Dissertação_ICS_Jamille Souza Fernandes

UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
JAMILLE SOUZA FERNANDES
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE MONÓCITOS DE
PACIENTES COM FIBROSE PERIPORTAL SECUNDÁRIA À
ESQUISTOSSOMOSE
Salvador, BA
2013
JAMILLE SOUZA FERNANDES
CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE MONÓCITOS DE
PACIENTES COM FIBROSE PERIPORTAL SECUNDÁRIA
A ESQUISTOSSOMOSE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Imunologia da Universidade Federal da Bahia, como requisito
parcial para obtenção do título de Mestre em Imunologia.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Ilma A. Santos Araujo
Co-orientadora: Profa. Dra. Luciana Santos Cardoso
Salvador, BA
2013
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Universitária de
Saúde, SIBI - UFBA.
F363
Fernandes, Jamille Souza
Caracterização fenotípica de monócitos de pacientes com
fibrose periportal secundária à esquistossomose / Jamille Souza
Fernandes – Salvador, 2013.
93 f.
Orientadora: Profª Drª Maria Ilma Andrade Santos Araujo
Co-orientadora: Profª Drª Luciana Santos Cardoso
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal da Bahia.
Instituto de Ciências da Saúde, 2013.
1. Esquistossomose. 2. Fibrose Periportal. 3. Monócitos. I.
Araujo, Maria Ilma Andrade Santos. II. Cardoso, Luciana
Santos. III. Universidade Federal da Bahia. IV. Título.
CDU 616.995.122
ATA DA SESSÃO PÚBLICA DO COLEGIADO DO PROGRAMA DE PÓSGRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA PARA JULGAMENTO DA DISSERTAÇÃO DA
MESTRANDA JAMILLE SOUZA FERNANDES
Aos vinte e sete dias do mês de março do ano de dois mil e treze às quatorze horas no
Auditório III do 2º andar no Instituto de Ciências da Saúde, em sessão pública, a Banca
Examinadora composta pelos Professores: Dra. Maria Ilma Andrade Santos Araujo,
Orientadora, Dra. Amélia Maria Ribeiro de Jesus, Dr. Régis de Albuquerque Campos se
reúne com a finalidade de discutir, avaliar e julgar o trabalho de Dissertação intitulado:
"CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA DE MONÓCITOS DE PACIENTES COM
FIBROSE PERIPORTAL SECUNDÁRIA A ESQUISTOSSOMOSE" da Mestranda
Jamille Souza Fernandes. Após a apresentação, foram feitos os comentários pelos
examinadores. Havendo cumprido as exigências para a defesa, a Banca Examinadora conclui
que o pós-graduando teve a sua defesa de Dissertação Aprovada, emitindo pareceres
individuais que serão anexados à ata. Nada mais havendo a tratar, é encerrada a sessão, da
qual é lavrada a presente ata que após lida e aprovada vai assinada pelos componentes da
Banca Examinadora, pelo Mestrando e pela Coordenadora do Programa de Pós-Graduação
em Imunologia. Salvador, 27 de março de 2013.
Dedico este trabalho a Deus,
meus pais e meus irmãos pelo amor,
força e apoio durante todo esse trajeto.
AGRADECIMENTOS
A Deus.
A Profa Luciana Cardoso pela sua inteira dedicação ao trabalho, apoio,
compreensão, ensinamentos e carinho. Sou infinitamente grata por tudo Lú.
A Profa Ilma pela paciência, atenção, pessoa que é exemplo de profissionalismo e
dedicação. Querida Profa agradeço por todos os ensinamentos transmitidos, apoio e
confiança.
Aos colegas do laboratório Alergia e Helmintíase: Aline Báfica, Andréia Barreto,
Luciane Lima, Robson Paixão, Joanemile Pacheco, Ricardo Riccio, Tarcísio Vila
Verde
agradeço
por
contribuir
através
de
opiniões,
sugestões
e
pelo
companheirismo.
A Rafael Jabar, Giuseppe Tittoni e Dorival Araújo pelo suporte na área endêmica.
Aos meus amigos Diego Lopes, Natayme Tartaglia, Cinthia Vila Nova, Patrícia
Benedet, Verena Nery, Kelly Pedroza e Tamires Brasil pela atenção, apoio, amizade
e por estarem sempre presentes.
Ao Prof Edgar Carvalho pelos ensinamentos e colaboração.
A todos os pesquisadores e funcionários do Serviço de Imunologia, sempre muito
prestativos e atenciosos.
A Dilcéia Reis, Sônia Costa e Giovane Machado pela paciência e por estarem
sempre disponíveis a ajudar.
Aos pacientes pela receptividade e por ter permitido a realização deste estudo.
A agente de saúde, Irene de Jesus, por todo apoio prestado na área endêmica.
A toda minha família, meus pais (Melquiades e Joana), irmãos (Diego e Bruno),
minha avó (Maria de Lourdes) pelo amor, força, confiança e por acreditar sempre em
mim. E aos meus sobrinhos, Daniel e Douglas, por me mostrarem nos pequenos
detalhes a simplicidade da vida.
A vida nem sempre segue o nosso querer,
mas ela é perfeita naquilo que tem que ser!
Chico Xavier
RESUMO
Cerca de 5 a 10% dos indivíduos infectados pelo Schistosoma mansoni evoluem
para a forma grave da doença, caracterizada por fibrose periportal. A patogênese
da esquistossomose é predominantemente causada pela resposta imune do
hospedeiro aos antígenos do ovo e estudos têm enfatizado o papel de monócitos
na progressão da fibrose em modelos experimentais. O objetivo deste estudo foi
caracterizar as subpopulações de monócitos e o seu grau de ativação em
indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal secundária à
esquistossomose. Participaram do estudo quarenta indivíduos da área endêmica
em esquistossomose Água Preta, Bahia, Brasil. Monócitos foram obtidos através
de células mononucleares do sangue periférico e avaliados ex vivo ou na
presença do antígeno solúvel do ovo (SEA). Os monócitos foram classificados
em: clássicos, intermediários e não-clássicos. A expressão de moléculas coestimulatórias, citocinas e receptores de citocinas foram avaliadas usando a
técnica de citometria de fluxo. De um modo geral, a frequência dos monócitos
clássicos foi maior em relação às demais subpopulações. A expressão de HLADR foi maior nos monócitos de indivíduos com fibrose moderada a grave
comparando com os indivíduos sem fibrose ou com fibrose incipiente. Quanto a
expressão do receptor α de IL-4 (IL-4Rα) e de IL-10 (IL-10R) foi maior nos
monócitos de indivíduos sem fibrose e com fibrose moderada a grave. A
expressão de IL-6, TNF-α e TGF-β foi maior nos monócitos de indivíduos com
fibrose moderada a grave, enquanto que a expressão de IL-12 foi menor nos
monócitos desses indivíduos. Este estudo mostrou que os monócitos dos
indivíduos com fibrose periportal, independente da subpopulação, participam na
imunopatogênese da doença, uma vez que expressam altos níveis de citocinas
pró-inflamatórias e pró-fibróticas e baixos níveis de citocinas anti-fibróticas.
Palavras-chave: esquistossomose, fibrose periportal, monócitos
ABSTRACT
About 5 to 10% of individuals infected with Schistosoma mansoni progress to the
severe form of the disease, characterized by periportal fibrosis. The pathogenesis
of schistosomiasis is caused predominantly by the host immune response to egg
antigens and studies have emphasized the role of monocytes in the progression
of fibrosis in experimental models. The aim of this study was to characterize the
subpopulations of monocytes and their status of activation in individuals with
different degrees of periportal fibrosis secondary to schistosomiasis. The study
included forty subjects from an endemic area of schistosomiasis, Água Preta,
Bahia, Brazil. Monocytes were obtained from peripheral blood mononuclear cells
and evaluated ex vivo or in the presence of soluble egg antigen (SEA).
Monocytes were classified in: classical, intermediate and non-classical. The
expression of co-stimulatory molecules, cytokines and cytokine receptors were
assessed using the flow cytometry technique. In general, the frequency of
classical monocytes was higher than the other monocytes subpopulations. The
expression of HLA-DR was higher in monocytes from individuals with moderate to
severe fibrosis compared to individuals without fibrosis or with incipient fibrosis. In
relation to the expression of the α receptor of IL-4 (IL-4Rα) and the IL-10 receptor
(IL-10R), they were higher expressed in monocytes from individuals without
fibrosis and with moderate to severe fibrosis. The expression of IL-6, TNF-α and
TGF-β was higher in monocytes of individuals with moderate to severe fibrosis,
while the expression of IL-12 was lower in monocytes from these individuals. This
study showed that monocytes of individuals with moderate to severe periportal
fibrosis, regardless of the subpopulation, participate in the immunopathogenesis
of the disease, since they express high levels of proinflammatory and profibrotic
cytokines and low levels of anti-fibrotic cytokines.
Keywords: schistosomiasis, periportal fibrosis, monocytes
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Ciclo de transmissão do Schistosoma mansoni. A: vermes adultos
pareados. B: ovos (da esquerda para a direita, S. haematobium, S. mansoni, S.
japonicum). C: miracídio ciliado. D: caramujo hospedeiro intermediário (esquerda
para a direita, Oncomelania, Biomphalaria, Bulinus). E: cercárias. Fonte:
Gryseels, Polman et al. “Human schistosomiasis”. Lancet, 2006.........................19
Figura 2: Resposta imune ao Schistosoma mansoni. Fonte: Adaptado de Dunne
e Cooke. “A worm's eye view of the immune system: consequences for evolution
of human autoimmune disease”. Nat Rev Immunol, 2005....................................21
Figura 3: Granuloma esquistossomótico hepático fibrótico. Foto gentilmente
cedida pelo Prof Moyses Sadigursky – Serviço de Patologia – HUPES –
UFBa.....................................................................................................................23
Figura 4: Cinética da regeneração tecidual e formação de cicatriz fibrótica.
Fonte: Adaptado de Wynn, T. A. “Common and unique mechanisms regulate
fibrosis in various fibroproliferative diseases”. J Clin Invest, 2007........................25
Figura 5: Localização do município de Gandu - Bahia. Fonte: Wikipédia,
2013......................................................................................................................34
Figura 6: Habitantes de Água Preta utilizando a água do rio, única fonte hídrica
desta região..........................................................................................................35
Figura 7: (A) Imagem densitométrica de fluorescência não específica por
tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) celular, identificando a população de
monócitos, região 1 (G1). (B) Subpopulações de monócitos a partir da expressão
de CD14 e CD16. (C) Histograma de expressão de CD14 nas subpopulações de
monócitos..............................................................................................................39
Figura 8: Tamanho do fígado (A), considerando a medida pela linha médioclavicular e tamanho do baço (B) considerando o maior diâmetro do órgão
medido por USG nos indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal
(*p<0,005 ANOVA)................................................................................................43
Figura 9: Frequência das subpopulações de monócitos: clássicos (CD14 ++CD16-)
(A), intermediários (CD14++CD16+) (B) e não-clássicos (CD14+CD16++) (C) nos
indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal secundária à
esquistossomose em culturas estimuladas com 10μg/mL de SEA (barra cinza) e
sem estímulo (barra branca). *p<0,05 (Kruskal Wallis).........................................44
Figura 10: Frequência dos monócitos clássicos (CD14++CD16-), intermediários
(CD14++CD16+) e não clássicos (CD14+CD16++) em CMSP ex vivo de indivíduos
com diferentes graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose.
**p<0,005 (Kruskal Wallis)....................................................................................45
Figura 11: Expressão de HLA-DR nas subpopulações de monócitos nos
indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal secundária à
esquistossomose em culturas estimuladas com 10μg/mL de SEA (barra cinza) e
sem estímulo (barra branca). *p<0,05 e **p<0,005 (Kruskal Wallis).....................46
Figura 12: Expressão de HLA-DR (A) e das moléculas co-estimulatórias CD80
(B) e CD86 (C) nas subpopulações de monócitos de CMSP ex vivo de indivíduos
com diferentes graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose.
*p<0,05 e **p<0,005 (Kruskal Wallis)....................................................................47
Figura 13: Frequência das moléculas co-estimulatórias CD80 (A) e CD86 (B) nas
subpopulações de monócitos de CMSP ex vivo de indivíduos com diferentes
graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose. *p<0,05, **p<0,005 e
***p<0,0001 (Kruskal Wallis).................................................................................49
Figura 14: Expressão das moléculas pró-inflamatórias IL-6 (A-C) e TNF-α (D-F) e
pró-fibróticas TGF-β (G-I) e IL-4Rα (J-L) nas subpopulações de monócitos nos
indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal secundária à
esquistossomose em culturas estimuladas 10μg/mL de SEA (barra cinza) e sem
estímulo (barra branca). *p<0,05 e **p<0,005 (Kruskal Wallis)............................52
Figura 15: Frequência (A) e expressão (B) do receptor α de IL-4 na
subpopulações de monócitos de CMSP ex vivo de indivíduos com diferentes
graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose. *p<0,05 e **p<0,005
(Kruskal Wallis).....................................................................................................55
Figura 16: Expressão das moléculas anti-fibrótica IL-12 (A-C) e reguladoras IL-10
(D-F) e IL-10R (G-I) nas subpopulações de monócitos nos indivíduos com
diferentes graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose em culturas
estimuladas com 10μg/mL de SEA(barra cinza) e sem estímulo (barra branca).
*p<0,05 e **p<0,005 (Kruskal Wallis)....................................................................57
Figura 17: Frequência (A) e expressão (B) do receptor de IL-10 na
subpopulações de monócitos de CMSP ex vivo de indivíduos com diferentes
graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose. *p<0,05, **p<0,005 e
***p<0,0001 (Kruskal Wallis).................................................................................61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Características da população de estudo..............................................42
Tabela 2: Frequência de subpopulações de monócitos expressando moléculas
pró-inflamatórias e pró-fibróticas nos indivíduos com diferentes graus de fibrose
periportal secundária à esquistossomose.............................................................54
Tabela 3: Frequência de subpopulações de monócitos expressando moléculas
anti-fibróticas e regulatórias nos indivíduos com diferentes graus de fibrose
periportal secundária à esquistossomose.............................................................59
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BSA
Fração V de albumina bovina
CD
Do inglês “cluster of differentiation”
CMSP
Células mononucleares do sangue periférico
IL-
Interleucina
LPS
Lipopolissacarídeo
MEC
Matriz extracelular
MHC II
Molécula do complexo principal de histocompatilidade classe II
MIF
Média de intensidade de fluorescência
MMP
Metaloproteinase da matriz
PDGF
Fator de crescimento e diferenciação plaquetário
PBS
Tampão fosfato-salina
RPMI
Do inglês “Roswell Park Memorial Institute medium”
SEA
Antígeno solúvel do ovo do Schistosoma mansoni
TGF-β
Fator beta de transformação de crescimento
TIMP
Inibidor tecidual da metaloproteinase
TNF
Fator de necrose tumoral
Th
Do inglês “T helper”
VEGF
Fator de crescimento do epitélio vascular
SUMÁRIO
1.Introdução ....................................................................................................... 16
2. Revisão da literatura ...................................................................................... 18
2.1 Ciclo biológico e resposta imune ao Schistosoma mansoni ......................... 18
2.2 Imunopatogênese da esquistossomose crônica .......................................... 21
2.2.1 Características do granuloma periovular e fibrose periportal .................... 21
2.2.2 Papel das moléculas pró-fibróticas na fibrose ........................................... 26
2.2.3 Papel das moléculas pró-inflamatórias na fibrose ..................................... 28
2.2.4 Papel das moléculas anti-fibróticas e reguladoras na fibrose hepática. .... 29
2.2.5 Participação dos monócitos na patogênese da fibrose hepática ............... 31
3. Objetivos e Hipótese ...................................................................................... 33
3.1 Objetivo geral ............................................................................................... 33
3.2 Objetivos específicos ................................................................................... 33
4. Metodologia.................................................................................................... 34
4.1 Seleção de indivíduos na área endêmica em esquistossomose e desenho do
estudo ................................................................................................................ 34
4.2 Desenho do estudo e cálculo amostral ........................................................ 35
4.3 Critérios de inclusão ..................................................................................... 35
4.4 Critérios de não inclusão .............................................................................. 36
4.5 Exame parasitológico de fezes .................................................................... 36
4.6 Ultrassonografia de abdome superior - USG ............................................... 36
4.7 Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) ............ 37
4.8 Avaliação do fenótipo dos monócitos ex vivo ............................................... 37
4.9 Análise da expressão de citocinas intracelulares ......................................... 39
4.10 Análise estatística ...................................................................................... 40
4.11 Considerações éticas ................................................................................. 41
5. Resultados ..................................................................................................... 42
5.1 Características da população de estudo ...................................................... 42
5.2 Caracterização fenotípica dos monócitos estimulados com o antígeno
solúvel do ovo (SEA) e ex vivo nos indivíduos com diferentes graus de fibrose
periportal secundária à esquistossomose .......................................................... 43
5.2.1 Frequência das subpopulações de monócitos nos indivíduos com
diferentes graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose. .............. 43
5.2.2 Estado de ativação das subpopulações de monócitos nos indivíduos com
diferentes graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose. .............. 45
5.2.3 Expressão de moléculas pró-inflamatórias e pró-fibróticas nas
subpopulações de monócitos nos indivíduos com diferentes graus de fibrose
periportal secundária à esquistossomose. ......................................................... 49
5.2.4 Expressão de moléculas anti-fibróticas e regulatórias nas subpopulações
de monócitos nos indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal
secundária à esquistossomose. ......................................................................... 56
6.Discussão........................................................................................................ 62
7.Resumo dos resultados................................................................................... 72
8.Conclusão ....................................................................................................... 73
9. Perspectivas ................................................................................................... 73
10.Referências ................................................................................................... 74
11. Anexos ......................................................................................................... 89
11.1 Ficha de avaliação ultrassonográfica – USG ............................................. 89
11.2 Termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE) para participar do
estudo ................................................................................................................ 91
11.3 Parecer do comitê de ética em pesquisa ................................................... 93
16
1. INTRODUÇÃO
A esquistossomose é uma doença crônica e debilitante que acomete mais
de 200 milhões de pessoas no mundo e estima-se que 700 milhões vivem em
áreas de risco de infecção (IAROTSKI e DAVIS, 1981; STEINMANN et al., 2006;
OMS, 2012). Ela assume o segundo lugar em termos de importância sócioeconômica e de saúde pública, sendo prevalente em áreas tropicais e subtropicais (OMS, 2012). Alguns dos gêneros do Schistosoma são responsáveis
por causar no homem a esquistossomose intestinal, que pode acometer o fígado
e o baço (Schistosoma mekongi, Schistosoma intercalatum, Schistosoma
malayensis, Schistosoma japonicum e Schistosoma mansoni), enquanto que o
Schistosoma haematobium acomete nas vias urinárias (OMS, 2012).
Originária da África, a esquistossomose foi trazida para o Brasil,
possivelmente, durante o tráfico de escravos africanos que eram portadores tanto
do S. mansoni quanto do S. haematobium, porém, somente o S. mansoni resistiu
por ter encontrado condições ambientais semelhantes às regiões de origem e
hospedeiros intermediários do gênero Biomphalaria (PRATA, 1984).
No Brasil, antes da implantação do Programa Especial de Controle da
Esquistossomose (PECE), a esquistossomose atingia entre dez e doze milhões
de
pessoas
(PROGRAMA
ESPECIAL
DE
CONTROLE
DA
ESQUISTOSSOMOSE, 1977). Atualmente, estima-se que cerca de 2,5 a 6
milhões de indivíduos estejam infectados e 25 milhões vivem em áreas de risco
de
infecção
(VIGILÂNCIA
ESQUISTOSSOMOSE,
2007;
EPIDEMIOLÓGICA
BRASIL.,
2009).
E
A
CONTROLE
DA
distribuição
da
esquistossomose ocorre em 19 estados numa faixa contínua ao longo do litoral,
desde o Rio Grande do Norte até a Bahia, na região Nordeste, Espírito Santo e
Minas Gerais, no Sudeste. A Bahia é um dos principais estados atingidos pela
doença (BRASIL., 2009).
Entre os indivíduos cronicamente infectados pelo S. mansoni, cerca de 510% evoluem para a forma grave da doença, caracterizada por fibrose hepática e
hipertensão portal, ascite e varizes esofágicas e gástricas, que podem complicar
com hemorragias digestivas e levar a morte (HENRI et al., 2002; BINA e PRATA,
2003).
17
As células mononucleares estão envolvidas em quase todos os aspectos
de doenças crônicas do fígado, especialmente naqueles que levam a fibrogênese.
Os monócitos, por exemplo, participam no desenvolvimento da fibrose através de
vários mecanismos, incluindo secreção de citocinas e geração de produtos
relacionados ao estresse oxidativo (MARRA et al., 2009). Dependendo do seu
estado de diferenciação e de sinais locais, monócitos e macrófagos são capazes
de secretar uma variedade de citocinas pró-inflamatórias, pró-fibróticas, antiinflamatórias, além de fatores de crescimento (BATALLER e BRENNER, 2005).
Recentemente,
os
monócitos
humanos
foram
classificados
em
três
subpopulações de acordo com a expressão de CD14 e CD16: clássicos
(CD14++CD16-), intermediários (CD14++CD16+) e não-clássicos (CD14+CD16++)
(ZIEGLER-HEITBROCK et al., 2010). Entretanto, na literatura ainda não existem
trabalhos caracterizando esses monócitos nos indivíduos com fibrose periportal
secundária à esquistossomose. Desse modo, para o entendimento da
patogênese associada à doença, este estudo visa caracterizar essas três
subpopulações de monócitos quanto ao seu grau de ativação e expressão de
moléculas pró-inflamatórias, anti- e pró-fibróticas e reguladoras nos indivíduos
com diferentes graus de fibrose.
18
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Ciclo biológico e resposta imune ao Schistosoma mansoni
O Schistosoma mansoni tem um ciclo de vida complexo que inclui estágios
de vida livre, aquáticos, além de fases parasitárias no caramujo, hospedeiro
intermediário, e no mamífero, hospedeiro definitivo (Figura 1). As cercárias,
larvas multicelulares, evadem do hospedeiro intermediário em ambientes
aquáticos e utilizam uma variedade de estímulos ambientais para encontrar seu
hospedeiro definitivo, através da locomoção, contraste claro-escuro e gradientes
químicos e térmicos (HAAS et al., 1997). A infecção se inicia com a penetração
das cercárias na pele do hospedeiro, após a perda da sua cauda, as larvas
resultantes, denominadas esquistossômulos, migram através da circulação
sanguínea para o coração, através das veias pulmonares, e para o fígado, onde
amadurecem em 4-6 semanas em vermes adultos no sistema porta intra-hepático.
Os vermes adultos migram acasalados para as veias mesentéricas inferiores,
onde fazem a ovoposição. Os ovos depositados aparecem nas fezes após
passarem pelos tecidos da mucosa intestinal ou ganham a circulação portohepática e alcançam os espaços porta, induzindo uma forte resposta
granulomatosa. Posteriormente, fibrose e hipertensão portal podem desenvolver,
que são as principais causas de morbidade e mortalidade em indivíduos
infectados.
A fase aguda da doença, também conhecida como síndrome toxêmica ou
síndrome de Katayama, inicia-se seis a oito semanas após a primeira exposição
ao S. mansoni (BOGLIOLO, 1965). Em muitos casos, as infecções agudas são
assintomáticas. No entanto, os sintomas que se manifestarem, acredita-se ser
resultado de uma reação alérgica durante a migração larval e ovoposição
precoce por vermes adultos, e podem variar em termos de gravidade
dependendo das espécies infectantes (COOKE et al., 1999; BOTTIEAU et al.,
2006). O início da doença é geralmente súbito, produzindo muitos sintomas nãoespecíficos, tais como febre, fadiga, mialgia, dor de cabeça, mal-estar, tosse não
produtiva e urticária (GELFAND et al., 1981; FARID et al., 1989). Além disso,
lesões focais na mucosa e submucosa intestinal coincidem com o início da
19
postura dos ovos, ocasionando dor abdominal e diarréia.
A fase aguda
sintomática é raramente observada em pessoas residentes em áreas endêmicas,
e mais comuns em indivíduos expostos pela primeira vez à infecção. Uma
explicação para esta diferença é que a sensibilização in-utero e infecções prévias
pode diminuir a gravidade dos sintomas comuns da síndrome de Katayama em
indivíduos que são cronicamente expostos (MALHOTRA et al., 1997; KING et al.,
1998).
Figura 1: Ciclo de transmissão do Schistosoma mansoni. A: vermes adultos pareados. B: ovos
(da esquerda para a direita, S. haematobium, S. mansoni, S. japonicum). C: miracídio ciliado. D:
caramujo hospedeiro intermediário (esquerda para a direita, Oncomelania, Biomphalaria, Bulinus).
E: cercárias.
Fonte: Gryseels et al. “Human schistosomiasis”. Lancet, 2006.
20
No curso da infecção pelo S. mansoni, a resposta imune progride através
de três fases (Figura 2). Na primeira fase, 3-5 semanas após o início da infecção,
a resposta é predominante do tipo Th1/inflamatória, com produção de citocinas
pró-inflamatórias, tais como IFN-γ, TNF-α, IL-6 e IL-1. Essa resposta tem sido
associada à destruição de esquistossômulos no pulmão com ativação de
macrófagos pelo IFN-γ (LAMBERTUCCI et al., 1997; WYNN et al., 1998; DE
JESUS et al., 2002). Conforme os parasitas amadurecem e iniciam a ovoposição,
entre a 5ª e a 6ª semanas, a resposta é polarizada para o tipo Th2 e regulatória,
que é caracterizada pela produção de IL-4, IL-5, IL-13, IL-10 e com baixos níveis
de IFN-γ (GAZZINELLI e COLLEY, 1992; ARAUJO et al., 1996; CORREAOLIVEIRA et al., 1998). Na fase crônica da doença, por volta da 12ª semana, no
qual os vermes continuam com a produção de ovos (~300 ovos por dia), a
resposta Th2 é modulada (PEARCE e MACDONALD, 2002). Estudos têm
mostrado que essa resposta Th2 é induzida principalmente por produtos
secretados pelo ovo de S. mansoni, tais como, as glicoproteínas ômega-1 e
IPSE/alfa-1(CASS et al., 2007; MATHIESON e WILSON, 2010), uma vez que
esses produtos secretados são as primeiras moléculas que entram em contato
com as células do sistema imunológico do hospedeiro e são, assim, prováveis de
apresentar propriedades imunomodulatórias do ovo de Schistosoma (SCHRAMM
e HAAS, 2010). Em contrapartida, as proteínas estruturais do ovo tornam-se
acessíveis para as células do sistema imunológico, apenas quando os ovos estão
morrendo e se desintegrando.
21
Figura 2: Resposta imune ao Schistosoma mansoni
Fonte: Adaptado de Dunne e Cooke. “A worm's eye view of the immune system: consequences
for evolution of human autoimmune disease”. Nat Rev Immunol, 2005.
2.2 Imunopatogênese da esquistossomose crônica
2.2.1 Características do granuloma periovular e fibrose periportal
A imunopatogênese nas fases aguda e crônica da doença é bastante
distinta (LAMBERTUCCI, 1993; DE JESUS et al., 2002; BURKE et al., 2009).
Três formas clínicas na fase crônica são bem caracterizadas: intestinal e
hepatointestinal
(menos
grave),
e
a
forma
mais
grave
denominada
hepatoesplênica (BINA, 1997; BINA e PRATA, 2003). A hepatoesplenomegalia
crônica na esquistossomose é encontrada com mais frequência em pacientes
que residem em áreas endêmicas, o que mostra que as altas taxas de
transmissão da doença e o nível de sua ocorrência tem sido associado com a
22
intensidade da infecção (GRYSEELS, 1991). A forma grave ou avançada da
esquistossomose é caracterizada morfologicamente pela fibrose hepática
periportal, descrita por Symmers (1904) (SYMMERS, 1904).
A patogênese da infecção pelo S. mansoni é predominantemente causada
pela resposta imune do hospedeiro aos antígenos do ovo (WARREN, 1968; BICA
et al., 2000; CHIARAMONTE et al., 2003). Vários estudos têm mostrado que a
gravidade da doença é uma consequência da fibrose causada pela reação
granulomatosa em torno dos ovos de S. mansoni que estão presos nos pequenos
vasos do fígado (Figura 3). Quando o ovo emerge do verme fêmea é imaturo e
não provoca nenhuma reação nos tecidos. Cerca de 5-6 dias o miracídio
diferencia-se e inicia a eliminação de secreções líticas e antigênicas através de
microporos presentes na casca de ovo (ANDRADE, 2009). Estas secreções são
compostas por proteínas, enzimas proteolíticas, hidrolíticas e polissacarídeos.
Consequentemente, os granulomas formados funcionam como barreiras que
previnem a dispersão dos antígenos dos ovos do S. mansoni. Entretanto, com a
chegada contínua dos ovos, o processo inflamatório pode evoluir para fibrose
grave, o que leva à interrupção do fluxo sanguíneo normal do sistema venoso
para os sinusóides resultando em hipertensão portal, que é seguido pela
hepatoesplenomegalia, formação de varizes esofágicas e gástricas, que podem
romper espontaneamente e levar a óbito por anemia aguda (BAPTISTA e
ANDRADE, 2005; WYNN, 2007). Embora os sinais e sintomas de hipertensão
portal são dominantes na esquistossomose, o parênquima hepático é preservado
e a insuficiência hepatocelular é visivelmente ausente, o que difere com a
situação na cirrrose (ANDRADE, 2004; 2009).
23
Figura 3: Granuloma esquistossomótico hepático fibrótico. Foto gentilmente cedida pelo Prof
Moyses Sadigursky – Serviço de Patologia – HUPES - UFBA
A fibrose geralmente resulta de reações inflamatórias crônicas, definidas
como respostas que persistem por várias semanas ou meses (WYNN, 2007). A
maioria dos distúrbios fibróticos crônicos tem em comum uma irritação tecidual
persistente, a qual contribui para a produção de fatores de crescimento, enzimas
proteolíticas, fatores angiogênicos e fibrogênicos, produção e liberação de
citocinas e quimiocinas, que em conjunto estimulam a deposição de elementos
do tecido conjuntivo que progressivamente remodelam e destroem a arquitetura
do tecido normal (TOMASEK et al., 2002; WYNN, 2007; FRIEDMAN, 2008).
As células endoteliais estão presentes em grandes números dentro do
granuloma periovular (LENZI et al., 1988). Estudos in vitro têm demonstrado que
antígenos solúveis do ovo do S. mansoni (SEA) induzem a proliferação de
células endoteliais e também regulam a produção de fator de crescimento do
epitélio vascular (VEGF) e a angiogênese (FREEDMAN e OTTESEN, 1988;
LOEFFLER et al., 2002; BAPTISTA e ANDRADE, 2005). Após a lesão tecidual,
essas células liberam mediadores inflamatórios que iniciam a cascata de
coagulação antifibrinolítica (KUMAR, 2005). As plaquetas são ativadas e se
agregam, formando tampões que contribuem para a hemostasia. As células
epiteliais e/ou endoteliais produzem metaloproteinase da matriz (MMP), que
rompe a membrana basal, permitindo um recrutamento eficiente de células
inflamatórias para o local da lesão, como também secretam fatores de
crescimento,
citocinas,
quimiocinas
que
recrutam
e
ativam
neutrófilos,
24
macrófagos, células B, células T, e eosinófilos, que são componentes
importantes do reparo tecidual.
Os macrófagos e neutrófilos são importantes no processo de eliminação de
debris celulares, restos tissulares e também de microrganismos invasores, como
também participam na produção de citocinas e quimiocinas que amplificam a
resposta cicatricial. Posteriormente, as células T são ativadas e secretam
citocinas pró-fibróticas, a exemplo da IL-13 e do TGF-β (WYNN, 2003; LI et al.,
2006), que por sua vez, ativam os macrófagos e fibroblastos. Os fibroblastos
ativados podem evoluir para miofibroblastos (secretores de colágeno), que são
derivados de células mesenquimais locais ou recrutados da medula óssea
(WYNN, 2003; PARSONS et al., 2007). Após a ativação, os miofibroblastos
promovem a contração da lesão, processo no qual a borda da lesão desloca-se
em direção ao centro e, finalmente, as células epiteliais e endoteliais se dividem
e migram para regenerar o tecido danificado. Porém, no caso de lesões teciduais
crônicas, o processo de cicatrização normal é interrompido. Inflamação
persistente, necrose tecidual e infecção conduzem a uma ativação crônica de
miofibroblastos e acumulação excessiva de proteínas da matriz extracelular
(MEC), especialmente colágenos tipo I e III, bem como, o aumento de outros
constituintes como o ácido hialurônico, fibronectina, proteoglicanos, laminina que
contribuem para a formação de cicatriz fibrótica permanente (GUTIERREZ-RUIZ
et al., 2002; WYNN, 2008). A degradação das proteínas da matriz extracelular é
regulada pela MMP (BENYON e ARTHUR, 2001), a fibrose, então, ocorre
quando há um desequilíbrio entre fibrogênese e fibrólise, ou seja, quando há uma
redução da expressão da MMP e um aumento do TIMP (inibidor tecidual da
metaloproteinase) (KERSHENOBICH STALNIKOWITZ e WEISSBROD, 2003;
ISSA et al., 2004; ANDRADE, 2009). Desta forma, na fase de remodelamento, a
síntese de colágeno por fibroblastos excede a taxa de sua degradação, trazendo
como consequência a deposição excessiva desta proteína, culminando na
formação de cicatriz fibrótica (Figura 4).
25
Figura 4: Cinética da regeneração tecidual e formação de cicatriz fibrótica.
Fonte: Adaptado de Wynn, T. A. “Common and unique mechanisms regulate fibrosis in various
fibroproliferative diseases”. J Clin Invest, 2007.
26
2.2.2 Papel das moléculas pró-fibróticas na fibrose
Moléculas de caráter pró-fibróticos, tais como o receptor de IL-4 (IL-4Rα) e
o TGF-β podem ser cruciais para o desenvolvimento da fibrose. O receptor de IL4 é expresso na maioria dos tipos de células, incluindo células hematopoiéticas,
endotelial, muscular e neural (NELMS et al., 1999). O IL-4Rα pode combinar com
a cadeia gama comum - γc (IL-4R tipo I) ou com IL-13Rα1 (IL-4R tipo II) para
ligar-se a IL-4 sozinho, ou a ambos IL-4 e IL-13, respectivamente (MILOUX et al.,
1997; LAPORTE et al., 2008; GORDON e MARTINEZ, 2010; ALLEN e MAIZELS,
2011). A sinalização através deste receptor induz a transcrição do gene
dependente de STAT6 que polariza a imunidade do hospedeiro para a resposta
do tipo Th2 (MCKENZIE et al., 1999; MURATA et al., 1999; ANDREW et al.,
2002).
Os
monócitos/macrófagos,
no
entanto,
adquirem
um
fenótipo
alternativamente ativado quando estimulados por essas citocinas do tipo Th2 (IL4 e IL-13), as quais induzem nessas células a expressão de arginase, enzima
responsável pela conversão de L-arginina em prolina. A prolina é um aminoácido
essencial que está envolvido na produção de colágeno e, portanto, pode
contribuir no desenvolvimento da fibrose (HESSE et al., 2001).
Embora a
arginase-1 (ARG1) é um marcador clássico de macrófagos alternativamente
ativados em camundongos, a sua expressão em monócitos/macrófagos humanos
não é bem definida (ROUZAUT et al., 1999; OCHOA et al., 2001; MUNDER, et al.,
2005; RAES et al., 2005). Estudo de Badu et al (2009) mostraram que monócitos
de pacientes com filariose assintomática exibiram aumento da expressão do RNA
mensageiro da ARG1, bem como aumento dos níveis de TGF-β e IL-10,
caracterizando os monócitos com um fenótipo alternativamente ativados
imunorregulador (BABU et al., 2009).
Macrófagos alternativamente ativados induzidos por helmintos têm
mostrado ser importantes em três diferentes processos: controle da inflamação
tipo Th1, reparo tecidual e expulsão do verme (KREIDER et al., 2007). Em
modelo experimental, os macrófagos alternativamente ativados dependente de
IL-4Rα podem regular a inflamação induzida pelo S. mansoni durante a fase
aguda da doença através da produção de citocinas imunossupressoras IL-10 e
27
TGF-β (HERBERT et al, 2008). Em contrapartida, na fase crônica da doença
induz fibrose hepática debilitante (WYNN et al., 2004).
Vários outros estudos têm demonstrado que a sinalização via IL-4Rα é
essencial para formação do granuloma e sobrevivência do hospedeiro, em
modelo experimental de esquistossomose (JANKOVIC et al., 1999; FALLON et
al., 2000; HERBERT et al., 2004; HERBERT et al., 2008).
Outra molécula importante é a citocina TGF-β responsável por múltiplos
processos biológicos tais como inflamação, fibrose, reparo tecidual, homeostasia,
controle do ciclo celular (MASSAGUE, 1998; MCCARTNEY-FRANCIS et al.,
1998; BLOBE et al., 2000; LI et al., 2006) .
O dano tecidual ocorre frequentemente durante as respostas imunes
patológicas devido à inflamação, em que os neutrófilos entram no local da lesão
para remover agentes patogênicos e tecidos danificados através de fagocitose, e
os macrófagos aparecem para continuar o processo e secretam mais fatores de
crescimento, incluindo TGF-β, o qual auxilia na cicatrização (LI et al., 2006). Esta
citocina induz proliferação de fibroblastos e produção de colágeno, a sua
produção é aumentada no local da fibrose, o que sugere seu papel potencial no
estabelecimento da fibrose (FINE e GOLDSTEIN, 1987; LEROY et al., 1990;
BORDER e NOBLE, 1994; VERRECCHIA e MAUVIEL, 2007).
Evidência adicional de apoio do papel profibrótico TGF-β in vivo são os
dados que mostram que camundongos deficientes em TGF-β exibem o estágio
de reparação tecidual gravemente prejudicada, incluindo diminuição da reepitelização e deposição de colágeno, em comparação com os camundongos
controle, no entanto, os camundongos deficientes em TGF-β também mostraram
uma síndrome debilitante grave acompanhada por uma pronunciada resposta
inflamatória generalizada e necrose dos tecidos, resultando em falha do órgão e
morte (KULKARNI e KARLSSON, 1993; BOTTINGER et al., 1997).
Em indivíduos com fibrose periportal secundária à esquistossomose,
alguns autores não encontraram influência do TGF-β no agravamento do quadro
(DE JESUS, et al., 2004; DE SOUZA, et al., 2012).
28
2.2.3 Papel das moléculas pró-inflamatórias na fibrose
A produção de proteínas da matriz extracelular no local de uma inflamação
é parte do processo de reparação normal. Esse processo é iniciado por
moléculas liberadas pelos tecidos e regulado por uma série de citocinas
importantes, entre elas IL-6 e TNF-α (POLI, 2000).
A IL-6 é uma citocina pleiotrópica, a qual é produzida por uma variedade de
células, incluindo monócitos, células endoteliais, fibroblastos e alguns tipos de
células tumorais (AKIRA et al., 1993).
A IL-6 é uma citocina que exerce papéis importantes na resposta
inflamatória de fase aguda e crônica, autoimunidade, disfunção da célula
endotelial e na fibrogênese, uma vez que também induz a proliferação de
fibroblastos, produção de colágeno, bem como a síntese do inibidor de
metaloproteinase 1 (TIMP-1) (DUNCAN e BERMAN, 1991; LOTZ e GUERNE,
1991; MIHARA et al., 1996; BARNES et al., 2011). Diversos trabalhos
envolvendo modelo experimental têm demonstrado que a administração in vivo
de IL-6 induziu inflamação hepática e fibrose (CHOI et al., 1994), outros também
mostraram que a ausência de IL-6 tornou a reparação tecidual prejudicada
(Gallucci, et al., 2000; 2006). No entanto, Yang et al (2012) mostraram que a
ausência desta citocina não teve efeito significativo no desenvolvimento da
fibrose (YANG et al., 2012).
Em modelo experimental de esquistossomose, alguns autores observaram
um aumento da produção de IL-6 durante o curso da infecção pelo parasito,
como também na formação do granuloma hepático (KHALIL et al., 1996) e outros
relataram que o antígeno solúvel do ovo (SEA) estimulou a produção de IL-6 em
culturas de macrófagos isolados de granulomas (CHENSUE et al., 1994).
Quanto ao TNF-α, é uma citocina proinflamatória que desempenha papel
importante em diversos eventos celulares. A ligação do TNF-α com seu receptor
desencadeia
na
produção
de
citocinas
inflamatórias
ou
na
apoptose
(AGGARWAL, 2003; MUPPIDI et al., 2004). Produzido por neutrófilos, linfócitos
ativados, células NK, células endoteliais, mastócitos e monócitos, o TNF-α há
muito tempo têm sido conhecido por possuir habilidade anti-fibróticas (JOSEPH e
BOROS, 1993; ABRAHAM et al., 2000; MORI et al., 2002), além de ser um
29
potente indutor da síntese de MMPs (AMIRI et al., 1992). Entretanto, o TNF-α
também é considerado uma citocina pró-fibrótica em alguns estudos, sendo o seu
papel e mecanismo de ação não bem definidos. Esta citocina pode estar
envolvida na regeneração hepática quando o hospedeiro entra em contato com
agentes que possam danificar o fígado estimulando a regeneração (KUBO et al.,
1996; KIMURA et al., 1997). Alguns estudos têm mostrado que TNF-α
desempenha um papel crucial na formação do granuloma esquistossomótico e
que altos níveis desta citocina estão associados com a presença de fibrose
periportal (MWATHA et al., 1998; HASEEB et al., 2001; HENRI et al., 2002;
BOOTH et al., 2004). Em outros trabalhos, no entanto, têm demonstrado que
TNF-α pode ser fundamental para a redução do granuloma e da fibrose hepática
em modelo experimental (HOFFMANN et al., 1998).
2.2.4 Papel das moléculas anti-fibróticas e reguladoras na fibrose hepática.
A IL-12 é produzida por monócitos, macrófagos, células dendríticas e entre
outros tipos de células. É uma citocina heterodimérica composta por duas
subunidades ligadas por pontes dissulfeto designadas p35 e p40 (GATELY et al.,
1991; TRINCHIERI e SCOTT, 1999). Quando coexpressadas na mesma célula,
essas subunidades formam o heterodímero p70 biologicamente ativo (GUBLER,
et al., 1991).
Uma das principais ações de IL-12 é a sua indução de outras citocinas,
particularmente IFN-γ, inicialmente nas células T e NK. O IFN-γ estimula a
atividade bactericida de células fagocíticas e, portanto, aumenta a resposta
imune inata (WATFORD et al., 2003). Os macrófagos classicamente ativados, no
entanto, surgem em resposta ao IFN-γ, os quais secretam citocinas próinflamatórias e produzem intermediários reativos de oxigênio e nitrogênio que
causam dano tecidual oxidativo (GORDON e TAYLOR, 2005; O'SHEA e
MURRAY, 2008).
A IL-12 participa de um ciclo de feedback positivo por promover a secreção
de IFN-γ que, por sua vez, potencializa os monócitos e polimorfonucleares para
produzirem mais IL-12 (YOSHIDA et al., 1994; MA et al., 1996). Assim, a IL-12
30
também é responsável por direcionar a respostas imune adaptativas, polarizando
as células T CD4 naives para o fenótipo Th1 (HSIEH et al., 1993).
Por favorecer respostas do tipo Th1, estudos têm mostrado que a IL-12
pode ser capaz de reduzir a inflamação granulomatosa e a fibrose hepática em
camundongos infectados pelo parasito por substituir o padrão de citocinas Th2,
que é característica da infecção por S. mansoni, por citocinas do tipo Th1(WYNN
et al., 1994; WYNN et al., 1995). Considerando, assim, esta citocina como antifibrótica por inibir a síntese de colágeno em fibroblastos (WYNN et al., 1995). O
desvio dessa resposta têm sido caracterizado pelo aumento da expressão de
RNA mensageiro de IFN-γ, IL-12 e TNF-α no granuloma hepático, as quais foram
demonstradas ser necessárias para a manutenção da resposta Th1 e para
redução do tamanho do granuloma e fibrose hepática (HOFFMANN et al., 1998).
Vários estudos têm também relatado o papel protetor de IL-10 durante a
esquistossomose (BOSSHARDT et al., 1997; HOFFMANN et al., 2000; BOOTH
et al., 2004). A IL-10 é uma citocina importante produzida por uma variedade de
tipos de células, incluindo células T, monócitos/macrófagos, mastócitos,
queratinócitos, eosinófilos e várias células tumorais (MOORE et al., 1993).
A IL-10 tem sido bem estudada em modelo murino de infeção pelo S.
mansoni e mostrou controlar resposta excessiva Th1 ou Th2, suprimir ativação
de macrófagos e células dendríticas e limitar a hepatotoxicidade induzida pelos
ovos do parasito durante a fase aguda da infecção (OSWALD et al., 1992;
HOFFMANN et al., 2000; HESSE et al., 2004). Entretanto, parece não ser
fundamental no processo de imunomodulação na fase crônica da infecção
(WYNN et al., 1998). Falcão et al (1998) demonstraram que a IL-10 desempenha
um papel principal na regulação in vitro da formação do granuloma e que pode
ser uma citocina importante no controle da morbidade na infecção pelo S.
mansoni (FALCAO et al., 1998).
O papel de IL-10 no desenvolvimento da fibrose permanece controverso,
com alguns estudos demonstrando um papel profibrótico para IL-10 (BARBARIN
et al., 2005; SUN et al., 2011) e outros identificando papéis inibitórios (LOUIS et
al., 1998; THOMPSON et al., 1998; NELSON et al., 2000).
31
Trabalhos envolvendo modelo experimental em esquistossomose têm
mostrado que a fibrose foi consistentemente aumentada em camundongos
deficientes em IL-10 e IL-12 simultaneamente, sugerindo que ambas citocinas
interagem de forma colaborativa para inibir o desenvolvimento de fibrose
(HOFFMANN et al., 2000; MENTINK-KANE et al., 2011). Outros estudos têm
demonstrado que administração de anticorpos monoclonais anti-IL-10R em
camundongos infectados pelo S. mansoni aumentou significativamente a
produção de IL-4, IFN-γ, TNF-α e IL-17 em aproximadamente sete semanas após
infecção, como também aumentou o tamanho do granuloma hepático e lesões
hepatocelulares (HERBERT et al., 2008).
2.2.5 Participação dos monócitos na patogênese da fibrose hepática
Os monócitos contribuem para a defesa do hospedeiro na imunidade inata
e adquirida, como também, no remodelamento tecidual. As características de
macrófagos humanos e camundongos são parcialmente correspondentes
(MOSSER e EDWARDS, 2008; MARTINEZ et al., 2009; MURRAY e WYNN,
2011), mas a infecção pelo S. mansoni causa resposta imune e patologia
semelhantes em ambos os hospedeiros (CHEEVER et al., 2002; PEARCE e
MACDONALD, 2002; WYNN et al., 2004).
Nos últimos anos, vários estudos têm enfatizado o papel importante de
monócitos infiltrantes para a progressão da inflamação e fibrose hepática em
modelos experimentais (DUFFIELD et al., 2005; KARLMARK et al., 2009;
MITCHELL et al., 2009; SEKI et al., 2009), como também na regressão da fibrose
uma vez que podem também degradar proteínas da matriz extracelular e exercer
ações anti-inflamatórias (ZIMMERMANN e TACKE, 2011; FALLOWFIELD et al.,
2007). Esses monócitos participam no desenvolvimento da fibrose através de
vários mecanismos, incluindo secreção de citocinas e geração de produtos
relacionados ao estresse oxidativo (MARRA et al., 2009). Dependendo do seu
estado de diferenciação e de sinais locais, monócitos e macrófagos são capazes
de secretar uma variedade de citocinas pró-inflamatórias, pró-fibróticas, antiinflamatórias e fatores de crescimento (BATALLER e BRENNER, 2005).
32
Os monócitos humanos têm sido segregados em duas subpopulações de
acordo com a expressão de CD14 e CD16 (CD14 +CD16- e CD14+CD16+) por
mais de duas décadas (PASSLICK et al., 1989; FRANKENBERGER et al., 1996;
ANCUTA et al., 2003; GEISSMANN et al., 2003; GORDON e TAYLOR, 2005;
TACKE e RANDOLPH, 2006; ZIEGLER-HEITBROCK, 2007; AUFFRAY et al.,
2009). Entretanto, uma nova nomenclatura foi aprovada e definem os monócitos
humanos em três subpopulações, a maior população dos monócitos humanos
(90%) com alta expressão de CD14 e nenhuma expressão para CD16
(CD14++CD16-) são denominados de monócitos clássicos, enquanto a menor
população (10%) de monócitos humanos é subdividida em intermediários, com
alta expressão de CD14 e baixa para CD16 (CD14 ++CD16+) e em não-clássicos
com alta expressão de CD16, mas com expressão relativamente baixa de CD14
(CD14+CD16++) (ZIEGLER-HEITBROCK et al., 2010).
Em um estudo de Wong et al (2011) foram avaliadas as características dos
monócitos clássicos, intermediários e não-clássicos através do perfil de
expressão gênica. Observou que os monócitos clássicos expressaram genes
envolvidos na angiogênese, cicatrização e coagulação, implicando em funções
de reparo tecidual, além da alta expressão de genes proinflamatórios; os
monócitos intermediários com alta expressão de MHC de classe II que indica
funções de célula apresentadora de antígeno e estimulatórias de células T
(WONG et al., 2011) e quanto aos monócitos não-clássicos com genes
envolvidos no rearranjo do citoesqueleto o que pode ser responsável por sua alta
motilidade observada in vivo (CROS et al., 2010). O estudo de Liaskou et al
(2013) mostrou evidências que implicam os monócitos intermediários na
patogênese da fibrose hepática causada por doenças inflamatórias crônicas
(LIASKOU et al., 2013).
Existem poucos dados na literatura quanto a caracterização das
subpopulações de monócitos e o papel destas células na patogênese da fibrose
periportal secundária à esquistossomose. Desta forma, a fim de entender de que
maneira
as
subpopulações
de
monócitos
estariam
participando
na
imunopatogênese na fibrose periportal, moléculas de caráter pró-inflamatórias,
pro- e anti-fibróticas e reguladoras expressas nessas células foram avaliadas
neste estudo.
33
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Caracterizar o fenótipo dos monócitos de indivíduos com diferentes graus de
fibrose periportal secundária à esquistossomose mansônica.
3.2 Objetivos Específicos
Nos indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal secundária à
esquistossomose mansônica:
1. Caracterizar as subpopulações dos monócitos (clássicos, intermediários e
não-clássicos) através da expressão dos marcadores de superfície CD14 e
CD16;
2. Avaliar o grau de ativação dos monócitos, através da expressão de HLA-DR,
CD80 e CD86;
3. Avaliar a expressão de moléculas pró-inflamatórias (IL-6 e TNF), pro-fibróticas
(IL-4Rα e TGF-β), anti-fibrótica (IL-12) e regulatórias (IL-10R e IL-10) por
diferentes subpopulações de monócitos.
HIPÓTESE
Monócitos com perfil pró-fibrótico e pró-inflamatório estão associados ao
desenvolvimento da fibrose periportal secundária à esquistossomose mansoni.
34
4. METODOLOGIA
4.1 Seleção de indivíduos na área endêmica em esquistossomose e
desenho do estudo
Neste estudo foram avaliados indivíduos infectados pelo S. mansoni,
apresentando diferentes graus de fibrose hepática secundárias à infecção por
este helminto, desde manifestações intestinais até as formas mais graves da
doença, como a fibrose periportal. O estudo foi desenvolvido no povoado de
Água Preta, município de Gandu, Bahia, localizado no Litoral Sul, a 280 km de
Salvador (Figura 5). O povoado de Água Preta compreende uma comunidade
residente na vila principal e moradores de fazendas da vizinhança, totalizando
cerca de 1000 habitantes.
Gandu
Figura 5: Localização do município de Gandu - Bahia. Fonte: Wikipédia, 2013
As condições sanitárias da região são precárias, colocando os moradores
sob alto risco de infecções parasitárias. A principal fonte de renda da população é
a agricultura e a água do rio é utilizada para banho, lavagem de roupas e
utensílios, além do lazer (Figura 6). O acesso da população aos Serviços de
Saúde é difícil e existem apenas relatos de tratamentos prévios esporádicos com
anti-helmínticos.
35
Figura 6: Habitantes de Água Preta utilizando a água do rio, única fonte hídrica desta região.
4.2 Desenho do estudo e cálculo amostral
O cálculo amostral foi realizado baseado no estudo de De Jesus et al
(2004), no qual foi demonstrado que os níveis de citocina IL-13 têm sido
diferentes entre indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal secundária
à esquistossomose (Grau I= 24 ± 11,4 pg/ml e Grau III= 116 ± 120.9 pg/ml) (DE
JESUS et al., 2004). Desta forma, um tamanho mínimo de 15 indivíduos em cada
grupo seria suficiente para detectar diferenças significativas. Levou-se em
consideração um poder de 80% e erro α de 0,05.
4.3 Critérios de inclusão

Ambos os sexos;

Idade entre 10 a 60 anos, para a avaliação imunológica;

Indivíduos infectados pelo Schistosoma mansoni, sem fibrose periportal
(Grau 0), para compor o grupo I ;

Indivíduos infectados pelo Schistosoma mansoni com fibrose periportal
incipiente (Grau I), para compor o grupo II;

Indivíduos infectados pelo Schistosoma mansoni com fibrose periportal
moderada a grave (Graus II e III), para comporem o grupo III.
36
Os indivíduos com fibrose periportal moderada e grave foram incluídos no
mesmo grupo por causa da baixa frequência de ocorrência da fibrose grave
(ALVES OLIVEIRA et al.; 2006).
4.4 Critérios de não inclusão
Não foram admitidos no estudo:

Indivíduos com idade inferior a 10 anos e superior a 60 anos;

Gestantes;

Indivíduos com histórico de alcoolismo crônico;

Indivíduos portadores de doenças que possam interferir com os resultados
da avaliação da resposta imune, a exemplo das hepatites B e C, diabetes
melitus, HTLV-I e HIV;

Indivíduos que estejam em uso de imunossupressores ou em tratamento
quimioterápico de qualquer natureza.
Crianças menores de dez anos e adultos maiores de 60 não foram
incluídos no estudo de avaliação imunológica devido a maior frequência da
fibrose em indivíduos com idade superior a 10 anos (DE SOUZA et al., 2012) e à
possibilidade de apresentarem alterações da resposta imune depois dos 60 anos.
4.5 Exame parasitológico de fezes
As análises coproparasitológicas foram realizadas através da técnica de
sedimentação espontânea – Hoffmann-Pons-Janer ou método de Lutz, para a
determinação da infecção parasitária e através da técnica de Kato-Katz (KATZ et
al., 1970) para a determinação da carga parasitária dos helmintos.
4.6 Ultrassonografia de abdome superior - USG
A ultrassonografia representa uma importante ferramenta no diagnóstico
das diferentes formas clínicas da esquistossomose bem como na avaliação do
grau de fibrose periportal. O espessamento fibroso periportal constitui-se em
37
alteração que permite identificar a doença, sendo caracterizada pela USG como
área
de
hiperecogenicidade
periportal.
Esse
espessamento
acomete
principalmente a veia porta no hilo hepático, estendendo-se também para os
ramos intra-hepáticos do sistema porta e para a região perivesicular (MACHADO,
2002). A USG dos indivíduos de água preta foi realizada em clínica de
diagnóstico por imagem na cidade de Gandu-Ba, sendo alguns exames reavaliados em clínica de diagnóstico por imagem em Salvador-Ba. Para a
determinação do grau da fibrose hepática foram utilizados os critérios
preconizados pela Organização Mundial de Saúde (ABDEL-WAHAB et al., 1992).
Essa classificação leva em consideração o valor médio do diâmetro dos quatro
espaços periportais após a primeira divisão dos ramos direito e esquerdo da veia
porta, sendo considerado o grau de fibrose zero (Grau 0) o valor menor do que
3,0 mm, grau de fibrose I (Grau I) entre 3,0 a 4,9 mm; grau de fibrose II (Grau II)
entre 5,0 a 7,0 mm e grau de fibrose III (Grau III) se o diâmetro for superior a 7,0
mm.
4.7 Obtenção de células mononucleares do sangue periférico (CMSP)
Foram coletados 20 mL de sangue dos indivíduos e as células
mononucleares de sangue periférico (CMSP) foram obtidas através do gradiente
de Ficoll-Hypaque e ajustadas para concentração de 3 x 10 5 células/mL em RPMI
1640, contendo 10% de soro humano AB+ normal inativado, penicilina 100U/mL,
estreptomicina 100µL/mL, L-glutamina 2mM, 30mM HEPES (Life technologies
GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). As células foram estimuladas com 10 µg do
antígeno solúvel do ovo (SEA). Para avaliação da expressão de receptores e
produção de citocinas as células foram cultivadas a 37°C e 5% de CO2 em placas
de cultura de 96 poços por 16h. Após a incubação, as células foram marcadas
por anticorpos conjugados com fluorocromos e adquiridos por citometria de fluxo.
4.8 Avaliação do fenótipo dos monócitos ex vivo
Foram realizadas marcações das células com anticorpos monoclonais
contra marcadores de superfície celular, conjugados com fluorocromos
isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE) e “cycrhome” (CY),
38
“Allophycocyanin”(APC),
utilizando
citometria
de
fluxo.
Os
anticorpos
monoclonais incluem os marcadores de monócitos, marcadores de ativação e
receptores: CD14 (clone 61D3, eBioscience), CD16 (clone CB16, eBioscience),
CD80 (clone 2D10, eBioscience), CD86 (clone 2331(FUN-1), BD Pharmigen),
HLA-DR (clone LN3, eBioscience), IL-4Rα (clone hIL-4R-M57, BD Pharmigen) e
IL-10R (policlonal, R&D System).
Foram adicionadas 30l da solução contendo as células a 1 x 10 7
células/ml em cada poço da placa de 96 poços com fundo em “U”. Em seguida
foram acrescentados 20l da solução contendo os anticorpos específicos diluídos
em solução de diluição de anticorpos (tampão salina fosfato - PBS 1x, azida 1M e
fração V de albumina bovina - BSA) e as placas foram incubadas, protegidas da
luz por 20 minutos a 4ºC. Foram feitas 3 lavagens sucessivas utilizando PBS 1x e
solução de lavagem (PBS 1x, azida 1M e BSA) para eliminar o excesso de
anticorpo monoclonal e as células foram ressuspensas em 200l de formaldeído
2%. As placas foram mantidas a 4ºC, protegido da luz até o momento da
aquisição em FACSCanto (Becton Dickinson).
As células mononucleares foram analisadas de acordo com a frequência da
expressão dos marcadores de superfície celular usando o programa “Flow Jo”.
As populações celulares foram definidas por fluorescência inespecífica a partir da
dispersão frontal (FSC) e lateral (SSC) como parâmetros de tamanho e
granulosidade celular, respectivamente. De acordo com as características
celulares, foi feita a seleção das populações de monócitos por janelas nesta
população. Foi delimitada uma região específica no gráfico: região 1 (G1),
correspondente a janela na área de monócitos (Figura 7). Portanto, para a
análise das características fenotípicas e expressão de receptores e citocinas
intracelulares em monócitos foi utilizada a região G1.
39
Figura 7: (A) Imagem densitométrica de fluorescência não específica por tamanho (FSC) e
granulosidade (SSC) celular, identificando a população de monócitos, região 1 (G1). (B)
Subpopulações de monócitos a partir da expressão de CD14 e CD16. (C) Histograma de
expressão de CD14 nas subpopulações de monócitos.
4.9 Análise da expressão de citocinas intracelulares
A expressão de citocinas intracelulares IL-10 (clone JES3-19F1, BD
Pharmigen), IL-12 (clone C8.6, eBioscience), TGF-β (clone 9016, R&D System),
IL-6 (clone MQ2-13A5, BD Pharmigen), e TNF-α (MAb11, eBioscience) na
população de monócitos foram analisadas como descrito por Sornasse e
colaboradores (1996) (SORNASSE et al., 1996). Em resumo, suspensões com 3
x 105 células foram incubadas em placas de 96 poços por 16 horas a 37ºC, 5%
de CO2 na presença ou ausência do antígeno solúvel do S. mansoni. Após a
incubação, foram adicionados 20L/poço de brefeldina diluída 10X e realizada
40
nova incubação sob as mesmas condições por 4 horas. As células foram então
marcadas com os anticorpos monoclonais anti-CD14, anti-CD16, anti- IL-10R, IL4Rα conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC), “cycrhome” (CY) ou
APC (“Allophycocyanin”). Após a marcação das moléculas de superfície, as
placas foram lavadas com PBS azida sódica, fixadas com 200 l de formaldeído
a 2% em PBS e mantidas a 4°C até o dia seguinte. Após esta etapa, as placas
foram centrifugadas e incubadas com 150 l/poço do tampão de permeabilização,
por 10 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, foi feita marcação
intracelular, utilizando-se anticorpo monoclonal anti-citocinas, conjugados com
ficoeritrina (PE), seguido de incubação por 30 minutos à temperatura ambiente,
protegido da luz. Em seguida foram feitas sucessivas lavagens utilizando-se o
tampão de permeabilização, seguida de ressuspensão das células em 200 L de
solução de lavagem e transferência para tubos de leitura do FACS. A aquisição
foi realizada utilizando-se o aparelho FACSCanto (Becton Dickinson), num total
de 100.000 eventos.
4.10 Análise estatística
Os dados referentes à amostra da população estudada foram apresentados
através de médias aritméticas e seus respectivos desvios padrões, ou através da
mediana (mínimo – máximo).
Os resultados do fenótipo das células e dos marcadores de ativação celular
por citometria de fluxo foram expressos em percentagem de positividade do total
de células, ou percentagem de positividade dentro de um grupo celular específico.
No caso da expressão das diferentes moléculas nos monócitos, foi utilizada a
intensidade de expressão (MIF – Média de Intensidade de Fluorescência), sendo
os valores representados por mediana (mínimo-máximo).
Para comparação entre grupos, testes paramétricos e não-paramétricos
foram utilizados de acordo com a natureza dos dados gerados, tais como ANOVA
e Kruskal Wallis, respectivamente.
Todos os testes estatísticos de hipóteses foram bi-caudais, sendo
considerados estatisticamente significantes valores de p inferiores ao nível de
significância pré-estabelecidos em 5%.
41
A representação gráfica foi realizada utilizando-se o programa GraphPad
Prism® versão 5.0.
4.11 Considerações Éticas
O presente estudo é uma extensão do projeto aprovado pelo Comitê de
Ética Médica da Maternidade Climério de Oliveira – UFBA, intitulado: Avaliação
do Grau de Ativação Celular e do Perfil de Citocinas em Indivíduos com
Diferentes
Graus
de
Fibrose
Hepática
Secundária
à
Esquistossomose
(Parecer/Resolução nº 240/2008). No referido projeto foram realizados
inicialmente os exames parasitológicos de fezes e a ultrassonografia de abdome,
para avaliação do grau de fibrose hepática.
Os
participantes
do
estudo
foram
todos
voluntários
que,
após
esclarecimentos sobre o objetivo desta pesquisa, assinaram o termo de
consentimento informado. No caso de menores, o consentimento foi assinado por
um dos responsáveis.
Todos os exames foram realizados por profissionais da área de saúde
habilitados para tal. Todos os indivíduos portadores de enteroparasitoses foram
tratados, gratuitamente e, no caso de apresentarem alguma manifestação clínica
secundária à esquistossomose, receberam instruções para o tratamento da
mesma ou foi encaminhado para o acompanhamento por médicos especializados
no Complexo Hospitalar Universitário Professor Edgard Santos (C-HUPESUFBA).
42
5. RESULTADOS
5.1 Características da população de estudo
No presente estudo foram avaliados 40 indivíduos infectados pelo S.
mansoni, sendo 17 sem fibrose, 15 com fibrose incipiente e 8 com fibrose
moderada a grave (Tabela 1). Nos indivíduos com fibrose moderada a grave a
média da idade foi maior comparado com os indivíduos sem fibrose. Não foram
observadas diferenças significativas na distribuição de gênero e na carga
parasitária entre os grupos.
Tabela 1: Características da população de estudo
Sem fibrose
Fibrose incipiente
(n=17)
(n=15)
Idade (anos)*
29.7 ± 12.6
37.2 ± 11.8
(média ± DP)
Gênero Masculino n (%)**
6 (35,3)
5 (33,3)
Fibrose moderada a grave
p
(n=8)
a
46.1 ± 14.2
p<0,05
2 (25)
Carga parasitária (opg)*** 72 (24-392)
72 (24-600)
66 (24-192)
Mediana (min-max)
a
*ANOVA; **Qui-quadrado; ***Krukal-Wallis; Fibrose moderada a grave versus sem fibrose
p>0,05
p>0,05
Os tamanhos do fígado e do baço também foram avaliados nesse estudo
(Figura 8). Não houve diferença significativa no tamanho do fígado entre os
grupos [Sem fibrose (9,5 ± 1,3 cm); fibrose incipiente (10,3 ± 1,5 cm); fibrose
moderada a grave (10,9 ± 2,2 cm)], considerando a medida pela linha médioclavicular (Figura 8A). Entretanto, no grupo de indivíduos com fibrose moderada
a grave o tamanho do baço foi maior (10,9 ± 2,4 cm) em relação ao grupo de
indivíduos com fibrose incipiente (8,3 ± 1,4 cm) e sem fibrose (8,4 ± 1,7 cm),
(p<0,005) (FIGURA 8B).
43
Figura 8: Tamanho do fígado (A), considerando a medida pela linha médio-clavicular e tamanho
do baço (B) considerando o maior diâmetro do órgão medido por USG nos indivíduos com
diferentes graus de fibrose periportal (*p<0,005 ANOVA).
5.2 Caracterização fenotípica dos monócitos estimulados com o antígeno
solúvel do ovo (SEA) e ex vivo nos indivíduos com diferentes graus de
fibrose periportal secundária à esquistossomose
5.2.1 Frequência das subpopulações de monócitos nos indivíduos com diferentes
graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose.
A frequência das subpopulações de monócitos (clássicos, intermediários e
não-clássicos) foi avaliada nos indivíduos com diferentes graus de fibrose
periportal secundária à esquistossomose e os dados estão representados em
mediana (mínimo-máximo) na figura 9. Foi observado que no grupo de indivíduos
com fibrose incipiente a frequência dos monócitos intermediários (Figura 9B) e
não-clássicos (Figura 9C) em culturas estimuladas com SEA foi mais elevada
[17%
(7,72%-32,3%);
11,1%
(2,71%-27,4%),
respectivamente]
quando
comparada com o grupo de indivíduos sem fibrose [13,8% (3,88%-22,8%); 7,56%
(1,88%-24%), respectivamente]. Não foi observada diferença significativa na
frequência dos monócitos clássicos entre os indivíduos com diferentes graus de
fibrose periportal (Figura 9A). Além disso, foi também observado que
independentemente do grau de fibrose, a frequência dos monócitos clássicos foi
maior em culturas não estimuladas [56,3% (32,3%-73,9%)] e com SEA [50,1%
(32%-73,9%)], p<0,0001, quando comparada com a frequência dos monócitos
44
intermediários [Sem estímulo: 14,35% (6,3-23,4) e SEA: 13,8 (3,88-22,8),
p<0,0001] e não-clássicos [Sem estímulo: 5,36% (2,24-26,2) e SEA: 7,5 (1,88-24),
p<0,0001] . A frequência de monócitos totais não diferiu significativamente entre
os grupos com diferentes graus de fibrose periportal (dados não mostrados).
++
-
Figura 9: Frequência das subpopulações de monócitos: clássicos (CD14 CD16 ) (A),
++
+
+
++
intermediários (CD14 CD16 ) (B) e não-clássicos (CD14 CD16 ) (C) nos indivíduos com
diferentes graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose em culturas estimuladas com
10μg/mL de SEA (barra cinza) e sem estímulo (barra branca). *p<0,05 (Kruskal Wallis).
A frequência das subpopulações de monócitos foi também avaliada ex vivo
(Figura 10) e não foi observada diferença significativa entre os grupos com
diferentes graus de fibrose periportal. No entanto, a frequência dos monócitos
clássicos nos três grupos [Sem fibrose: 54,9% (31,5%-75,4%); fibrose incipiente:
51,5% (4,1%-59,6%) e fibrose moderada a grave: 50% (42,7%-71%)] foi maior
quando comparada com a frequência dos monócitos intermediários [Sem fibrose:
8,5% (4,7%-25,1%); fibrose incipiente: 9,9% (4%-18,5%) e fibrose moderada a
grave: 15,2% (8,1%-18,6%)] e não-clássicos [Sem fibrose: 13,7% (4,9%-37,3%);
fibrose incipiente: 18,8% (12,7%-41%) e fibrose moderada a grave: 19,75%
(11,1%-29,7%); p<0,005]. Em relação ao grupo de indivíduos com fibrose
incipiente observou-se também um aumento da frequência dos monócitos nãoclássicos [18,8% (12,7%-41%)] quando comparada com a frequência dos
monócitos intermediários [9,9% (4%-18,5%); p<0,005].
45
++
-
++
+
Figura 10: Frequência dos monócitos clássicos (CD14 CD16 ), intermediários (CD14 CD16 ) e
+
++
não-clássicos (CD14 CD16 ) em CMSP ex vivo de indivíduos com diferentes graus de fibrose
periportal secundária à esquistossomose. **p<0,005 (Kruskal Wallis).
5.2.2 Estado de ativação das subpopulações de monócitos nos indivíduos com
diferentes graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose.
As moléculas de ativação: HLA-DR, CD80 e CD86 foram avaliadas nos
monócitos de indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal. Foi
observado que no grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave a
expressão do HLA-DR foi maior tanto nos monócitos clássicos (Figura 11A) [Sem
estímulo MIF= 1318 (404-2531), SEA MIF= 1981 (906-3419)], quanto nos
monócitos intermediários (Figura 11B) [Sem estímulo MIF= 1782 (648-3563),
SEA MIF= 2033 (965-4198)] quando comparado com o grupo de indivíduos com
fibrose incipiente [Clássicos: Sem estímulo
MIF= 492 (278-1623), SEA MIF=
747,5 (313-1766) e Intermediários: Sem estímulo MIF= 807 (278-2079), SEA
MIF= 1034 (392-2022)] e sem fibrose [Clássicos: Sem estímulo MIF= 659 (2631138), SEA MIF= 533 (315-1791) e Intermediários: Sem estímulo MIF= 970 (4741430), SEA MIF= 733 (486-2733. Todavia, não houve diferença significativa na
expressão de HLA-DR nos monócitos não-clássicos entre os indivíduos com
diferentes graus de fibrose periportal (Figura 11C).
46
Figura 11: Expressão de HLA-DR nas subpopulações de monócitos nos indivíduos com
diferentes graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose em culturas estimuladas com
10μg/mL de SEA (barra cinza) e sem estímulo (barra branca). *p<0,05 e **p<0,005 (Kruskal
Wallis).
Quanto a expressão de HLA-DR ex vivo (Figura 12A) foi também
observado que nos indivíduos com fibrose moderada a grave houve uma maior
expressão de HLA-DR nos monócitos intermediários [MIF= 1265 (186-1666)]
quando comparado ao grupo de indivíduos sem fibrose [MIF= 208 (79,2-2756)] e
com fibrose incipiente [MIF= 179 (109-1512), p<0,05]. Em relação a expressão de
HLA-DR entre as subpopulações de monócitos nos diferentes grupos de
pacientes, observou-se uma maior expressão nos monócitos intermediários no
grupo de indivíduos sem fibrose [MIF= 208 (79,2-2756)], com fibrose incipiente
[MIF= 179 (109-1512) e com fibrose moderada a grave [MIF= 1265 (186-1666)],
comparado aos monócitos clássicos desses três grupos [MIF= 104,5 (41,6-544);
87,4 (52-489); 324,5 (116-571), respectivamente]. Além disso, nos grupos de
indivíduos com fibrose incipiente e com fibrose moderada a grave a expressão de
HLA-DR nos monócitos intermediários foi também mais elevada quando
comparado aos monócitos não-clássicos [MIF= 102,9 (41,4-541); 423 (120-774),
respectivamente].
A expressão das moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 nos monócitos
foi avaliada ex vivo e apresentou um padrão semelhante entre si (Figura 12B e
12C, respectivamente). Não houve diferença significativa na expressão de ambas
as moléculas entre os grupos de indivíduos, sendo a expressão de CD80 maior
nos monócitos intermediários nos três grupos de indivíduos avaliados [Sem
fibrose MIF= 61,4 (28,4-164); fibrose incipiente MIF= 65,2 (28-114); fibrose
moderada a grave MIF= 44,2(25,8-163)] quando comparados com os monócitos
clássicos [Sem fibrose MIF= 33,7 (25,4-59,5); fibrose incipiente MIF= 36,5 (13-
47
66,6); fibrose moderada a grave MIF= 30,8 (21,4-44,3)] e não-clássicos [Sem
fibrose MIF= 29,8 (17,1-66,1); fibrose incipiente MIF= 26,9 (11,5-44,2); fibrose
moderada a grave MIF= 24,8 (18,6-61)]. A expressão de CD86 foi de um modo
geral mais elevada, mas semelhante a expressão de CD80, foi também maior
nos monócitos intermediários nos três grupos de indivíduos avaliados [Sem
fibrose MIF= 123 (54,8-272); fibrose incipiente MIF= 116 (62,7-323) e fibrose
moderada a grave MIF= 219 (71,8-268)] em relação aos monócitos clássicos
[Sem fibrose MIF= 57,3 (28,4-173); fibrose incipiente MIF= 75 (36-243) e fibrose
moderada a grave MIF= 153,5 (31,4-182)] e não-clássicos [Sem fibrose MIF=
53,1 (30,7-134); fibrose incipiente MIF= 51,6 (21,1-157) e fibrose moderada a
grave MIF= 75,9 (28,3-107)].
Figura 12: Expressão de HLA-DR (A) e das moléculas co-estimulatórias CD80 (B) e CD86 (C)
nas subpopulações de monócitos de CMSP ex vivo de indivíduos com diferentes graus de fibrose
periportal secundária à esquistossomose. *p<0,05 e **p<0,005 (Kruskal Wallis).
A frequência de CD80 (Figura 13A) e de CD86 (Figura 13B) foram também
avaliadas ex vivo nas diferentes subpopulações de monócitos. A frequência de
CD80 foi maior nos monócitos intermediários nos três grupos de indivíduos
48
avaliados [Sem fibrose: 14,2% (1,98%-53%); fibrose incipiente: 15,35% (3%36,9%) e fibrose moderada a grave: 2,88% (0,69%-16%)] em relação aos
monócitos clássicos [Sem fibrose: 7,5% (0,37%-16,8%); fibrose incipiente: 4,7%
(0,8%-21,5%); fibrose moderada a grave: 1,23% (0,27%-5,9%)] e não-clássicos
[Sem fibrose: 1,69% (0,75%-16%); fibrose incipiente: 1,25% (0,3%-8,1%); fibrose
moderada a grave: 0,65% (0,14%-3%)]. No grupo de indivíduos com fibrose
moderada a grave a frequência de CD80 nos monócitos clássicos [1,23%
(0,27%-5,9%)] e intermediários [2,88% (0,69%-16%)] foi menor quando
comparada ao grupo de indivíduos sem fibrose [7,5% (0,37%-16,8%); 14,2%
(1,98%-53%), respectivamente].
Quanto a molécula CD86 (Figura 13B), observou-se que no grupo de
indivíduos com fibrose incipiente a frequência foi mais elevada nos monócitos
clássicos [37,4% (17,5%-87%)] e intermediários [15,35% (3%-36,9%)] quando
comparada com o grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave [19,8%
(4,1%-39%); 2,88% (0,69%-16%, respectivamente)]. Semelhante a CD80,
também foi observado que a frequência de CD86 foi maior nos monócitos
intermediários nos três grupos de indivíduos avaliados [Sem fibrose: 57%
(22,7%-93,4%); fibrose incipiente: 15,35% (3%-36,9%) e fibrose moderada a
grave: 2,88% (0,69%-16%)] quando comparados com os monócitos clássicos
[Sem fibrose: 27,2% (3%-58,6%); fibrose incipiente: 37,4% (17,5%-87%) e fibrose
moderada a grave: 19,8% (4,1%-39%)] e não-clássicos [Sem fibrose: 20%
(3,45%-75,6%); fibrose incipiente: 18,9% (6,7%-77,2%) e fibrose moderada a
grave: 17,4% (6,6%-45%)].
49
Figura 13: Frequência das moléculas co-estimulatórias CD80 (A) e CD86 (B) nas subpopulações
de monócitos de CMSP ex vivo de indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal
secundária à esquistossomose. *p<0,05, **p<0,005 e ***p<0,0001 (Kruskal Wallis).
5.2.3
Expressão
de
moléculas
pró-inflamatórias
e
pró-fibróticas
nas
subpopulações de monócitos nos indivíduos com diferentes graus de fibrose
periportal secundária à esquistossomose.
A expressão das moléculas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α e pró-fibróticas
TGF-β e IL-4Rα nas subpopulações de monócitos de indivíduos com diferentes
graus de fibrose periportal está demonstrado, na figura 14.
No grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave a expressão de IL-6
(Figura 14A-C) foi maior nas três subpopulações de monócitos [Clássicos: Sem
estímulo MIF= 79,8 (28-98,6), SEA MIF= 65,45 (26,5-135); Intermediários: Sem
estímulo MIF= 145 (38,4-217), SEA MIF= 131 (36-258) e Não-clássicos: Sem
estímulo MIF= 99,15 (18,5-172), SEA MIF= 87,6 (17,9-231)] quando comparados
com o grupo de indivíduos sem fibrose [Clássicos: Sem estímulo MIF= 18,35
(9,75-36), SEA MIF= 21,4 (8,6-62,5); Intermediários: Sem estímulo MIF= 17,9
(12,6-55,5), SEA MIF= 21,85 (12,3-108) e Não-clássicos: Sem estímulo MIF=
10,8 (7,23-32,8), SEA MIF= 10,6 (6,63-39,2)] e com fibrose incipiente [Clássicos:
Sem estímulo MIF= 25,4 (21,1-70,9), SEA MIF= 25,2 (20,7-87,6); Intermediários:
Sem estímulo MIF= 33,1 (26,1-117) e Não-clássicos: Sem estímulo MIF= 16,2
(10,1-93), SEA MIF= 11,1 (15,2-107)]. Além disso, foi também observado que no
grupo de indivíduos com fibrose incipiente a expressão de IL-6 nos monócitos
50
intermediários foi maior [SEA MIF= 31,2 (26-139] quando comparado ao grupo de
indivíduos sem fibrose [SEA MIF= 21,85 (12,3-108)] (Figura 14B).
Em relação a expressão de TNF-α observou-se que no grupo de indivíduos
com fibrose moderada a grave houve maior expressão tanto nos monócitos
clássicos (Figura 14D) [Sem estímulo MIF= 321 (52-386), SEA MIF= 244 (47,4324)], intermediários (Figura 14E) [Sem estímulo MIF= 368 (73,1-413), SEA MIF=
261 (62,8-377)] e não-clássicos (Figura 14F) [SEA MIF= 85,6 (24,3-123)] quando
comparado ao grupo de indivíduos sem fibrose [Clássicos: Sem estímulo MIF=
20,5 (5,32-86,9), SEA MIF= 20,5 (4,1-108); Intermediários: Sem estímulo MIF=
62,7 (17,4-129), SEA MIF= 48,7 (14,7-125)]; Não-clássicos SEA MIF= 25,65 (8112)]. No grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave foi ainda observado
um aumento da expressão de TNF nos monócitos não-clássicos (Figura 14F),
sem estimulação antigênica [MIF= 85,2 (19,6-111)], quando comparado com o
grupo de indivíduos com fibrose incipiente [MIF= 15,7 (8,5-97,6)]. No grupo de
indivíduos com fibrose incipiente observou-se que apenas nos monócitos
clássicos [MIF= Sem estímulo 78,8 (22,4-384), SEA MIF= 67,9 (12,9-313)] houve
um aumento da expressão desta citocina quando comparado com o grupo de
indivíduos sem fibrose (Figura 14D).
Quanto a expressão da citocina pro-fibrótica TGF-β foi também observado
que no grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave houve uma maior
expressão nos monócitos clássicos (Figura 14G) [Sem estímulo MIF= 62,25
(29,1-74,1), SEA MIF= 55,5 (24,1-81,8)], intermediários (Figura 14H) [Sem
estímulo MIF= 85,4 (22,5-102), SEA MIF= 64,7 (22,4-115)] e não-clássicos
(Figura 14I) [Sem estímulo MIF= 28,5 (13,7-44,2)] quando comparado com o
grupo de indivíduos sem fibrose [Clássicos: Sem estímulo MIF= 18,05 (10,4-58,2),
SEA MIF= 26,2 (8,9-46,2); Intermediários: Sem estímulo MIF= 21,6 (13-77,9),
SEA MIF= 25,6 (12,2-52,8); Não-clássicos: Sem estímulo MIF= 13,45 (7,6-27,7)].
Além disso, no grupo de indivíduos com fibrose incipiente a expressão de TGF-β
nos monócitos clássicos, não estimulados com SEA [MIF= 29,8 (21,9-86)] foi
maior quando comparado com grupo de indivíduos sem fibrose [MIF= 18,05
(10,4-58,2)] (Figura 14G).
A expressão do receptor α de IL-4 no grupo de indivíduos sem fibrose foi
elevada tanto nos monócitos clássicos (Figura 14J) [Sem estímulo MIF= 66,5
51
(38,5-199), SEA MIF= 67,15 (37,4-257)], intermediários (Figura 14K) [Sem
estímulo MIF= 110 (48,2-319), SEA MIF= 113,5 (50,9-367)] e não-clássicos
(Figura 14L) [Sem estímulo MIF= 90,7 (26,3-205); SEA MIF= 103,4 (24,1-230)]
quando comparado com o grupo de indivíduos com fibrose incipiente [Clássicos:
Sem estímulo MIF= 36,7 (19,5-202), SEA MIF= 38,35 (26-228); Intermediários:
Sem estímulo MIF= 53,6 (32,5-316), SEA MIF= 54,1 (42-316); Não-clássicos:
Sem estímulo MIF= 42,25 (21,2-235); SEA MIF= 38 (32,8-217)]. Além disso, no
grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave observou-se que a expressão
deste receptor foi maior também nas três subpopulações de monócitos [Clássicos:
SEA MIF= 49,9 (35,5-120); Intermediários: Sem estímulo MIF= 106 (59,7-197),
SEA MIF= 103 (62,1-213); Não-clássicos: SEA MIF= 62,6 (42,9-189)] quando
comparado com o grupo de indivíduos com fibrose incipiente, sendo que nos
monócitos clássicos (Figura 14J) e não-clássicos (Figura 14L) essa diferença foi
observada apenas nas culturas estimuladas com SEA.
52
Figura 14: Expressão das moléculas pró-inflamatórias IL-6 (A-C) e TNF-α (D-F) e pró-fibróticas TGFβ (G-I) e IL-4Rα (J-L) nas subpopulações de monócitos nos indivíduos com diferentes graus de
fibrose periportal secundária à esquistossomose em culturas estimuladas 10μg/mL de SEA (barra
cinza) e sem estímulo (barra branca). *p<0,05 e **p<0,005 (Kruskal Wallis).
53
A frequência dessas moléculas está demonstrada na tabela 2. Foi
observado que no grupo de indivíduos sem fibrose a frequência da citocina TNFα nos monócitos clássicos foi maior quando estimulados com SEA quando
comparado com o grupo de indivíduos com fibrose incipiente. Além disso, a sua
frequência nos monócitos intermediários foi maior também no grupo de
indivíduos sem fibrose em relação ao grupo de indivíduos com fibrose incipiente
e com fibrose moderada a grave, tanto na presença como na ausência do
estímulo.
Quanto a citocina TGF-β, a sua frequência nos monócitos não-clássicos foi
maior no grupo de indivíduos sem fibrose quando comparado com o grupo de
indivíduos com fibrose moderada a grave, na presença ou na ausência do
estímulo, e com o grupo de indivíduos com fibrose incipiente, apenas quando
estimulados com SEA. A frequência de IL-6 nos monócitos não-clássicos foi
maior também no grupo de indivíduos sem fibrose em relação ao grupo de
indivíduos com fibrose incipiente, na presença do estímulo.
Quanto a frequência das outras moléculas nas subpopulações de
monócitos, estimulados ou não com SEA, não foi observada diferença
significativa entre os indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal.
54
Tabela 2: Frequência de subpopulações de monócitos expressando moléculas pró-inflamatórias e
pró-fibróticas nos indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose
Sem estímulo (%)
SEA (10μg/mL) (%)
Fibrose
Sem
Fibrose
moderada a
p
fibrose
incipiente
grave
2,9
2,7
3,3
3,0
3,0
IL-6
p>0,05
(1,2-6,5)
(0,67-8,5)
(1,8-13,8)
(0,69-8,5)
(1,6-11,5)
4,3
2,6
2,5
3,6
1,7
TNF-α
p>0,05
(0,79-16,2)
(0,4-8,3)
(0,6-4,8)
(1,2-12,0)
(0,24-7,5)
1,6
2,9
3,1
3,5
2,8
TGF-β
p>0,05
(0,8-6,6)
(0,9-7,8)
(2,3-6,4)
(0,89-12,4)
(0,6-11,0)
3,7
5,3
5,2
7,3
5,9
IL-4Rα
p>0,05
(1,5-10,3)
(1,0-18,5)
(2,0-15,8)
(1,5-18,9)
(0,88-21,8)
10,6
8,7
9,5
10,0
7,5
IL-6
p>0,05
(3,2-27,0)
(2,6-13,8)
(3,8-18,6)
(2,4-33,9)
(3,2-15,0)
a
14,1
4,2
5,3
p<0,005
13,4
2,3
TNF-α
b
(3,2-27,8)
(0,95-10,5)
(1,6-12,4)
p<0,05
(2,4-19,5)
(0,3-20,9)
5,0
6,0
11,8
3,5
6,0
TGF-β
p>0,05
(0,6-21,1)
(1,7-12,3)
(2,0-13)
(0,4-21,6)
(1,9-18,4)
20,8
27,8
36,8
18,8
27,4
IL-4Rα
p>0,05
(7,3-31,5)
(4,5-59,3)
(12,4-56,3)
(6,9-39,1)
(10-54,8)
4,2
1,3
3,2
4,9
0,39
IL-6
p>0,05
(0,14-9,3)
(0,15-10,5)
(2,5-4,4)
(0,36-13,1)
(0,09-8,9)
7,5
1,4
1,9
3,7
1,7
TNF-α
p>0,05
(0,59-24,8)
(0,69-8,2)
(0,5-7,2)
(0,4-15,9)
(0,18-12,8)
2,4
0,89
0,21
6,7
1,12
b
TGF-β
p<0,05
(0,36-10,5)
(0,12-5,5)
(0,1-5,1)
(1,4-16,5)
(0,1-5,1)
10,0
15,5
17,6
11,7
15,6
IL-4Rα
p>0,05
(4,8-17,4)
(7,2-26,4)
(4,4-32,3)
(1,3-24,9)
(5,5-28,8)
a
b
Sem fibrose vs fibrose incipiente; Sem fibrose vs fibrose moderada a grave
Monócitos nãoclássicos
Monócitos
intermediários
Monócitos
clássicos
Sem
fibrose
Fibrose
incipiente
Fibrose
moderada
a grave
2,9
(1,4-4,9)
1,0
(0,75-2,7)
2,0
(1,7-7,5)
5,2
(3,7-20,9)
5,3
(2,9-16,0)
2,6
(1,6-4,9)
7,9
(5,0-11,4)
37,3
(15,3-58,5)
2,9
(0,23-9,4)
1,7
(0,8-8,2)
0,58
(0,2-2,0)
25,0
(5,9-43)
p
p>0,05
a
p<0,05
p>0,05
p>0,05
p>0,05
a
p<0,005
b
p<0,05
p>0,05
p>0,05
a
p<0,05
p>0,05
a,b
p<0,05
p>0,05
55
A frequência e expressão do receptor α de IL-4 nas subpopulações de
monócitos foram também avaliadas ex vivo e não foi observada diferença
significativa entre os grupos com diferentes graus de fibrose periportal (Figura
15A e Figura 15B, respectivamente). No entanto, nos grupos de indivíduos sem
fibrose e com fibrose incipiente a frequência do IL-4Rα foi maior nos monócitos
intermediários [9,37% (0,47%-34,3%); 15% (0,52%-27,8%), respectivamente]
quando comparados com os monócitos clássicos [3,9% (0,2%-20%); 4,6%
(0,17%-12,9%), respectivamente] e não-clássicos [1,9% (0,06%-10,6%); 3,9%
(0,09%-11,3%), respectivamente]. Semelhante a frequência, a medida de
intensidade de fluorescência do IL-4Rα nos grupos de indivíduos sem fibrose e
com fibrose incipiente foi maior nos monócitos intermediários [MIF= 45,7 (27,877,1); 55,3 (26-101), respectivamente] quando comparados com os monócitos
clássicos [MIF= 32,2 (23,2-66,3); 35,1 (17,4-61,8), respectivamente] e nãoclássicos [MIF= 31,4 (21,5-46,1); 31 (17-53,5), respectivamente]. No entanto, no
grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave, a expressão deste receptor
nos monócitos intermediários foi maior [MIF= 44,2 (30,8-54,5) em relação aos
monócitos não-clássicos [MIF= 26,5 (21,5-59)].
Figura 15: Frequência (A) e expressão (B) do receptor α de IL-4 na subpopulações de monócitos
de CMSP ex vivo de indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal secundária à
esquistossomose. *p<0,05 e **p<0,005 (Kruskal Wallis).
56
5.2.4 Expressão de moléculas anti-fibróticas e regulatórias nas subpopulações de
monócitos nos indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal secundária à
esquistossomose.
Na figura 16 é mostrada a expressão da molécula anti-fibrótica (IL-12) e
reguladoras (IL-10 e IL-10R) nos monócitos de indivíduos com diferentes graus
de fibrose periportal.
No grupo de indivíduos com fibrose incipiente a expressão de IL-12 foi
maior tanto nos monócitos clássicos (Figura 16A) [Sem estímulo MIF= 464 (87,51310) e SEA MIF= 456,5 (97,6-831)], intermediários (Figura 16B) [Sem estímulo
MIF= 722,5 (104-1589) e SEA MIF= 635 (117-1180)] e não-clássicos (Figura 16C)
[Sem estímulo MIF= 492,5 (52,1-1006) e SEA MIF= 434 (62,1-690)] quando
comparado com o grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave [Clássicos:
Sem estímulo MIF= 115,5 (85,4-656) e SEA MIF= 117,5 (81-584); Intermediários:
Sem estímulo MIF= 144 (113-922) e SEA MIF= 145,5 (83,8-896); Não-clássicos:
Sem estímulo MIF= 67,45 (39,7-618) e SEA MIF= 84,8 (37,5-550)]. Além disso,
foi observado que no grupo de indivíduos sem fibrose a expressão de IL-12 foi
maior tanto nos monócitos clássicos [Sem estímulo MIF= 408 (86,2-757) e SEA
MIF= 416 (57,2-716)] como nos não-clássicos [SEA MIF= 422 (28,4-624)] quando
comparado com o grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave, sendo que
nos monócitos não-clássicos essa diferença só foi observada na presença de
SEA.
Quanto a expressão da molécula reguladora IL-10 nesses monócitos não
foi observada diferenças significantes entre os indivíduos com diferentes graus
de fibrose periportal (Figura 16D-F).
Foi avaliada também a expressão do receptor de IL-10 nas subpolulações
de monócitos entre os indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal
(Figura 16G-I). No grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave observouse que a expressão do IL-10R foi maior tanto nos monócitos clássicos (Figura
16G) [SEA MIF= 62,3 (41,6-90,8)], intermediários (Figura 16H) [Sem estímulo
MIF= 118 (83,2-291) e SEA MIF= 151 (93,8-284)] e não-clássicos (Figura 16I)
[SEA MIF= 78,6 (61,3-187)] quando comparado com o grupo de indivíduos com
fibrose incipiente [Clássicos: SEA MIF= 41,75 (25,2-198); Intermediários: Sem
57
estímulo MIF= 73,8 (38,8-305) e SEA MIF= 85,75 (40,8-291) e Não-clássicos:
SEA MIF= 42,35 (24,6-213)], sendo que nos monócitos clássicos e não-clássicos
essa diferença só foi observada em culturas estimuladas com SEA. Além disso,
no grupo de indivíduos sem fibrose a expressão de IL-10R foi maior nos
monócitos clássicos [Sem estímulo MIF= 82,6 (40-211) e SEA MIF= 63,1 (39,7227)] e não-clássicos [Sem estímulo MIF= 101,4 (37,8-234)] quando comparado
ao grupo de indivíduos com fibrose incipiente [Clássicos: Sem estímulo MIF=
41,45 (25,4-217) e SEA MIF= 41,75 (25,2-198) e Não-clássicos: Sem estímulo
MIF= 44,8 (25-243)], sendo que nos monócitos não-clássicos essa diferença só
foi observada em culturas não estimuladas.
Figura 16: Expressão das moléculas anti-fibrótica IL-12 (A-C) e reguladoras IL-10 (D-F) e IL-10R
(G-I) nas subpopulações de monócitos nos indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal
secundária à esquistossomose em culturas estimuladas com 10μg/mL de SEA(barra cinza) e sem
estímulo (barra branca). *p<0,05 e **p<0,005 (Kruskal Wallis).
58
A frequência destas moléculas está demonstrada na tabela 3. Nos
monócitos clássicos e intermediários foi observado que a frequência de IL-12 foi
maior no grupo de indivíduos sem fibrose quando comparado com o grupo de
indivíduos com fibrose moderada a grave (na presença do estímulo) e com
fibrose incipiente (na ausência do estímulo), respectivamente. Além disso, foi
também observado que a frequência desta citocina nos monócitos clássicos no
grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave foi maior na ausência do
estímulo do que nas culturas estimuladas com SEA.
Quanto a citocina IL-10 foi observada que sua frequência nos monócitos
clássicos, na presença do SEA, foi maior no grupo de indivíduos com fibrose
incipiente em relação ao grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave.
Entretanto, não foi observada diferença significativa dessa molécula nos
monócitos intermediários e não-clássicos entre os indivíduos com diferentes
graus de fibrose periportal. Já o receptor de IL-10, a sua frequência nos
monócitos intermediários foi maior no grupo de indivíduos com fibrose incipiente
e com fibrose moderada a grave quando comparado com o grupo de indivíduos
sem fibrose, apenas na presença do SEA.
Quanto a frequência dessas moléculas nos monócitos não-clássicos, não foi
observada diferença significativa entre os indivíduos com diferentes graus de
fibrose periportal.
59
Monócitos nãoclássicos
Monócitos
intermediários
Monócitos
clássicos
Tabela 3: Frequência de subpopulações de monócitos expressando moléculas anti-fibróticas e
regulatórias nos indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal secundária à esquistossomose
Sem estímulo (%)
SEA (10μg/mL) (%)
Sem
fibrose
Fibrose
incipiente
IL-12
3,7
(0,3-12,8)
3,5
(1,5-10,8)
Fibrose
moderada
a grave
2,9 *
(0,3-12,5)
p
Sem
fibrose
Fibrose
incipiente
p>0,05
3,4
(0,33-12,2)
1,9
(0,24-9,5)
Fibrose
moderada
a grave
2,1
(0,5-3,0)
IL-10
2,0
(0,73-11,2)
2,0
(0,65-9,8)
0,87
(0,33-3,2)
p>0,05
1,5
(0,16-14,8)
2,25
(0,4-15,6)
1,0
(0,17-4,5)
p<0,05
IL-10R
3,9
(1,8-13)
1,7
(8,4-20)
8,2
(4,3-16,2)
p>0,05
4,0
(1,9-24,7)
7,7
(2,0-21,6)
17,3
(3,6-25,6)
p>0,05
IL-12
17,25
(6,0-32,0)
10,4
(1,8-20,3)
17,8
(1,2-30,1)
p<0,05
13,4
(3,7-32,9)
11,8
(2,0-39,5)
4,3
(1,7-21,7)
p<0,05
IL-10
10,7
(1,3-24,7)
12,5
(2,8-20,1)
6,7
(1,7-18,5)
p>0,05
5,7
(0,45-20,6)
12,5
(1,4-24)
4,0
(1,3-15,8)
p>0,05
IL-10R
19,6
(8,9-33,1)
25,2
(9,0-43,1)
31,2
(12,6-44,1)
p>0,05
16,3
(5,3-29)
26,8
(7,3-44,2)
41,3
(16,4-47)
p<0,05
e
p<0,005
IL-12
8,4
(0,13-18,6)
1,7
(0,35-16,2)
1,9
(0,34-15,9)
p>0,05
3,4
(0,25-15,7)
3,1
(0,29-13,9)
2,0
(0,87-13,6)
p>0,05
IL-10
3,7
(0,33-11,2)
1,7
(0,4-16,8)
1,9
(0,39-3,8)
p>0,05
1,0
(0,36-14,4)
1,4
(0,18-9,2)
1,4
(1,0-2,5)
p>0,05
IL-10R
10,3
(5,0-21,3)
17,3
(2,8-43,4)
13,3
(7,6-28,6)
p>0,05
8,2
(3,9-26,1)
12,9
(2,5-39,7)
19,2
(6,8-37,6)
p>0,05
a
b
a
c
Sem fibrose vs Fibrose incipiente; Sem fibrose vs Fibrose moderada a grave; Fibrose incipiente
d
e
vs sem fibrose; Fibrose incipiente vs Fibrose moderada a grave; Fibrose moderada a grave vs sem
fibrose * Comparado com Fibrose moderada a grave estimulado com SEA (10μg/mL)
p
b
p<0,05
d
c
60
O receptor de IL-10 foi também avaliado ex vivo e observou-se que no
grupo de indivíduos com fibrose moderada a grave a frequência dos monócitos
clássicos expressando o receptor de IL-10 foi mais elevada [16,75% (5,4%29,7%)] quando comparada com o grupo de indivíduos sem fibrose [5,2%
(0,25%-11,9%)] e com fibrose incipiente [4,1% (0,3%-12,9%)]. Além disso, no
grupo de indivíduos sem fibrose e com fibrose incipiente foi observado uma maior
frequência do IL-10R nos monócitos intermediários [13,1% (0,76%-26,2%); 10%
(0,71%-20,3%), respectivamente] quando comparada com os monócitos
clássicos [5,2% (0,25%-11,9%); 4,1% (0,3%-12,9%), respectivamente]. No
entanto, no grupo de indivíduos sem fibrose a frequência do IL-10R nos
monócitos intermediários foi também maior quando comparada aos monócitos
não-clássicos [6,2% (0,52%-13,2%)] e no grupo de indivíduos com fibrose
moderada a grave a frequência do IL-10R foi maior nos monócitos clássicos
[16,75% (5,4%-29,7%)] quando comparada aos monócitos não-clássicos [2,1%
(0,6%-5,86%)] (Figura 17). Quanto a expressão de IL10R (Figura 17B), observouse maior intensidade de expressão nos monócitos intermediários dos três grupos
de indivíduos avaliados [Sem fibrose MIF= 91,8 (30,2-239), fibrose incipiente
MIF= 81 (29,5-159) e fibrose moderada a grave MIF= 126 (64,8-155)] em relação
aos monócitos clássicos [Sem fibrose MIF= 42,7 (30,1-75,7), fibrose incipiente
MIF= 42 (14,5-77,1) e fibrose moderada a grave MIF= 38,9 (32-68,2)] e nãoclássicos [Sem fibrose MIF= 39,7 (23,7-72,9), fibrose incipiente MIF= 30 (16-62,7)
e fibrose moderada a grave MIF= 26,1 (18-81,5)].
61
Figura 17: Frequência (A) e expressão (B) do receptor de IL-10 na subpopulações de monócitos
de CMSP ex vivo de indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal secundária à
esquistossomose. *p<0,05, **p<0,005 e ***p<0,0001 (Kruskal Wallis).
62
6.DISCUSSÃO
Este estudo teve como objetivo caracterizar o fenótipo dos monócitos de
indivíduos
com
diferentes
graus
de
fibrose
periportal
secundária
à
esquistossomose mansônica. Foi observado que a média da idade dos indivíduos
com fibrose moderada a grave foi maior quando comparada com os indivíduos
sem fibrose, o que está de acordo com a literatura em que se observa idade mais
elevada nos indivíduos com fibrose moderada a grave quando comparada aos
demais grupos (DE JESUS et al., 2004; ALVES OLIVEIRA et al., 2006; DE
SOUZA et al., 2012). Este fato pode ser explicado pela resposta imune induzida
pela constante reexposição ao parasito ao longo da vida, ou pelo lento processo
da formação da fibrose. Portanto, os indivíduos mais jovens provavelmente não
foram expostos o tempo suficiente para efeitos cumulativos da deposição do
colágeno na região periportal (BOOTH et al., 2004). Quanto a carga parasitária,
não foi observada diferença entre os grupos de pacientes com diferentes graus
de fibrose. Outros trabalhos têm demonstrado que os indivíduos sem fibrose
apresentaram carga parasitária maior quando comparado com os outros grupos
(DE JESUS et al., 2004; DE SOUZA et al., 2012). No presente estudo, também
não foi observado diferença na distribuição dos gêneros entre os grupos, apesar
de alguns estudos demonstrarem a importância de fatores associados ao gênero
no desenvolvimento da fibrose periportal (SILVA-TEIXEIRA et al 2004;
MOHAMED-ALi et al., 1999).
Em relação ao tamanho do fígado, estudos têm mostrado que o tamanho
do fígado diminui com o aumento do grau de fibrose associada a
esquistossomose (ABDEL-WAHAB et al., 1989, 1992; RICHTER et al., 1992;
HOUSTON et al., 1993), enquanto outros não tem encontrado nenhuma relação
entre o tamanho e a fibrose periportal (DOEHRING-SCHWERDTFEGER et al.,
1990). No presente estudo, também não foi observada diferença significativa do
tamanho fígado entre os três grupos de indivíduos avaliados. Quanto ao tamanho
do baço, alguns estudos não têm encontrado correlação entre esplenomegalia e
os graus de fibrose (DOEHRING-SCHWERDTFEGER et al., 1992; RICHTER et
al., 1992). Entretanto, no nosso estudo foi observado que o tamanho do baço dos
indivíduos com fibrose moderada a grave foi maior em relação aos demais
63
grupos, achado concordante com alguns trabalhos (HOMEIDA et al., 1988; DE
JESUS et al., 2000).
As células mononucleares estão envolvidas em quase todos os aspectos
de doenças crônicas do fígado, especialmente naqueles que levam a fibrogênese.
A fibrose é um processo de cicatrização multicelular, onde miofibroblastos que
expressam componentes de matriz extracelular têm comunicação cruzada com
outras células residentes no fígado ou recrutadas a partir da corrente sanguínea
(MARRA et al., 2009). Nos últimos anos, vários estudos têm enfatizado o papel
importante de monócitos para a progressão da inflamação e fibrose hepática em
modelos experimentais (DUFFIELD et al., 2005; KARLMARK et al., 2009;
MITCHELL et al., 2009; SEKI et al., 2009).
A frequência de diferentes subpopulações de monócitos foi avaliada neste
estudo, tanto ex vivo quanto em culturas na presença e ausência do antígeno
solúvel do ovo (SEA). Foi observado que a frequência dos monócitos clássicos
foi maior em relação as demais subpopulações. Os monócitos clássicos
correspondem aproximadamente a 90% dos monócitos no sangue periférico
(ZIEGLER-HEITBROCK et al., 2010; WONG et al., 2011), e um estudo de
Liaskou et al (2013) sobre as subpopulações de monócitos de indivíduos com
doenças
crônicas
hepáticas
também
observam
uma
frequência
de
aproximadamente 80% dos monócitos clássicos tanto nos pacientes quanto nos
indivíduos saudáveis (LIASKOU et al., 2013). Além disso, no nosso estudo foi
observado que no grupo de indivíduos com fibrose incipiente existe uma
expansão de monócitos intermediários e não-clássicos, na presença do SEA,
quando comparada ao grupo de indivíduos sem fibrose.
Quanto ao estado de ativação desses monócitos foram analisadas as
moléculas HLA-DR, CD80 e CD86. A expressão de HLA-DR nos monócitos é um
pré-requisito importante para uma apresentação de antígeno efetiva às células T
CD4+. No presente estudo, a expressão de HLA-DR foi avaliada tanto em ex vivo
como em culturas na presença e ausência do SEA. Foi observado que no grupo
de indivíduos com fibrose moderada a grave a expressão de HLA-DR nos
monócitos intermediários nas três condições e nos monócitos clássicos nas
culturas foi maior quando comparada ao grupo de indivíduos com fibrose
incipiente e sem fibrose. Esses resultados indicam que os monócitos de
64
indivíduos com o grau mais elevado de fibrose são mais ativados do que os
outros grupos, contribuindo com o processamento e apresentação de antígeno e
ativação de células T.
Além disso, de um modo geral a expressão de HLA-DR nos monócitos
intermediários foi maior do que nos monócitos clássicos e não-clássicos. O
mesmo foi observado em relação a expressão de CD80 e CD86. Estudos têm
mostrado que os monócitos intermediários expressam altos níveis de genes
associados ao processamento e apresentação de antígenos (WONG et al., 2011;
ZAWADA et al., 2011). No entanto, outros trabalhos envolvendo células de
indivíduos saudáveis (WONG et al., 2011) e de indivíduos com leishmaniose
cutânea na presença do Sm29 do Schistosoma mansoni (BAFICA et al., 2012)
não observaram diferenças significativas na expressão de CD80 e CD86 nas três
subpopulações de monócitos, o que diferiu do nosso resultado.
A frequência de monócitos clássicos e intermediários expressando CD80
foi maior no grupo de indivíduos sem fibrose quando comparada com aqueles
com fibrose moderada a grave. A frequência de CD86 foi maior também nos
monócitos clássicos e intermediários no grupo de indivíduos com fibrose
incipiente quando comparada ao grupo de indivíduos com fibrose moderada a
grave. As moléculas co-estimulatórias CD80 e CD86 são bem conhecidas pelo
papel importante que desempenham durante a iniciação de respostas imune
adaptativas e em várias doenças imune-medidas (LENSCHOW et al., 1996;
ODOBASIC et al., 2005). Alguns trabalhos em modelo experimental têm
mostrado que CD80 e CD86 podem seletivamente induzir respostas do tipo Th1
e Th2, respectivamente (KUCHROO et al., 1995; LENSCHOW et al., 1996).
Entretanto, outros estudos mostraram que essa seletividade tem sido difícil
estabelecer em humanos (LEVINE et al., 1995; BASHIAN et al., 1997). Neste
estudo observou-se uma baixa frequência de monócitos expressando CD80 e
CD86 em indivíduos com grau mais elevado de fibrose. A fibrose moderada a
grave tem sido associada a uma resposta Th2 exacerbada (DE JESUS, et al.,
2004; ALVES OLIVEIRA et al., 2006) e Subramanian et al (1997) demonstraram
que CD86 pode ser necessário para formação do granuloma induzido por
helminto e para expressão de citocinas do tipo Th2 em modelo experimental
(SUBRAMANIAN et al., 1997).
65
Em células T humanas, a ligação de CTLA-4 com CD80 expressa em
células dendríticas promove a função reguladora, enquanto que as interações
CD86-CD28 representam um potente sinal que interfere nas funções inibitórias
das células T reguladoras (ZHENG et al., 2004). Estes dados poderiam justificar
essa maior frequência de CD80 no grupo sem fibrose, o que estaria associado na
sua indução da supressão da resposta imune e que a maior frequência de CD86
nos monócitos de indivíduos com fibrose incipiente poderia estar associada a
uma ausência de regulação no desenvolvimento da fibrose nestes indivíduos. O
fato de ambas as moléculas estarem diminuídas nos monócitos de indivíduos
com fibrose moderada a grave poderia sugerir uma modulação crônica da
resposta imune nestes indivíduos, desde que tem sido demonstrado que a
infecção crônica por helmintos induz modulação no sistema imunológico. O papel
de CD80 e CD86, entretanto, é controverso em várias doenças e mais estudos
são necessários para o entendimento do papel da expressão dessas moléculas
na fibrose periportal secundária à esquistossomose.
Para auxiliar no entendimento dos mecanismos que poderiam estar
envolvidos
no
desenvolvimento
da
fibrose
periportal
secundária
à
esquistossomose, moléculas de caráter pró-fibróticas e pró-inflamatórias foram
também avaliadas nas diferentes subpopulações de monócitos.
A expressão de IL-4Rα nas três subpopulações de monócitos foi maior nos
indivíduos sem fibrose e com fibrose moderada a grave quando comparada com
os indivíduos com fibrose incipiente. Além disso, a frequência de monócitos
intermediários expressando IL-4Rα e também a expressão da molécula nestas
células no grupo de indivíduos sem fibrose e com fibrose incipiente foi maior
quando comparada com os monócitos clássicos e não-clássicos, corroborando
com os demais achados neste estudo, em que esta subpopulação está mais
ativada quando comparada as demais subpopulações. Em modelo experimental
as citocinas IL-4 e IL-13 são responsáveis por induzir uma ativação alternativa de
monócitos, através da ligação ao receptor α de IL-4. A sinalização através do IL4Rα induz a expressão de arginase, enzima responsável pela conversão de Larginina em prolina. A prolina é um aminoácido essencial que está envolvido na
produção de colágeno e, portanto, no desenvolvimento da fibrose (HESSE et al.,
2001).
Estudos envolvendo modelo experimental em
S. mansoni
têm
66
demonstrado que a responsividade através do IL-4Rα é importante para
formação do granuloma e sobrevivência do hospedeiro durante a infecção por
este helminto (JANKOVIC et al., 1999; HERBERT et al., 2004). No entanto, na
literatura são raros os trabalhos relatando a função deste receptor nos monócitos
humanos e, em modelo experimental de esquistossomose, o papel IL-4Rα
permanece controverso.
Em relação a expressão de TGF-β, observou-se elevação nas três
subpopulações de monócitos no grupo de indivíduos com fibrose moderada a
grave e nos monócitos clássicos de pacientes com fibrose incipiente quando
comparada ao grupo de indivíduos sem fibrose. A TGF-β é uma citocina
responsável por múltiplos processos biológicos tais como inflamação, fibrose e
reparo tecidual (BLOBE, et al., 2000; LI et al., 2006). Esta citocina induz
proliferação de fibroblastos e produção de colágeno, a sua produção é
aumentada no local da fibrose, o que sugere seu papel potencial no
estabelecimento da fibrose (FINE e GOLDSTEIN, 1987; BORDER e NOBLE,
1994; VERRECCHIA e MAUVIEL, 2007). Estudo de Souza et al (2012) não
observou diferença significativa nos níveis séricos de TGF-β nos grupos de
indivíduos
com
diferentes
graus
de
fibrose
periportal
secundária
à
esquistossomose (DE SOUZA et al., 2012). Além disso, outros estudos também
não observam diferenças nos níveis de TGF-β em sobrenadantes de CMSP
estimulados com SEA entre grupos de indivíduos com diferentes graus de fibrose
periportal (DE JESUS et al., 2004; ALVES OLIVEIRA et al., 2006). No entanto, a
produção desta citocina tem sido demonstrada em CMSP de babuínos infectados
com S. mansoni, o qual sugeriu uma associação com fibrose (FARAH et al.,
2000). Possivelmente a expressão de TGF-β por monócitos humanos se associa
melhor com a fibrose do que a produção desta citocina por CMSP.
As citocinas pro-inflamatórias IL-6 e TNF-α também foram avaliadas neste
estudo. A expressão de IL-6 foi maior nas três subpopulações de monócitos de
indivíduos com fibrose moderada a grave quando comparada com os indivíduos
com fibrose incipiente e sem fibrose, e maior também nos monócitos
intermediários de indivíduos com fibrose incipiente quando comparada com os
indivíduos sem fibrose. A IL-6 é uma citocina envolvida numa variedade de
papéis importantes na resposta imune, desde a indução de uma resposta
67
inflamatória de fase aguda até na fibrogênese, uma vez que também induz a
proliferação de fibroblastos, produção de colágeno, bem como a síntese do
inibidor de metaloproteinase 1(TIMP-1) (DUNCAN e BERMAN, 1991; LOTZ e
GUERNE, 1991; MIHARA et al., 1996; BARNES et al., 2011). Estudo de Khalil et
al (1996) relatam um aumento da produção de IL-6 durante o curso da infecção
pelo S. mansoni em modelo experimental, como também na formação do
granuloma hepático, o que poderia indicar a participação desta citocina na
resposta inflamatória granulomatosa (KHALIL et al., 1996). Outro estudo relata
que o SEA estimula a produção de IL-6 em culturas de macrófagos isolados de
granulomas em modelo experimental (CHENSUE et al., 1994). Nosso estudo dá
suporte também à participação de monócitos expressando IL-6 na progressão da
fibrose periportal secundária à esquistossomose em humanos.
Por outro lado, no nosso estudo a frequência de IL-6 nos monócitos nãoclássicos foi maior no grupo de indivíduos sem fibrose quando comparada com o
grupo
de
indivíduos
com
fibrose
incipiente.
Faz-se
necessário
um
acompanhamento dos indivíduos com frequência elevada de monócitos
expressando IL-6 para avaliar a possibilidade do aumento da predisposição para
o desenvolvimento da fibrose periportal nesses indivíduos.
A combinação de citocinas TGF-β e IL-6 é essencial para a diferenciação
das células T naive em Th17 (VELDHOEN, et al., 2006; BETTELLI, et al., 2006;
MANGAN et al., 2006; KORN et al., 2009). A IL-17 é uma citocina envolvida no
desenvolvimento da doença grave pelo recrutamento de neutrófilos e macrófagos
nos sítios inflamatórios (TALLIMA et al., 2009) e também tem sido envolvida na
patogênese da esquistossomose em modelos experimentais (ANDRADE, 2009;
RUTITZKY et al., 2005, 2006). Em nosso estudo, observamos uma maior
expressão de IL-6 e TGF-β nos monócitos de indivíduos com fibrose moderada a
grave, o que poderia contribuir com a indução de IL-17 e consequentemente com
o agravamento da doença. No estudo De Souza et al (2012), entretanto, não
observou diferenças nos níveis de IL-17 em sobrenadantes de CMSP
estimulados com SEA entre os grupos de indivíduos com diferentes graus de
fibrose periportal (DE SOUZA et al., 2012).
Quanto ao TNF-α, a sua expressão foi maior nos monócitos de indivíduos
com fibrose moderada a grave quando comparada com os indivíduos sem fibrose
68
e com fibrose incipiente (monócitos não-clássicos), como também, foi mais
expressada nos monócitos clássicos de indivíduos com fibrose incipiente quando
comparada com os indivíduos sem fibrose. Estudos realizados com indivíduos
com esquistossomose têm mostrado que altos níveis desta citocina produzidos
por CMSP estimulados com antígenos de Schistosoma são significativamente
associado com a presença da fibrose periportal (MWATHA et al., 1998; HENRI et
al., 2002; BOOTH et al., 2004). De Souza et al (2012) mostram que os níveis de
TNF-α em sobrenadante de CMSP, sem estimulação antigênica, é maior nos
indivíduos com fibrose moderada a grave quando comparada com os indivíduos
sem fibrose (DE SOUZA et al., 2012). Entretanto, outros estudos não observam
diferenças significativas nos níveis de TNF-α em sobrenadantes de CMSP
estimuladas com SEA entre os grupos com diferentes graus de fibrose (DE
JESUS et al., 2004; ALVES OLIVEIRA et al., 2006; DE SOUZA et al., 2012).
Outros trabalhos têm sugerido que TNF-α pode ser fundamental para a redução
do granuloma e da fibrose hepática em modelo experimental (HOFFMANN et al.,
1998). Nosso estudo mostra que os monócitos expressando esta citocina,
independente da sua subpopulação, são importantes para desenvolvimento da
fibrose. No entanto, semelhante à IL-6, a frequência de monócitos expressando
TNF-α, na presença do SEA, foi maior nos monócitos clássicos e intermediários
dos indivíduos sem fibrose quando comparada com os indivíduos com fibrose
incipiente e com os indivíduos com fibrose moderada a grave. Embora tenha sido
baixa a intensidade de expressão de IL-6 e TNF-α nos monócitos de pacientes
sem fibrose, eles devem ser monitoradas quanto ao desenvolvimento da fibrose.
Estudos demonstram que os monócitos clássicos, intermediários e nãoclássicos de indivíduos saudáveis produzem níveis elevados de IL-6 e TNF-α,
quando estimulados com lipopolissacarídeo (LPS) (WONG et al., 2011). A
presença do SEA nas culturas expandiu a população de monócitos expressando
TNF-α, IL-6 e TGF-β nos pacientes sem fibrose, entretanto, a expressão destas
moléculas por células foi muito baixa nesses pacientes.
Trabalhos
realizados
com
modelo
experimental
indicam
que
monócitos/macrófagos não são apenas fundamentais para progressão da fibrose,
mas também para regressão da fibrose, uma vez que podem também degradar
proteínas
da
matriz
extracelular
e
exercer
ações
anti-inflamatórias
69
(ZIMMERMANN e TACKE, 2011; FALLOWFIELD et al., 2007). Devido a isso,
nosso estudo também avalia as moléculas com perfil regulador e antifibrótico.
Em nosso trabalho, a expressão de IL-12 foi maior nos monócitos de
indivíduos com fibrose incipiente e sem fibrose (observado nos monócitos
clássicos e não-clássicos) quando comparada com os indivíduos com fibrose
moderada a grave. Foi também observada uma maior frequência de monócitos
expressando esta citocina em indivíduos sem fibrose quando comparada aqueles
com fibrose moderada a grave e fibrose incipiente. A citocina IL-12 é conhecida
por favorecer respostas do tipo Th1, e os efeitos que a mesma exerce na fibrose
são acompanhados pela substituição do padrão de citocinas Th2, que é
característica da infecção por S. mansoni, por citocinas do tipo Th1 (WYNN et al.,
1995). Neste mesmo estudo, os autores também consideram esta citocina como
anti-fibrótica por inibir a síntese de colágeno em fibroblastos. Alguns trabalhos
têm também mostrado que a inflamação granulomatosa e fibrose hepática em
modelo experimental de S. mansoni pode ser prevenida com adição de IL-12,
considerada uma potente adjuvante indutora de resposta Th1 (WYNN et al., 1994,
1995; MENTINK-KANE et al., 2011). Hoffman et al (1998) demonstram que o
desvio da resposta imune de Th2 para Th1, e a manutenção desta resposta é
necessária para redução do tamanho do granuloma e prevenção da fibrose
hepática (HOFFMANN et al., 1998). Além disso, a IL-12 poderia também ativar os
monócitos/macrófagos a expressarem o óxido nítrico sintase induzida (iNOS), ao
invés da arginase (HESSE et al., 2000). Como esperado, os monócitos de
indivíduos com fibrose moderada a grave apresentaram uma baixa expressão de
IL-12, sendo a resposta Th1 desses pacientes possivelmente insuficiente para
controlar o desenvolvimento da fibrose.
As moléculas reguladoras IL-10 e IL-10R foram também avaliadas nos
monócitos de indivíduos com diferentes graus de fibrose periportal. Não foi
observada diferença significativa na expressão de IL-10 nos monócitos de
indivíduos dos diferentes gupos. Entretanto, a frequência de monócitos clássicos
expressando IL-10 foi maior nos indivíduos com fibrose incipiente quando
comparada com os indivíduos com fibrose moderada a grave. Vários estudos
relatam o papel protetor de IL-10 durante a esquistossomose (BOSSHARDT et
al., 1997; HOFFMANN et al., 2000; BOOTH et al., 2004). Tem sido mostrado que
70
esta citocina pode controlar a resposta excessiva tanto do tipo Th1 quanto Th2,
suprimir a ativação de células dendríticas e macrófagos e limitar a
hepatotoxicidade induzida por ovos do verme adulto durante a fase aguda da
infecção (OSWALD et al., 1992; HOFFMANN et al., 2000; HESSE et al., 2004).
Os níveis de IL-10 em sobrenadante de culturas de CMSP estimulados com SEA
nos indivíduos com fibrose periportal têm sido discordantes na literatura. Alguns
autores encontraram níveis elevados desta citocina em indivíduos com fibrose
periportal grave quando comparada com os outros graus (DE JESUS et al.,
2004) , enquanto outros encontraram níveis mais baixos de IL-10 nos indivíduos
com fibrose moderada a grave (ALVES OLIVEIRA et al., 2006). Existe ainda
estudo que não encontrou diferença significativa nos níveis desta citocina entre
os grupos de indivíduos (DE SOUZA et al., 2012). Trabalhos envolvendo modelo
experimental
em
esquistossomose
têm
mostrado
que
a
fibrose
foi
consistentemente aumentada em camundongos deficientes em IL-10 e IL-12
simultaneamente, sugerindo que ambas citocinas interagem para inibir o
desenvolvimento de fibrose (HOFFMANN et al., 2000; MENTINK-KANE et al.,
2011).
Quanto a expressão do receptor de IL-10 no presente estudo, observou-se
uma maior expressão nos monócitos clássicos, assim como uma maior
frequência de monócitos intermediários expressando IL-10R nos indivíduos com
fibrose moderada a grave e com fibrose incipiente. Esse é um dado inesperado,
desde que Herbert et al (2008) demonstram que a administração de anticorpos
monoclonais anti-IL-10R em camundongos infectados pelo S. mansoni aumentou
significativamente a produção de IL-4, IFN-γ, TNF-α e IL-17, como também
aumentou o tamanho do granuloma hepático e lesões hepatocelulares
(HERBERT et al, 2008). Apesar da elevada expressão de IL-10R nos monócitos
clássicos e intermediários dos pacientes com fibrose moderada a grave, estes
foram os mais ativados e os que expressaram altos níveis de moléculas prófibróticas e pró-inflamatórias, a exemplo de IL-4Rα, TGF-β, IL-6 e TNF-α.
São raros os trabalhos que retratam a funcionalidade dessas moléculas
reguladoras na fibrose periportal secundária à esquistossomose. As expressões
dessas moléculas nos monócitos assim como o seu papel nesta doença
permanecem controversas, entretanto o presente estudo traz importantes
71
contribuições no entendimento do papel das diferentes subpopulações de
monócitos na patogênese da esquistossomose humana.
72
7.RESUMO DOS RESULTADOS
7.1 Expressão das moléculas co-estimulatórias e receptores de citocinas em
ensaio ex vivo em monócitos de pacientes esquistossomóticos com diferentes
graus de fibrose periportal.
Grau de
fibrose Sem fibrose
Monócitos
HLA-DR +
CD80 +
Clássicos
CD86 +
Intermediários
Não clássicos
HLA-DR ++
CD80 +++
CD86 +++
IL-4Rα +++
IL-10R +++
CD80 +
CD86 +
IL-4Rα +
IL-10R +
Fibrose
incipiente
HLA-DR +
CD80 +
CD86 +
IL-4Rα +
IL-10R +
HLA-DR ++
CD80 +++
CD86 +++
IL-4Rα +++
IL-10R +++
HLA-DR +
CD80 +
CD86 +
IL-4Rα +
IL-10R +
Fibrose
moderada a
grave
HLA-DR +
CD80 +
CD86 +
IL-10R +
HLA-DR +++
CD80 +++
CD86 +++
IL-4Rα +++
IL-10R +++
HLA-DR +
CD80 +
CD86 +
IL-4Rα +
IL-10R +
7.2 Figura representativa da expressão de citocinas e receptores nos monócitos
após cultura de pacientes esquistossomóticos com diferentes graus de fibrose
periportal.
Sem Fibrose
Clássicos
Fibrose incipiente
Fibrose moderada a grave
IL-6
TNF
TGF-β
IL-12
Intermediários
Não-clássicos
IL-10R
IL-4Rα
73
8.CONCLUSÃO
Os resultados deste estudo indicam que os monócitos de indivíduos com fibrose
periportal moderada a grave, independente da subpopulação, participam da
imunopatogênese da doença, uma vez que expressam altos níveis de citocinas
pró-inflamatórias e pró-fibróticas e baixos níveis de citocinas anti-fibróticas.
9. PERSPECTIVAS
Este é o primeiro trabalho nesta área, sendo necessários mais estudos para o
melhor entendimento do papel de moléculas expressas nos monócitos na
progressão e na regulação da fibrose.
74
10.REFERÊNCIAS
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89
11. ANEXOS
11.1 Ficha de avaliação ultrassonográfica – USG
IDENTIFICAÇÃO
1. Nome: ___________________________________________ Identificação:
2. Comunidade: ____________________
3. Data da avaliação: ______/______/______
1 – FÍGADO
1.1 Dimensões
1.1.1 Medida da linha média (cm): __________
1.1.2 Medida da linha médio-clavicular (cm): __________
1.1.3 Lobo direito abaixo do RCD:
(a) Sim, sem
inspiração profunda
(b) Sim, à
inspiração profunda
(c) Não
1.1.4 Lobo esquerdo abaixo do AX: (a) Sim, sem inspiração profunda
(b) Sim, à inspiração profunda
(c) Não
1.2 Características da superfície do fígado:
(a) Regulares
(b) Irregulares
1.3 Textura do parênquima hepático
1.3.1 Múltiplas áreas ecogênicas no fígado (espaços porta):
(a) Presentes
(b) Ausentes
1.3.2 Atenuação do feixe acústico posterior:
(a) Presentes
(b) Ausentes
1.4 Espessura de 4 espaços periportais (entre a 1ª e a 2ª divisão após os ramos esquerdo e
direito da veia porta) (mm):1. (________)
2. (________)
3. (________)
4.
(________) Média _______
1.5 Espessura de 4 espaços periportais distais (entre a 2ª e a 3ª divisão após os ramos
esquerdo e direito da veia porta) (mm):
1. (________) 2. (________) 3. (________) 4.
(________) Média ________
1.6 Maior diâmetro da veia porta extra hepática (mm): __________
1.7 Diâmetro da veia porta (localização: ponto médio entre a entrado do hilo hepático e sua
bifurcação dentro do fígado) (mm): __________
1.8 Espessura da parede da veia porta (mm): __________
90
2 – VESÍCULA BILIAR
2.1 Espessura da parede (mm): __________
2.2 Presença de cálculos: (a)Sim
(b) Não
3 – BAÇO
3.1 Tamanho do baço (cm): __________
3.2 Presença de pontos ecogênicos no parênquima do baço:
(a) Sim
(b) Não
3.3 Diâmetro da veia esplênica (mm):
3.3.1 Linha média (distal): __________
3.3.2 Hilo esplênico (proximal): __________
3.4 Presença de calcificação na parede da veia esplênica:
(a) Sim
(b) Não
3.5 Veias gástricas curtas:
(a) Individualizadas, medindo __________ mm
(b) Não individualizadas
3.6 Sinais de varizes:
3.6.1 Esôfago distal:
(a) Sim
(b) Não
3.6.2 Fundo gástrico:
(a) Sim
(b) Não
3.6.3 Hilo esplênico:
(a) Sim
(b) Não
3.7 Ascite:
(a) Presente
(b) Ausente
3.8 Outros achados ultra-sonográficos relevantes:
3.9 Classificação: Média dos 4 espaços periportais centrais:
(
) GRAU 0 < 3
mm
(
) GRAU I 3 – 4,9 mm
(
) GRAU II 5 – 7
mm
(
) GRAU III > 7
mm
____________________
____________________
____________________
____________________
____________________
91
11.2 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) Para Participar
Do Estudo
Nome do Projeto: Caracterização fenotípica dos monócitos de pacientes com
fibrose periportal secundária à esquistossomose.
Investigador Principal: Maria Ilma Andrade Santos Araújo, médica, Serviço
Imunologia, Hospital Universitário Prof. Edgard Santos – UFBA, Rua João da
Botas s/n, Canela, CEP 40.110-160, Salvador-BA
Nome do Paciente:
_____________________________________________________
Convite e Objetivo:
Você está sendo convidado(a) a participar de um estudo que tem como objetivo
caracterizar os tipos de monócitos entre os indivíduos com diferentes
manifestações clínicas secundária à esquistossomose.
Esta participação implica na sua concordância responder a um questionário com
perguntas sobre exposição a água do rio, submeter-se a exames clínicos, além
de ultrassonografia de abdome e da coleta de amostras de sangue e de amostras
de fezes.
Além das informações aqui presentes você pode perguntar tudo sobre o estudo
ao seu médico.
Participação Voluntária:
A sua participação no estudo é voluntária e você estará contribuindo para o
melhor entendimento da sua doença. Você é livre para recusar a participar do
estudo, ou se retirar em qualquer época após o seu início sem afetar ou
prejudicar a qualidade e a disponibilidade da assistência médica que lhe será
prestada.
Finalidade do estudo:
Este estudo tem a finalidade de avaliar a influência da verminose no
aparecimento de manifestações clínicas, a exemplo da hepatoespelenomegalia.
Procedimentos:
Caso concorde em participar do estudo, você receberá os frascos coletores de
fezes, que deverão ser devolvidos, para que possamos realizar os exames
parasitológicos. Você doará 20mL de sangue, em caso de criança e 40 mL de
sangue no caso dos adultos, que será coletado por profissional capacitado para
tal, com o auxílio de seringas e agulhas descartáveis.
Duração do Estudo:
Após a assinatura do termo de consentimento, sua participação no estudo terá
uma duração máxima prevista de 12 meses.
Confidencialidade:
Qualquer informação obtida durante este estudo será confidencial sendo apenas
compartilhada com outros membros da equipe. Os resultados serão divulgados
92
na forma de comunicação científica, não permitindo a identificação individual dos
participantes.
Análise dos Riscos e Benefícios:
A retirada de sangue venoso é um procedimento médico de rotina e, em casos
raros pode provocar dor leve e sangramento após retirada da agulha. Caso isso
aconteça, todos os cuidados serão tomados por profissionais devidamente
habilitados.
Retorno dos Benefícios para o Sujeito e para a Sociedade:
Estudos que contribuem para identificação dos mecanismos envolvidos nas
diferentes manifestações clínicas causadas pela infecção pelo Schistosoma
mansoni, podem levar ao desenvolvimento de estratégias terapêuticas para a
prevenção do aparecimento destas manifestações.
As pessoas que se submeterem aos exames receberão, se desejarem, os
resultados dos mesmos. No caso de detectarmos a presença de parasitas
intestinais, você será tratado gratuitamente e, no caso de observarmos a
presença de alguma manifestação clínica você receberá instruções para o
tratamento da mesma ou será encaminhado para o acompanhamento por
médicos especializados no HUPES.
Custos:
Você não terá custos com a participação no estudo e nem receberá pagamento
por sua participação.
Esclarecimentos:
Qualquer dúvida que você tenha sobre o que está escrito neste consentimento ou
sobre os procedimentos que constam desse projeto de pesquisa, poderá entrar
em contato com Dra. Maria Ilma Araujo, coordenadora do projeto, médica do
Serviço de Imunologia do HUPES-UFBA, Rua Padre Feijó, s/n – Canela, telefone
(071) 3237-7353, ou com o Comitê de Ética em Pesquisa do Ambulatório
Magalhães Neto, na pessoa do Dr. Antônio Barata, no endereço Rua Padre Feijó,
240 – Canela, telefone (071) 3203-2740.
Consentimento:
Se você leu o consentimento livre e esclarecido ou este lhe foi explicado e você
concorda em participar voluntariamente deste estudo, favor assinar o nome
abaixo. A você será entregue uma cópia deste formulário.
_________________________________
Assinatura do Participante
__________________________________
Assinatura do Pesquisador
_____________________
RG nº
_____________________
RG nº
Local:____________________ Data_____/_____/_____ Hora:_________
93
11.3 Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa