Kaio César de Melo Gorgonha

Capa do trabalho
Capa não se inumera
Quebra
Pró-Reitoria de Graduação
de
seção,
outro
Curso de Biomedicina
Trabalho de Conclusão de Curso
document
A Importância da Autofagia na Apresentação de Antígenos de
Cryptococcus neoformans por Macrófagos
Autor: Kaio César de Melo Gorgonha
Orientador: Dr. André Moraes Nicola
Brasília-DF
2015
KAIO CÉSAR DE MELO GORGONHA
A Importância da Autofagia na Apresentação de Antígenos de
Cryptococcus neoformans por Macrófagos
Monografia apresentada ao curso de
graduação
Universidade
em
Biomedicina
Católica
de
da
Brasília,
como requisito parcial para obtenção
do Título de Bacharel em Biomedicina.
Orientador: Dr. André Morares Nicola
Brasília – DF
2015
FOLHA DE APROVAÇÃO
Monografia de autoria de Kaio César de Melo Gorgonha, intitulado “A
IMPORTÂNCIA DA AUTOFAGIA NA APRESENTAÇÃO DE ANTÍGENOS DE
CRYPTOCOCCUS NEOFORMANS POR MACRÓFAGOS” apresentada como
requisito parcial para obtenção do grau de Bacharel em Biomedicina da
Universidade Católica de Brasília, em 25/05de 2015, defendida e aprovada pela
banca examinadora abaixo assinada:
_________________________________________
Dr. André Moraes Nicola
Orientador
UCB
_________________________________________
Dra. Verenice Paredez Hernandez
Banca examinadora
_________________________________________
Dra. Tatiana Karla Borges
Banca examinadora
SUMÀRIO
1
INTRODUÇÃO ............................................................................................ 7
1.1
A CRIPTOCOCOSE ............................................................................. 7
1.2
CRYPTOCOCCUS E A MP98 .............................................................. 7
1.3
IMUNOLOGIA DA CRIPTOCOCOSE................................................... 9
2
JUSTIFICATIVA E PERSPECTIVAS ....................................................... 11
3
HIPÓTESE ................................................................................................ 12
4
OBJETIVOS ............................................................................................. 13
5
6
4.1
OBJETIVO GERAL............................................................................. 13
4.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................. 13
MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................... 14
5.1
PRODUÇÃO DE MP98 RECOMBINANTE......................................... 14
5.2
PRODUÇÃO DOS LENTIVÍRUS ........................................................ 15
RESULTADOS ......................................................................................... 17
6.1
PRODUÇÃO DE MP98 RECOMBINANTE......................................... 17
6.2
PRODUÇÃO DE LENTIVÍRUS ........................................................... 19
7
DISCUSSÃO ............................................................................................. 21
8
CONCLUSÃO ........................................................................................... 23
9
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................ 24
RESUMO
GORGONHA, Kaio César de Melo. A Importância da Autofagia na Apresentação
de Antígenos de Cryptococcus neoformans por Macrófagos. 2015. Trabalho de
Conclusão de Curso em Biomedicina – UCB. Brasília, 2015
Cryptococcus neoformans é uma levedura encapsulada causadora de
meningoencefalite oportunista. Estima-se que mais de 650.000 pessoas morram por
ano em decorrência da criptococose, a maioria em países em desenvolvimento Os
macrófagos são as principais células efetoras do sistema imune na resposta contra
C. neoformans, eles fagocitam, apresentam antígenos e secretam citocinas na
tentativa de montar uma resposta imune e controlar a disseminação sistêmica do
fungo. A autofagia é um processo pelo qual células eucarióticas reciclam material
intracelular. O processo de iniciação é feito por uma bicamada lipídica chamada
fagóforo que tem o objetivo de englobar o componente citoplasmático a ser
reciclado. Depois do fechamento completo essa membrana recebe o nome de
autofagossomo, que irá se fundir com um lisossomo resultando na degradação do
material englobado. Trabalhos recentes com vários tipos de microrganismo mostram
que as atividades efetoras de macrófagos, como a fagocitose, atividade
antimicrobiana, secreção de citocinas e apresentação de antígenos, são
influenciadas pela autofagia. No modelo de criptococose, especificamente, já se
demonstrou que a autofagia tem um papel na atividade fungistática do macrófago e
na sua produção de citocinas. A hipótese de trabalho da linha de pesquisa na qual
este trabalho de conclusão de curso se insere é que a autofagia também está
envolvida na outra atividade de macrófagos contra C. neoformans: a apresentação
de antígenos. Para testar essa hipótese, será feito um experimento com macrófagos
nos quais a maquinaria autofágica foi desligada por meio de RNA de interferência
contra um gene envolvido na formação de autofagossomos, o ATG5. Além de gerar
estes macrófagos, é necessário produzir uma proteína recombinante de C.
neoformans chamada MP98, um excelente antígeno para ativação de células T.
Espera-se que, na falta de autofagia nos macrófagos, a apresentação de MP98
medida pela produção de IL-2 por células T seja diminuída. O objetivo deste plano
de trabalho foi gerar as ferramentas necessárias para que este complexo
experimento possa ser realizado. Macrófagos com interferência na expressão do
gene ATG5 foram gerados por transdução de vetores lentivirais contendo shRNA
contra o gene. A proteína MP98 foi produzida por expressão heteróloga em Pichia
pastoris, purificada por cromatografia de afinidade em colunas de níquel-NTA e
quantificada por espectrofotometria. Estas ferramentas experimentais foram obtidas
com sucesso em quantidade e qualidade suficientes para o andamento da linha de
pesquisa.
ABSTRACT
Cryptococcus
neoformans
is
an
encapsulated
yeast
causing
opportunistic
meningoencephalitis. It is estimated that more than 650,000 people die each year as
a result of cryptococcosis, mostly in developing countries. Macrophages are the
major effector cells of the immune system in response against C. neoformans; they
phagocytose, present antigens and secrete cytokines in an attempt to build an
immune response and control systemic spread of the fungus. Autophagy is a process
by which eukaryotic cells recycle intracellular material. It initiates with a lipid bilayer
called phagophore that surrounds the cytoplasmic component to be recycled. After
the complete closure of this membrane it is called autophagosome and it merges with
a lysosome resulting in degradation of the enclosed material. Recent work with
various types of microorganism shows the effector activity of macrophages, such as
phagocytosis, antimicrobial activity, secretion of cytokines and antigen presentation
are influenced by autophagy. In the model of cryptococcosis, specifically, it has been
shown that autophagy plays a role in fungistatic activity of macrophages and their
production of cytokines. This project is part of a broader line of research whose
working hypothesis is that autophagy is also involved in the other activity of
macrophages against C. neoformans: the presentation of antigens. To test this
hypothesis, an experiment with macrophages in which the autophagic machinery has
been switched off by means of RNA interference against a gene involved in the
formation of autophagosomes, Atg5, will be done. In addition to generating these
macrophages, it is necessary to produce a C. neoformans recombinant protein called
MP98, an excellent antigen for T cell activation. It is expected that in the absence of
autophagy in macrophages, the presentation of MP98, measured by IL-2 production
by T cells, will be decreased. The objective of this work was to generate the
necessary tools so that this complex experiment can be done. Macrophages with
Atg5 interference were generated by lentiviral transduction vectors containing shRNA
against the gene. The MP98 protein was produced by heterologous expression in
Pichia pastoris, purified by affinity chromatography on nickel-NTA columns and
quantified
by
spectrophotometry.
These
experimental
tools
were
obtained
successfully in sufficient quantity and quality to move on with the research.
7
1
1.1
INTRODUÇÃO
A CRIPTOCOCOSE
Cryptococcus neoformans, o agente etiológico da criptococose, é um
basidiomiceto de distribuição global que existe normalmente como um saprófita de
solo (PERFECT; CASADEVALL, 2002). A infecção inicial por C. neoformans ocorre
por inalação de esporos do fungo e é efetivamente controlada pela formação de
granulomas, que impedem a disseminação do fungo e estabelecem um estado
assintomático de dormência da infecção. Em caso de comprometimento da
imunidade celular, a infecção é reativada e se espalha sistemicamente, causando
principalmente uma meningoencefalite severa. Estima-se que mais de 650.000
pessoas morram por ano em decorrência da criptococose, a maioria em países em
desenvolvimento (JARVIS; HARRISON, 2007).
1.2
CRYPTOCOCCUS E A MP98
As células de C. neoformans são revestidas por uma cápsula polissacarídica
que é seu principal fator de virulência, com papéis defensivos e ofensivos (
VECCHIARELLI, 2000 ; PERFECT, 2005). A cápsula de C. neoformans possui
tamanho variável, chegando a medir de 5 a 30 µm, medidos a partir da parede
celular do fungo (RIVERA et al., 1998 ; FELDMESSER; KRESS; CASADEVALL,
2001) . A cápsula é formada por um gel de polissacarídeos hidratados, portando
polímeros de alto peso molecular, como a glicuronoxilomanana (GXM), a
galactoxilomanana (GalXM) e as manoprot;eínas (MP) (FRIES et al., 2001; KUMAR
et al., 2011). Aproximadamente 90% da capsula é composta por GXM (GRECHI et
al., 2011), 9% é composto por GalXM e as manoproteínas correspondem a menos
de 1% da massa da cápsula (TEIXEIRA et al., 2014). Apesar de se apresentar em
menor quantidade em comparação com os outros carboidratos da cápsula do
C.neoformans, as manoproteínas são bem mais imunogênicas (MURPHY et al.,
1988; RODRIGUES; NIMRICHTER, 2012; TEIXEIRA et al., 2014). Elas têm um
papel fundamental na indução imunitária mediada por células T, sendo responsável
por desencadear uma resposta de hipersensibilidade tardia (FRIES et al., 2001;
MURPHY et al., 1988)
8
Para estudar o papel das manoproteínas, Levitz e colaboradores geraram um
hibridoma de células T denominado P1D6, capaz de produzir de IL-2 em resposta a
uma manoproteína chamada de MP98 (LEVITZ et al., 2001). Utilizando a ferramenta
BLAST, que permite comparar informações de sequências biológicas baseadas num
banco de dados, revelou-se que a MP98 apresenta homologia com quitina
desacetilases de outras espécies de fungos (LEVITZ et al., 2001), por isso também
é conhecida por Cda2. A sequência dessa proteína revela uma sequência sinal, um
domínio funcional, regiões ricas em Ser/Thr (de O-Glicosilação), regiões com
sequências Asn-Xaa-Ser/Thr (de N-glicosilação) e um local de ancoramento de
glico-fosfatidil-inositol (GPI) (LEVITZ, STUART.; SPECHT, 2006). Mp98/Cda2
catalisa um processo de conversão do polissacarídeo quitina num derivado mais
solúvel, a quitosana (EIGENHEER et al., 2007). Existem outras duas desacetilases
de quitina em Cryptococcus, Cda1 e a Cda3 (BAKER et al., 2007). Estudos
demonstram que mutantes com supressão dos genes de todos os três tipos de
quitina desacetilases não produziram quitosana, o que levou uma maior
sensibilidade da parede celular do fungo a agentes químicos, um crescimento mais
lento e dissociação incompleta dos brotos (BAKER et al., 2007). Estes resultados
levam a crer que sem a quitosana o fungo perde a virulência (BAKER; SPECHT;
LODGE, 2011).
Figura 1. Manoproteína Cda2/MP-98 de C.neoformans
Fonte: Adaptado de LEVITZ et al. 2006.
9
1.3
IMUNOLOGIA DA CRIPTOCOCOSE
Os Macrófagos são considerados as mais importantes células efetoras do
sistema imune na resposta contra C. neoformans. Estas células imunitárias
fagocitam o fungo e o contém em fagossomos, onde ele é exposto a substâncias
antifúngicas como espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, hidrolases e peptídios
antimicrobianos (FELDMESSER; TUCKER; CASADEVALL, 2001;
LEVITZ et al.,
1999). Por outro lado, os macrófagos também são utilizados como nicho para
sobrevivência de C. neoformans no hospedeiro (FELDMESSER; TUCKER; et al.,
2001; LEVITZ et al., 1999).
Dada a importância dos macrófagos na resposta imune contra C. neoformans,
se torna essencial entender quais os mecanismos utilizados na defesa contra este
fungo oportunista. Estudos realizados na última década sugerem que macrófagos
utilizam a autofagia na resposta imune a patógenos intracelulares (LEVINE, 2005).
Conservada em todos os eucariotos, a autofagia é usada pela célula para reciclar
materiais citoplasmáticos, desde proteínas até organelas inteiras (MIZUSHIMA,
2007). O processo de autofagia se inicia com a formação de uma estrutura chamada
fagóforo, uma vesícula que gradualmente cresce em forma de lua crescente
englobando o material a ser reciclado em um compartimento envolto por duas
bicamadas lipídicas. Esta vesícula, chamada autofagossomo, se funde então com
lisossomos, que degradam o material em seu interior e permitem sua reutilização
(MIZUSHIMA, 2007). Muito já se conhece sobre a maquinaria molecular envolvida
na autofagia, e nesse projeto será analisada uma proteína que é especialmente
importante nesse processo, uma enzima que catalisa um passo essencial para que a
formação de autofagossomos chamada ATG5 (MIZUSHIMA, 2007).
Trabalhos recentes têm demonstrado que, além de seu papel na reciclagem,
a autofagia também é importante na imunidade contra patógenos intracelulares
como herpes simplex vírus (TALLOCZY et al., 2002), Listaria monocytogenes
(RICH; BURKETT; WEBSTER, 2003) ou Mycobacterium tuberculoses (GUTIERREZ
et al., 2004), além de participar da apresentação de antígenos tanto por MHC I
quanto por MHC II (MUNZ, 2010). Além disso, macrófagos em que a autofagia foi
diminuída por interferência de RNA contra ATG5 foram menos capazes de controlar
o crescimento de C. neoformans e mostraram um perfil diferente de secreção de
citocinas {Nicola, 2012 #910}. Como macrófagos possuem três funções principais na
10
resposta imune a C.neoformans (1 - fagocitose e morte do patógeno, 2 - secreção
de o citocinas e outros mediadores inflamatórios e 3 – apresentação de antígenos do
fungo) e as duas primeiras já foram estudadas, foi estabelecida uma linha de
pesquisa para determinar se o papel da autofagia também é necessário para
apresentação de antígenos de C. neoformans.
11
2
JUSTIFICATIVA E PERSPECTIVAS
C. neoformans é um fungo cosmopolita, sua presença ocorre em diversos
substratos orgânicos, frequentemente associa-se a habitat de aves e suas fezes,
madeira em decomposição e não o bastante, também é encontrado em até 50 %
das amostras de poeira domiciliar (SWINNE et al., 1989). A criptococose era uma
infecção rara, mas após o início dos anos 80 ela se tornou cada vez mais frequente;
este aumento deve-se ao constante avanço da medicina moderna que permite a
sobrevida de pacientes com o sistema imune debilitado como a de indivíduos
transplantados, portadores de câncer em quimioterapia e principalmente a pandemia
da AIDS. Cerca de três quartos dos casos de criptococose associados com a
Síndrome da imunodeficiência humana se desenvolve quando o número de T CD4
está menor que 50 células/mL (PINNER; HAJJEH; POWDERLY, 1995). A
anfotericina B, flucitosina e os azólicos são fármacos de escolha utilizados para
tratamento da criptococose, mas ainda apresentam problemas de espectro de ação,
resistência, custo elevado e efeitos adversos tóxicos (LIN; HEITMAN, 2006).
Sabendo que a susceptibilidade à doença tem uma relação íntima com o
estado do sistema imunológico do indivíduo e da necessidade de melhorias no
tratamento, fica cada vez mais evidente a necessidade de se estudar esta relação
patógeno vs hospedeiro in vitro, que aliada a um estudo clínico, possibilita o futuro
estabelecimento de estratégias no tratamento de criptococose.
12
3
HIPÓTESE
A hipótese da linha de pesquisa na qual este trabalho se inclui é de que o
mecanismo de autofagia nos macrófagos seja importante para que uma
apresentação de antígenos de C. neoformans eficiente.
13
4
OBJETIVOS
4.1
Objetivo geral
O objetivo deste plano de trabalho é gerar ferramentas para a realização de
um experimento que permita identificar o papel da autofagia de macrófagos na
apresentação de antígenos de C. neoformans.
4.2

Objetivos específicos
Gerar macrófagos com interferência no gene relacionado à autofagia
ATG5.

Produzir e purificar um antígeno recombinante de C. neoformans, a
manoproteína MP98.
14
5
5.1
MATERIAL E MÉTODOS
PRODUÇÃO DE MP98 RECOMBINANTE
Vetor de expressão
O gene que codifica a MP98 foi inserido no vetor de expressão pPICZα
(Invitrogen) e transformado em P. pastoris X-33 por utilização do kit de
Transformação da Pichia Easy Comp (Invitrogen). Leveduras transgênicas capazes
de expressar a proteína foram cedidas pelo pesquisador estadunidense Stuart
Levitz. Foi feito repique em Meio YPD + Zeocina para se obter uma única colônia
que seguiu para o pré-inóculo em meio BMGY + Glicerol por 24 horas a 28 °C.
Quando o pré-ínóculo chegou à OD de 0,5 ele foi lavado (para retirada do Glicerol) e
incubado para a indução em BMGY por 72 horas a 28 °C. Ao longo das 72 horas de
incubação foram adicionados 0,5% de metanol no meio, após 24 e 48 horas,
induzindo os promotores AOX a expressar a manoproteína MP98 recombinante.
Meios de Cultura
Meio YPD para o repique de fungos: extrato de levedura a 1%, peptona a 2%
e dextrose a 2% completado com água destilada até um volume final de 100 ml.
Meio BMGY para expressão em P. pastoris X-33: 10 ml de YP (2% extrato de
levedura, 4% peptona em 50 ml de água destilada), 2,5 ml de Tampão potássio 1 M
pH 6,0 (13,2 ml K2HPO4 + 86,8 ml KH2PO4 em 100 ml de água destilada), 2,5 ml de
YNB sem aminoácidos 10x (YNB sem aminoácidos + 10 g Sulfato de amônio em 100
ml de agua destilada), 200 µl de biotina, 2,5 ml de glicerol e água destilada num
volume final de 25 ml.
SDS-PAGE
A proteína recombinante foi analisada em gel de poliacrilamida contendo
SDS. O gel foi feito com poliacrilamida a 12% ( para obtermos um range de
empilhamento de proteínas entre 10 kDa e 200 kDa ) com a adição de 0,045% de
persulfato de amônio e 0,075% de TEMED. A solução de gel concentrador 4% foi
preparada com persulfato de amônio a
0,12% e TEMED a 0,05%, Depois da
completa polimerização, o sistema de géis foi acoplado a cuba de eletroforese
vertical 10x10cm.
15
As amostras de cada tempo da indução foram fervidas por 5 minutos e 10 µL
de cada uma delas e os marcadores de massa molecular Unstained Protein
Molecular Weight Marker (Life Technologies ) e pré-corado Precision Plus Protein
Standards Dual Color (BIO-RAD). A corrida do gel foi feita em tampão Tris-glicina.
Terminada a eletroforese, o gel foi corado para visualização da proteína, e depois
transferido para membrana para procedimentos de western-blot.
Coloração e visualização do gel
O gel foi corado com Coomassie Blue para a visualização do perfil protéico,
por 1 hora, sob agitação. Depois o gel foi lavado com uma solução descorante e
visualizado
num
aparelho
transiluminador
de
luz
branca,
scaneado
para
documentação do perfil protéico das amostras, como mostra a figura 2 e 3
Western-blot
Depois da cromatografia de afinidade o outro gel foi feito para analizarmos a
eficiência das eluições. Ele foi incubado por 30 min em solução de transferência e
transferido para uma membrana de nitrocelulose (Amershan Pharmacia Biotech)
ultilizando o aparelho Trans-Blot SD Semi-Dry Eletrophoretic Transfer Cell (BIORAD) .Este aparelho possui dois eletrodos e submetidos a uma corrente elétrica de
15V durante 15 minutos. Após a transferência, a membrana foi bloqueada com
solução de leite desnatado comercial (5%) em PBST 1X por 1 hora a temperatura
ambiente, sob leve agitação, depois lavada 3 vezes com PBST 1X por 5 minutos e
incubada durante 2 horas a temperatura ambiente, sob leve agitação, com anticorpo
monoclonal anti-polyHis conjugado com fosfatase alcalina (Sigma) na diluição
1:1000 em solução PBS. Após a incubação, a membrana foi lavada 3 vezes de 5
minutos com PBST 1X. Em seguida, a membrana foi imersa em solução APB e
submetida ao tratamento com a solução reveladora de western-blot (NBT e BCIP)
até o aparecimento das bandas. A membrana foi finalmente lavada com água
destilada, seca a temperatura ambiente e fotografada, como mostra a Figura 3.
5.2
PRODUÇÃO DOS LENTIVÍRUS
Este trabalho foi feito em parceria com Kellyane Teixeira Rangel, durante seu
Mestrado.
16
Diminuição da autofagia por meio de interferência com ATG5
Para obter macrófagos com deficiência na autofagia, células J774 foram
transduzidas com os vetores lentivirais, que resultam em integração de shRNAs
(short hairpin RNA) cujo alvo é ATG5 no genoma da célula. Estes shRNAs são
processados pela célula e transformados em siRNAs (small interfering RNA), que
resultam na degradação do mRNA e consequente silenciamento de ATG5.
Geração de células J774 com ATG5 shRna
Para montar uma partícula lentiviral são necessários vários plasmídeos
carregando uma sequência com função singular. Plasmídeos de expressão em
mamíferos são eles: TAT, REV, VSV-G e GAG-POL. As sequências de
empacotamento que estes plasmídeos carregam foram originadas de retrovírus
(Vírus da Imunodeficiência humana 1 - HIV-1) e do vírus da estomatite vesicular
humano (VSV).
O outro vetor utilizado é o plasmídeo pLK0.1. Este é o vetor que carrega a
sequência de RNA interferente que foi transcrito. A sequência escolhida tem como
foco o gene ATG5 de camundongo. Estes conjuntos de plasmídeos foram
importados e multiplicados em Escherichia coli termocompetente da linhagem
Omnimax em meio LB (sendo cultivadas sob o protocolo Inoue com multiplicação
bacteriana a 18ºC) e depois extraídas com o kit comercial de mini preparação
GenElute (Sigma). Com as células HEK 293T foram realizados os procedimentos de
transfecção com lipídeos catiônicos. As placas foram preenchidas com vetores
pLKO.1 contendo shRNAs contra Atg5 de camundongo.
RT-PCR em tempo real
O RNA foi extraído das células J774 com o knockout por meio do uso do
reagente trizol e de 1-bromo-3-cloropropano e, em um gel com 1% de tampão TAE
livre de RNAse, foi colocado 70ng do RNA extraído com o corante de carregamento,
deixando o RNA extraído correr no gel por 40 minutos a 70V/400mA. Uma qPCR foi
realizada com 2µl de tampão TAQ/sybrgreen, 0.8ul dNTPs, 1µl de mix de primer por
amostra, além de 4µl de cDNA diluído.
17
6
6.1
RESULTADOS
PRODUÇÃO DE MP98 RECOMBINANTE
Fizemos o repique em Meio YPD + Zeocina com cepa que carrega o gene que
codifica a MP98 e montamos o pré-ínóculo em meio BMGY + Glicerol por 24 horas a
28 °C. Lavamos para a retirada do glicerol e incubamos em meio BMGY por 72
horas a 28 °C. Para monitorar se a produção da proteína estava ocorrendo,
coletamos amostras da cultura nos tempos 24, 48 e 72 horas de indução. Essas
amostras foram precipitadas com uma Solução de TCA (ácido tricloroacético) e
comparadas por eletroforese, como mostra a Figura 2.
Figura 2. Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida submetido à coloração
com coomassie blue por 30 minutos. Mostrando o aumento das bandas entre 90 e
100 kDa ao longo das 72 horas de indução da expressão da MP98 por P. pastoris.
Purificação da MP98 recombinante por cromatografia de afinidade
O vetor de expressão utilizado, pPICZα, (Invitrogen) permitiu adicionar a
proteína MP98 uma cauda de 6 (seis) histidinas (His-Tag). Essa adição tem como
18
objetivo separar a proteína de interesse, purificando por cromatografia de afinidade.
O sobrenadante, contendo a proteína solúvel expressa, foi separado para realização
da purificação em coluna contendo a resina NiSepharose6FastFlow (GE
Healthcare).
Figura 3. Eletroforese de proteínas em gel de poliacrilamida que foi submetido ao
ensaio de western blot com InVision™ His-tag In-gel Stain e corado com coomassie
blue por 30 minutos. O gel mostra que a segunda eluição nas colunas resina
NiSepharose6 foi a que carregou maiores quantidades de proteína.
Quantificação da MP98
Concentramos
os
tubos
com
a
Eluição
2
e
quantificamos
espectrofotometria. A concentração obtida foi de 3,42 mg/ml.
ultilizando
19
6.2
PRODUÇÃO DE LENTIVÍRUS
Transfecção de HEK293T
As células HEK 293T foram cultivadas incubadas com o mix de produção
lentiviral
(vetores
pLK0.1,
plasmídeos
de
empacotamento,
OptiMEM
e
lipofectamina). Após o período de incubação, foram realizadas coletas do
sobrenadante a cada 12 horas. Os sobrenadantes coletados foram centrifugados a
baixa velocidade para sedimentar restos celulares e centrifugado novamente em
eppendorfs a 20.000g por 90 min a 4 °C para concentração.
Transdução de J774
Células J774 foram cultivadas em placas, sendo adicionada posteriormente a
concentração de lentivírus de 100µl, 50µl e 10µl. Foi transferido o volume da placa
de 96 poços para uma placa de 6 poços, usando 5µg/ml de puromicina para
selecionar as células transfectadas. Após atingir a confluência necessária, uma
alíquota das células foi utilizada para produção de RNA a ser utilizado em reações
de qPCR.
RT-PCR em tempo real
Valor absoluto da expressão do gene
Unidades Arbitrárias
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5
0
Amostras
20
Figura 4 – Resultado do qPCR. Expressão absoluta do gene em unidades
arbitrárias (UA), que é o resultado da razão entre a eficiência da reação (Q) e o fator
de normalização da amostra. O gene endógeno usado como controle do teste foi o
ACT1. No gel é possível observar que os lentivírus 305 e 306 na menor
concentração obtiveram o maior silenciamento do gene ATG5.
21
7
DISCUSSÃO
P.pastoris é uma levedura metilotrófica capaz de metabolizar metanol como
única fonte de carbono devido ao gene que codifica a enzima álcool oxidase (AOX
1). Além de ser fortemente regulada pela presença de metanol, a AOX1 também é
fortemente inibida pela presença de algumas fontes de carbono como o glicerol.
Estas peculiaridades metabólicas fazem com que P pastoris seja um importante
modelo de produção de proteínas recombinantes. Além disso, ela foi escolhida para
este trabalho por ser capaz de produzir proteínas com alto grau de manosilação
(LAM et al., 2005), necessárias para completa imunogenicidade da MP98.
(SPECHT et al., 2007).
O sistema de expressão heteróloga em P. pastoris tem outras vantagens:
pode ser obtida comercialmente e cultivada de forma simples, em pequena ou larga
escala, com uma produção significativa e de forma bem menos dispendiosa que
outros modelos eucarióticos de expressão heteróloga.
Além da capacidade de ser induzida com metanol, a P.pastoris e o vetor de
expressão pPICZα possuem outras características que foram críticas para o
desenvolvimento deste trabalho: capacidade de adição de peptídeo sinal e cauda de
poli-histidina. Estas características são fundamentais quando se pensa em
purificação da MP98, uma vez que o peptídeo sinal leva a secreção da proteína para
o meio extracelular e a adição da cauda de poli-histidina permite a separação da
proteína por métodos simples de cromatografia e visualização por Western-blot.
Uma das maneiras de se observar qual a função de um componente num
determinado processo é o teste de perda de função. Para tentar mostrar qual a
importância do processo da autofagia de macrófagos na apresentação de antígenos
de C. neoformans utilizamos uma ferramenta que se mostra cada dia mais poderosa
nos estudos de função de genes em mamíferos, o RNA de interferência. O
mecanismo é baseado inserção citoplasmática de sequências de RNA dupla fita
idêntica a que se deseja inibir, desencadeando uma via enzimática envolvendo um
complexo de silenciamento (RISC) induzido por RNA, resultando em silenciamento
do RNA alvo com estabilidade a longo prazo (MANIATAKI; MOURELATOS, 2005;
MOORE et al., 2010).
O gene que foi silenciado em células J774 é o que codifica a Atg5, uma
proteína necessária no durante a elongação do autofagossomo. Atg5 é ativada pela
22
proteína Atg7 formando um complexo necessário na conjugação do LC3-I a
fosfatidiletanolamina. Este complexo origina o LC3-II que sinaliza a conclusão
processo autofágico (CODOGNO; MEIJER, 2006).
Células J774 são sabidamente refratárias a transfecção com metodologias
mais comuns, como lipídeos catiônicos e nucleofecção. Para contornar esta
dificuldade, utilizamos vetores lentivirais. Resultado de engenharia genética que
combina vírus como HIV e VSV, estes vetores possuem altíssima eficiência de
transdução de material genético para macrófagos (>95%). Além disso, resultam em
integração permanente do material genético transduzido ao núcleo da célula,
gerando o silenciamento estável de Atg5 que é necessário neste projeto.
23
8
CONCLUSÃO
Ao longo deste trabalho de TCC implementamos importantes tecnologias de
imunologia e bioquímica que tornaram possíveis a realização de experimentos de
apresentação de antígenos necessários para testar a hipótese da linha de trabalho
do grupo de pesquisa. A proteína MP98 foi produzida, purificada e concentrada com
sucesso, gerando uma fonte precisa de antígenos para apresentação. Utilizando
RNA de interferência, geramos macrófagos com defeitos na maquinaria autofágica.
Com essas ferramentas, poderemos finalmente realizar experimentos in vitro e ex
vivo para testar o efeito da autofagia na apresentação de antígenos de C.
neoformans.
O
conhecimento
gerado
poderá
futuramente
servir
para
o
desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e/ou profiláticas para a
criptococose.
24
9
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