Roteiro para Apresentação de Dissertação no PPGEM

UNIVERSIDADE DO CEUMA
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO, PESQUISA E EXTENSÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA PARASITÁRIA
ROXANA DE CARVALHO VERAS
VÍRUS ENTÉRICOS ASSOCIADOS À
GASTROENTERITE AGUDA INFANTIL
EM SÃO LUÍS - MA
SÃO LUÍS
2012
ROXANA DE CARVALHO VERAS
VÍRUS ENTÉRICOS ASSOCIADOS À GASTROENTERITE AGUDA INFANTIL EM
SÃO LUÍS-MA
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia Parasitária como parte
dos requisitos para a obtenção do título de
Mestre
em
Biologia
Parasitária
da
Universidade do CEUMA
Orientador: Prof. Dr. Valério Monteiro Neto
Coorientador: Profa. Dra. Patrícia de Maria
Silva Figueiredo
SÃO LUÍS
2012
Ficha catalográfica elaborada pela bibliotecária Luciana de Araújo CRB-13/445.
Veras, Roxana de Carvalho.
Vírus entéricos associados à gastroenterite aguda infantil em São
V473
Luís-Ma./ Roxana de Carvalho Veras. São Luís: UNICEUMA, 2012.
v
105p. il.
Dissertação (Mestrado) – Curso
Universidade do CEUMA, 2012.
de
Biologia
Parasitária.
1. Diarreia Infantil. 2. Vírus Entéricos. 3. Genotipagem
Monteiro Neto, Valério (Orientador) II. Título.
I.
CDU: 616.97(812.1)
ROXANA DE CARVALHO VERAS
VÍRUS ENTÉRICOS ASSOCIADOS À GASTROENTERITE AGUDA INFANTIL EM
SÃO LUÍS-MA
A Comissão julgadora da Defesa do Trabalho Final de Mestrado em
Biologia Parasitária, em sessão pública realizada no dia 27 / 06 / 2012, considerou a
candidata
( X ) APROVADA
(
) REPROVADA
1) Examinador: Rosimary de Jesus Gomes Turri
2) Examinador: Maria Rosa Quaresma Bomfim
3) Examinador: Cristina de Andrade Monteiro
4) Presidente (Orientador): Valério Monteiro Neto
Aos meus queridos pais José Ribamar
Veras e Celeste Maria de Carvalho Veras
AGRADECIMENTOS
A Deus, pois toda honra, glória e poder sejam dados a ele. Obrigada Senhor por mais
essa vitória na minha vida! Sem Ti nada disso seria possível.
Aos meus queridos pais, José Ribamar Veras e Celeste Mª de Carvalho Veras, pois
vocês são meus principais incentivadores. Obrigada por sempre estarem comigo em
todos os momentos da minha vida. Sem o amor, o cuidado e a paciência de vocês eu
não teria chegado ao final de mais uma conquista. Amo vocês!!!
Ao meu irmão Rogério Veras, pelo exemplo e incentivo.
A minha querida prima Keylla Cristine por ser mais que uma prima pra mim, uma
verdadeira amiga. Sempre com palavras de incentivo e apoio, mostrando-se sempre
presente em todas as etapas da minha vida. Eu sei que a minha vitória é a tua
vitória também. Muito Obrigada!
Ao meu orientador, Prof. Dr. Valério Monteiro Neto pela sua rica orientação e por
acreditar que eu pudesse realizar este trabalho.
As professoras Patrícia de Mª Silva Figueiredo e Cristina de Andrade Monteiro
pelas colaborações na realização deste trabalho e palavras de apoio e incentivo.
A todos os meus colegas de turma do Mestrado Biologia Parasitária Adriana
Marques, Viviane Menezes, Márcia Boor, Inácio Pereira, Kênia Regina e Suzane
Katy pelos momentos de descontração, tornando os momentos difíceis mais
agradáveis.
Principalmente
Alícia
Zaranza
e
Ione
Paiva
pela
amizade,
companheirismo, apoio e auxílio em todas às horas. Muito obrigada!
A todos os amigos que conquistei no laboratório do UNICEUMA, Márcia Barros,
Jessika Farias, Patrícia Valéria, Iven Neylla, Diogo Marcelo, Monique Santos,
Francyelle Costa e Dália Cristine, por terem me acolhido e me tratarem sempre com
carinho e atenção. Por cooperarem de alguma forma na realização desse trabalho,
ou com palavras de incentivo, ou com uma brincadeira, ou uma saidinha para
lanchar, ou me emprestando a câmara digital, ou fazendo um gel. Obrigada
queridos!
Aos meus colegas do CTA que muita paciência tiveram comigo durante esses dois
anos.
Principalmente
Andrezza
Brito,
Tiago
Ahid
e
Marilene
Agra,
pela
preocupação, amizade e paciência. Valdenide Santos, Márcia Rocha e Angela
Carvalho pelas palavras de carinho e incentivo. Ana Luiza por me liberar do serviço
nos dias de aula, provas e reuniões no mestrado.
A professora Emygdia Rosa e aos meus colegas do LEGH por me incentivarem a ter
gosto pela pesquisa e sempre estarem dispostos a me ajudar, Fernanda de Carvalho,
Fábio França, Ellen Lisboa, Patrícia Azevedo, Fernando Patrício, Bruno Nunes,
Fabiano
Monteles,
Leidyane
Cunha
e
Maxwellem
Ferreira.
Especialmente
Alexsandro Santos por ótimas dicas na realização desse trabalho.
A professora Silma Pereira por ter liberado o espaço físico do LABGEN da UFMA
para que eu pudesse concluir os meus experimentos. E a todos os colegas do LABGEN,
principalmente Perla Lopes, Rossy-Eric Soares, Jaqueline Diniz, Marta Belfort,
Mayara Ingrid e Maria Santana pelo acolhimento carinhoso.
Finalmente a todos que direta ou indiretamente contribuíram para confecção e
finalização desse trabalho. Obrigada!
Tudo coopera para o bem daqueles que
amam a Deus”
Romanos 8:28
“Tudo posso Naquele que me fortalece”
Filipenses 4:13
RESUMO
Muitos agentes infecciosos podem estar associados à doença diarréica, mas os vírus são os
principais responsáveis por gastroenterites endêmicas e epidêmicas. Contudo existem poucos
relatos que descrevam a importância desses agentes em nosso meio. Desta forma, o presente
estudo teve por objetivo detectar a presença de vírus entéricos em crianças menores de 5 anos
de idade em São Luís – MA e caracterizar as amostras positivas de rotavírus quanto ao seu
fenótipo e genótipo. Entre maio de 2009 e maio de 2011 foram analisadas 131 amostras de
fezes de crianças, sendo que deste total 76 amostras eram de crianças com diarréia aguda
(grupo caso) e 55 amostras eram de crianças sem diarréia aguda (grupo controle). Para
detecção molecular dos vírus entéricos foi utilizada a técnica de RT-PCR (ou PCR para
adenovírus), utilizando os primers específicos para cada agente. No caso da detecção de
rotavírus também foi empregada à técnica de ELISA e as amostras positivas foram
fenotipadas por eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA) e genotipadas através de PCR
para os genótipos G e P. Das crianças estudadas, 26,3% (20/76) no grupo caso e 10,9% (6/55)
no grupo controle tiveram positividade para um dos vírus entéricos pesquisados. Entre as
crianças com gastroenterites os vírus mais frequentemente detectados foram: rotavírus
(13,1%) e adenovírus (5,3%), seguido por norovírus (4,0%), Aichi vírus (2,6%) e astrovírus
(1,3%). Das 11 amostras positivas para rotavírus, 4 amostras não apresentaram perfil de
migração eletroforética e 7 amostras apresentaram um perfil de migração compatível com o
fenótipo de rotavírus do grupo A do tipo longo. Como resultado da associação G e P, a
combinação observada foi G2P[4]. Os norovírus detectados foram do genogrupo II. Este
estudo demonstrou que todos esses vírus circularam entre as crianças em nosso meio e que o
rotavírus é ainda um agente significante da gastroenterite mesmo após a introdução da
vacinação, devido ao envolvimento de outros genótipos não incluídos rotineiramente na
vacina usada no Brasil.
Palavras-chave: Diarreia infantil, Vírus entéricos, RT-PCR, Genotipagem.
ABSTRACT
Many infectious agents can be associated to diarrhea disease, but viruses are the main cause
of endemic and epidemic gastroenteritis. However, there are few reports describing the
importance of these agents in our region. Thus, this study aimed to detect the presence of
enteric viruses in children under 5 years old in São Luís – MA and characterize the rotavirus
positive samples according to their phenotype and genotype. Between May 2009 and May
2011 we analyzed 131 stool samples from children, 76 of which were samples from children
with acute diarrhea (case group) and 55 samples were from children without diarrhea (control
group). For molecular detection of enteric viruses, it was used the RT-PCR (or PCR for
adenovirus), having specific primers for each agent. Related to rotavirus detection we also
used ELISA and the positive samples were phenotyped by polyacrylamide agarose gel
electrophoresis (PAGE) and genotyped by PCR for genotypes G e P. Of the children studied,
26.3% (20/76) in the case group and 10.9% (6/55) in the control group were positive for at
least one of the enteric viruses studied. The viruses most frequently detected in children with
gastroenteritis were: rotavirus (13.1%) and adenovirus (5.3%), followed by norovirus (4.0%),
Aichi virus (2.6%), and astrovirus (1.3%). In the control group, norovirus was detected more
often than in cases (7.3%), followed by rotavirus (1.8%), and adenovirus (1.8%). From 11
positive samples for rotavirus, 4 samples showed no electrophoretic migration profile and 7
samples had a migration profile compatible with the phenotype of long type group A
rotavirus. As a result of the association G and P, the combination found was G2P[4]. The
noroviruses detected were from the genogroup II. This study demonstrated that all these
viruses are circulating in children in our region and that rotavirus is still a significant agent of
gastroenteritis even after introduction of vaccination, due to the involvement of other
genotypes not included in the vaccine routinely used in Brazil.
Keywords: Infantile diarrhea, Enteric viruses, RT-PCR, Genotyping.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Representação esquemática da partícula de rotavírus e seus segmentos, com os
respectivos produtos.................................................................................................. 19
Figura 2 - Incidência estimada dos casos fatais de diarreia por rotavírus para cada 100.000
crianças menores de 05 anos...................................................................................... 23
Figura 3 - Representação da partícula de adenovírus................................................................. 27
Figura 4 - Organização genômica de adenovírus humano.......................................................... 28
Figura 5 - Representação esquemática do genoma dos astrovírus ............................................. 31
Figura 6 - Representação esquemática do genoma dos norovírus ............................................. 35
Figura 7 - Percentual de crianças menores de 05 anos com positividade para um dos vírus
entéricos em São Luís - MA, entre maio de 2009 a maio de
2011............................................................................................................................ 53
Figura 8 - Gel de agarose 1,5% mostrando o perfil de detecção por RT-PCR e PCR específico dos
vírus entéricos causadores de gastroenterite em crianças.................................................. 54
Figura 9 -Variação sazonal na freqüência dos vírus entéricos detectados em 76 crianças
menores de 05 anos com gastroenterite em relação à pluviosidade em São LuísMA, entre maio de 2009 a maio de 2011................................................................... 58
Figura 10 - Gel de poliacrilamida 7,5% mostrando o perfil eletroforético de amostras fecais de
crianças menores de 05 anos positivas para rotavírus em São Luís-MA. A canaleta A
contém controle negativo. As canaletas B, E, F, H, I e J apresentam amostras
com perfil eletroforético padrão longo................................................................... 60
Figura 11 - Genotipagem de rotavírus visualizada em gel de agarose a 2%. A- genotipagem
P (VP4) de rotavírus usando produtos da 1ªamplificação........................................ 61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Primers utilizados na detecção molecular dos vírus entéricos................................... 48
Tabela 2 - Sequência dos primers utilizados para a definição do genótipo G e P do
rotavírus........................................................................................................... 51
Tabela 3 - Frequência de vírus entéricos em crianças menores de 05 anos com e sem
gastroenterite em São Luís – MA, entre maio de 2009 a maio de 2011........ 55
Tabela 4 - Frequência de vírus entéricos em 76 crianças com gastroenterite menores de
05 anos em São Luís – MA, entre maio de 2009 a maio de 2011,
distribuídos por faixa etária ............................................................................ 56
Tabela 5 - Frequência de vírus entéricos em 76 crianças menores de 05 anos com
gastroenterite em São Luís – MA, entre maio de 2009 a maio de 2011,
distribuídos por sexo..................................................................................... 57
Tabela 6 - Detecção de rotavírus em crianças menores de 05 anos em São Luís – MA,
entre maio de 2009 a maio de 2011, distribuídas de acordo com o estado
vacinal............................................................................................................. 59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AdV Adenovírus
Aich Aichi vírus
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
DNAc DNA complementar
CVE Centro de Vigilância Epidemiológica
dATP Deoxyadenosine triphosphate (Desoxiadenosina trifosfato)
dCTP Deoxycytidine triphosphate (Desoxicitidina trifosfato)
dGTP Deoxyguanosine triphosphate (Desoxiguanosina trifosfato)
DNA Ácido Desoxirribonucleico
DNase Desoxirribonuclease
dNTP Deoxynucleotide triphosphate (Desoxirribonucleotídeo trifosfato)
dsRNA Double Stranded Ribonucleic Acid (Ácido ribonucleico de fita dupla)
dTTP Deoxythymidine triphosphate (Desoxitimidina trifosfato)
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Ácido tetracético etilenodiamino)
EGPA Eletroforese de RNA em Gel de Poliacrilamida.
ELISA Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay
EUA Estados Unidos da América
FAPEMA Fundação de Amparo a Pesquisa e ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
do Maranhão
FDA Food and Drug Administration
HCl Ácido Clorídrico
HAst Astrovírus
M Molar
mA Mili Ampére
ME Microscopia Eletrônica
MgCl2 Cloreto de Magnésio
mL Mililitro
MDDA Monitorização das Doenças Diarreicas Agudas
mM Milímetro
mRNA Ácido ribonucleico mensageiro
MS Ministério da Saúde
NaOH Hidróxido de Sódio
NoV Norovírus
Nm Nanômetro
OMS Organização Mundial de Saúde
ORF Open Reading Frame (Região de leitura aberta)
pb Pares de Base
pH Potencial Hidrogeniônico
PBS Phosphate Buffered Saline (Tampão fosfato salina)
PCR Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia de polimerase)
RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism
RNA Ácido Ribonucleico
RNase Ribonuclease
RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia de
polimerase pós-transcrição reversa)
RV Rotavírus
SDS Sodium Dodecyl Sulfate (Dodecil Sulfato de Sódio)
TBE Tris-Borate-EDTA
TEMED Tetramethylethylenediamine (Tetrametiletilenodiamina)
TRIS Hydroxymethyl-aminomethane (Hidroximetil-aminometano)
μL Microlitro
µM Micromol
V Volt
VP Viral Protein
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
15
2 REVISÃO DE LITERATURA
18
2.1
Rotavírus .................................................................................................................... 18
2.1.1
Patogenia, Manifestações Clínicas e Imunidade ............................................... 21
2.1.2
Epidemiologia..................................................................................................... 22
2.1.3
Diagnóstico Laboratorial ................................................................................... 24
2.1.4
Prevenção, Controle e Tratamento .................................................................... 25
2.2
Adenovírus ................................................................................................................. 26
2.2.1
Patogenia, Manifestações Clínicas e Diagnóstico ............................................. 29
2.2.2
Epidemiologia..................................................................................................... 29
2.2.3
Prevenção, Controle e Tratamento .................................................................... 30
2.3
Astrovírus................................................................................................................... 30
2.3.1
Patogenia, Manifestações clínicas e Imunidade ................................................ 32
2.3.2
Diagnóstico Laboratorial ................................................................................... 32
2.3.3
Epidemiologia..................................................................................................... 33
2.3.4
Prevenção, Controle e Tratamento .................................................................... 34
2.4
Norovírus ................................................................................................................... 34
2.4.1
Patogenia, Manifestações Clínicas e Imunidade ............................................... 36
2.4.2
Epidemiologia..................................................................................................... 37
2.4.3
Diagnóstico Laboratorial ................................................................................... 37
2.4.4
Prevenção, Controle e Tratamento .................................................................... 38
2.5
Aichi vírus.................................................................................................................. 38
2.5.1
Epidemiologia..................................................................................................... 40
2.5.2
Diagnóstico Laboratorial ................................................................................... 40
2.5.3
Prevenção, Controle e Tratamento .................................................................... 40
3 OBJETIVOS
41
3.1
Geral ........................................................................................................................... 41
3.2
Específicos ................................................................................................................. 41
4 METODOLOGIA
42
4.1
Área de estudo e pacientes ......................................................................................... 42
4.2
Coleta e transporte ..................................................................................................... 42
4.3
Extração do ácido nucleico ........................................................................................ 43
4.3.1
Preparo das suspensões fecais ........................................................................... 43
4.3.2
Extração do DNA viral ....................................................................................... 43
4.3.3
Extração do RNA viral ....................................................................................... 43
4.4
Detecção inicial das amostras para rotavírus ............................................................. 44
4.4.1
Detecção por ensaio imunoenzimático (ELISA)................................................. 44
4.4.2
Detecção do dsRNA viral em gel de poliacrilamida (EGPA) ............................ 44
4.5 Detecção do adenovírus humano ..................................................................................... 46
4.6 Reação em cadeia de polimerase pós-transcrição reversa (RT-PCR) .............................. 47
4.6.1 Detecção de Rotavírus ............................................................................................. 49
4.6.2 Detecção de Astrovírus ............................................................................................ 49
4.6.3 Detecção de Norovírus ............................................................................................. 49
4.6.4 Detecção de Aichi vírus ........................................................................................... 50
4.6.5 Análise da Reação em cadeia de polimerase pós-transcrição reversa (RT-PCR) .. 50
4.7 Genotipagem de Rotavírus ............................................................................................... 50
4.8 Análise de dados .............................................................................................................. 52
5 RESULTADOS
53
5.1 Detecção e distribuição dos vírus entéricos ..................................................................... 53
5.2 Perfil eletroforético do genoma de rotavírus................................................................... 59
5.3 Genotipagem dos Rotavírus..............................................................................................60
6 DISCUSSÃO
62
7 CONCLUSÃO
69
REFERÊNCIAS
70
APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO..................83
APÊNDICE B - SOLUÇÕES E REAGENTES.......................................................................84
ANEXO A - PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
DO UNICEUMA......................................................................................................................89
ANEXO B - CERTIFICADO DO PRÊMIO DE MELHOR PAINEL DO V SIMPÓSIO DE
MICROBIOLOGIA APLICADA.............................................................................................90
ANEXO C - PUBLICAÇÃO DO RESUMO: DETECTION OF ROTAVÍRUS AND
ADENOVÍRUS IN FECAL SAMPLES FROM CHILDREN HOSPITALIZED IN SÃO
LUÍS, MARANHÃO, BRAZIL. REVISTA HOLOS ENVIRONMENTAL...........................91
ANEXO D - PROTOCOLO DE SUBMISSÃO DE ARTIGO À REVISTA PEDIATRIC
RESEARCH..............................................................................................................................92
ANEXO E – COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DO ARTIGO À REVISTA PEDIATRIC
RESEARCH..............................................................................................................................93
ANEXO F – ARTIGO SUBMETIDO CONFORME AS NORMAS DA REVISTA
PEDIATRIC RESEARCH........................................................................................................94
15
1 INTRODUÇÃO
A doença diarreica constitui um grave problema de saúde pública, pois é
reconhecida pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como uma causa importante de
morbidade e mortalidade infantil em todo o mundo, atingindo pessoas de todas as classes
sociais (SILVA; LIRA; LIMA, 2004; BRYCE et al., 2005). Embora as evidências
demonstrem o declínio nos índices de mortalidade infantil, nessa última década, tais valores
ainda são considerados altos e os índices de morbidade permanecem tão elevados quanto os
observados há 30 anos, principalmente nas regiões menos desenvolvidas do mundo onde
cerca de um quarto das crianças são mal nutridas, mais de um bilhão de pessoas não têm
acesso a água potável e mais de dois bilhões têm saneamento inadequado ou não tem
saneamento básico (KOSEK; BERN; GUERRANT, 2003; SANTOS; SOARES, 2008).
Estima-se que a mortalidade mundial por diarreia na população menor de cinco
anos esteja em torno de 1,87 milhões, o que corresponde a aproximadamente 19% do total da
mortalidade infantil. Alguns países da África e Sudeste Asiático acumulam juntos 78% (1,46
milhões) de todas as mortes por diarreia registradas entre as crianças no mundo todo; e 73%
dessas mortes estão concentradas em apenas 15 países em desenvolvimento (BOSCHIPINTO; VELEBIT; SHIBUYA, 2008). Já nos países desenvolvidos, a importância das
doenças diarreicas está relacionada ao impacto produzido na população, traduzido pelos danos
à saúde, que afetam diretamente o desenvolvimento infantil, bem como a sociedade,
representando um enorme gasto em termos de custos médicos, perdas de dias de trabalho e
escola, gastos com medicamentos, transportes, entre outros (PARASHAR et al., 2006).
No Brasil, apesar dos importantes avanços alcançados na prevenção e no controle
das doenças infecciosas, a doença diarreica aguda continua a ser um dos principais problemas
de saúde pública e um grande desafio para as autoridades de saúde. Em virtude disso, foi
instituído, em 1994, um sistema de vigilância sentinela chamado Monitorização das Doenças
Diarreicas Agudas (MDDA) que é um importante instrumento para o acompanhamento desses
agravos na esfera municipal, cujos objetivos principais são detectar os surtos de forma
precoce e identificar os agentes etiológicos envolvidos. Conforme os dados do Ministério da
Saúde, até março de 2006, a MDDA já havia sido implantada em 78% dos municípios do país
(BRASIL, 2006). Em 2010, foram notificados ao Ministério da Saúde pela MDDA, 4.341.209
casos de diarreia em todo território nacional, dos quais, 1.171.705 foram registrados na região
nordeste do Brasil. Já no Maranhão, de acordo com a Secretaria de Vigilância em Saúde do
16
Estado, foram notificados 74.788 casos de diarreia em crianças menores de 5 anos no ano de
2010, com 10.819 somente em São Luís (BRASIL, 2010).
Geralmente, a diarreia aguda é uma doença autolimitada, isto é, evolui para a cura
espontaneamente, com duração entre 2 a 14 dias, e sua gravidade depende da presença e
intensidade da desidratação ou do tipo de toxina produzida pelo patógeno. É caracterizada por
alterações do volume, consistência e frequência das fezes, mais frequentemente associada
com fezes líquidas e com o aumento no número de evacuações (mais de três episódios por
dia). Frequentemente costuma ser acompanhada de vômitos, febre, cólicas e dor abdominal;
em alguns casos há presença de muco e sangue (THIELMAN; GUEMANT, 2004).
Muitos agentes infecciosos (bactérias, parasitas e vírus) podem ser associados,
mas os vírus são os principais responsáveis por gastroenterites endêmicas e epidêmicas, a
maioria representada por um grupo de rotavírus, os quais provocam infecção em praticamente
todas as crianças nos primeiros 5 anos de vida (GLASS et al., 2006; RIBEIRO et al., 2008).
Porém, outros importantes patógenos virais têm sido associados à infecção diarreica em
crianças, dentre os quais se destacam os norovírus, astrovírus, Aichi vírus e adenovírus
entéricos (MAGALHÃES et al., 2007; VICTORIA et al., 2007A; AMBERT-BALAY et al.,
2008; ANDREASI et al., 2007).
Estes vírus são transmitidos pela via fecal-oral, através de contados íntimos com
pessoas infectadas, ingestão de água e alimentos contaminados e por fômites, com uma dose
infectante extremamente baixa, variando de uma a dez unidades infecciosas. Eles podem
permanecer potencialmente infectantes durante vários meses, resistindo a condições
ambientais adversas e identificados durante todas as estações do ano. Alguns vírus resistem a
processos de tratamento de água e esgoto aplicados no controle bacteriano, inclusive cloração
(TAVARES; CARDOSO; BRITO, 2005).
Clinicamente, não é possível diferenciar as infecções provocadas pelos patógenos
virais, com isso o diagnóstico laboratorial se torna importante para a instituição de medidas de
suporte do paciente com essas infecções, uma vez que não há necessidade de
antibioticoterapia e na maioria das vezes, nem internação, pois não existe tratamento
específico contra esses vírus (CARRARO et al., 2008).
Há muitos testes laboratoriais disponíveis no mercado para a detecção de agentes
virais utilizando métodos enzimáticos para a pesquisa de antígenos virais e com o avanço das
técnicas de biologia molecular e a disponibilidade de dados da sequência de vários sorotipos,
foram desenvolvidos ensaios moleculares de Transcrição Reversa seguida da Reação em
Cadeia de Polimerase (RT-PCR) que empregam primers específicos que permitem em
17
diversas oportunidades, confirmar a presença desses vírus (SDIRI-LOULIZI et al., 2008;
BARLETTA et al., 2009).
Devido ao elevado índice de morbi-mortalidade associada à diarreia causada por
vírus, particularmente rotavírus, ficou evidente a necessidade de medidas urgentes como
desenvolvimento de vacinas, cujo objetivo principal seria à atenuação da gravidade da doença
diarreica (GLASS et al., 2006). Já foram concluídos ensaios clínicos de duas vacinas orais
contra os rotavírus. Uma delas, a Rotatrix®, foi licenciada pela Agência Nacional de
Vigilância Sanitária (ANVISA), em julho de 2005. Em março de 2006, ela foi introduzida no
calendário básico de imunização para crianças brasileiras menores de seis meses de idade,
para proteger antecipadamente as crianças da faixa etária de 6 a 24 meses, nas quais se
observa a maior carga de complicações decorrentes da infecção pelo rotavírus, com
administração de duas doses, com a primeira aos 2 ou 3 meses e a segunda aos 4 ou 5 meses
de idade (BRASIL, 2006; GURGEL et al., 2007).
A pesquisa de enteropatógenos virais envolvidos em casos de doença diarreica
infantil é importante para elucidar a etiologia e fornecer dados que possibilitem intervenções
públicas, no sentido de melhorar a qualidade de vida. A maioria dos estudos no Brasil tem
sido realizada nas regiões norte, centro-oeste e sudeste, sendo escassos os dados na região
nordeste, particularmente no estado do Maranhão. Portanto, a uma lacuna de conhecimentos
na epidemiologia desses vírus que evidenciem a sua importância como agentes etiológicos da
diarreia infantil, não somente para se conhecer a situação em São Luís, Maranhão, mas
também para investigar a sua importância principalmente após a implantação do processo
vacinal para rotavírus.
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Rotavírus
O gênero Rotavirus é um dos nove gêneros da família Reoviridae que apresentam
propriedades morfológicas e bioquímicas em comum. O nome rotavírus deriva da palavra
latina “rota” devido possuírem partículas virais com aparência de roda quando observadas em
microscópio eletrônico (FLEWETT et al., 1975).
A partícula viral quando íntegra mede aproximadamente 75 nm de diâmetro, não
possuem envelope lipídico e o capsídeo de simetria icosaédrica é constituído de três camadas
concêntricas de proteínas: o capsídeo externo, o capsídeo interno e o core que envolve o
genoma viral, o qual é composto de 11 segmentos de fita dupla de RNA (dsRNA). Cada
segmento codifica uma proteína (monocistrônico), com exceção do segmento 11 que codifica
duas proteínas (bicistrônico), NSP5 e NSP6 (KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001;
LUNDGREN; SUENSSON, 2001; MASCARENHAS et al., 2002; JAYARAM; ESTES;
PRASAD, 2004; FAUQUET et al., 2007; SANTOS; SOARES, 2008).
Seis desses segmentos de dupla fita de RNA encontrados no genoma do rotavírus
codificam seis proteínas virais (Viral Protein) que são as VP1, VP2, VP3, VP4, VP6 e VP7,
sendo que as proteínas VP5 e VP8 são originadas por clivagem da proteína precursora VP4.
Os outros cinco segmentos genômicos dão origem a seis proteínas não estruturais (Not
Structural Protein) NSP1, NSP2, NSP3, NSP4, NSP5 e NSP6 que são detectadas nas células
infectadas, mas não nas partículas virais maduras (ESTES, 2001). A estrutura do genoma viral
com a sequência dos segmentos de RNA pode ser visualizada na Figura 1.
19
Figura 1 – Representação esquemática da partícula de rotavírus e seus segmentos, com os respectivos
produtos.
Fonte: GARBAG – CHENON, 2003.
A camada mais interna da partícula viral madura (vírion), denominada de core, é
composta pela proteína VP2, a qual envolve o material genético e interage com as proteínas
VP1 e VP3. As proteínas VP1 e VP3, por sua vez, possuem a capacidade de se ligar ao RNA
e apresentam, respectivamente, as atividades de RNA polimerase-RNA dependente e
guanililtransferase. As proteínas VP1, VP2 e VP3 são codificadas pelos segmentos 1, 2, 3,
respectivamente (KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001; ESTES, 2001; SANTOS;
SOARES, 2008).
A camada intermediária, o capsídeo interno, é constituída da proteína VP6 que é
codificada pelo segmento 6 do genoma viral. O seu antígeno que é detectado em testes
diagnósticos como ELISA (Ensaio imunoenzimático) é usado para caracterizar sete diferentes
grupos de rotavírus de A a G, porém os maiores causadores de diarreia no homem são os
pertencentes ao grupo A, embora integrantes dos grupos B e C sejam também encontrados
20
infectando seres humanos (ESTES, 2001; KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001;
RAMIG, 2004).
A camada externa corresponde ao capsídeo externo e é composta pelas proteínas
VP4, as espículas, que determina o tipo P (de sensível a Protease) e VP7, que determina o tipo
G (G de Glicoproteína), ambas importantes para a infectividade viral, já que a infectividade
da partícula depende da integridade do capsídeo externo, que, por sua vez, depende da
presença de íons cálcio (ESTES, 2001; SANTOS; SOARES, 2008).
A glicoproteína VP7 é o principal constituinte da camada protéica mais externa e
o segundo elemento mais abundante na partícula e é codificada pelos segmentos 7, 8 ou 9,
dependendo da amostra viral (KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001). Essa estrutura
também é responsável pela determinação de sorotipos virais, designados pela letra G
(glicoproteína). Atualmente, são conhecidos 15 sorotipos G, isto pelo fato de apresentar
diferentes determinantes antigênicos, apresentando uma correlação boa entre a sorologia e as
classificações do genoma, com o sorotipo e genótipo designado por um único número (ex.
G1) (FISHER; GENTSCH, 2004; GLASS, 2006; MUNFORD et al., 2007).
Outra proteína presente no capsídeo externo, denominada VP4, é codificada pelo
quarto segmento genômico que apresenta sítios de clivagem para a enzima tripsina,
produzindo os fragmentos VP5* e VP8*, os quais são responsáveis por aumentar a
infectividade da partícula (VAN REGENMORTEL, 2000; KAPIKIAN; HOSHINO;
CHANOCK, 2001). É a proteína de ligação à célula, com papel de internalização do vírus,
porém a sua correlação entre a sorologia e as classificações do genoma são mais difíceis. Até
o momento são conhecidos 15 sorotipos e 27 genótipos P. O sorotipo é designado por
números e o genótipo é expresso em números entre parênteses (ex. P1[8]) (COLUCHI et al.,
2002; MUNFORD et al., 2007; SANTOS; SOARES, 2008).
Como os genes que codificam as proteínas VP4 e VP7 podem se segregar de
maneira independente, várias combinações, entre P e G podem ser detectadas na natureza. No
entanto a combinação G1P[8] é a mais comum identificada em humanos de tal forma que foi
eleita para compor a vacina monovalente Rotarix® (GLASS; PARASHAR, 2006).
As diferentes espécies de rotavírus apresentam um típico padrão eletroforético de
migração de seus 11 segmentos em eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA), o que
permite associar a disposição das bandas às espécies dentro do gênero Rotavirus, já que os
padrões de migração variam em diferentes linhagens dentro de uma mesma espécie. Então a
análise dos perfis eletroforéticos tem sido amplamente utilizada para caracterizar as amostras
21
de rotavírus, com a cocirculação de amostras com perfis diferentes durante uma epidemia
(FAVACHO et al., 2005; GENTSCH et al., 2005).
Observa-se que os segmentos migram em quatro grupos distintos de acordo com a
massa molecular e numerados de 1 a 11 pela ordem de migração no gel: grupo I (genes 1 a 4),
grupo II (genes 5 e 6), grupo III (genes 7 a 9) e finalmente o grupo IV (genes 10 e 11). A
migração desses últimos segmentos define os perfis longo (L), curto (S) e supercurto (SS),
representando um critério útil para a classificação dos rotavírus do grupo A (SANTOS;
SOARES, 2008).
2.1.1 Patogenia, Manifestações Clínicas e Imunidade
A transmissão do rotavírus é feita pela via fecal-oral. No entanto, considerando-se
que a taxa de infecção é extremamente alta em todo mundo, tem-se especulado que a
transmissão pode ocorrer também por via respiratória. O período de incubação da doença
varia de um a três dias e a transmissibilidade se dá com a máxima excreção nas fezes entre o
primeiro e quarto dia do início dos sintomas (ANDERSON; WEBER, 2004; RIBEIRO, 2006;
SANTOS; SOARES, 2008).
Os mecanismos de ação patogênica do rotavírus não são bem definidos. Sabe-se
que a sua replicação produz alterações histopatológicas restritas ao intestino delgado, que são
mais pronunciadas nas porções do jejuno e do íleo, nas células epiteliais maduras (enterócitos)
onde a adsorção do vírus acontece (FERNANDES et al., 2000). Nesses sítios de ocorrência da
multiplicação viral, nota-se hiperplasia das glândulas do intestino associada ao encurtamento,
atrofia e desnudamento das vilosidades intestinais, hipertrofia das criptas, infiltração das
células mononucleadas na lâmina própria, dilatação das cisternas do retículo endoplasmático,
dilatação mitocondrial e escassez das microvilosidades (KAPIKIAN; HOSHINO;
CHANOCK, 2001; ESTES, 2001).
As manifestações clínicas mais frequentes são vômitos, febre, dor abdominal e
desidratação. A infecção é autolimitada e após um período de uma semana a dez dias o quadro
se resolve com a completa recuperação da morfologia, função intestinal e secreção de
anticorpos circulantes. O grande problema é quando a doença está associada à desnutrição ou
a quadros graves de desidratação, ou ainda associada à falta de tratamento adequado, o que
pode levar à morte (ESTES et al., 2001).
22
A severidade da doença parece ser influenciada pela idade do paciente. Em
neonatos, a infecção é assintomática ou resulta numa diarreia branda, possivelmente devido à
proteção dos anticorpos maternos adquiridos através do aleitamento materno. As primeiras
infecções sintomáticas geralmente são mais severas e ocorrem entre os 6 e 24 meses de idade,
com um pico de incidência aos 12 meses. Contudo, em locais onde a exposição é mais intensa
e na ausência do aleitamento materno, a doença pode ocorrer mais cedo. A alta prevalência de
anticorpos anti-rotavírus em adultos sugere que ocorram reinfecções subclínicas, apontando
assim, um papel potencialmente importante dos adultos na transmissão e manutenção dos
rotavírus na natureza (KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001; SANTOS; SOARES,
2008).
A imunidade à infecção parece requerer, pelo menos parcialmente, a presença de
IgA no lúmen do intestino. Estas imunoglobulinas são anticorpos dirigidos contra a proteína
VP6 que podem ser adquiridos de forma ativa ou passiva, com a capacidade de diminuir a
gravidade da infecção, mas não impedem a reinfecção (GLASS et al., 2005). De acordo com
Linhares e Bresser (2000) e Linhares et al (2002), a imunidade de mucosas, mediada pela IgA
secretora, parece desempenhar papel mais relevante do que a imunidade humoral na proteção
contra os rotavírus.
2.1.2 Epidemiologia
A infecção por rotavírus representa a causa mais comum de diarreia grave na
infância em todo o mundo. Ocorrem por ano cerca de 114 milhões de episódios diarreicos, 24
milhões de consultas ambulatoriais e 2,4 milhões de hospitalizações, com a taxa da doença
semelhante em ambos os países desenvolvidos e em desenvolvimento. Em 2008, o
rotavírus foi responsável por quase 400.000 óbitos, e 4% da mortalidade global ocorreu entre
crianças com idades inferiores a 5 anos (CHANDRAN et al., 2010).
Estima-se que de 54 a 55 mil crianças que são hospitalizadas por diarreia,
anualmente nos EUA, menos de 40 morrem pela infecção por rotavírus. No entanto, a
mortalidade é predominante nos países em desenvolvimento onde o acesso aos cuidados é
limitado e os fatores de risco para doença são elevados (CHANDRAN et al., 2010;
OLIVEIRA; MELO; SIMONETTI, 2010). Cerca de 90% dessas mortes ocorrem na África e
Ásia; mais de 100.000 ocorrem na Índia e África subsaariana e 35.000 ocorrem na China,
enquanto que menos de 1.000 mortes por rotavírus ocorrem em países de alta renda
23
(SANTOS; SOARES, 2008; CHANDRAN et al., 2010). A Figura 2 mostra a incidência de
casos de mortes por região do mundo.
Figura 2 - Incidência estimada dos casos fatais de diarreia por rotavírus para cada 100.000
crianças menores de 5 anos.
Fonte: CHANDRAN et al., 2010.
Nos países em desenvolvimento, a idade média da infecção grave está entre 6 a 9
meses, enquanto nos países industrializados está entre 9 a 15 meses. Em contrapartida, as
crianças mais velhas estão protegidas contra a doença grave pela exposição anterior e
infecção aparente e se ocorrer, ela é geralmente leve. Da mesma forma, a doença pode ocorrer
em recém-nascidos e lactentes de 3-4 meses, mas é geralmente leve ou assintomática. As
rotaviroses também mostram uma grande variação sazonal em países de clima temperado de
alta renda, com uma maior ocorrência durante o inverno; enquanto que a sazonalidade é
menos acentuada em países de clima tropical e de baixa renda (FARHAT; CARVALHO;
SUCCI, 2007; CHANDRAN et al., 2010).
Em termos gerais, a frequência de diarreias associadas aos rotavírus variou de
12% a 42% e considerando as médias dos índices de positividade por região, ressalta-se
36,5% para a região norte e 25%, 24%, 22% e 42%, para as regiões nordeste, centro-oeste,
sudeste e sul, respectivamente (LUZ et al., 2005; CARMO, 2006). No entanto, desde que as
vacinas foram
introduzidas em
2006,
houve
uma
redução
global nas
consultas e
hospitalizações causadas por diarreia com as maiores reduções em crianças com idade inferior
a 5 anos, isso pode ser resultado de vacinação e saneamento básico (GURGEL et al., 2009).
24
Devido ao elevado impacto da rotavirose em todo o mundo e ao esforço da
comunidade científica para o desenvolvimento de medidas de prevenção seguras e eficientes,
diversos programas de vigilância epidemiológica tem sido criados com o objetivo de
monitorar a diversidade dos rotavírus que circulam na população (SANTOS; SOARES,
2008).
Os dados publicados até o momento demonstram que os rotavírus do grupo A,
com especificidade G1P[8], G2P[4], G3P[8] e G4P[8], são responsáveis por 92% das
infecções entre humanos. E recentemente, tem sido observado um aumento da incidência de
infecções por rotavírus, com especificidade G9P[8] ou G9P[6]. As infecções por rotavírus dos
grupos B e C em humanos não parecem ser epidemiologicamente importantes, exceto na
China, onde os rotavírus do grupo B estão associados a diversos surtos de diarreia grave,
predominantemente em adultos (SANTOS; SOARES, 2008).
A mais extensa investigação realizada no Brasil, com vistas à caracterização
genotípica do rotavírus, abrangeu nove estados, além do Distrito Federal, e os achados foram
os que seguem: G1[P8]: 43%; G2[P4]: 12%; G3[P8]: 6% e G4[P8]: 6%. Estudo longitudinal
realizado na região norte, no período de 1983 a 1985, também observou que os tipos G1 e G2
prevaleceram com 50% e 30%, respectivamente. Por outro lado, estudo subsequente,
realizado no período de 1992 a 1994, revelou inversão, predominando o tipo G2 com 80%,
seguido do G1 com 20% (MUNFORD et al., 2007; ARAÚJO et al., 2010).
2.1.3 Diagnóstico Laboratorial
A doença diarreica causada pelos rotavírus não gera sintomas característicos e
específicos suficientes para que se possa fechar um diagnóstico apenas com base nas
manifestações clínicas. Isso porque outros agentes etiológicos também causam sintomas de
gastroenterites semelhantes aos causados durante uma infecção por rotavírus, o que torna
imprescindível o diagnóstico laboratorial para a definição do agente causador (ESTES, 2001;
FISCHER; GENTSCH, 2004; ESTES; KAPIKIAN, 2007).
A altíssima concentração de partículas de rotavírus excretadas nas fezes durante a
fase aguda da enfermidade possibilitou a padronização de metodologias rápidas para o
diagnóstico laboratorial feito diretamente a partir de amostras fecais, utilizando técnicas
imunológicas e não imunológicas como o ensaio imunoenzimático (EIE), a aglutinação de
partículas de látex e a EGPA (LUZ et al., 2005; SILVEIRA 2005). Outras técnicas, incluindo
25
microscopia eletrônica, RT-PCR e cultura são usadas principalmente em centros de pesquisas
(CIARLET; ESTES, 2001; MASCARENHAS et al., 2002; LANDAETA et al., 2003).
2.1.4 Prevenção, Controle e Tratamento
Apesar das medidas de higiene se mostrarem pouco eficazes na prevenção da
doença diarreica por rotavírus, algumas medidas são estabelecidas como conduta para o
controle da doença, como o saneamento básico, a utilização de água tratada, o destino
adequado de dejetos, a desinfecção concorrente de superfícies e objetos que entram em
contato com fezes humanas, no entanto, o conceito de que o recurso mais efetivo de profilaxia
das diarréias por rotavírus reside na obtenção de uma imunização eficaz (ESTES et al., 2001;
RIBEIRO, 2006).
A primeira vacina contra rotavírus foi licenciada nos EUA em 1998, nomeada
como RotaShield®. Era uma vacina oral atenuada tetravalente, com rearranjo símio e
humano, contendo os antígenos G1 a G4, aplicada no esquema de três doses aos 2, 4 e 6
meses de idade. Os estudos realizados sugeriram uma baixa reatividade da vacina o que a
tornaria segura para uso em crianças. Porém, em 1999, a vacina foi suspensa, depois que se
encontrou uma associação entre a sua utilização e um tipo raro de intussuscepção intestinal
que é uma forma de obstrução intestinal na qual um segmento do intestino invagina sobre o
outro segmento, localizado mais distalmente, causando obstrução intestinal e compressão
vascular da alça invaginada. Com isso, foram reiniciadas as pesquisas com a finalidade de
desenvolver uma vacina mais segura e eficaz (LINHARES, 2000; GLASS, 2006).
Assim, a GlaxoSmithKline lançou, em 2004, a vacina RotaRix®, que foi testada
principalmente na América Latina, que determinou a segurança da vacina em relação ao risco
de intussuscepção e uma eficácia de 85% até 100% nos casos de gastroenterite grave, além de
reduzir significativamente o número de infecções. É uma vacina monovalente, e tem como
base uma amostra isolada de humano atenuada, com especificidade G1[P8], cepa RIX4414
(BRASIL, 2006; RUIZ-PALACIOS et al., 2006).
Outra vacina, denominada Rotateq®, desenvolvida pela MerkSharpDome, foi
licenciada para comercialização nos Estados Unidos pela FDA (Food and Drug
Administration) em fevereiro de 2006. É uma vacina pentavalente, preparada a partir de
recombinantes de rotavírus de bovino (cepa WC3) e de humanos. Desse modo, cada um dos
vírus recombinantes contém um gene que codifica uma variante da proteína VP7 que confere
imunidade contra os genótipos G1, G2, G3 e G4, além de carregar um gene de vírus humano
26
na forma de P[8] da proteína VP4. É administrada por via oral em três doses, a primeira entre
6 a 12 semanas de idade e as doses subsequentes com 4 a 10 semanas de intervalo (GLASS,
2006). Esta se revelou 94,5% eficaz frente às hospitalizações e consultas nas emergências
relacionadas aos tipos virais G1 a G4, reduziu em 74% as gastroenterites associadas a esses
sorotipos e exibiu níveis protetores de 98% referentes aos episódios graves causados por
rotavírus (VESIKARI et al., 2006).
O tratamento é sintomático, consistindo em reposição de fluídos e eletrólitos
perdidos por vômito e diarreia. Não se recomenda o uso de antimicrobianos, antidiarreicos e
não há terapêutica específica para combater os rotavírus (SANTOS; SOARES, 2008).
Entretanto, uma droga recentemente lançada no mercado, denominada nitazoxanida, com
nome de fantasia Annita®, já em utilização para tratamento de várias parasitoses, tem sido
indicada para tratamento de rotavírus e norovírus. Segundo alguns estudos, essa droga
mostrou ser efetiva na redução do tempo de duração da doença, com atividade anti‐viral
decorrente de um mecanismo de provável atuação na síntese da proteína viral, inibindo a
replicação viral, e podendo reduzir a excreção do vírus (ROSSIGNOL; EL-GOHARY, 2006).
2.2 Adenovírus
Embora os adenovírus humanos sejam mais associados a infecções respiratórias, a
relação entre estes e a doença diarreica tem uma história longa e complicada porque muitos
adenovírus são replicados no intestino e são excretados nas fezes, sem que a doença diarreica
seja observada. No entanto, alguns sorotipos causam gastroenterites e são considerados
relevantes em surtos esporádicos de gastroenterites agudas no mundo afetando jovens e
adultos. Atualmente, os adenovírus entéricos são considerados agentes etiológicos
importantes da doença diarreica infantil em todo o mundo (HORWITZ, 2001; SOARES et al.,
2002).
Os adenovírus entéricos fazem parte da família Adenoviridae e do gênero
Mastadenovírus, constituído de 51 sorotipos humanos classificados em seis espécies de A a F
de acordo com as suas propriedades físico-químicas, imunológicas e bioquímicas. A espécie F
é formada por sorotipos de adenovírus entéricos 40 e 41 que crescem em culturas celulares
(HORWITZ, 2001; JONES, 2007).
As partículas virais são icosaédricas, não possuem envelope lipídico, com
aproximadamente 90 nm de diâmetro. O virion consiste em um capsídio proteico que envolve
um core contendo o DNA viral. O capsídio é constituído de 252 capsômeros, 240 do tipo
27
hexon que formam as 20 faces triangulares do icosaedro e 12 do tipo penton que formam os
vértices do icosaedro (TAVARES; CARDOSO; BRITO, 2005).
O virion possui 11 proteínas, as quais são convencionalmente numeradas
iniciando pelo polipeptídio II a IX, IIIa, µ, TP (proteína terminal) e mais a p53 (protease
viral). Sete desses peptídeos formam o capsídio: o hexon é formado pelo trímero do
polipeptídio II, unido por ligações covalentes. O penton consiste em duas estruturas distintas:
a base que é um pentâmero do polipeptídio III e é responsável por ancorar o penton ao
capsídio. Da base de cada penton projeta-se uma estrutura protéica denominada fibra, um
trímero do polipeptídio IV, que apresenta na sua extremidade sendo uma protuberância que
possui propriedade imunogênica e função de adsorção do vírus à célula hospedeira
(TAVARES; CARDOSO; BRITO, 2005). Os polipeptídios VI, VIII e IX estabilizam as faces
do capsídio e interagem com o hexon na face externa do capsídio. O core da partícula viral
consiste em cinco proteínas: os polipeptídios V, VII, µ, TP e p23 (protease) (Figura 3)
(SANTOS; SOARES, 2008).
Figura 3 – Representação da partícula de adenovírus.
Fonte: SANTOS; SOARES, 2008.
O genoma é composto por DNA de fita dupla, linear e não-segmentado, com
aproximadamente 36.000 pares de bases (pb). Nas extremidades do DNA, há sequências
terminais (3’e 5’) repetidas e invertidas que variam de tamanho de acordo com o sorotipo de
adenovírus. Essas regiões invertidas permitem a circularização da fita simples do DNA viral
28
que formam uma estrutura redobrada, importante para a replicação do genoma (SANTOS;
SOARES, 2008).
A sequência do DNA viral é bastante conservada entre todos adenovírus e
codifica proteínas estruturais, além de proteínas envolvidas na replicação do DNA e
montagem do vírus. O genoma codifica cinco unidades de transcrição iniciais (E1A, E1B, E2,
E3 e E4), três unidades iniciais tardias (IX, Iva2 e E2 tardio) e uma unidade tardia que em seu
processamento, gera cinco famílias de RNA mensageiros tardios (L1 a L5), todos transcritos
pela RNA polimerase II (SHENK, 2001).
O gene E1A codifica duas proteínas (253R e 191R) que ativam a transcrição de
outros genes; E1B codifica duas proteínas que bloqueiam a apoptose. E2 codifica proteínas
que sinalizam para a replicação do DNA, dessa forma na região E2A é codificada uma
proteína, DPB, que se liga a fita simples do DNA e na E2B uma DNA polimerase, além de
uma proteína precursora terminal. Os produtos de E3 modulam a resposta do hospedeiro para
a infecção viral. E4 possui cinco regiões de leitura aberta (ORFs), podendo variar com a
espécie, cujos produtos possuem funções de regulação transcricional, transporte de mRNA,
modulação da replicação do DNA e apoptose celular. As regiões iniciais tardias estabilizam as
interações hexon-hexon e ainda tem função na encapsidação do DNA e os mRNA tardios (L1
a L5) são responsáveis pela produção e montagem dos componentes do capsídeo (Figura 4)
(SHENK, 2001; REDDY et al., 2005).
Figura 4 – Organização genômica de adenovírus humano.
Fonte: DAVISON; BENKO; HARRACH, 2003.
29
2.2.1 Patogenia, Manifestações Clínicas e Diagnóstico
A transmissão dos adenovírus entéricos ocorre pela via fecal-oral, através de água
ou alimentos contaminados (BERK, 2007). E o período de incubação é de aproximadamente 8
dias. Essa infecção está menos associada à febre alta e desidratação do que a doença diarreica
causada por rotavírus, ou seja, caracteriza-se como uma doença branda; vômito e febre são
sintomas que podem preceder ou acompanhar a diarreia (HORWITZ, 2001; SANTOS;
SOARES, 2008).
Uma característica única do adenovírus é que a sua proteína estrutural penton tem
um efeito tóxico sobre as células mas a sua importância na doença não foi esclarecida. A
gastroenterite causada por adenovírus dos sorotipos 40 e 41 produz lesões no trato
gastrointestinal que levam a atrofia das vilosidades e hiperplasia compensatória das criptas,
com subsequente malabsorção e perda de fluidos (SANTOS; SOARES, 2008).
O cultivo celular, além de promover o isolamento viral, apresenta a vantagem de
aumentar a quantidade de partículas virais para posterior identificação por imunofluorescência
(IF), fixação do complemento (FC), inibição da hemaglutinação (HI) e soroneutralização (SN)
(HIERHOLZER, 1995).
A ME tem sido usada para detectar adenovírus tanto de material de cultivo quanto
de espécime clínico, onde se observa a morfologia característica destes agentes (FLEWETT et
al., 1975). A genotipagem das amostras isoladas de espécimes clínicos pode ser feita por
diversos métodos tais como sequenciamento do genoma viral, reação em cadeia de polimerase
(PCR),
digestão
enzimática
do
DNA
total
(RFLP-Restriction
Fragment
Length
Polymorphism) (LI et al., 2005).
2.2.2 Epidemiologia
Em geral, a gastroenterite associada a adenovírus é tão prevalente quanto a
causada por rotavírus e ocorre mais frequentemente em crianças com menos de 4 anos. Em
regiões de clima temperado, a prevalência de adenovírus entéricos é maior. No entanto, em
países de clima tropical, como o Brasil, adenovírus veiculados pela água têm sido detectados
durante todos os meses do ano (SOARES et al., 2002).
Sabe-se que os adenovírus apresentam maior estabilidade na água do que os
outros enterovírus, porém têm sido evidenciados poucos surtos de gastroenterites causados
por adenovírus associados a águas destinadas ao consumo humano (TAVARES; CARDOSO;
30
BRITO, 2005). Entretanto, várias espécies e sorotipos de adenovírus foram encontrados em
águas de instituíções públicas de diversões, incluindo os sorotipos 40 e 41, na região dos
grandes lagos nos EUA (XAGORAKI et al., 2007).
As taxas de adenovírus entéricos isolados de amostras de crianças com diarreia
aguda variam de 1,1% a 12% em todas as partes do mundo com predominância do sorotipo 41
(FUKUDA et al., 2006). No Brasil, pouco se sabe quanto a incidência desse vírus em
associação a quadros de diarreia. Além disso, são poucos os estudos que além de detecção têm
como objetivo a caracterização dos sorotipos isolados, o que ampliaria a visão epidemiológica
da doença. Apesar dessa dificuldade, foi demonstrada a circulação de adenovírus causando
diarreia na população com taxas de incidência aproximada a 4 e 6% (MAGALHÃES et al.,
2007; ANDREASI et al., 2007).
2.2.3 Prevenção, Controle e Tratamento
As boas condições sanitárias e de higiene pessoal ainda são as melhores maneiras
para redução de casos. Até o momento não existe uma vacina contra a infecção entérica por
adenovírus, pois o risco para a população em geral é tão baixo que a vacinação não é uma
proposição viável (HORWITZ, 2001).
O tratamento das infecções entéricas por adenovírus é sintomático. É necessário o
diagnóstico precoce, o acesso rápido aos sistemas de saúde, para que se evite a desidratação
com reposição dos eletrólitos perdidos em decorrência de vômitos e diarreia constantes
(HORWITZ, 2001; DENNO et al., 2005).
2.3 Astrovírus
A primeira evidência da associação de astrovírus com casos de gastroenterite
aguda foi relatada por Appleton e Higgins, em 1975, em maternidade localizada no sul da
Inglaterra, onde observaram, por microscopia eletrônica, a presença de partículas virais
pequenas e sem nenhuma semelhança estrutural com os previamente identificados rotavírus e
norovírus. (SANTOS; CARDOSO, 2005).
Os Astrovírus pertencem à família Astroviridae que está dividida em dois
gêneros: Mamastrovírus e Avastrovírus. O gênero Mamastrovírus compreende todos os
astrovírus de mamíferos: os oito sorotipos de astrovírus humanos e aqueles que acometem
31
suínos, felinos, caninos, bovinos e ovinos. O gênero Avastrovírus engloba astrovírus que
infectam aves como patos, perus e galinhas (vírus da nefrite aviária) (LUKASHOV;
GOUDSMIT, 2000; WALTER; MITCHELL, 2003).
As partículas de astrovírus são esféricas, pequenas, com diâmetro de 28 nm a 30
nm. Não possuem envelope lipídico e são constituídos de capsídios icosaédricos formados por
dois ou três tipos de proteínas (P1, P2 e P3). Apresentam uma morfologia peculiar de estrela
de cinco a seis pontas que é observada somente em 10% das partículas virais quando
visualizadas sob microscopia eletrônica ou quando submetidas a soluções alcalinas
concentradas (SANTOS; SOARES, 2008).
O material genético é composto por uma molécula de RNA de fita simples
(ssRNA), linear de polaridade positiva, com aproximadamente 6.800 nucleotídios,
poliadenilada na sua extremidade 3’. O genoma dos astrovírus é composto por três ORFs,
denominadas ORF1a, ORF1b e ORF2. Cada uma delas codifica pelo menos uma poliproteína
viral (Figura 5) (MENDEZ et al., 2003).
Figura 5 - Representação esquemática do genoma dos astrovírus.
Fonte: SANTOS; SOARES, 2008.
As ORF1a e ORF1b, localizadas próximas à extremidade 5’ do genoma, são
responsáveis pela codificação de uma poliproteína não-estrutural denominada NSP1ab de 160
kDa, a qual é clivada em duas proteínas NSP1a (103 kDa) e exibe uma sequência codificante
para a serina protease viral e uma outra de 57 kDa que apresenta motivos de uma RNA
polimerase-RNA dependente. A ORF2, localizada na terminação 3’ do genoma, codifica as
proteínas estruturais dos astrovírus (MATSUI; GREENBERG, 2001; MENDEZ et al., 2003).
32
2.3.1 Patogenia, Manifestações clínicas e Imunidade
As infecções por astrovírus são transmitidas pela via fecal-oral, geralmente
através do contato pessoa a pessoa ou por água e alimentos contaminados, acometendo uma
variada gama de populações. Entretanto, o grupo populacional mais afetado por essas
infecções são crianças menores de dois anos de idade (SANTOS et al., 2007).
A patogênese ainda não está totalmente esclarecida. No entanto, parece que a
patogênese de astrovírus associados à diarreia em humanos não é de natureza inflamatória e
que não há envolvimento gástrico, apenas células do intestino delgado são atingidas, com uma
extensão maior da infecção nas células do jejuno-íleo se comparadas com o duodeno
(SANTOS; SOARES, 2008).
O período de incubação dos astrovírus varia de um a quatro dias. A enfermidade
causada pelo astrovírus é menos grave do que a causada pela infecção por rotavírus e se
resolve espontaneamente. A infecção produz um quadro de gastroenterite aguda, no qual o
sintoma típico é diarreia aquosa e leve que pode persistir por dois a três dias. Além disso,
outros sintomas como vômito, febre, anorexia e dor abdominal também são ocasionalmente
observados (SANTOS; CARDOSO, 2005).
Os aspectos determinantes na imunidade de astrovírus não são bem
compreendidos. Estudos sugerem que anticorpos adquiridos nos primeiros anos de vida
conferem proteção contra a doença impedindo reinfecções ocasionadas por este agente viral
até a fase adulta do indivíduo e que a imunidade relacionada com esses vírus tende a diminuir
em pessoas com idade mais avançada (MATSUI; GREENBERG, 2001).
2.3.2 Diagnóstico Laboratorial
Os astrovírus eram detectados em amostras fecais por microscopia eletrônica
(ME). Trata-se de um procedimento rápido que não exige partículas virais viáveis, mas requer
alta concentração de vírus no espécime clínico e um microscopista muito bem treinado
(MATSUI; GREENBERG, 2001; RÁCZ, 2004).
O diagnóstico também pode ser feito por ensaios imunoenzimáticos com o
emprego de anticorpos monoclonais ou policlonais detectando antígenos comuns a todos os
sorotipos de astrovírus; e, testes que empregam a aglutinação em látex que são considerados
procedimentos simples, rápidos, menos dispendiosos e com elevados índices de
especificidade, além de também permitirem a análise de grande número de amostras. Esses
33
testes, quando comparados à técnica de ME, revelam ser mais sensíveis e específicos
(KOMORIYA et al., 2003; SANTOS; CARDOSO, 2005).
O desenvolvimento de técnicas moleculares como RT-PCR permitiram um grande
avanço na detecção e na caracterização do genoma desses agentes por serem métodos bastante
sensíveis e específicos do que os testes imunoenzimáticos comerciais, embora seja vulnerável
à contaminação de seus produtos e à presença de agentes inibidores que podem produzir
resultados falso-negativos (TAI et al., 2003; GRIMM et al., 2004). Alguns pesquisadores
utilizam regiões conservadas da ORF1a como região alvo, outros grupos utilizam
oligonucleotídeos para uma região relativamente conservada dentro da região variável do
gene do capsídio que pode ser sequenciada para determinação do genótipo de astrovírus
(SANTOS; SOARES, 2008).
2.3.3 Epidemiologia
Os astrovírus são reconhecidos como uma das causas mais comuns de
gastroenterite viral em crianças em todo mundo. Geralmente, a faixa etária em que mais se
observa infecção por este agente viral é a de crianças com menos de 5 anos de idade,
conforme já foi demonstrado em estudos realizados em vários países (DE GRAZIA et al.,
2004; GIORDANO et al., 2004). Estudos de soroprevalência também têm demonstrado que
até 90% das crianças nesta faixa etária já foram infectadas por este enteropatógeno
(MITCHELL, 2002).
Estudos realizados em países asiáticos demonstraram índices de detecção que
variaram de 4 a 11%, enquanto que em países do continente europeu a estimativa foi de 3% a
7%. Já na América Latina, segundo alguns estudos realizados, a ocorrência de astrovírus
variou de 4% a 17% (OH; GAEDICKE; SCHREIER, 2003; ESPUL et al., 2004; DE
GRAZIA et al., 2004; LIU et al., 2004; PHAN et al., 2004).
No Brasil, há poucos trabalhos descrevendo o papel dessa infecção. Até o ano de
2001, os poucos trabalhos que foram publicados utilizaram a microscopia eletrônica como
método de detecção, com uma taxa de detecção em torno de 2 a 5% (SILVA et al., 2001).
Com o advento de métodos mais sensíveis como os ensaios imunoenzimáticos as taxas
encontradas podem chegar a 9% de detecção. E com o emprego de técnicas moleculares a
importância dos astrovírus como agentes etiológicos de gastroenterite infantil só foi
reafirmada (SANTOS; SOARES, 2008).
34
A sazonalidade das infecções atribuídas a astrovírus parece variar de acordo com
a região geográfica. Os picos de incidência da doença ocorrem no inverno nas regiões
temperadas e nas estações chuvosas nos países tropicais (CARDOSO et al., 2002; GUIX et
al., 2002).
Apesar do sorotipo 1 (HastV-1) ser o tipo mais prevalente em vários países,
inclusive no Brasil, outros sorotipos também circulam na população, tendo sido já descritos os
sorotipos de 2 a 5 e 8 (SILVA et al., 2001; CARDOSO et al., 2002; DALTON et al., 2002;
DE GRAZIA et al., 2004).
2.3.4 Prevenção, Controle e Tratamento
As medidas que visam prevenir e controlar epidemias de gastroenterite viral
associada à astrovírus devem ter como foco a interrupção da transmissão por meio de ações
como: saneamento básico, boas práticas de higiene pessoal reforçadas em hospitais, creches e
controle de indivíduos que sejam manipuladores de alimentos, já que os astrovírus podem
começar a ser excretados pelas fezes um dia antes do surgimento da diarreia (MATSUI;
GREENBERG, 2001; WALTER; MITCHELL, 2003). Medidas efetivas e apropriadas de
isolamento de crianças que apresentem quadros diarreicos severos, assim como de pacientes
imunocomprometidos, são fundamentais para a prevenção de infecções nosocomiais
(MITCHELL, 2002).
Geralmente, a gastroenterite causada pelos astrovírus, não requer na maioria dos
casos, a utilização de uma terapia específica, a não ser em pacientes que ficam desidratados,
nos quais a reposição de eletrólitos e fluidos perdidos durante a doença se faz necessário
(MATSUI; GREENBERG, 2001; MITCHELL, 2002; WALTER; MITCHELL, 2003).
2.4 Norovírus
Estudos que utilizavam a imunoeletromicroscopia, em 1972, observaram uma
partícula viral pequena que foi relacionada com a doença ocorrida em 1968 na escola de
Norwalk, semelhante à síndrome descrita por Zahorsky em 1929, a qual foi denominada
agente Norwalk (LOPMAN; BROWN; KOOPMANS, 2002).
No entanto, somente em 1990, com a clonagem e caracterização do genoma do
vírus Norwalk é que ele foi caracterizado como membro da família Caliciviridae. Essa família
é composta por cinco gêneros: Norovírus, Lagovírus, Sapovírus, Vesivírus e Nebovírus. Os
35
vírus dos gêneros Lagovírus, Vesivírus e Nebovírus são até o momento, exclusivo de animais,
enquanto que os vírus dos gêneros Sapovírus e Norovírus, infectam principalmente seres
humanos (SANTOS; SOARES, 2008). Os norovírus são divididos em 5 genogrupos
geneticamente distintos (GI, GII, GIII, GIV e GV), com pelo menos 31 genótipos. Os
genogrupos GI e GII e GIV infectam humanos, com a predominância dos genogrupos GI e
GII. Os animais são infectados pelos genogrupos GIII (suínos e bovinos) e GV,
encontrando‐se GIV em cães (ATMAR; ESTES, 2006; VICTORIA et al., 2007B).
As partículas de norovírus apresentam cerca de 27-40 nm de diâmetro, capsídio de
simetria icosaédrica, não contém envelope lipídico e possuem material genético composto por
uma molécula de RNA fita simples, linear, de polaridade positiva poliadenilada com
aproximadamente 7,6 kb (ATMAR; ESTES, 2006).
O genoma é organizado em três ORFs distintas: a ORF1 codifica uma poliproteína
não estrutural de 1738 aminoácidos (aa) com um peso molecular de 193,5 kD. Essa
poliproteína contém regiões similares às proteínas 2C (helicase), 3C (cisteíno-protease) e 3D
(RNA polimerase-RNA dependente) dos picornavírus; a ORF2 codifica a proteína do capsídio
(VP1), com 530 aa (56,6 kD); a ORF3 considerada a região mais variável do genoma,codifica
uma proteína estrutural menor de 212 aa (22,5 kD) que está associada à estabilidade da VP1 e
possivelmente têm as funções de encapsidação do RNA viral e de regulagem da montagem do
vírus (Figura 6) (GLASS et al., 2000; GREEN et al., 2000).
Figura 6 – Representação esquemática do genoma dos norovírus.
Fonte: SANTOS; SOARES, 2008.
36
2.4.1 Patogenia, Manifestações Clínicas e Imunidade
Sobre a patogênese da infecção por norovírus, sabe-se que é proveniente de
estudos em voluntários. Com base nesses estudos, a infecção é autolimitada, com duração dos
sintomas de 24 a 48 horas, precedidos de um período de incubação semelhante (TAVARES;
CARDOSO; BRITO, 2005). São transmitidos primariamente por via fecal‐oral, por consumo
de água ou alimentos contaminados com fezes humanas (principalmente crustáceos), ou
diretamente disseminados de pessoa para pessoa. Contaminação ambiental por esgotos ou de
objetos que podem ser levados à boca também são fontes de infecção. Aerossóis gerados
durante os episódios de vômitos podem contaminar as superfícies ou alcançarem a mucosa
oral e serem engolidas explicam a rápida disseminação em hospitais e intradomicílios
(SANTOS; SOARES, 2008).
O sítio primário de replicação no homem não é bem conhecido, mas com base em
estudos da biópsia intestinal de voluntários, na fase aguda da doença, a mucosa intestinal
apresentou anormalidades como achatamento e alargamento das vilosidades do intestino
delgado, desorganização das células epiteliais e infiltração da lâmina própria por células
mononucleares. Observou-se também uma dilatação do retículo endoplasmático liso e rugoso
com concomitante aumento no número de corpos multivesiculados. Houve também um
decréscimo significativo da atividade enzimática condizentes com a lesão histológica
transitória descrita anteriormente que voltou ao normal após a recuperação (BORGES;
CARDOSO, 2005; SANTOS; SOARES, 2008).
A doença é caracterizada por náusea, vômito, diarreia, dores epigástrica e
abdominal. Podem ocorrer também dores musculares, sensação de fadiga, cefaleia e febre
baixa. Um alto percentual de casos pode apresentar apenas vômitos, frequentemente muito
intensos. Embora esses sintomas sejam vistos em pacientes de todas as faixas etárias, o
vômito é mais frequente entre as crianças e a diarreia, entre adultos. Estudos mostram que em
30% das infecções os casos são assintomáticos (CHRIS, 2003; ATMAR et al., 2008).
Todos os indivíduos são susceptíveis. Mecanismos de imunidade não são claros, e
ocorrem reinfecções, devido inclusive, à grande variedade genética. Observa‐se uma curta
imunidade por um período de 14 semanas. Níveis de anticorpos pré‐existentes ao norovírus
não indicam o grau de susceptibilidade ou resistência (ATMAR; ESTES, 2006).
37
2.4.2 Epidemiologia
Os norovírus têm sido descritos como importantes agentes etiológicos de
gastroenterite aguda em todos os países estudados. São responsáveis por grandes surtos
epidêmicos de gastroenterite não-bacteriana, acometendo pessoas de todas as idades, uma
característica que os distingue de outros vírus causadores de gastroenterite, como os rotavírus,
adenovírus e astrovírus que infectam preferencialmente crianças de até 5 anos de idade
(GLASS et al., 2000).
A gastroenterite causada por infecções por norovírus é descrita como uma
síndrome que apresenta um perfil sazonal bem definido, ocorrendo nos meses mais frios do
ano (MOUNTS et al., 2000). Porém, Loopman et al., em 2004, em estudo desenvolvido na
Europa, observaram uma sazonalidade de uma amostras mutante do GII, que foi detectado
pela primeira vez em janeiro de 2002, com um pico atípico na primavera.
Estudos de surtos e casos esporádicos no mundo todo revelam taxas de incidência
de norovírus muito variadas, dependendo do país, da população estudada e dos métodos de
detecção utilizados. De 1999 a 2008, entre o total de surtos de doenças de transmissão hídrica
e alimentar (DTA) notificados em São Paulo, foram diagnosticados apenas 3 surtos (0,1%)
por norovírus, com 254 (9,4%) casos identificados a partir da padronização e implantação da
técnica de RT‐PCR no Instituto Adolfo Lutz (IAL) para diagnóstico do norovírus (MORILLO
et al., 2008). Já Ribeiro et al., 2008, através da mesma técnica de RT-PCR, observaram um
percentual de 39,7% de norovírus em amostras fecais de crianças com gastroenterite aguda
hospitalizadas na cidade de Vitória, Espírito Santo, entre julho de 2004 a novembro de 2006.
Por outro lado, os dados epidemiológicos das infecções por norovírus mostram
que apesar de ocorrer a cocirculação de genogrupos, o genogrupo II é predominante na
Europa e no resto do mundo (BUESA et al., 2002).
2.4.3 Diagnóstico Laboratorial
O diagnóstico laboratorial hoje em uso compreende tanto ensaios moleculares
quanto não moleculares. Dentre os ensaios não moleculares, tem-se a microscopia eletrônica,
a imunomicroscopia eletrônica, o radioimunoensaio e o ensaio imunoenzimático (ATMAR;
ESTES, 2001; KOOPMANS et al., 2002; RICHARDS et al., 2003).
No entanto, esses testes são menos efetivos em função da diversidade molecular
desses vírus o que leva a uma baixa detecção de antígenos e à necessidade de um painel de
38
antissoros hiperimunes para múltiplos tipos antigênicos dos calicivírus humanos (GUO et al.,
2000).
Desde a década de 90, com a disponibilidade de técnicas moleculares de
amplificação, sequenciamento e expressão genômica, tem sido possível a caracterização
genômica e antigênica dos calicivírus humanos. O ensaio de hibridização e a RT-PCR têm
sido os métodos mais utilizados para detecção de genoma de calicivírus em amostras clínicas
e ambientais. Em comparação com os EIE, a RT-PCR e suas variações é muito mais sensível
e mais rápida, e ainda é usada para identificação dos genogrupos de norovírus (TRUJILLO;
MCCAUSTLAND; ZHENG, 2006).
2.4.4 Prevenção, Controle e Tratamento
A fonte primária mais comum dos surtos tem sido a água, tais como a água de
abastecimento de cidades, lagos, piscinas, água armazenada por navios, etc. Por isso conhecer
a origem da contaminação dos alimentos tem sido importante para a prevenção e controle das
infecções por norovírus. Frutas, verduras, legumes e frutos do mar, ingeridos crus ou mal
cozidos, são frequentemente implicados em surtos de origem alimentar, por isso cuidados
especiais devem ser tomados para o processamento higiênico de alimentos (LOPMAN et al.,
2004).
O principal tratamento para as gastroenterites virais consiste de hidratação e
reposição de eletrólitos, por meio de sais orais ou soro caseiro, e hidratação endovenosa nos
casos mais graves. Não há vacina para prevenir o norovírus, assim como não há um
medicamento específico desenvolvido para este vírus (SANTOS; SOARES, 2008).
2.5 Aichi vírus
O Aichi vírus foi isolado pela primeira vez em 1989 a partir de uma amostra de
fezes de um paciente com gastroenterite não bacteriana associada ao consumo de ostras na
província de Aichi, no Japão (YAMASHITA et al., 1991). Em 1993, Yamashita e
colaboradores relataram que no Japão, 32% das amostras de fezes coletadas em um surto de
gastroenterite apresentaram antígenos específicos do vírus, sugerindo que infecções com este
agente são bastante frequentes (YAMASHITA et al., 1993). O vírus também foi isolado de
crianças paquistanesas e de turistas que retornaram de países do Sudeste Asiático,com
sintomas de gastroenterite (YAMASHITA et al., 1995). Desde então, estes vírus foram
39
associados com casos de gastroenterite em adultos e crianças em diferentes países da Europa,
Norte da África e América do Sul (OH et al., 2006; LE GUYADER et al., 2008; SDIRILOULIZI et al., 2008).
É um membro do gênero Kobuvírus da família Picornaviridae. Quando
examinado por microscopia eletrônica é morfologicamente semelhante aos astrovírus:
pequeno, redondo, sem envelope com cerca de 30nm de diâmetro. Seu genoma consiste de
uma molécula de RNA fita simples de sentido positivo de 8.280 nucleotídeos e uma
extremidade de poliadenilada. A única grande ORF codifica uma poliproteína de 2.432
aminoácidos que é clivada resultando nas proteínas estruturais VP0, VP3, VP1, e nas
proteínas não estruturais 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C e 3D do típico picornavírus (YAMASHITA
et al., 1998; SASAKI et al., 2001).
Com base na análise filogenética da sequência de 519 pb na junção 3C-3D (3CD)
de 17 isolados, Yamashita et al. (2000) propuseram que o Aichi vírus pode ser dividido em
dois genótipos A e B, com homologia de aproximadamente 90%. Recentemente, um terceiro
genótipo (C) foi proposto. A análise filogenética de 13 cepas de Aichi vírus usando uma
sequência do gene VP1 de 699 pb mostrou uma boa correlação com o sistema de classificação
3C/3D, apoiando a proposta do terceiro genótipo (AMBERT-BALAY et al., 2008).
A presença do Aichi vírus em amostras pediátricas e em um surto, não associados
com o consumo de ostras, pode significar que o Aichi vírus poderia ser transmitido por outras
vias além do consumo de ostras (YAMASHITA et al., 2000; OH et al., 2006; PHAM et al.,
2007; AMBERT-BALAY et al., 2008).
Reuter et al. (2009) propôs duas hipóteses possíveis: 1) infecção por Aichi vírus pode
ser geralmente assintomática, e 2) a infecção por Aichi vírus é sintomática, mas também é
associada a outros sintomas, em vez de só gastroenterite, porém mais estudos devem ser
realizados para que se possa avaliar o significado clínico desses vírus.
A alta prevalência de anticorpos contra Aichi vírus na população em comparação
com a taxa de detecção em casos de gastroenterite levanta questões sobre a etiologia,
virulência e patogenicidade de Aichi vírus em gastroenterite sintomática (OH et al., 2006;
AMBERT-BALAY et al., 2008; REUTER et al., 2009). E embora o Aichi vírus seja detectado
em casos esporádicos de gastroenterite em adultos, acredita-se que a exposição ao vírus
ocorre principalmente durante a infância, com soroprevalência de anticorpos contra Aichi
vírus aumentando com a idade (YAMASHITA et al., 1993; YAMASHITA et al., 2000; OH et
al., 2006).
40
2.5.1 Epidemiologia
Pouco se sabe sobre a epidemiologia do Aichi vírus, pois poucos estudos sobre a
soroprevalência de anticorpos têm sido realizados para avaliar a importância epidemiológica
do vírus. No entanto, no Japão, o uso do ELISA mostrou a presença do vírus em 18,8% dos
pacientes adultos envolvidos em surtos de gastroenterite. Em outro estudo o RNA viral foi
detectado por RT-PCR em 20,5% dos adultos japoneses envolvidos em surtos de
gastroenterite. Na Alemanha, o Aichi vírus foi detectado em amostras de fezes de pacientes
envolvidos em um surto. Este vírus também foi isolado de casos esporádicos de gastroenterite
em crianças e adultos em países asiáticos e no Brasil (YAMASHITA et al., 1993;
YAMASHITA et al., 1995; YAMASHITA et al., 2000; OH et al., 2006).
2.5.2 Diagnóstico Laboratorial
Até agora, a maioria dos estudos tem utilizado a RT-PCR para a detecção do RNA
de Aichi vírus. Os primers para a RT-PCR são desenhados na junção 3C/3D do genoma do
Aichi vírus. O par de primers 6261-6779 produz um fragmento de DNAc de 519 pb que
também é usado para genotipagem molecular das cepas de Aichi vírus (YAMASHITA et al
2000).
2.5.3 Prevenção, Controle e Tratamento
Saneamento básico e boas práticas de higiene pessoal são as principais medidas de
prevenção e controle das infecções gastrointestinais e no caso das infecções causadas por
Aichi vírus, já foram descritos surtos epidemiológicos de Aichi vírus associados à ingestão de
ostras, portanto esse tipo de alimento deve ser bem cozido e preparado com cuidado, uma vez
que são capazes de concentrar microrganismos patogênicos, especialmente quando extraído
ou cultivado em regiões costeiras contaminadas por esgotos (YAMASHITA et al., 1995;
TAVARES; CARDOSO; BRITO, 2005).
Nenhum tratamento específico é necessário, a não ser em pacientes que ficam
desidratados, nos quais a reposição de fluidos e eletrólitos perdidos durante a doença se faz
necessário, por meio de sais orais ou soro caseiro (SANTOS; SOARES, 2008).
41
3 OBJETIVOS
3.1 Geral
Detectar a presença de rotavírus, adenovírus, astrovírus, norovírus e Aichi vírus
em amostras de fezes de crianças com ou sem gastroenterite aguda, menores de 5 anos de
idade, em São Luís - MA.
3.2 Específicos
 Avaliar a incidência dos vírus entéricos em crianças atendidas em postos localizados
na comunidade do bairro da Cidade Olímpica e em dois hospitais públicos de São
Luís - MA;
 Investigar a ocorrência de sazonalidade das infecções causadas por vírus entéricos
em relação à pluviosidade no período estudado;
 Caracterizar as amostras positivas de rotavírus quanto ao seu fenótipo e genótipo.
42
4 METODOLOGIA
4.1 Área de estudo e pacientes
O estudo foi realizado na área metropolitana de São Luís, capital do Estado do
Maranhão, que possui uma população estimada em 966.989 habitantes em uma área de
827km2 (IBGE, 2010). O clima é tropical, quente e úmido, com uma pluviosidade total
durante o período de estudo de 4.060 mm (variando de 0,2 a 484 mm por mês). Possui apenas
duas estações, uma de chuvas (Janeiro a Junho) e outra de seca (Julho a Dezembro). As
temperaturas médias variaram entre de 24 oC a 29 ºC e com umidade relativa do ar alta
durante todo ano geralmente superior a 80% (Dados fornecidos pelo Laboratório de
Meteorologia da Universidade Estadual do Maranhão).
Foram analisadas, entre maio de 2009 e maio de 2011, 131 amostras fecais de
crianças menores de cinco anos de idade, atendidas em postos da pesquisa, localizados em
dois Hospitais Públicos de São Luís e na comunidade do bairro da Cidade Olímpica. No
momento de cada coleta os responsáveis preencheram uma ficha de identificação com
informações pessoais e clínicas do paciente e assinaram um termo de consentimento livre e
esclarecido (APÊNDICE A), aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do UNICEUMA
(Nº do parecer consubstanciado: CEP 00559/09 – ANEXO A), concordando com a
participação das crianças na pesquisa. Foi estabelecido como caso de diarréia todas as
crianças que apresentaram três ou mais evacuações de fezes não formadas em um período de
24 h, até sete dias e foram incluídas como controle crianças que não tinham apresentado
distúrbios no trato intestinal nos últimos 30 dias que foram examinadas em razão de outros
motivos, que não eram distúrbios gastrointestinais.
4.2 Coleta e transporte
As amostras fecais foram coletadas em um recipiente plástico estéril e
transportadas em recipiente isotérmico, sob refrigeração, ao Laboratório de Microbiologia
Médica do UNICEUMA, aonde as mesmas foram devidamente registradas, rotuladas e
mantidas estocadas a -20 ºC até o momento da análise.
43
4.3 Extração do ácido nucleico
4.3.1 Preparo das suspensões fecais
Foram preparadas suspensões fecais de 10-20% das fezes semi-sólidas e 50% das
fezes líquidas em tampão fosfato salina (PBS) pH 7,4. Centrifugadas por 10 minutos a 3500 x
g (5500 rpm) e o sobrenadante estocado a -20 ºC até o momento do uso (SANTOS et al.,
2008).
4.3.2 Extração do DNA viral
Para a extração do DNA do adenovírus, 100 μL da suspensão foram colocadas em
tubo de microcentrífuga com água estéril (1 ml) e deixadas por 8 a 10 min em água em
ebulição. Em seguida estocados a -20 ºC até a análise.
4.3.3 Extração do RNA viral
O RNA viral (rotavírus, astrovírus, norovírus e Aichi vírus) foi extraído das
suspensões fecais seguindo o protocolo do kit QIAamp viral RNA (Qiagen), com todas as
etapas realizadas na capela de fluxo laminar.
Alíquotas de 140 µL de cada suspensão fecal foram adicionadas em um tubo de
microcentrífuga com 560 µL de tampão RNA Carrier-AVL. Cada tubo teve seu conteúdo
homogeneizado e a mistura incubada a temperatura ambiente (15º-25 ºC) por 10 min. Em
seguida, adicionou-se 560 µL de etanol absoluto e transferida 630 µL dessa mistura para uma
mini coluna (QIAamp). Após centrifugação a 6000 x g (8000 rpm) por 1 min, descartou-se o
filtrado coletado em tubo coletor e esse procedimento se repetiu por mais duas vezes. Para a
lavagem do RNA adicionou-se à mini coluna 500 µL de tampão AW1. Repetiu-se a mesma
centrifugação, descartando o filtrado. Logo após, adicionou-se 500 µL de tampão AW2
centrifugando a velocidade máxima por 3 min e desprezou-se novamente o filtrado. Para
eluição do RNA, adicionou-se à mini coluna 60 µL de tampão AVE e centrifugou-se a 6000 x
g (8000 rpm) por 1 min. O filtrado coletado em um tubo Eppendorf foi armazenado a -20 ºC.
44
4.4 Detecção inicial das amostras para rotavírus
Para a detecção inicial dos rotavírus, as amostras foram submetidas à técnica de
ELISA sandwich e a EGPA.
4.4.1 Detecção por ensaio imunoenzimático (ELISA)
Foram preparadas suspensões fecais a 10% em tampão de diluição de amostras,
conforme recomendações do fabricante do kit RIDASCREEN® (R-Biopharm). Estas foram
clarificadas por centrifugação a 3000 xg (5000 RPM) por 5 min. A seguir, adicionaram-se nos
poços da microplaca (poços sensibilizados com anticorpos monoclonais contra a proteína do
capsídeo do rotavírus -VP6), as suspensões fecais a serem testadas, os controles positivos e os
negativos. Nesta mesma etapa foi adicionado o conjugado (anticorpo monoclonal antirotavírus, conjugado com peroxidase). A reação foi revelada com a solução substrato,
composta pelo cromógeno tetrametilbenzidina (TMB) e pelo peróxido de hidrogênio (H2O2).
E quando apareceu uma tonalidade azul no controle positivo, a reação foi interrompida pela
adição do reagente bloqueador (ácido sulfúrico 1N), que mudou a cor azul para amarelo. A
leitura foi feita visualmente e por medida de densidade ótica (DO) em leitor
espectrofotômetro (PR2100 da BioRad), utilizando filtro simples no comprimento de onda de
450nm. As amostras foram consideradas positivas para rotavírus quando apresentaram DO
maior que o valor do ponto de corte (cut-off), calculado de acordo com a fórmula (valor de
absorbância do controle negativo + 0,15), respeitando uma margem de erro de 10%.
4.4.2 Detecção do dsRNA viral em gel de poliacrilamida (EGPA)
As amostras positivas para rotavírus foram submetidas à EGPA para a obtenção
dos perfis eletroforéticos de migração do dsRNA viral e realização do estudo fenotípico dessas
amostras, de acordo com a metodologia descrita previamente por Herring et al. (1982) e
Costa, Candeias e Capeletti (1990), com algumas modificações.
45
Montagem da placa vertical e preparação do gel de poliacrilamida
As placas de vidro para géis foram limpas com detergente, seguida de uma
solução de álcool a 70% e água destilada e então montadas, separadas por espaçadores de 0,75
mm dando forma ao gel.
Para preparação de um gel de 7,5% foram utilizadas (APÊNDICE B):
 2,4 ml de água destilada;
 1, 25 ml de Tris-HCL 1,5 M em pH 8,8;
 50 µl de SDS (dodecil sulfato de sódio) a 10%
 1,25 ml de acrilamida/bis 30%;
 50 µl de persulfato de amônia (PA) 10%
 5 µl de TEMED (tetrametiletilenodiamina);
As soluções foram adicionadas nessa ordem, homogenizadas e imediatamente
vertidas até a borda do vidro menor, sem formar bolhas. Um pente de 0,75 mm de espessura
com dez dentes foi colocado entre as placas de vidro para a formação de canaletas, para a
aplicação das amostras. Deixando o gel polimerizar por 30 min.
Tratamento das amostras
Após esse período, 20 µL da amostra foi diluída em 20 µL do tampão de
tratamento das amostras (TTA), (água destilada, Tris-HCl pH 6,8, glicerol, SDS 10%, 2-β
Mercaptoetano, azul bromofenol 1%), seguida de homogenização e posterior incubação a
56ºC por 10 min e imediata aplicação em gel de poliacrilamida.
Eletroforese das amostras
Na sequência, foi retirado o pente e adicionado 20 μL de cada amostra em cada
canaleta do gel. Depois de todas as amostras colocadas, a fonte de energia foi ligada, e as
amostras corridas em tampão de corrida Tris/Glicina 1X com uma voltagem em torno de 60V80V e 30 mA. Após a saída do corante azul de bromofenol do gel, a fonte foi mantida ligada
46
por mais 1h para finalizar a corrida de eletroforese, com um tempo total de aproximadamente
5-6 horas.
Coloração do gel com nitrato de prata
Após a eletroforese, as placas foram retiradas da cuba e o pente removido
cuidadosamente para não causar danos ao gel e então às placas foram separadas. Fez-se uma
pequena marcação no gel recém retirado para que se pudesse identificar a ordem em que as
amostras foram adicionadas nas caneletas. Em seguida, transferido para um recipiente que
continha uma solução fixadora (etanol 10% e ácido acético 0,5%), agitando-o por 30 minutos.
A seguir, o gel foi submetido à coloração de nitrato de prata 0,01 M de acordo com Herring et
al. (1982) por mais 30 min, com agitações periódicas. Desprezou-se a solução corante e o gel
foi lavado com 500 mL de água destilada e remanejado para uma solução reveladora de
hidróxido de sódio (NaOH) 0,75 M e formaldeído 0,95%. Após o aparecimento das bandas a
revelação foi interrompida com a solução fixadora.
Secagem e Conservação do gel
Após esse procedimento, o gel foi desidratado. Duas folhas de celofane foram
embebidas no álcool 20%, uma das folhas de celofane foi usada para recobrir uma placa de
vidro, com o gel colocado sobre ela e sobre o gel foi colocada a outra folha de celofane. O gel
corado foi identificado, lido em um transluminador de luz branca e fotografado com câmara
digital para posterior análise.
4.5 Detecção do adenovírus humano
A detecção do adenovírus humano através da PCR foi realizada conforme
procedimento descrito por Allard, Albinsson e Wadell (2001): 0,6 µL de cada primer (0,5
μM) (Tabela 1), 2 µL MgCl2 (3 mM), 2,5 µL dNTPs (0,2 mM), 0,2µL Taq DNA polimerase
(5u/µL), 5 µL do tampão de reação 5X para um volume final de 25 μL com 7,5 μL do DNA.
Em cada reação foi utilizado água estéril como controle negativo e uma amostra
reconhecidamente positiva para adenovírus foi empregada como controle positivo. As
amostras foram amplificadas utilizando o termociclador (Mycycler Thermal Cycler – BioRad)
47
nas seguintes condições: um ciclo a 94 ºC por 3 minutos, 35 ciclos a 94 ºC por 30 segundos,
55 ºC por 30 segundos e 72 ºC por 1 minuto e um ciclo final a 72 ºC por 5 minutos.
O produto amplificado foi verificado através de eletroforese a partir de gel de
agarose a 1,5% usando como corante o azul de bromofenol e como tampão de corrida o
Tri/Borato/EDTA (TBE) 0,5X. Após a corrida, as amostras foram coradas com brometo de
etídeo na concentração de 10 mg/mL de água e em seguida, o gel foi visualizado em
transluminador UV e fotodocumentado com câmara digital. Como padrão de peso molecular
em cada corrida eletroforética, foi utilizado o DNA ladder de 100 pb e 50 pb (Promega).
4.6 Reação em cadeia de polimerase pós-transcrição reversa (RT-PCR)
A reação de RT-PCR foi feita conforme a recomendação do fabricante do kit
Qiagen OneStep RT-PCR (Qiagen), onde a transcrição reversa e a PCR foram realizadas de
forma sequencial no mesmo tubo. Todos os componentes necessários para ambas às reações
foram adicionados durante o procedimento, utilizando os primers específicos para cada
agente, citados na Tabela 1, com exceção dos primers para adenovírus.
A reação foi realizada em 25 μL da mistura de reação contendo 11,5 μL de água
estéril, 5 μL do tampão 5X, 1 μL da mistura de dNTPs (0,4 mM), 1 μL do mix de enzimas,
especialmente formulada tanto para a transcrição reversa e amplificação por PCR, 0,75 μL de
cada primer (0,6 mM), e 5 μl do RNA extraído.
Entretanto antes de se adicionar o mix de enzimas, essa mistura foi submetida à
temperatura de 97 °C por 5 minutos para desnaturação do RNA dupla-fita viral (dsRNA) do
rotavírus e a 80 ºC por 10 minutos para desnaturação do RNA fita simples (ssRNA) dos
outros enterovírus pesquisados (GOUVEA et al., 1990; NOEL et al.,1995).
Logo depois, os tubos de reação foram transferidos para banho de gelo por 5 min.
Em seguida, foi adicionado 1µL do mix de enzimas e então levados ao termociclador
(Mycycler Thermal Cycler – BioRad) e as condições de reação foram constituídas por uma
etapa de transcrição reversa, a 50 °C por 30 min, seguido por uma etapa inicial de
desnaturação do DNAc a 95 ºC por 15 min onde ocorreram também a inativação das
transcriptases reversas e ativação da HotStarTaq DNA polimerase. A partir daí, os ciclos
utilizados para PCR foram de acordo com os primers específicos utilizados para a pesquisa do
enteropatógeno viral.
48
Tabela 1 - Primers utilizados na detecção molecular dos vírus entéricos.
Gene alvo ou
sequência específica
Primers
Sequência (5'-3')
Amplicon
(pb)
Referências
Adenovírus
Hexon
hex1deg
hex2deg
GCCSCARTGGKCWTACATGCACATC
CAGCACSCCICGRATGTCAAA
301
(ALLARD et al., 2001)
Rotavírus
Gene 4
Con 3
Con 2
TGGCTTCGCCATTTTATAGACA
ATTTCGGACCATTTATAACC
876
(GENTSCH et al., 1992)
Gene 9 (ou 8)
Beg9
End9
GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG
GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG
1.062
(GOUVEA et al., 1990)
Astrovírus
ORF2
Mon 244
Mon 245
GGTGTCACAGGACCAAAACC
TTAGTGAGCCACCAGCCATC
413
(NOEL et al., 1995)
Norovírus
Região do capsídeo
G1SKF
G1SKR
CTGCCCGAATTYGTAAATGA
CCAACCCARCCATTRTACA
330
(KOJIMA et al., 2002)
G2SKF
G2SKR
CNTGGGAGGGCGATCGCAA
CCRCCNGCATRHCCRTTRTACAT
344
(KOJIMA et al., 2002)
6261
ACACTCCCACCTCCCGCCAGTA
6779
GGAAGAGCTGGGTGTCAAGA
519
(YAMASHITA et al., 2000)
Agente
Aichi vírus
RNA polymerase
49
4.6.1 Detecção de Rotavírus
Para a pesquisa de rotavírus foram utilizados os primers consensuais (Con2
e Con3) e (Beg9 e End9), que resultou em um produto de 876 pb e 1062 pb,
respectivamente.
Para o primer consensual (Con2 e Con3), a reação de PCR foi processada
através dos seguintes ciclos: 40 ciclos (94 ºC por 45 s, 50 °C por 45 s, e 72 °C por 60 s)
e ao final dos ciclos de amplificação, foram programados mais 10 minutos a 72 °C para
a extensão final das moléculas de DNAc amplificadas. Quando foi utilizado o primer
consensual (Beg9 e End9) às condições foram: 35 ciclos a 94 °C por 1 minuto, 42 °C
por 2 minutos e 72 °C por 1 minuto, um ciclo de extensão a 72 °C por 7 minutos. Para o
controle de qualidade de cada PCR, foram utilizados um controle negativo (água miliQ)
e um controle positivo (RNA preparado de uma amostra fecal reconhecidamente
positiva para rotavírus) (GOUVEA et al., 1990; GENTSCH et al., 1992; VAN DOORN
et al., 2009).
4.6.2 Detecção de Astrovírus
Foram utilizados para a detecção dos astrovírus, os primers específicos Mon
244 e Mon 245 direcionados para a ORF2 do genoma viral, conforme descrito por Noel
et al. (1995). E após as etapas de transcrição reversa e desnaturação inicial do DNAc às
condições de reação seguidas para a PCR foi de 40 ciclos de amplificação (94 ºC por 60
s, 50 ºC por 60 s e 72 ºC por 60 s), seguindo-se uma elongação final a 72 ºC por 10
minutos. Resultando em um produto final amplificado de 413 pb.
4.6.3 Detecção de Norovírus
Para a detecção de norovírus, utilizou-se separadamente os pares de primers
G1SKF / G1SKR e G2SKF / G2SKR, que amplificam um fragmento do gene do
capsídeo do genogrupo I (GI) e genogrupo II (GII), com um tamanho de 330 pb e 344
pb, respectivamente. As condições de reação foram às mesmas para ambos pares de
primers que após a transcrição reversa e a desnaturação inicial, segue os 40 ciclos de
amplificação da PCR (94° C por 30 s, 50 °C por 30 s, e 72 °C por 60 s) com um ciclo de
50
extensão final de 72 °C por 7 minutos (VINJE; KOOPMANS, 1996; KOJIMA et al.,
2002; SDIRI-LOULIZI et al., 2008).
4.6.4 Detecção de Aichi vírus
A pesquisa para Aichi vírus foi feita com o par de primers 6261 e 6779
descrita pelo Yamashita et al. (2000). Após as etapas de transcrição reversa e
desnaturação inicial do DNAc, seguiu-se os 40 ciclos de amplificação com desnaturação
a 95 °C por 30 s, anelamento a 55 °C por 30 s, e extensão a 72 °C por 60 s, com um
ciclo final de incubação a 72° C por 5 minutos. O produto de amplificação obtido foi de
519 pb de comprimento, na junção entre o terminal C do 3C e N-terminal de 3D
(AMBERT-BALAY et al., 2008).
4.6.5 Análise da Reação em cadeia de polimerase pós-transcrição reversa (RT-PCR)
Os produtos obtidos foram visualizados em gel de agarose a 1,5% em
tampão de corrida TBE 0,5X, usando cuba de eletroforese horizontal, com corrida
eletroforética de 80 minutos sob tensão de 80 volts. O DNAc foi impregnado com
brometo de etídeo na concentração de 10 mg/mL de água para visualização sob ação de
luz ultravioleta e o gel foi foto documentado com câmera digital. Em cada corrida
eletroforética, foi utilizado o DNA ladder de 100 pb ou 50 pb ( Promega) como padrão
de peso molecular.
4.7 Genotipagem de Rotavírus
Após a realização da RT-PCR, procedeu-se a reação de semi-nested-PCR.
Foi utilizado 1 μL do produto da primeira amplificação para detecção de rotavírus como
molde para identificação dos genótipos P (VP4) e G (VP7), o qual foi adicionado a
mistura de reação para um volume final de 22 µL, utilizando primers específicos para os
diferentes genótipos P (Con3, 1T-1, 2T-1, 3T-1, 4T-1, 5T-1) e para os genótipos G
(End9, aAT8, aBT1, aCT2, aDT4, aET3 e aFT9) de acordo com a Tabela 2 (GOUVEA
et al., 1990; GENTSCH et al., 1992).
Foram adicionados 21 μL da seguinte mistura: 4,4 μL de tampão de reação
5x, 4,4 μL da mistura de dNTPs (0,4 mM), 2,2 μL de MgCl2 (2,5 mM), 0,8 µL de
51
primers específicos para cada genótipo (0,8 µM de cada) e 0,26 µL de Taq DNA
polimerase (5u/µL), completando o volume com água MiliQ. A seguir, os tubos foram
colocados no termociclador (Mycycler Thermal Cycler-BioRad) programado para 25
ciclos de PCR (94 ºC por 1 minuto, 50 ºC por 2 minutos e 72 ºC por mais um minuto) e
a uma incubação de extensão final de 72 ºC por 7 minutos.
Após a realização da segunda etapa de amplificação do DNA, 8 µL do
produto amplificado de cada amostra, misturado com 2 µL do azul de bromofenol foi
aplicado em gel de agarose a 2%, submetida a uma eletroforese de 80 volts durante
aproximadamente 80 minutos em tampão de corrida TBE 0,5X, em seguida, corado com
brometo de etídio na concentração de 10 mg/mL de água. Para cada gel foram aplicados
5μL do marcador de peso molecular com 100 pares de base (100 pb DNA LadderPromega). O gel foi examinado e foto documentado com câmara digital para observação
do amplicon correspondente a cada genótipo de rotavírus pesquisado (Tabela 2).
Tabela 2- Sequência dos primers utilizados para a detecção do genótipo G e P do rotavírus.
Primers
Posição
Beg9
1-28
End9
10621036
Sequencia 5’-3’
Genótipo Tamanho
GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTCTGG Consenso
GGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG
-
Consenso
1062pb
aAT8
178-198
GTCACACCATTTGTAAATTCG
G8
885pb
aBT1
314-335
CAAGTACTCAAATCAATGATGG
G1
749pb
aCT2
411-435
CAATGATATTAACACATTTTCTGTG
G2
652pb
aET3
689-709
CGTTTGAAGAAGTTGCAACAG
G3
374pb
aDT4
480-498
CGTTTCTGGTGAGGAGTTG
G4
583pb
aFT9
757-776
ATC GAT GAT ACT ACA ACT AC
G9
306pb
Con-2
868-887
ATT TCG GAC CAT TTA TAA CC
Consenso
-
Con-3
11-32
TGG CTT CGC CAT TTT ATA GAC A
Consenso
876pb
1T-1
339-356
TCTACTTGG ATA ACG TGC
P[8]
345pb
2T-1
474-494
CTA TTG TTA GAG GTT AGA GTC
P[4]
483pb
3T-1
259-278
TGT TGA TTA GTT GGA TTC AA
P[6]
267pb
4T-1
385-402
TGA GAC ATG CAAT TGG AC
P[9]
391pb
5T-1
575-594
ATC ATA GTT AGT AGT CGC
P[10]
583pb
Fonte: GOUVEA et al., 1990; GENTSCH et al.,1992.
52
4.8 Análise de dados
Os dados coletados foram agrupados e tabelados. Utilizou-se o programa
Excel for Windows® para a confecção de Figuras. Com o auxílio do programa
estatístico Bioestat 5.0 (2007), avaliou-se os dados através do teste de Qui-quadrado
( 2) de Independência no cruzamento das variáveis classificatórias e a correlação de
Pearson no cruzamento das variáveis numéricas, índice pluviométrico e nº de vírus
detectados nas amostras. Em todos os testes o nível de significância aplicado foi de 5%,
ou seja, considerou-se significativo quando p < 0,05.
53
5 RESULTADOS
5.1 Detecção e distribuição dos vírus entéricos
Foram testadas para os vírus entéricos (rotavírus, adenovírus, astrovírus,
norovírus e Aichi vírus), 131 amostras fecais de crianças menores de cinco anos
atendidas entre maio de 2009 a maio de 2011. Setenta e seis pertenciam ao grupo caso
(37 do sexo feminino e 39 do sexo masculino) e 55 ao grupo controle (24 do sexo
feminino e 31 do sexo masculino).
Entre as 131 crianças testadas, 20 (26,3%) e 6 (10,9%) tiveram positividade
para um dos vírus entéricos pesquisados entre o grupo caso e controle respectivamente,
sendo mais frequente no grupo caso, conforme mostrado na Figura 7 mas sem
apresentar uma relação significante.
Figura 7- Percentual de crianças menores de 05 anos com positividade para um dos vírus
entéricos em São Luís - MA, entre maio de 2009 a maio de 2011.
Vírus Entéricos
Percentual de Crianças
30
25
20
15
10
5
0
CASO
CONTROLE
Grupos
2
= 3,84; p = 0,0500
A RT-PCR resultou em fragmentos de 1062 pb e 876 pb (rotavírus), 413 pb
(astrovírus), 519 pb (Aichi vírus). Já todas as 7 amostras detectadas para norovírus,
mostraram ser norovírus do genogrupo II com um fragmento de 344 pb. A PCR resultou
em um fragmento de 301 pb para adenovírus. Todos os fragmentos foram visualizados
em gel de agarose, apresentados na Figura 8.
54
Figura 8 - Gel de agarose 1,5% mostrando o perfil de detecção por RT-PCR e PCR específico
dos vírus entéricos causadores de gastroenterite em crianças < 05 anos em São Luís
– MA, entre maio de 2009 a maio de 2011. PM1: peso molecular (100pb), RV1:
rotavírus (End9 / Beg9), RV2: rotavírus (Con2 e Con3), AdV : adenovírus 40/41,
HAst: astrovírus, Aich: Aichi vírus, NoV: norovírus (Genogrupo II) .
Os rotavírus, adenovírus e norovírus foram detectados em ambos os grupos
estudados, mas os rotavírus foram os únicos associados significativamente com
gastroenterites (p = 0,0465). A frequência de cada virus no grupo caso e no controle foi
respectivamente: rotavirus, 13,1% versus 1,8%; adenovirus, 5,3% versus 1,8%; and
norovirus, 4,0% versus 7,3%. Aichi virus (2,6%) e astrovirus (1,3%) foram detectados
somente em pacientes do grupo caso (Tabela 3).
55
Tabela 3 - Frequência de vírus entéricos em crianças menores de 05 anos com e sem
gastroenterite em São Luís – MA, entre maio de 2009 a maio de 2011.
Grupos
Vírus entéricos
Caso
Controle
N = 76
N = 55
2
p
n
(%)
n
(%)
Rotavirus
10
(13,1)
1
(1,8)
3,96
0,0465
Adenovirus
4
(5,3)
1
(1,8)
0,30
0,5798
Norovirus
3
(4,0)
4
(7,3)
0,19
0,6587
Aichi virus
2
(2,6)
0
(0,0)
0,24
0,6238
Astrovirus
1
(1,3)
0
(0,0)
0,02
0,8705
Total
20
(26,3)
6
(10,9)
3,84
0,0500
As crianças com gastroenterite foram agrupadas nas seguintes faixas etárias:
0-6 meses (n = 11), 7-12 meses (n = 8), 13-24 meses (n = 21), 25-36 meses (n = 22) e de
37-59 meses (n = 14) e estes agrupamentos foram correlacionados com a freqüência de
amostras positivas para os enterovírus pesquisados (Tabela 4).
56
Tabela 4 - Frequência de vírus entéricos em 76 crianças com gastroenterite menores de 05 anos em São Luís – MA,
entre maio de 2009 a maio de 2011, distribuídos por faixa etária.
Faixa
etária*
N. (%) de infecções
Total
N.
Rotavirus
Adenovirus
Norovirus
Aichi virus
Astrovirus
n (%)
(meses)
0-6
11
1
(9,1)
-
-
-
-
-
-
-
-
1 (9,1)
7-12
8
2
(25,0)
1
(12,5)
1
(12,5)
-
-
-
-
4 (50,0)
13-24
21
2
(9,5)
1
(4,7)
2
(9,5)
1
(4,7)
-
-
6 (28,5)
25-36
22
4
(18,2)
1
(4,5)
-
-
1
(4,5)
1
(4,5)
7 (31,8)
37-59
14
1
(7,1)
1
(7,1)
-
-
-
-
-
-
2 (14,3)
Total
76
10
(13,1)
4
(5,3)
3
(4,0)
2
(2,6)
1
(1,3)
20 (26,3)
* Teste de
2
de Independência, p > 0,05
Quanto à análise estatística das cinco faixas etárias, o estudo não revelou
correlação significativa entre os vírus entéricos estudados e a idade das crianças (p <
0,05) (Tabela 4). No entanto, os rotavírus foram detectados em todas as faixas etárias,
estando presentes em 9,1% das amostras fecais de crianças de 0-6 meses, 25% das
crianças de 7-12 meses, 9,5% das crianças de 13-24 meses, 18,2% das crianças de 25-36
meses e 7,1% das crianças de 37-59 meses.
A Tabela 5 apresenta a frequência dos vírus entéricos em relação ao sexo.
Também não se observou uma correlação significativa entre a detecção dos cinco vírus
pesquisados com o sexo.
57
Tabela 5 - Frequência de vírus entéricos em 76 crianças menores de 05 anos com gastroenterite
em São Luís – MA, entre maio de 2009 a maio de 2011, distribuídos por sexo.
Sexo
Vírus entéricos
Feminino
Masculino
N = 37
N = 39
2
p
n
(%)
n
(%)
Rotavirus
8
(21,6)
2
(5,1)
4,52
0,074
Adenovirus
3
(8,1)
1
(2,6)
1,17
0,5701
Norovirus
0
(0,0)
3
(7,7)
2,96
0,2576
Aichi virus
1
(2,8)
1
(2,6)
0,001
0,4971
Astrovirus
1
(2,8)
0
(0,0)
1,068
0,9789
Total
13
(35,1)
7
(18,0)
2,89
0,1498
Ao se investigar a ocorrência de sazonalidade dos vírus entéricos em relação
à pluviosidade, observou-se que não houve uma correlação (r = -0,021; p > 0,05) entre a
presença desses enterovírus detectados ao longo dos dois anos estudados, tanto para o
período chuvoso quanto o seco nas crianças com gastroenterite menores de 05 anos de
idade (Figura 9).
58
Figura 9 - Variação sazonal na freqüência dos vírus entéricos detectados em 76 crianças
menores de 05 anos com gastroenterite em relação à pluviosidade em São LuísMA, entre maio de 2009 a maio de 2011.
Sazonalidade
6
Numéro de vírus
5
4
3
2
1
0
0
100
200
300
400
500
600
Índice pluviométrico (mm)
Na Tabela 6 mostra a positividade de rotavírus nos grupos pesquisados em
relação ao estado vacinal. Das 131 crianças incluídas neste estudo, 44 (33,5%), foram
vacinadas, 61 (46,5%) não foram vacinadas e em 26 (20%) crianças os pais não sabiam
ou não informaram a situação vacinal. Das 11 (8,4%) crianças que foram positivas para
rotavírus, 7 delas (11,5%) não foram vacinadas, 2 (4,5%) foram vacinadas e 2 (7,7%) os
pais não sabiam ou não informaram o estado vacinal. Entretanto, não houve diferença
significativa entre os grupos caso e controle, em relação à positividade para rotavírus e
o estado vacinal (p = 0,2472, p = 0,7429, respectivamente).
59
Tabela 6 – Detecção de rotavírus em crianças menores de 05 anos em São Luís – MA, entre
maio de 2009 a maio de 2011, distribuídas de acordo com o estado vacinal.
Estado vacinal
Grupo
Positivo/vacinado
Positivo/não vacinado
Não sabe
Total
No. (%)
No. (%)
No. (%)
No. (%)
*Caso
2/25 (8)
6/25(24)
2/26 (7,7)
10/76 (13,1)
**Controle
0/19 (0)
1/36 (2.8)
-
1/55 (1,8)
2/44 (4,5)
7/61 (11,5)
2/26 (7,7)
11/131 (8,4)
Total
* Teste de
2
de Independência, p = 0, 2472 **p = 0,7429
5.2 Perfil eletroforético do genoma de Rotavírus
Através da EGPA foi possível se fazer a análise do genoma do rotavírus de
amostras positivas detectadas e confirmadas pelas técnicas de ELISA e RT-PCR. Das
11 amostras positivas, 4 amostras não apresentaram perfil de migração eletroforética,
portanto não foi possível se fazer a análise fenotípica dessas amostras, porém 7 amostras
revelaram um perfil de migração compatível com o fenótipo de rotavírus do grupo A do
tipo longo (4, 2, 3, 2). A Figura 10 mostra a EGPA de algumas amostras do presente
estudo.
60
Figura 10 – Gel de poliacrilamida 7,5% mostrando o perfil eletroforético de amostras fecais de
crianças menores de 05 anos positivas para rotavírus em São Luís-MA. A canaleta
A contém controle negativo. As canaletas B, E, F, H, I e J apresentam amostras
com perfil eletroforético padrão longo. As canaleta C, D e G representam amostras
negativas na EGPA. Os números de 1 a 11 representam os segmentos do dsRNA.
5.3 Genotipagem dos Rotavírus
As 11 amostras positivas para rotavírus foram genotipadas por meio do
método de PCR para os genótipos P (VP4) e G (VP7). Na análise dos resultados da
genotipagem, observou-se que todas as amostras eram P[4] em relação à genotipagem P
(Figura 11A). No entanto para a genotipagem G, somente 9 amostras foram
genotipáveis, sendo todas classificadas como G2 (Figura 11B). Duas amostras que não
apresentaram características de nenhum dos genótipos G pesquisados, também não
apresentaram o produto da primeira amplificação (determinação de VP7). Observando
nessas 9 amostras a combinação G2P[4].
61
Figura 11 – Genotipagem de rotavírus visualizada em gel de agarose a 2%. A- genotipagem P
(VP4) de rotavírus usando produtos da 1ªamplificação e um cocktail de primers
(Con3,1T-1 a 5T-1). PM: peso molecular (100 pb), Cp: controle positivo, 1 a 11:
amostras positivas mostrando fragmentos amplificados de 483 pb (P[4]). Bgenotipagem G (VP7) de rotavírus usando produtos da 1ª amplificação e um
cocktail de primers (End9, aAT8, aBT1, aCT2, aDT4, aET3 e aFT9). PM: peso
molecular (100 pb), Cp: controle positivo, 1 a 6: amostras positivas mostrando
fragmentos amplificados de 652 pb (G2).
1000pb
1000pb
A
500pb
500pb
B
62
6 DISCUSSÃO
A importância dos vírus na gastroenterite infantil tem sido descrita em
diversos estudos em todo o mundo com taxas de incidência variáveis. Por exemplo,
Svraka et al. (2007), mostraram em seu estudo na Holanda que a etiologia viral
correspondia a mais de 80% dos casos de diarreia diagnosticados. Meqdam e Thwiny
(2007) encontraram uma positividade de 50% em crianças com gastroenterite aguda na
Arábia Saudita.
No Brasil dados da literatura apontam para a ocorrência desses vírus em
percentuais que variam entre 12 a 47% de crianças com gastroenterite, atendidas em
ambulatório ou hospitais (LINHARES, 2000; CARDOSO et al., 2003; BARLETTA et
al., 2009), compatíveis com nosso estudo que encontrou uma incidência de 26,3% em
crianças do grupo caso, mostrando que todos esses vírus estão circulando em crianças
da nossa região, principalmente o rotavírus. As condições dos estudos tais como a
amostragem, o nível socioeconômico da população, e métodos de diagnóstico, podem
explicar essas diferenças entre os estudos nas taxas de detecção (SDIRI-LOULIZI et al.,
2008).
No presente estudo os rotavírus, norovírus e adenovírus foram claramente os
três principais agentes virais detectados nas amostras analisadas, sendo detectados em
ambos os grupos caso e controle estudados (13,1% e 1,8%; 4,0% e 7,3%; 5,3% e 1,8%,
respectivamente), confirmando a importância destes vírus como causadores de doença
diarreica.
Os resultados aqui apresentados são similares aos achados de outros países
(MEQDAM; THWINY, 2007; NGUYEN et al., 2007; SVRAKA et al., 2007; SDIRILOULIZI et al., 2008) e também de outras regiões do Brasil (ANDREASI et al., 2007;
MAGALHÃES et al., 2007; BARLETTA et al., 2009; MUNFORD et al., 2009; DE
MOURA et al., 2012) que descrevem os rotavírus como o principal agente etiológico da
gastroenterite infantil.
Além disso, os resultados aqui obtidos (Tabela 3) são comparáveis aos
dados anteriores, em São Luís, que mostraram a ocorrência dos rotavírus com
frequência elevada (21,2%) entre as crianças hospitalizadas por diarréia aguda (LUZ et
al., 2005). No entanto, curiosamente, nossos dados também mostram uma proporção de
1,8% de crianças sem diarreia que excretaram rotavírus, porém com uma taxa que não
ultrapassou os estudos anteriores realizados na mesma cidade (STEWIEN et al., 1991)
63
Uma explicação para esse fato pode ser a introdução da imunização contra o rotavírus
no Brasil, em 2006, reduzindo a circulação do vírus entre as crianças.
Apesar de estudos recentes afirmarem que a idade mais comum da presença
de gastroenterite viral esporádica é de 6-24 meses (LUZ et al., 2005; SDIRI-LOULIZI
et al., 2008; BARLETTA et al., 2009; LEVIDIOTOU et al., 2009), Santos et al (2008)
observaram uma maior frequência de casos positivos em crianças de 2 a 5 anos de
idade. No entanto, neste estudo, não foi observada, uma correlação significativa entre os
vírus pesquisados e as faixas etárias estudadas (p > 0,05). A literatura mostra que apesar
das infecções ocorrerem preferencialmente em lactentes, à faixa etária acometida pode
variar, de acordo com a região, nível sócio econômico e período de realização do estudo
(COSTA et al., 2004).
No presente estudo, foi observado que a infecção por rotavírus ocorreu em
todas as faixas etárias, incluindo crianças com menos de 6 meses de idade (9,1%),
apesar dessa faixa etária de 0-6 meses ser considerada de ocorrência assintomática
(WILHELMI; ROMAN; SÁNCHEZ-FAUQUIER, 2003). Andreasi et al. (2007)
também encontraram importante índice de infecção sintomática nessa faixa etária
(15,7%), o que pode refletir as condições sócio-econômico-sanitárias da população.
Neste estudo não foi observada diferença estatística significante entre os
resultados obtidos para os cinco vírus pesquisados em relação ao sexo (Tabela 5), mas
se observou uma maior positividade desses vírus no sexo feminino para rotavírus
(21,6%). Este dado é semelhante ao verificado por Carneiro et al. (2005), quando este
estudava as características clínicas e epidemiológicas de crianças internadas por
rotavírus na cidade de Salvador-BA, Brasil. Entretanto, divergiu de Cardoso et al.
(2003) que encontrou maior índice de positividade para o gênero masculino.
No Brasil, a distribuição sazonal das infecções virais assume duas
configurações bem definidas. As regiões centro-oeste, sudeste e sul apresentam um
perfil sazonal marcante, principalmente em relação às rotaviroses, com maior incidência
de casos nos meses mais secos ou frios do ano (CARDOSO et al., 2002; CAMPOS et
al., 2003; ANDREASI et al., 2007; BARLETTA et al., 2009). Porém o mesmo não
acontece nas regiões norte e nordeste, onde as infecções ocorrem durante o ano todo
(LUZ et al., 2005; GABBAY et al., 2005; GABBAY et al., 2007).
Os resultados do presente estudo mostraram um padrão semelhante ao que
geralmente é relatado para regiões tropicais, com os vírus entéricos sendo detectados ao
longo do ano em crianças menores de 5 anos, sem uma correlação entre a freqüência dos
64
enterovírus e a pluviosidade (Figura 9). Entretanto, a falta da ocorrência de sazonalidade
das infecções virais em relação à pluviosidade, talvez não reflita a realidade, devido à
irregularidade na obtenção das amostras durante o período de estudo. Porém, pesquisas
anteriores realizadas na mesma cidade mostraram que a freqüência de vírus entéricos,
pode variar de um ano para o outro em regiões de clima tropical e que não está
necessariamente relacionada ao índice pluviométrico (STEWIEN et al., 1991;
GABBAY et al., 2005; LUZ et al., 2005).
Em relação ao estado vacinal das crianças pesquisadas contra rotávírus, 44
(33,5%) foram vacinadas e 61 (46,5%) não foram vacinadas (Tabela 6).
Atualmente, dois tipos de vacinas estão disponíveis, uma monovalente
atenuada de especificidade G1P[8] (Rotarix ®, GlaxoSmithKline Biologicals,
Rixensart, Bélgica) e uma pentavalente recombinante contendo os sorotipos G1, G2,
G3, G4 e P[8] (RotaTeq ®, vacinas da Merck, Whitehouse Station, NJ, EUA) (RUIZPALACIOS et al., 2006; VESIKARI et al., 2006; GURGEL et al., 2009; CHANDRAN
et al., 2010). Estas vacinas fazem parte dos programas de imunização em muitos países
da América Latina. Uma revisão recente da literatura de estudos caso-controle que
avaliaram o impacto da vacina utilizada no Brasil, México, Nicarágua, Panamá,
concluíram que a imunização contra o rotavírus tem um impacto significativo na
redução tanto da internação hospitalar quanto na mortalidade entre as crianças por
diarreia (DESAI et al., 2011).
No Brasil, o Ministério da Saúde introduziu a vacina Rotarix ® contra o
rotavírus no calendário básico de vacinação em março de 2006, oferecendo
gratuitamente a todas as crianças menores de seis meses (BRASIL, 2006). No entanto,
das 131 crianças incluídas neste estudo, 44 (33,5%) tomaram a vacina o que poderia ter
reduzido ainda mais o número de acesso dessas crianças aos hospitais ou postos de
saúde com sintomas de diarréia se um maior número de crianças tivesse sido vacinado.
Neste estudo, ao se analisar apenas o rotavírus em crianças vacinadas, observou-se uma
freqüência de 4,5% (Tabela 6), sugerindo que a imunização contra o rotavírus teve um
impacto importante na redução da morbidade por este vírus, mesmo com uma pequena
amostra de crianças incluídas, o que é uma limitação do presente estudo.
Os genótipos G, encontrados com maior prevalência no mundo todo, são os
genótipos G1 e G4, porém outros genótipos G, como G2, G5, G6, G8, G9 e G10 têm
apresentado significativa importância, principalmente em paises em desenvolvimento
como o Brasil. Esses dados apontam para a possibilidade de mudanças na prevalência
65
de diferentes genótipos por região (MASCARENHAS et al., 2002; ANDREASI et al.,
2007).
Neste estudo, foi observado o predomínio total do genótipo G2. Porém, em
um estudo realizado em São Luís, entre 1997 a 1999, foi mostrado o predomínio do
sorotipo G1 que respondeu por aproximadamente 70% dos isolado tipados, sendo o
sorotipo G2 o segundo mais prevalente durante todo o período estudado (LUZ et al.,
2005). Via de regra, as investigações indicam que um determinado genótipo predomina
durante um ou dois anos, emergindo, a partir de então, uma nova variedade antigênica
dominante (KAPIKIAN; HOSHINO; CHANOCK, 2001).
Por outro lado, considerando a genotipagem P, todas as amostras
genotipáveis foram P[4] e como resultado da associação G e P, a combinação observada
foi G2P[4] que não está incluída na vacina utilizada rotineiramente no Brasil. Fato
semelhante a este foi observado por Gurgel et al. (2007), quando estudavam crianças
vacinadas e não vacinadas contra o rotavírus em Aracajú-SE, onde mesmo após terem
recebido a vacina contra rotavírus algumas crianças desenvolveram a doença diarreica
por rotavírus com a combinação G2P[4]. Munford et al. (2009) ao estudar crianças de 4
regiões do Brasil, observaram também com maior frequência o genótipo G2P [4].
Estudos realizados em diversos estados brasileiros (SANTOS et al., 2003;
ANDREASI et al., 2007; MONTENEGRO et al., 2007), bem como em outros países
(BON et al., 2000; UCHIDA et al., 2006), consideraram a combinação G1P[8] de maior
importância epidemiológica nas causas da doença diarreica por rotavírus. Fato que
levou o desenvolvimento da vacina Rotarix® que confere imunidade para esta
combinação. Porém atualmente no período pós-vacinal, o genótipo G2P[4] é
predominante em todo o Brasil (GURGEL et al., 2009; CORREIA et al., 2010;
JUSTINO et al., 2011).
Variações devem sempre ser apuradas por causa das flutuações genéticas, já
que pode levar a redução da eficácia da vacina ou até mesmo a falha da vacina ao longo
do tempo. Portanto, o acompanhamento contínuo das cepas circulantes em todo mundo,
é necessário para avaliar e atualizar os métodos de análise da vacina. (ROSE;
MIAGOSTOVICH; LEITE, 2010)
Neste estudo, a análise do RNA dos rotavírus detectados em sete amostras
positivas (Figura 10) através da EGPA demonstrou um perfil eletroferótipo compatível
com o grupo A de perfil longo. Esse resultado está de acordo com a literatura que relata
que os rotavírus do grupo A são de maior incidência e responsáveis por mais de 98%
66
das infecções entre humanos, com uma nítida preponderância do padrão longo em
relação ao curto (COLUCHI et al., 2002; CAMPOS et al., 2003; GENTSCH et al.,
2005; ANDREASI et al., 2007).
Entretanto, é perceptível a partir dos resultados obtidos neste estudo que
houve uma certa variação de eletroferótipos em comparação ao estudo realizado em São
Luís onde eletroferótipos longos e curtos circularam com taxas semelhantes ao longo do
período pesquisado (LUZ et al., 2005). Este fato reforça a opinião de que o padrão de
bandeamento dos 11 diferentes segmentos de dsRNA de Rotavírus A fornecem
importantes informações em termos de variação de amostras em determinado tempo e
localidade (LINHARES; BRESEE, 2000).
Com relação à ocorrência de quatro amostras positivas para rotavírus
detectadas por ELISA e RT-PCR, mas que foram negativas por EGPA (Figura 10).
Supõe-se que provavelmente a concentração de RNA era insuficiente, ou seja, abaixo do
limite de coloração da prata de 3-4 ng, já que a EGPA é uma técnica que precisa de uma
carga viral maior para a detecção do RNA viral, ou devido à degradação do RNA pela
ação enzimática das fezes (HERRING et al., 1982; CAMPOS et al., 2002).
Os adenovírus entéricos têm sido alvo de estudos por ser um importante
patógeno humano, estando entre os quatro vírus mais relacionados à gastroenterite
infantil (WILHELMI; ROMAN; SÁNCHEZ-FAUQUIER, 2003). No presente estudo
os adenovírus foram encontrados em segundo lugar, em crianças com gastroenterite
(5,3%), mas também ocorreram em crianças sem sintomas de diarreica aguda (1,8%).
Taxas de detecção um pouco maiores do que estas foram encontradas nas cidades do
Rio de Janeiro (6%), Juiz de Fora - MG (5,4%) e na Amazônia Ocidental (6,4%) em
crianças internadas ou não devido à gastroenterite (CAMPOS et al., 2003;
MAGALHÃES et al., 2007; BARLETTA et al., 2009).
Os norovírus são considerados os principais causadores de surtos de
gastroenterite
que
afetam
todos
os
grupos
etários
nos
países
ocidentais
(FANKHAUSER et al., 2002; LOPMAN et al., 2003). No entanto, a positividade
observada neste estudo em fezes diarreicas (4,0%) foi menor do que a encontrada em
São Paulo (15,7%) e Espírito Santo (39,7%) em crianças que foram hospitalizadas com
sintomas de gastroenterite (MORILLO et al., 2008; RIBEIRO et al., 2008). Apesar da
frequência encontrada neste trabalho, os norovírus não podem ser responsabilizados
como agentes causais de diarreia, pois estão presentes também em fezes normais
(7,3%).
67
Neste estudo, todas as amostras positivas para norovírus foram do
genogrupo II, consistente com os resultados recentes do norte e sul do Brasil
(ARAGÃO et al., 2010; GEORGIADIS et al., 2010) que demonstraram a prevalência
deste genogrupo. Outros trabalhos relataram um aumento significativo neste genogrupo,
com uma grande variabilidade genética tanto em surtos longos como a casos
esporádicos (BULL et al., 2006; OKADA et al., 2007). Embora no Japão tenha sido
observada prevalência semelhante para ambos os grupos (NAKATA et al., 2000).
Os astrovírus de humanos são considerados importantes patógenos virais em
crianças com gastroenterite aguda na maioria dos países onde foram investigados,
porém a prevalência da doença varia bastante de acordo com os grupos estudados e há
relatos em crianças assintomáticas (MÉNDEZ-TOSS et al., 2004; GABBAY et al.,
2007; SDIRI-LOULIZI et al., 2008).
No presente estudo, das 131 amostras pesquisadas, somente uma criança
(0,76%) com sintomas de diarreia apresentou positividade para astrovírus, estando
abaixo das incidências já descritas por diversos pesquisadores como Gabbay et al.
(2007) que encontraram uma taxa de 6,1% nos casos de doença infantil diarreica em
Belém e de Santos et al. (2007) que observaram uma incidência de 4,3% nas crianças
hospitalizadas com gastroenterite aguda em Brasília e Goiânia. Taxas bem mais
elevadas já foram registradas em São Luís (11%) e Rio de Janeiro (14%) em crianças
com até 24 meses de idade (GABBAY et al., 2005; VICTORIA et al., 2007A).
Vale ressaltar, que os autores acima citados utilizaram uma amostragem
muito maior que a utilizada neste estudo. No entanto, os resultados obtidos permanecem
em conformidade com os da literatura que mostram que estes vírus causam infecções
assintomáticas ou formas leves de gastroenterite que são tratados em casa, não
requerendo hospitalizações (BUESA et al., 2002; OH; GAEDICKE; SCHREIER, 2003;
NGUYEN et al., 2007).
Além da confirmação da circulação de todos esses vírus entéricos em
crianças de São Luís, o presente estudo é o segundo a relatar a presença de Aichi vírus
no Brasil, uma vez que foi detectada em 2 (2,6%) crianças do grupo caso. Este vírus foi
descrito pela primeira vez no Brasil por Oh et al. (2006), em crianças com gastroenterite
esporádica na região Centro-Oeste, porém sua participação na gastroenterite infantil,
ainda continua a ser um evento raro (OH; GAEDICKE; SCHREIER, 2003; AMBERTBALAY et al., 2008), pois é conhecido como um agente causador de gastroenterite
associado ao consumo de ostras (YAMASHITA et al., 2000).
68
Os dados recentes da literatura somados aos resultados obtidos no presente
trabalho reforçam a idéia do papel do Aichi vírus, em casos de gastroenterite e sugerem
que as ostras não podem ser o único vetor de transmissão do vírus. Entretanto mais
estudos devem ser realizados a fim de elucidar o papel do Aichi vírus na etiologia da
gastroenterite infantil.
69
7 CONCLUSÃO
Os rotavírus, adenovírus e norovírus são os três principais agentes virais mais
presentes na gastroenterite infantil em nosso meio. Enquanto que os astrovírus e
Aichi vírus raramente estão envolvidos.
Não foi observada correlação significativa entre a detecção de vírus entéricos
com o sexo e a idade das crianças pesquisadas. Da mesma forma, não foi
verificada variação sazonal da incidência das infecções pelos vírus entéricos nos
períodos chuvosos e secos do ano.
Todos esses vírus estão circulando entre as crianças de São Luís e o rotavírus é
ainda um agente mais prevalente na gastroenterite, mesmo após a introdução da
vacina devido ao envolvimento de outros genótipos não incluídos rotineiramente
na vacina usada no Brasil.
Os rotavírus circulantes apresentaram um perfil eletroforético compatível com o
grupo A de perfil longo e são do genótipo G2P[4], enquanto os norovírus são do
genogrupo II.
Uma vez que G2P[4] é o novo genótipo predominante, existe uma necessidade
de reavaliação da introdução de vacinas que proporcionem protecção contra os
sorotipos múltiplos.
Embora os outros vírus entéricos tenham sido detectados em taxas de baixa
freqüência, podemos sugerir que, além de rotavírus e adenovírus, norovírus
também sejam incluídos no teste de rotina no Brasil.
70
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2000.
82
APÊNDICES
83
APÊNDICE A – TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
84
APÊNDICE B - SOLUÇÕES E REAGENTES
1-Solução utilizada para o preparo das suspensões fecais
1.1-Tampão fosfato salina (PBS) 10X - pH 7,4
NaCl
Na2HPO4
80 g
14,4 g
KH2PO4
KCl
Água destilada estéril q.s.p
2,4 g
2g
1000 mL
1.2 Tampão fosfato salina (PBS) 1X – pH 7,4
PBS 10X
Água destilada estéril q.s.p
100 mL
1000 mL
2-Soluções utilizadas para a eletroforese em gel de agarose
2.1-EDTA 0,5 M pH 8,0
EDTA
NaOH
Água destilida estéril q.s.p
2.2-Solução de brometo de etídeo 10 mg/mL
Brometo de etídeo
Água destilada estéril q.s.p
186,1 g
20 g
1000 mL
1g
100 mL
2.3-Tampão Tris/Borato/EDTA (TBE) 10X – pH 8,4
Tris base
Ácido bórico
EDTA 0,5 M pH 8,0
Água destilida estéril q.s.p
108 g
55 g
40 mL
1000 mL
2.4-Tampão Tris/Borato/EDTA (TBE) 0,5X – pH8,4
TBE 10X
Água destilida estéril q.s.p
50 mL
1000 mL
2.5-Tampão corante para amostras
85
Azul de bromofenol
Xileno cianol
Ácido bórico
Glicerol
Água destilida estéril q.s.p
25 mg
25 mL
55 g
3 mL
1000 mL
2.6- Agarose 1,5%
Agarose
TBE 0,5X q.s.p
3g
200 mL
2.7-Agarose 2,0%
Agarose
TBE 0,5X q.s.p
5g
250 mL
3-Soluções utilizadas para eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA)
3.1- Acrilamida 30%
Acrilamida
Bisacrilamida
Água destilida estéril q.s.p
Armazenar a 4 ºC ao abrigo da luz
29 g
1g
100 mL
3.2-Tris-HCL 1,5M, pH 8,8
Tris base
Água destilida estéril q.s.p
Ajustar com HCL 6N e armazenar a 4 ºC
27,23 g
150 mL
3.3-Tris-HCL 0,5M, pH 6,8
Tris base
Água destilida estéril q.s.p
Ajustar com HCL 6N e armazenar a 4 ºC
6,1 g
100 mL
3.4-Solução de HCL 6N
HCl
50,4 mL
86
Água destilida estéril q.s.p
100 mL
3.5-Solução de Dodecil sulfato de sódio (SDS) 10%
SDS
Água destilida estéril q.s.p
1g
10 mL
3.6-Azul de bromofenol 1%
Azul de bromofenol
Água estéril
0,1 g
10 mL
3.7-Tampão de tratamento das amostras
Tris-HCL 0,5M, pH 6,8
Glicerol
SDS 10%
2-β Mercaptoetanol
Azul de bromofenol 1%
Água estéril
1 mL
0,8 mL
1,6 mL
0,4 mL
0,4 mL
3,8 mL
3.8-Tampão de corrida Tris/Glicina 5X, pH 8,3
Tris base
Glicina
SDS
Água destilida estéril q.s.p
15 g
72 g
5g
1000 mL
3.9-Tampão de corrida Tris/Glicina 1X
Tris/Glicina 5X
Água destilida estéril q.s.p
200 mL
1000 mL
3.10- Solução de Persulfato de Amônia (PA) 10%
Persulfato de amônia
Água destilida estéril q.s.p
1g
10 mL
3.11-Solução Fixadora (Álcool etílico 10% - Ácido acético 0,5%)
Álcool etílico PA
50 mL
Ácido acético PA
2,5 mL
87
Água estéril q.s.p
500 mL
3.12-Solução de Nitrato de Prata 0,01 M
AgNO3
Água destilida estéril q.s.p
0,85 g
500 mL
3.13-Solução Reveladora (NaOH 0,75 M – Formaldeído 0,95%)
NaOH
15 g
Formaldeído
12, 8 mL
Água estéril q.s.p
500 mL
88
ANEXOS
89
ANEXO A - PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA EM
PESQUISA DO UNICEUMA
90
ANEXO B - CERTIFICADO DO PRÊMIO DE MELHOR PAINEL DO V SIMPÓSIO
DE MICROBIOLOGIA APLICADA
91
ANEXO C - PUBLICAÇÃO DO RESUMO: DETECTION OF ROTAVÍRUS AND
ADENOVÍRUS IN FECAL SAMPLES FROM CHILDREN HOSPITALIZED IN SÃO
LUÍS, MARANHÃO, BRAZIL. NA REVISTA HOLOS ENVIRONMENTAL
92
ANEXO D - PROTOCOLO DE SUBMISSÃO DE ARTIGO À REVISTA PEDIATRIC
RESEARCH
93
ANEXO E – COMPROVANTE DE SUBMISSÃO DE ARTIGO À REVISTA
PEDIATRIC RESEARCH
94
ANEXO F – ARTIGO SUBMETIDO CONFORME AS NORMAS DA REVISTA
PEDIATRIC RESEARCH
ENTERIC VIRUSES ASSOCIATED TO INFANTILE GASTROENTERITIS IN
NORTHEAST BRAZIL
Running title: Enteric viruses in northeast Brazil
Roxana de C. Veras1,2; Patrícia de M. S. Figueiredo1; Cristina Andrade-Monteiro1,3; Jessika S.
M. Farias1; Márcia B. Alves1,3; Leandro A. Soares1; Nyla T. M. Lobão1; Valério MonteiroNeto1,4
1
Research Group of Endemic and Parasitic Diseases, CEUMA University, 2University Hospital,
Federal University of Maranhão; 3Federal Institute of Maranhão; 4Center of Health and
Biological Sciences, Federal University of Maranhão, São Luís, Maranhão, Brazil.
Corresponding author: Valério Monteiro-Neto, Universidade do CEUMA, Rua Josué Montello
No. 1, CEP: 65.075-120, São Luís-MA, Brazil. E-mail: [email protected]. Telephone:
+55 98 3214 4252. Fax: +55 98 3235 8600.
Financial support: This study received a grant from FAPEMA (Foundation of Support for
Research and Technological Development of Maranhão) No.2918/10.
Category of study: translational study
Word count of abstract: 196
Word count of manuscript: 4,484
ABSTRACT
INTRODUCTION: Viral gastroenteritis is a major cause of morbidity and mortality
throughout the world, affecting mainly children under 5 years of age.
METHODS: This study, conducted from May 2009 to May 2011, investigated the presence of
several viral pathogens in children with (76) and without (55) acute diarrhea in the city São
Luís, Maranhão, northeast Brazil.
RESULTS: Of the children studied, 26.3% (20/76) in the case group and 10.9% (6/55) in the
control group were positive for at least one of the enteric viruses studied. The viruses most
frequently detected in children with gastroenteritis were: rotavirus (13.1%) and adenovirus
(5.3%), followed by norovirus (4.0%), Aichi virus (2.6%), and astrovirus (1.3%). In the control
group, norovirus was detected more often than in cases (7.3%), followed by rotavirus (1.8%),
and adenovirus (1.8%). Rotavirus was the only one significantly associated with gastroenteritis,
of which 9 out of 11 strains were genotyped as G2P[4].
DISCUSSION: This study demonstrated that all these viruses are circulating in children in
northeast Brazil and that rotavirus is still a significant agent of gastroenteritis even after
introduction of vaccination, due to the involvement of other genotype not included in the
vaccine routinely used in Brazil.
INTRODUCTION
Diarrhea is one of the major public health problem worldwide, since it is an important cause of
morbidity and mortality among children, particularly in developing countries (1). It is estimated
that the global mortality due to diarrhea in the population up to 5 years old is almost 2 million,
which corresponds approximately to 19% of total child mortality (2). Their etiology is
associated to many microorganisms, but viruses are the major agents responsible for endemic
and epidemic gastroenteritis (3). A variety of viruses have been frequently reported in
association to infantile gastroenteritis, principally: rotavirus, adenoviruses, noroviruses,
astroviruses, and Aichi virus (4-9).
95
Rotavirus is considered the most prevalent viral enteropathogen all over the world.
Groups A, B, and C are those that produce infections in humans, but group A rotavirus causes
infection in almost every children in the first 5 years of life (10-12) and is responsible for more
than 60% of all hospital admissions of children with diarrhea in some countries (13). However,
data from case-control studies carried in Latin America countries have demonstrated a
substantial reduction in morbidity and mortality after introduction of routine vaccination for
group A rotavirus (14).
Enteric adenoviruses have a DNA genome that displays a great variability, which allows
its classification in different species and serotypes, including more than 51 human serotypes
classified in six species, from A to F. The enteric serotypes 40 and 41 (species F) are the most
frequently associated to infantile gastroenteritis (5, 15). They present variable incidences in
developing countries ranging from 2% to 31% (10).
Norovirus belongs to the Caliciviridae family and is involved in gastroenteritis in both
children and adults (16, 17). It is a small single-stranded RNA virus, which is classified in three
genogroups: genogroup I is composed by five genetic groups; genogroup II has nine genetic
groups and genogroup III has a single genetic group (18). Norovirus is considered the main
agent responsible for outbreaks of non-bacterial diarrhea and the second cause of viral
gastroenteritis after rotavirus, in many countries (10, 9). The intestinal infection is soft and selflimited, lasting for up to 48 hours and related to the consumption of contaminated food and
water (19, 20).
The astroviruses are spherical non-enveloped viruses, with well-defined borders,
presenting an stellar configuration whose genome is composed of a molecule of single-stranded
RNA, classified in the Astroviridae family. The infection caused by astroviruses in humans is
characterized by an acute gastroenteritis that lasts for two or three days and affects mainly
children under five years of age (21).
Aichi virus is a member of the Kobuvirus genus of the Picornaviridae family. It is
positive single-stranded RNA that was isolated for the first time in 1989 from a stool sample of
a patient with non-bacterial gastroenteritis associated to consumption of oysters in the province
of Aichi, in Japan. In Brazil, this virus was reported only once in sporadic gastroenteritis (22).
Despite the significant advance in the study of all these viruses as agents of epidemic and
endemic diarrhea in many countries, in Brazil, particularly in its northeast region, little is known
about their contribution to the etiology of infantile gastroenteritis. Thus, the objective of this
study was to investigate the frequency of enteric viruses in children under 5 years old with and
without diarrhea, in the city of São Luís, state of Maranhão, Brazil.
METHODS
Area of study and patients
This study was conducted from May 2009 to May 2011 in the metropolitan area of São Luís,
state capital of Maranhão, northeast Brazil. This city has a tropical climate, it is hot and humid,
with a total rainfall during the period of study of 4,060 mm. There are only a rainy (from
January to June) and a dry season (from July to December). The average temperatures vary from
24°C to 29°C with a high relative humidity of air exceeding 80% all over the year (data supplied
by the Laboratory of Meteorology, State University of Maranhão).
One hundred thirty-one stool samples of children under five years old were analyzed. Of those,
76 samples were from children with acute diarrhea (case group) and 55 did not display any
gastrointestinal symptoms (control group). Written informed consent was obtained from the
parents or legal guardians of the participants enrolled in the study. Children of both groups were
seen at two public pediatric hospitals and at a community health center. This study was
approved by the Committee on Ethics in Research of UNICEUMA (License No. 00559/09).
Laboratory Procedures
Stool samples were screened for rotavirus with the enzyme immunoassay Ridascreen® (RBiopharm, Darmstadt, Germany) and then by RT-PCR using the primers Beg9 and End9 (23)
and primers Con2 and Con3 (24). Positives samples for rotavirus were submitted to genotyping
by using specific primers to identify the genotypes G (G1-G4 and G8, G9), as well as the
genotypes P (P[4], P[6], P[8],P[9] and P[10]) (23, 24). PAGE was also carried out for the
completion of the characterization study (25, 26).
96
Noroviruses, astroviruses and Aichi viruses were also detected by RT-PCR (kit Qiagen
OneStep RT-PCR). To detect noroviruses, we used separately the pairs of primers G1SKF /
G1SKR and G2SKF / G2SKR, that amplified a fragment of the capsid gene of the genogroup I
(GI) and genogroup II (GII), respectively (27, 28). To detect astroviruses and Aichi viruses we
used, respectively, the specific primers Mon244 and Mon245, directed to the ORF2 of the viral
genome and the pair of primers Ai6261 and Ai6779 that target the RNA polymerase gene (29,
30). Viral nucleic acids were extracted from 20% stool suspensions in phosphate-buffered saline
with QIAamp viral kit (Qiagen, Hilden, Germany). RT-PCRs were carried out with Qiagen
OneStep RT-PCR, according to the manufacturer´s instructions (Qiagen, Hilden, Germany).
Human adenovirus were detected by conventional PCR using the set of primers
Hex1DEG and Hex2DEG (31).
Statistical analyzes. Statistical analyses were performed with Bioestat software version
5.0 (2007). Data were compared by the Chi-square ( 2) test of independence for the categorical
variables. Pearson’s correlation was used to compare numerical variables, rainfall rate and
number of viruses detected in the samples. In all tests, the significance level applied was 5%,
that is, it was considered significant when P < 0, 05.
RESULTS
Positive results were obtained for at least one of the studied viruses in 20 (26.3%) children of
the case group and in 6 (10.9%) controls. Rotavirus, adenovirus, and norovirus were detected in
both studied groups, but rotavirus was the only significantly associated with gastroenteritis (P =
0.0465). The frequency rates of each virus in cases and in controls were, respectively: rotavirus,
13.1% versus 1.8; adenovirus, 5.3% versus 1.8%; and norovirus, 4.0% versus 7.3% (Table 1).
Aichi virus (2.6%) and astrovirus (1.3%) were detected only in patients of the case group. All
the 7 positive samples for norovirus were shown to be of genogroup II.
Regarding age, the studied viruses, there were no significant correlations the enteric
viruses and the age groups of children (P > 0.05) (Table 2).
From the 131 children included in our study, 44 (33.5%) were vaccinated, 61 (46.5%)
were unvaccinated, and the parents of 26 (20%) children did not know or did not inform the
vaccination status. Of the 11 (8.4%) children that were positive for rotavirus, 7 of them (11.5%)
were unvaccinated, 2 (4.5%) were vaccinated and 2 (7.7%) did not know or did not inform the
vaccination status. There was no significant difference between the case and control groups in
relation to the positivity for rotavirus and the vaccination status (Table 3).
After PAGE analysis, 4 samples did not show any electrophoretic migration profile, but 7
samples showed a profile compatible to the phenotype of long type (4, 2, 3, 2), which
characterizes group A rotavirus (Figure 1). P genotyping of the 11 samples positive for rotavirus
revealed that all samples were P[4]. However, for G genotyping, 9 samples were classified as
G2, i.e., they were G2P[4] (Figure 2). Two samples did not present any of the studied G type
and did not show the product of the first amplification as well (determination of VP7).
In this study, we did not observe a significant correlation of virus detection with gender
(data not shown). The same way, we did not observed seasonality of their incidence in both
rainy and dry periods of the year (r = -0.021; p > 0.05).
DISCUSSION
The data of the present study showed that all these viruses are circulating in children in our
region, principally rotavirus. The contribution of rotavirus for infantile gastroenteritis is well
established all over the word with variable incidence rates (9, 10, 32). In Brazil, many studies
have demonstrated the prevalence of rotavirus in children with diarrhea (5, 12, 33-35), but there
are only a few studies that reported the frequency of norovirus, adenovirus, and astrovirus in
children with gastroenteritis (6, 7, 12, 36-39).
Regarding rotavirus, the results presented here corroborate findings from other countries
(9, 32, 40, 41) and also from other regions of Brazil (5, 35, 42, 43), which describe rotavirus as
an important agent of infantile gastroenteritis. However, a low detection rate (1.8%) was
observed among children in the control group. A explanation for this fact may be the
introduction of rotavirus immunization in Brazil, in 2006, reducing virus circulation among
those children.
97
According to some studies, a significant reduction in morbidity and mortality is expected
to occur after the introduction of vaccination programs. At present, two kinds of vaccines are
available, a monovalent live attenuated of G1P(8) (Rotarix®, GlaxoSmithKline Biologicals,
Rixensart, Belgium) and a pentavalent recombinant containing serotypes G1, G2, G3, G4, and
P1A(8) (RotaTeq®, Merck Vaccines, Whitehouse Station, NJ, USA) (44-48). These vaccines
are part of immunization programs in many countries of Latin America. A recent review of
published literature of case-control studies of vaccine effectiveness and population-based
studies for vaccine impact data carried out in Brazil, Mexico, Nicaragua, and Panama concluded
that rotavirus immunization have a significant impact in the reduction of both hospitalization
and mortality among children by diarrhea (14).
In São Luís, a study performed in the pre-vaccine era demonstrated a positivity rate of
32% and 9.8% for rotavirus in children with and without diarrhea, respectively. The majority of
them was of G1-serotype (66.7%) and showed long (30.9%) and short (19%) RNA migration
patterns. Some G1 strains (16.7%) did not show any migration pattern. Other strains were
serotyped as G2 (14.3%) and exhibited a short electropherotype (34). This fact reinforces the
opinion that the banding pattern of the 11 different RNA segments of rotavirus A give important
information about sample variation in certain time and place (49), since our strains were typed
as G2 and displayed a long RNA migration pattern.
In our study, if one analyzes only rotavirus in vaccinated children, a frequency of 4.5%
was observed, suggesting that rotavirus immunization had an important impact in the reduction
of morbidity by this virus. Even though we had a small sample of children enrolled, which is a
limitation of our study. The predominant rotavirus strain G2P[4] detected in our study is distinct
of the predominant type previously observed among us and also it is not included in vaccine
routinely used in Brazil. This variability in prevalence of rotavirus strain has been described in
other studies in Brazil and also in other countries (50-53). In a recent study performed with
children from 4 regions of Brazil, G2P[4] was the most frequent detected genotype (42).
Although we did not observe any statistical difference regarding age and rotavirus
gastroenteritis, a higher rate of detection occurred in children with age between 6-24 months.
This data is similar to those previously described in the literature (9, 34, 54). However, elevated
rotavirus frequencies in children aged 2 – 5 years have also been reported (55).
The frequency rates observed for adenovirus, norovirus, and astrovirus in our study were
lower than those obtained in some of these studies carried out in Brazil. Detection rates of
adenovirus in children with gastroenteritis in the Western Brazilian Amazonia were reported to
be approximately 6.4% (5). Caliciviruses, including norovirus, have been observed in 8.6% of
infants in the Central-West region (56). In São Paulo city, which is located in the Southeast
region, a detection rate of 15% has been reported for norovirus (57) For astrovirus, detection
rates have varied from 3.1% to 31.1% in several Brazilian cities (7, 36, 38, 58). Recently,
Andreasi et al. found astrovirus, adenovirus, and calivirus in frequencies 3.1%, 3.6% and 7.5%
in children in the Central-West region (7).
In this study, all positive samples for norovirus were from the genogroup II, which is
consistent with recent findings from northern Brazil (59). A significant raise in this genogroup
has been reported with a great genetic variability both in outbreaks and sporadic cases in
different countries (60, 61).
In addition to the confirmation of all these viruses in children of São Luís, the present
study is the second to report the presence of Aichi virus in Brazil, since it was detected in 2
(2.6%) children of the case group. This virus was first described in Brazil, in the Central-West
region, associated to sporadic gastroenteritis in 5 children (22).
In Brazil, the seasonal distribution of the viral infections assumes two well defined
configurations. Central-west, southeast and south regions have a striking seasonal profile,
especially in relation to rotavirus, with higher incidence of cases in the driest or coldest months
of the year (33, 35, 55). However, in northern and northeast regions, rotavirus infections occur
all over the year (34, 37). In our study, a pattern similar to the one of tropical regions was
observed, with the detection of the enteric viruses all over the year and no correlation between
the viruses frequency and rainfall rates (r = -0.021; p > 0.05). However, the lack of seasonality
of viral infections in relation to rainfall rates may also be due to the irregularity in obtaining
stool samples during the study period, but previous studies in the same city showed that the
98
enteroviruses frequency may vary during the year and that it is not related to the rainfall rates
(34, 36, 62).
In sum, the data of this study demonstrate that rotavirus is still an important agent of
infantile gastroenteritis in our region. Since G2P[4] is the new predominant strain, there is a
need to re-evaluate of the introduction of vaccines that provide protection against multiple
serotypes. Although the other enteric viruses were detected in low frequency rates, we may
suggest that, besides rotavirus and adenovirus, norovirus be also included in routine testing in
Brazil.
ACKNOWLEDGEMENTS
Authors wish to thank to FAPEMA (Foundation of Support for Research and Technological
Development of Maranhão) for financial support (grant No.2918/10).
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102
Table 1. Frequency of enteric viruses in children with and without gastroenteritis in São Luís,
MA, northeast Brazil.
Groups
Enteric viruses
Case
Control
N = 76
N = 55
2
P value
n
(%)
n
(%)
Rotavirus
10
(13.1)
1
(1.8)
3.96
0.0465
Adenovirus
4
(5.3)
1
(1.8)
0.30
0.5798
Norovirus
3
(4.0)
4
(7.3)
0.19
0.6587
Aichi virus
2
(2.6)
0
(0.0)
0.24
0.6238
Astrovirus
1
(1.3)
0
(0.0)
0.02
0.8705
Total
20
(26.3)
6
(10.9)
3.84
0.0500
103
Table 2. Distribution of enteric viruses in 76 children with gastroenteritis by age in São Luís, MA, northeast Brazil.
No. (%) of infections
Age group* No.
of
(months)
children
Total
n (%)
Rotavirus
Adenovirus
Norovirus
Aichi virus
Astrovirus
0-6
11
1
(9.1)
-
-
-
-
-
-
-
-
1 (9.1)
7-12
8
2
(25.0)
1
(12.5)
1
(12.5)
-
-
-
-
4 (50.0)
13-24
21
2
(9.5)
1
(4.7)
2
(9.5)
1
(4.7)
-
-
6 (28.5)
25-36
22
4
(18.2)
1
(4.5)
-
-
1
(4.5)
1
(4.5)
7 (31.8)
37-59
14
1
(7.1)
1
(7.1)
-
-
-
-
-
-
2 (14.3)
Total
76
10
(13.1)
4
(5.3)
3
(4.0)
2
(2.6)
1
(1.3)
20 (26.3)
*P >0.05
104
Table 3. Detection of rotavirus in case and control groups according to their vaccination status.
Vaccination status
Group
Positive/vaccinated
No. (%)
Positive/unvaccinated
No. (%)
Unknown
No. (%)
Total
No. (%)
*Case
2/25 (8)
6/25 (24)
2/26 (7.7)
10/76 (13.2)
**Control
0/19 (0)
1/36 (2.8)
-
1/55 (1.8)
Total
2/44 (4.5)***
7/61 (11.5)***
2/26 (7.7)
11/131 (8.4)
*P = 0. 2472; **P = 0.7429; ***P = 0.369
Figure. 1 Polyacrylamide gel electrophoresis stained with silver nitrate. Lane A - negative
control. Lanes B, E, F, H, I, and J - samples with long electrophoretic profile pattern. Lanes
C, D and G - negative samples in PAGE. Numbers 1 to 11 represent dsRNA segments.
105
Figure. 2 Genotyping analysis of rotavirus by agarose gel electrophoresis. a - P
genotyping using products of the first amplification and primers Con3,1T-1 to 5T1. MW: molecular weight (100 bp), Pc - positive control, 1 to 11 - positive
samples showing amplified fragments of 483 bp (P[4]). b – G genotyping using
products of the first amplification and primers End9, aAT8, aBT1, aCT2, aDT4,
aET3, and aFT9. MW - molecular weight (100 bp), Pc: positive control, 1 to 6:
positive samples showing amplified fragments of 652 bp (G2).