CULTIVO In Vitro DE Cochlospermum regium (Schrank) Pilger

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO
FACULDADE DE ENGENHARIA FLORESTAL
Programa de Pós-Graduação em Ciências Florestais e
Ambientais
CULTIVO In Vitro DE Cochlospermum regium (Schrank)
Pilger
NATÁLIA HELENA GAVILAN
CUIABÁ-MT
2016
NATÁLIA HELENA GAVILAN
CULTIVO In Vitro DE Cochlospermum regium (Schrank)
Pilger
Orientador: Prof. Dr. Gilvano Ebling Brondani
Co-Orientador: Dr. Leandro Silva de Oliveira
Dissertação apresentada à Faculdade
de Engenharia Florestal da Universidade
Federal de Mato Grosso, como parte
das exigências do Curso de PósGraduação em Ciências Florestais e
Ambientais, para obtenção do título de
Mestre em Ciências Florestais e
Ambientais.
CUIABÁ-MT
2016
Dedico esse trabalho:
Aos meus pais, Vera e Ulderico
Aos meus irmãos, Arthur e João Pedro
iii
AGRADECIMENTOS
À minha família, que pacientemente soube lidar com a minha
fase mestrado, pelo amor, carinho, compreensão, incentivo e todo apoio
que me deram para que chegasse até aqui.
À Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), pela
oportunidade de poder complementar minha formação.
Ao meu orientador, Prof. Dr. Gilvano Ebling Brondani, pela
paciência, pela orientação, compreensão, críticas, conselhos e amizade.
Ao meu co-orientador, Prof. Dr. Leandro Silva de Oliveira, por
todo o conhecimento partilhado, orientação, ajuda na coleta de campo,
ajuda nas longas horas iniciais de laboratório, pela amizade, críticas,
conselhos e sugestões.
Aos colegas de curso e laboratório, Alex e Fernanda, sozinhos
jamais teríamos feito metade do que conseguimos. Fer, obrigada pela
amizade/irmandade, por me surpreender mostrando ser uma pessoa
maravilhosa, por todas as brigas que compramos juntas, enfim, todo
apoio. Alex, obrigada por quebrar o galho quando não poderia ir ao
laboratório e você estava sempre disposto a ajudar.
Aos meus amigos Cinthia, Thadeu, Marina, Rafaela, Maria
Clara, Benito, Samy e Yarim pela paciência, compreensão e amizade, não
deve ter sido fácil me ouvir falar sobre esses anos de mestrado e eu não
teria conseguido passar por eles sem vocês.
À Dra. Erika Mendes Graner pelo auxílio na análise histológica
das minhas lâminas.
Aos componentes da banca examinadora, por aceitarem fazer
parte
desse
trabalho,
suas
contribuições,
sugestões,
críticas
e
conhecimento.
Ao ICMBio pela autorização de coleta de material botânico na
Unidade de Conservação Parque Nacional da Chapada dos Guimarães –
Chapada dos Guimarães, MT.
iv
É necessário abrir os olhos e perceber que as coisas boas estão dentro
de nós, onde os sentimentos não precisam de motivos, nem os desejos
de razão. O importante é aproveitar o momento e aprender sua duração,
pois a vida está nos olhos de quem sabe ver.
Gabriel Garcia Marques
v
SUMÁRIO
RESUMO ......................................................................................... i
ABSTRACT ...................................................................................... i
1 INTRODUÇÃO .............................................................................1
1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................2
1.1.1 A ESPÉCIE Cochlospermum regium ......................................2
1.1.1.1 Caracterização botânica e habitat .......................................2
1.1.1.2 Etnobotânica e etnofarmacologia ........................................4
1.1.1.3 Propriedades fitoquímicas e biológicas ................................7
1.1.1.4 Características agronômicas ...............................................8
1.2 MICROPROPAGAÇÃO .............................................................9
1.2.1 Princípios gerais da micropropagação ....................................9
1.2.2 Esterilização química do meio de cultura ..............................11
1.2.3 Fitorreguladores ...................................................................12
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................14
2 ESTERILIZAÇÃO QUÍMICA DO MEIO DE CULTURA PARA A
MULTIPLICAÇÃO in vitro DE Cochlospermum regium ............................23
2.1 INTRODUÇÃO ........................................................................24
2.2 OBJETIVOS ............................................................................26
2.2.1 Objetivo geral .......................................................................26
2.2.2 Objetivos específicos ............................................................26
2.3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................26
2.3.1 Caracterização geral ............................................................26
2.3.1.1 Fonte dos explantes ..........................................................27
2.3.1.2 Tratamentos e delineamento experimental ........................28
2.3.1.2.1 Multiplicação in vitro .......................................................28
2.3.1.3 Preparo do meio de cultura e condições de crescimento ...29
2.3.3 Análise estatística dos dados ...............................................30
2.4 RESULTADOS ........................................................................30
2.5 DISCUSSÃO ...........................................................................38
2.6 CONCLUSÕES .......................................................................41
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................41
vi
3
CALOGÊNESE
E
ORGANOGÊNESE
INDIRETA
DE
Cochlospermum regium ...........................................................................45
3.1 INTRODUÇÃO ........................................................................46
3.2 OBJETIVOS ............................................................................47
3.2.1 Objetivo geral .......................................................................47
3.2.2 Objetivos específicos ............................................................47
3.3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................48
3.3.1 Caracterização geral ............................................................48
3.3.1.1 Fonte dos explantes ..........................................................48
3.3.1.2 Tratamentos e delineamento experimental ........................49
3.3.1.2.1 Calogênese ....................................................................49
3.3.1.2.2 Regeneração in vitro ......................................................49
3.3.1.3 Preparo do meio de cultura e condições de crescimento ...50
3.3.3 Análise estatística ................................................................51
3.4 RESULTADOS ........................................................................51
3.4.1 Calogênese ..........................................................................51
3.4.2 Regeneração in vitro ............................................................55
3.5 DISCUSSÃO ...........................................................................58
3.6 CONCLUSÕES .......................................................................60
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..............................................60
vii
RESUMO
GAVILAN, Natália Helena. Cultivo in vitro de Cochlospermum regium
(Schrank) Pilger. 2015. Dissertação (Mestrado em Ciências Florestais e
Ambientais) - Universidade Federal de Mato Grosso, Cuiabá-MT.
Orientador: Prof. Dr. Gilvano Ebling Brondani. Coorientador: Prof. Dr.
Leandro Silva de Oliveira.
Cochlospermum regium é uma espécie nativa do Cerrado que apresenta
importância econômica devido ao seu potencial medicinal. A destruição do
bioma e o uso desordenado de suas raízes pela população local visando
a elaboração de fitoterápicos têm agravado ainda mais o risco de
extinção. Contudo, estudos sobre a micropropagação da espécie ainda
são escassos, principalmente ao considerar o desenvolvimento de
protocolos que busquem definir as melhores condições para o cultivo in
vitro, como é o caso da esterilização química do meio de cultura e da
organogênese indireta. O presente estudo teve como objetivos: (i)
elaborar um protocolo de multiplicação de gemas axilares de
Cochlospermum regium por meio da esterilização química do meio de
cultura, sendo o experimento conduzido em delineamento inteiramente
casualizado em esquema fatorial (4x5), com parcelas subdivididas no
tempo, onde foram utilizados quatro preparos do meio de cultura (M1 –
meio de cultura autoclavado, M2 – 0,001%, M3 – 0,003% e M4 – 0,005%
de cloro ativo adicionado ao meio de cultura) e cinco subcultivos; e (ii)
desenvolver um protocolo de organogênese indireta visando à calogênese
e a regeneração de brotos adventícios, onde os tratamentos propostos
baseram-se na combinação do tipo de explante (cotilédone, hipocótilo e
raiz) e o tipo de fitorregulador (2,4-D, TDZ e ANA), sendo os experimentos
conduzidos em delineamento inteiramente casualizado no esquema
fatorial (3x3). Para o protocolo de multiplicação de gemas axilares em
relação a esterilização química do meio de cultura, observou-se que o
preparo convencional (meio de cultura autoclavado) apresentou os
melhores resultados em relação ao preparo do meio de cultura
suplementado com o cloro ativo. No entanto, foi possível recomendar o
uso de até 0,005% de cloro ativo para a esterilização química do meio de
cultura (sem a necessidade de autoclavagem), apresentando controle
satisfatório de agentes contaminantes (como fungos e bactérias), além de
apresentar a maior proliferação de brotos. Para a organogênese indireta
verificou-se que o TDZ (thidiazuron) foi o fitorregulador que favoreceu a
calogênese, independentemente do explante utilizado, enquanto que
associado ao explante do tipo hipocótilo, resultaram nas melhores
respostas quanto a regeneração de brotos adventícios.
Palavras-chave:
algodãozinho-do-cerrado;
calogênese; organogênese indireta.
esterilização
química;
viii
ABSTRACT
GAVILAN, Natália Helena. Cultivation in vitro of Cochlospermum
regium (Schrank) Pilger. 2015. Dissertation (Master in Forestry and
Environmental Sciences) - Federal University of Mato Grosso, Cuiabá-MT.
Advisor: Prof. Dr. Gilvano Ebling Brondani. Supervisor: Prof. Dr. Leandro
Silva de Oliveira.
Cochlospermum regium is a native species to the Cerrado that has
economic importance because of its medicinal potential. The destruction of
the biome and the unrestricted use of C. regium roots by local human
populations, which are aimed at producing phytotherapics, has aggravated
its risk to extinction. However, studies concerning the micropropagation of
the species are still scarce, especially when considering the development
of protocols that seek to define the best conditions for their in vitro culture,
such as the chemical sterilization of the culture medium and indirect
organogenesis. This study aimed at: (i) Developing a protocol for
multiplication of axillary buds of Cochlospermum regium through chemical
sterilization of the culture medium, being the experiment conducted in a
completely randomized design with factorial arrangement (4x5) with plots
split through time. In this experiment, we used four preparations of the
culture medium (M1 – autoclaved, M2 – 0.001%, M3 – 0.003%and M4 –
0.005% of active chlorine added to the culture medium) and five
subcultures;(ii) Developing an indirect organogenesis protocol aimed at
callus formation and regeneration of shoots, where the treatments were
the combination of the type of explant (cotyledon, hypocotyl and root) and
the type of plant growth regulator (2,4-D, TDZ and NAA). The experiments
were conducted in a completely randomized design in factorial scheme
(3x3). As regards the multiplication protocol of axillary buds concerning the
chemical sterilization of the culture medium, the conventional preparation
of the culture medium (autoclaved) showed the best results in comparison
to the culture medium supplemented with active chlorine. However, it was
possible to recommend the use of 0.005% of active chlorine for the
chemical sterilization of the culture medium (without autoclaving), showing
satisfactory control of contaminants (such as bacteria and fungi)/It also
exhibited the best shoot proliferation results. As what concerns indirect
organogenesis, we found that TDZ (thidiazuron) was the growth regulator
that most favored callus induction regardless of the explant used. Mean
while, when associated with the hypocotyl explant type, it resulted in the
best responses and the regeneration of adventitious shoots.
Keywords: algodãozinho-do-cerrado; chemical sterilization; in vitro callus
induction; indirect organogenesis.
ix
1 INTRODUÇÃO
O Cochlospermum regium (Schrank) Pilger é uma espécie
muito
utilizada
por
possuir
propriedades
medicinais.
Populações
tradicionais do Cerrado fazem uso desse extrato, o que vem prejudicando
a regeneração natural da espécie. No entanto, essa não é a única
maneira de devastação dessa espécie, que sofre também, com o
desmatamento do Cerrado para a ocupação humana e atividades
agrícolas. O uso desordenado de suas raízes para a produção de extratos
fitoterápicos vem causando erosão genética da espécie, tendo em vista
que a parte utilizada são as raízes e precisam ser coletadas por completo,
causando a morte da planta.
Diversos estudos farmacológicos comprovaram a eficiência do
extrato fitoterápico de suas raízes, e buscam o isolamento dos princípios
ativos por possuírem atividades antimicrobianas, os quais podem ser
utilizados na geração de fármacos, já que diversos fitoterápicos, de outras
espécies possuem autorização da ANVISA para comercialização.
Uma alternativa para evitar a extinção da espécie e também
para fornecer material para a farmacologia, têm sido o cultivo de tecidos
por meio da micropropagação, que consiste na propagação assexuada in
vitro em condições controladas, sendo uma ferramenta essencial, em
vista da espécie apresentar sementes com dormência tegumentar, o que
dificulta a sua germinação.
A micropropagação permite a produção em larga escala de
mudas, sendo muito utilizada na clonagem de espécies florestais de valor
comercial, o que não impede que seja utilizada como ferramenta para a
conservação de espécies nativas. No entanto, poucos são os estudos que
abordem essa técnica para a propagação de espécies nativas, do
Cerrado.
Ao considerar o Cochlospermum regium, caracterizada por ser
uma espécie medicinal intensamente utilizada pela população que habita
o Cerrado, vê-se a necessidade de multiplicá-la através da propagação in
vitro visando o abastecimento de mudas para o mercado e para fins
1
conservacionistas, tais como a criação de banco de germoplasma, além
de ser uma técnica alternativa à propagação via seminal.
Dessa forma, o presente estudo teve como objetivo a
elaboração de protocolos de multiplicação in vitro de gemas axilares de
Cochlospermum regium.
1.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1.1 A ESPÉCIE Cochlospermum regium
1.1.1.1 Caracterização botânica e habitat
Segundo o Missouri Botanical Garden (2014), a espécie
Cochlospermum regium apresenta a seguinte classificação taxonômica:
Reino: Plantae
Filo: Magnoliophyta Cronquist, Takht. & W. Zimm. Ex Reveal
Classe: Magnoliopsida Brongn.
Subclasse: Magnoliidae Novák ex Takht.
Super Ordem: Rosanae Takht.
Ordem: Malvales Juss.
Família: Bixaceae Kunth
Gênero: Cochlospermum Kunth
Espécie: Cochlospermum regium (Schrank) Pilger
A espécie é conhecida popularmente por diversos nomes, tais
como: algodãozinho-do-campo, algodão-cravo, algodão do mato, algodão
bravo, algodãozinho-do-cerrado (CAMILLO et al., 2009; INÁCIO et al.,
2011; PIO CORREA, 1975; SIQUEIRA, 1988). O C. regium é um arbusto
de ocorrência natural e frequente nas áreas de cerrado, pantanal e
caatinga (CAMILLO, 2008; CAMILLO et al., 2009; MENDONÇA et al.,
1998; SILVA, 1998).
Essa espécie é encontrada em áreas antropizadas, como em
bordas de matas e margens de estradas e ferrovias, sendo considerada
uma espécie pioneira, por ocorrer tanto em áreas abertas quanto em
2
perturbadas (COELHO et al., 2008; INÁCIO, 2010; POPPENDIECK,
1981).
O C. regium é um arbusto de aproximadamente dois metros de
altura, com raízes lenhosas, resistentes e bastante profundas, caule
ferrugíneo, nodoso e de ramos variando de coloração castanhoavermelhada a acinzentada (RITTO e KATO, 1998; CAMILO, 2008;
KIRIZAWA, 1981; MENDONÇA et al., 1998; DURIGAN et al., 2004)
(Figura 1A).
As
folhas
são
de
coloração
verde-escuras,
alternas,
palmatífidas, com margem foliar variando de crenada a serrilhada, com
consistência coriácea e superfície pubescente, sendo longo-pecioladas,
com três a cinco lobos profundos e agudos (KIRIZAWA, 1981; CAMILLO,
2008; ANTUNES, 2009) (Figura 1B).
Suas flores são ígneo-fulvas ou amarelas, pentâmeras, em
formato de concha medindo de 6 a 8 cm de diâmetro, dispostas em
panículas terminais na extremidade de brotos grossos e totalmente
despidos de folhas, contendo de 5 a 10 flores (CAMILLO, 2008;
NORONHA e GOTTSBERGER, 1980; KIRIZAWA, 1981) (Figura 1C).
Os frutos formam uma cápsula deiscente ovóide, com cerca de
6 cm de comprimento. Sua coloração inicialmente é verde-escura,
tornando-se acastanhada quando se abre para liberar as sementes,
sendo essas reniformes e envoltas em filamentos compridos e lanosos
que se assemelham ao algodão comercial (ANTUNES, 2009; FERRI,
1969; MENDONÇA et al., 1998; PIO CORREA, 1984) (Figuras 1D e 1E).
O sistema radicular é bastante desenvolvido, com raízes
tuberosas devido a abundância de tecido parenquimático de reserva, o
qual é permeado pelo tecido vascular e pode atingir mais de 3 metros de
comprimento por 20 cm de diâmetro (KIRIZAWA, 1981) (Figura 1F).
A frutificação, germinação, desenvolvimento dos sistemas
aéreo e subterrâneo ocorrem nas épocas chuvosas, enquanto os botões
florais, frequentemente, ocorrem entre os meses de maio a julho, podendo
ocorrer também em períodos diferentes (ANTUNES, 2009; KIRIZAWA,
1981).
3
Uma característica única do C. regium, dentre as espécies do
gênero, refere-se a sua plasticidade em relação à floração. Suas flores
aparecem no topo da parte aérea anual do vegetal, que geralmente está
desfolhada na época. Quando o ramo do ano é destruído, pelos
incêndios, por exemplo, que são bastante frequentes no Cerrado, as
flores nascem ao nível do solo a partir do xilopódio, de onde também são
emitidos os ramos. Esta característica colabora para que a espécie se
adapte as intempéries da natureza e as ações antrópicas (INÁCIO, 2010;
POPPENDIECK, 1981).
FIGURA 1 – DETALHE DAS ESTRUTURAS DE UMA PLANTA DE
Cochlospermum regium. (A) ARBUSTO; (B) FOLHA; (C)
FLOR; (D) FRUTO VERDE; (E) FRUTOS MADUROS e (D)
SISTEMA RADICULAR. FOTO: NATÁLIA HELENA
GAVILAN (2014).
1.1.1.2 Etnobotânica e etnofarmacologia
O Cochlospermum regium é intensamente utilizado na
medicina popular e suas raízes são comercializadas em todo o bioma do
Cerrado (INÁCIO et al., 2011). De acordo com Nunes et al. (2003), a
espécie está classificada entre as 10 mais solicitadas e ou indicadas por
raizeiros em levantamentos realizados em 1992 e 2002.
Suas raízes são utilizadas na forma de fatias, cavacos ou pó,
para a preparação de chás, infusões e garrafadas (CASTRO et al., 2004).
4
O extrato de suas raízes é utilizado para diversos fins, tais como:
tratamento de infecções intestinais, gastrite, úlceras, artrite reumatóide,
leucorréia e afecções da pele depurativa do sangue (BATISTA et al.,
2014; CAMILLO et al., 2009; CASTRO et al., 2004; GUARIM NETO,
1987). No entanto, a maior indicação está relacionada à infecções do
ovário e do sistema reprodutor feminino (TRESVENZOL et al., 2006;
SOUZA e FELFILI, 2006).
Estudos revelaram diversas atividades farmacológicas, tais
como: efeitos anti-inflamatórios (PIO CORREA, 1975), efeitos analgésicos
e antidematogênicos (SIQUEIRA et al., 1991) e efeito antibacteriano para
Staphylococcus aureus e Escherichia coli (PIO CORREA, 1975;
SIQUEIRA et al., 1991; OLIVEIRA et al., 1996; CASTRO et al., 2004).
Siqueira (1988) adverte, entretanto, que a infusão da raiz é
empregada como um perigoso “purgativo”, devendo-se tomar o cuidado
de evitar doses excessivas no uso desta planta. Além disso, Cunha-Laura
et al. (2005) recomendaram cautela na utilização do extrato das raízes
durante
a
gestação,
pois
estudos
realizados
em
laboratórios
demonstraram efeitos consideráveis de toxicidade neste período.
Na Tabela 1 estão relacionados os principais usos do C. regium
de acordo com levantamentos em diversas regiões brasileiras.
5
TABELA 1 – PRINCIPAIS USOS DE Cochlospermum regium.
Estado
Órgão
Uso
Indicação
Referência
TO
-
-
Dores de cabeça
Rodrigues e Carlini (2005)
MT
Raiz
Chá, garrafada
Inflamação em geral, problema de próstata e Moreira e Guarim-Neto (2009)
pneumonia.
GO
Xilopódio
Chá, garrafada ou pó
Infecções ginecológicas, gastrite e úlcera gástrica
Tresvenzol et al. (2006)
GO
-
-
Infecção gástrica
Carvalho (2004)
MS
Raiz
-
Colesterol, feridas internas e externas, laxante,
depurativo do sangue, inflamações da pele, útero,
ovário e próstata
Nunes et al. (2003)
MT
Casca
Chá
Depurativo do sangue
Guarim-Neto (2006)
GO
-
-
Inflamações uterinas, vias urinárias, diarréia
Souza e Felfili (2006)
MT
Rizófaro
Decocto, chá
Infecções, inflamações, corrimentos, depurativo
Souza e Felfili (2006)
MT
Folha
Chá
Cálculo renal, úlcera
Sangalli et al. (2002)
MT
Raiz
Chá, banho
Inflamação de mulher, inflamação do útero
Loureiro (1999)
MT
Raiz
-
Gonorréia, inflamação do útero e ovário, leucorréia,
afecções não específicas do trato urinário
De La Cruz (1997)
MT
Raiz
Chá, garrafada
vinho
GO
Casca, raiz
Decocto
com Dor de bexiga e urina, depurativo do sangue, anti- Somavilla (1998)
acne
Afecções urogenitais, purgativo
Vila-Verde et al. (2003)
ADAPTADO DE INÁCIO (2010) E SÓLON (2009).
6
1.1.1.3 Propriedades fitoquímicas e biológicas
A busca pela caracterização fitoquímica de Cochlospermum
regium é intensa e foram identificados diversos compostos. Flavanóides
(dihidro-kaempferol-3-O-glicose e kempferol) foram isolados em extratos
dos rizomas da espécie com acetato de etila (SIQUEIRA et al., 1994;
LIMA et al., 1995). Ritto (1996) relatou que as raízes de C. regium contêm
compostos triterpenóides, flavanóides, saponinas, taninos e compostos
fenólicos, posteriormente isolados e identificados os componentes 1hidroxi,
tetradecanona-3,
naningenina
e
aromadendrina.
Amostras
químicas comprovaram a presença de taninos, derivados fenólicos,
mucilagem e óleos essenciais (HONDA et al., 1997; LIMA et al., 1996).
Em investigação fitoquímica no extrato hidroalcoólico das
raízes de C. regium, foram detectados cinco derivados fenólicos e dois
triacilbenzenos, conhecidos como Cochlosperminas A e B. O padrão
quimiotaxonômico pode ser caracterizado pela presença de flavonóides
triaclbenzenos e derivados de ácido gálico, fornecendo apoio para
justificar o uso popular desta espécie no tratamento de infecções
(SÓLON, 2009; SÓLON et al., 2012).
A presença do flavanóide Kaempferol (F-52) nas raízes de C.
regium
foram
farmacológicas
confirmadas
e
antidermatogênicas,
que
através
apresenta
anti-bacterianas,
de
análises
fitoquímicas
propriedades
antioxidantes,
e
analgésicas,
mutagênicas
e
citotóxicas (CAMILLO et al., 2009).
Existem estudos que buscam verificar a eficácia dos compostos
fitoquímicos de C. regium, tal como o relato de que o flavonóide 3-0glicosildihidrocanferol, isolado a partir de extrato de raízes, apresenta
efeito antinociceptivo, além de atividade anti-bacteriana do óleo essencial
(CASTRO, 2000; BRUM et al., 1997). Além disso, também foi detectada a
atividade citotóxica do extrato de C. regium em células CHO-K1 não
tumorigênicas, por inibição da proliferação celular e a indução da
apoptose (CESCHINI e CAMPOS, 2006), considerando que não houve
efeito antimutagênico quando avaliado no osso da medula de ratos
(ANDRADE et al., 2008).
7
Em
vista
dessas
observações,
estudos
químicos,
farmacológicos e toxicológicos justificam, parcialmente, a eficácia do
extrato fitoterápico de C. regium (SÓLON et al., 2009), destacando
potencialidade para o aplicações comerciais.
1.1.1.4 Características agronômicas
O Cerrado, apesar de ocupar uma área de aproximadamente 2
milhões de km2 e conter uma elevada biodiversidade, têm sido pouco
valorizado em termos de conservação (MENDONÇA et al., 1998; BRASIL,
1999; FELFILI et al., 2002). A abertura de extensas áreas para pastagens,
lavouras, principalmente de soja, contribuiu para uma redução drástica
das áreas de cerrado (FELFILI et al., 2002), além de ocasionar a extinção
de espécies nativas com potencial biológico e econômico, ainda a serem
estudados, como é o caso do C. regium.
C. regium é considerada uma planta forrageira, ornamental e
medicinal, com resistência às queimadas e ao pastejo. Mesmo
sobrevivendo em condições áridas, está sendo considerada em perigo de
extinção, enquadrando-se na lista de espécies medicinais ameaçadas,
divulgada pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos
Naturais Renováveis (IBAMA) (POTT e POTT, 1994; SOUZA e LORENZI,
2008; IBAMA, 2015).
Sementes dessa espécie apresentam característica ortodoxa,
por tolerarem dessecação a -20ºC, e são consideradas dormentes devido
à presença do tegumento duro que impede a permeabilidade da água
(KIRIZAWA, 1981; CAMILLO, 2008).
A dormência de sementes têm fundamental importância para a
perpetuação e o estabelecimento de muitas espécies vegetais nos mais
variados ambientes, mas pode trazer desvantagens, principalmente ao
considerar a produção de mudas (ZAIDAN e BARBEDO, 2004).
Entretanto, esta dormência, pode ser superada com tratamentos
laboratoriais de escarificação mecânica (lixamento), química (ácidos) e
térmica (água quente), que promovem o rompimento do tegumento das
sementes, possibilitando à penetração de água e oxigênio, com
8
consequente reativação dos processos metabólicos que favorecem a
germinação (BORGES e RENNA, 1993).
O interesse medicinal associado ao perigo da extinção de C.
regium estimulou estudos agronômicos que objetivam, basicamente,
determinar métodos efetivos para superar a dormência da semente e
potencializar o processo de germinação possibilitando estabelecer
técnicas de cultivo e manejo para assegurar a sobrevivência e
disponibilidade deste material genético (SALES, 2001; MOLINARI et al.,
1996;
NOGUEIRA
e
KUNIYOSHI,
1998;
MELLO
et
al.,
1998;
ALBUQUERQUE et al., 2002).
Dessa forma, a técnica de micropropagação pode ser utilizada
como ferramenta para a propagação de espécies que apresentam
dificuldade de germinação, como ocorre com o C. regium. Além disso,
essa técnica também poderá ser utilizada para a cultura de órgãos da
espécie visando à extração de compostos medicinais em escala
comercial.
1.2 MICROPROPAGAÇÃO
1.2.1 Princípios gerais da micropropagação
A micropropagação ou propagação in vitro proporciona a
clonagem de muitas espécies, permitindo a formação de indivíduos
geneticamente idênticos a partir de células, órgãos ou pequenos
fragmentos de uma planta matriz, os quais são mantidos em culturas
assépticas para regenerar novas plantas (INÁCIO, 2010; HARTMANN et
al., 2011). Os meios nutritivos fornecem substâncias essenciais para o
crescimento dos tecidos e também participam do controle do padrão de
desenvolvimento in vitro (CALDAS et al., 1998).
A micropropagação têm sido utilizada para a formação de
bancos de germoplasma, produção de plantas livres de doenças,
multiplicação rápida de plantas em períodos de tempo e espaço físico
reduzidos e rejuvenescimento de mudas de clones selecionados
9
(HARTMANN et al., 2011; GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998;
COMÉRIO et al., 1996).
Alguns procedimentos básicos iniciais devem ser seguidos a
fim de utilizar a técnica de micropropagação, dentre estes incluem-se a
seleção da planta-matriz, no qual deve ser considerada a sanidade e o
estádio fisiológico dos tecidos, o tipo de explante utilizado para iniciar o
cultivo in vitro, que podem ser folhas, cotilédones, talos, segmentos
nodais, ápices caulinares e radículas, dentre outros (ALBUQUERQUE et
al., 2000; SETHER et al., 2001; TEIXEIRA, 2005; CARVALHO et al.,
2006; INÁCIO, 2010).
O nível de diferenciação do tecido e a fase de desenvolvimento
em que se encontra devem ser levados em consideração para garantir o
potencial morfogênico e a estabilidade genética (SERRANO GARCÍA e
PIÑOL SERRA, 1991). Em programas de estabelecimento de bancos de
germoplasma ou de melhoramento genético, a juvenilidade do material
vegetal pode ser a chave do sucesso (BREESE, 1989; HIGASHI et al.,
2000; BACCARIN, 2012).
Grattapaglia
e
Machado
(1998)
estabeleceram
que
a
micropropagação pode ser dividida nas seguintes fases:
Fase 0: Refere-se ao condicionamento das plantas matrizes,
relacionando aspectos ligados a condição fisiológica, ao ambiente onde
ela se encontra e condições de sanidade. De maneira geral, as matrizes
vigorosas, sadias, isentas de qualquer tipo de estresse e em pleno
crescimento são aquelas que fornecem os melhores explantes, sendo a
nutrição das plantas matrizes um fator chave para o sucesso do
estabelecimento das culturas in vitro.
Fase I: Está ligada ao estabelecimento in vitro dos explantes,
onde neste estádio é visada a obtenção de explantes no tubo de ensaio
totalmente
livre
estabelecimento
de
do
contaminação,
mesmo,
visto
condição
que
o
imprescindível
ao
desenvolvimento
de
microorganismos no meio de cultura pode resultar na morte do explante.
Nessa fase, todas as operações devem ser realizadas em condições
assépticas e em câmaras de fluxo laminar.
10
Fase II: É considerada a fase de multiplicação rápida dos
explantes obtidos sem contaminação na fase anterior (Fase I). Nessa
fase, objetiva-se a produção do maior número possível de gemas, no
menor espaço de tempo e com a máxima uniformidade.
Fase III: Refere-se ao alongamento das brotações obtidas por
multiplicação, caracterizando-se por ser uma fase necessária para a
maioria das culturas, visando condicioná-las para o enraizamento. Isto é
importante, pois a multiplicação dos explantes induz a formação de muitas
brotações pequenas, sendo necessário fornecer condições para a
indução de brotações mais alongadas, a fim de facilitar o manejo in vitro.
Fase IV: É a última etapa e está relacionada à indução do
enraizamento das brotações. Quando o enraizamento não ocorrer nas
condições de multiplicação in vitro, os explantes são acondicionados em
meio de cultura apropriado ao enraizamento, contendo maior relação
auxina/citocinina. No enraizamento ex vitro, os explantes induzidos in vitro
são enraizados em substrato sob condições de elevada umidade relativa
do ar (casa de vegetação ou outra estrutura adequada), para que os
mesmos formem as raízes e regenerem uma planta completa.
Para que o processo seja executado adequadamente, algumas
condições de incubação devem ser padronizadas, tais como a
manutenção da temperatura entre 20ºC e 27ºC e fotoperíodo entre 12h e
16h (GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998).
1.2.2 Esterilização química do meio de cultura
Apesar das várias vantagens da micropropagação, alguns
problemas persistem e não satisfazem os interesses comerciais,
especialmente os altos custos de implementação e manutenção técnica
(BRONDANI et al., 2013).
Neste contexto, um dos principais problemas é o alto gasto de
energia e o tempo necessário para a preparação de material durante a
fase de autoclavagem do meio de cultura, a qual poderia ser substituída
pela adição de substâncias químicas ao meio de cultura que possa
erradicar os agentes patogênicos. Esse procedimento é conhecido como
11
esterilização química do meio de cultura (MACEK et al., 1995; BRONDANI
et al., 2013).
Uma
das
substâncias
mais
promissoras
para
esse
procedimento refere-se ao hipoclorito de sódio (NaClO), que é
normalmente utilizado para assepsia dos tecidos vegetais (ALCÂNTARA
et al., 2011; BORGES et al., 2012; BRONDANI et al., 2011; MALYSZ et
al., 2011; NIEDZ e BAUSHER, 2002; TEIXEIRA et al., 2006). Para atuar
como uma alternativa viável ao tratamento em autoclave ou a utilização
de produtos químicos mais prejudiciais, o NaClO deve ser eficaz em
pequenas concentrações, eliminando ou pelo menos reduzindo a
atividade de microorganismos, além de proporcionar condições ideais
para o crescimento e desenvolvimento dos tecidos vegetais (BRONDANI
et al., 2013).
1.2.3 Fitorreguladores
Os reguladores de crescimento ou fitorreguladores são
substâncias sintéticas que produzem efeitos semelhantes aos produzidos
pelos fitohormônios. Essas substâncias podem ser adicionadas ao meio
de cultura para auxiliar o crescimento e também o direcionamento da
resposta do desenvolvimento dos propágulos (CARVALHO et al., 2006;
HARTMANN et al., 2011).
A adição de fitorreguladores em meios nutritivos têm o objetivo
principal de suprir possíveis deficiências de teores endógenos de
fitohormônios nos explantes que se encontram isolados das regiões
produtoras
na
fitorreguladores
planta
estimula
matriz.
Simultaneamente,
respostas
morfogênicas,
a
tais
adição
como
de
o
alongamento celular, a multiplicação de gemas e o enraizamento
(GRATAPAGLIA e MACHADO, 1998).
A escolha do fitorregulador a ser utilizado na cultura in vitro
dependerá do tipo de estímulo a ser induzido; de seu nível endógeno no
explante no momento da excisão; da capacidade do tecido sintetizar o
fitohormônio durante o período da cultura e da possível interação com os
fitohormônios e fitorreguladores meio (SANTOS, 2003).
12
Quanto aos reguladores de crescimento, das várias classes
conhecidas, as auxinas e citocininas são, sem dúvida, as mais
importantes na regulação do crescimento e da morfogênese na cultura de
tecidos (ALVES, 2001).
As auxinas estão envolvidas na divisão e alongamento celular
e na síntese de parede celular (ALVES, 2001). A principal auxina natural é
o AIA (ácido indol-3-acético), o qual não tem sido muito utilizado em
cultura de tecidos devido à sua instabilidade (BONGA e VON ADERKAS,
1992). No entanto, as auxinas sintéticas mais comumente utilizadas são o
2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), AIB (ácido indol-3-butírico) e ANA
(ácido α-naftalenoacético) (CARVALHO, 1999; GEORGE, 1993).
Uma das principais funções da citocinina na cultura de tecidos
refere-se a indução de gemas adventícias, bem como a proliferação de
gemas axilares através da supressão da dominância apical (HARTMANN
et al., 2011). Também é requerida para a formação de calos e outros
processos envolvendo a divisão celular (ALVES, 2001). As citocininas
comumente aplicadas são o BAP (6-benzilaminopurina), cinetina, TDZ
(thidiazuron), 2-iP (2-isopenteniladenina) e zeatina, sendo as duas últimas
citocininas de ocorrência natural (CARVALHO, 1999; BONGA e VON
ADERKAS, 1992).
O modo de interação entre as auxinas e citocininas é
frequentemente dependente da espécie, da planta e do tipo de tecido
utilizado na cultura (COENEN e LOMAZ, 1997; PIERIK, 1997). A ausência
na resposta a um regulador de crescimento é um problema maior quando
explantes de plantas adultas são utilizados, em comparação com material
juvenil (BONGA e VON ADERKAS, 1992).
A propagação por meio de cultura de tecidos pode ser feita por
via direta ou indireta. Nesta última via, há formação de calos com retorno
ao nível meristemático das células diferenciadas e, em seguida, a
transformação em novos brotos e plantas, sendo então considerada uma
forma potencial de propagação em massa (LANDA et al., 2000). Dessa
forma, o balanço hormonal entre auxinas e citocininas é um aspecto
essencial para a cultura de calos, com destaque para o 2,4-D e, mais
recentemente, TDZ (NOGUEIRA et al., 2007; AKRAM; AFTAB, 2008).
13
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22
2 ESTERILIZAÇÃO QUÍMICA DO MEIO DE CULTURA PARA A
MULTIPLICAÇÃO in vitro DE Cochlospermum regium
Resumo – O objetivo deste estudo foi elaborar um protocolo de
multiplicação de gemas axilares de Cochlospermum regium por meio da
esterilização química do meio de cultura. Os tratamentos propostos foram
baseados na comparação do preparo convencional (M1 – meio de cultura
autoclavado) com a esterilização sem autoclavagem pela utilização de
diferentes concentrações de cloro ativo no meio de cultura (esterilização
química) (M2 – 0,001%, M3 – 0,003% e M4 – 0,005% de cloro ativo). O
meio de cultura utilizado foi o MS suplementado com 1 mg.L-1 de BAP e
0,5 mg.L-1 de ANA. Como explantes foram utilizadas gemas apicais
provenientes de plantas germinadas in vitro. O experimento foi conduzido
no delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial (4x5), com
parcelas subdivididas no tempo, onde foram utilizados quatro preparos do
meio de cultura e cinco subcultivos. As variáveis correspondentes à
porcentagem de contaminação fúngica, bacteriana, indução de calo,
número de brotos, oxidação, pigmentação e sobrevivência, foram
mensuradas e submetidas à ANOVA, sendo em seguida analisadas pelo
teste de comparação de médias de Duncan e/ou análise de regressão
polinomial, logística e/ou exponencial. De modo geral, o preparo
convencional do meio de cultura não foi significativamente mais
responsivo para a multiplicação in vitro que o preparo com a
suplementação de cloro ativo, chegando a 55,0% de indução de
brotações, com média de 3,1 brotos por explante. O uso de 0,005% de
cloro ativo para a esterilização química do meio de cultura controlou
satisfatoriamente os agentes contaminantes (bactérias e fungos) e foi
aquele que induziu a maior proliferação de brotos (65,0% com média de
2,7 brotos por explante).
Palavras-chave: algodãozinho-do-cerrado; agente esterilizante; cloro
ativo; micropropagação.
2 CHEMICAL STERILIZATION OF CULTURE MEDIUM FOR IN VITRO
MULTIPLICATION OF Cochlospermum regium
Abstract – The objective of this study was to develop a multiplication
protocol axillary buds of Cochlospermum regium affix through the chemical
sterilization of the culture medium, where the proposed treatment was the
comparison of conventional tillage (M1 - means of autoclaved culture),
with sterilization without autoclaving using different concentrations of
active chlorine in the culture medium (chemical sterilization) (M2 - 0.001%,
M3 - M4 and 0.003% - 0.005% of active chlorine added to culture
medium). The culture medium used was MS supplemented with 30 g.L-1
sucrose, 1 mg.L-1 BAP 0.5 mg.L-1 NAA, and 6 g.L-1 agar. As apical buds
explants from in vitro germinated plants were used. The experiment was
conducted in a completely randomized design in a factorial arrangement
(4x5) with split plot, where they were used four preparations of the culture
medium and five subcultures. The variables percentage of fungal
23
contamination, bacterial, callus induction, shoot number, oxidation,
pigmentation and survivors were subjected to ANOVA, the comparison
analysis means Duncan (p <0.05) and polynomial regression analysis,
logistic and exponential. Generally the conventional preparation of the
culture medium was not significantly more responsive to in vitro
multiplication that the preparation with active chlorine supplementation,
reaching 55.0% of shoot induction, with an average of 3.1 buds per
explant while the use of 0.005% of active chlorine for the chemical
sterilization of the culture medium satisfactorily controlled contaminants
(fungi and bacteria) and have been the one that induced the greatest
shoot proliferation (65.0% with a mean of 2.7 shoots per explant).
Keywors: algodãozinho-do-cerrado; sterilizing agents; active chlorine;
micropropagation.
2.1 INTRODUÇÃO
Os componentes da biodiversidade podem fornecer ampla
gama de produtos de importância econômica, onde destacam-se os
fitoterápicos e os fitofármacos. Essas substâncias são originadas dos
recursos genéticos vegetais, mais especificamente de plantas medicinais,
cuja demanda por essas espécies têm crescido consideravelmente nos
últimos anos (GUERRA e NODARI, 2007; NEPOMUCENO et al., 2014).
Dentre as espécies, encontra-se o Cochlospermum regium
(Schrank) Pilg., Bixaceae, que é considerada uma planta medicinal nativa
do
bioma
Cerrado
(INÁCIO
et
al.,
2014).
Estudos
químicos,
farmacognósticos e toxicológicos sugerem a eficácia e a segurança dos
extratos fitoterápicos de C. regium (SÓLON et al., 2009). Além disso, há
comprovação da atividade analgésica e antiedematogênica (CASTRO et
al., 2004) e de atividade antibacteriana em Staphylococcus aureus e
Escherichia coli (OLIVEIRA et al., 1994). A produção de fitoterápicos
industrializados a partir de C. regium é inviável até o momento, pois a
espécie é coletada de forma extrativista e não há estudos agronômicos
suficientes que viabilizem o seu cultivo em larga escala (INÁCIO et al.,
2010). Dessa forma, a cultura de tecidos, por meio da técnica de
micropropagação, torna-se uma alternativa para a propagação da
espécie.
24
O aumento do número de plantas produzidas in vitro deve-se
às diversas vantagens que a micropropagação oferece, incluindo a
possibilidade de multiplicação em larga escala e em curto espaço de
tempo; utilização de espaço reduzido para a obtenção de grande
quantidade de plantas, mudas livres de doenças e pragas, reduzida
dependência das condições ambientais externas, elevada precisão no
estabelecimento de cronogramas de produção e comercialização, elevada
qualidade do produto no que diz respeito à homogeneidade e vigor das
plantas, dentre outras (RIBEIRO et al., 2011).
Apesar de várias vantagens da micropropagação, alguns
problemas persistem e não satisfazem os interesses comerciais,
especialmente
aqueles
associados
aos
elevados
custos
de
implementação e manutenção da técnica, elevado consumo de energia
elétrica e o tempo necessário para a preparação de material durante a
fase de autoclavagem do meio de cultura (BRONDANI et al., 2013;
MACEK et al., 1995).
A autoclavagem é o método mais comumente utilizado para a
esterilização de vidrarias, meios de cultura e materiais cirúrgicos que são
utilizados
em
laboratório,
sendo
uma
operação
dispendiosa.
A
possibilidade de substituição desse método de esterilização por outro de
menor custo seria altamente desejável (RIBEIRO et al., 2011).
Considerando esses aspectos e, para atuar como uma
alternativa viável para a assepsia, o uso de NaClO por meio da
esterilização química do meio de cultura pode ser eficaz em pequenas
concentrações, pois pode eliminar (ou pelo menos reduzir) a atividade
microorganismos. Contudo, é necessário estabelecer as condições ideais
para que não ocorram danos ao crescimento e desenvolvimento dos
tecidos vegetais em meio de cultura (BRONDANI et al., 2013).
O uso de NaClO para a esterilização do meio de cultura foi
comprovado para o cultivo in vitro de diversas espécies, tais como em
Ananas comosus (TEIXEIRA et al., 2006), Musa spp. (MATSUMOTO et
al., 2007), Eucalyptus pellita (TEIXEIRA et al., 2008), Pfaffia glomerata
(RIBEIRO et al., 2009), Sequoia sempervirens (RIBEIRO et al., 2011),
Saccharum spp. (COSTA-PINHO, 2012), Chrysantemum (DEEIN et al.,
25
2013), Eucalyptus benthamii (BRONDANI et al., 2013) e Hyptis
leucochepala e Hyptis platanifolia (NEPOMUCENO et al., 2014).
2.2 OBJETIVOS
2.2.1 Objetivo geral
Elaborar um protocolo de multiplicação in vitro de gemas
apicais de Cochlospermum regium por meio da esterilização química do
meio de cultura.
2.2.2 Objetivos específicos

Comparar a eficiência da esterilização química do meio de cultura
com o preparo convencional (autoclavagem);

Determinar a melhor concentração de cloro ativo para a
esterilização química do meio de cultura sem ocasionar a
mortalidade do explante;

Determinar a multiplicação de gemas axilares em relação a
esterilização química do meio de cultura.
2.3 MATERIAL E MÉTODOS
2.3.1 CARACTERIZAÇÃO GERAL
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura
de Tecidos Vegetais, pertencente à Faculdade de Engenharia Florestal da
Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Cuiabá – MT.
26
2.3.1.1 Fonte dos explantes
Como explantes foram utilizados ápices caulinares (Figura 1A e
1B) coletados de plantas germinadas in vitro, as quais foram obtidas a
partir de sementes. As sementes de Cochlospermum regium utilizadas
para a realização do experimento foram coletadas de frutos maduros
durante os meses de Setembro e Outubro de 2014 em área do Cerrado, a
qual foi localizada no Parque Nacional da Chapada dos Guimarães,
Rodovia MT – 251, no município de Chapada dos Guimarães (autorização
nº 46295 do ICMBio – Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade).
FIGURA 1 – DETALHE DA GERMINAÇÃO in vitro E SECCIONAMENTO
DA PLÂNTULA DE Cochlospermum regium. (A) PLÂNTULA
GERMINADA in vitro. (B) ÁPICE CAULINAR UTILIZADO
COMO EXPLANTE (SETA). BARRA: 1 cm. FOTO: NATÁLIA
HELENA GAVILAN (2014).
27
2.3.1.2 Tratamentos e delineamento experimental
2.3.1.2.1 Multiplicação in vitro
Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio (2×10 cm)
contendo 5 mL do meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962),
suplementado com 0,05 mg.L-1 de ANA (ácido α-naftalenoacético) e 1
mg.L-1 de BAP (bezilaminopurina), onde foram avaliados quatro preparos
de meio de cultura (Tabela 1). A esterilização química foi realizada com o
uso de NaClO (2,0-2,5% de cloro ativo) conforme a concentração de Cl
em cada tratamento avaliado. O primeiro subcultivo ocorreu aos 21 dias, e
os demais a cada 28 dias, totalizando 4 subcultivos (91 dias).
TABELA 1 - RELAÇÃO DOS MÉTODOS DE PREPARO DO MEIO DE
CULTURA E CONCENTRAÇÕES DE CLORO ATIVO
(NaClO) PARA A ESTERILIZAÇÃO QUÍMICA DURANTE O
ESTABELECIMENTO IN VITRO DE EXPLANTES DE
Cochlospermum regium.
Tratamento
Método de preparo
M1
Meio de cultura tradicional - autoclavado
M2
0,001% de Cl ativo - sem autoclavagem
M3
0,003% de Cl ativo - sem autoclavagem
M4
0,005% de Cl ativo - sem autoclavagem
O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente
casualizado em esquema fatorial (4x5), com parcelas subdivididas no
tempo, onde foram utilizados quatro preparos do meio de cultura e cinco
subcultivos. Para tanto, foram utilizadas 4 repetições compostas por 5
unidades experimentais para cada repetição. Cada unidade experimental
foi composta por um tubo de ensaio (2×10 cm), contendo 5 mL do meio
de cultura e um explante.
As caracterizações do crescimento e desenvolvimento dos
tecidos foram realizadas a cada subcultivo, onde foram avaliados a
porcentagem de contaminação fúngica e bacteriana, a indução de calo, o
número de brotos, a oxidação, e a sobrevivência.
28
2.3.1.3 Preparo do meio de cultura e condições de crescimento
O meio de cultura foi preparado com água destilada,
adicionando-se 6 g.L-1 de ágar e 30 g.L-1 de sacarose. O valor do pH foi
ajustado para 5,8 com HCl (0,1M) e/ou NaOH (0,1M), previamente a
adição do ágar ao meio de cultura, e então procedeu-se a autoclavagem a
temperatura de 121°C (≈ 1 kgf.cm-2) durante 20 minutos, conforme o
tratamento (somente no meio M1 – Tabela 1). O procedimento de
manipulação dos explantes foi executado em câmara de fluxo laminar em
condições assépticas. Os explantes foram cultivados em sala de
crescimento com temperatura controlada a 25°C (± 2°C), fotoperíodo de
16 horas e luminosidade de 32 μmol m-2 s-1.
2.3.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA
Amostras dos tecidos calogênicos e da região da gema axilar foram
fixados em solução de formaldeído e glutaraldeído (KARNOVSKY, 1965)
modificado (glutaraldeído 1%; paraformaldeído 4% em tampão fostato de
sódio - NaH2PO4.H2O à 0,1 M; pH 7,2) e submetidas a seis séries de
vácuo (-600 mmHg) por 30 minutos cada. As amostras foram
armazenadas durante 40 dias a 4°C, e posteriormente foram desidratadas
por meio de série alcoólica-etílica em concentrações crescentes (10, 20,
30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e 100%, v/v), permanecendo em cada solução
por 15 minutos. Em seguida as amostras foram imersas em meio de
infiltração (Historesina, Leica) durante 24 horas e após, foram alocadas na
porção inferior do recipiente de moldura. As amostras foram emblocadas
em Historesina (hidroxietil metacrilato, Leica) com endurecedor conforme
recomendação do fabricante, onde permaneceram durante 34 dias à
temperatura de 24°C. Os blocos foram seccionados longitudinalmente ou
transversalmente à 5 μm de espessura com o uso de micrótomo rotativo
automático Microm HM 355S (Thermo Scientific). Os cortes obtidos foram
corados com azul de toluidina (0,05%, v/v) em tampão fostato de sódio e
ácido cítrico (SAKAI, 1973) durante 15 minutos e montados em lâminas
histológicas com resina sintética (Entellan). As lâminas histológicas foram
29
analisadas e fotomicrografadas em microscópio de luz (Opton) sendo as
imagens capturadas em escala micrométrica.
2.3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS
O conjunto de dados foi submetido ao teste de Shapiro-Wilk
(p<0,05) afim de verificar a normalidade. Para verificar a homogeneidade
de variância foi utilizado o teste de Hartley (p<0,05) e, para transformar os
dados, foi utilizado o teste de Box-Cox. Após, os dados foram submetidos
à análise de variância (ANOVA, p<0,05 e p<0,01). Por fim, os dados
foram submetidos a análise de comparação de médias de Duncan
(p<0,05) ou análise de regressão polinomial, logística e exponencial,
selecionando o melhor modelo ajustado. Os programas SOC (EMBRAPA,
1990) e R (R DEVELOPMENT CORE TEAM, 2012) foram utilizados para
a análise estatística dos dados. As análises histológicas foram
caracterizadas por análise descritiva.
2.4 RESULTADOS
De acordo com a análise de variância houve efeito significativo
para todas as variáveis avaliadas, tanto para os subcultivos quanto para o
preparo do meio de cultura. No entanto, não houve interação entre os
tratamentos (Tabela 2).
30
TABELA 2 - RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA A CONTAMINAÇÃO FÚNGICA (FUN), CONTAMINAÇÃO
BACTERIANA (BAC), CALOGÊNESE (CAL), BROTAÇÕES (BRO), OXIDAÇÃO (OXI), SOBREVIVÊNCIA DO
EXPLANTE (SOB) E NÚMERO DE BROTOS (NBRO) PARA EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM
RELAÇÃO AOS TRATAMENTOS AVALIADOS AO LONGO DE 91 DIAS DE CULTIVO in vitro.
Causas da
variação
SUB
Resíduo – SUB
Parcela
PMC
SUB×PMC
Resíduo
Subparcela
Média Real
CVexp(%)
ns
GL
4
15
19
3
12
365
399
-
FUN(1)
(%)
0,202*
0,042*
0,067*
0,007ns
0,012
22,0
15,9
BAC(1)
(%)
0,026*
0,004ns
0,031*
0,003ns
0,007
9,5
11,9
Quadrados médios
CAL(2)
BRO(1)
OXI(1)
(%)
(%)
(%)
2,150*
0,382*
0,353*
*
ns
0,154
0,015
0,050ns
*
*
0,340
0,119
0,100*
0,031ns
0,007ns
0,009ns
0,038
0,018
0,017
55,2
40,0
38,0
19,8
20,7
19,7
*
SOB(1)
(%)
0,264*
0,023ns
0,088*
0,011ns
0,012
78,0
20,8
NBRO(1)
(explante-1)
4,022*
0,012ns
0,060*
0,018ns
0,014
2,0
29,8
(1)
(2)
Valor não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. Valor significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro, pelo teste F. e
0,5
0,5
Dados transformados por 1/[exp(n+0,5)] e (n+0,5) , respectivamente, onde n = dado amostrado. GL = graus de liberdade, CV exp. = coeficiente de variação
experimental, SUB = subcultivo, PMC = preparo do meio de cultura.
31
Na Figura 2, pode-se observar o comportamento de cada
variável ao longo de 91 dias de condução do experimento. As variáveis
correspondentes a porcentagem de contaminação bacteriana (Figura 2A)
e fúngica (Figura 2B) apresentam comportamento semelhante, onde os
valores médios aumentaram entre o 2º (49 dias) e o 3º (70 dias)
subcultivos. A estabilização ocorreu em torno dos 50 dias de cultivo,
permanecendo assim, até o término do experimento (aos 91 dias). A
diferença entre a ocorrência de contaminação bacteriana e fúngica foi
correspondente a incidência, onde a bacteriana foi próxima a 20%,
enquanto que a fúngica foi de 40%.
Para a indução de calos (Figura 2C) os valores máximos
estimados foram de 58%, aos 42 dias. Aos 91 dias de cultivo, o valor real
de produção de calo foi de, aproximadamente, 60%, tendo o pico de
produção ocorrido entre o 2º e o 3º subcultivo, chegando a 80% de
indução de calos.
Quanto a indução de brotação (Figura 2D), o valor máximo
estimado correspondeu aos 61 e 28 dias, correspondendo a 57% de
brotações emitidas. Aos 91 dias de experimento, a produção de brotos
por explante chegou próxima a 50%.
A oxidação apresentou valor máximo estimado em 54% de
ocorrência aos 59 dias, enquanto que a pigmentação apresentou 54% aos
58 dias. Os valores reais para tal variável ao fim do experimento, ou seja,
aos 91 dias, aproximaram-se a 40% de ocorrência (Figuras 2E).
Todas as variáveis avaliadas apresentaram comportamento
semelhante, com redução dos valores de produção aos 91 dias de
experimento, o que se explica pelo fato de que a sobrevivência dos
explantes (Figura 2F) também diminuiu ao longo do tempo, reduzindo
para aproximadamente 60% de sobrevivência de explantes ao fim do
experimento.
32
FIGURA 2 – VALORES
MÉDIOS
EM
PORCENTAGEM
DAS
CARACTERÍSTICAS AVALIADAS EM EXPLANTES DE
Cochlospermum regium, AO LONGO DE 91 DIAS DE
CULTIVO
in
vitro.
(A)
PORCENTAGEM
DE
CONTAMINAÇÃO BACTERIANA; (B) CONTAMINAÇÃO
FÚNGICA; (C) INDUÇÃO DE CALOS; (D) INDUÇÃO DE
BROTOS; (E) OXIDAÇÃO E (F) SOBREVIVÊNCIA.
O preparo do meio de cultura por meio da autoclavagem (M1)
foi significativamente o mais eficaz para o controle da contaminação
bacteriana. A contaminação bacteriana aos 91 dias foi de apenas 5% de
ocorrência, enquanto o meio de cultura M3, mostrou-se o menos eficaz
para o controle da contaminação bacteriana, apresentando 25% aos 91
dias (Tabela 3).
33
TABELA 3 – PORCENTAGEM ACUMULADA DE CONTAMINAÇÃO
BACTERIANA EM EXPLANTES DE Cochlospermum
regium EM RELAÇÃO AO PREPARO DO MEIO DE
CULTURA PARA CADA SUBCULTIVO.
Meio
de
cultura
M1
M2
M3
M4
Subcultivos (dias)
0
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
28
49
5,0±5,0 a
5,0±5,0 a
10,0±6,8 a
10,0±6,8 a
5,0±5,0 b
5,0±5,0 b
25,0±9,9 a
15,0±8,1 ab
70
5,0±5,0 b
10,0±6,8 ab
25,0±9,9 a
15,0±8,1 ab
91
5,0±5,0 b
10,0±6,8 ab
25,0±9,9 a
15,0±8,1 ab
Nas colunas, médias seguidas por letras iguais não diferem significativamente entre si pelo teste
de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão. M1 = meio de cultura
autoclavado, M2 = meio de cultura suplementado com 0,001% Cl, M3 = meio de cultura
suplementado com 0,003% Cl e M4 = meio de cultura suplementado com 0,005% de Cl.
Para a contaminação fúngica, não houve diferença significativa
entre os tratamentos adotados, no entanto, o preparo M2, foi o que
apresentou menor ocorrência da contaminação aos 91 dias de cultivo
(Tabela 4).
TABELA 4 – PORCENTAGEM ACUMULADA DE CONTAMINAÇÃO
FÚNGICA EM EXPLANTES DE Cochlospermum regium
EM RELAÇÃO AO PREPARO DO MEIO DE CULTURA
PARA CADA SUBCULTIVO.
Meio
de
cultura
M1
M2
M3
M4
Subcultivos (dias)
0
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
28
49
70
91
15,0±8,1 a
5,0±5,0 a
15,0±8,1 a
0,0±0,0 a
45,0±11,4 a
10,0±6,8 b
35,0±10,9 a
25,0±9,9 ab
45,0±11,4 a
20,0±9,1 b
45,0±11,4 a
30,0±10,5 ab
45,0±11,4 a
25,0±9,9 a
45,0±11,4 a
35,0±10,9 a
Nas colunas, médias seguidas por letras iguais não diferem significativamente entre si pelo teste
de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão. M1 = meio de cultura
autoclavado, M2 = meio de cultura suplementado com 0,001% Cl, M3 = meio de cultura
suplementado com 0,003% Cl e M4 = meio de cultura suplementado com 0,005% de Cl.
Em vista desses resultados, pode-se presumir que para a
esterilização do meio de cultura, o preparo convencional (autoclavado) foi
a melhor opção para o controle de bactérias e, o M2 para a fúngica.
Contudo, deve-se ressaltar que a ocorrência aos 91 dias representa a
contaminação acumulada ao longo do tempo.
Para a indução de calos, pode-se observar que o M2
sobressaiu aos demais tratamentos avaliados durante todo o experimento,
onde aos 91 dias apresentou uma taxa de 85% de indução de calo e o M1
apresentou 55%. Os preparos M1 e M3 foram os que responderam
34
significativamente melhor aos tratamentos avaliados, apresentando as
menores taxas de incidência de calos aos 91 dias de cultivo, sendo de
55% e 50%, respectivamente (Tabela 5).
TABELA
Meio
de
cultura
M1
M2
M3
M4
5
-
PORCENTAGEM DE INDUÇÃO DE CALOS EM
EXPLANTES
DE
Cochlospermum
regium
EM
RELAÇÃO AO PREPARO DO MEIO DE CULTURA
PARA CADA SUBCULTIVO.
Subcultivos (dias)
0
28
49
70
91
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
85,0±8,1 a
90,0±6,8 a
65,0±10,9 a
85,0±8,1 a
55,0±11,4 b
85,0±8,1 a
50,0±11,4 b
70,0±10,5 ab
55,0±11,4 b
85,0±8,1 a
50,0±11,4 b
70,0±10,5 ab
55,0±11,4 b
85,0±8,1 a
50,0±11,4 b
70,0±10,5 ab
Nas colunas, médias seguidas por letras iguais não diferem significativamente entre si pelo teste
de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão M1 = meio de cultura
autoclavado, M2 = meio de cultura suplementado com 0,001% Cl, M3 = meio de cultura
suplementado com 0,003% Cl e M4 = meio de cultura suplementado com 0,005% de Cl.
Quando avaliada a indução de brotos, não houve diferença
significativa entre os tratamentos, aos 91 dias, mesmo que o M4 tenha
apresentado o maior valor para a indução de brotações, aos 28 dias,
obtendo uma média de 75% de brotações (Tabela 6). Tanto a redução
quanto o aumento da emissão de brotações ao longo dos subcultivos
pode ser explicada pela ocorrência de mortalidade de explantes ou por
contaminação (fúngica e/ou bacteriana), onde o material fora descartado.
TABELA 6 - PORCENTAGEM DE INDUÇÃO DE BROTOS EM
EXPLANTES DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO
AO PREPARO DO MEIO DE CULTURA PARA CADA
SUBCULTIVO.
Meio
de
cultura
M1
M2
M3
M4
Subcultivos (dias)
0
28
49
70
91
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
60,0±11,2 ab
40,0±11,2 b
45,0±11,4 b
75,0±9,9 a
50,0±11,4 a
35,0±10,9 a
40,0±11,2 a
65,0±10,9 a
55,0±11,4 a
35,0±10,9 a
40,0±11,2 a
65,0±10,9 a
55,0±11,4 a
35,0±10,9 a
40,0±11,2 a
65,0±10,9 a
Nas colunas, médias seguidas por letras iguais não diferem significativamente entre si pelo teste
de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão. M1 = meio de cultura
autoclavado, M2 = meio de cultura suplementado com 0,001% Cl, M3 = meio de cultura
suplementado com 0,003% Cl e M4 = meio de cultura suplementado com 0,005% de Cl.
Em relação ao número de brotos por explante, os tratamentos
M1 e M3, apresentaram os maiores valores médios em relação aos
35
demais tratamentos, resultando em média de 3,18 e 3,11 brotos por
explante, respectivamente, aos 91 dias de cultivo, correspondendo aos
melhores tratamentos em todo o período de experimento (Tabela 7).
TABELA 7 – NÚMERO DE BROTOS EMITIDOS EM EXPLANTES
Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO PREPARO DO
MEIO DE CULTURA PARA CADA SUBCULTIVO.
Meio de
cultura
M1
M2
M3
M4
0
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
28
3,9±0,6 a
2,3±0,4 b
2,8±0,4 b
2,6±0,5 b
Subcultivos (dias)
49
70
3,8±0,4 a
3,0±0,6 a
2,0±0,2 c
2,2±0,3 b
3,5±0,5 a
3,1±0,7 a
2,8±0,5 b
2,7±0,3 ab
91
3,1±0,6 a
2,3±0,3 b
3,1±0,7 a
2,7±0,3 ab
Nas colunas, médias seguidas por letras iguais não diferem significativamente entre si pelo teste
de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão. M1 = meio de cultura
autoclavado, M2 = meio de cultura suplementado com 0,001% Cl, M3 = meio de cultura
suplementado com 0,003% Cl e M4 = meio de cultura suplementado com 0,005% de Cl.
A oxidação foi evidente em todos os tratamentos, no entanto
quando o meio de cultura utilizado foi o M1 (isento de cloro ativo), a
ocorrência de oxidação foi menor. Esse efeito pode ser justificado pelo
fato do NaClO propiciar a oxidação dos explantes (Tabela 8).
TABELA 8 - PORCENTAGEM DE OXIDAÇÃO DE EXPLANTES DE
Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO PREPARO DO
MEIO DE CULTURA PARA CADA SUBCULTIVO.
Meio
de
cultura
M1
M2
M3
M4
Subcultivos (dias)
0
28
49
70
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
0,0±0,0 a
45,0±11,4 a
60,0±11,2 a
65,0±10,9 a
50,0±11,4 a
25,0±9,9 b
60,0±11,2 a
50,0±11,4 ab
45,0±11,4 ab
25,0±9,9 b
60,0±11,2 a
50,0±11,4 ab
45,0±11,4 ab
91
25,0±9,9 b
60,0±11,2 a
50,0±11,4 ab
45,0±11,4 ab
Nas colunas, médias seguidas por letras iguais não diferem significativamente entre si pelo teste
de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão. M1 = meio de cultura
autoclavado, M2 = meio de cultura suplementado com 0,001% Cl, M3 = meio de cultura
suplementado com 0,003% Cl e M4 = meio de cultura suplementado com 0,005% de Cl.
Quanto à sobrevivência (Tabela 9), aos 91 dias, o tratamento
M2 foi o que apresentou melhores respostas, resultando em 75% de
sobrevivência de explantes. O M3 apresentou o pior desempenho, com
apenas 45% dos explantes vivos ao fim do experimento. Esse
comportamento foi observado também ao longo do tempo de cultivo.
36
TABELA 9 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA EM EXPLANTES
DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO PREPARO
DO MEIO DE CULTURA PARA CADA SUBCULTIVO.
Meio
de
cultura
M1
M2
M3
M4
Subcultivos (dias)
0
28
49
70
91
100,0±0,0 a
100,0±0,0 a
100,0±0,0 a
100,0±0,0 a
100,0±0,0 a
100,0±0,0 a
85,0±8,1 a
100,0±0,0 a
55,0±11,4 c
85,0±8,1 a
60,0±11,2 bc
80,0±9,1 ab
55,0±11,4 bc
80,0±9,1 a
45,0±11,4 c
75,0±9,9 ab
55,0±11,4 ab
75,0±9,9 a
45,0±11,4 b
65,0±10,9 ab
Nas colunas, médias seguidas por letras iguais não diferem significativamente entre si pelo teste
de Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão. M1 = meio de cultura
autoclavado, M2 = meio de cultura suplementado com 0,001% Cl, M3 = meio de cultura
suplementado com 0,003% Cl e M4 = meio de cultura suplementado com 0,005% de Cl.
Na Figura 3A-D pode-se observar o desenvolvimento de um
explante submetido à multiplicação in vitro com o uso da esterilização
química (M2), no decorrer do tempo. Pode-se observar a formação de
calo na base do explante, vindo este a oxidar com a passagem dos
subcultivos. Observa-se também a presença de pontos de pigmentação
avermelhada na borda das folhas.
FIGURA 3 – DESENVOLVIMENTO in vitro DE EXPLANTES DE
Cochlospermum regium AO LONGO DO TEMPO. (A) 28
DIAS DE CULTIVO; (B) 49 DIAS DE CULTIVO; (C) 70
DIAS DE CULTIVO; (D) 91 DIAS DE CULTIVO. FOTO:
NATÁLIA HELENA GAVILAN (2015).
Na análise histológica foram observadas áreas meristemáticas
nos calos formados (Figura 4A), consistindo de células pequenas e
isodiamétricas. Nas figuras 4B e 4C, observou-se a presença de centros
meristemáticos unipolarizados em fase de diferenciação. Na figura 4D, foi
possível visualizar a presença de células pró-embrionárias. Como
verificado, a presença de calos foi evidente durante toda a fase de
multiplicação in vitro.
37
FIGURA
4
–
CORTES HISTOLÓGICOS DE EXPLANTES DE
Cochlospermum regium CULTIVADOS in vitro ONDE
AS SETAS INDICAM: (A) ZONAS MERISTEMÁTICAS
(BARRA: 100 µm); (B) E (C) DETALHE DE CENTROS
MERISTEMÁTICOS EM FASE DE DIFERENCIAÇÃO
(BARRA: 100 µm); (D) SETA EVIDENCIANDO
CÉLULA PRÓ-EMBRIONÁRIA (BARRA: 50 µm).
2.5 DISCUSSÃO
O uso de cloro ativo para a esterilização química do meio de
cultura visando a propagação in vitro de plantas já foi comprovado para
diversas espécies (TEIXEIRA et al., 2008; RIBEIRO et al., 2011;
BRONDANI et al., 2013; NEPOMUCENO et al., 2014). Estes estudos
corroboram com os resultados obtidos neste trabalho ao considerar o uso
do cloro ativo para a esterilização química do meio de cultura durante o
cultivo in vitro de C. regium. Em termos gerais, mesmo que o meio de
cultura
autoclavado
tenha
proporcionado
o
maior
controle
das
contaminações (bacteriana e/ou fúngica), foi possível comprovar o efeito
positivo da suplementação de cloro ativo ao meio de cultura (sem
necessitar de autoclavagem).
38
Os meios de cultura M2 (0,001% de cloro ativo), M3 (0,003%
de cloro ativo) e M4 (0,005% de cloro ativo) controlaram satisfatoriamente
as manifestações fúngicas e bacterianas durante os 91 dias de subcultivo.
Além disso, constatou-se reduzido efeito prejudicial quanto a multiplicação
de gemas dos explantes, sendo possível verificar emissão de brotações
saudáveis e vigorosas.
Os resultados encontrados neste estudo, quanto à incidência
de brotos diferem dos encontrados por Brondani et al. (2013) para E.
benthamii, onde concentrações iguais ou superiores a 0,005% de cloro
ativo induziu menores valores de viabilidade de brotos, indicando efeito
tóxico.
A concentração de 0,005% de cloro ativo foi a que apresentou
maior taxa de emissão de brotos para C. regium, corroborando os
resultados de Teixeira et al. (2008) para E. pellita, onde concentrações de
até 0,009% de cloro ativo, mostram-se satisfatórias para o cultivo in vitro,
mesmo que ocorrendo uma pequena redução do número de brotos em
comparação ao preparo convencional autoclavado.
Ao utilizar citocininas como fitorreguladores no processo de
multiplicação de gemas in vitro, espera-se que haja um aumento do
número de brotação (INÁCIO, 2010). Contudo, no presente experimento
com C. regium foi possível verificar que houve proliferação da calogênese
com a suplementação de BAP ao meio de cultura. Esse efeito também foi
constatado por Inácio (2010) e pode estar associado às concentrações
endógenas de fitohormônios, pois foram utilizados explantes provenientes
de plântulas germinadas in vitro, as quais apresentam elevada
juvenilidade.
Quanto a oxidação dos explantes, os resultados diferem dos
encontrados por Brondani et al. (2013), que observaram a oxidação
apenas em concentrações iguais ou superiores à 0,005% de cloro ativo
ao trabalhar com Eucalyptus benthamii, enquanto que para C. regium a
oxidação foi detectada em todos os tratamentos. Tal fato pode ser
justificado pela exsudação de substâncias endógenas pelos explantes de
C. regium após a excisão, fato esse que foi observado a cada subcultivo,
principalmente quando era necessário realizar algum corte no explante.
39
No entanto, não existem estudos que identifiquem a natureza das
substâncias exsudadas dos explantes de C. regium após a excisão. Uma
alternativa para redução da oxidação seria evitar cortes desnecessários
nos explantes, além da redução do tempo de subcultivos, que segundo
Jones e Saxena (2013) pode contribuir para a redução da oxidação.
Como evidenciado por Inácio et al. (2011), a multiplicação in
vitro de C. regium é possível de ser conduzida, o que também foi
confirmado no presente estudo. Além disso, mesmo com o uso de cloro
ativo para a esterilização química do meio de cultura, houve multiplicação
dos brotos, chegando a apresentar 65% de explantes combrotações
quando utilizado 0,005% de cloro ativo no meio de cultura.
Quanto ao tempo de cultivo in vitro, os resultados indicam que
a máxima produção de brotos ocorre aos 60 dias de cultivo, corroborando
as observações de Inácio et al. (2011). Dessa forma, o presente estudo
também permitiu verificar que o C. regium é uma espécie que necessita
de vários subcultivos in vitro para que apresente resposta morfogênica em
relação a multiplicação de brotos.
A análise histológica dos tecidos permitiu verificar intensa
atividade meristemática e células potencialmente embrionárias, com
divisões assimétricas, semelhante ao encontrado em estruturas próembrionárias. A presença de zonas meristemáticas pressupõe a formação
de gemas adventícias, e a presença de células com características próembrionárias mostra a possibilidade da ocorrência de embriogênese
somática, a qual têm origem a partir de células somáticas, sem a
ocorrência de fusão de gametas (CARNEIRO et al., 2014), sendo uma
excelente alternativa para a propagação assexuada.
Tendo em vista os resultados do presente estudo, pôde-se
verificar que a suplementação de cloro ativo ao meio de cultura até a
concentração de 0,005% foi viável para a multiplicação de brotos in vitro
de C. regium, ao comparar com o tradicional método de preparo do meio
de cultura (com autoclavagem).
Levando-se em conta o potencial da esterilização química do
meio de cultura para a multiplicação de brotos in vitro, também verificouse controle adequado da contaminação fúngica e bacteriana, resposta
40
positiva à calogênese, indução de brotos, e até 75% de sobrevivência de
explantes. Além disso, pela análise histológica, foi possível verificar a
presença de células potencialmente embrionárias, independente do
tratamento testado.
Dessa forma, a possibilidade da esterilização química do meio
de cultura com cloro ativo foi viável para o cultivo in vitro de C. regium,
tornando-se uma alternativa em relação ao preparo do meio de cultura
autoclavado. A esterilização química do meio de cultura é um processo a
ser considerado em sistemas de produção de plantas in vitro,
principalmente no que diz respeito à redução de custos.
2.6 CONCLUSÕES
A suplementação de cloro ativo ao meio de cultura apresentou
resultados satisfatórios para a multiplicação in vitro de C. regium, com
respostas
similares
ao
preparo
convencional
(meio
de
cultura
autoclavado).
A concentração de até 0,005% de cloro ativo suplementado ao
meio de cultura foi adequada para a multiplicação in vitro de gemas
adventícias em C. regium, considerando 91 dias de cultivo.
A multiplicação de gemas adventícias foi verificada em todos os
tratamentos, apresentando o maior valor (65%) quando se aplicou 0,005%
de cloro ativo ao meio de cultura.
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São Paulo, São Paulo-SP.
43
SÓLON, S.; BRANDÃO, L. F. G. e SIQUEIRA, J. M. o gênero
Cochlospermum Kunth com ênfase nos aspectos etnobotânicos,
farmacológicos, toxicológicos e químicos de Cochlospermum regium
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44
3 ORGANOGÊNESE INDIRETA EM Cochlospermum regium
Resumo – O objetivo deste trabalho foi elaborar um protocolo de
organogênese indireta em Cochlospermum regium por meio da indução à
calogênese e regeneração de brotos. Os tratamentos propostos
basearam-se nas combinações do tipo de explante (cotilédone, hipocótilo
e raiz) e do tipo de fitorregulador (2,4-D, TDZ e ANA). O meio de cultura
utilizado foi o MS. Os explantes foram coletados de plântulas germinadas
in vitro. Para a indução da calogênese, o meio de cultura foi
suplementado com 1 mg.L-1 de cada fitorregulador testado. Passados 49
dias de exposição aos fitorreguladores, os explantes foram transferidos
para meio de cultura de regeneração, o qual conteve a suplementação de
1 mg.L-1 de BAP e 0,05 mg.L-1 de ANA. O experimento foi conduzido no
delineamento inteiramente casualizado em esquema fatorial (3x3). Para a
calogênese foram avaliadas a porcentagem de indução de calos, a
oxidação e a sobrevivência dos explantes. Para a regeneração foram
avaliadas a porcentagem de brotos, oxidação e sobrevivência. Os dados
foram submetidos à ANOVA e posteriormente à análise de comparação
de médias de Duncan (p<0,05). Todos os tratamentos avaliados
induziram à formação de calos e, ao final de 91 dias de experimento,
verificou-se que o TDZ foi o único fitorregulador responsivo à regeneração
de brotos, resultando em 5,3% de proliferação de brotos.
Palavras-chave: Regeneração, regulador de crescimento, tipo de
explante.
3 INDIRECT ORGANOGENESIS IN Cochlospermum regium
Abstract – The objective was to prepare an indirect organogenesis
protocol C. regium order to callus formation and regeneration of shoots.
Proposed treatments were the combination of the type of explants
(cotyledon, hypocotyl and root) and type of plant growth regulator (2,4-D
and NAA TDZ). The culture medium used was MS supplemented with 30
g.L-1 sucrose and 6 g.L-1 agar. The explants were collected from seedlings
germinated in vitro. For callus induction was used 1 mg.L-1 of each tested
plant growth regulator. After 49 days of exposure to growth regulators, the
explants were transferred to regeneration medium culture, which
contained the 1 mg.L-1 BAP and 0.05 mg.L-1 NAA. The experiment was
conducted in a completely randomized design in factorial scheme (3x3) for
callus formation were evaluated percentage of callus induction, oxidation,
pigmentation and survival and, for regeneration percentage shoots,
oxidation and survival. Data were subjected to ANOVA and then to the
comparison analysis means Duncan (p <0.05). After 49 days of
experiment evaluated the callus formation, where all the treatments
induced the formation of callus and at the end of 91 days of the
experiment, it was found that the growth regulator TDZ was the only
responsive to the regeneration of shoots with 5.3% proliferation.
Keywords: Regeneration, growth regulators, type of explant.
45
3.1 INTRODUÇÃO
O Cerrado é o segundo maior bioma brasileiro, ocupando 21%
do território nacional (BORLAUG, 2002; KLINK e MACHADO, 2005). É
apontado ainda como a formação savânica de maior diversidade vegetal
do mundo (MENDONÇA et al., 1998). Em contraste a toda esta riqueza, a
vegetação vem sendo devastada demasiadamente, e por esse motivo,
está inclusa entre as vegetações de maior risco de desaparecimento no
país (KAPLAN et al., 1994).
A intensa exploração das áreas do Cerrado têm contribuído
para que muitas espécies nativas sejam classificadas em risco de
extinção. Além disso, ocorre a coleta indiscriminada, a qual é realizada
corriqueiramente por mateiros, raizeiros, comunidades locais e por
aqueles que revendem matéria-prima aos laboratórios, sem que haja
compromisso em repor à natureza o que dela é retirada (SANGALLI,
2000).
Dentre as espécies endêmicas e em risco de extinção do bioma
Cerrado pode-se citar o Cochlospermum regium, que é um arbusto de
ocorrência frequente nas áreas da região centro-oeste do país (CAMILLO
et al., 2009; ROSSI et al., 2013). O C. regium apresenta indicações
medicinais populares, onde o rizóforo é usado em chás ou para combater
infecções e inflamações (ROSSI et al., 2013). No entanto, a importância
dessa espécie não está restrita apenas à medicina popular, pois também
houve a comprovação do efeito analgésico e antiedematogênico
(CASTRO et al., 2004) e de atividade antibacteriana em Staphylococcus
aureus e Escherichia coli (OLIVEIRA et al., 1994).
Outro fator que agrava a extinção de muitas espécies
medicinais do cerrado é a baixa germinação, devido às sementes
apresentarem dormência (ROSSI, et al., 2013), como é o caso do C.
regium, onde as sementes apresentam dormência tegumentar, ou seja, o
tegumento duro impede a permeabilidade à água (KIRIZAWA, 1981;
CAMILLO et al., 2009; INÁCIO et al., 2010).
As técnicas de cultura de tecidos de plantas, em alguns casos,
podem representar a única estratégia para conservar espécies fora do seu
46
habitat, como no caso de plantas com sementes recalcitrantes e de difícil
propagação por métodos convencionais (ROCA et al., 1991; FERREIRA
et al., 1998).
Todavia, diversos fatores influenciam as diferentes etapas da
micropropagação e os materiais genéticos apresentam especificidades
quanto ao cultivo in vitro (BORGES et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2011),
exigindo a adequação de metodologias para os materiais genéticos
estudados de forma a realizar o cultivo in vitro com sucesso (OLIVEIRA,
2014).
A organogênese in vitro envolve uma variedade de sequências
complexas de desenvolvimento, resultantes da manipulação experimental
de partes de uma planta até culminar na formação de primórdios de
órgãos ou plantas inteiras (HICKS, 1980). A organogênese indireta é
caracterizada quando a regeneração ocorre a partir de calos isolados do
explante inicial (STIRMART, 1986) onde qualquer tecido vegetal pode ser
utilizado como explante (MORAIS et al., 2012). Entretanto, procura-se
utilizar explantes que contenham maior proporção de tecido meristemático
ou que apresentem maior capacidade de expressar a totipotência celular
(GRATTAPAGLIA e MACHADO, 1998), além de avaliar o melhor tipo de
fitorregulador para controlar os padrões morfogênicos (GEORGE, 1993).
3.2 OBJETIVOS
3.2.1 Objetivo geral
Elaborar
um
protocolo
organogênese
indireta
para
Cochlospermum regium.
3.2.2 Objetivos específicos

Determinar o melhor fitorregulador e explante para induzir à
calogênese;

Determinar o melhor fitorregulador e explante para induzir à
regeneração in vitro de brotos.
47
3.3 MATERIAL E MÉTODOS
3.3.1 CARACTERIZAÇÃO GERAL
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Cultura
de Tecidos Vegetais, pertencente à Faculdade de Engenharia Florestal da
Universidade Federal de Mato Grosso (UFMT), Cuiabá – MT.
3.3.1.1 Fonte dos explantes
Como explantes foram utilizados tecidos vegetais (Figura 1A e
1B) coletados de plantas germinadas in vitro, as quais foram obtidas a
partir de sementes. As sementes de Cochlospermum regium utilizadas
para a realização do experimento foram coletadas de frutos maduros
durante os meses de Setembro e Outubro de 2014 em área do Cerrado, a
qual foi localizada no Parque Nacional da Chapada dos Guimarães,
Rodovia MT – 251, no município de Chapada dos Guimarães (autorização
nº 46295 do ICMBio – Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade).
FIGURA 1 – DETALHE DA GERMINAÇÃO in vitro E SECCIONAMENTO
DA PLÂNTULA DE Cochlospermum regium. (A) PLÂNTULA
GERMINADA in vitro. (B) TECIDOS VEGETAIS
(COTILÉDONE, HIPOCÓTILO E RADÍCULA) UTILIZADOS
COMO EXPLANTES (SETA). BARRA: 1 cm. FOTO:
NATÁLIA HELENA GAVILAN (2014).
48
3.3.1.2 Tratamentos e delineamento experimental
3.3.1.2.1 Calogênese
Os explantes foram inoculados em tubos de ensaio (2×10 cm)
contendo 5 mL do meio de cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962),
onde foram avaliados nove tratamentos por 49 dias, realizando apenas
um subcultivo aos 28 dias (Tabela 1).
TABELA 1 - RELAÇÃO DOS TRATAMENTOS E CONCENTRAÇÕES
DE FITORREGULADORES E TIPO DO EXPLANTE PARA
A ORGANOGÊNESE EM C. regium.
Tratamento
Fitorregulador
Tipo de Explante
-1
T1
2,4-D (1,0 mg.L )
Cotilédone
T2
2,4-D (1,0 mg.L-1)
Hipocótilo
-1
T3
2,4-D (1,0 mg.L )
Radícula
T4
TDZ (1,0 mg.L-1)
Cotilédone
T5
TDZ (1,0 mg.L-1)
Hipocótilo
-1
T6
TDZ (1,0 mg.L )
Radícula
T7
ANA (1,0 mg.L-1)
Cotilédone
-1
T8
ANA (1,0 mg.L )
Hipocótilo
T9
ANA (1,0 mg.L-1)
Radícula
TDZ: thidiazuron; 2,4-D: ácido 2,4-diclorofenoxiacético; ANA: ácido α-naftalenoacético.
O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente
casualizado no esquema fatorial (3x3), onde foram avaliados três
fitorreguladores e três tipos de explantes (Tabela 1). As avaliações foram
realizadas ao fim de 49 dias de cultivo, onde foram avaliadas a
porcentagem de calogênese, a oxidação e a sobrevivência.
3.3.1.2.2 Regeneração in vitro
Os calos obtidos no experimento anterior foram utilizados como
fonte de explantes visando regenerar gemas e brotos. Os explantes foram
inoculados em tubos de ensaio (2×10 cm) contendo 5 mL do meio de
cultura MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), o qual foi suplementado com
1 mg.L-1 de BAP (benzilaminopurina) para induzir gemas e/ou brotações.
49
O experimento foi conduzido até os 49 dias de cultivo, tendo havido um
subcultivo aos 28 dias.
O experimento foi conduzido em delineamento inteiramente
casualizado no esquema fatorial (3x3), onde foram avaliados três
fitorreguladores e três tipos de explantes (Tabela 1). As avaliações foram
realizadas ao fim de 49 dias de cultivo, onde foram avaliadas a
porcentagem de brotos, a oxidação e a sobrevivência.
3.3.1.3 Preparo do meio de cultura e condições de crescimento
O meio de cultura foi preparado com água destilada,
adicionando-se 6 g.L-1 de ágar e 30 g.L-1 de sacarose. O valor do pH foi
ajustado para 5,8 com HCl (0,1M) e NaOH (0,1M) previamente a adição
do ágar ao meio de cultura, e então autoclavado a temperatura de 121°C
(≈ 1 kgf.cm-2) durante 20 minutos. O procedimento de manipulação dos
explantes foi executado em câmara de fluxo laminar. Os explantes foram
cultivados em sala de crescimento com temperatura controlada a 25°C (±
2°C), fotoperíodo de 16 horas e luminosidade de 32 μmol m-2 s-1.
3.3.2 ANÁLISE HISTOLÓGICA
Amostras dos tecidos calogênicos foram fixados em solução de
formaldeído
e
glutaraldeído
(KARNOVSKY,
1965)
modificado
(glutaraldeído 1%; paraformaldeído 4% em tampão fostato de sódio NaH2PO4.H2O à 0,1 M; pH 7,2) e submetidas a seis séries de vácuo (-600
mmHg) por 30 minutos cada. As amostras foram armazenadas durante 40
dias a 4°C, e posteriormente foram desidratadas por meio de série
alcoólica-etílica em concentrações crescentes (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70,
80, 90 e 100%, v/v), permanecendo em cada solução por 15 minutos. Em
seguida as amostras foram imersas em meio de infiltração (Historesina,
Leica) durante 24 horas e após, foram alocadas na porção inferior do
recipiente de moldura. As amostras foram emblocadas em Historesina
(hidroxietil metacrilato, Leica) com endurecedor conforme recomendação
do fabricante, onde permaneceram durante 34 dias à temperatura de
50
24°C.
Os
blocos
foram
seccionados
longitudinalmente
ou
transversalmente à 5 μm de espessura com o uso de micrótomo rotativo
automático Microm HM 355S (Thermo Scientific). Os cortes obtidos foram
corados com azul de toluidina (0,05%, v/v) em tampão fostato de sódio e
ácido cítrico (SAKAI, 1973) durante 15 minutos e montados em lâminas
histológicas com resina sintética (Entellan). As lâminas histológicas foram
analisadas e fotomicrografadas em microscópio de luz (Opton) sendo as
imagens capturadas em escala micrométrica.
3.3.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA
O conjunto de dados foi submetido ao teste de Shapiro-Wilk
(p<0,05) afim de verificar a normalidade. Para verificar a homogeneidade
de variância foi utilizado o teste de Hartley (p<0,05) e, para transformar os
dados, foi utilizado o teste de Box-Cox. Após, os dados foram submetidos
à análise de variância (ANOVA, p<0,05 e p<0,01). Por fim, os dados
foram submetidos a análise de comparação de médias de Duncan
(p<0,05). Os programas SOC (EMBRAPA, 1990) e R (R DEVELOPMENT
CORE TEAM, 2012) foram utilizados para a análise estatística dos dados.
As análises histológicas foram caracterizadas por análise descritiva.
3.4 RESULTADOS
3.4.1 CALOGÊNESE
De acordo com a análise de variância, houve efeito significativo
do fitorregulador e tipo de explante para indução de calo e sobrevivência
de explantes. Foi constatada interação entre os tratamentos apenas
quando a variável avaliada foi a indução de calo. Para a oxidação, o tipo
de explante não foi significativo, porém ocorreu interação entre os
tratamentos.
51
TABELA 2 - RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA A
CALOGÊNESE
(CAL),
OXIDAÇÃO
(OXI)
E
SOBREVIVÊNCIA
(SOB)
DO
EXPLANTE
DE
Cochlospermum
regium
EM
RELAÇÃO
AOS
TRATAMENTOS AVALIADOS EM 49 DIAS DE CULTIVO
in vitro.
Quadrados Médios
Causas
CAL (1)
OXI(1)
SOB(1)
da variação
GL
(%)
(%)
(%)
*
*
FR
2
0,097
0,238
0,375*
TE
2
0,652*
0,026ns
0,109*
*
*
FR×TE
4
0,099
0,062
0,021ns
Resíduo
416
0,013
0,008
0,016
Total
424
Média
74,3
87,5
77,4
CVexp(%)
21,2
18,1
23,1
ns
*
Valor não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. Valor significativo
(1)
0,5
ao nível de 5% de probabilidade de erro, pelo teste F. Dados transformados por 1/[exp(n+0,5)]
onde n = dado amostrado. GL = graus de liberdade, CVexp. = coeficiente de variação
experimental, FR = regulador de crescimento, TE = tipo de explante.
Quando a variável analisada foi a indução de calos (CAL),
pode-se observar que o explante proveniente do hipocótilo apresentou
maior predisposição ao calejamento, independentemente do fitorregulador
utilizado (Tabela 3). De maneira geral, todos os tratamentos induziram à
calogênese, sendo que a combinação entre os fitorreguladores 2,4-D
(92,0%) e TDZ (91,6%) com o explante de origem do hipocótilo,
apresentaram as maiores médias (Tabela 3).
TABELA
3
Tipo de
Explante
Cotilédone
Hipocótilo
Radícula
-
PORCENTAGEM DE INDUÇÃO DE CALOS EM
Cochlospermum
regium
EM
RELAÇÃO
AO
FITORREGULADOR E TIPO DE EXPLANTE EM 49
DIAS DE CULTIVO in vitro.
Fitorregulador
2,4-D
TDZ
ANA
83,6±5,3 Aa
78,7±6,0 Bb
89,1±4,6 Aa
92,0±3,8 Aa
91,6±4,0 Aa
85,4±5,1 Aab
31,2±6,7 Bb
38,2±7,1 Bc
78,5±6,4 Ab
Nas colunas, médias seguidas por mesma letra minúscula e, nas linhas, médias seguidas por
mesma letra maiúscula não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05).
Dados apresentados como: média ± erro padrão.
Explantes de origem cotiledonar foram os que, em geral,
apresentaram a menor porcentagem de oxidação (Tabela 4). A aplicação
de TDZ e ANA ao meio de cultura resultou em aumento da porcentagem
52
de oxidação dos tecidos, independente do tipo de explante avaliado.
Dessa forma, a combinação recomendável para reduzir a oxidação dos
tecidos de C. regium é a aplicação de 2,4-D como fitorregulador e
hipocótilo como explante (Tabela 4).
TABELA 4 - PORCENTAGEM DE OXIDAÇÃO EM EXPLANTES DE
Cochlospermum
regium
EM
RELAÇÃO
AO
FITORREGULADOR EM 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.
Fitorregulador
Tipo de
Explante
2,4-D
TDZ
ANA
Cotilédone
77,5±6,0 Ba
97,8±2,1 Aa
78,2±6,1 Bb
Hipocótilo
58,0±7,0 Bb
100,0±0,0 Aa
100,0±0,0 Aa
Radícula
83,3±5,4 Aa
95,7±2,9 Aa
100,0±0,0 Aa
Nas colunas, médias seguidas por mesma letra minúscula e, nas linhas, médias seguidas por
mesma letra maiúscula não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05).
Dados apresentados como: média ± erro padrão.
Para os tratamentos com fitorregulador, os explantes que foram
cultivados em meio de cultura suplementado com ANA, apresentaram a
menor taxa de sobrevivência em relação aos que foram cultivados com
2,4-D e TDZ (Tabela 5).
TABELA 5 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA DE EXPLANTES DE
Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO TIPO DE
FITORREGULADOR EM 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.
Fitorregulador
Médias
2,4-D
82,9±3,1 a
TDZ
86,6±2,8 a
ANA
61,7±8,7 b
Médias seguidas por mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de
Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão.
Quanto ao tipo de explante, pode-se observar que o cotilédone
apresentou melhor resposta para a porcentagem de sobrevivência
(90,1%), o qual não diferiu significativamente do hipocótilo (75,3%). O
explante menos viável para a porcentagem de sobrevivência foi
proveniente do sistema radicular (66,4%) (Tabela 6).
53
TABELA 6 - PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA DE EXPLANTES DE
Cochlospermum regium QUANTO AO TIPO EXPLANTE EM
49 DIAS DE CULTIVO in vitro.
Tipo de Explante
Médias
Cotilédone
90,1±7,8 a
Hipocótilo
75,3±3,5 ab
Radícula
66,4±4,0 b
Médias seguidas por mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de
Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão.
Na Figura 2, pode-se observar a formação calogênica em duas
épocas diferentes. A Figura 2A refere-se ao calejamento ocorrido aos 28
dias de cultivo, e a Figura 2B, ao final do experimento, com 49 dias de
cultivo, e sem a formação de brotos. Os calos obtidos ao longo do
experimento apresentaram textura macia e do tipo friável.
FIGURA 2 – CALOGÊNESE in vitro DE Cochlospermum regium. (A)
CALOS INDUZIDOS AOS 28 DIAS DE CULTIVO. (B)
CALOS INDUZIDOS AOS 49 DIAS DE CULTIVO. BARRA:
1 cm. FOTO: NATÁLIA HELENA GAVILAN (2014).
A análise histológica dos tecidos calogênicos evidenciou a
presença de células meristemáticas potencialmente embrionárias (Figura
3A), além da ocorrência de embriogênese somática, sendo possível
visualizar a estrutura do pró-embrião (Figura 3B), além de embriões
somáticos (Figura 3C) quando utilizado o fitorregulador TDZ com o
explante hipocótilo.
54
FIGURA 3 – CORTES HISTOLÓGICOS EM CALOS DE Cochlospermum
regium CULTIVADOS in vitro AOS 49 DIAS. (A) SETAS
INDICAM CÉLULAS MERISTEMÁTICAS; (B) SETA
INDICANDO PRÓ-EMBRIÃO; (C) SETA INDICANDO
PRESENÇA DE EMBRIÃO. BARRA: 50 µm.
3.4.2 REGENERAÇÃO in vitro
De acordo com a análise de variância, apenas as variáveis
correspondentes
a
porcentagem
de
oxidação
e
sobrevivência
apresentaram interação entre os tratamentos testados. Para a indução de
brotos, apenas o tratamento com fitorreguladores foi significativo (Tabela
7).
TABELA 7 – RESUMO DA ANÁLISE DE VARIÂNCIA PARA A
PORCENTAGEM DA INDUÇÃO DE BROTOS (BRO),
OXIDAÇÃO (OXI) E SOBREVIVÊNCIA DE EXPLANTES
(SOB) DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AOS
TRATAMENTOS AVALIADOS EM 49 DIAS DE
CULTIVO in vitro.
Quadrados Médios
Causas
(1)
BRO
OXI(1)
SOB(1)
da variação
GL
(%)
(%)
(%)
FR
2
0,011*
0,359*
0,407*
TE
2
0,007ns
0,048ns
0,124*
FR×TE
4
0,006ns
0,398*
0,354*
Resíduo
309
0,001
0,015
0,016
Total
317
Média
2,2
40,5
50,3
CVexp(%)
5,6
19,0
20,3
ns
*
Valor não significativo ao nível de 5% de probabilidade de erro pelo teste F. Valor significativo
(1)
0,5
ao nível de 5% de probabilidade de erro, pelo teste F. Dados transformados por 1/[exp(n+0,5)]
onde n = dado amostrado. GL = graus de liberdade, CVexp. = coeficiente de variação
experimental, FR = fitorregulador, TE = tipo de explante.
Apenas os calos originados pelo tratamento com TDZ emitiram
brotações, sendo essas observadas na maioria dos explantes do tipo
55
hipocótilo, o qual diferiu significativamente em relação aos demais
tratamentos avaliados (Tabela 8). Os calos originados pela aplicação de
2,4-D e ANA (embora tenham sido os que apresentaram a melhor indução
à calogênese) não emitiram brotos quando submetidos ao meio de cultura
para a regeneração (Tabela 8).
TABELA 8 – PORCENTAGEM DE BROTOS EMITIDOS EM EXPLANTES
DE
Cochlospermum
regium
EM
RELAÇÃO
AO
FITORREGULADOR AOS 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.
Fitorregulador
Média
2,4-D
0,0±0,0 b
TDZ
5,3±4,06 a
ANA
0,0±0,0 b
Médias seguidas por mesma letra não diferem significativamente entre si pelo teste de
Duncan (P<0,05). Dados apresentados como: média ± erro padrão.
A porcentagem de oxidação dos tecidos foi observada em
todos os tratamentos, sendo a maior ocorrência no tratamento de
interação entre hipocótilo e TDZ. Embora os maiores índices de oxidação
terem sido verificados quando o fitorregulador utilizado foi o TDZ, não veio
a inviabilizar o experimento, uma vez que houve regeneração de brotos
apenas com o uso desse regulador de crescimento. Os reguladores de
crescimento 2,4-D e ANA, apresentaram menores taxas de oxidação em
comparação com TDZ (Tabela 9).
TABELA 9 – PORCENTAGEM DE OXIDAÇÃO EM EXPLANTES DE
Cochlospermum
regium
EM
RELAÇÃO
AO
FITORREGULADOR AOS 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.
Fitorregulador
Tipo de
Explante
2,4-D
TDZ
ANA
Cotilédone
48,9±7,3 Aa
15,0±5,7 Cb
36,6±8,9 Bb
Hipocótilo
0,0±0,0 Cb
77,7±6,2 Aa
37,5±10,0 Bb
Radícula
8,8±4,9 Bb
72,9±7,4 Aa
75,0±9,9 Aa
Nas colunas, médias seguidas por mesma letra minúscula e, nas linhas, médias seguidas por
mesma letra maiúscula não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05).
Dados apresentados como: média ± erro padrão.
Em relação à sobrevivência dos explantes, o fitorregulador que
apresentou o melhor desempenho foi o TDZ, principalmente quando o
explante utilizado foi o hipocótilo. Apenas para explantes de origem
cotiledonar, o regulador de crescimento 2,4-D foi superior quanto a
56
sobrevivência, apresentando a maior média em relação aos demais
tratamentos (Tabela 10).
TABELA 10 – PORCENTAGEM DE SOBREVIVÊNCIA DE EXPLANTES
DE Cochlospermum regium EM RELAÇÃO AO
FITORREGULADOR EM 49 DIAS DE CULTIVO in vitro.
Fitorregulador
Tipo de
Explante
2,4-D
TDZ
ANA
Cotilédone
74,4±6,4 Aa
52,5±7,9 Bb
46,6±9,2 Bb
Hipocótilo
0,0±0,0 Cb
77,7±6,2 Aa
37,5±10,0 Bb
Radícula
8,8±4,9 Bb
75,6±7,1 Aa
75,0±9,9 Aa
Nas colunas, médias seguidas por mesma letra minúscula e, nas linhas, médias seguidas por
mesma letra maiúscula não diferem significativamente entre si pelo teste de Duncan (P<0,05).
Dados apresentados como: média ± erro padrão.
Na Figura 3 pode-se observar a regeneração de gemas e
iniciação dos brotos após a adição de BAP ao meio de cultura. É possível
observar também a oxidação na base do calo, o que não veio prejudicar a
emissão de brotos.
FIGURA 3 – DETALHES DA REGENERAÇÃO in vitro DE GEMAS E
BROTOS
DE
Cochlospermum
regium.
(A)
REGENERAÇÃO AOS 28 DIAS DE CULTIVO in vitro. (B)
REGENERAÇÃO AO FINAL DO CULTIVO, AOS 49 DIAS
(SETA). BARRA: 1 cm. FOTO: NATÁLIA HELENA
GAVILAN (2015).
A presença de gemas adventícias foi evidenciada através da
análise histológica, vindo a confirmar a ação do TDZ para a regeneração
de brotos em calos cultivados in vitro de Cochlospermum regium (Figuras
4A e 4B). Essas gemas adventícias originadas dos tecidos do calo
57
indicam a formação de parte aérea, efeito importante para a obtenção de
plantas por meio de organogênese indireta.
FIGURA 4 – CORTES HISTOLÓGICOS DE CALOS de Cochlospermum
regium REGENERADOS in vitro AOS 49 DIAS DE
CULTIVOS. (A) E (B) DETALHES DA FORMAÇÃO DE
GEMAS. BARRA: 50 µm.
3.5 DISCUSSÃO
O processo de organogênese indireta sob condições in vitro é
caracterizado como um evento complexo, com atuação de múltiplos
fatores externos e internos que envolvem a interação entre fonte de
explante, meio de cultura, fatores ambientais, além da ação de
reguladores de crescimento, e da habilidade do tecido em responder a
essas mudanças hormonais durante o período de cultivo (OLIVEIRA et al.,
2013; ALVES et al., 2004).
Inácio et al. (2011) ao avaliar o tipo de explante para a
organogênese de C. regium, observaram que tecidos do hipocótilo
apresentaram maior indução de calos. No entanto, a indução de
brotações foi menor, quando comparada com explantes cotiledonares, em
que a indução da calogênese foi elevada, assim como a indução de
brotações.
Resultados semelhantes também foram observados por
Oliveira (2014) ao estudar a organogênse indireta em E. cloeziana, onde
foi relatado que ambos os explantes (hipocótilo e cotilédone) foram
responsivos, no entanto, explantes cotiledonares apresentaram maior
58
potencial organogênico em comparação aos de origem do hipocótilo.
Esses resultados discordam dos encontrados no presente estudo com C.
regium, onde explantes de origem do hipocótilo foram mais responsivos, o
que pode ser explicado devido a elevada competência celular desse tipo
de tecido.
Dentre os reguladores de crescimento mais utilizados para a
indução de calo em tecidos vegetais destacam-se o thidiazuron (TDZ)
(LAMEIRA et al., 1997) e o 2,4-D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético)
(NOGUEIRA et al., 2007). No entanto, neste trabalho, o regulador de
crescimento ANA (ácido naftaleno acético) foi o mais responsivo, assim
como observado em testes realizados em cupuaçu, onde a adição de
ANA ao meio de cultura aumentou a eficiência da indução de calos
(VELHO et al., 1988; FERREIRA et al., 2001; VENTURIANI e
VENTURIANI, 2004). O ANA e o 2,4-D apresentam ação de auxina e são
capazes de iniciar a divisão celular e controlar os processos de
crescimento e alongamento celular (NOGUEIRA et al., 2007), efeito esse
que pode favorecer a indução de massas calogênicas em determinadas
condições in vitro (GEORGE et al., 1993).
Quanto ao fato de explantes submetidos à calogênese com o
uso de TDZ terem sido os únicos responsivos à regeneração de brotos,
pode-se justificar devido ao efeito residual durante a fase de indução
(OLIVEIRA, 2014). Esse fitorregulador induz a formação de gemas
adventícias e embriões somáticos em maior frequência do que em
tratamentos a base de auxina-citocinina (RADICE, 2010; ASGHAR et al.,
2013).
A presença de células pró-embrionárias visualizadas na análise
histológica dos calos confirmou a eficiência do TDZ no favorecimento da
embriogênese. Enquanto que para a regeneração de brotos, a análise
evidenciou a indução de primórdios foliares, confirmando as observações
visuais (por meio da morfologia externa) e as comprovadas pela análise
estatística.
Em E. globulus a maior frequência de regeneração de brotos
foi verificada nos tratamentos que associaram BAP e TDZ (AZMI et al.,
1997), corroborando os resultados para C. regium.
59
Em virtude desses resultados, fica evidente a necessidade do
desenvolvimento de estudos em relação a rota organogênica para a
espécie C. regium, para que se possa estabelecer o balanço adequado de
auxina/citocinina para a regeneração de brotos in vitro.
Outro fator que deve ser estudado é o tempo de cultivo para a
indução de gemas e desenvolvimento das brotações. E espécie em si,
necessita de muito tempo de cultivo in vitro (inúmeros subcultivos) para
apresentar resposta organogênica a um determinado estímulo químico, o
que poderia vir a aumentar a proliferação de gemas e favorecer o
desenvolvimento de brotos.
Em termos gerais foi possível comprovar a viabilidade da
organogênese indireta em C. regium, contudo esse evento deve ser
aprimorado a para elaboração de protocolos futuros visando adequação
em sistemas de produção de mudas ou para a obtenção de determinados
tipos de órgãos.
3.6 CONCLUSÕES
Todos os fitorreguladores e explantes testados induziram à
calogênese, sendo a associação entre o 2,4-D e explante do tipo
hipocótilo foram os mais responsivos.
O TDZ quando associado à explantes de origem do hipocótilo
foi o único que resultou em regeneração de brotos.
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