,3 %
2,66
3,1 %
12,7 %
2,43
2,62
7,8 %
2,72
3,8 %
11,9 %
G4
2,43
2,66
9,5 %
2,81
5,6 %
15,6 %
G5
2,17
2,37
9,2 %
2,51
5,9 %
15,7 %
G6
2,22
2,39
7,6 %
2,44
2,1 %
9,9 %
No decorrer do experimento, observou-se que todos os grupos apresentaram um percentual
de ganho de massa corporal semelhante entre si, sendo o grupo G6 com o menor percentual de
aumento de peso. A partir disso, infere-se que o tratamento com a tintura de taro não interfere no
processo de ganho de peso corporal. Esse resultado está de acordo com o estudo de BOBAN et al.
54
(2006) onde ratos normocolesterolêmicos alimentados com mucilagem isolada do taro não
apresentaram diferença estatisticamente significativa quanto ao ganho de massa corporal.
1.2.
Avaliação macroscópica do fígado dos animais:
Figura 21: Aspecto macroscópico do fígado dos coelhos após o experimento
55
O acúmulo de gordura no interior dos hepatócitos é um mecanismo natural, utilizado para
estocar energia. Porém, uma dieta rica em gordura e carboidratos pode levar ao acúmulo de gordura
no fígado, formando macrovesículas lipídicas o que caracteriza a esteatose hepática.
A partir da visualização macroscópica do fígado dos animais ao final do experimento,
observou-se no grupo G2 a presença de macrovesículas de gordura indicando o aparecimento da
esteatose, fato decorrente da dieta hipercolesterolêmica sem tratamento. Os grupos G3 e G4,
também apresentaram esteatose, porém de forma mais discreta. Já o grupo G5 e G6 mantiveram o
fígado com aspecto macroscópico normal semelhante ao grupo controle G1, indicando que os
tratamentos com a tintura de taro na dose de 10mL e com o fármaco referência, ao diminuir os
níveis lipídicos sanguíneos, também impediram o surgimento de esteatose hepática.
CONCLUSÃO
A partir do bioensaio de letalidade com Artemia salina Leach, o extrato de Colocasia
esculenta não apresentou toxicidade aguda significante, não oferecendo risco toxicológico para
Artemia salina.
Através do teste antifúngico de microdiluição em caldo, o extrato de Colocasia esculenta
apresentou atividade antifúngica contra 4 espécies de Candida: C. Albicans, C. tropicalis, C.
parapsilosis, C. krusei.
A dosagem mais eficaz da tintura de taro 20% foi a de 10 mL. Ela mostrou-se eficaz na
redução do perfil lipídico sérico de coelhos. Houve uma diminuição de 73,2% do colesterol total em
relação ao grupo doente. Ocorreu diminuição da fração HDL, mas em menor grau que a observada
no grupo que utilizou a sinvastatina. O nível de triglicerídeo também foi reduzido. Observou-se
aumento da glicose sérica dentro dos grupos que receberam a tintura, decorrente do conteúdo de
carboidratos presente no taro, sendo que a dose de 10 mL promoveu o menor aumento. A partir dos
outros parâmetros analisados: uréia, creatinina, AST, ALT, fosfatase alcalina, gama-GT, albumina e
proteínas totais, pode-se dizer que o tratamento com a tintura de taro não prejudicou as funções
renal e hepática dos animais, pois não ocorreram alterações clinicamente significativas nesses
parâmetros. Apesar de ser um vegetal calórico, a utilização da tintura de taro não promoveu o ganho
de peso corporal. E, quanto à análise macroscópica do fígado, a dose de 10 mL inibiu o
aparecimento de esteatose decorrente da dieta hipercolesterolêmica. Assim, a tintura de taro
mostrou-se eficiente no tratamento da hipercolesterolemia em coelhos, o que torna a espécie
Colocasia esculenta um alvo para mais estudos na busca por novos medicamentos fitoterápicos.
56
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