Ana Ruth Silva de Araújo
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UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL DOUTORADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE ADAPTATIVA AO HCV DE PACIENTES COM HEPATITE C CRÔNICA ANTES E DURANTE O TRATAMENTO COM INTERFERON ALFA E RIBAVIRINA. ANA RUTH SILVA DE ARAÚJO MANAUS 2010 i ANA RUTH SILVA DE ARAÚJO CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE ADAPTATIVA AO HCV DE PACIENTES COM HEPATITE C CRÔNICA ANTES E DURANTE O TRATAMENTO COM INTERFERON ALFA E RIBAVIRINA. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas – UEA, em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado – FMT-HVD, como requisito para obtenção do título de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas. Orientadora: Profª. Dra. Adriana Malheiro Co-Orientador: Prof. Dr. Sinésio Talhari MANAUS 2010 Ficha Catalográfica A663c Araújo, Ana Ruth Silva de Caracterização da resposta imune adaptativa ao HCV de pacientes com hepatite C crônica antes e durante o tratamento com interferon alfa e ribavirina / Ana Ruth Silva de Araújo. -Manaus: Universidade do Estado do Amazonas, 2010. xv, 100f. : il. Tese (Doutorado) - Universidade do Estado Amazonas Programa de Doutorado em Doenças Tropicais e Infecciosas, 2010. Orientadora: Profª. Drª.Adriana Malheiros. Coorientador: Dr. Sinésio Talhari. 1. Hepatite C 2. Interferon 3. Ribavirina 4. Citocinas. I. Malheiros, Adriana II. Talhari, Sinésio III. Título. CDU: 616.91/97(043) Ficha catalográfica elaborada por Maria Eliana N. Silva – CRB- 11/248 ii FOLHA DE JULGAMENTO CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE ADAPTATIVA AO HCV DE PACIENTES COM HEPATITE C CRÔNICA ANTES E DURANTE O TRATAMENTO COM INTERFERON ALFA E RIBAVIRINA. ANA RUTH SILVA DE ARAÚJO “Esta Tese foi julgada adequada para obtenção do Título de Doutor em Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo programa de PósGraduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas, em convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”. Banca Julgadora: _________________________________ Profª. Adriana Malheiro, Dra. Presidente ___________________________________ Prof. Alex Vianey Calado França, Dr. Membro _________________________________ Prof. Luiz Carlos de Lima Ferreira, Dr. Membro ___________________________________ Profª. Maria Cristina dos Santos, Dra. Membro ____________________________________ Profª. Maria Paula Gomes Mourão, Dra. Membro iii DEDICATÓRIA Aos meus pais, Pedro e Ruth Aos meus filhos, Fernando e Mônica, todo o meu amor iv AGRADECIMENTOS À minha mãe, pelo carinho e apoio incondicional em todos os momentos e ao meu pai pelo exemplo de perseverança e determinação. Aos meus filhos, Mônica e Fernando, pela compreensão e força para continuar, aguentando firmes as minhas ausências e me ajudando, tantas vezes, apenas com um sorriso e um abraço. Aos pacientes, que, embora sofrendo, entenderam a importância de sua contribuição para a pesquisa científica, tendo participado deste estudo com disciplina e boa vontade. À minha orientadora, Dra. Adriana Malheiro, pela orientação nesta pesquisa. Ao Dr. Sinésio Talhari, pelas correções inteligentes e objetivas. À Gina, pelo apoio fundamental para concretização deste trabalho, além do exemplo de vida, coragem e ética que representa. À minha irmã Iara, pela sua fé e alto astral, com que sempre se pode contar. Ao Rodopho, meu filho de coração, pela dedicação e esforço, quando eu mais precisei de ajuda na faculdade de Medicina. Ao Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais e Infecciosas da Universidade do Estado do Amazonas e a todos os seus integrantes, em especial à Dra. Graça Barbosa e à Conceição, pela oportunidade de concretização deste trabalho. À SUFRAMA, pelo suporte financeiro ao Programa de Pós-Graduação em Doenças Tropicais e Infecciosas. À Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM), pela contribuição através do ambulatório de hepatites, onde foi possível a construção do nosso banco de dados e acompanhamento dos pacientes. À Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (FHEMOAM), pela realização de exames de citometria de fluxo e ELISA. Ao Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMT-SP), na pessoa do Dr. José Eduardo Levi, por ceder o laboratório para processamento de amostras do HCV. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo apoio financeiro ao projeto. v Aos queridos professores da FMT-AM Dr. Luiz Ferreira Dr. Silas Guedes e Dr. Araújo. Às funcionárias competentes e amigas da FMT-AM, Conceição, Waldirene, Liane, Sarah e Rosana, pelo carinho e atenção. Ao estatístico Edson da Fonseca de Lira, da FHEMOAM, pelas contribuições nas análises dos resultados. Aos professores, funcionários e amigos da UFAM, especialmente Antonino, Tavares, Rodrigo, Miralha e Alline por respeitarem e apoiarem o trabalho na faculdade de Medicina durante esse período de mudanças primordiais no curso e na minha formação acadêmica. Aos amigos e colegas do grupo de pesquisa da FHEMOAM: Andréa, Kátia, Tatiane, João Paulo, Laura, Liziara e Walter, que, de diversas formas, contribuíram com esta pesquisa. Aos amigos da Fundação de Vigilância em Saúde (FVS), Alfredo, Andréa, José de Jesus, Joaquim, Margareth e tantos outros. Ao Professor José Carlos Fonseca, pelo encaminhamento de pacientes. Ao Professor Fernando Ferreira (In Memoriam), mestre e amigo, que me incentivou e me ajudou a abraçar a hepatologia. A uma família especial que conheci nesse caminho: Naíza, Edvaldo, Nádia, Naiana e Thiago, pelo exemplo de união e fé. Aos meus alunos Anthony e Izabella, pelo interesse pela hepatologia. Ao laboratório Roche, especialmente aos amigos Ed, Rafael, Gabi, Fábio, Cavalcante, Salomão e Flávio. Ao poeta Dori Carvalho, pelo amor. A todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a concretização deste sonho. vi RESUMO A infecção pelo HCV está estimada em mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo, correspondendo a mais de 3% de toda a população mundial. Até o momento, identificaram-se 6 genótipos do vírus, além de múltiplos subtipos: 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 e 6. A determinação do genótipo relacionado a cada indivíduo é importante por apresentar valor preditivo em termos de resposta à terapia antiviral, com melhor resposta associada aos genótipos 2 e 3 do que ao genótipo 1. A resposta imune celular parece desempenhar um papel crucial no controle da hepatite C crônica. Durante a terapia combinada, as respostas imunológicas celulares podem contribuir para o sucesso ou falha terapêutica. O objetivo desse trabalho foi fazer a caracterização da resposta imune adaptativa ao HCV de pacientes com hepatite C crônica, antes e durante o tratamento com interferon alfa 2a e ribavirina. Foram estudados 14 pacientes com hepatite C crônica atendidos na FMT-AM, no pré-tratamento, 4a, 12a e 24a semanas após o início do tratamento. O genótipo e a carga viral foram determinados por biologia molecular, o perfil celular foi analisado por citometria de fluxo e as citocinas foram dosadas por ELISA. Os dados demonstraram que 78% dos pacientes apresentavam genótipo 1, e 22%, o 3. Todos os pacientes apresentaram diminuição dos níveis séricos de ALT na 4a semana após o tratamento. Após o início do tratamento, foi observado leucopenia, que se manteve até a 24a semana. Observou-se aumento de células TCD4+ na semana 4, com diminuição na 12a e 24a semanas após o início do tratamento. Esta diminuição também foi observada para LTCD8+ nas semanas 12 e 24. Houve aumento crescente da IL-12 a partir da 4a semana, mantendo-se elevada nas semanas 12 e 24. Não foram observadas diferenças estatísticas significativas em relação a IL-4, IL-5, IL-8, IL-10 e IFN-γ. Observou-se aumento significativo da expressão da molécula CD69 (marcador de ativação celular) em linfócitos, na 4a semana, com diminuição na 12a, se mantendo-se baixa até a semana 24. Houve diferenças significativas de CD69 em eosinófilos, neutrófilos e em monócitos nas diferentes semanas. De acordo com os resultados encontrados, sugere-se que o tratamento parece induzir a produção da IL-12, que desempenha importante papel no direcionamento da resposta imune para o perfil Th1, induzindo aumento de LTCD4+ no início do tratamento e ativação celular. Não foi observado aumento de IFNγ, o que corrobora com a idéia da diminuição de LTCD4+ e CD8+ após a 12a semana, sugerindo que esta citocina seria importante para a manutenção deste perfil de resposta imune. Palavras-chaves: Hepatite C, interferon, ribavirina, reposta imune, citocinas. vii ABSTRACT Hepatitis C virus affects an estimated 200 million people worldwide, which corresponds to 3% of the world population. Six virus genotypes, and several subtypes, have been found so far: 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5, and 6. Genotype identification for each individual is important inasmuch as it is predictive as regards responses to antiviral therapy. Genotypes 2 and 3 respond better than genotype 1. Cellular immune response has been a crucial role in the control of chronic C-hepatitis. Cellular immunological responses may contribute to the success or failure of combined therapies. The objective of this study was a molecular characterisation of HCV, while describing the immunological profile of chronic C-hepatitis patients, before and during treatment with alpha 2A interferon and ribavirin. The sample of the 14 patients from FMT-AM were study before the beginning of treatment and on the 4th, 12th, and 24th weeks after the treatment. It identifies genotype and viral load through molecular biology, analyses cellular profile through flux cytometry, and measures cytokines through ELISA. Collected data show that 78% of the patients had genotype 1, while 22% had genotype 3. All patients underwent a reduction of ALT concentration on the 4th week after beginning of treatment. There occurs a remarkable decrease of the leuKocytes until the 24th week after beginning of treatment. There is a remarkable growth of TCD4+ on the 4th week, with a subsequent decrease on 12th and 24th weeks after treatment begins. A similar LTCD8+ decrease takes place on 12th and 24th weeks. IL-12 gradually grows from the 4th week onwards, keeping at high level on the 12th and 24th weeks. There is no remarkable statistical difference regarding IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, and IFN-γ. There is a remarkable increase in CD69 expression (a cellular activation marker) in lymphocytes on the 4th week, which in turn decreases on the 12th, keeping at a low level until the 24th week. There are significant CD69 differences in eosinophils, neutrophils, and monocytes for several weeks. The final results suggest that treatment seems to induce the production of IL-12, which plays an important role in directing an immune response toward a Th1 profile, inducing an increase of LTCD4+ and cellular activation at the beginning of treatment. Meanwhile there is no remarkable increase of IFN-γ, which suggests that this would be an important cytokines for the maintenance of such an immune response profile. Keywords: C-hepatitis, interferon, ribavirin, immune response, cytokines. viii LISTA DE FIGURAS – TESE Figura 1. Fluxograma de inclusão de pacientes no estudo.................. 22 Figura 2. Sequência de procedimentos utilizados para as análises dos percentuais de populações celulares por citometria de fluxo....................................................................................... 26 Figura 3. Árvore filogenética de uma amostragem de indivíduos portadores do HCV, com as sequências representadas para os genótipos 1, 2 e 3.................................................... 36 ix LISTA DE FIGURAS – ARTIGO III Figura 1. Concentração de hemoglobina, hematócrito, percentual leucócitos totais e concentração de ALT de pacientes com hepatite C crônica, submetidos a tratamento com interferon alfa 2a peguilado associado à ribavirina............ 70 Figura 2. Percentual de linfócitos TCD3+/CD4+ (A) LTCD3+/CD8+ (B) no sangue periférico de pacientes com hepatite C crônica, tratados com interferon alfa 2a peguilado associado à ribavirina......................................................... 71 Figura 3. Análise da concentração das citocinas IL-12, IFN-У e IL10 e IL-8 no sangue periférico de pacientes com hepatite C crônica tratados com interferon peguilado alfa 2a associado à ribavirina.......................................................... 73 Figura 4. Análise da concentração das citocinas IL-4, IL-5 e IL-8 no sangue periférico de pacientes com hepatite C crônica tratados com interferon peguilado alfa 2a associado à ribavirina............................................................................... 74 Figura 5. Análise das citocinas IL-6 e TNF-α no sangue periférico de pacientes com hepatite C crônica, tratados com interferon peguilado alfa 2a associado à ribavirina............ 75 Percentual de leucócitos ativados, marcados com CD69, linfócitos CD69+ (A), eosinófilos CD69+ (B), monócitos CD69+ (C) e neutrófilos CD69+ (D) no sangue periférico de pacientes com hepatite C crônica, tratados com interferon peguilado alfa 2a associado à ribavirina............ 76 Figura 6. x LISTA DE QUADROS – TESE Quadro 1. Gradiente de temperatura no termociclador .......................... 29 Quadro 2. Sequência de nucleotídeos dos iniciadores HC11 e HC18 ... 30 Quadro 3. Programa utilizado no termociclador para a reação de amplificação por PCR ............................................................ 30 Quadro 4. Programa utilizado no termociclador Mastercycler Gradient – Eppendorf para a primeira reação do Nested-PCR ............ 31 Quadro 5. Sequência de nucleotídeos iniciadores P32, P36, P33 e P48 Quadro 6. Programa utilizado no termociclador para a segunda reação do Nested-PCR ...................................................................... 32 32 xi LISTA DE TABELAS – ARTIGO II Tabela 1. Distribuição dos genótipos do Vírus da Hepatite C em pacientes com Hepatite C crônica .................................... 52 xii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CEP Comitê de Ética em Pesquisa CD Cluster Differentiation (Linhagem de Diferenciação Celular) CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico DNA Ácido Desoxirribonucléico D0 Dia 0 da Pesquisa (antes do início do tratamento) – Base Line EDTA Etilenodiaminotetraacetato (anticoagulante para coleta de sangue) ELISA Enzyme Linked Imunnesorbant Assay (Ensaio Imunoenzimático) FAPEAM Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas FHEMOAM Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas FMTAM Fundação de Medicina Tropical do Amazonas FVS Fundação de Vigilância em Saúde HCV Vírus da hepatite C IL Interleucina IL 2 R IL 2 Recombinante IL 10 R IL 10 Recombinante INF Interferon NK Célula Natural Killer NKT Célula Natural Killer T PCR Reação em Cadeia de Polimerase RBV Ribavirina RNA Acido Ribonucléico RT-PCR Reação em Cadeia de Polimerase por Transcriptase Reversa RVP Resposta virológica precoce RVR Resposta virológica rápida RVS Resposta virológica sustentada TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido TH1 Linfócito T Auxiliar do Tipo 1 TH2 Linfócito T Auxiliar do Tipo 2 TNF-ALFA Fator de Necrose Tumoral Alfa UEA Universidade Estadual do Amazonas xiii SUMÁRIO 1 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.6.1 1.6.2 1.6.3 1.6.4 1.6.5 1.6.6 1.7 INTRODUÇÃO.................................................................................... O vírus da hepatite C.......................................................................... Impacto e epidemiologia da infecção pelo HCV................................. História natural e quadro clínico da hepatite C................................... Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HCV.................................. Manejo clínico da hepatite C............................................................... Imunidade ao HCV e suas implicações terapêuticas........................ Interação vírus-hospedeiro.................................................................. Resposta imune celular....................................................................... Resposta imune humoral. Citocinas e regulação da reposta imune Evasão à resposta imune.................................................................... Dano tecidual e apoptose.................................................................... Perfil imunológico do hospedeiro e resposta terapêutica................. Perspectivas atuais de pesquisa sobre o HCV................................... 1 1 2 4 5 6 9 9 10 12 14 15 16 18 2 2.1 2.2 OBJETIVOS........................................................................................ Geral................................................................................................... Específicos.......................................................................................... 20 20 20 3 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.8.1 3.8.2 3.8.3 3.8.4 3.8.5 3.9 3.9.1 3.9.2 3.9.3 3.9.4 3.9.5 3.9.6 3.9.7 3.9.8 3.9.9 3.9.10 3.10 3.11 3.12 MATERIAL E MÉTODOS................................................................... Modelo do estudo................................................................................ Descrição da área do estudo.............................................................. População de estudo e amostragem.................................................. Critérios de inclusão e exclusão......................................................... Esquema terapêutico.......................................................................... Seguimento do estudo........................................................................ Avaliação clínica................................................................................. Avaliação laboratorial.......................................................................... Procedimento para coleta de sangue periférico................................. Perfil hematológico de sangue periférico............................................ Perfil bioquímico de sangue periférico................................................ Análise celular em sangue periférico por citometria de fluxo.......... Perfil imunológico de citocinas no sangue periférico....................... Técnicas moleculares do HCV............................................................ Extração do RNA do plasma............................................................... Síntese de DNA complementar (cDNA).............................................. Reação em cadeia de polimerase (PCR)............................................ Nested PCR........................................................................................ Purificação dos produtos amplificados............................................... Semi-quantificação dos produtos purificados.................................... Reação de sequenciamento e purificação do produto Sequenciamento................................................................................. Análise das sequências....................................................................... Determinação da carga viral............................................................... Ultrasonografia.................................................................................... Biópsia hepática.................................................................................. Metodologia estatística........................................................................ 21 21 21 21 22 23 23 24 24 24 25 25 25 27 28 28 29 29 31 33 34 34 35 35 36 37 37 38 xiv 3.13 Aspectos éticos................................................................................... 38 4 4.1 RESULTADOS.................................................................................... Artigo 1 : Resposta virológica sustentada em paciente com co-infecção pelos genótipos 1 e 2 do vírus da hepatite C, com apenas nove semanas de terapêutica antiviral: Relato de caso ........ Artigo 2: Genótipos do vírus da hepatite C em pacientes com hepatite C crônica, Manaus, Brasil...................................................... Artigo 3: Perfil imunológico celular e humoral de pacientes com hepatite C crônica tratados com interferon alfa e ribavirina............... 39 5 DISCUSSÃO...................................................................................... 87 6 CONCLUSÕES................................................................................... 95 6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................... 96 7 ANEXOS.............................................................................................. 102 4.2 4.3 40 48 58 1 1. INTRODUÇÃO 1.1 O vírus da Hepatite C O vírus da hepatite C (HCV) é uma das principais causas conhecidas de doença hepática crônica em todo o mundo. A prevalência da infecção pelo HCV é estimada em torno de 3% de toda a população mundial, ou seja, aproximadamente 170 a 210 milhões de pessoas em todo o mundo 1. O HCV foi identificado por Choo e colaboradores em 1989, na Chiron Corporation, na Califórnia, ao investigarem a etiologia da hepatite “não-A, nãoB”. Aqueles autores conseguiram clonar o genoma viral do HCV, isolando ácido desoxirribonucléico (DNA) complementar a partir de soro humano que continha uma fita positiva de ácido ribonucléico (RNA). As pesquisas de tratamentos para a hepatite C aumentaram quando, em 1989, este vírus foi isolado e identificado como o principal responsável pelas hepatites pós-transfusionais “não-A não-B” 2. O HCV é o único representante do gênero Hepacivirus, incluído na família Flaviviridae. É um pequeno vírus com cerca de 30 a 60 nm de diâmetro e apresenta um genoma de RNA linear com hélice única e positiva, cuja organização assemelha-se a de outros flavivírus, como o vírus da dengue 3. Seu genoma contém 9400 nucleotídeos, possuindo uma única fase de leitura aberta (open reading frame), que codifica uma poliproteína de pouco mais de 3000 aminoácidos, contendo uma região estrutural e uma nãoestrutural. Estas regiões são clivadas por proteases, liberando as proteínas estruturais e não estruturais do vírus 4. A região estrutural localiza-se na porção aminoterminal, codificando a proteína core do nucleocapsídeo viral (proteína C, com cerca de 19 kD) e as glicoproteínas E1 (gp33) e E2 (gp72), constituintes do envelope viral. Esta região do genoma representa a sequência mais altamente conservada, sugerindo um papel regulador durante a replicação viral [3]. As proteínas não 2 estruturais NS2, NS3, NS4A, NSB, NS5A e NS5B representam a extremidade carboxiterminal do genoma viral 5. Identificaram-se 6 genótipos de HCV, distintos mas relacionados, além de múltiplos subtipos, por meio de correlações moleculares: 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 e 6. A determinação do genótipo relacionado a cada indivíduo é importante por apresentar valor preditivo em termos de resposta à terapia antiviral, com melhor resposta associada aos genótipos 2 e 3 do que ao genótipo 1 4. Como ocorre com todos os RNA-vírus, falta à polimerase do HCV, uma função de leitura de prova (proof-reading function). Isto permite que, no curso de infecção persistente, a replicação viral propensa a erros gere um repertório de variantes virais altamente relacionadas, mas geneticamente distintas, ou quasispécies. Esta variabilidade genética concede ao HCV um notável potencial adaptativo, tendo sido implicado com a evasão e controle da resposta do hospedeiro à infecção e a uma sensibilidade diferencial à terapia com Interferon 6. 1.2 Impacto e epidemiologia da infecção pelo HCV A hepatite C é considerada um grave problema de saúde pública pela alta incidência na população e por sua evolução silenciosa para doença crônica que compromete a qualidade de vida e a sobrevida dos pacientes 7. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) estima-se que 170 milhões de pessoas em todo o mundo estejam infectadas pelo HCV8. Dados mais recentes sugerem que o HCV seja responsável pela infecção de cerca de 200 milhões de pessoas em todo o mundo afetando indivíduos de ambos os sexos e de todas as idades e etnias 9. A infecção pelo HCV causa em torno de 100.000 casos anuais de câncer hepático e índice semelhante de hemorragias digestivas altas 10 , causando, também, grande impacto e significante mortalidade e constituindo a causa mais comum de transplante hepático em adultos 11, 12. 3 Dados de triagem sorológica da Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas (HEMOAM) revelam que 0,32% dos doadores apresentam soropositividade para o HCV. No entanto, constitui sub-estimativa, ao desconsiderar populações de risco, as quais devem ser descartadas na triagem clínica antes da doação como encarcerados e outros indivíduos institucionalizados, usuários de drogas injetáveis e etc 13. A transmissão do HCV se dá essencialmente por via sanguínea, constituindo fatores de risco o uso de drogas ilícitas injetáveis, hemotransfusões e lesões cutâneas em profissionais de saúde14. Devido à transmissão predominantemente parenteral, os grupos que apresentam maior prevalência da infecção são os que estiveram expostos a transfusões de sangue ou hemoderivados ou a transplantes de órgãos ou tecidos antes de 1992, quando o teste para a pesquisa do anti-HCV passou a ser rotina nos bancos de sangue. Considerando relatos de maior prevalência, o risco parece ser ainda maior em hemofílicos, usuários de drogas injetáveis, portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV), portadores de doença renal crônica submetidos à hemodiálise, indivíduos com vida sexual promíscua e indivíduos expostos a outras potenciais fontes de contaminação parenteral, como tatuagens, acupuntura ou piercings 4, 14. Na cidade de Manaus, em um estudo do perfil epidemiológico de 231 pacientes com hepatite C, Araújo e cols, 2007 demonstraram que houve predominância absoluta das formas crônicas e que os principais fatores de risco associados à ocorrência de hepatite C foram transfusão sanguínea e história de cirurgia prévia 15. A medida preventiva que mais efetivamente diminuiu o risco de transmissão do HCV em larga escala foi a triagem sorológica para o HCV nos hemoderivados, a partir de sua utilização rotineira pelos bancos de sangue na maioria dos países do mundo no início da década de 1990 4. Esta medida permitiu reduzir drasticamente o risco de transmissão associada aos hemocomponentes, sendo estimada em quase 50% menor que para o vírus da hepatite B (HBV) e 5 vezes maior que para o HIV. A inativação de produtos 4 sanguíneos e o uso sistemático de seringas e agulhas descartáveis também são medidas eficazes de prevenção 12 . Não há vacina disponível para o HCV até o momento 16. Uma das características mais importantes do HCV é a sua heterogeneidade genética. De acordo com o sistema de classificação de Simmonds (1993), um total de seis genótipos são reconhecidos e denominados de 1 a 6, e os seus correspondentes subtipos designados por letras (1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 4a, 5a, 6a). Os diferentes genótipos estão associados a alguns aspectos relativos à infecção, como distribuição geográfica, patogenia e resposta ao tratamento com INF 17. No Brasil, o genótipo 1b ocorre com maior frequência na população de doadores de sangue, sendo também encontrados em outros grupos os subtipos 1a, 2a, 2b e 3 [13]. Recentemente, foram detectados os subtipos 4 e 5 no Brasil 18. 1.3 História natural e quadro clínico da hepatite C Na grande maioria das vezes a doença apresenta-se de forma assintomática, oligossintomática ou associada a sintomas inespecíficos, sendo portanto difícil avaliar a história natural da hepatite C bem como definir o diagnóstico na fase aguda ou no início da infecção crônica. Geralmente o diagnóstico é acidental, ocorrendo, algumas vezes, durante triagem sorológica para doação de sangue e exames médicos de rotina ou, ainda, durante as recentes campanhas de detecção da hepatite C 17 . Mesmo quando presentes, os sintomas podem ser os mesmos da hepatite aguda com dor abdominal, febre, icterícia, mal-estar, náuseas e vômitos ou apresentar-se de forma leve e inespecífica com fadiga, náuseas, anorexia, mialgia e artralgias 4,17. Aproximadamente 80 a 90% dos indivíduos agudamente infectados pelo HCV desenvolvem persistência viral e, consequentemente têm maior risco de desenvolver cirrose hepática e carcinoma hepatocelular enquanto uma pequena porção dos pacientes (10 a 20%) elimina o vírus 6, 18 . Acredita-se que 5 a capacidade de resolver a infecção aguda é determinada pela competência das respostas inata e adaptativa do hospedeiro e que seria necessária uma vigorosa e sustentada resposta imune para exercer este controle eficazmente 19 . Uma vez estabelecida a infecção crônica, a possibilidade de ocorrer eliminação viral espontaneamente é remota. Cerca de 50 a 85% dos casos de infecção pelo HCV evoluem para a infecção crônica 20 , desencadeando, a longo prazo, complicações como a fibrose hepática, cirrose e o carcinoma hepatocelular 1, 4. Estima-se, ainda, que 20% dos pacientes portadores crônicos de HCV desenvolverão cirrose hepática após 20 anos de doença, elevando o risco de desenvolver carcinoma hepatocelular9. A velocidade com que a doença progride é variável e está relacionada a fatores que interferem na progressão da fibrose hepática, como a idade mais avançada ao contrair o HCV, o consumo de álcool e as co-infecções com outros vírus, como o HIV e o HBV 21. Além da doença hepática, há importantes manifestações extra-hepáticas da infecção pelo HCV, sendo a maioria destas síndromes associadas a estados autoimunes ou linfoproliferativos, provavelmente em consequência da replicação do HCV em células linfóides 4. A principal delas é a crioglobulinemia mista (90% dos pacientes são HCV RNA positivos); nos casos sintomáticos e/ou associados à glomerulopatia membranoproliferativa ou linfomas nãoHodgkin está indicado o tratamento da infecção pelo HCV, mesmo que não exista doença hepática significativa. Nesses casos a supressão da viremia frequentemente vem acompanhada de melhora do quadro extra-hepático 21 . Outras doenças associadas ao HCV são o líquen plano e a porfiria cutânea 14. 1.4 Diagnóstico laboratorial da infecção pelo HCV A detecção do HCV é de crucial importância para o controle da doença em nível global, sendo que mesmo em países desenvolvidos, o número de mortes tende a continuar aumentando devido à inadequada detecção, o que posterga o tratamento 10. 6 Esta detecção é baseada em dois tipos de testes: os ensaios sorológicos para detecção de anticorpos específicos e os testes moleculares para detecção de partículas virais. Especificamente em relação aos testes moleculares, a determinação da carga viral permite avaliar a evolução da resposta terapêutica, enquanto a genotipagem prediz a resposta e influencia no regime de tratamento escolhido 4. A avaliação virológica do HCV depende de uma série de ensaios que são essenciais para o diagnóstico e para a conduta terapêutica, sendo esses ensaios classificados em 3 grupos: ensaios dirigidos à detecção de anticorpos específicos contra o HCV; técnicas que detectam e quantificam a carga viral; e testes que determinam o tipo de HCV infectante. O teste de detecção do HCVRNA seria particularmente útil naqueles pacientes que apresentam sorologia negativa para o HCV - anti-HCV negativo 22. Por sua vez, Pawlotsky, 2003, ao analisar a utilidade dos 4 marcadores biológicos para o HCV: anticorpos anti-HCV, HCV-RNA, HCV antígeno core e genótipo do HCV, ressalta que a hepatite C, tanto aguda quanto crônica, é diagnosticada pelo ensaio imunoenzimático ou enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA Anti-HCV) e pelo HCV-RNA, com sensível técnica de biologia molecular 23 . Além disso, o autor defende a utilização de ferramentas como a determinação do genótipo e a quantificação do HCV-RNA, especialmente para guiar a escolha terapêutica individual e para monitorar a resposta à terapia 23. 1.5 Manejo clínico O HCV é notadamente bem sucedido, produzindo uma infecção persistente que continuará por toda a vida do indivíduo, com vastas oportunidades de transmissão dentro da população humana, a menos que interrompida por uma terapia baseada no interferon 6. Basicamente, o tratamento da hepatite C visa deter a progressão da doença hepática pela inibição da replicação viral 24 . Apesar do vírus permanecer latente em algumas células do organismo, é possível erradicá-lo 7 do sangue e do tecido hepático com as medicações disponíveis. A eficácia, entretanto, ainda é reduzida em muitos pacientes e o tratamento é de elevado custo, pouco específico e de difícil adesão 25. O protocolo terapêutico preconizado atualmente pelo Ministério da Saúde do Brasil que vai ao encontro das recomendações dos protocolos americano (NATIONAL INSTITUTES OF HEALTH, 2002) e europeu (EASL, 1999), inclui a administração de interferon alfa em associação com o antiviral ribavirina, que potencializa o efeito do primeiro 26. A monoterapia com interferon alfa foi a primeira alternativa terapêutica, aprovada em 1990. Contudo, associa-se a baixas taxas de resposta inicial (cerca de 40%) com taxa de resposta sustentada de menos de metade deste índice, principalmente em portadores de HCV genótipo 1a ou 1b, os mais prevalentes no ocidente e associados às piores taxas de resposta 4. A taxa de resposta virológica sustentada relaciona-se com a ausência de RNA viral após 6 meses de tratamento e com a regressão da fibrose 27 e oscilam na literatura mundial entre 33% e 37%. A falha do tratamento com IFN em erradicar a infecção é multifatorial, enquanto o sucesso terapêutico é determinado principalmente pela eliminação de células infectadas 20 . Segundo estudo de Kontouras, 2003, o efeito antiviral também poderia ser alcançado por meio da indução de apoptose 28. O interferon em formulação peguilada (peginterferon), associado à molécula de polietilenoglicol, que o torna mais pesado, dando-lhe meia-vida mais longa, pode ser administrado em esquema terapêutico que inclui a ribavirina, e apresenta maior eficácia em várias situações clínicas 29 , podendo gerar resposta terapêutica sustentada em torno de 50% dos pacientes 10, 30, 31. Tem sido sistematicamente descrita uma correlação entre o genótipo viral e a resposta terapêutica. Em 2003, Hugle e Cerny relataram que, para os genótipos 2 e 3, o IFN-peguilado, em combinação com a ribavirina, é eficaz em 80% dos casos 32. 8 Para os genótipos 2 e 3, em um ensaio clínico conduzido por Mangia et cols., 2005 demonstraram que um curso menor de 12 semanas de peginterferon e ribavirina seria tão eficaz quanto um esquema de 24 semanas. Estes dados evidenciam que o tratamento pode ser mais ou menos eficaz de acordo com o genótipo viral encontrado, sendo a resposta clínica melhor com os genótipos 2 e 3 quando comparada ao genótipo 133. Ainda em relação ao tratamento, é importante o acompanhamento da cinética viral pela reação em cadeia de polimerase por transcriptase reversa (RT-PCR). Pode-se fazer a confirmação da persistência do vírus pelo teste de PCR qualitativo e determinar a carga viral apresentada pelo paciente. O monitoramento destes dados influencia decisivamente na condução do tratamento de indivíduos com hepatite C crônica resposta ao tratamento 34, 35 e pode predizer a 10 . Os efeitos colaterais relacionados ao interferon, considerados muito comuns, com frequência acima de 30%, são: síndrome “influenza-like”, cefaléia, fadiga, febre, mialgia, trombocitopenia e indução de anticorpos; os efeitos comuns, com frequência entre 1% e 30%, são anorexia, eritema no local da aplicação, insônia, alopécia, dificuldade de concentração, irritabilidade, labilidade emocional, depressão, diarréia, indução de doença autoimune, leucopenia e alteração de paladar. Os efeitos colaterais considerados raros, com freqüência abaixo de 1%, são polineuropatia, paranóia, ideação suicida, diabetes, retinopatia, neurite óptica e alteração da audição. Quanto aos efeitos colaterais relacionados à ribavirina temos comumente: hemólise, anemia, náuseas, congestão nasal e prurido e, mais raramente, a gota 4. Em relação à terapêutica complementar ou adjuvante, o uso de fatores de crescimento hematopoiético poderia reverter alguns dos efeitos adversos das drogas incluídas no protocolo de tratamento e melhorar a qualidade de vida dos pacientes36. A administração de ácidos biliares foi relacionada à significante melhora das concentrações séricas de transaminases na hepatite C, mas não há evidência suficiente de efeito nos marcadores virais, na mortalidade, na histologia hepática ou na incidência de cirrose 37. 9 1.6 Imunidade ao HCV e suas implicações etiopatogênicas e terapêuticas 1.6.1 Interação vírus-hospedeiro O HCV é um vírus hepatotrópico, mas não diretamente citopático, que suscita resposta inflamatória que produz lesões hepáticas progressivas, e resultando, finalmente, efetivamente erradicado em doença hepática terminal, a menos que 19, 38 . A interação entre o hospedeiro e a hepatite C resulta na eliminação do vírus ou no estabelecimento da infecção crônica 39. mamíferos por vírus rapidamente desencadeia A infecção de células de eventos sinalizadores intracelulares que levam à produção de IFN alfa e beta, bem como a um estado celular antiviral que propicia uma barreira inicial à replicação e à disseminação viral. Contudo, o HCV evade a resposta imune por uma complexa combinação de interferência na sinalização celular do hospedeiro, na modulação de funções imunológicas efetoras e na variação genética contínua. Estas estratégias permitem a persistência viral no ser humano mesmo em pacientes imunocompetentes 6, 40 . Assim, a interação vírus-hospedeiro pode determinar a persistência viral, a extensão e a gravidade da inflamação hepática e, possivelmente, a hepato-carcinogênese 28. Tanto as respostas imunológicas celulares como humorais participam na defesa do hospedeiro contra a infecção pelo HCV, mas há crescente reconhecimento do papel da resposta celular e das citocinas na imunopatogênese da hepatite C crônica. Esta resposta celular depende da atividade de linfócitos T citotóxicos e auxiliares (helper) pela ação de citocinas reguladoras de macrófagos, célullas natural killer (NK) e proteínas celulares antivirais 41. A infecção crônica é induzida pelo HCV em 50 a 80% dos indivíduos infectados, sendo que a ineficiência do sistema imunológico em eliminar o vírus não é bem compreendida, já que o vírus induz resposta imune celular e humoral 42 . Então, o desfecho da infecção pelo HCV é determinado pela 10 interação entre o vírus e o sistema imunológico do hospedeiro, que responde com mecanismos efetores celulares, humorais e com citocinas, sendo que, na maioria das vezes, esses mecanismos são insuficientes para erradicar a infecção 43. Embora os fatores relacionados à eliminação viral espontânea ou o desenvolvimento de infecção persistente ainda não estejam bem definidos, um crescente número de estudos de associação genética tem revelado o impacto dos genes relacionados à imunidade na suscetibilidade da evolução da infecção pelo HCV 44. O HCV, como muitos outros vírus, vem desenvolvendo maneiras de subverter tanto a resposta imune inata quanto a resposta imune adaptativa do hospedeiro, para estabelecer a persistência da infecção. O sistema imune primeiramente tenta erradicar o vírus, entretanto, quando ocorre a infecção crônica, provavelmente promove dano hepatocitário e fibrose pela toxicidade celular direta e da relação com citocinas inflamatórias 45 . Diversos tipos de linfócitos citotóxicos, envolvidos no microambiente imune hepático, parecem estar na patogênese do dano hepático induzido pelo HCV. O dano hepático da infecção pelo HCV depende do balanço entre os mecanismos antivirais do hospedeiro e a “habilidade” do vírus de evadi-los 45. 1.6.2 Resposta imune celular A resposta imune na infecção pelo HCV pode desempenhar um importante papel nos vários estágios da infecção: existem evidências de que, durante a infecção aguda, a resposta imune celular tem um importante papel no controle da replicação viral nos pacientes que subsequentemente controlam a infecção 16 . A literatura é unânime em considerar como muito importante o papel desempenhado pelos linfócitos T no controle e no clareamento HCV 40, 46, 47, 19 . A erradicação espontânea do HCV durante a fase aguda da infecção requer uma resposta CD4+ e CD8+ contra múltiplos epitopos virais. Pacientes 11 que falham em desenvolver resposta vírus-específica ou aqueles que respondem mais tardiamente podem tornar-se cronicamente infectados pelo HCV 48,49. Uma vez estabelecida a infecção crônica, a resposta de células T específica é quantitativamente fraca, provendo apenas mínima pressão seletiva para mais mutações de escape 40, 50 . Sun et cols., 2004 referem que cada uma daquelas células T deve ter um papel específico no processo, e que o interferon gama intra-hepático, produzido por estas células, é importante para a ação antiviral daquelas células. Eles relatam que os interferons, alfa e beta, sozinhos, sem desencadear uma resposta celular T específica contra o HCV, podem não levar a uma resposta viral sustentada in vivo 51. Quanto ao papel de outras células na imunidade ao HCV, o sinergismo entre linfócitos T, células natural killer (NK) e células NKT (outro tipo de NK) é importante para a resolução da doença; possivelmente, a eliminação viral e o dano tecidual são causados por diferentes mecanismos efetores celulares Takehara & Hayashi, 2005 52 51 . referem que as células NK provêem ao hospedeiro uma primeira linha de defesa por sua habilidade de eliminar células transformadas e células infectadas por patógenos, sendo geralmente ativados numa fase precoce da infecção viral 53. O fígado é particularmente rico em células NK, que são ativadas por vírus hepatotrópicos como o HCV, desempenhando um papel crucial no recrutamento de células T HCV-específicas e na indução da atividade antiviral específica. Estas células podem eliminar hepatócitos infectados diretamente por citólise ou indiretamente pela secreção de citocinas, que induzem um estado antiviral nas células do hospedeiro. Assim, elas seriam importantes para limitar a replicação viral naquele órgão, ainda que também pudessem contribuir para o dano tecidual hepático durante a resposta imunológica 53. Vale ainda ressaltar que, recentemente, tem-se demonstrado que o HCV não somente infecta hepatócitos como também as próprias células do sistema 12 imune, linfócitos B e T, cujo resultado é a disfunção da resposta imune àquele vírus 54. 1.6.3 Resposta imune humoral. Citocinas e a regulação da resposta imune A produção de anticorpos é fundamental para a neutralização de partículas virais livres e para impedir a entrada do vírus nas células do hospedeiro. Por outro lado, apesar da existência de anticorpos neutralizantes, como aqueles que atuam contra a região E2 HVR, a resposta humoral é muito ineficiente, talvez pela rápida seleção de variantes de escape ou porque estes anticorpos falhem em induzir eliminação viral 40. Há evidência de que uma vigorosa resposta imune tipo 1 contra as proteínas virais torna-se necessária para a eliminação viral e que o recrutamento de tais efetores celulares para o fígado depende da atividade local de quimiocinas especificamente induzidas. Múltiplos fatores determinam a capacidade do HCV de sobreviver à resposta imune do hospedeiro, incluindo a habilidade de alterar o perfil de citocinas secretadas pelas células T e o poder de causar resistência aos efeitos de citocinas antivirais como o interferon 11. As citocinas produzidas no fígado são essenciais para defender o hospedeiro contra a infecção pelo HCV, mas elas também têm sido implicadas na lesão hepatocelular vista na maioria dos pacientes infectados cronicamente. Além disso, a infecção persistente perturba o equilíbrio entre citocinas imunoestimulatórias e inibitórias, o que pode prolongar a inflamação e levar a necrose, fibrose e doença hepática crônica 41,55. Alterações no balanço das citocinas da resposta Th1 como as interleucinas (IL-2, IL-12 e IL-18), citocinas pró-inflamatórias como as interleucinas (IL-1 e IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e citocinas da resposta Th2 (IL-4) e regulatória como a IL-10 no tecido hepático e no sangue periférico, podem contribuir para a persistência viral e lesão hepática crônica 56. 13 Citocinas imunorregulatórias desempenham um papel crucial na resposta do hospedeiro ao HCV. Enquanto as citocinas Th1 são necessárias para a resposta imune antiviral, citocinas Th2 podem inibir o desenvolvimento desses mecanismos efetores. Em seu estudo com 30 pacientes e 25 controles negativos, Abayali et cols., 2003 observaram que as concentraçoes de IL4 (Th2) e IL10 (regulatória), mas não IFN-У (Th1), estavam significativamente elevados em pacientes com hepatite C crônica quando comparados aos controles 57 . Um estudo de Torre et cols., 2004 descreve um papel central da IL10 ao orquestrar a resposta imune antiviral, sendo que seu declínio precoce pode favorecer uma mudança de reposta imune tipo Th2 para Th1, levando a uma resposta terapêutica sustentada 58. O TNF-α, citocina pró-inflamatória, é secretado pelos macrófagos e pelos linfócitos Th1, enquanto a IL-4 é secretada pelas células Th2 e descritas como citocina anti-inflamatória. O equilíbrio entre a imunidade Th1 e Th2 pode ser um fator determinante em muitas infecções virais ou não virais. Estudos prévios in vitro demonstraram que as concentrações de proteínas e mRNA de várias citocinas, incluindo as de resposta Th1 e Th2, de pacientes com hepatite C crônica eram significativamente mais altos que os controles. Estudos in vivo também demonstraram que as concentrações séricas de citocinas especialmente as Th2, de pacientes com hepatite C crônica estavam significativamente aumentadas 44. As células T regulatórias antígeno-específicas, que secretam interleucina 10 (IL-10), contribuem para a persistência viral, e as células mononucleares de pacientes com infecção crônica pelo HCV, secretam IL-10, mas não IFN-У em resposta às proteínas não estruturais do vírus 59 . Por outro lado, a resposta celular também predominantemente tipo 1 (Th1) exerce papel central no controle da replicação viral 60, 46. Uma nova família de citocinas relacionadas ao IFN tem sido descrita e designada como IL-29, IL-28A, IL-28B. Estas citocinas induzem a expressão de genes normalmente ativados pelo IFNα/β. Similar ao IFNα/β, a expressão da IL-29 é induzida pelos receptores Toll-like, que sinalizam a infecção viral, e é 14 altamente produzida pelas células dendríticas. Além disso a IL-29 possui atividade antiviral e inibe a replicação de vários vírus como o do herpessimples, o vírus da encefalomiocardite, o HBV e o HCV 61. 1.6.4 Evasão à resposta imune O HCV, como muitos outros vírus, vem desenvolvendo métodos de subverter a resposta imune inata e adaptativa do hospedeiro à infecção 45 .O sucesso da infecção pelo HCV está ligado à sua habilidade de evadir e antagonizar as respostas do sistema imune, além de resistir às ações antivirais da terapia baseada em interferon 6. O HCV evade o sistema imune por várias estratégias, por exemplo, a serina-protease NS3/4A, que bloqueia um fator de transcrição chave para iniciar a resposta celular ao interferon 51. Numa fase precoce da infecção aguda, o HCV continua a se replicar no fígado, sugerindo uma capacidade do vírus de inibir a resposta imune inata. Por outro lado, uma vez que se desenvolva a persistência, o vírus utiliza-se de múltiplas estratégias para subverter os vários efetores do sistema imune do hospedeiro 19. Vários mecanismos podem explicar a falha imunológica como a variação viral por geração de escapes mutantes que levam à persistência viral. Estudos da proteína E2 marcada por anticorpos também demonstraram evidências de seleção imunológica na infecção aguda 45 . A atenuação ou modulação de células T evidenciada, em modelos murinos, onde a alta carga viral leva a um processo de exaustão clonal. Esse processo pode ser acelerado na ausência funcional de células TCD4+, anticorpos neutralizantes ou citocinas como o IFNУ. Pode ocorrer, antes, uma perda transitória da capacidade de secretar IFN-У. Existem, ainda, evidências importantes do papel apresentação do antígeno e na indução da tolerância 45. do hepatócito na 15 Dados de Brady et cols., 2003 sugerem que o HCV subverte o sistema imune ao induzir a produção de IL10 e inibir a de IL12 pelos monócitos, o que por sua vez inibe a ativação de células dendríticas que levam à diferenciação de células Th1 59 . Estes dados corroboram o achado de Sarih et cols., 2000 que indicam que a produção diminuída tanto de IL12 quanto de interferon gama pode contribuir para a persistência viral 62. Dados sugerem que existe uma desregulação da população de células TCD4+ no sangue periférico com a produção inapropriada de citocinas aos antígenos virais contribuindo para a persistência viral e para a doença crônica. Entretanto, os resultados de diferentes estudos são conflitantes no que diz respeito ao predomínio de citocinas de resposta Th1 ou Th2 que resulta na inabilidade do hospedeiro de resolver a infecção pelo HCV 50. 1.6.5 Dano tecidual e apoptose O dano celular e a patogênese no fígado causado pela infecção crônica não estão totalmente esclarecidos 60 . Depois de estabelecida a infecção crônica pelo HCV, linfócitos citotóxicos podem exercer algum controle sobre a infecção viral. Entretanto, estes mesmos efetores são responsáveis pelo dano hepático progressivo, característico da hepatite C crônica 63 . Leroy et al., 2003 encontraram forte evidência do papel de células TCD8+ como efetoras de dano hepático e de sua incapacidade de controlar a replicação viral 60. A apoptose é um processo que parece contribuir como mecanismo de defesa contra infecções virais e tumorigênese. A modulação da apoptose pode envolver a ligação da proteína core do HCV com porções transdutoras de sinais intracelulares dos receptores apoptóticos e desarranjo de moléculas de sinalização. A apoptose pode, ainda ocorrer na ausência de elevação significante de transaminases, explicando assim a ausência de correlação entre atividade bioquímica e lesão hepatocelular. Além disso, o efeito antiviral do interferon poderia se dar pela indução da apoptose. Contudo, há evidência de que a apoptose representa mais um mecanismo para a proliferação viral do que para proteção 28. 16 O HCV exibe atividade tanto proapoptótica quanto antiapoptótica 7, 28 . Enquanto a indução da apoptose pode contribuir criticamente para o dano hepático, a inibição deste processo pode resultar em persistência viral e no desenvolvimento de carcinoma hepatocelular 7. Kanto & Hayashi, 2006 observaram que células TCD8+ HCV-específicas são elementos importantes para a eliminação viral ao induzir apoptose do hepatócito, no qual o antígeno fas/CD95 estaria envolvido 19. 1.6.6 Perfil imunológico do hospedeiro e resposta terapêutica Na fase crônica da infecção, a resposta imune potencialmente determina a taxa de progressão da doença tanto na limitação da replicação viral como por contribuir com a imunopatologia. Finalmente, durante a terapia combinada, a resposta imune celular pode contribuir para o sucesso ou para o fracasso do tratamento 16 . A restauração da concentração de citocinas também poderia contribuir para alcançar resultados terapêuticos na hepatite C crônica 64. O tratamento atual baseia-se na utilização do interferon peguilado associado à ribavirina em regimes individualizados na dose e duração, constituindo a abordagem de terapia guiada pela resposta (response guided therapy - RGT). O objetivo da terapia atual é a não detecção persistente do HCV seis meses após o término do tratamento, com a definição da Resposta Virológica Sustentada (RVS). Quando, durante a terapia, não ocorre a negativação ou ocorre recidiva após a não detecção ou término da terapia caracterizam-se os insucessos: a não resposta (NR) e a recidiva (REL), respectivamente. A não detecção do HCV na quarta semana da terapia constitui a Resposta Virológica Rápida (RVR), enquanto a não-detecção na 12ª semana da terapia constitui a Resposta Virológica Precoce completa (RVPc), sendo a redução em 2logs a Resposta Virológica Precoce parcial (RVPp) 65. Os fatores associados com a não-resposta ao tratamento são o genótipo viral, a carga viral, idade, sexo, grau de fibrose hepática e cirrose. Os fatores metabólicos também podem interferir na resposta ao tratamento. Pacientes 17 infectados com genótipo 3 e com esteatose apresentaram pior resposta ao tratamento quando comparados a pacientes sem esteatose. Estes achados corroboram a afirmação de que o diabetes, a obesidade e a resistência à insulina são descritos como fortes co-fatores relacionados à doença crônica do fígado pelo HCV, e que podem ser indicadores de não-resposta ao tratamento. Finalmente, recentes estudos relacionaram a resposta ao tratamento antiviral a uma variedade de genes, em particular à super expressão do gene sinalizador de supressão de citocina 3 (SOCS3) no tecido hepático associado a uma pobre resposta ao tratamento 66. Pacientes respondedores à terapia padrão demonstram concentrações aumentadas de IFN-У e IL10 quando comparados a pacientes nãorespondedores. Além disso, o equilíbrio entre a resposta Th1 e Th2 parece representar um evento chave na evolução da infecção pelo HCV e pode representar um dos principais efeitos da terapia com interferon e ribavirina 67. Em um estudo de Jia et cols., 2003, observou-se que as concentrações de citocinas IL18, IL10 e IL2R (recombinante) solúvel foram mais elevadas em portadores de hepatite C crônica que em pessoas saudáveis e portadores assintomáticos e concluiu-se que as duas últimas são importantes preditores da resposta à terapia baseada em interferon 68. Bozkaya et cols., 2000, avaliando 37 pacientes que receberam interferon por 6 meses (18 respondedores e 19 não respondedores), concluíram que não há alteração constante e regular das concentrações de citocinas com o uso do interferon em relação à resposta terapêutica 69. Vrolijk et cols. analisaram 17 pacientes cronicamente infectados com HCV e tratados com IFN e ribavirina por 26 semanas e observaram que o número de células TCD8+ presentes no espaço porta antes de começar a terapia foi significativamente maior em pacientes que responderam do que nos não-respondedores. Naquele estudo, eles ainda relatam que nem as concentrações periféricas de citocinas nem a reatividade de células T 18 específicas contra o HCV em células mononucleares de sangue periférico mostraram correlação com a terapia 70. 1.7 Perspectivas atuais de pesquisa sobre o HCV Os mecanismos pelos quais as células T controlam a replicação viral, o papel dos anticorpos em conferir proteção, e como as imunidades, inata e adquirida, são subvertidas durante a infecção persistente permanecem como questões a serem esclarecidas 47. Segundo Gremion e Cerny, 2005 falta uma explicação convincente para a cronicidade da infecção na presença de um sistema imune funcional, sendo esta uma importante área de pesquisa para compreender a imunopatogênese do HCV. Além disso, conforme aqueles autores, a pesquisa futura deveria dissecar os mecanismos que levam a respostas imunes inadequadas do ponto de vista qualitativo ou quantitativo, bem como o papel da alta variabilidade do vírus, a relevância de fatores genéticos do hospedeiro e os mecanismos de imunossupressão induzida pelo vírus 42. Mais estudos são necessários a fim de se compreender o papel das células NK na defesa do hospedeiro e no dano tecidual durante a infecção pelo HCV [53]. A natureza da imunidade protetora, incluindo o papel da resposta imune inata logo após a exposição ao HCV, permanece por ser definido 63. Chang, 2003 afirma serem necessárias mais pesquisas para definir o mecanismo de persistência viral e a lesão do hepatócito, constituindo um desafio o desenvolvimento de vacina e imunoterapia para o HCV. Ele também ressalta que uma melhor compreensão dos fatores virais e do hospedeiro, relevantes para o desfecho clínico e virológico, bem como do mecanismo de defeito imune seletivo contra o HCV, ajudará a melhorar o tratamento dos pacientes 40. O recente desenvolvimento de modelos de infecção pelo HCV em cultura de células possibilitará definir os mecanismos moleculares e sítios de 19 ação para a modulação terapêutica dos controles de resposta imune que regulam a infecção e o ciclo de replicação do HCV 6. Além disso, tem-se acumulado evidências de que o desenvolvimento de resistência irá limitar a eficácia de novas drogas, exigindo novas terapias com múltiplos agentes 71. Ao se compreender fatores virais e do hospedeiro que influenciam a manutenção e a função de células T HCV-específicas, haverá mais evidências para o desenvolvimento de terapias imunomodulatórias e vacinas que induzam imunidade duradoura e robusta 46. Com os avanços dos sistemas de culturas de células na última década, o desenvolvimento de antivirais de ação direta (DAAS) para o HCV tem se tornado possível. Existem atualmente mais de 50 ensaios clínicos na área terapêutica e os inibidores de protease NS3/4A estão entrando em estudos de fase III 72. Estes dados evidenciam a necessidade do entendimento dos mecanismos etiopatogênicos e imunológicos envolvidos na infecção pelo HCV, que poderiam diferir conforme o genótipo e interferir no sucesso do tratamento. 20 2. OBJETIVOS 2.1 Geral ● Caracterizar a resposta imune adaptativa de pacientes com hepatite C crônica antes e durante o tratamento com interferon alfa e ribavirina na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. 2.2 Específicos ● Caracterizar o genótipo e quantificar a carga viral do HCV em pacientes com hepatite C crônica. ● Quantificar o perfil de células TCD4+ e TCD8+. ● Quantificar o perfil da citocinas IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IFNУ e TNF-α. 21 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Modelo de estudo O estudo é do tipo observacional, descritivo, clínico evolutivo de uma série de pacientes com hepatite C crônica, que avalia resposta imune celular e humoral antes e durante o tratamento com interferon alfa 2a e ribavirina. Este estudo foi financiado com recursos do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo convênio 208460/20055. Faz parte da linha de pesquisa sobre HCV desenvolvida pela Diretoria de Ensino e Pesquisa da FHEMOAM. 3.2 Descrição da área de estudo O estudo foi desenvolvido na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM), centro de referência no ensino, pesquisa e assistência para doenças infecciosas e parasitárias no Estado do Amazonas. A FMTAM possui uma unidade de internação e serviços de urgência e emergência. Sua estrutura é dotada de ambulatórios especializados para atendimento de pacientes com doenças infecciosas, entre eles o ambulatório de hepatites virais. 3.3 População de estudo e amostragem Foi tomada uma amostra não-probabilística de conveniência, constituída de pacientes de ambos os sexos, acima de 18 anos, moradores na cidade de Manaus, portadores de hepatite C crônica, atendidos no Ambulatório de Hepatites da FMTAM. Foram incluídos os pacientes que obedeceram a todos os critérios de inclusão e concordaram voluntariamente em participar da pesquisa após a apresentação dos objetivos e métodos da mesma, e cujos registros foram feitos 22 pela assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido – TCLE. (Anexo 1). O período de inclusão foi de 01/08/2007 a 30/08/2009, e o acompanhamento para fins de pesquisa foi realizado até 24 semanas após o início do tratamento do último paciente incluído no protocolo. Após este período, foi mantido o tratamento dos pacientes com genótipo 1, até a 48ª semana, e mantido o acompanhamento ambulatorial de todos os pacientes. Vinte e dois pacientes iniciaram o tratamento e o acompanhamento para fins de pesquisa, entretanto seis pacientes foram excluídos entre a 4ª e a 12ª semana: três pacientes por mudança de domicílio e de cidade e três por apresentarem reações adversas, que os levaram a desistir do tratamento; e ocorreu, ainda, perda de mais dois pacientes por não terem comparecido para a coleta da 12ª semana (Figura 1). Convidados a iniciar o tratamento e participar do estudo Pré-tratamento Semana 4 69 pacientes 22 pacientes Semana 12 16 pacientes Semana 24 14 pacientes Figura 1: Fluxograma de inclusão de pacientes ao estudo. 3.4 Critérios de inclusão e exclusão Foram considerados critérios de inclusão: pacientes adultos com mais 23 de 18 anos, com diagnóstico de infecção pelo HCV confirmado por, pelo menos, um anti-HCV pela técnica de ELISA e um Imunoblot positivos. Foram excluídos do estudo: Pacientes gestantes (triagem com beta-HCG). Pacientes que apresentaram co-infecção, detectada por meio de reação positiva para marcadores da Hepatite B (anti-HBc, HBsAg), HIV (anti-HIV-I e II), HTLV (anti-HTLV- I e II), Doença de Chagas (teste ELISA), Sífilis (VDRL). Pacientes que apresentaram quadro clínico-laboratorial de cirrose hepática descompensada. Pacientes diabéticos descompensados. Pacientes com história de uso de drogas ilícitas nos últimos sete anos. Pacientes com relato de consumo diário de bebida alcoólica. Pacientes com distúrbios psiquiátricos. Pacientes renais crônicos. Pacientes com síndrome plurimetabólica. 3.5 Esquema Terapêutico O esquema terapêutico utilizado em todos os pacientes foi interferon peguilado α 2a (40KD), na dose de 180 µcg por via subcutânea, semanalmente associado à ribavirina na dose de 1,0 g, por via oral, diariamente. 3.6 Seguimento do estudo Os pacientes foram submetidos a avaliação clínica, mensalmente. A avaliação laboratorial foi realizada em quatro momentos: • Pré-tratamento; • Final da 4ª semana de tratamento; • Final da 12ª semana de tratamento; • Final da 24ª semana de tratamento. 24 3.7 Avaliação clínica O protocolo de pesquisa e o termo de consentimento livre e esclarecido foram apresentados aos pacientes pelo investigador médico responsável pela pesquisa, seguindo-se abordagem clínica, epidemiológica e exame físico dos voluntários, pela aplicação de um roteiro estruturado para anamnese e exame físico (anexo 2). As manifestações hepáticas e extra-hepáticas da infecção pelo HCV, estigmas de hepatopatia crônica e a presença de co-morbidades foram avaliadas mensalmente. 3.8 Avaliação laboratorial As amostras foram coletadas na FHEMOAM, onde foram fracionadas e enviadas às instituições colaboradoras, com as seguintes finalidades: triagem sorológica para co-infecções – DO; confirmação sorológica para hepatites virais - D0; determinação de carga viral - D0, 4ª, 12ª e 24ª semanas; seqüenciamento e genotipagem do HCV - D0; perfil bioquímico e avaliação da função hepática - D0, 4ª, 12ª e 24ª semanas; perfil hematológico de sangue periférico - D0, 4ª, 12ª e 24ª semanas; perfil imunológico celular (LTCD3+/CD4+, L TCD3+/CD8+, LTCD69+; perfil imunológico humoral (IL4, IL5, IL8 IL10, IL12, TNF-α e IFN) de sangue periférico - D0, 4ª, 12ª e 24ª semanas); 3.8.1 Procedimento para a coleta de amostra de sangue periférico As amostras de sangue - 30 mL de cada paciente, foram coletadas no HEMOAM. Após punção venosa, o sangue foi acondicionado em seis tubos EDTA (Vacutainer BD, Franklin Lakes, NJ,USA) e em um tubo PPT/Plasma Preparation Tube (Vacutainer BD, Franklin Lakes, NJ, USA). 25 O material foi identificado e centrifugado a 200 rpm durante 10 minutos. O soro foi separado em tubos livres de RNAse de 1,5 mL e armazenado a – 800C. Parte do material desta coleta foi enviada para o Instituto de Medicina Tropical de São Paulo – IMT-SP e o restante da amostra foi processado na FHEMOAM. Os exames de hemograma e bioquímicos foram realizados no laboratório de análises clínicas da FMTAM,. 3.8.2 Perfil hematológico de sangue periférico Foi realizado hemograma completo. 3.8.3 Perfil bioquímico de sangue periférico Para fins de acompanhamento ambulatorial foram realizados os seguintes exames: Bioquímico: aspartato aminotransferase, glutamato aminotransferase, bilirrubina direta e indireta, dosagem sérica de desidrogenase láctica e glicemia de jejum; Função renal: uréia, creatinina, sódio e potássio séricos; Função hepática: tempo de protrombina ativada e proteínas séricas. 3.8.4 Análise celular em sangue periférico por citometria de fluxo Amostras de 50 µL foram incubadas com anticorpos monoclonais por 20 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Foram avaliados: antiCD8+ (code MHCD0801, lote 08090506, marca CALTAG), marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-CD4 (code MHCD0404, lote 23031206, marca CALTAG) marcados com ficoeritrina (PE) e anti-CD3 (code MHCD0306, lote 60010708, marca CALTAG). Após a marcação dos leucócitos, as hemácias presentes foram: lisadas com 2 ml de solução de lise, lavadas com 2 mL de PBS (solução fisiológica tamponada com fosfato) e centrifugadas por 7 minutos, a 1300 rotações por minuto. Posteriormente, desprezou-se o sobrenadante por inversão e 26 adicionou-se 300 µL de PBS a 1% de formaldeído. A leitura foi realizada no citômetro de fluxo FACScalibur com sistema de detecção de quatro cores (Becton Dickinson). A identificação das populações celulares de interesse foi realizada utilizando-se o programa Cell-Quest. Primeiro identificou-se a população de linfócitos, neutrófilos, monócitos e eosinófilos, utilizando gráficos “dot plot” onde a população de interesse ocupa região característica após ajustes de ganhos de seu tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) (Figura 2A). Após a seleção da região de interesse, foi analisada a intensidade de fluorescência apresentada pelas células marcadas nesta região, pelo histograma de fluorescência 1 (FL1) versus fluorescência 2 (FL2) (Figura 2B). Figura 2: Sequência de procedimentos utilizados para as análises de populações celulares por citometria de fluxo. (A) Gráficos Dot plot FSC x SSC, utilizados para seleção da população linfocitária – R2. (B) Histograma; FL1 x FL2, utilizados para avaliar parâmetros de interesse em populações celulares específicas. Após a definição das regiões, o percentual de células positivas foi determinado utilizando-se histograma simples de análise das regiões. Os 27 resultados obtidos foram anexados à ficha de acompanhamento dos pacientes padronizada para este estudo. 3.8.5 Perfil imunológico de citocinas no sangue periférico As citocinas foram dosadas no soro do sangue periférico por ensaio imunoenzimático (ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assays) no Laboratório de Pesquisa Multidisciplinar do HEMOAM, utilizando-se pares de anticorpos (Anticorpo Primário e Anticorpo Secundário) e respectivos padrões recombinantes obtidos comercialmente OpteiaTm Set Human (BD Biosciences. Pharmingen, San Diego, CA, US), conforme as recomendações do fabricante. Foram quantificadas as concentrações séricas das citocinas IL-4, IL-5, IL-6, IL8, IL-10, IL12, IFN-У e TNF-α em pg/mL. Microplacas de 96 poços foram sensibilizadas com 100μL de anticorpo de captura (anticorpo primário) diluído em tampão de ligação (Carbonato de Sódio 0,1 M, pH 9,6). A placa foi envolvida em papel alumínio e incubada por 12 horas, a 4°C. Após esse período de incubação, os poços foram aspirados e lavados 3 vezes com 300 µL de tampão de lavagem (PBS 1X + 0,05% de Tween-20%). Concluída a última lavagem, as placas foram aspiradas e invertidas em papel absorvente para remover qualquer tampão residual. Duzentos microlitros de diluente de ensaio (Solução Salina Tamponada de Fosfato - PBS 1X + 10% de Soro Bovino Fetal - SBF) foram acrescentados em cada poço e a placa foi envolvida em papel laminado e incubada a temperatura ambiente por 1 hora. Durante essa incubação foram preparadas diluições seriadas de cada citocina, cujas concentrações seguiram as especificações do fabricante. As diluições foram realizadas em microtubos utilizando-se um volume inicial de 500 µL no primeiro tubo e, em outros 7 tubos, foram adicionados 250 µl da solução diluente. Depois de acrescido o volume exigido de citocina no primeiro tubo, foram transferidos 250 µL para o próximo tubo, agitando entre cada transferência, até a obtenção de uma curva de diluição seriada. 28 Após o término do período de incubação, as placas foram aspiradas e lavadas novamente por 3 vezes, com 300 µL de tampão de lavagem e, em seguida, invertidas em papel absorvente para remover qualquer tampão residual. Foram adicionados 50 µL de cada amostra, padrão de referência e solução diluente (PBS + 10% SBF, como controle negativo) dentro dos poços apropriados, a placa foi envolvida em papel alumínio e incubada a temperatura ambiente, por 2 horas. Após esta incubação, as placas foram aspiradas e lavadas com 5 ciclos de lavagens. Logo em seguida, foram adicionados 100 µL do anticorpo de detecção associado à enzima (anticorpo secundário + reagente SAv-HRP) para cada poço. Novamente, a placa foi envolvida em papel alumínio e incubada à temperatura ambiente, por 1 hora. As placas foram aspiradas e lavadas em 7 ciclos no total, deixando de molho por 30s em cada ciclo. Foram adicionados 100 µL de solução de substrato em cada poço, a placa foi envolvida em papel alumínio e incubada à temperatura ambiente por 30 minutos. Para o bloqueio da reação foram acrescidos 50 µL de H 2 SO 4 (2N) em cada poço e realizada a leitura da absorbância a 450 nm em aparelho da marca ASYS (Microplate reader v.1.14) em até 30 minutos após o término da reação. 3.9 Técnicas moleculares do HCV 3.9.1 Extração do RNA do plasma A extração do RNA das amostras foi realizada no laboratório de virologia do IMT-SP, a partir de 140μL de soro utilizando-se o Kit QIAamp® Viral RNA (Qiagen, Uniscience do Brasil-SP). As amostras foram inicialmente lisadas em tampão de denaturação para inativação de RNases e para assegurar o isolamento de RNA intacto. As condições de tamponamento foram ajustadas para promover uma ótima ligação do RNA à coluna. O RNA fica ligado à coluna e os contaminantes foram eficientemente lavados e retirados em duas etapas utilizando-se dois diferentes tampões de lavagem (PBS 1X com 0,05% de Tween-20 (p.ex.: 500mL de PBS 1X + 250μL de Tween-20). O RNA foi diluído em um tampão especial livre de RNase que favorece a estocagem e também o uso direto do RNA. O RNA extraído ficou livre de proteínas, nucleases e outros 29 contaminantes e inibidores, de acordo com as instruções do fabricante. Após o término da extração do RNA, realizou-se a síntese do DNA complementar (cDNA). 3.9.2 Síntese de DNA complementar (cDNA) A síntese de cDNA foi realizada pela reação de Transcrição Reversa (RT), utilizando-se reagentes da InvitrogenTM Life Technologies, Carlsbad, CA, USA. O volume final da reação foi de 40,1µL nas seguintes condições: Tampão PCR 1X sem Magnésio, 0,2mM de dNTP´s, 5mM de MgCl 2, 10-3 M de DTT, 2,5 µM de primer randômico PDN (6), 1 unidade de enzima inibidora de RNAse, e 2,5 unidades de enzima Transcriptase Reversa do Vírus da Leucemia Murina de Moloney (M-MLV). As amostras foram submetidas a gradiente de temperatura no termociclador Veriti Thermal Cycler – Applied Biosystems, conforme o quadro abaixo: Quadro 1. Gradiente de temperatura no termociclador. Temperatura Minutos 65º C 5 minutos 22º C 10 minutos 37º C 30 minutos 95º C 5 minutos 3.9.3 Reação em cadeia da polimerase (PCR) Os iniciadores utilizados para a reação em cadeia da polimerase foram desenhados a partir da região conservada 5’NCR do genoma do HCV (SMITH et al., 1995). Após a etapa de síntese, o DNA complementar foi amplificado pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), utilizando-se reagentes da InvitrogenTM Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, nas seguintes condições: 30 tampão PCR 1X, 0,16 mM de dNTP, 0,2 µM de cada iniciador HC11 e HC18 (Quadro 2); 1 unidade de Taq Platinum DNA polimerase; 0,1µg/µL de cresol red; 10 µL de cDNA, para uma reação com volume final de 50 µL. O programa que foi utilizado para a amplificação por PCR, no termociclador Veriti Thermal Cycler – Applied Biosystems, está representado no quadro 3. O produto amplificado pelos iniciadores HC11 e HC18 gera um fragmento de 331 pares de base da região 5'NTR do genoma do HCV. Quadro 2. Sequência de nucleotídeos dos iniciadores HC11 e HC18 Quantidade de Iniciadores Sequência 5’- 3’ HC 18 GGTGCACGGTCTACGAGACCT 21 HC 11 GGCGACACTCCACCATAGATCACT 24 bases Quadro 3. Programa utilizado no termociclador para a reação de amplificação por PCR Etapa 1 Desnaturação inicial por 5 minutos a 95º C Etapa 2 Desnaturação por 30 segundos a 94º C Etapa 3 Hibridização por 30 segundos a 55º C Etapa 4 Extensão por 1 minuto a 72º C Etapa 5 Repetição das etapas 2 a 4 por 50 ciclos Etapa 6 72º C por 7 minutos 3.9.4 Nested PCR 31 Para amostras que não amplificaram pela técnica da reação em cadeia da polimerase com a utilização dos primers HC11 e HC18, foi realizada a técnica de Nested-PCR, como uma segunda estratégia devido à sua maior sensibilidade, utilizando-se reagentes da InvitrogenTM Life Technologies, Carlsbad, CA, USA. O primeiro ciclo do Nested-PCR foi realizado nas seguintes condições: tampão PCR 1X, 0,16 mM de dNTP, 2,8 mM de MgCl 2 , 0,2 µM de cada iniciadores P32 e P36 (Quadro 7), 1,25 unidades de Taq Platinum DNA polimerase; 0,1 µg/µL de cresol red; 10 mM de cDNA, para uma reação com volume final de 25µL. O programa utilizado para a amplificação por PCR, no termociclador Veriti Thermal Cycler – Applied Biosystems, está representado no quadro 6. Quadro 4. Programa utilizado no termociclador Mastercycler Gradient – Eppendorf para a primeira reação do Nested-PCR Etapa 1 Desnaturação inicial por 5 minutos a 95º C Etapa 2 Desnaturação por 30 segundos a 94º C Etapa 3 Hibridização por 30 segundos a 55º C Etapa 4 Extensão por 1 minuto a 72º C Etapa 5 Repetição das etapas 2 a 4 por 50 ciclos Etapa 6 72º C por 7 minutos Após o término do primeiro ciclo do Nested-PCR, iniciou-se o segundo ciclo utilizando reagentes da InvitrogenTM Life Technologies, Carlsbad, CA, USA, nas seguintes condições: tampão PCR 1X, 0,16 mM de dNTP, 2,0 mM de MgCl 2 , 0,2 µM de cada iniciador P33 e P48, 1,5 unidades de Taq Platinum DNA polimerase, 10 µL do produto amplificado no primeiro ciclo, para uma reação com volume final de 25 µL. Utilizou-se o programa para a amplificação 32 por PCR, no termociclador Veriti Thermal Cycler – Applied Biosystems (quadro 6). Quadro 5. Sequência de nucleotídeos iniciadores P32, P36, P33 e P48 Iniciador Sequência 5’- 3’ Quantidade de bases P32 CTGTGAGGAACTACTGTCTT 20 P36 ACTGCTAGCCGAGTAGTGTT 20 P33 TTCACGCAGAAAGCGTCTAG 20 P48 GGGTCCTTTCTTGGATCAAA 20 Quadro 6. Programa utilizado no termociclador para a segunda reação do Nested-PCR Etapa 1 Desnaturação inicial por 5 minutos a 95º C Etapa 2 Desnaturação por 30 segundos a 94º C Etapa 3 Hibridização por 30 segundos a 55º C Etapa 4 Extensão por 1 minuto a 72º C Etapa 5 Repetição das etapas 2 a 4 por 45 ciclos Etapa 6 72º C por 7 minutos O produto amplificado pelos iniciadores P32 e P36 gera um fragmento de 220 pares de base e, pelos iniciadores P33 e P48, um fragmento de 145 pares de bases da região 5'NTR do genoma do HCV. Após o término da PCR, para a identificação das amostras positivas, o produto amplificado foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1,5%, contendo Gel Red (InvitrogenTM Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), na 33 proporção de 10 µL: 50 mL de Agarose. Foi aplicado 5 µL de cada amostra e 1 µL do marcador de 50 pares de bases (InvitrogenTM Life Technologies, Carlsbad,CA,USA). A reação foi realizada montando-se uma mistura de volume final de 50μl contendo 5μl de Tampão de PCR 10x (Invitrogen® - Minus MgCl 2 ) com concentração final de 1X, 3,2μL de dNTP’s (2,5mM) com concentração final de 0,16mM (Invitrogen®, Brasil), 1μL do Primer HC11(sense) (10uM) com concentração final de 0,2 μL, 1μL do primer HC18 (antisense) (10uM) com concentração final de 0,2 μL (Invitrogen, Brasil), 0,5μL de Taq DNA Polimerase (5U/μL) com concentração final de 2,5U/μL (enzima Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen TM Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), 5μL de Glicerol (57%) com concentração final de 5,7mM (Invitrogen®, Brasil), 2μL de Cresol red (2,5μg/UL) com concentração final de 0,1 μg/UL, 22,3μL de H 2 O deionizada e 10μL de cDNA. Nesta mistura não foi acrescido MgCl 2 considerando que no cDNA sintetizado já existe uma concentração final de 1mM de MgCl 2 . Esta mistura foi submetida a condições de 95oC por 5 minutos para provocar desnaturação das fitas seguido de 40 ciclos nas seguintes condições: 94oC por 30 segundos, 55ºC por 30 segundos, 72oC por 1 minuto e no fim a 72 oC por 7 minutos. 3.9.5 Purificação dos produtos amplificados A purificação dos produtos amplificados foi feita com a utilização de colunas do Kit Microcon Centrifugal Filter Devices ® (Milipore). Para cada produto de PCR foi utilizada uma coluna sobre um tubo de 1,5 ml. Foram adicionados 300μL de H2O MiliQ ultra-pura no topo da coluna sem tocar a membrana; posteriormente foram adicionados todo volume do produto de PCR (cerca de 50µL) no centro da coluna sem tocá-la. As colunas foram centrifugadas por 15 minutos a 550 x g, à temperatura ambiente. Em seguida as colunas foram invertidas sobre outro tubo de 1,5 ml limpo e estéril e foram adicionados 35μL de água MiliQ no centro da coluna e a mesma foi novamente centrifugada por 5 minutos a 650 x g. 34 3.9.6 Semi-quantificação dos produtos purificados Após purificação foi feito uma eletroforese em gel de agarose 1,5% (Ultrapure TM Invitrogen®) contendo 0,5µl/mL de brometo de etídio em tampão TAE 1X (50X - Invitrogen®) para favorecer uma semi-quantificação do produto amplificado para posterior seqüenciamento, utilizando como marcador 4µl do marcador Low Mass Ladder (Gibco®). Para tal, foram aplicados 5µl do tampão de corrida (Loading Buffer 2xInvitrogen®) e 5μL do produto amplificado e purificado aplicando-se a mistura de 10μL no gel de agarose. Esta etapa de semi-quantificação permitiu uma comparação visual da intensidade das bandas da amostra com o marcado. Desta forma, foi possível a semi-quantificação do produto amplificado de modo a permitir o uso de aproximadamente 100 ng do material na reação de sequenciamento. 3.9.7 Reação de sequenciamento e purificação do produto Baseando-se na semi-quantificação descrita anteriormente, cerca de 100 ng de produto amplificado foi adicionado a um micro-tubo com 3,2 pmol do primer HC11 (sense), 2μL de Mix ABI PRISM Big Dye Terminator ready reaction (Applied Biosystem Incorporation, Foster City, Califórnia, EUA), 4,4μL de Save Money (Tris-HCl 200 mM (pH 9,0) e 5mM de MgCl2). A extensão enzimática foi realizada em termociclador Eppendorf durante 25 ciclos de 96o C por 10 segundos para desnaturação do DNA molde, 50o C por 10 segundos, para anelamento do primer e 60o C por 4 minutos para extensão. O produto foi novamente purificado visando a remoção de excesso de dideoxinucleotídeos “terminadores” presentes na reação, através do método de precipitação. Para tal foi adicionado 80μL de isopropanol (75%) à reação de seqüenciamento e incubado por 15 minutos à temperatura ambiente (protegido da luz) e foi realizada centrifugação entre 15.000 e 20.000 x g por 20 minutos. Então, foi descartado o sobrenadante por aspiração, seguido de lavagem com 160μL de etanol a 80%, seguido de agitação em vortex por 15 segundos, 35 centrifugação por 5 minutos (20.000 g), e aspiração do sobrenadante. Após secagem do pellet a 45o C por 10 minutos as amostras foram re-suspensas utilizado-se 4μL de loading buffer (Applied Biosystem Incorporation, Foster City, Califórnia, EUA). 3.9.8 Sequenciamento Foi montado o gel de eletroforese utilizando-se o Kit Long Ranger Acrilamide® (CAMBREX Bio Science Rockland Inc. ME- EUA) segundo recomendações do fabricante. A eletroforese do gel de acrilamida foi realizada no seqüenciador ABI PRISM TM 377 Applied Biosystems Incorporation, Foster City, California, EUA. No momento anterior a aplicação no gel foi feita a desnaturação da amostra a 95° C por 2 minutos e as amostras foram mantidas em gelo para em seguida serem aplicados 2μL de cada amostra no gel de seqüenciamento. O alinhamento das seqüências foi realizado utilizando-se o software ABI 377-96 collection v. 2.6. 3.9.9 Análise das sequências A genotipagem foi feita através da edição e alinhamento das seqüências das regiões 5'NCR, utilizando o programa Sequence Navigator v.3.4 (Applied Biosystems), em conjunto com as seqüências padrão obtidas do GenBank, verificando os genótipos de cada amostra através do acesso on-line para consulta ao banco de dados do Los Alamos National Laboratory nos Estados Unidos conforme descrito por Kuiken et al. (2006). As análises das seqüências foram realizadas no Laboratório do IMT-SP. 36 CrINF32 CrINF34 CrINF12 CrINF11 CrINF06 CrINF03 CrINF26 NC 009824.1|HCVgp3 CrINF04 CrINF07 NC 009825.1|HCVgp4 NC 009826.1|HCVgp5 CrINF20 NC 004102.1|HCVgp1 CrINF19 CrINF02 CrINF27 CrINF05 CrINF28 CrINF10 CrINF22 CrINF33 CrINF35 NC 009827.1|HCVgp6 CrINF29 NC 009823.1|HCVgp2 CrINF09 CrINF15 CrINF18 CrINF21 CrINF25 0.01 Figura 3: Árvore filogenética de uma amostragem de indivíduos portadores do HCV, com as seqüências representadas para os genótipos 1, 2 e 3, grifados em verde, rosa e azul, respectivamente. 3.9.10 Determinação da carga viral A determinação da carga viral foi realizada através da técnica de amplificação de ácidos nucléicos utilizando-se o kit Amplicor HCV MonitorTM Test (Roche) v.2.0. Este ensaio baseia-se em cinco processos principais: preparação da amostra; transcrição reversa do RNA alvo para produzir DNA complementar (cDNA); amplificação por PCR do cDNA alvo usando iniciadores específicos complementares do HCV; hibridização dos produtos amplificados com sondas 37 oligonucleotídicas específicas do alvo; e detecção dos produtos amplificados fixos à sonda por determinação colorimétrica. Esta metodologia baseada em PCR permitiu a determinação precisa da carga viral presente no soro/plasma, pela inclusão de um controle, um RNA artificial, contendo as mesmas regiões de ligação dos primers ao HCV-RNA, mas com outra seqüência nucleotídica entre os primers. Os produtos de RTPCR foram hibridizados com uma sonda interna imobilizada em placa de 96 poços. Os primers foram marcados com molécula de biotina, o que permitiu a posterior detecção e leitura por sistema enzimático como os utilizados nas reações sorológicas rotineiras. A relação entre as leituras óticas derivadas do HCV-RNA e do controle, cujo número de cópias incluído na reação é conhecido, permitiu estimar a carga viral da amostra. De acordo com o fabricante, o limite inferior deste método é de 600 UI/mL e o superior é de 850.000 UI/mL. 3.10 Ultrasonografia Antes do início do tratamento todos os pacientes foram submetidos a ultrassonografia de abdome total. O exame de imagem foi realizado como exame complementar diagnóstico visando a avaliar a estrutura hepática e os outros órgãos abdominais. 3.11 Biópsia Hepática Oito pacientes foram submetidos à biópsia hepática antes do início do tratamento. As biópsias foram realizadas através de punção aspirativa percutânea, de acordo com o protocolo da FMTAM. As biópsias foram necessárias para se avaliar o grau de comprometimento hepático. Os achados histopatológicos foram descritos de acordo com a classificação de METAVIR. A fibrose foi avaliada como: F0 – sem fibrose; F1 – fibrose portal sem septos; F2 – fibrose portal com pouca formação de septo; F3 – fibrose portal com muitos septos; F4 – cirrose. 38 3.12 Metodologia estatística O banco de dados foi construído utilizando-se a plataforma Excell. Os dados foram apresentados por meio de gráficos e tabelas de freqüência. A análise dos dados foi iniciada com descrição estatística simples, sendo utilizado o intervalo de confiança ao nível de 95%, adotando-se nível de significância igual a 0,05 em todas as análises. Fez-se análise estatística através do programa R; a normalidade foi objeto do teste de Shapiro-Wilk. Após definição de quais eram os dados paramétricos e não-paramétricos, realizaram-se os testes ANOVA com pósteste de Tukey para os dados paramétricos, e de Kruskal-Wallis para os dados não-paramétricos. Para a análise de grupos pareados foram utilizados os testes de Tukey e de Kruskal-Wallis. 3.13 Aspectos éticos Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos (CEP) da FMTAM em 27/07/2007, processo número 0913/2007FMT-AM (anexo 3) e está de acordo com as normas previstas na Resolução N0 196/96 do Conselho Nacional de Saúde. 39 4. RESULTADOS Os resultados e a discussão estão apresentados na forma de artigos originais. O primeiro artigo relata o caso de um paciente excluído do estudo na 9ª semana de tratamento face à ocorrência de efeitos colaterais. O segundo artigo mostra os dados demográficos e a caracterização molecular dos 69 pacientes convidados a participar do estudo. No terceiro artigo estão apresentados os resultados do perfil celular e de citocinas de 14 pacientes acompanhados até a 24ª semana de tratamento. 40 4.1 ARTIGO I Publicado na Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical no volume 43(4) jul-ago, 2010 Relato de Caso/Case Report Resposta virológica sustentada em paciente com co-infecção pelos genótipos 1 e 2 do vírus da hepatite C, com apenas nove semanas de terapêutica antiviral: Relato de caso Sustained virological response in patients with coinfection by hepatitis C virus genotypes 1 and 2, after just nine weeks of antiviral therapy: Case report Ana Ruth Araújo1,2, José Eduardo Levi4, Carlos Mauríco de Almeida1, Tatiane Amábili de Lima1,3, Laura Patrícia Viana Maia2,3, Kátia Luz Torres3, Andréa Monteiro Tarragô3, Flamir Victória1, Marilu Victória1, Sinésio Talhari1 e Adriana Malheiro1-3 1. Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Manaus, AM. 2. Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM. 3. Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, Manaus, AM. 4. Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, São Paulo, SP. Endereço para correspondência: Dra. Adriana Malheiro. HEMOAM. Av. Constantino Nery 4397 69050-002 Manaus, AM, Brasil. Tel: 55 92 3655-0113 e-mail: [email protected] Recebido para publicação em 08/04/2010 Aceito em 12/05/2010 41 RESUMO Relata-se um paciente do sexo masculino com 67 anos e sorologia positiva para o vírus da hepatite C (HCV). Exames moleculares revelaram a presença do RNA do HCV, com carga viral de 2.000 cópias/mL e genótipos 1 e 2. O tratamento foi com alfapeginterferon-2a, 180mcg/semana e ribavirina, 1000mg/dia. Na quarta semana de tratamento, a carga viral para o HCV era indetectável. Na nona semana, o paciente apresentou hematêmese, piora do quadro de astenia, inapetência e comprometimento do estado geral, quando o tratamento foi descontinuado. O PCR foi negativo após 6 meses e permaneceu assim após um ano. O paciente encontra-se assintomático. Palavras-chaves: Vírus da hepatite C. Co-infecção. RVS. ABSTRACT A report of a 67 year-old male patient with positive serology for HCV. PCR revealed the presence of HCV RNA, viral load of 2,000 copies/mL and genotypes 1 and 2. The pacient was treated with peginterferon alfa-2a at 180 mcg/week and Ribavirin at 1,000 mg/day. In week four of treatment, HCV viral load was undetectable. In week nine, the patient developed hematemesis, worsening of asthenia, anorexia and impaired general condition, so the treatment was discontinued. The PCR was negative six months and one year after the cessation of treatment. The patient remains asymptomatic. Key-words: Hepatite C virus. Co-infection. SRV. INTRODUÇÃO A infecção pelo HCV está estimada em mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo, correspondendo a mais de 3% de toda a população mundial1. É um vírus emergente e constitui significativa causa de morbimortalidade humana2. Desta forma, constitui um grave problema de saúde pública. O objetivo deste trabalho é relatar sobre um paciente atendido na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. 42 RELATO DO CASO Paciente do sexo masculino, com 67 anos de idade, caucasiano, procedente de Manaus, Estado do Amazonas que utilizava glucanergan há 40 anos e negava o uso de álcool ou outras drogas. Não havia histórico de transfusões sanguíneas. Queixava-se de astenia, gosto amargo na boca e gases. Os exames apresentaram os seguintes resultados (Hto 36,8, Hb 12,4, plaquetas 113.000, leucócitos 3.900, ALT 99, alfa-feto proteína 3,3). A ultrassonografia revelou fígado com aspecto normal. As sorologias confirmatórias revelaram positividade para Anti-HCV, sendo negativas para (HBsAg-, anti-HBc-, anti-HBs-). Os exames de biologia molecular revelaram a presença do RNA do HCV, com carga viral de 2.000 cópias/mL e através da análise filogenética, concluiu-se que o paciente apresentava os genótipos 1 e 2. Esta etapa do trabalho foi realizada no Laboratório de virologia do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMT-SP). A extração do RNA das amostras foi realizada a partir de 140μL de soro utilizando-se o Kit QIAamp® viral RNA (Qiagen, Uniscience do Brasil-SP), de acordo com as especificações do fabricante. Para a síntese de DNA complementar (cDNA) foi realizada a reação de transcrição reversa (RT), utilizando-se a enzima transcriptase reversa Moloney Murine Leukemia Vírus (M-MLV) (Invitrogen® Brasil) que utiliza moléculas de RNA fita simples, na presença de Random Hexamers N6 (Random primers) para sintetizar fitas de DNA e a reação foi submetida as condições de termociclagem. Após a obtenção do cDNA, o mesmo foi amplificado pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizandose a enzima Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen® TM Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Os primers foram desenhados a partir da região conservada 5’NCR do genoma do HCV. O Produto amplificado foi identificado por eletroforese em gel de agarose 1,5% (agarose ultrapureTM - Invitrogen Life Technologies). A amostra do paciente continha RNA do HCV no plasma e foi submetida a nova reação em cadeia da polimerase que gerou um produto amplificado de 308pb ideal para análise dos genótipos do HCV. O sequenciamento do HCV foi realizado no sequenciador ABI PRISM TM 377 Applied Biosystems Incorporation, Foster City, California, EUA. O alinhamento das sequências foi realizado utilizando-se o software ABI 377-96 collection v. 43 2.6. A genotipagem foi feita pela edição e alinhamento das sequências das regiões 5'NCR, utilizando o programa Sequence Navigator v.3.4 (Applied Biosystems), em conjunto com as sequências padrão obtidas do GenBank, (acessoon-line) no banco de dados do Los Alamos National Laboratory nos Estados Unidos. A carga viral foi determinada por meio da quantificação do RNA viral pela técnica de amplificação de ácidos nucléicos, pelo Kit Amplicor HCVTM Test (Roche). O paciente iniciou o tratamento com alfapeginterferona-2a (40KD), 180mcg/semana, associada à ribavirina, 1.000mg/dia, conforme protocolo do Ministério da Saúde para tratamento do HCV genótipo 1. Na segunda semana após o início do tratamento, observou-se queda discreta do hematócrito, hemoglobina, plaquetas e leucócitos. A partir da quarta semana de tratamento, o paciente passou a apresentar astenia, anorexia e perda de peso, com queda progressiva do hematócrito, hemoglobina, plaquetas e leucócitos. Na quarta semana de tratamento, a carga viral para o HCV era indetectável (<200 cópias/ml) e valores alterados de ALT= 82 UI/l e AST= 73 UI/L. Na nona semana de tratamento, o paciente apresentou hematêmese, piora do quadro de astenia, inapetência e comprometimento do estado geral. Foi internado no Serviço de Pronto Atendimento da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, com quadro de pancitopenia. Na internação, apresentava hemoglobina-3,7 hematócrito-11,8, plaquetas-22.000, Leucócitos-1.500, AST73, ALT-82. O paciente recebeu 4 unidades de concentrado de plaquetas e 04 unidades de concentrado de hemácias. O tratamento preconizado inicialmente (interferon associado à ribavirina) foi descontinuado e fez-se hemograma, bioquímica, nova carga viral e ressonância magnética (RNM). A carga viral permanecia inferior ao limite de detecção e as enzimas hepáticas estavam normais. A RNM revelou sinais de hepatopatia crônica. A endoscopia digestiva alta revelou presença de dois cordões varicosos de fino calibre em segmento distal, sugerindo quadro de hipertensão portal por doença hepática crônica. 44 Após seis meses da suspensão do tratamento, o paciente estava assintomático. Os resultados dos novos exames demonstraram: Hto-33,8, Hb11,6, plaquetas-100.000, TAP-70,7% e ALT-58. O PCR qualitativo, seis meses após a suspensão do tratamento foi negativo e permaneceu assim após um ano. O paciente encontra-se assintomático, com perfil bioquímico dentro dos parâmetros de normalidade. DISCUSSÃO O HCV é um vírus emergente1 em todo o mundo e constitui significativa causa de morbimortalidade humana2. O HCV é o único representante do gênero Hepacivirus, incluído na família Flaviviridae. É um pequeno vírus, com 30 a 60 nm de diâmetro, e apresentando um genoma de RNA linear, com hélice única e positiva, cuja organização assemelha-se a de outros flavivírus, como o vírus do dengue3. Até o momento, foram Identificados 6 genótipos de HCV, distintos mas relacionados, além de múltiplos subtipos, por meio de correlações moleculares: 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 e 6. A determinação do genótipo relacionado a cada indivíduo é importante por apresentar valor preditivo em termos de resposta à terapia antiviral, com melhor resposta associada aos genótipos 2 e 3 do que ao genótipo 14. Como relatado neste trabalho, observamos que o paciente apresentava infecção por dois diferentes genótipos 1 e 2 do HCV. Este fato explica-se porque como ocorre com todos os RNA-vírus, falta à polimerase do HCV, uma função de leitura de prova (proof-reading function). Isto permite que, no curso de infecção persistente, a replicação viral propensa a erros gere um repertório de variantes virais altamente relacionadas, mas geneticamente distintas, ou quasispécies. Esta variabilidade genética concede ao HCV um notável potencial adaptativo, tendo sido implicado com a evasão e controle da resposta do hospedeiro à infecção e a uma sensibilidade diferencial à terapia com Interferon5. Além disso, trabalhos recentes do nosso grupo demonstraram que o genótipo 1 do HCV é o de maior prevalência no Estado do Amazonas, seguido dos genótipos 2 e 3, podendo sugerir ainda que este paciente tenha tido contato com ambos os genótipos dos vírus. 45 O tratamento da hepatite C visa deter a progressão da doença hepática pela inibição da replicação viral7. O protocolo terapêutico do Ministério da Saúde preconiza a administração de interferon alfa em associação com a ribavirina, variando o tempo de tratamento de acordo com o genótipo do HCV. Considerando que o genótipo 1 tem sido descrito como o que apresenta pior resposta à terapia, o Ministério da Saúde, preconiza, nestes casos, um tratamento mais prolongado, com interferon peguilado. Desta forma, optou-se por tratar o paciente considerando o genótipo 1. Tem sido sistematicamente descrita uma correlação entre o genótipo viral e a resposta terapêutica. Dados da literatura indicam que para os genótipos 2 e 3 o IFN-α em combinação com a ribavirina são eficazes em 80% dos casos. Tempo inferior a 12 semanas de interferon-α e ribavirina seria tão eficaz quanto um esquema de 24 semanas8. Estes dados evidenciam que o tratamento pode ser mais ou menos eficaz de acordo com o genótipo viral encontrado, sendo a resposta clínica melhor com os genótipos tipos 2 e 3 quando comparada aos genótipos 1a e 1b, como exposto anteriormente. Após quatro semanas de tratamento, o paciente relatado apresentou carga viral indetectável, sugerindo que o mesmo seja bom respondedor ao tratamento, mesmo apresentando a co-infecção com os genótipos 1 e 2. Estes dados estão de acordo com a literatura. Alguns autores relatam que um percentual de pacientes tratados com interferon e ribavirina que apresenta resposta virológica na 4a semana de tratamento, têm maior probabilidade de manter a resposta virológica sustentada (PCR qualitativo negativo após 6 meses de suspensão do tratamento)9. Por outro lado, dados de estudo realizado na China com 40 pacientes com hepatite C crônica, submetidos a terapia com IFN-g e ribavirina por 48 semanas, tiveram resposta viral sustentada; dentre estes, 28% a 31% apresentavam genótipo 1 e 64% a 66% genótipos 2 ou 310. Após a 4ª semana, apesar da boa resposta do paciente ao tratamento foram observadas alterações laboratoriais. Houve queda do hematócrino, 46 hemoglobina e quadro de anemia severa, com diminuição de leucócitos e plaquetas, havendo hemorragia digestiva e comprometimento do estado geral do paciente. O tratamento foi descontinuado na nona semana face à pancitopenia e comprometimento do estado geral do paciente. Todas as manifestações e alterações laboratoriais parecem estar relacionado aos efeitos colaterais ocasionados pelo interferon peguilado, associado à ribavirina. Em 2010, Rumi e cols10, observaram que o tratamento com interferon associado à ribavirina pode causar pancitopenia, anemia grave e hemorragias digestivas. Estes autores sugeriram que este quadro pode estar associado ao tipo de interferon peguilado utilizado e o genótipo do HCV. Sendo que nestas situações é indicado descontinuar o tratamento, até que haja melhora do paciente. No presente estudo, o tratamento foi eficaz, mesmo sendo descontinuado na nona semana após seu início, uma vez que manteve RVS no controle de 6 e 12 meses após a suspensão do tratamento e até o momento apresenta-se assintomático, com concentrações normais das transaminases. A RNM mostrou fígado de aspecto normal, sugerindo que o tratamento foi eficaz neste paciente, tanto para o genótipo 1, como para o 2. SUPORTE FINANCEIRO Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas – FAPEAM e Conselho Nacional de Pesquisa – CNPq. 47 REFERÊNCIAS 1. Pavio N, Lai MMC. The hepatitis C virus persistence: how to evade the immune system? J Biosci 2003; 28:287-304. 2. Bowen DG, Walker CM. Adaptive immune responses in acute and chornic hepatitis C virus infection. Nature 2005; 436:946-952. 3. Houghton M, Weiner A, Han J, Kuo G, Choo QL. Molecular biology of the hepatitis C viruses: implications for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatol 1991; 14:381-388. 4. Lauer GM, Walker BD. Hepatitis C virus infection. N. Engl. J. Med 2001; 345:41-52. 5. Galé-Jr M, Foy EM. Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus. Nature 2005. 436:939-945. 6. Torres KL, Malheiro A, Tateno A, Lima TA, Mia LPV, Pimentel JPD, et al. Hepatitis C vírus in blood donors, Brazil. Emerg Infect Dis 2009; 15:676-678. 7. Strauss, E. Hepatite C. Rev Soc Bras Med Trop 2001; 24:69-82. 48 4.2 ARTIGO II Aceito para publicação na Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical (Anexo 4) Genótipos do Vírus da Hepatite C em Pacientes com Hepatite C Crônica, Manaus, Brasil Hepatitis C Virus in cronic hepatitis patiens, Manaus, Brasil Ana Ruth Araújo1,2(MSc), Carlos Mauríco de Almeida1(MSc), Liziara Fraporti3, Nadja Garcia3, Tatiane Amábili de Lima1,3, Laura Patrícia Viana Maia2,3(MSC), Kátia Luz Torres3(PhD), Andréa Monteiro Tarragô3, Flamir Victória1(PhD), Marilu Victória1(PhD), Adriana Tateno4(PhD), José Eduardo Levi4(PhD)SinésioTalhari1(PhD) e Adriana Malheiro1-3(PhD). 1. Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Manaus, AM. 2. Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM. 3. Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, Manaus, AM. 4. Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, São Paulo, SP. Aprovado pelo CEP da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas Endereço para correspondência: Dra. Adriana Malheiro. HEMOAM. Av. Constantino Nery 4397 69050-002 Manaus, AM, Brasil. Tel: 55 92 36550113 e-mail: [email protected] Recebido para publicação em 12/08/2010 Aceito em 16/11/2010 49 RESUMO No Estado do Amazonas os dados sobre a prevalência dos genótipos do HCV ainda são escassos. Neste estudo foram determinados os genótipos do HCV em 69 pacientes da FMT-AM. O RNA do HCV foi detectado pela técnica de RTPCR, utilizando-se iniciadores HC11/HC18 para a região 5’não traduzida. Dos 69 pacientes estudados, 65,2% era do sexo masculino e 34,8% do feminino. O genótipo 1 foi o mais prevalente, seguidos dos 3 e 2. Estes dados sugerem que Manaus é porta de entrada do vírus HCV no Estado do Amazonas. Palavras chaves: Vírus da Hepatite C, Genotipagem, Hepatites ABSTRACT In Amazonas state data about the prevalence of the different genotypes of HCV are still scarce. For the study the genotype of 69 patients HCV positive was determined. An in-house standardized nested-PCR was used to detected HCV RNA. Genotypes assignment was based on type-specific motifs on the sequenced amplicons delimited by primers HC11/HC18 from the 5’ untranslated region. Of the 69 patients studied, 65,2% were male and 34,8% were female. We found the genotype 1, with most prevelance, followed by 3 and 02. These data suggesting that Manaus is the point of arrival of HCV in the Amazon state. Key words: HCV and genotypes A infecção pelo Vírus da Hepatite C (HCV) está estimada em mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo, correspondendo a mais de 3% de toda a população mundial 1. O HCV é o único representante do gênero Hepacivirus, incluído na família Flaviviridae. É um pequeno vírus com cerca de 30 a 60 nm de diâmetro e apresenta um genoma de RNA linear com hélice única e positiva, cuja organização assemelha-se a outros flavivírus, como o vírus do dengue 2. Seu genoma contém 9400 nucleotídeos, possuindo uma única fase de leitura aberta (open reading frame), que codifica uma poliproteína de pouco 50 mais de 3000 aminoácidos, contendo uma região estrutural e uma nãoestrutural 3. Estas regiões são clivadas por proteases, liberando as proteínas estruturais e não estruturais do vírus. A região estrutural localiza-se na porção aminoterminal, codificando a proteína core do nucleocapsídeo viral (proteína C, com cerca de 19 kD) e as glicoproteínas E1 (gp33) e E2 (gp72), constituintes do envelope viral 2. Esta região do genoma representa a sequência mais altamente conservada, sugerindo um papel regulador durante a replicação viral2. As proteínas não estruturais NS2, NS3, NS4A, NSB, NS5A e NS5B representam a extremidade carboxiterminal do genoma viral 4. Os genótipos do HCV são determinados pelo sequenciamento de nucleotídeos do genoma inteiro seguido por uma composição da árvore filogenética. Este é atualmente o padrão-ouro para a detecção e identificação dos diferentes genótipos do HCV. Outros métodos de genotipagem são baseados em técnicas sorológicas e moleculares. A reação da polimerase (PCR) com métodos de genotipagem incluem o uso de primers para amplificação, análise de hibridização reversa, usando sondas específicas para uma região do HCV e por análises da técnica de “restriction fragment length polymorphism” (RFLP) 5. Até o momento foram identificados 6 genótipos de HCV, distintos mas relacionados, além de múltiplos subtipos, por meio de correlações moleculares3: 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 e 6. A determinação do genótipo relacionado a cada indivíduo é importante por apresentar valor preditivo em termos de resposta à terapia antiviral, com melhor resposta associada aos genótipos 2 e 3 do que ao genótipo 1 3. Basicamente, o tratamento da hepatite C visa deter a progressão da doença hepática pela inibição da replicação viral 6. O protocolo terapêutico preconizado atualmente pelo Ministério da Saúde do Brasil7 inclui a administração de interferon alfa em associação com o antiviral ribavirina, que potencializa o efeito do primeiro. 51 O impacto do HCV na saúde pública abrange desde a alta prevalência na população em geral, cujos dados ainda são pontuais e escassos, até o alto custo do tratamento das co-morbidades observadas no decorrer do curso clínico. Observa-se, ainda, alta mortalidade na fase terminal da doença, com frequentes hospitalizações e intercorrências de difícil manejo, especialmente em locais de poucos recursos para assistência à saúde. Sobre esta infecção, vários aspectos ainda não são conhecidos, especialmente na região amazônica, onde faltam estudos epidemiológicos e moleculares na área. Este trabalho visou caracterizar os genótipos do vírus da Hepatite C, em pacientes atendidos na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. Foram incluídos no estudo 69 pacientes, moradores da cidade de Manaus, portadores de hepatite C crônica, cadastrados no Ambulatório da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, hospital de referência em doenças tropicais na cidade de Manaus, Amazonas. As técnicas de biologia molecular foram realizadas no laboratório de virologia do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMT-SP). A extração do RNA das amostras foi realizada a partir de 140μL de soro utilizando-se o Kit QIAamp® Viral RNA (Qiagen, Uniscience do Brasil-SP), de acordo com as especificações do fabricante. Para a síntese de DNA complementar (cDNA) foi realizada a reação de Transcrição Reversa (RT), utilizando-se a enzima Transcriptase Reversa Moloney Murine Leukemia Vírus (M-MLV) (Invitrogen ® Brasil) que utiliza moléculas de RNA fita simples, na presença de Random Hexamers N6 (Random primers) para sintetizar fitas de DNA e a reação foi submetida as condições de termociclagem. Após a obtenção do cDNA, o mesmo foi amplificado pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), utilizando-se a enzima Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen® TM Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Os primers foram desenhados a partir da região conservada 5’NCR do genoma do HCV. O Produto amplificado foi identificado por eletroforese em gel de agarose 1,5% (Agarose UltrapureTM Invitrogen Life Technologies). As amostras dos pacientes que continham RNA do HCV no plasma foram submetidas à nova PCR que gerou um produto amplificado de 308pb ideal para análise dos genótipos do HCV. Os genótipos foram determinados utilizando-se iniciadores genótipos específicos nas 52 sequências delimitadas pelos iniciadores HC11/HC18 para a região 5’não traduzida. O sequenciamento do HCV foi realizado no sequenciador ABI PRISM TM 377 (Applied Biosystems Incorporation, Foster City, California, EUA). O alinhamento das sequências foi realizado utilizando-se o software ABI 377-96 collection v. 2.6. A genotipagem foi feita pela edição e alinhamento das sequências das regiões 5'NCR, utilizando o programa Sequence Navigator v.3.4 (Applied Biosystems), em conjunto com as sequências padrão obtidas do GenBank, (acesso on-line) no banco de dados do Los Alamos National Laboratory nos Estados Unidos. As análises estatísticas foram feitas no programa GraphPad Prism versão 4.0. Foram incluídos no estudo 69 pacientes, sendo a maior prevalência do sexo masculino (65,2%) em comparação ao feminino (34,8%). Sendo que a média de idade para o sexo feminino foi 45±15,31 e para o masculino de 46±11,92, não apresentando diferença estatística significativa entre ambos os sexos. Não foram observadas alterações significativas em relação a AST, (48,54±36,98) e (54,64±33,86), para o sexo feminino e masculino, respectivamente. No entanto, foram observadas alterações nas concentrações de ALT entre ambos os sexos, quando comparado aos valores de referência. Todos os pacientes foram reativos no teste sorológico anti-HCV e as amostras foram submetidas a técnica de PCR para confirmação do diagnóstico e posteriormente a determinação do genótipo viral como preconizado pelo Ministério da Saúde. Como mostra a tabela 1, foram detectados os genótipos 1em (54,2%), 3 (25%) e 2 (20,8%) das mulheres. Para o sexo masculino observamos, assim como para o feminino, a maior prevalência do genótipo 1 (76,1%), 3 (19,6%) e 2 (4,3%) (tabela 1). 53 Tabela 1: Distribuição dos genótipos do Vírus da Hepatite C em pacientes com Hepatite C crônica. MÉDIA SEXO DE GENÓTIPO IDADE Feminino Masculino 34,8% (N=24) 65,2% (N=45) AST ALT UI/mL UI/mL 1 (54,2%) 45±15,31 2 (20,8%) 48,54±36,98 74,13±66,23 3 (25%) 1 (76,1%) 46±11,92 2 (4,3%) 54,64±33,86 100,3±100,1 3 (19,6%) A detecção do HCV é de crucial importância para o controle da doença em nível global, sendo que mesmo em países desenvolvidos, o número de mortes deve continuar aumentando devido à inadequada detecção, o que posterga o tratamento 8. Esta detecção é baseada em 2 tipos de testes: os ensaios sorológicos para detecção de anticorpos específicos (cuja sensibilidade tem aumentado progressivamente) e os testes moleculares para detecção de partículas virais 3 . Especialmente em relação aos testes moleculares, a determinação da carga viral permite avaliar a evolução da resposta terapêutica, enquanto a genotipagem prediz a resposta e influencia no regime de tratamento escolhido 3. O HCV é notadamente bem sucedido, produzindo uma infecção persistente que continuará por toda a vida do indivíduo, com vastas oportunidades de transmissão dentro da população humana, a menos que interrompida por uma terapia baseada no uso do interferon (IFN) 9. Neste estudo, amostras de 69 pacientes com diagnóstico de hepatite C foram analisadas. Nesta população de estudo a maioria dos indivíduos infectados era do sexo masculino, e encontrava-se na faixa etária acima dos 40 anos. Estes 54 dados estão de acordo aos encontrados por Torres e colaboradores, 2009 10 em doadores de sangue. Naquele estudo os autores relataram uma relação estatística entre a viremia do HCV e a faixa entre 45-55 anos. Estes dados sugerem que estes indivíduos foram infectados pelo HCV antes da inclusão de exames sorológicos obrigatórios no Brasil e por se tratar de uma infecção latente e muitas vezes silenciosa passaram a apresentar alterações do quadro clínico mais tardiamente. O protocolo terapêutico preconizado atualmente pelo Ministério da Saúde do Brasil 7, inclui a administração de interferon alfa em associação com o antiviral ribavirina, de acordo com o genótipo viral. Desta forma, é obrigatório a genotipagem de amostras de pacientes soropositivos antes do início do tratamento. Apesar desta obrigatoriedade, dados relacionados à prevalência do HCV no Estado do Amazonas, ainda são escassos. Em 2005, Campiotto e colaboradores11, em um estudo multicêntrico, descreveram que o genótipo 1 era o mais prevalente no Estado do Amazonas. No entanto, poucos indivíduos foram analisados naquela época. No presente estudo foi observado uma maior prevalência do genótipo 1, seguido do 3 e 2. O Genótipo 1 é predominante em todo o mundo, e é composto de dois subtipos principais, 1a e 1b. Além disso, tem sido demonstrado que as taxas de crescimento destes subtipos são maiores do que os genótipos 4 e 6. Na população de Alagoas, a prevalência do subtipo 1b (65,2%) foi maior do que a observada em Salvador, Bahia, onde este subtipo só ocorreu em 38,6% dos amostras positivas para o anti-HCV. No entanto, foi muito semelhante aos resultados obtidos a partir de amostras de HCV positivas de outros estados brasileiros, como Acre, Amazonas e Pará (Região Norte), bem como Pernambuco, com frequências de 60% e 71% para cada região, respectivamente 12. Ainda, Campiotto e colaboradores (2005) 11 , demonstraram que a frequência do genótipo 3 variou entre as diferentes regiões brasileiras, com maior prevalência em Santa Catarina (50%) e Paraná (41,7%), Região Sul, bem como Goiás, região Centro-oeste (37,1%), e Pernambuco (36,9%). 55 Dados semelhantes foram publicados por Torres e colaboradores em 2009. Estes autores demonstraram a maior prevalência do genótipo 1, seguido do genótipo 3, na população de doadores de sangue do Estado do Amazonas 10 . Estes dados corroboram com os encontrados para a população de pacientes da Fundação de Medicina Tropical, onde observamos maior prevalência do genótipo 1, seguido do 3. No entanto, naquele estudo os autores não detectaram o genótipo 2 na população de doadores de sangue. Segundo estes autores, a distribuição geográfica demonstra os genótipos 1 e 3 em Manaus, e somente o 1, em amostras obtidas em doadores de sangue do interior do Estado. Esta distribuição dos genótipos é semelhante ao que é encontrada por muitas cidades brasileiras e países do Oriente e pode refletir na via de introdução do HCV na Amazônia. O vírus foi provavelmente introduzido na Região Amazônica por imigrantes europeus e medicamentos importados derivados do sangue para o Brasil. Esta hipótese é corroborada pela identificação do genótipo 3, exclusivamente, em Manaus, sugerindo que esta cidade é o ponto de chegada do HCV e que novas cepas foram disseminadas a partir de Manaus para o interior 11 , revisto por Torres e colaboradores 10 . Em nosso estudo foi também detectado o genótipo 2 do HCV em pacientes moradores de Manaus, reforçando a hipótese de que esta cidade é a porta de entrada de diferentes genótipos do HCV e distribuição do mesmo para outras localidades, como descrito anteriormente. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao serviço de atendimento aos pacientes da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brasil. Nós também agradecemos ao Edson da Fonseca Lira pela análise estatística e aos pacientes pelo consentimento em participar do estudo. SUPORTE FINANCEIRO Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas – FAPEAM e Conselho Nacional de Pesquisa – CNPq 56 CONFLITOS DE INTERESSE Os autores declaram que não existem conflitos de interesses. REFERÊNCIAS 1. Pavio N, Lai MMC. The hepatitis C virus persistence: how to evade the immune system? J Biosci 2003; 28:287-304. 2. Houghton M, Weiner A, Han J, Kuo G, Choo QL. Molecular biology of the hepatitis C viruses: implications for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology 1991; 14:381-388. 3. Lauer GM, Walker BD. Hepatitis C virus infection. N. Engl. J. Med 2001; 345:41-52. 4. Sáez-Alquezar, A; Bassit, L.; Sabino, E.C. Hepatites virais. In: Ferreira,W.A. & Ávila,S.L.M. Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas e auto-imunes. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2001. 5. Bezzera C.S., Lima C.M.J., Vilar J.L., et al. Viral hepatitis C in a leading brazilian Hospital: epidemiological factors and genotyping. Braz J Microb 2007; 38:656-661. 6. Strauss, E. Hepatite C. Rev Soc Bras Med Trop 2001; 24:69-82. 7. Brasil. Programa Nacional de Hepatites Virais (PNHV), 2006. Disponível em: www.saude.gov.br/porta/saude. Acessado em 15 de fevereiro de 2010. 8. Poynard, T.; Yuen, M.F.; Ratziu, V.; Lai, C.L. Viral hepatitis C. Lancet 2003; 362(9401):2095-100. 9. Gale Jr, M. & Foy, E.M. Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus. Nature 2005; 436(7053):939-45. 10. Torres KL, Malheiro A, Tateno A, Lima TA, Mia LPV, Pimentel JPD, et al. Hepatitis C vírus in blood donors, Brazil. Emerg Infect Dis 2009; 15:676678. 57 11. Campiotto S., Pilho, J.R.R., Carrilho F.J., et al. Geografic distribution of Hepatitis C vírus genotypes im Brazil. Braz J Med Biol Res 2005; 38(1): 41-49. 12. Gonzaga R.M., Rodart I.F., Reis M.G.,et al. Distribution Of Hepatitis C Virus (HCV) Genotypes In Seropositive Patients In The State Of Alagoas, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology 2008; 39:644-647. 58 4.3 ARTIGO III A ser submetido à revista indexada para publicação. Efeito do tratamento com Interferon-α 2A peguilado e ribavirina na resposta imune celular de pacientes com hepatite C crônica Ana Ruth Araújo1,2,3, Laura Patrícia Viana Maia3,4; Tatiane Amábili de Lima1,2,4; João Paulo Diniz Pimentel4; Lúcia de Paula3,6; Carlos Maurício de Almeida1; Andréa Monteiro Tarragô3,4 ; Adriana Tateno5; José Eduardo Levi5; Andrea Teixeira-Carvalho7, Olindo de Assis Martins-Filho7; Edson da Fonseca Lira4, Kátia Luz Torres4; Sinésio Talhari1,2; Adriana Malheiro3,4. 1. Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Manaus, AM, Brasil, 2. Universidade do Estado do Amazonas- UEA, Manaus, AM, Brasil 3. Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM, Brasil. 4. Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas-Hemoam, Manaus, AM, Brasil, 5. Instituto de Medicina Tropical de São Paulo-IMT, São Paulo, SP, Brasil, 6. Fundação Alfredo da Matta – FUAM, Manaus, AM, Brasil 7. Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e Monitoração, Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, MG, Brasil. Endereço para correspondência: Dra. Adriana Malheiro Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas - HEMOAM. Av. Constantino Nery 4397 69050-002 Manaus, AM, Brasil. Tel: 55 92 36550113 e-mail: [email protected] 59 RESUMO O objetivo desse trabalho descrever o perfil imunológico de pacientes com hepatite C crônica, antes e durante o tratamento com interferon alfa 2a e ribavirina. Foram estudados 14 pacientes com hepatite C crônica atendidos na FMT-AM, no pré-tratamento, 4a, 12a e 24a semanas pós o início do tratamento. O genótipo e a carga viral foram determinados por Biologia Molecular, o perfil celular foi analisado por citometria de fluxo e as citocinas foram dosadas por ELISA. Os dados demonstraram que 78% dos pacientes apresentavam genótipo 1 e 22% o genótipo 3. Todos os pacientes apresentaram diminuição da concentração de ALT na 4a semana após o tratamento. Foi observado leucopenia após o início do tratamento que se manteve até a 24a semana. Dentre os sintomas clínicos apresentados, destacam-se febre, astenia, depressão e anemia. Observou-se aumento de células TCD4+ na semana 4, com diminuição na 12a e 24a semanas após o início do tratamento. Esta diminuição também foi observada para LTCD8+ nas semanas 12 e 24. Houve aumento crescente da IL-12, a partir da 4a semana, se mantendo elevado nas semanas 12 e 24. Não foram observadas diferenças estatísticas significativas em relação a IL-4, IL-5, CXCL-8, IL-10 e IFN-γ. Observou-se aumento significativo da expressão da molécula CD69 (marcador de ativação celular), em linfócitos, na 4a semana, com diminuição na 12a, se mantendo baixo até a semana 24. Houve diferenças significativas de CD69 em eosinófilos, neutrófilos e monócitos entre as diferentes semanas. De acordo com os resultados encontrados, sugere-se que o tratamento parece induzir a produção da IL-12 que desempenha importante papel no direcionamento da resposta imune para o perfil Th1, induzindo aumento de células CD4+ no início do tratamento e ativação celular. No entanto, não foi observado aumento de IFN-γ, o que corrobora a diminuição de CD4+ e CD8+ após a 12a semana, sugerindo que esta citocina seria importante para a manutenção deste perfil de resposta imune. Palavras-chaves: Hepatite C, interferon, ribavirina, reposta imune, citocinas. 60 ABSTRACT The purpose of this study was to examine HCV genotypes and phenotypic features of peripheral blood leukocytes and the seric levels of cytokine, before and 4, 12 and 24 weeks after beginning of treatment with alpha 2A interferon and ribavirin. In the present study was analized 14 patients at the Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. The genotypes was identify for molecular biology and immunophenotypic analysis was performed by flow cytometry and seric cytokines quantified by ELISA. Our findings demonstrated that 78% of the patients had genotype 1, while 22% had genotype 3. The HCV patients displayed of ALT concentration decreased on the 4th week of treatment. The low levels of leukocytes was observed until the 24th week after beginning of treatment. The most evident clinical symptoms included fever, asthenia, depressien, and anaemia. Increased levels of LTCD4+, but not LTCD8+ on the 4th week were found, with a subsequent decrease in CD4+/CD8+ on 12th and 24th weeks after treatment begins. Increased seric concentration of IL-12 was observed on 4th week, keeping at high level on the 12th and 24th weeks. While low levels of IL-8, IL-10, IL-4, IL-5, and IFN-γ were observed. Enhanced frequency of activated lymphocytes on the 4th week with reduced on the 12th and 24th weeks are observed in the peripheral blood of HCV patients. Whereas higher activation status of lymphocytes was found, low levels of activated innate immunity leukocytes were observed. This results suggest that IL-12 plays an important role in directing a immune response for Th1 profile, inducing LTCD4+ enhanced with higher activation status in this cells. Key words: C hepatitis, interferon, ribavirin, immune response, cytokines 61 INTRODUÇÃO A hepatite C é considerada um grave problema de saúde pública pela alta incidência na população e por sua evolução silenciosa para doença crônica que compromete a qualidade de vida e a sobrevida dos pacientes1. A prevalência da infecção pelo HCV é estimada em torno de 3% de toda a população mundial, ou seja, aproximadamente 170 a 210 milhões de pessoas em todo o mundo2. De acordo com o sistema de classificação de Simmonds (1993), o HCV pode ser classificado em um total de seis genótipos já descritos e denominados de 1 a 6, e os seus correspondentes subtipos designados por letras (1a, 1b, 1c, 2a, 2b, 2c, 3a, 3b, 4a, 5a, 6a). Os diferentes genótipos estão associados a alguns aspectos relativos à infecção, como distribuição geográfica, patogenia e resposta ao tratamento com IFN-α 3. Uma vez estabelecida a infecção crônica, a possibilidade de ocorrer eliminação espontânea do vírus é remota. Cerca de 50 a 85% dos casos de infecção pelo HCV evoluem para a infecção crônica4, e estima-se que 20% dos pacientes portadores crônicos de HCV desenvolverão cirrose hepática após 20 anos de doença, elevando o risco de desenvolver hepatocarcinoma5. A velocidade com que a doença progride é variável e está relacionada a fatores que interferem na progressão da fibrose hepática, como a idade mais avançada ao contrair o HCV, o consumo de álcool e as co-infecções com outros vírus, como o HIV e o HBV6. Além disso, as respostas imunes inata e adaptativa do hospedeiro exercem papel fundamental no controle eficaz contra a infecção7. A taxa de resposta virológica sustentada relaciona-se com a ausência de RNA viral após 6 meses de tratamento e com a regressão da fibrose8 e oscilam na literatura mundial entre 33% a 37%. A falha do tratamento com IFN em erradicar a infecção é multifatorial, enquanto o sucesso terapêutico é determinado principalmente pela eliminação de células infectadas9. 62 O interferon em formulação peguilada (peginterferon), associado à molécula de polietilenoglicol, torna-se mais pesado, o que lhe confere meiavida mais longa, possibilitando sua administração em esquema terapêutico com a ribavirina e apresentando maior eficácia em várias situações clínicas10 podendo gerar resposta terapêutica sustentada em torno de aproximadamente 50% dos pacientes11, 12, 13. A infecção de células pelo HCV desencadeia rapidamente eventos sinalizadores intracelulares, que levam à produção de IFN alfa e beta e a um estado celular antiviral, propiciando uma barreira inicial à replicação e à disseminação viral. Contudo, o HCV evade à resposta imune através de uma complexa combinação de interferência na sinalização celular do hospedeiro, modulação de funções imunológicas efetoras e variação genética contínua. Estas estratégias permitem a persistência viral no ser humano mesmo em pacientes imunocompetentes14,8. Assim, a interação vírus-hospedeiro pode determinar a persistência viral, a extensão e gravidade da inflamação hepática e, possivelmente, a hepatocarcinogênese15. Tanto as respostas imunológicas celulares como humorais participam na defesa do hospedeiro contra a infecção pelo HCV, com crescente reconhecimento do papel da resposta celular e das citocinas na imunopatogênese da hepatite C crônica. Esta resposta celular depende da atividade de linfócitos T citotóxicos e auxiliares (helper) e age através de citocinas reguladoras de macrófagos, células natural killer (NK) e proteínas celulares antivirais16. O HCV, como muitos vírus, vem desenvolvendo maneiras de subverter tanto a resposta imune inata quanto a resposta imune adaptativa do hospedeiro à infecção. As proteínas do HCV parecem modular a apoptose, a esteatose, em último estágio, a fibrose e o carcinoma hepatocelular. Além disso, o HCV manipula o sistema imune, rompendo tanto a resposta inata quanto a adaptativa para estabelecer a infecção persistente. Existem evidências que durante a infecção aguda, a resposta imune celular tem um importante papel 63 no controle da replicação viral nos pacientes que subsequentemente controlam a infecção10. A infecção persistente é geralmente associada a fraca resposta de células T CD4+ e CD8+ durante a fase aguda, não havendo boa explicação sobre o porque desta resposta ser suficientemente eficaz para erradicar o vírus nesta fase em 20% dos infectados, ou seja, naqueles que naturalmente resolvem a infecção. Tem-se enfatizado, ainda, a importância da resposta de células T auxiliares CD4+ tanto na expansão quanto na manutenção de células TCD8+ HCV específicas17. Na infecção crônica estabelecida, a resposta de células T específicas é quantitativamente fraca, provendo apenas mínima pressão seletiva para mais mutações de escape [8, 18]. Sun et al,( 2004), referem que cada uma destas células T deve ter um papel específico no processo e que o IFN-γ intra- hepático, produzido por estas células, é central para a ação antiviral . Estes autores relatam que os interferons, alfa e beta, sozinhos, podem não levar à resposta viral sustentada in vivo sem desencadear uma resposta de células T específicas contra o HCV19. Quanto ao papel de outras células na imunidade ao HCV, o sinergismo entre linfócitos T, células NK e células NKT parece ser importante para a resolução da doença e, possivelmente, a eliminação viral e o dano tecidual são causados por diferentes mecanismos celulares efetores19. O fígado é particularmente rico em células NK, que são ativadas por vírus hepatotrópicos como o HCV, desempenhando um papel crucial no recrutamento de células T HCV-específicas e na indução da atividade antiviral específica. Estas células podem eliminar hepatócitos infectados diretamente por citólise ou indiretamente pela secreção de citocinas, que induzem um estado antiviral nas células do hospedeiro. Assim, elas seriam importantes para limitar a replicação viral naquele órgão, ainda que também pudessem contribuir para o dano tecidual hepático durante a resposta imunológica20. 64 Vale ainda ressaltar que, recentemente, tem-se demonstrado que o HCV não somente infecta hepatócitos como também as próprias células do sistema imune, tais como linfócitos B e T, resultando em disfunção da resposta imune àquele vírus21. As citocinas produzidas no fígado são essenciais para defender o hospedeiro contra a infecção pelo HCV, mas algumas delas também tem sido implicadas na lesão hepatocelular vista na maioria dos pacientes infectados cronicamente. Além disso, a infecção persistente perturba o equilíbrio entre citocinas imunoestimulatórias e inibitórias, o que pode prolongar a inflamação e levar a necrose, fibrose e doença hepática crônica [16]. Alterações no balanço das citocinas da resposta Th1 como as interleucinas (IL-1, IL-2, IL-6, IL-12, IL-18), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e citocinas da resposta Th2 (IL-4) e regulatórias (IL-10) no tecido hepático e no sangue periférico podem contribuir para a persistência viral e lesão hepática crônica22. Citocinas imunorregulatórias desempenham um papel crucial na resposta do hospedeiro ao HCV. Enquanto citocinas Th1 são necessárias para a resposta imune antiviral, as citocinas Th2 podem inibir o desenvolvimento dos mecanismos efetores. Na fase crônica da infecção, a resposta imune potencialmente determina a taxa de progressão da doença tanto na limitação da replicação viral, como também por contribuir com a imunopatologia. Finalmente, durante a terapia combinada, a resposta imune celular pode contribuir para o sucesso ou fracasso do tratamento23. A restauração das concentrações de citocinas também pode contribuir para alcançar melhores resultados terapêuticos na hepatite C crônica24. O objetivo da terapia atual é a não detecção persistente do HCV seis meses após o término do tratamento, com a definição da resposta virológica sustentada (RVS). Durante esta terapia, não ocorre a negativação ou surge recidiva, após a não detecção ou término da terapia caracterizam-se os insucessos, não resposta (NR) e recidiva (REL). A não detecção do HCV na 65 quarta semana da terapia constitui a resposta virológica rápida (RVR), enquanto a não-detecção na 12ª semana da terapia constitui a resposta virológica precoce completa (RVPc), e a redução em 2log em reação à resposta virológica precoce parcial (RVPp) 25. Pacientes respondedores à terapia padrão exibem altas concentrações de IFN-γ e IL-10 quando comparados aos pacientes não-respondedores. Além disso, o equilíbrio entre a reposta Th1 e Th2 parece representar um evento chave na evolução da infecção pelo HCV e pode representar um dos principais efeitos da terapia com interferon e ribavirina26. Outras citocinas como IL-18, IL10 e receptores para citocinas como IL-2R (recombinante) solúvel também são descritos em concentrações mais elevadas em portadores de hepatite C crônica que em pessoas saudáveis e portadores assintomáticos, demonstrando que são importantes preditores da resposta à terapia baseada em interferon27. Apesar dos crescentes estudos da relação entre o sistema imune e a infecção pelo HCV, além dos efeitos do tratamento sobre o sistema imune e vice-versa, esta interação ainda não está bem compreendida. Compreender fatores virais e do hospedeiro que influenciem na manutenção e na função de células T HCV-específicas, fornecerá mais evidências para o desenvolvimento de terapias imunomodulatórias e vacinas que induzam imunidade eficaz e duradoura. Este estudo avaliou o perfil da resposta imune pré e pós a 4a, 12a e 24a semanas de tratamento com interferon-α 2a peguilado, em pacientes com hepatite C crônica. PACIENTES E MÉTODOS PACIENTES O estudo é do tipo observacional, descritivo, clínico evolutivo de uma série de pacientes com hepatite C crônica, que avalia resposta imune celular e humoral, pré e pós-tratamento, com interferon alfa 2a e ribavirina. Foi tomada uma amostra não-probabilística de conveniência, constituída de pacientes de 66 ambos os sexos, acima de 18 anos, moradores na cidade de Manaus, portadores de hepatite C crônica, atendidos no Ambulatório de Hepatites da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas – FMTAM. Foram incluídos no estudo 14 pacientes, todos recrutados para o tratamento. Dentre os 14 pacientes seguidos no estudo, 8 eram do sexo masculino e 6 do sexo feminino. Sendo que a maior concentração de positivos para o HCV está nas faixas etárias entre 30 e 60 anos, sendo a maior prevalência entre 40 e 50 anos. Acima de 60 anos houve apenas um infectado, assim como na faixa etária entre 20 e 30 anos. Não houve casos com menos de 20 anos. As amostras foram submetidas à técnica de PCR para confirmação do diagnóstico e posteriormente a determinação do genótipo viral. Todos os pacientes foram tratados com interferon alfa 2a (40KD), na dose de 180 µcg por via subcutânea, semanalmente associado à ribavirina na dose de 1,0 g, por via oral, diariamente. O acompanhamento para fins de pesquisa foi realizado até 24ª semanas após o início do tratamento do último paciente incluído no protocolo. Foram excluídos do estudo: gestantes (triagem com beta-HCG), pacientes com co-infecção, detectada por meio de reação positiva para marcadores da hepatite B (anti-HBc, HBsAg), HIV (anti-HIV-I e II), HTLV (anti-HTLV- I e II), doença de Chagas (teste ELISA), sífilis (VDRL); cirrose hepática descompensada; diabéticos descompensados; história de uso de drogas ilícitas nos últimos sete anos; relato de consumo diário de bebida alcoólica; pacientes com distúrbios psiquiátricos; renais crônicos; síndrome plurimetabólica. Os pacientes foram submetidos à avaliação clínica mensalmente. A avaliação laboratorial foi realizada pré e pós tratamento, sendo este realizado ao final das semanas 4, 12 e 24 após o início do tratamento. Foram realizadas ultrassonografia abdominal e biópsia hepática. A carga viral, o perfil bioquímico, hematológico e celular também foram avaliados nos diferentes tempos - S0, 4ª, 12ª e 24ª semanas. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de Medicina Tropical-AM (Processo N0. 093/2007) e todos os pacientes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. 67 Detecção do RNA do HCV e genotipagem Amostras de soro foram estocadas a -80 C, e o RNA viral foi extraído usando o Kit QIAamp® Viral RNA (Qiagen, Uniscience do Brasil-SP). Para a síntese de DNA complementar (cDNA) foi realizada a reação de Transcrição Reversa (RT), utilizando-se a enzima Transcriptase Reversa Moloney Murine Leukemia Vírus (M-MLV) (Invitrogen ®Brasil) que utiliza moléculas de RNA fita simples, na presença de Random Hexamers N6 (Random primers) para sintetizar fitas de DNA e a reação foi submetida as condições de termociclagem. Após a obtenção do cDNA, o mesmo foi amplificado pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), utilizando-se a enzima Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen® TM Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Os primers foram desenhados a partir da região conservada 5’NCR do genoma do HCV. O Produto amplificado foi identificado por eletroforese em gel de agarose 1,5% (Agarose UltrapureTM - Invitrogen Life Technologies). As amostras dos pacientes que continham RNA do HCV no plasma foram submetidas à nova PCR que gerou um produto amplificado de 308 pb ideal para análise dos genótipos do HCV. Os genótipos foram determinados utilizando-se iniciadores genótipos específicos nas sequências delimitadas pelos iniciadores HC11/HC18 para a região 5’ não traduzida. O sequenciamento do HCV foi realizado no sequenciador ABI PRISM TM 377 (Applied Biosystems Incorporation, Foster City, California, EUA). O alinhamento das sequências foi realizado utilizando-se o software ABI 377-96 collection v. 2.6. A genotipagem foi feita pela edição e alinhamento das sequências das regiões 5' NCR, utilizando o programa Sequence Navigator v.3.4 (Applied Biosystems), em conjunto com as sequências padrão obtidas do GenBank, (acesso on-line) no banco de dados do Los Alamos National Laboratory nos Estados Unidos. A carga viral foi determinada por meio da quantificação do RNA viral pela técnica de amplificação de ácidos nucléicos, pelo Kit Amplicor HCVTM Test (Roche). 68 Biópsia de fígado Oito pacientes foram submetidos à biópsia de fígado antes do início do tratamento. Os demais pacientes apresentavam diminuição de plaquetas, cirrose hepática ou não aceitaram fazer a biópsia. O grau de fibrose foi caracterizado de acordo com a classificação do Metavir, considerando aspectos básficos: F0, sem fibrose; F1, fibrose portal sem septos; F2, fibrose portal com pouco septo; F3, fibrose portal com muitos septos; F4, cirrose hepática. Dosagem de ALT no soro O nível sérico da ALT foi determinada no soro, usando amostras coletadas por punção venosa obtidas antes do início do tratamento, 4, 12 e 24 semanas após o início do tratamento, usando-se o teste ALT (Abbott Laboratories,Chicago). Os valores foram apresentados em concentração. Imunofenotipagem de leucócitos do sangue periférico por citometria de fluxo Coletou-se 50 µL de sangue venoso em EDTA; foram incubadas com anticorpos monoclonais por 20 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Foram avaliados: anti-CD8+ (code MHCD0801, lote 08090506, marca CALTAG), marcados com isotiocianato de fluoresceína (FITC), anti-CD4 (code MHCD0404, lote 23031206, marca CALTAG) marcados com ficoeritrina (PE) e anti-CD3 (code MHCD0306, lote 60010708, marca CALTAG). Após a marcação dos glóbulos brancos, as hemácias presentes foram: lisadas com 2 mL de solução de lise, lavadas com 2 mL de PBS (solução fisiológica tamponada com fosfato) e centrifugadas por 7 minutos, a 1300 rotações por minuto. Posteriormente, desprezou-se o sobrenadante por inversão e adicionou-se 300 µL de PBS a 1% de formaldeído. A leitura foi realizada no citômetro de fluxo FACScalibur com sistema de detecção de quatro cores (Becton Dickinson). 69 A identificação das populações celulares de interesse foi realizada utilizando-se o programa Cell-Quest. Primeiro identificou-se a população de linfócitos, neutrófilos, monócitos e eosinófilos, utilizando gráficos “dot plot” onde a população de interesse ocupa região característica após ajustes de ganhos de seu tamanho (FSC) e granulosidade (SSC). Após a seleção da região de interesse, foi analisada a intensidade de fluorescência apresentada pelas células marcadas nesta região, pelo histograma de fluorescência 1 (FL1) versus fluorescência 2 (FL2) (Figura 1B). Após a definição das regiões, o percentual de células positivas foi determinado utilizando-se histograma simples de análise das regiões. Os resultados obtidos foram anexados na ficha de acompanhamento dos pacientes, padronizada para este estudo. Análise estatística As análises estatísticas foram feitas usando-se o programa R e Graphpad Prism version 5.01 (Graphpad Software, San Diego, CA, USA). A análise dos dados foi iniciada com descrição estatística simples, sendo utilizado o intervalo de confiança ao nível de 95%, adotando-se nível de significância igual a 0,05 em todas as análises. A normalidade foi testada pelo teste de Shapiro-Wilk. Após definição de quais eram os dados paramétricos e não-paramétricos, realizaram-se os testes ANOVA com pós-teste de Tukey para os dados paramétricos, e de Kruskal-Wallis para os dados nãoparamétricos. Para a análise de grupos pareados foram utilizados os testes de Tukey e de Kruskal-Wallis. 70 RESULTADOS Genótipo, carga viral, biópsia hepática, hemograma e ALT Os genótipos do HCV foram determinados nesta população de estudo e 11 pacientes apresentavam genótipo 1 e apenas em três foi detectado o genótipo 3. Com relação à atividade inflamatória, seis pacientes foram classificados como A2 e dois foram A3. Em relação fibrose hepática, cinco pacientes foram classificados como F1, um F2 e dois como F3. A carga viral de todos os pacientes, no pré-tratamento era superior a 600.000 UI/ml. Após a quarta semana de tratamento oito pacientes apresentaram carga viral inferior ao limite de detecção e seis tornaram-se negativos na 12ª semana. A figura 1 demonstra que houve diminuição significativa da hemoglobina (A) e do hematócrito (B) na 4a,12a, 24a semanas após o tratamento, quando comparado com o pré-tratamento (S0). Como se pode observar na figura 1C houve redução significativa do número de leucócitos totais na 4a, após o início do tratamento. Demonstrou-se diferença estatisticamente significativa quando se comparou os valores da semana do pré-tratamento com os valores das demais semanas. Observou-se diminuição significativa das concentrações de ALT na 4a semana após o início do tratamento que se manteve até a 24a semana (Figura 1D). 71 Figura 1: Concentração de hemoglobina (A), hematócrito (B), percentual leucócitos totais (C) concentração de ALT (D) de pacientes com hepatite C crônica, submetidos a tratamento com interferon alfa 2a peguilado associado à ribavirina. As análises foram feitas antes do tratamento, 4, 12 e 24 semanas de tratamento. *(p < 0,05) Linfócitos TCD4+ aumentam na 4a semana após o início do tratamento, enquanto LTCD8+, diminuem a partir da 12a semana. Os resultados evidenciam que a subpopulação de LTCD4+ apresenta aumento na quarta semana após o início do tratamento, voltando à quantidades semelhante ao pré-tratamento na 12ª e 24a semanas após o início do tratamento (figura 2-A). Por outro lado não foi observado aumento de CD8+ no início do tratamento, mas estas células aparecem diminuidas na 12a e 24a semanas após o início do tratamento (figura 2-B). 72 Figura 2: Percentual de linfócitos TCD3+/CD4+ (A) e LTCD3+/CD8+ (B) no sangue periférico de pacientes com hepatite C crônica, tratados com interferon alfa 2a peguilado e ribavirina. As análises foram feitas antes do tratamento e após 4, 12 e 24 semanas de tratamento. *(p < 0,05) O tratamento com Interferon alpha peguilado induz aumento de IL-12, mas não IFN- γ, IL-10, IL-4, IL-5, IL-8, IL-6 e TNF-α. Ao analisarmos as concentrações destas citocinas observamos que a IL12, mostrou aumento progressivo entre as semanas alcançando concentrações mais elevadas na semana 24 após o início do tratamento quando comparado às de pré-tratamento (Figura 3- A). Paradoxalmente, com relação ao IFN-У, 73 que sustenta a resposta Th1, notou-se redução importante em suas concentrações logo após o início do tratamento, ou seja, na 4a semana mantendo baixas nas semanas 12 e 24 (Figura 3-B). Não foram observadas diferenças significativas nas concentrações de IL-10, no entanto, observa-se uma tendência ao aumento desta citocina, que atua regulando a resposta imune, na 4ª e 12ª semanas após o início do tratamento, com redução na 24ª semana (Figura 3-C). Para as citocinas IL-4, IL-5, CXCL-8 (figura 4 A, B e C), assim como para a IL-6 e o TNF-α, não foram observadas diferenças significativas entre as diferentes semanas analisadas. 74 Figura 3: Análise da concentração das citocinas IL-12, IFN-У e IL-10 e CXCL-8 no sangue periférico de pacientes com hepatite C crônica tratados com interferon peguilado alfa 2a e ribavirina. As análises foram feitas antes do tratamento e após 4, 12 e 24 semanas de tratamento. 75 Figura 4: Análise da concentração das citocinas IL-4, IL-5 e CXCL-8 no sangue periférico de pacientes com hepatite C crônica tratados com interferon peguilado alfa 2a e ribavirina. As análises foram feitas antes do tratamento e após 4, 12 e 24 semanas de tratamento. 76 Figura 5: Análise das citocinas IL-6 e TNF-α no sangue periférico de pacientes com hepatite C crônica, tratados com interferon peguilado alfa 2a e ribavirina. As análises foram feitas antes do tratamento e após 4, 12 e 24 semanas de tratamento. O tratamento com interferon peguilado α-2A induz a aumento da ativação de linfócitos e neutrófilos na 4ª semana de tratamento Na análise das sub-populações de leucócitos ativados no sangue periférico demonstrou-se um aumento de linfócitos CD69+ entre as semanas 0 e 4, seguindo-se com uma redução significativa entre as semanas 4 e 12, e mantendo baixo até a semana 24 (figura 6-A). Este perfil também foi observado 77 para neutrófilos (figura 6-B). No entanto, o tratamento induziu redução da ativação em monócitos (figura 6-C) na 4ª semana, com discreta elevação na 12ª, apresentando nova redução na 24ª semana após o início do tratamento. Como mostra a figura (6-D) houve menor expressão de CD69 em eosinófilos, a partir da 4ª semana, mantendo-se baixa até a 24ª semana de tratamento. Figura 6: Percentual de leucócitos ativados, marcados com CD69, linfócitos CD69+ (A), eosinófilos CD69+ (B), monócitos CD69+ (C) e neutrófilos CD69+ (D) no sangue periférico de pacientes com hepatite C crônica, tratados com interferon peguilado alfa 2a e ribavirina. As análises foram feitas antes do tratamento e após 4, 12 e 24 semanas de tratamento. *(p < 0,05) 78 DISCUSSÃO A terapia atual para a infecção pelo vírus da hepatite C consiste no uso de interferon-α peguilado (IFN) associado à ribavirina, um análogo da guanosina. O tratamento suprime a infecção viral em 70-80% dos pacientes infectados pelos genótipos 2 e 3, e 40-50% dos pacientes infectados com genótipo 1 28. No presente trabalho foram analisadas 14 pacientes, sendo que 78% apresentava o genótipo 1, enquanto que 22% o 3. A terapia atual é modesta na obtenção de RVS. Pouco mais de 50% dos portadores de infecção pelo genótipo 1 e em torno de 80% dos infectados pelo genótipo 3 obtêm RVS 6. Em nossa amostra de 14 pacientes, seis apresentaram resposta virológica rápida (RVR), sendo que dentre estes, três apresentavam o genótipo 3 e outros três, o genótipo 1, ou seja, negativaram a carga viral na quarta semana de tratamento. Os oito pacientes que não tiveram RVR apresentaram queda superior a 2 logs na carga viral. No entanto, estes pacientes apresentaram negativação da carga viral na 12ª semana de tratamento, resposta virológica precoce completa (RVPc). apresentavam o genótipo 1, tiveram recidiva 6 meses Três após pacientes, o que final tratamento de 48 semanas (dados não mostrados), demonstrando do que o mesmo não foi eficaz em manter a RVS nesta população, assim como demonstrado pelo trabalho citado anteriormente6. Considerando o importante papel das transaminases no diagnóstico da hepatite C, as concentrações de ALT foram avaliadas no pré-tratamento, na 4ª, 12ª e 24ª semanas após o início do tratamento. Foi observado que todos os pacientes apresentavam ALT elevada no pré-tratamento, o que demonstra estar ocorrendo lesão hepatocitária. Após a 4ª semana do tratamento com IFN e ribavirina observou-se uma diminuição significativa desta enzima, e se manteve baixa até o final do tratamento. Estes dados vão de encontro com a diminuição da carga viral, observada nestes pacientes, como citado anteriormente 29. 79 Vários estudos avaliando os efeitos do tratamento com IFN associado à ribavirina sobre a resposta imune tem apresentado resultados conflitantes. Neste estudo avaliamos o efeito do tratamento sobre a resposta imune celular e perfil da produção de citocinas na população de pacientes com hepatite C crônica. Nossos dados demonstraram que o tratamento induziu leucopenia, observado após a 4ª semana de tratamento que se manteve até a 24ª semana. Estes dados são semelhantes aos encontrados por Lee et al., 2010 28. Naquele estudo os autores relataram que o tratamento induziu uma intensa leucopenia na população de pacientes com hepatite C crônica estudada por eles. Os linfócitos TCD4+ reconhecem antígenos apresentados nas moléculas MHC de classe II presentes nas APCs e células TCD8+ em MHC de classe I. Subsequentemente linfócitos TCD4+ desempenham inúmeras funções efetoras, incluindo ativação direta de macrófagos e linfócitos B antígeno específicos, assim como a ativação de linfócitos TCD8+ dependentes de citocinas, e estas células tem efeito direto na eliminação de células infectadas por mecanismos citolíticos e não citolíticos 30. Nossos resultados demonstraram que houve aumento de TCD4+ na quarta semana, com redução do número destas células na 12a e 24a semanas após o início do tratamento. Estes dados sugerem um importante papel dos TC4+ no início da resposta imune, culminando com a diminuição da carga viral e induzindo a RVR. Dados da literatura demonstram que na infecção persistente pelo HCV ocorre redução substancial de células TCD4+ antígeno específicas 31 e que em indivíduos cronicamente infectados não é comum encontrar forte resposta de células TCD4+ de forma sustentada, o que difere naqueles indivíduos que eliminam o vírus espontaneamente 23. Quando se avalia o perfil de TCD8+ observa-se que houve redução significativa no número destas células na 12a e 24a semanas após o tratamento. Estes dados corroboram aos encontrados por Lee et al., 2010 28 . Essa redução pode sugerir um importante papel dos linfócitos TCD8+ na fase inicial da resolução da infecção mesmo naqueles pacientes cronicamente infectados quando estimulados pela ação do IFN. Provavelmente o interferon 80 promova a migração destas células para o fígado, levando a redução das mesmas na circulação periférica. Após a exposição ao vírus as células da resposta imune são recrutadas para o fígado para o controle da replicação viral, entretanto na maioria dos casos a infecção crônica é estabelecida. A resposta imune nesta fase pode ter papel benéfico ou deletério ao hospedeiro32. O interferon aumenta a produção de citocinas Th1. O aumento da resposta Th1 está associado ao aumento de linfócitos TCD4+, TCD8+ com consequente redução da carga viral. As citocinas IL-12 e IFN-У tem ações de indução de resposta Th1. No presente estudo avaliou-se o perfil de citocinas nestes pacientes, nos diferentes tempos estudados. Não observou-se diferenças estatísticas significativas em relação a IL-4, IL-5, CXCL-8 e IFN-γ. No entanto, quando analisou-se o perfil da IL-12, foi observado aumento crescente, na 4a, 12a e 24a semanas após o início do tratamento. Este fato é interessante uma vez que a IL-12 tem importante papel no direcionamento da resposta imune para o perfil Th1. Diferente dos dados encontrados neste estudo, Brady et al., 2003 demonstram que o HCV subverte o sistema imune ao induzir a produção de IL10 e inibir a produção de IL12 pelos monócitos, o que por sua vez inibe a ativação de células dendríticas que levam à diferenciação de células Th1 33 . Os dados encontrados por estes autores corroboram os achados de Sarih et al., 2000, que indicam que a produção diminuída tanto de IL12 quanto de IFN-γ pode contribuir para a persistência viral 34. Contrariando nossos dados, em outro estudo com 30 pacientes e 25 controles negativos, Abayali et al., 2003, observaram que as concentrações de IL4 e IL10, estavam signicativamente elevados nos pacientes com hepatite C crônica quando comparados aos controles 35 . Corroborando os dados do presente estudo, os autores citados anteriormente35, não observaram diferenças significativas em relação ao IFN-γ. Estes dados sugerem que o aumento da IL-12 observado no presente trabalho tem importante papel na indução da resposta Th1 e eliminação viral no início da infeção, como citado 81 anteriormente. No entanto, a ausência do IFN-γ, nestes indivíduos poderia estar relacionado com a diminuição dos (LTCD4+/CD8+), observado na 12a e 24a semanas após o início do tratamento. As células T regulatórias antígenoespecíficas, que secretam (IL-10), contribuem para a persistência viral, e as células mononucleares de pacientes com infecção crônica pelo HCV, secretam IL-10, mas não IFN-gama em resposta às proteínas não estruturais do vírus 33. Por outro lado, a resposta celular também predominantemente (Th1) exerce papel central no controle da replicação viral 17, 36. Além disso, dados sugerem que existe uma desregulação da população de células TCD4+ no sangue periférico com a produção inapropriada de citocinas aos antígenos virais contribuindo para a persistência viral e para a doença crônica. Entretanto, os resultados de diferentes estudos são conflitantes no que diz respeito ao predomínio de citocinas de resposta Th1 ou Th2 que resulta na inabilidade do hospedeiro em resolver a infecção pelo HCV18. Depois de estabelecida a infecção crônica pelo HCV, linfócitos citotóxicos podem exercer algum controle sobre a infecção viral. Entretanto, estes mesmos efetores são responsáveis pelo dano hepático progressivo, característico da hepatite C crônica 31 . Leroy et al., 2003, encontraram forte evidência do papel de células TCD8+ como efetoras de dano hepático e de sua incapacidade de controlar a replicação viral 36. Neste estudo observou-se aumento da frequência de ativação de linfócitos na 4ª semana após o início do tratamento, o que corresponde ao aumento de TCD4+ e IL-12. Estes dados sugerem que o tratamento com IFN parece induzir aumento de IL-12 que por sua vez modula a expressão de CD69, o marcador de ativação celular. Por outro lado, leucócitos da imunidade inata, apresentaram menor frequência do marcador de ativação celular, sugerindo que a infecção pelo HCV induz uma resposta vírus-específica que pode ser potenciada pela ação do tratamento com IFN. Este parece ser um evento importante uma vez que os resultados apresentados demonstraram diminuição da carga viral na maioria dos pacientes na 4ª e 12ª semanas após o 82 início do tratamento. No entanto, alguns pontos ainda precisam ser melhor elucidados para o completo entendimento dos mecanismos efetores da resposta imune sobre o controle da infecção pelo HCV. 83 REFERÊNCIAS 1. Bantel H, Schultze-Osthoff K. Apoptosis in hepatitis C vírus infection. Cell Death Differ 2003; 10(suppl 1): S48-S58. 2. World Health Organization (2007) Weekly Epidemiological Record 74, 421- 428. 3. Ferraz MLG. Hepatite C. Programa de Educação Médica Continuada – Sociedade Brasileira de Hepatologia 2010; 3-6. 4. Hugle T, Cerny A. Current therapy and new molecular approaches to antiviral treatment and prevention of hepatitis C. Rev Med Virol 2003; 13 (6): 361-71. 5. Calabrese LH, Zein N, Vassilopoulos D. Safety of antitumor necrosis factor (anti-TNF) therapy in patients with chronic viral infections : hepatitis C, hepatitis B and HIV infection. Ann Rheumat Dis 2004 ; 63(Suppl II):ii18-ii24. 6. Ghany MG, Strader DB, Thomas DI, Seef LB. American Association for the Study of the Liver Diseases: Diagnosis, management and treatment of hepatitis C: an update. Hepatology, 2009; 49: 1335-74. 7. Kanto T, Hayashi N. Immunopathogenesis of hepatitis C virus infection: multifaceted strategies subverting innate and adaptive immunity. Internal Medicine 2006; 45(4):183-91. 8. Chang KM. Immunopathogenesis of hepatitis C virus infection. Clin Liver Dis 2003; 7(1) :89-105. 9. Pawlotsky JM. The nature of interferon-alpha resistance in hepatitis C virus infection. Curr Opin Infect Dis 2003; 16(6), 587-92. 10. Fried MW, Shiffman ML, Reddy KR, Smith C, Marinos G, Gonçales Jr FL et al. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection. N Engl J Méd 2002; 347(13) :975-82. 11. Poynard T, Yuen MF, Ratziu V, Lai CL. Viral hepatitis C. Lancet 2003; 362(9401):2095-100. 12. Dixit NM, Layden-Almer JR, Layden TJ, Perelson AS. Modelling how ribavirin improves interferon response rates in hepatitis C virus infection. Nature 2004 ; 432(7019) :922-4. 84 13. Thevenot T, Di Martino V, Lunel-Fabiani F, Vanlemmens C, Becker MC, Bronowicki JP et al. Complementary treatment of chronic viral hepatitis C. Gastroenterol Clin Biol 2006; 30(2):197-214. 14. Gale Jr M, Foy EM. Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus. Nature 2005. 436(7053): 939-45. 15. Kountouras J, Zavos C, Chatzopoulos D. Apoptosis in hepatitis C. J Viral Hepat 2003; 10(5):335-42. 16. Jacobson-Brown PM, Neuman MG. Immunopathogenesis of hepatitis C virus infection: Th1/Th2 responses and the role of cytokines. Clin Biochem 2001; 34(3):167-71. 17. Darling JM, Wright TL. Immune responses in hepatitis C: is virus or host the problem? Curr Opin Infect Dis 2004 ; 17(3) :193-8. 18. Gigi E, Raptopoulou-Gigi M, Kalogeridis A, Masiou S, Orphanou E, Vrettou E, Lalla TH, Sinakos E, Tsapas V. Cytokine mRNA expression in hepatitis C virus infection: TH1-TH2 cytokine profile in subjects with selflimited disease. Journal of Viral Hepatitis, 2008; 15: 145-154. 19. Sun J, Li K, Shata MT, Chan TS. The immunologic basis for hepatitis C infection. Curr Opin Gastroenterol 2004; 20(6):598-602. 20. Ahmad A, Alvarez F. Role of Nk and NKT cells in the immunopathogenesis of HCV-induced hepatitis. J leukoc Biol 2004; 76(4):743-59. 21. Pavio N, Lai MMC. the hepatitis C virus persistence: how to evade the immune system? J Biosci 2003; 28(3):287-304. 22. Neuman MG, Benhamou JP, Marcellin P, Valla D, Malkiewicz IM, Katz GG, Trepo C, Bourliere M, Cameron RG, Cohen L, Morgan M, Schmilovitz-Weiss H, Ben-Ari Z. Cytokine-chemokine and apoptotic signatures in patients with hepatitis C. Tranl. Res. 2007; 149(3): 126-36. 23. Willberg C, Barnes E, Klenerman P. HCV immunology – death and the maiden T cell. Cell Death and Differentiation 2003; 10:S39-S47. 24. Piazzolla G, Torotorella C, Schiraldi O, Antonaci S. Relationship between interferon-gamma, interleukine-10, and interleukine-12 production in chronic hepatitis C and in vitro effects of interferon-alpha. J Clin Immunol 2000; 20(1):54-61. 25. Ghany MG, Strader DB, Thoma DL, Seef LB.Diagnosis, management 85 andtreatment of hepatitis C: an update. Hepatology 2009; 49:1335-74. 26. Amati L, Caradonna L, Magrone T, Mastronardi ML, Cuppone R, Cozzolongo R et. al. Modifications of the immune responsiveness in patients with hepatitis C virus infection following treatment with IFNalpha/ribavirin. Curr Pharm Des 2002; 8(11):981-93. 27. Jia H, Du J, Zhu S, Ma, Y, Cai H. Clinical observation of serum IL-18, IL10 and sIL-2R levels inpatients with chronic hepatitis C pré- and post antiviral treatment. Chin Med J (Engl) 2003; 116(4):605-8. 28. Lee S, Hammond T, Watson MW, Flexman JP, Cheng W, Fernandez S, Price P. Could a loss of memory T cells limit responses to hepatitis C virus (HCV) antigens in blood leucocytes from patients chronically infected with HCV before and during pegylated interferon-α and ribavirin therapy. Clinical and Experimental Immunology, 2010; 161: 118-126. 29. Yagura M, Tanaka A, Kamitsukasa H, Otsuka H, Kanno S, Aoyama T. Re-evaluation of the serum alanine aminotransferase upper normal limit in chronic hepatitis C patients. Intern Med. 2010; 49 (6): 525-528. 30. Neumann-Haefelin C, Blum HE, Chisari FV, Thimme R. T cell response in hepatitis C virus infection. J Clin Virol 2005; 32(2):75-85. 31. Semmo N, Krashias G, Willberg C, Klenerman P. Analysis of the relationship between cytokine secretion and proliferative capacity in hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis, 2007; 14: 492-502. 32. Wald O, Weiss ID, Galun E, Peled A. Chemokines in hepatitis C virus infection: Pathogenesis, prognosis and therapeutics. Review Article. Cytokine 2007; 39: 50-62. 33. Brady MT, McDonald AJ, Rowan AG, Mills KH. Hepatitis C virus nonstructural protein 4 suppress Th1 responses by stimulating IL-10 production from monocytes. Eur J Immunol 2003; 33 (12):3448-57. 34. Sarih M, Bouchirit N, Benslimane A. Different cytokine profiles of peripheral blood mononuclear cells from patients with persistent and selflimited hepatitis C virus infection. Immunol Lett 2000; 74(2):117-20. 35. Abayali B, Canataroglu A, Akkiz H. Serum profile of T helper 1 and T helper 2 cytokines in patients with chronic hepatitis C vírus infection. Turk J Gastroenterol 2003; 14(1):7-11. 36. Leroy V, Vigan I, Mosnier JF, Dufeu-Duchese T, Pernollet M, Zarski JP, 86 Marche PN, Jouvin-Marche E. Phenotypic and functional characterization of intrahepatic T lymphocytes during chronic hepatitis C. Hepatology 2003; 38 (4): 829-41. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem os pacientes que doaram sangue para este estudo e ao Departamento de atendimento ao paciente da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Manaus, Brasil. Este estudo recebeu suporte financeiro do CNPq, FAPEAM, FINEP, IMT-SP, FMT-AM e HEMOAM. CONFLITOS DE INTERESSE Os autores declaram não haver conflitos de interesses 87 5. DISCUSSÃO A discussão deste trabalho envolve três momentos distintos: 1) o relato de um caso de paciente portador de dois diferentes genótipos que apresenta resposta virológica sustentada, 2) a distribuição dos genótipos de 69 indivíduos no estado do Amazonas e 3) a análise do perfil imunológico de pré-tratamento e de resposta ao tratamento na quarta, décima segunda e vigésima quarta semana. O HCV constitui significativa causa de morbimortalidade humana, é um vírus emergente1 do gênero Hepacivirus, incluído na família Flaviridae. Até o momento, foram Identificados seis genótipos de HCV, distintos, mas relacionados, além de múltiplos subtipos, por meio de correlações moleculares: 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 e 6. A determinação do genótipo relacionado a cada indivíduo é importante por apresentar valor preditivo em termos de resposta à terapia antiviral, com melhor resposta associada aos genótipos 2 e 3 do que ao genótipo 14. Como relatado neste trabalho, observamos que o paciente apresentava infecção por dois diferentes genótipos 1 e 2 do HCV. Este fato explica-se porque como ocorre com todos os RNA-vírus, falta à polimerase do HCV, uma função de leitura de prova (proof-reading function). Isto permite que, no curso de infecção persistente, a replicação viral propensa a erros gere um repertório de variantes virais altamente relacionadas, mas geneticamente distintas, ou quasispécies. Esta variabilidade genética concede ao HCV um notável potencial adaptativo, tendo sido implicado com a evasão e controle da resposta do hospedeiro à infecção e a uma sensibilidade diferencial à terapia com Interferon5. Além disso, trabalhos recentes do nosso grupo demonstraram que o genótipo 1 do HCV é o de maior prevalência no Estado do Amazonas, seguido dos genótipos 2 e 3, podendo sugerir ainda que o paciente relatado tenha tido contato com ambos os genótipos dos vírus. O tratamento da hepatite C visa deter a progressão da doença hepática pela inibição da replicação viral. O protocolo terapêutico do Ministério da Saúde preconiza a administração de interferon alfa em associação com a ribavirina, variando o tempo de tratamento de acordo com o genótipo do HCV. 88 Considerando que o genótipo 1 tem sido descrito como o que apresenta pior resposta à terapia, o Ministério da Saúde, preconiza, nestes casos, um tratamento mais prolongado, com interferon peguilado. Tem sido sistematicamente descrita uma correlação entre o genótipo viral e a resposta terapêutica. Dados da literatura indicam que para os genótipos 2 e 3 o IFN-α em combinação com a ribavirina são eficazes em 80% dos casos. Tempo inferior a 12 semanas de interferon-α e ribavirina seria tão eficaz quanto um esquema de 24 semanas8. Estes dados evidenciam que o tratamento pode ser mais ou menos eficaz de acordo com o genótipo viral encontrado, sendo a resposta clínica melhor com os genótipos tipos 2 e 3 quando comparada aos genótipos 1a e 1b, como exposto anteriormente. No caso relatado neste trabalho, o tratamento foi eficaz, mesmo sendo descontinuado na nona semana após seu início, uma vez que manteve resposta virológica sustentada no controle de 6 e 12 meses após a suspensão do tratamento e manteve-se assintomático, com concentrações normais das transaminases. A detecção do HCV é de crucial importância para o controle da doença em nível global, sendo que mesmo em países desenvolvidos, o número de mortes deve continuar aumentando devido à inadequada detecção, o que posterga o tratamento 8. Esta detecção é baseada em 2 tipos de testes: os ensaios sorológicos para detecção de anticorpos específicos (cuja sensibilidade tem aumentado progressivamente) e os testes moleculares para detecção de partículas virais 3 . Especialmente em relação aos testes moleculares, a determinação da carga viral permite avaliar a evolução da resposta terapêutica, enquanto a genotipagem prediz a resposta e influencia no regime de tratamento escolhido 3. O HCV é notadamente bem sucedido, produzindo uma infecção persistente que continuará por toda a vida do indivíduo, com vastas oportunidades de transmissão dentro da população humana, a menos que 89 interrompida por uma terapia baseada no uso do interferon (IFN) 9. Neste estudo, amostras de 69 pacientes com diagnóstico de hepatite C foram analisadas. Nesta população de estudo a maioria dos indivíduos infectados era do sexo masculino, e encontrava-se na faixa etária acima dos 40 anos. Estes dados estão de acordo aos encontrados por Torres e colaboradores, 2009 10 em doadores de sangue. Naquele estudo os autores relataram uma relação estatística entre a viremia do HCV e a faixa entre 45-55 anos. Estes dados sugerem que estes indivíduos foram infectados pelo HCV antes da inclusão de exames sorológicos obrigatórios no Brasil e por se tratar de uma infecção latente e muitas vezes silenciosa passaram a apresentar alterações do quadro clínico mais tardiamente. O protocolo terapêutico preconizado atualmente pelo Ministério da Saúde do Brasil 7, inclui a administração de interferon alfa em associação com o antiviral ribavirina, de acordo com o genótipo viral. Desta forma, é obrigatório a genotipagem de amostras de pacientes soropositivos antes do início do tratamento. Apesar desta obrigatoriedade, dados relacionados à prevalência do HCV no Estado do Amazonas, ainda são escassos. Em 2005, Campiotto e colaboradores11, em um estudo multicêntrico, descreveram que o genótipo 1 era o mais prevalente no Estado do Amazonas. No entanto, poucos indivíduos foram analisados naquela época. Neste estudo foi observado uma maior prevalência do genótipo 1, seguido do 3 e 2. O Genótipo 1 é predominante em todo o mundo, e é composto de dois subtipos principais - 1a e 1b. Além disso, tem sido demonstrado que as taxas de crescimento destes subtipos são maiores do que os genótipos 4 e 6. Na população de Alagoas, a prevalência do subtipo 1b (65,2%) foi maior do que a observada em Salvador, Bahia, onde este subtipo só ocorreu em 38,6% das amostras positivas para o anti-HCV. No entanto, foi muito semelhante aos resultados obtidos a partir de amostras de HCV positivas de outros estados brasileiros, como Acre, Amazonas e Pará (Região Norte), bem como Pernambuco, com frequências de 60% e 71% para cada região, respectivamente 12. 90 Ainda, Campiotto e colaboradores (2005) 11 , demonstraram que a frequência do genótipo 3 variou entre as diferentes regiões brasileiras, com maior prevalência em Santa Catarina (50%) e Paraná (41,7%), Região Sul, bem como Goiás, região Centro-oeste (37,1%), e Pernambuco (36,9%). Dados semelhantes foram publicados por Torres e colaboradores em 2009. Estes autores demonstraram a maior prevalência do genótipo 1, seguido do genótipo 3, na população de doadores de sangue do Estado do Amazonas 10 . Estes dados corroboram com os encontrados para a população de pacientes da Fundação de Medicina Tropical, onde observamos maior prevalência do genótipo 1, seguido do 3. No entanto, naquele estudo os autores não detectaram o genótipo 2 na população de doadores de sangue. Segundo estes autores, a distribuição geográfica demonstra os genótipos 1 e 3 em Manaus, e somente o 1, em amostras obtidas em doadores de sangue do interior do Estado. Esta distribuição dos genótipos é semelhante ao que é encontrada por muitas cidades brasileiras e países do Oriente e pode refletir na via de introdução do HCV na Amazônia. O vírus foi provavelmente introduzido na Região Amazônica por imigrantes europeus e medicamentos importados derivados do sangue para o Brasil. Esta hipótese é corroborada pela identificação do genótipo 3, exclusivamente, em Manaus, sugerindo que esta cidade é o ponto de chegada do HCV e que novas cepas foram disseminadas a partir de Manaus para o interior 11 , revisto por Torres e colaboradores 10 . Em nosso estudo foi também detectado o genótipo 2 do HCV em pacientes moradores de Manaus, reforçando a hipótese de que esta cidade é a porta de entrada de diferentes genótipos do HCV e distribuição do mesmo para outras localidades, como descrito anteriormente. A terapia atual para a infecção pelo vírus da hepatite C consiste no uso de interferon-α peguilado (IFN) associado à ribavirina, um análogo da guanosina. O tratamento suprime a infecção viral em 70-80% dos pacientes infectados pelos genótipos 2 e 3, e 40-50% dos pacientes infectados com genótipo 1 28. 91 Neste trabalho foram analisados 14 pacientes, sendo que 78% apresentava o genótipo 1, enquanto que 22% o 3. A terapia atual é modesta na obtenção de RVS. Pouco mais de 50% dos portadores de infecção pelo genótipo 1 e em torno de 80% dos infectados pelo genótipo 3 obtêm RVS 6. Em nossa amostra de 14 pacientes, seis apresentaram resposta virológica rápida (RVR), sendo que dentre estes, três apresentavam o genótipo 3 e outros três, o genótipo 1, ou seja, negativaram a carga viral na quarta semana de tratamento. Os oito pacientes que não tiveram RVR apresentaram queda superior a 2 logs na carga viral. No entanto, estes pacientes apresentaram negativação da carga viral na 12ª semana de tratamento, resposta virológica precoce completa (RVPc). apresentavam o genótipo 1, tiveram recidiva 6 meses Três após pacientes, o que final tratamento de 48 semanas (dados não mostrados), demonstrando do que o mesmo não foi eficaz em manter a RVS nesta população, assim como demonstrado pelo trabalho citado anteriormente6. Considerando o importante papel das transaminases no diagnóstico da hepatite C, as concentrações de ALT foram avaliadas no pré-tratamento, na 4ª, 12ª e 24ª semanas após o início do tratamento. Foi observado que todos os pacientes apresentavam ALT elevada no pré-tratamento, o que demonstra estar ocorrendo lesão hepatocitária. Após a 4ª semana do tratamento com IFN e ribavirina observou-se uma diminuição significativa desta enzima, e se manteve baixa até o final do tratamento. Estes dados vão de encontro com a diminuição da carga viral, observada nestes pacientes, como citado anteriormente 29. Vários estudos avaliando os efeitos do tratamento com IFN associado à ribavirina sobre a resposta imune têm apresentado resultados conflitantes. Neste estudo avaliamos o efeito do tratamento sobre a resposta imune celular e perfil da produção de citocinas na população de pacientes com hepatite C crônica. Nossos dados demonstraram que o tratamento induziu leucopenia, observado após a 4ª semana de tratamento que se manteve até a 24ª semana. Estes dados são semelhantes aos encontrados por Lee et al., 2010 28. Naquele 92 estudo os autores relataram que o tratamento induziu uma intensa leucopenia na população de pacientes com hepatite C crônica estudada por eles. Os linfócitos TCD4+ reconhecem antígenos apresentados nas moléculas MHC de classe II presentes nas APCs e células TCD8+ em MHC de classe I. Subsequentemente linfócitos TCD4+ desempenham inúmeras funções efetoras, incluindo ativação direta de macrófagos e de linfócitos B antígeno-específicos. Assim como a ativação de linfócitos TCD8+ dependentes de citocinas, e estas células tem efeito direto na eliminação de células infectadas por mecanismos citolíticos e não citolíticos 30. Nossos resultados demonstraram que houve aumento de TCD4+ na quarta semana, com redução do número destas células na 12a e 24a semanas após o início do tratamento. Estes dados sugerem um importante papel dos TC4+ no início da resposta imune, culminando com a diminuição da carga viral e induzindo a RVR. Dados da literatura demonstram que na infecção persistente pelo HCV ocorre redução substancial de células TCD4+ antígenoespecíficas31 e que em indivíduos cronicamente infectados não é comum encontrar forte resposta de células TCD4+ de forma sustentada, o que difere naqueles indivíduos que eliminam o vírus espontaneamente 23. Quando se avalia o perfil de TCD8+ observa-se que houve redução significativa no número destas células na 12a e 24a semanas após o tratamento. Estes dados corroboram aos encontrados por Lee et al., 2010 28 . + Essa redução pode sugerir um importante papel dos linfócitos TCD8 na fase inicial da resolução da infecção mesmo naqueles pacientes cronicamente infectados quando estimulados pela ação do IFN. Provavelmente o interferon promova a migração destas células para o fígado, levando a redução das mesmas na circulação periférica. Após a exposição ao vírus as células da resposta imune são recrutadas para o fígado para o controle da replicação viral, entretanto na maioria dos casos a infecção crônica é estabelecida. A resposta imune nesta fase pode ter papel benéfico ou deletério ao hospedeiro32. 93 O interferon aumenta a produção de citocinas Th1. O aumento da resposta Th1 está associado ao aumento de linfócitos TCD4+, TCD8+ com consequente redução da carga viral. As citocinas IL-12 e IFN-У tem ações de indução de resposta Th1. No presente estudo avaliou-se o perfil de citocinas nestes pacientes, nos diferentes tempos estudados. Não observou-se diferenças estatísticas significativas em relação a IL-4, IL-5, CXCL-8 e IFN-γ. No entanto, quando analisou-se o perfil da IL-12, foi observado aumento crescente, na 4a, 12a e 24a semanas após o início do tratamento. Este fato é interessante uma vez que a IL-12 tem importante papel no direcionamento da resposta imune para o perfil Th1. Diferente dos dados encontrados neste estudo, Brady et al., 2003 demonstram que o HCV subverte o sistema imune ao induzir a produção de IL10 e inibir a produção de IL12 pelos monócitos, o que por sua vez inibe a ativação de células dendríticas que levam à diferenciação de células Th1 33 . Os dados encontrados por estes autores corroboram os achados de Sarih et al., 2000, que indicam que a produção diminuída tanto de IL12 quanto de IFN-γ pode contribuir para a persistência viral 34. Contrariando nossos dados, em outro estudo com 30 pacientes e 25 controles negativos, Abayali et al., 2003, observaram que as concentrações de IL4 e IL10, estavam signicativamente elevados nos pacientes com hepatite C crônica quando comparados aos controles 35 . Corroborando os dados do presente estudo, os autores citados anteriormente35, não observaram diferenças significativas em relação ao IFN-γ. Estes dados sugerem que o aumento da IL-12 observado no presente trabalho tem importante papel na indução da resposta Th1 e eliminação viral no início da infeção, como citado anteriormente. No entanto, nestes indivíduos, a ausência do IFN-γ poderia estar relacionada com a diminuição dos (LTCD4+/CD8+), observado na 12a e 24a semanas após o início do tratamento. As células T regulatórias antígenoespecíficas, que secretam (IL-10), contribuem para a persistência viral, e as células mononucleares de pacientes com infecção crônica pelo HCV, secretam IL-10, mas não IFN-gama em resposta às proteínas não estruturais do vírus 33 . 94 Por outro lado, a resposta celular também predominantemente (Th1) exerce papel central no controle da replicação viral 17, 36. Além disso, dados sugerem que existe uma desregulação da população de células TCD4+ no sangue periférico com a produção inapropriada de citocinas aos antígenos virais contribuindo para a persistência viral e para a doença crônica. Entretanto, os resultados de diferentes estudos são conflitantes no que diz respeito ao predomínio de citocinas de resposta Th1 ou Th2 que resulta na inabilidade do hospedeiro em resolver a infecção pelo HCV18. Depois de estabelecida a infecção crônica pelo HCV, linfócitos citotóxicos podem exercer algum controle sobre a infecção viral. Entretanto, estes mesmos efetores são responsáveis pelo dano hepático progressivo, característico da hepatite C crônica 31 . Leroy et al., 2003, encontraram forte + evidência do papel de células TCD8 como efetoras de dano hepático e de sua incapacidade de controlar a replicação viral 36. Neste estudo observou-se aumento da frequência de ativação de linfócitos na 4ª semana após o início do tratamento, o que corresponde ao aumento de TCD4+ e IL-12. Estes dados sugerem que o tratamento com IFN parece induzir aumento de IL-12 que por sua vez modula a expressão de CD69, o marcador de ativação celular. Por outro lado, leucócitos da imunidade inata, apresentaram menor frequência do marcador de ativação celular, sugerindo que a infecção pelo HCV induz uma resposta vírus-específica que pode ser potenciada pela ação do tratamento com IFN. Este parece ser um evento importante uma vez que os resultados apresentados demonstraram diminuição da carga viral na maioria dos pacientes na 4ª e 12ª semanas após o início do tratamento. No entanto, alguns pontos ainda precisam ser melhor elucidados para o completo entendimento dos mecanismos efetores da resposta imune sobre o controle da infecção pelo HCV. 95 6. CONCLUSÕES - O genótipo 1 foi mais prevalente que os genótipos 2 e 3 e acometeu mais o sexo masculino que o feminino na população estudada. - Em nosso estudo foi também detectado o genótipo 2 do HCV em pacientes moradores de Manaus, reforçando a hipótese de que esta cidade é a porta de entrada de diferentes genótipos do HCV e distribuição do mesmo para outras localidades, como descrito anteriormente. - Ocorreu redução significativa das concentrações de ALT após a 4ª semana em todos os pacientes submetidos ao tratamento com IFN-α 2a e ribavirina. - Obtivemos taxa de RVR de 42,8% e RVP de 57,1%, tendo 100% de negativação da carga viral até a 12ª semana de tratamento. - O tratamento parece induzir a produção da IL-12 que desempenha importante papel no direcionamento da resposta imune para o perfil Th1, induzindo aumento de células CD4+ no início do tratamento e ativação celular. -- Não foi observado aumento de IFN-γ, corroborando a diminuição de LTCD4+ e CD8+ após a 12a semana, sugerindo que esta citocina seria importante para a manutenção do perfil de resposta Th 1. - A redução significativa dos linfócitos TCD8+ na 12a e 24a semanas após o tratamento, pode sugerir um importante papel destas células naqueles pacientes cronicamente infectados pelo HCV quando estimulados pela ação do IFN-α. 96 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Alter HJ, Sheef LB. Recovery, persistence and sequelae in hepatitis C vírus infection: a perspective in long term outcome. Semin Liver Disease 2000; 20: 17-35. 2. Choo QL, Kuo G, Weiner AI, Overley LR, Bradley DW, Hougthon M. Isolation of a cDNA clone from a blood-borne non-A non-B viral hepatitis genome. Science 1989; 244: 359-62. 3. Houghton M, Weiner A, Han J, Kuo G, Choo QL. Molecular biology of the hepatitis C viruses: implications for diagnosis, development and control of viral disease. Hepatology 1991; 14(2):381-8. 4. Lauer GM, Walker BD. Hepatitis C virus infection. N Engl J Med 2001; 345(1):41-52. 5. Sáez-Alquezar A, Bassit L, Sabino EC. Hepatites virais. In: Ferreira WA, Ávila SLM. Diagnóstico laboratorial das principais doenças infecciosas e auto-imunes. 2ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 2001. P. 74-91. 6. Gale Jr M, Foy EM. Evasion of intracellular host defence by hepatitis C virus. Nature 2005. 436(7053): 939-45. 7. Bantel H, Schultze-Osthoff K. Apoptosis in hepatitis C vírus infection. Cell Death Differ 2003; 10(suppl 1): S48-S58. 8. World Health Organization (2007) Weekly Epidemiological Record 74, 421- 428. 9. Calabrese LH, Zein N, Vassilopoulos D. Safety of antitumor necrosis factor (anti-TNF) therapy in patients with chronic viral infections : hepatitis C, hepatitis B and HIV infection. Ann Rheumat Dis 2004 ; 63(Suppl II):ii18-ii24. 10. Poynard T, Yuen MF, Ratziu V, Lai CL. Viral hepatitis C. Lancet 2003; 362(9401):2095-100. 11. Heydtmann M, Shields P, McCaughan G, Adams D. Cytokines and chemokines in the immune response to hepatitis C infection. Curr Opin Infect Dis 2001; 14(3):279-87. 12. Leroux-Roels G. Development of prophylactic and therapeutic vaccines against hepatitis C virus. Experts Rev Vaccines 2005; 4(3):351-71. 13. Torres KL, Malheiro A, Tateno A, Lima TA, Maia LPV, Pimentel JPD, 97 Morais MPE, Usui CSM, Braga FO, Silva IAF, Vasquez F, Levi JE. Hepatitis C vírus in Blood Donors, Brazil. Emerging Infectious Disease. 2009; 15: 676-678. 14. Silva LC, Pinho JRR. Hepatite C. in: Gayotto LCC, Alves VAF. Doenças do Fígado e Vias Biliares. São Paulo: Editora Atheneu; 2001. P. 554-64. 15. Araújo ARS. Hepatites B e C em Manaus: perfil clínico-epidemiológico e distribuição espacial de casos conhecidos desde 1997 a 2001. Rio de Janeiro. Biblioteca de Saúde Pública, 2004. 16. Willberg C, Barnes E, Klenerman P. HCV immunology – death and the maiden T cell. Cell Death and Differentiation 2003; 10:S39-S47. 17. Ferraz MLG. Hepatite C. Programa de Educação Médica Continuada – Sociedade Brasileira de Hepatologia 2010; 3-6. 18. Levi JE, Takaoka DT, Garrini RH, Fachini RM, Focaccia R, De Bortholi Santos E, Mitre HP, De Mendonça JS, De Paula Cavalheiro N, Barone AA, Wendel S. Three cases of infection with hepatitis C vírus genotype 5 among brazilian hepatitis patients. J Clin Microbiol, 2002; 40(7):2645-7. 19. Kanto T, Hayashi N. Immunopathogenesis of hepatitis C virus infection: multifaceted strategies subverting innate and adaptive immunity. Internal Medicine 2006; 45(4):183-91. 20. Pawlotsky JM. Use and interpretation of hepatitis C vírus diagnostic assays. Clin Liver Dis 2003; 7(1):127-37. 21. Ghany MG, Strader DB, Thomas DI, Seef LB. American Association for the Study of the Liver Diseases: Diagnosis, management and treatment of hepatitis C: an update. Hepatology, 2009; 49: 1335-74. 22. Forns X, Costa J. HCV virological assessment. J Hepatol 2006; 44(1 Suppl):S35-9. 23. Pawlotsky JM. The nature of interferon-alpha resistance in hepatitis C virus infection. Curr Opin Infect Dis 2003; 16(6), 587-92. 24. Strauss E. Hepatite C. Rev Soc Bras Med Trop 2001; 24(1):69-82. 25. Focaccia R, Barbosa UA, Galante VC. Tratamento da Hepatite C – Abordagem atual. in: Focaccia R. Tratado de Hepatites Virais. 1ª ed. São Paulo: Editora Atheneu; 2003. P. 573-78. 26. Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Portaria 034, de 28 de setembro de 2007. Dispõe sobre Protocolo Clínico e 98 Diretrizes Terapêuticas para Hepatite Viral C. 27. Marcelin P, Boyer N, Gervais A, Martinot M, Pouteau M, Casteunal C, Kilani A, Areias J, Auperin A, Benhamou JP, Degott C, Erlinger S. Longterm histologic improvement and loss of detectable intrahepatic HCV RNA in patients with chronic hepatitis C and sustained response to interferon-alpha therapy. Ann Intern Med 1997; 127:875-81. 28. Kountouras J, Zavos C, Chatzopoulos D. Apoptosis in hepatitis C. J Viral Hepat 2003; 10(5):335-42. 29. Fried MW, Shiffman ML, Reddy KR, Smith C, Marinos G, Gonçales Jr FL et al. Peginterferon alfa-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection. N Engl J Méd 2002; 347(13) :975-82. 30. Dixit NM, Layden-Almer JR, Layden TJ, Perelson AS. Modelling how ribavirin improves interferon response rates in hepatitis C virus infection. Nature 2004 ; 432(7019) :922-4. 31. Thevenot T, Di Martino V, Lunel-Fabiani F, Vanlemmens C, Becker MC, Bronowicki JP et al. Complementary treatment of chronic viral hepatitis C. Gastroenterol Clin Biol 2006; 30(2):197-214. 32. Hugle T, Cerny A. Current therapy and new molecular approaches to antiviral treatment and prevention of hepatitis C. Rev Med Virol 2003; 13 (6): 361-71. 33. Mangia A, Santoro R, Minerva N, Ricci GL, Carreta V, Persico M et al. Peginterferon Alfa-2b and Ribavirin for 12 vs. 24 weeks in HCV genotype 2 or 3. N Engl J Med 2005; 352(25):2609-17. 34. Orland JR, Wright TL, Cooper S. Acute hepatitis C. Hepatology 2001; 33(2):321-326. 35. Barret S, Kieran N, Ryan E et al. Intrahepatic hepatitis C viral RNA status of serum polymerase chain reaction – negative idividuals with histological changes on liver biopsy. Hepatology, 2001; 33(6):1496-1502. 36. Kontorinis N, Agarwal K, Dieterich DT. Current status of the use of growth factors and other adjuvant medications in patients receiving peginterferon and ribavirina. Rev Gastroenterol Disord 2004; 4 Suppl 1:S39-47. 37. Chen W, Liu J, Gluud C. Bile acids for viral hepatitis. Cochrane Database for Syst Rev 2003 ; (2) :CD003181. 99 38. Neumann-Haefelin C, Blum HE, Chisari FV, Thimme R. T cell response in hepatitis C virus infection. J Clin Virol 2005; 32(2):75-85. 39. Grakoui A. HCV persistence and immune evasion in the absence of memory T cell help. Science 2003; 302(5645):659-62. 40. Chang KM. Immunopathogenesis of hepatitis C virus infection. Clin Liver Dis 2003; 7(1) :89-105. 41. Jacobson-Brown PM, Neuman MG. Immunopathogenesis of hepatitis C virus infection: Th1/Th2 responses and the role of cytokines. Clin Biochem 2001; 34(3):167-71. 42. Gremion C, Cerny A. Hepatitis C vírus and the immune system: a concise review. Rev Med Virol 2005; 15(4):235-68. 43. Nelson DR. The immunopathogenesis os hepatitis C virus infection. Clin Liver Dis 2001; 5(4):931-53. 44. Chen S, Wang YM. Evolutionary study of hepatitis C virus envelope genes during primary infection. Chin. Med. Journal 2007; 120(24): 217480. 45. Mengshol JA, Golden-Mason L, Rosen HR. Mechanisms of disease: HCV-induced liver injury. Nat Clin Pract Gastroenterol Hepatol 2007; 4(11): 622-34. 46. Darling JM, Wright TL. Immune responses in hepatitis C: is virus or host the problem? Curr Opin Infect Dis 2004 ; 17(3) :193-8. 47. Bowen DG, Walker CM. Adaptive immune responses in acute and chornic hepatitis C virus infection. Nature 2005; 436(7053):946-52. 48. Zereminsk M, Petrovic LM, Talal AH. The role of chemokines as inflammatory mediators in chronic hepatitis C virus infection. Journal of Viral Hepatitis, 2007; 14: 675-687. 49. Maino VC, Maecker HT. Cytokine flow cytometry: a multiparametric approach for assessing cellular immune response to antiviral antigens. Clin Immunol 2004; 110(3):222-31. 50. Gigi E, Raptopoulou-Gigi M, Kalogeridis A, Masiou S, Orphanou E, Vrettou E, Lalla TH, Sinakos E, Tsapas V. Cytokine mRNA expression in hepatitis C virus infection: TH1-TH2 cytokine profile in subjects with selflimited disease. Journal of Viral Hepatitis, 2008; 15: 145-154. 51. Sun J, Li K, Shata MT, Chan TS. The immunologic basis for hepatitis C 100 infection. Curr Opin Gastroenterol 2004; 20(6):598-602. 52. Takehara T, Hayashi N. Natural killer cells in hepatitis C virus infection: from innate immunity to adaptive immunity. Clin Gastroenterol Hepatol 2005; 3(10 Suppl 2):S78-81. 53. Ahmad A, Alvarez F. Role of Nk and NKT cells in the immunopathogenesis of HCV-induced hepatitis. J leukoc Biol 2004; 76(4):743-59. 54. Pavio N, Lai MMC. the hepatitis C virus persistence: how to evade the immune system? J Biosci 2003; 28(3):287-304. 55. Dinarello CA. Historical insights into cytokines. European Journal of Immunology, 2007; 37: S34-45. 56. Neuman MG, Benhamou JP, Marcellin P, Valla D, Malkiewicz IM, Katz GG, Trepo C, Bourliere M, Cameron RG, Cohen L, Morgan M, Schmilovitz-Weiss H, Ben-Ari Z. Cytokine-chemokine and apoptotic signatures in patients with hepatitis C. Tranl. Res. 2007; 149(3): 126-36. 57. Abayali B, Canataroglu A, Akkiz H. Serum profile of T helper 1 and T helper 2 cytokines in patients with chronic hepatitis C vírus infection. Turk J Gastroenterol 2003; 14(1):7-11. 58. Torre F, Rossol S, Pelli N, Basso N, Delfino A, Picciotto A. Kinetics of soluble tumour necrosis factor (TNF)-alpha receptors and cytokines in the early phase of treatment for chronic hepatitis C: comparison between interefron(IFN)-alpha alone, IFN-alpha plus amantadine or plus ribavirine. Clin Exp Immunol 2004; 136(3):507-12. 59. Brady MT, McDonald AJ, Rowan AG, Mills KH. Hepatitis C virus nonstructural protein 4 suppress Th1 responses by stimulating IL-10 production from monocytes. Eur J Immunol 2003; 33 (12):3448-57. 60. Leroy V, Vigan I, Mosnier JF, Dufeu-Duchese T, Pernollet M, Zarski JP, Marche PN, Jouvin-Marche E. Phenotypic and functional characterization of intrahepatic T lymphocytes during chronic hepatitis C. Hepatology 2003; 38 (4): 829-41. 61. Pagliaccetti NE, Eduardo R, Kleinstein SH, Mu XJ, Bandi P, Robek MD. Interleukin-29 functions cooperatively with interferon to induce antiviral gene expression and inhibit hepatitis C virus replication. The Journal of Biological Chemistry 2008; 283 (44): 30079-89. 101 62. Sarih M, Bouchirit N, Benslimane A. Different cytokine profiles of peripheral blood mononuclear cells from patients with persistent and selflimited hepatitis C virus infection. Immunol Lett 2000; 74(2):117-20. 63. Freeman AT, Marinos G, Ffrench RA, Lloyd AR. Immunopathogenesis of hepatitis C vírus infection. Immunol Cell Biol 2001; 79(6) :515-36. 64. Piazzolla G, Torotorella C, Schiraldi O, Antonaci S. Relationship between interferon-gamma, interleukine-10, and interleukine-12 production in chronic hepatitis C and in vitro effects of interferon-alpha. J Clin Immunol 2000; 20(1):54-61. 65. Ghany MG, Strader DB, Thoma DL, Seef LB.Diagnosis, management andtreatment of hepatitis C: an update. Hepatology 2009; 49:1335-74. 66. Persico M, Capasso M, Persico E, Svelto M, Russo R, Spano D, Crocè L, La Mura V, Moschella F, Masutti F, Torella R, Tiribelli C, Iolascon A. Supressor of Cytokine signaling 3 (SOCS3) expression and hepatitis C virus-related chronic hepatitis: Insulin resistance and response to antiviral therapy. 67. Amati L, Caradonna L, Magrone T, Mastronardi ML, Cuppone R, Cozzolongo R et. al. Modifications of the immune responsiveness in patients with hepatitis C virus infection following treatment with IFNalpha/ribavirin. Curr Pharm Des 2002; 8(11):981-93. 68. Jia H, Du J, Zhu S, Ma, Y, Cai H. Clinical observation of serum IL-18, IL10 and sIL-2R levels inpatients with chronic hepatitis C pré- and post antiviral treatment. Chin Med J (Engl) 2003; 116(4):605-8. 69. Bozkaya H, Bozdayi AM, Aslan N, Turkay C, Sarioglu M, Cetinkaya H et al. Circulating IL-2 and IL-10 in chronic active hepatitis C with respect to the response to IFN treatment. Infection 2000; 28(5):309-13. 70. Vrolijk JM, Kwekkeboom J, Janssen HL, Hansen BE, Zondervan PE, Osterhaus AD, Schalm SW, Haagmans BL. Pretreatment intrahepatic CD8+ cell count correlates with virological response to antiviral therapy in chronic hepatitis C virus infection. J Infect Dis 2003; 188(10):1528-32. 71. De Francesco R, Migliaccio G. Challenges and successes in developing new therapies for hepatitis C. Nature 2005; 436(7053) :953-60. 102 ANEXOS ANEXO 1 103 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PARA PESQUISA Conforme Resolução N° 196/1996 do CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE TÍTULO DO PROJETO: AVALIACÃO DO PERFIL IMUNOLÓGICO DE INDIVÍDUOS COM HEPATITE C CRÔNICA TRATADOS COM INTERFERON ALFA E RIBAVIRINA NA FUNDAÇAO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS Você está sendo convidado para participar de uma pesquisa clínica e laboratorial, a ser realizado na fundação de Medicina Tropical do Amazonas em parceria com a Fundação HEMOAM. Você só deve participar pior livre vontade. Leia atentamente as informações abaixo e faça qualquer pergunta que desejar, para que todos os procedimentos desta pesquisa sejam esclarecidos. Este estudo irá contribuir com informações sobre a resposta imune e os subtipos do vírus da hepatite C que atingem pacientes em todo o Estado do Amazonas, com o objetivo de descrever a evolução clínica e o sistema imunolóqico (defesas) durante o tratamento da hepatite C. Para este estudo será coletada amostra de 20ml de sangue. Serão feitos testes para verificar a presença do vírus e conhecer o subtipo envolvido. Alguns destes testes serão realizados na Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas - HEMOAM em Manaus e outros na Fundação Medicina Tropical do Amazonas (FMT-AM), como a ultrassonografia abdominal e para HIV (o teste de HIV não será utilizado para estudo, ele apenas faz parte da rotina de acompanhamento). A coleta do líquor será realizada por' punção em região lombar e a coleta da saliva por um esfregaço oral. Para as amostras sanguíneas e líquor haverá o desconforto da picada da agulha. Em 10% dos pacientes após a coleta do liquor poderá haver dor de cabeça passageira, dor no local da coleta e dormência transitória nas pernas. A ocorrência de lesão neurológica com a punção lombar é raríssima. A coleta de saliva e a Ultrassonografia não são exames invasivos e não acarretarão nenhum risco a você. A participação neste estudo não traz nenhum beneficio direto e imediato para o individuo, mas ajudará no conhecimento, na prevenção e no acompanhamento de pessoas com hepatite C. Os indivíduos participantes deste estudo terão, sempre que necessário, esclarecimentos de dúvidas, acompanhamento clínico e laboratorial no que diz respeito ao HCV, podendo entrar em contato com a Dra. Adriana Malheiro e Dr. Ian Lima Feitosa (Tel: 92-3655-0111/ 92-3656-0113/ 92-91792413). Sempre que necessário será prestada orientação médica adequada ou encaminhamentos necessários, feitos pela equipe médica da Fundação de Medicina Tropical. A participação neste estudo é voluntária. Os participantes deste estudo podem retirar sua participação a qualquer momento, sem que isso atrapalhe o seu atendimento na Fundação de Medicina Tropical. Os dados pessoais referentes à participação dos indivíduos neste estudo permanecerão confidenciais, não sendo divulgada a identidade dos participantes. Para eventuais danos decorrentes da pesquisa, a equipe da Fundação de Medicina Tropical e HEMOAM envolvida na pesquisa se propõe a atender os participantes. 104 USO DE. MATERIAL BIOLÓGICO COLETADO: O material biológico coletado (sangue periférico, líquor e saliva), será utilizado somente para fins de pesquisa e será armazenado para estudos posteriores. ( ) Autorizo que minhas amostras possam ser armazenadas para estudos posteriores ( ) Não autorizo que minhas amostras possam ser armazenadas para estudos posteriores CONSENTIMENTO PÓS-INFORMACÃO Após ter recebido informações claras, eu concordo.em participar do estudo em questão. __________________________________ (Assinatura do participante) __________________________________ (Assinatura do pesquisador) Manaus, _____/ _____/ _____. _ (Impressão dactiloscópica) 105 ANEXO 2 FICHA DE ACOMPANHAMENTO CLÍNICO AVALIAÇÃO PERFIL IMUNOLÓGICO DE INDIVÍDUOS COM HEPATITE C CRÔNICA TRATADOS NA FUNDAÇAO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS Paciente: Prontuário: Data do atendimento inicial: Nasc: / / / / Idade: Data de retorno: Sexo: ( )M ( )F / / Nº pesquisa: Endereço: RG: Órgão: UF: CPF: Naturalidade: Nacionalidade: ( )BRA ( )_______________ Profissão: Fone: Pai: Mãe: Acompanhante ou Parente: Fone: Mádico: CRM/AM: Queixa principal Tempo de evolução Sim Não Sim Assintomático Febre Calafrios Perda de peso Fadiga/astenia Mialgia Anorexia Cefaléia Náuseas / vômitos Icterícia História da doença atual Sim Não Colúria Acolia fecal Dor-abdominal Diarréia Melena Dispepsia Constipação Tontura Ansiedade Irritabilidade História Epidemiológica Não Sim Não Transfusão de sangue Quando: / / Cirurgia Quando: / / Procedimento médico Quando: / / Sim Não Sim Dif. de concentração Labilidade emocional Depressão Psicose Alt. sono e vigília Alt. da libido Pele seca Queda de cabelo Dispnéia Artralgia Não Drogas injetáveis Drogas inaláveis Anabolizantes Escarificações Tatuagem Icterícia anterior Hist. fam. hepatite Tungíase Escabiose Hemofílico Contactante HBV Contactante HCV Piercing Homossexualidade História Patológica Pregressa Sim Não Sim Não Sim Não DST Turberculose Hipertensão Anemia Diabetes Asma História Social Sim Não Sim Não Sim Não 106 Uso de bebidas Fermentada Tabagismo Destilada Uso diário de Álcool > 1º cigarros/dia Exame Físico Estatura Massa IMC PA FC FR Estado Geral Sim Não Sim Não Palidez Icterícia Desnutrição Febre Pele seca Spiders >10 Ascite Dor abdominal Ginecomastia Traube ocupado Hepatomegalia Esplenomegalia __________ cm ___________cm Sangramento Torpor AC: AP: Abd: Ext: Neurológico: Exames Leucograma Plaquetas Na K Ur Cr Glicemia AL T/TGO AST/TGP BD BI TAP Albumina Anti HCV Genótipo Carga viral CD4+ CD8+ IL-4 IL-5 IL-6 IL-10 IL-12 Data Sup. Corpo. Temp. Sim Não Anasarca Perda ponderal Edema de MMII Eritema palmar Hipertrofia Parotídea Circulação Colateral Faetor Haepaticus Encefalopatia 107 ANEXO 3 APROVAÇÃO DO CEP 108 109 ANEXO 4 ACEITE DO SEGUNDO ARTIGO 110
