Avaliação antimicrobiana dos extratos etanólicos da Maytenus sp

ISSN 1678-0493
Diálogos & Ciência
w w w. f t c . b r / d i a l o g o s
Avaliação antimicrobiana dos extratos etanólicos da Maytenus sp.
(galho e casca) sobre estreptococos do grupo mutans
Jéssica Vieira Cerqueira*, Iaquine Santos da Silva, Monique Dutra Fonseca, Itaynã Barbosa
Souza, Keila Silva de Jesus, Ana Fávia Souto Barbosa, Regiane Yatsuda
Instituto Multidisciplinar em Saúde, Universidade Federal da Bahia, Vitória da Conquista, BA, Brazil
doi: 10.7447/dc.2013.011
INFORMAÇÕES
RESUMO
Histórico:
Recebido em
25/02/2013
A Maytenus sp. é utilizada a muitos anos na terapêutica clínica, contudo suas propriedades farmacológicas
continuam sob estudo. O presente estudo avaliou in vitro as propriedades antimicrobianas dos extratos
etanólicos (EE) da casca e galho da mostarda (Maytenus sp.), coletada na Floresta Nacional Contendas do
Sincorá, Semiárido da Bahia, sobre o crescimento bacteriano de estreptococos do grupo mutans. Foi
avaliada a atividade antimicrobiana dos EE por meio da determinação da Concentração Inibitória Mínima,
da Concentração Bactericida Mínima, e do Teste de Aderência Celular à superfície. As cepas testadas foram
Streptococcus mutans UA159, S. mutans Ingbritt 1600 e S. sobrinus 6715. Os EE foram testados nas
concentrações entre 31,25 a 1000 μg/mL. Foram feitas 3 triplicatas para cada experimento (n=9). As placas
foram incubadas a 37°C por 24h, a 5% CO2, sendo realizada a leitura visual do crescimento, confirmado
com corante ressazurina. Observou-se que a casca e o galho da mostarda possuem atividade antimicrobiana,
principalmente para S. mutans UA159, sendo que a casca da mostarda também inibe a aderência celular.
Assim, a mostarda é promissora para o desenvolvimento de um fitoterápico antiplaca e antimicrobiano.
Revisado em:
22/03/2013
Aceito em:
27/03/2013
Palavras-chave:
S. mutans, antimicrobianos,
plantas medicinais.
AUTORES
ABSTRACT
JVC
* [email protected]
Graduando em Biotecnologia
TITLE: Antimicrobial evaluation of ethanol extracts of Maytenus sp. (branch and bark) on
Streptococcus mutans.
Maytenus sp. has been used for many years in clinical therapy, but its pharmacological properties remain
under study. The present study evaluated in vitro antimicrobial properties of ethanolic extracts (EE) of bark
and branch mustard (Maytenus sp.), collected in the National Forest Contendas Sincorá, Bahia region
semiarid, on bacterial growth of mutans streptococci. We evaluated the antimicrobial activity of EE by
determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), Minimum Bactericidal Concentration (MBC)
and Inhibition of Cell Adhesion to the surface. Four strains were tested: Streptococcus mutans UA159,
S.mutans Ingbritt 1600 and S. sobrinus 6715. The concentrations of EE ranging from 1000 to 31.25 mg/mL.
Three triplicates were made for each experiment (n = 9). Plates were incubated at 37 ° C for 24h, 5% CO2,
being performed the visual reading of growth, confirmed with dye ressazurin. It was observed that the bark
and branch of mustard possess antimicrobial activity, especially for S. mutans UA159, and the mustard’s
bark also inhibits cell adhesion. Thus, the mustard is a promising resource for the development of
antiplaque and antibacterial phytotherapeutic.
Keywords: S. mutans, antimicrobianos, plantas medicinais.
ISS
Graduando em Biotecnologia
MDF
Graduando em Enfermagem
IBS
Graduando em Enfermagem
KSJ
Graduando em Farmácia
AFSB
Graduando em Biotecnologia
RY
Doutor em Odontologia
1. Introdução
O uso de plantas medicinais tem sido descrito por
praticamente todos os povos desde os tempos mais remotos. A
partir dos conhecimentos tradicionais do uso de plantas
medicinais na busca da solução de algum mal-estar ou cura
para alguma doença surgiram interesses comerciais e
científicos (MENGUE et al., 2001). Atualmente, o estudo das
plantas medicinais, de uma maneira geral, é feito em todos os
continentes, havendo um número maior de pesquisas onde elas
são utilizadas popularmente para fins medicinais, tais como
Índia, Argentina, alguns países da Europa, África, Japão,
China, Estados Unidos e Brasil (VAZ, 1995).
Essas plantas podem se tornar uma fonte para a extração
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das matérias-primas para a síntese de diversos tipos de
medicamentos. As plantas são uma excelente fonte na busca
de novas drogas antimicrobianas, tendo em vista que a
diversidade molecular dos produtos naturais é muito superior
àquela derivada dos processos de síntese química (NOVAIS et
al., 2003).
O Streptococcus mutans é a principal bactéria oral
responsável pelo desenvolvimento da cárie dentária
(KOYANAGI e LÉVESQUE, 2013). A cárie é ainda um
problema de saúde pública na maioria dos países
industrializados. Muitos relatos trazem que os ingredientes
antibacterianos orais usados para reduzir a cárie, em parte,
podem causar efeitos colaterais (CHEN e CHUNG, 2012).
Assim, o estudo com plantas medicinais, no intuito de
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combater o Streptococcus mutans, é fundamental para a
melhoria da saúde pública e qualidade de vida.
Estima-se que existem cerca de 500 mil espécies de
vegetais em nosso planeta. Só no Semiárido brasileiro, região
que ocupa 11,5% do território nacional, deve haver oito mil
espécies vegetais sendo que destas, 318 espécies botânicas são
endêmicas da caatinga. Perante toda essa biodiversidade, surge
a necessidade de descobrir novas moléculas bioativas, sendo
de fundamental importância, o estudo farmacológico da flora
dessa região que ainda é pouco explorada nesse aspecto
(NOVAIS et al., 2003).
A FLONA é uma área de cobertura florestal (11.034,34
hectares) de espécies predominantemente nativas e tem por
objetivos básicos o uso múltiplo e sustentável dos recursos
florestais para pesquisa científica. A FLONA situa-se nos
limites dos municípios de Contendas do Sincorá, Tanhaçu e
Ituaçu, região de caatinga do Sudoeste Baiano. Nessa região
foram identificadas 2.897 plantas, destas 71 espécies, 51
gêneros e 23 famílias botânicas, incluindo o gênero Maytenus
sp. a ser estudado no presente trabalho, cuja espécie está em
processo de identificação, e é popularmente conhecida pelos
moradores como mostarda.
O gênero Maytenus é o maior da família Celastraceae e
está inserido na subfamília Celastroideae. Atualmente são
reconhecidas cerca de 80 espécies distribuídas por todo
território brasileiro (JOFFILY E VIEIRA, 2005). É formado
por espécies arbustivas ou arbóreas encontradas em matas e
campos. As plantas desse gênero têm sido avaliadas desde a
antiguidade por possuírem extratos ricos em propriedades
medicinais. A grande variedade de propriedades atribuídas aos
extratos vegetais brutos da família Celastraceae na medicina
tradicional e na agricultura é surpreendente. Dentre elas,
destacam-se as atividades antimicrobiana, antitumoral e
antileucêmica. Ao longo dos últimos 30 anos, um grande
número de metabólitos secundários que exibem uma vasta
gama de atividades biológicas foi extraído dessa família
(SPIVEY et al., 2002). Segundo Oliveira et al. (2009), estudos
pioneiros demonstraram que algumas espécies do gênero
Maytenus exibem forte atividade antimicrobiana contra várias
bactérias Gram positivas, demonstrando ter efeito
antimicrobiano para vários patógenos, dentre eles
Staphylococcus aureus e Streptococcus sp. Plantas da dessa
família são ricas em metabólitos bioativos da classe dos
terpenos ou isoprenóides (ESTEVAM et al., 2009).
Esse trabalho traz como objetivo a avaliação da atividade
antimicrobiana e inibição da aderência celular de
estreptococos do grupo mutans pela casca e galho da mostarda
(Maytenus sp.). Futuramente a planta poderá ser utilizada no
desenvolvimento de novos fitoterápicos, bem como, validar a
atividade biológica do produto natural, garantindo o uso de
plantas medicinais, fitoterápicos e serviços relacionados à
fitoterapia, com segurança, eficácia e qualidade, na
perspectiva da integralidade da atenção à saúde.
2. Material e Métodos
Coleta do material vegetal
As coletas do material vegetal ocorreram na FLONA –
Floresta Nacional Contendas do Sincorá, uma área de
cobertura florestal de espécies predominantemente nativas que
tem por objetivos básicos o uso múltiplo sustentável dos
recursos florestais e a pesquisa científica. A FLONA situa-se
nos limites dos municípios de Contendas do Sincorá, Tanhaçu
e Ituaçu, região de caatinga do Sudoeste Baiano.
As coletas foram realizadas com auxílio de um mateiro,
morador da região e prestador de serviços para a reserva
florestal, sob a coordenação do Instituto Chico Mendes. As
plantas coletadas foram fotografadas e localizadas com o uso
de um aparelho de GPS. As coletas ocorreram na FLONA,
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com o consentimento do Instituto Brasileiro do Meio
Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA),
sendo (N 12292-1) o registro de consentimento para a
manipulação fúngica e microbiológica e (N 13258-1) o
registro de autorização para atividade com finalidade
científica. As exsicatas da planta Maytenus sp. está catalogada
e depositada no Herbário da Universidade Estadual do
Sudoeste da Bahia, campus de Vitória da Conquista, sob
coordenação do Prof. Avaldo de Oliveira S. Filho. As exsicatas
foram depositadas com os números 4909, 4951, 4986, e foram
preparadas seguindo as orientações de MORI e cols. (1989) e
a identificação taxonômica foi feita por comparação no
herbário e através da literatura.
Preparação dos extratos
A metodologia utilizada para o preparo dos extratos foi
descrita por CECHINEL FILHO et al. (1998). O extrato
etanólico foi preparado a partir da planta seca. A casca e o
galho da mostarda foram levados para a maceração exaustiva
com etanol, sendo agitados esporadicamente. O extrato foi
filtrado e levado a um evaporador rotativo sob pressão
reduzida para a eliminação do etanol, fornecendo assim o
extrato etanólico bruto.
Atividade Antimicrobiana
Os microrganismos utilizados nesta pesquisa foram as
cepas de Streptococcus mutans UA159, Streptococcus mutans
Ingbritt 1600 e Streptococcus sobrinus 6715. Os testes foram
realizados em triplicata.
Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Foi separado e autoclavado todo o material necessário
para a realização do teste, sendo também preparados os meios
Brain Heart Infusion (BHI) caldo. Em seguida foram
preparados os extratos (0,08g dos extratos diluídos em 4 mL
de etanol P.A.) com concentração final de 1000 μg/mL, sendo
realizada diluição seriada até a concentração de 31,25 μg/mL.
Foi preparado o inóculo de S. mutans UA159, S. mutans
Ingbritt 1600 e S. sobrinus 6715, de modo a obter uma
concentração bacteriana em torno de 1-2 x 108 ufc/mL (0,5 da
escala McFarland). O teste de CIM foi realizado em uma
microplaca com 96 poços, onde em cada poço, exceto nos
poços do controle negativo, era colocado 190μL de meio BHI
mais inóculo (inoculação 1:1000), adicionando em seguida
10μL do extrato. Em seguida, as placas foram incubadas em
estufa a 37ºC e 5% de CO2 por 24 horas. Durante os testes
foram utilizados como controle positivo o meio de cultura,
inóculo e veículo (etanol, concentração final 10%, v/v) e como
controle negativo apenas o meio BHI. A CIM foi definida
como a menor concentração de extrato que não houve
crescimento bacteriano visível. Para confirmar tal resultado,
foi utilizado o corante Rezasurina (Sigma®), um indicador de
alteração de pH devido o crescimento bacteriano.
Concentração Bactericida Mínima (CBM)
Para a determinação do CBM, foram selecionados os
poços que não apresentaram crescimento bacteriano visível no
ensaio de CIM para as três bactérias, incubando-se uma
alíquota (20 μL) destes em BHI Ágar. Em seguida, as placas
foram incubadas em estufa a 37ºC e 5% de CO2 por 24 horas.
A CBM foi definida como a menor concentração em que não
houve crescimento visível no meio de cultura (99,9% morte).
Aderência Celular (ADH)
Para o ensaio de Aderência Celular os inóculos de S.
mutans UA159, S. mutans Ingbritt 1600 e S. sobrinus 6715
foram preparados de modo a obter uma concentração
bacteriana em torno de 1-2 x 108 ufc/mL (0,5 da escala
McFarland), e foram inoculadas em proporção 1:100 no meio
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Tabela 1: Atividade antimicrobiana e inibição da aderência celular dos
extratos etanólicos de Maytenus sp. (mostarda) sobre estreptococos do
grupo mutans.
Microrganismo
Extrato etanólico da cascaExtrato etanólico do galho
CIM CBM
ADH
CIM
CBM
ADH
S. mutans UA159
31,25
125
3,90
31,25
31,25
S. mutans Ingbritt 1600 125
250
S. sobrinus 6715
*Todos os testes foram feitos em 3 triplicatas, os valores apresentados na tabela
estão μg/ml.
** CIM: Concentração Inibitória Mínima.
***CBM: Concentração Bactericida Mínima.
****ADH: Inibição da Aderência Celular.
***** - : Não foram obtidos resultados.
BHI suplementado com 1% de sacarose. Após a
homogeneização obteve-se uma solução com volume de 2480
μL do inóculo e 20 μL dos extratos dos produtos naturais
(concentrações finais variando entre 800 a 100 μg/mL, com
diluição seriada de razão 2). Em seguida, as placas foram
incubadas em estufa a 37ºC e 5% de CO2 por 24 horas. Após a
incubação, foi feita a lavagem com água destilada e as placas
foram coradas com cristal de violeta 1%. Também foi
realizada a leitura visual da aderência em relação aos
controles.
A concentração inibitória da aderência celular desses
microrganismos foi considerada a menor faixa de
concentração dos extratos em que não houve aderência à
superfície.
3. Resultados
Todos os resultados obtidos nos testes antimicrobianos de
CIM (Concentração Inibitória Mínima), CBM (Concentração
Bactericida Mínima) e ADH (Inibição da Aderência Celular)
dos extratos etanólicos da casca e galho de Maytenus sp. sobre
S. mutans UA159, S. mutans Ingbritt 1600 e S. sobrinus 6715
estão apresentados na Tabela 1.
Os resultados obtidos para os testes antimicrobianos com
o S. mutans UA159 dos extratos etanólicos da casca e galho da
mostarda (Tabela 1) foram expressivos. No teste de CIM, tanto
a casca quanto o galho foram capazes de inibir o crescimento
bacteriano na menor concentração testada (CIM 31,25
μg/mL), sendo necessária maior concentração (125 μg/mL) do
extrato da casca para apresentar atividade bactericida do que o
galho (31,25 μg/mL). Deste modo, para esta cepa, o extrato
etanólico do galho apresentou melhores resultados
antimicrobianos. O S. mutans Ingbritt 1600 mostrou-se
resistente a todas as concentrações de extratos do galho
utilizados nos testes de CIM e CBM, mas a casca apresentou
resultado inibitório para S. mutans Ingbritt 1600 (CIM 125
μg/mL e CBM 250 μg/mL). O S. sobrinus 6715 mostrou-se
resistente a todas as concentrações testadas de extratos, tanto
da casca quanto do galho, nos testes de CIM não houve
inibição do crescimento, não demonstrando resultado
antimicrobiano.
A partir do CIM foi realizado o teste de Aderência Celular
obtendo-se resultado apenas para o extrato etanólico da casca
da mostarda (ADH 3,90 μg/mL) para o S. mutans UA159; o
extrato do galho não apresentou resultado no teste de
aderência celular para nenhuma das cepas bacterianas testadas.
A casca e o galho da mostarda não demonstraram resultados
de inibição da aderência com S. sobrinus 6715.
4. Discussão
Nos últimos anos, muitos antibacterianos têm apresentado
pouca eficácia no que diz respeito ao combate às doenças
infecciosas, isso ocorre principalmente devido a alta
incidência
de
infecções
causadas
por
bactérias
multirresistentes. Partindo desse ponto, os profissionais da
saúde enfrentam constantemente um desafio para combater
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tais infecções (SANTOS et al., 2011). Portanto, ações devem
ser tomadas para reduzir esse problema com intuito de
controlar o uso de antibióticos. Desenvolver pesquisas para
compreender melhor os mecanismos genéticos de resistência,
e dar seguimento aos estudos para desenvolver novos
medicamentos, sintético ou natural, é uma das formas de atuar
sobre esse problema (NASCIMENTO et al., 2000).
Sendo assim, a busca por substâncias com
atividade antimicrobiana é cada vez mais frequente e as
plantas medicinais têm sido consideradas uma opção
interessante devido à sua utilização na medicina popular para
tratar várias doenças infecciosas. Aumentando de forma
exponencial as investigações das atividades antimicrobianas
de produtos naturais contra microrganismos bucais (SILVA, et
al. 2012).
A atividade antimicrobiana de extratos vegetais é avaliada
através da determinação de uma pequena quantidade da
substância necessária para inibir o crescimento do
microrganismo-teste (CIM) (OSTROSKY et al., 2008). Em
nosso estudo, os melhores resultados dos extratos etanólicos
da casca e o galho da mostarda foram obtidos principalmente
para S. mutans UA159, em baixa concentração, sendo que a
casca da mostarda também inibe a aderência celular desse
microrganismo, um importante fator de virulência. Bianco et
al., avaliou a atividade do extrato do caule de cancerosa
(Maytenus ilicifolius), Estudos pioneiros como o de Lima et al.
(1969) já demonstravam que a maitenina, composto isolado da
Maytenus ilicifolius, conhecida popularmente como
"espinheira-santa", exibe forte atividade antimicrobiana contra
várias bactérias Gram positivas. Tais efeitos foram
corroborados com a demonstração que os extratos das folhas e
raízes têm efeito antimicrobiano para vários patógenos, dentre
eles Staphylococcus aureus e Streptococcus sp. (OLIVEIRA et
al., 2009).
A constituição química da casca e galho deve ser
semelhante
quanto
à
presença
de
composto(s)
antimicrobiano(s). No entanto, a presença de compostos com
atividade antiaderência deve estar presentes somente na casca,
ou com maior concentração no extrato da casca do que no
galho. Deste modo, a mostarda é uma promissora planta para o
desenvolvimento de um novo fitoterápico antiplaca e
antimicrobiano, e mais estudos devem ser realizados quanto à
composição química e entendimento da atividade sobre os
fatores de virulência dos S. mutans.
5. Agradecimentos
A todo o grupo de pesquisa. Aos órgãos financiadores:
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq-Universal 14/2010), a Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB - PPSUS),
Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nível
Superior (CAPES), Projeto Permanecer UFBA e o Programa
de Educação Tutorial de Biotecnologia (PET MEC).
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