Yonne Francis Chehuan Melo

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS - UEA
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS - FMTAM
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
AVALIAÇÃO in vitro DA SENSIBILIDADE DO
Plasmodium falciparum AOS ANTIMALÁRICOS, PELO ELISA COM
CAPTAÇÃO DA PROTEINA 2 RICA EM HISTIDINA
YONNE FRANCIS CHEHUAN MELO
MANAUS
2005
ii
YONNE FRANCIS CHEHUAN MELO
AVALIAÇÃO in vitro DA SENSIBILIDADE DO
Plasmodium falciparum AOS ANTIMALÁRICOS, PELO ELISA COM
CAPTAÇÃO DA PROTEINA 2 RICA EM HISTIDINA
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós Graduação em Medicina
Tropical da Universidade do Estado do
Amazonas em convênio com a Fundação
de Medicina Tropical do Amazonas,
como requisito para obtenção do título
de Mestre em Doenças Tropicais e
Infecciosas.
Orientadora: Profª Dra. Maria das Graças Costa Alecrim
Co-orientadores: Profª Dra. Maria das Graças Barbosa
Prof º MSc. Wilson Duarte Alecrim
MANAUS
2005
CHEHUAN, Yonne Francis
Avaliação in vitro da sensibilidade do Plasmodium falciparum aos antimaláricos pelo
ELISA pela captação da Proteína 2 Rica em Histidina / Yonne Francis Chehuan - Manaus AM; Universidade do Estado do Amazonas, 2005. 88 p.
Dissertação de Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas.
1. Malária 2. P. falciparum 3. ELISA 4. Proteína Rica em Histidina 5. In vitro 6. Quinino 7.
Mefloquina I. Titulo
iii
FOLHA DE JULGAMENTO
AVALIAÇÃO in vitro DA SENSIBILIDADE DO
Plasmodium falciparum AOS ANTIMALÁRICOS, PELO ELISA
COM CAPTAÇÃO DA PROTEINA 2 RICA EM HISTIDINA
YONNE FRANCIS CHEHUAN MELO
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa
de Pós-Graduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do
Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.”
Banca Julgadora:
______________________________________
Profª. Maria das Graças Costa Alecrim, Dra.
Presidente
______________________________________
Profª. Ivete de Araújo Roland, Dra.
______________________________________
Profª. Marinete Marins Póvoa, Dra.
iv
DEDICATÓRIA
Aos meus pais (in memorium)
Mansour Francis Chehuan
e
Julia Abrahim Chehuan
Seus exemplos, dedicação e amor, são os meus alicerces e
guia para não me desviar dos caminhos que me ensinaram
como percorrer com simplicidade, ética e respeito ao
próximo.
Aos meus amados filhos Dessana e Tigran pela compreensão dos
inúmeros momentos de ausência e sacrifício em nosso convívio
diário.
Ao meu esposo Henrique pelo seu carinho e estimulo sempre
presente nos momentos mais árduos.
Não existem palavras que expressem a gratidão e o amor que
sinto por vocês. Espero ser sempre motivo de orgulho e alegria.
Dedico-lhes esta conquista com gratidão.
v
Mais do que julgar, o importante é ensinar com amor,
mostrando que sempre é possível seguir adiante.
(Autor desconhecido)
O mundo amazônico não poderá ficar isolado ou alheio ao
desenvolvimento brasileiro e internacional, porém ele terá que se
auto-sustentar em quatro parâmetros e paradigmas fundamentais:
deve ser economicamente viável, ecologicamente adequado,
politicamente equilibrado e socialmente justo.
Prof. Samuel Benchimol
vi
AGRADECIMENTOS
A conquista para ser plenamente vitoriosa deve ser compartilhada.
Assim, com o cuidado que merece de não cometermos o descuido da omissão,
reverenciamos com profunda gratidão a todas as pessoas e Instituições,
indistintamente, que de maneira direta ou indireta foram agentes incentivadores
para a realização desta Dissertação de Mestrado, sem os quais teria sido difícil
desenvolve-la. De modo particular a:
Deus não escolhe os capacitados, capacita os escolhidos.
Agradeço, por Sua infinita benção em minha vida.
A Profª Dra Maria das Graças Costa Alecrim pela orientação e ao Professor
Wilson Duarte Alecrim pela co-orientação com os quais iniciei o aprendizado da
pesquisa, pelo incentivo e apoio para a concretização deste estudo.
Aos meus queridos irmãos Naylê, Neydelê, Yvone, Francis e Iman
sempre presentes apoiando e incentivando a conquista da vitória
independente dos obstáculos; amo todos vocês.
A minha co-orientadora Profª Dra Maria das Graças Barbosa, pela orientação, apoio,
confiança, estimulo e paciência para a conclusão desta jornada, tantas vezes difícil.
Ao Marcus Vinícius Lacerda o meu reconhecimento e sincera gratidão pelo
apoio e orientação para a conclusão deste estudo.
À Gerente de Malária da FMTAM MSc Mônica Regina Farias Costa Manso,
pela compreensão para a conclusão deste trabalho.
À Ana Ruth Lima Arcanjo, Márcia Almeida de Araújo e Flor Ernestina Martinez
amigas certas das horas incertas nesta conquista.
Ao mestrando Franklin Simões Santana Filho, companheiro de lutas e ideais,
muito obrigado pela amizade, apoio, solidariedade, incentivo e
paciência ao longo desta trajetória.
A Eva Batista Carvalho pelo incentivo amigo.
À técnica Maria José Siqueira e as bolsistas Glenda Janaína de Souza Oliveira,
Dácia Sarina de Azevedo Parente e Danielly de Alencar Arruda Almeida pela
contribuição valiosa na execução deste estudo.
Aos funcionários, Raimunda Ericilda de Araújo, Marly Marques, Rosemary Santos,
Eckner Falcão e Laurendina Pereira Batalha, pelo apoio e colaboração
constante.
vii
Aos funcionários da Gerência de Malária da FMTAM pelo convívio diário amistoso
e apoio administrativo. Aos microscopistas pela contribuição no diagnóstico
dos portadores de malária falciparum incluídos neste estudo.
Ao Dr. Pedro Paulo Vieira,, MSc Michele de Souza Bastos e a Bioquímica Eliete
Pereira de Azevedo pelo apoio durante a execução deste trabalho e
colaboração na execução dos testes.
Ao Gerente de Informática da FMTAM, Marco Antonio Sabóia pela
competência e prestimosa colaboração prestada.
A Profª Dra Marinete Marins Póvoa agradeço a amizade, o apoio, o incentivo, os
ensinamentos e a oportunidade de compartilhar e aprimorar os meus
conhecimentos e experiência profissional.
Ao Prof Dr Álvaro Augusto Ribeiro D’Almeida Couto que concedeu gentilmente
um exemplar da sua Tese de Doutorado, o meu especial agradecimento.
Ao Dr. Leonardo Carvalho do Laboratório de Pesquisa em Malária da FIOCRUZ
que à distância reservou espaço nos seus compromissos para compartilhar
seus conhecimentos técnicos com importantes sugestões nos momentos
críticos, meu agradecimento pela atenção e o apoio.
À Universidade do Estado do Amazonas pela criação do Curso de
Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Aos professores, colegas de curso e as funcionárias Maria da Conceição dos Santos
Tufic e Luzanira Araújo da Silva do Curso de Mestrado em Doenças Tropicais e
Infecciosas, pelo apoio e solidariedade.
À Fundação de Medicina Tropical do Amazonas pela oportunidade
concedida para o aprimoramento do conhecimento.
A Superintendência da Zona Franca de Manaus e Ministério da Saúde do
Brasil como fontes financiadoras deste estudo.
A Fundação de Apoio Institucional MURAKI, pelo suporte na
compra dos insumos para a realização deste estudo.
Aos amigos que à distância me acompanharam, auxiliaram e orientaram para
a conclusão desta jornada, o meu reconhecimento e gratidão.
A cada um dos pacientes de malária que foram imprescindíveis para o
desenvolvimento deste estudo, mais que agradecimento, meu respeito.
Ao Ministério da Saúde (Secretaria de Vigilância em Saúde/GerênciaTécnica de
Malária) e a Organização Pan-Americana da Saúde que através RAVREDA
deram suporte técnico-financeiro e confiança para o desenvolvimento deste
estudo proporcionando o aprimoramento da minha formação como
pesquisadora.
viii
RESUMO
Os rápidos e progressivos mecanismos que os plasmódios desenvolvem
para subterfugir aos efeitos dos quimioterápicos têm se tornado o principal
agravante no controle da malária no Brasil e no mundo. A expansão da
resistência do plasmódio aos antimaláricos dimensiona a magnitude e
gravidade do problema, frente à limitação da ausência de uma vacina
antimalárica, tornando cada vez mais importante, iminente e indispensável
como fonte de dados para a vigilância de droga-resistência, o desenvolvimento
e aplicação in vitro de métodos simples e confiáveis, particularmente sob
condições de campo. Como parte do protocolo multicêntrico da Rede
Amazônica de Vigilância da Resistência às Drogas Antimaláricas (RAVREDA),
executou-se um estudo para avaliação do desempenho do método ELISA
baseado na quantificação da Proteína 2 Rica em Histidina (HRP2) na
estimativa da sensibilidade com isolados frescos do Plasmodium falciparum às
drogas antimaláricas em análise de correlação dos resultados com os obtidos
pelo método da maturação de esquizontes (microteste/OMS), em um
laboratório de referência, na cidade de Manaus. Os 35 isolados frescos de P.
falciparum testados com sucesso pelo ELISA HRP2 e analisados em função da
concentração da inibição 50% (IC 50 ) com o intervalo de confiança 95% foram
de 225,19 nM (IC95%: 182,24 – 268,14 nM) e 40,03 nM (IC95% 32,54 – 47,52
nM) ao quinino e à mefloquina, respectivamente Os resultados mostraram uma
associação fortemente significante com aqueles obtidos com o teste padrão de
maturação de esquizontes da Organização Mundial da Saúde (OMS) (R=0,977;
p<0,001) para quinino e (R=0,946; p<0,001) para mefloquina. Com base no
ponto de corte do microteste/OMS, a resistência in vitro do P. falciparum ao
quinino foi de 22,8% e 42,8% à mefloquina. A aplicação deste novo método
ELISA HRP2 sugere ser factível em estudos epidemiológicos do
monitoramento da resistência às drogas antimaláricas, na medida em que a
técnica é sensível, permite a execução de múltiplos testes simultaneamente,
podendo ser adaptada facilmente às exigências de laboratórios individuais em
áreas endêmicas.
Palavras-chaves: Malária. P. falciparum. ELISA. Proteína Rica em Histidina. in
vitro. Quinino. Mefloquina.
ix
ABSTRACT
The Plasmodium resistance to the antimalarials is becoming the major
problem for the malaria control in Brazil and worldwide. With the increase of the
resistance to antimalarials, of single and reliable methods for in vitro continuous
studies of the Plasmodium sensitivity to antimalarial drugs, as data source for
the surveillance of drug resistance is a need. As part of the multicenter activities
of the Amazon Network of Surveillance of Resistance to Antimalarial Drugs
(RAVREDA), an experimental study was performed in order to evaluate the
sensitivity to antimalarials using the ELISA test based on the quantification of
the Histidine-rich Protein 2 (HRP2) with fresh isolates of Plasmodium
falciparum, in a laboratory of reference, in the Manaus city. The 35 fresh
isolates of P. falciparum tested with success disclosed inhibitory concentration
at 50% (IC50) of 225.19 nM and 40.03 nM, to quinine and mefloquine,
respectively. The results showed a highly significant association with those
obtained with the standard test of maturation of schizonts from the World Health
Organization (WHO) for quinine (R=0.977; p<0.001) and mefloquine (R=0.946;
p<0.001). Based on the cut-off from the microtest/WHO, the in vitro resistance
of P. falciparum to quinine was 22.8% and 42.8% to mefloquine. The use of the
new method seems to be useful in epidemiological studies for the monitoring of
resistance to antimalarial drugs, since the technique is sensitive, rapid and of
easy execution, with the possibility of adaptation in individual laboratories in
endemic areas.
Key words: Malaria. P. falciparum. ELISA. Histidine-rich Protein. in vitro.
Quinine. Mefloquine.
x
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
FIGURA 1
Quimioterapia da malária
22
FIGURA 2
Representação estrutural das quinolinas-metanóis
FIGURA 3
Ciclo biológico do P. falciparum
FIGURA 4
Princípio do método imunoenzimático da quantificação da
4
26
PfHRP2
41
FIGURA 5
Setores da Gerência de Malária FMTAM
45
FIGURA 6
Concentração das drogas quinino e mefloquina nas microplacas
48
FIGURA 7
Preparação do sangue e teste de sensibilidade in vitro do P.
falciparum
50
FIGURA 8
Técnica ELISA PfHRP2
54
FIGURA 9
Distribuição dos pacientes segundo sexo a faixa etária
56
FIGURA 10 Distribuição dos 59 participantes do estudo por local provável de
infecção
57
FIGURA 11 Distribuição dos 32 participantes do estudo por local provável de
infecção no município de Manaus
58
FIGURA 12 Microteste (OMS): a) Trofozoítos pela gota espessa; b)
Trofozoítos e pré-esquizontes cultura; c e d) esquizontes com três
ou mais cromatinas
59
FIGURA 13 Distribuição dos resultados das culturas de P. falciparum após o
período de incubação
60
FIGURA 14 Resultados dos 39 Microteste (OMS) relação de maturação de
esquizontes
e
inibição
do
crescimento
sob
as
diversas
62
concentrações do quinino
FIGURA 15 Resultados dos 39 Microteste (OMS) relação de maturação de
esquizontes
e
inibição
do
crescimento
sob
as
diversas
concentrações da mefloquina
FIGURA 16 Resultados dos 35 Microteste (OMS) relação de maturação de
63
xi
esquizontes
e
inibição
do
crescimento
sob
as
diversas
concentrações do quinino
65
FIGURA 17 Resultados dos 35 Microteste (OMS) relação de maturação de
esquizontes
e
inibição
do
crescimento
sob
as
diversas
65
concentrações da mefloquina
FIGURA 18 Média do IC50 nos 35 testes concordantes da sensibilidade do
P. falciparum às drogas quinino e mefloquina pelo ELISA HRP2
66
FIGURA 19 Média do IC50 nos 35 testes concordantes da sensibilidade do
P. falciparum às drogas quinino e mefloquina pelo Microteste
67
(OMS)
FIGURA 20 Análise de correlação do IC50 do quinino determinado pelos
métodos de ELISA HRP2 e Microteste (OMS)
68
FIGURA 21 Análise de correlação do IC50 da mefloquina determinado pelos
TABELA 1
métodos de ELISA HRP2 e Microteste (OMS)
Classificação da resistência in vivo do P. falciparum às drogas
TABELA 2
Concentrações
das
drogas
in
vitro
para
aos
níveis
68
34
de
sensibilidade/ resistência
TABELA 3
Concordância dos resultados entre os métodos Microteste (OMS)
e ELISA HRP2
TABELA 4
Avaliação dos 39 isolados pela (CMI%) e IC50 do
61
P.
falciparum ao quinino (QN) e mefloquina (MF) pelo microteste
(OMS)
52
64
xii
LISTA DE ABREVIAÇÕES
Ag-Ac
Antígeno/anticorpo
AP
Amapá
APAD
Acetil Piridina Adenina Dinucleotídeo
cm
Centímetro
CMI
Concentração Mínima Inibitória
CO 2
Gás Carbônico
Cut-off
Ponto de corte
D0
Dia zero
D28
Dia 28
DDT
Dicloro-difenil-tricloroetano
DHFR
Dihidrofolato-redutase
DNA
Ácido desoxirribonucléico
DO
Densidade ótica
EDTA
Ácido etileno-diamino-tetracético
EGCM
Estratégia Global para o Controle da Malária
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent
FMTAM
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
FNS/ FUNASA
Fundação Nacional de Saúde
HRP2/ PfHRP2
Proteína 2 Rica em Histidina
IC50
Concentração inibitória 50% do crescimento
IC90
Concentração inibitória 90% do crescimento
IC95
Intervalo de confiança 95%
L
Litro
LDH
Lactado desidrogedonase humano
MF
Mefloquina
mg
Miligrama
mL
mililitro
MS
Ministério da Saúde do Brasil
N2
Nitrogênio
NAD
Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NaHCO3
Bicarbonato de sódio
nM
Nanomolar
xiii
O2
Oxigênio
OMS/WHO
Organização Mundial de Saúde
OPS/PAHO
Organização Pan-Americana da Saúde
P. falciparum
Plasmodium falciparum
P. malariae
Plasmodium malariae
P. ovale
Plasmodium ovale
P. vivax
Plasmodium vivax
PA
Pará
Pfcrt
Pfdhfr
Plasmodium falciparum
transporter
Plasmodium falciparum
Pfdhps
Plasmodium falciparum
Pfmdr I
Plasmodium falciparum multi-drug resistance gene I
PIACM
Plano de Intensificação das Ações de Controle da Malária
pLDH
Lactado desidrogedonase Parasito
PM
Peso molecular
pmol
Picomol
PNCM
Programa Nacional de Controle da Malária
QN
Quinino
RAVREDA
RI, II e III
Rede Amazônica de Vigilância da Resistência às Drogas
Antimaláricas
Resistência in vivo tipo I, II e III
RNA
Ácido ribonucléico
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
S
Sensível
SP
Sulfadoxina+pirimetramina
SUCAM
Superintendência de Campanhas de Saúde Pública
SUFRAMA
Superintendência da Zona Franca de Manaus
SVS
Secretaria de Vigilância em Saúde
TA
Temperatura ambiente
USAID
United States Agency for International Development
μg/mL
Micrograma
°C
Graus Celsius
µL
Microlitro
chloroquine
resistance-related
xiv
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1
1.1
ASPECTOS GERAIS
1
1.2
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS
4
1.3
CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS E EPIDEMIOLÓGICAS
6
1.3.1 Vetor
6
1.3.2 Agente etiológico
6
1.3.3 Ciclo biológico do plasmódio
7
1.4
CARACTERÍSTICAS DAS DROGAS ANTIMALÁRICAS
8
1.5
RESISTÊNCIA DO P. FALCIPARUM AOS ANTIMALÁRICOS
12
1.6
HISTÓRIA DA RESISTÊNCIA DO P. FALCIPARUM
15
1.7
MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMALÁRICOS
18
1.8
TESTES IN VITRO
21
2. OBJETIVOS
29
3. MATERIAL E MÉTODOS
30
3.1
MODELO DO ESTUDO
30
3.2
LOCAL DO ESTUDO
30
3.3
POPULAÇÃO ESTUDADA
30
3.4
CRITÉRIOS DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
32
3.5
ASPECTOS ÉTICOS
32
3.6
RECURSOS FINANCEIROS
33
3.7
PROCEDIMENTOS LABORATORIAIS
33
3.7.1 PLACAS PRÉ-DOSADAS DE DROGAS QUININO E MEFLOQUINA
33
3.7.2 COLETA E PREPARAÇÃO DO SANGUE
34
3.7.3 CULTURA
E TESTE DE SENSIBILIDADE DO
P. FALCIPARUM
ÀS
DROGAS ANTIMALÁRICAS (MICROTESTE/OMS)
3.7.4 TESTE
IN VITRO DE SENSIBILIDADE DO
PROTEINA 2 RICA
ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO – ELISA
QUANTIFICAÇÃO DA
EM
P.
35
FALCIPARUM PELA
HISTIDINA (PFHRP2)
PELO
38
xv
3.8
ANÁLISES ESTATISTICAS
41
4. RESULTADOS
42
4.1
DADOS EPIDEMIOLÓGICOS
42
4.2
CONSIDERAÇÕES SOBRE AS TÉCNICAS
44
4.3
COMPARAÇÃO ENTRE AS TÉCNICAS
46
5. DISCUSSÃO
56
5.1 DADOS EPIDEMIOLÓGICOS
56
5.2 CONSIDERAÇÕES SOBRE AS TÉCNICAS
58
5.3 COMPARAÇÃO ENTRE AS TÉCNICAS
59
5.4 LIMIAR
DE SENSIBILIDADE/RESISTÊNCIA DO
P
FALCIPARUM ÀS DROGAS
ANTIMALÁRICAS
5.5 AVALIAÇÃO DA
QUINOLINAS-METANOIS
SENSIBILIDADE
DO
P.
FALCIPARUM
ÀS
DROGAS
62
64
6. CONCLUSÃO
73
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
74
8. ANEXOS
88
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos gerais
A malária apesar de ser uma doença que tem sua história intrinsecamente
relacionada com a própria história da humanidade, continua sendo ainda hoje um
grande obstáculo ao desenvolvimento socioeconômico e político nos países tropicais
e subtropicais, não obstante os resultados alcançados pelos programas de controle
que reduziram sua extensão geográfica ou sua incidência em muitas áreas
(PAHO/WHO, 1997).
Segundo Bruce-Chwatt (1985), o número expressivo de baixas provocadas
pela malária durante a Primeira Guerra Mundial motivou principalmente na Europa o
desenvolvimento de pesquisas que objetivavam encontrar medidas eficazes para o
combate e controle da doença, que teve na cloroquina e no DDT (dicloro-difeniltricloroetano) importantes resultados. Em 1955, a Organização Mundial de Saúde
(OMS), diante dos resultados promissores, elaborou um conjunto de medidas
visando à erradicação da malária no mundo (NAJERA, 1989). Todavia, ao longo das
últimas décadas, a malária vem reaparecendo ou se intensificando em regiões no
mundo, conseqüência do surgimento e dispersão de parasitos resistentes às drogas
antimaláricas
e
de
mosquitos
resistentes
aos
inseticidas,
associados
à
desestruturação dos programas de controle da malária resultado das dificuldades
sociais, políticas e econômicas (TRIGG e KONDRACHINE, 1998; GREENWOOD e
MUTABINGWA, 2002).
A doença foi erradicada da Europa e América do Norte, contudo permanece
como grave problema de Saúde Pública nos países em desenvolvimento pelos
2
fatores condicionantes e determinantes relacionados à população suscetível, ao
agente etiológico e ao vetor, associados às condições ecológicas, geográficas,
econômicas, sociais e culturais.
A mais recente intervenção para o controle da malária no Brasil foi em 2000,
com a implantação do Plano de Intensificação das Ações de Controle da Malária
(PIACM) na Região Amazônica, pelo Ministério da Saúde (MS), em parceria com
estados e municípios com os objetivos de reduzir a incidência, evitar o surgimento
de epidemias localizadas, reduzir a gravidade da doença e, conseqüentemente, o
número de internações e óbitos. Dentre outras, as estratégias estavam centradas
nos seguintes pontos: a) estruturação dos sistemas locais de saúde; b) diagnóstico e
tratamento precoce; c) intervenções seletivas para o controle vetorial; d)
aprimoramento e agilização do sistema de informação; e) detecção imediata de
epidemias; f) capacitação de recursos humanos; g) monitoramento da resistência às
drogas e inseticidas (BRASIL/MS/SVS, 2005).
Empenhado em estabelecer uma política permanente para a prevenção e o
controle dessa endemia, e consolidar o processo de descentralização, inclusive na
região extra-amazônica, o Ministério da Saúde editou, em 2003, o Programa
Nacional de Controle da Malária (PNCM) pactuado com os governos estaduais e
municipais, em parceria com a sociedade organizada, a fim de executar as
atividades necessárias ao controle da doença, dando continuidade aos avanços já
proporcionados pelo PIACM (BRASIL/MS/SVS, 2003).
Em 2001, foi criado a Rede Amazônica de Vigilância da Resistência às
Drogas Antimaláricas (RAVREDA), para subsidiar a política de medicamentos, com
3
a execução de um sistema de vigilância de fármaco-resistência aos antimaláricos em
toda Região Amazônica, com propósito de efetivar as ações de controle. Fazem
parte da rede amazônica os oito países que compõem a Bacia Amazônica Sul
Americana. O Projeto é coordenado pela Organização Pan-americana da Saúde
(OPS) e OMS, apoiado com recurso da United States Agency for International
Development (USAID).
No Brasil, a gestão e gerenciamento da RAVREDA pela Secretaria de
Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde, com a participação dos Centros
Colaboradores instalados em sete dos nove, estados da Amazônia Legal (divisão
política do território nacional que engloba os Estados: Amazonas, Pará, Acre,
Roraima, Rondônia, Amapá, Tocantins e Maranhão), estão realizando estudos de
resposta terapêutica dos esquemas de primeira linha preconizados pelo PNCM/MS
de adesão do paciente ao tratamento para malária, controle de qualidade dos
medicamentos, sensibilidade e estabilidade de testes de diagnostico rápido e
estudos in vitro de avaliação da suscetibilidade aos antimaláricos (MANGABEIRA e
MONTOYA, 2004; BRASIL/MS/SVS, 2005).
A resistência do plasmódio às drogas antimaláricas tem se tornado o principal
agravante no controle da malária no Brasil e no mundo. Os rápidos e progressivos
mecanismos que os plasmódios desenvolvem para subterfugir aos efeitos dos
quimioterápicos dimensionam a magnitude e gravidade do problema. Frente à
limitação da ausência de uma vacina antimalárica, o controle da malária depende
quase exclusivamente da quimioterapia que é ofertada gratuitamente à população e
do controle de vetores.
4
1.2 Aspectos Epidemiológicos
A malária configura-se como a antropozoonose de maior prevalência
no mundo. A doença é endêmica em 107 países, com aproximadamente 3,2 bilhões
de pessoas expostas ao risco de infecção. Nas Américas, cerca de 36% da
população vivem em áreas favoráveis à transmissão da doença.
Estima-se que anualmente entre 350 a 500 milhões pessoas adquirem
malária com mais de um milhão de mortes no mundo, principalmente crianças, ao
lado das infecções respiratórias e diarréicas, figura como uma das principais causas
de mortalidade no mundo. Na África sub-Saárica são registrados 60% de todos os
casos de malária do mundo, o restante está distribuído por regiões da Ásia, América
do Sul e Oceania (PAHO/WHO, 2001; TAYLOR-ROBINSON, 2002; WHO, 2002a;
OMS e UNICEF, 2005a).
Em 2002, o Brasil contribuiu com aproximadamente 40% do número total dos
casos de malária nas Américas. Mais de 99% dos casos diagnosticados pelo exame
parasitoscópico ocorreram na Amazônia Legal, onde residem cerca de 12% da
população de país. Destacaram-se pela intensidade de transmissão os Estados do
Pará, Amazonas e Rondônia, responsáveis por 88% dos casos relatados (OMS e
UNICEF, 2005a).
No Brasil, no início da década de 70, a malária apresentava sinais de
controle, com 66.689 casos registrados em 1974. A partir de 1975, houve um
aumento progressivo, registrando-se em 1989 577.520 casos (BRASIL/MS/SUCAM,
1989). Comparando os 459.013 casos notificados na Amazônia Legal no ano de
5
2004, em relação aos 635.646 em 1999; observa-se resultado positivo com uma
redução da doença, atribuída à política de intensificação das ações do controle da
malária do Ministério da Saúde em parceria com estados e municípios
(BRASIL/MS/SVS, 2005).
A elevação da ocorrência da doença nas décadas de 70 e 80 no Brasil estava
relacionada a diversos fatores, com uma forte influência do movimento migratório
movido por projetos desenvolvimentistas na ocupação de grandes espaços da
Amazônia. Destacam-se as grandes invasões nas áreas periurbanas das cidades de
Manaus e Porto Velho, ocasionando uma ocupação espacial desordenada, e ainda
associada às alterações ambientais com a construção de estradas e hidrelétricas,
extração de madeira e minérios, assim como as precárias condições de infraestrutura e socioeconômicas da população migrante não imune (MARQUES e
PINHEIRO, 1982; SAWYER, 1986; TAUIL, 1986; BRASIL/FUNASA, 2000).
O ecossistema característico da Amazônia, com alto índice pluviométrico,
uma ampla malha hídrica e a densa vegetação, aliados aos fatores sociais e
ambientais citados, favorecem a proliferação do vetor e a exposição de grande
quantidade de pessoas à doença.
No Estado do Amazonas, a malária tem se comportado com períodos
variáveis e nos últimos anos, ascendente, com 70.223 casos diagnosticados em
2002 e 140.642 casos em 2003, representando um acréscimo de 100% em relação
ao ano anterior e continuando a aumentar em 2004, com 146.296 casos e 100.567
6
até junho de 2005, com um aumento de 35,7% comparado ao mesmo período do
ano anterior (BRASIL/MS/SVS, 2005; FMTAM, 2005).
É importante considerar no agravamento progressivo da malária como
problema de Saúde Pública os seguintes fatores: a) resistência do vetor aos
inseticidas; b) hospedeiro; c) parasitos; d) meio ambiente; e) quimioterapia
antimalárica. Os notáveis avanços científicos nas áreas do diagnóstico, tratamento,
fisiopatologia,
imunologia,
biologia
molecular
e
inúmera
constatações
epidemiológicas não refletiram um melhor paralelo com o controle da endemia ao
longo desses anos (WONGSRICHANALAI et al., 2002; RIGBY et al., 2002).
1.3 Características Clínicas e Epidemiológicas
1.3.1 Vetor - Os transmissores da malária aos mamíferos são insetos da
ordem dos dípteros, da família Culicidae do gênero Anopheles. No Brasil, as
espécies de vetores em potencial são: A. darlingi, A. aquasalis, espécies do
complexo A. albitarsis, A. cruzii e A. bellator. O A. darlingi destaca-se pela sua
importância epidemiológica, particularmente na região da Amazônia Brasileira, pelo
seu hábito antropofílico e endofílico, e a elevada suscetibilidade à infecção
plasmodial (TADEI e DURATY THATCHER, 2000; BRASIL/MS/FUNASA, 2002).
1.3.2 Agente etiológico - Os parasitos causadores da malária fazem parte do
Filo Apicomplexa, Ordem Eucoccidiidae, Subordem Haemosporinae, Família
Plasmodiidae, Gênero Plasmodium.
7
A malária humana é causada por uma ou mais das quatro espécies de
protozoários
esporozoários
intracelulares
do
gênero
Plasmodium.
Segundo
Garnham e Duggan (1986) essas espécies são: Plasmodium malariae (Laveran,
1881), Plasmodium vivax (Grassi e Feletti, 1890), Plasmodium falciparum, (Welch,
1897) e Plasmodium ovale (Stephens, 1922).
No Brasil, destaca-se com maior importância epidemiológica o P. vivax e o P.
falciparum. Embora com baixa letalidade, o P. vivax constitui importante causa de
morbidade e é responsável por grande número de recaídas nas regiões endêmicas.
O P. falciparum é a espécie responsável pela maioria dos casos graves e óbitos,
além de desenvolver com maior freqüência resistência às drogas usadas no
tratamento da malária (WHO, 2001b; BANNISTER e MITCHELL, 2003).
1.3.3 Ciclo biológico do plasmódio - O ciclo evolutivo dos plasmódios da
malária se caracteriza por apresentar duas fases distintas de reprodução:
a) Sexuada do tipo esporogonia, que se passa no hospedeiro invertebrado –
ocorre na fêmea do mosquito anofelino após o repasto sangüíneo; os eventuais
gametas existentes no estômago do mosquito se unem formando o ovo ou o zigoto
e, por esporogonia, formam-se os esporozoítos, que são inoculados por hematofagia
no homem.
b) Assexuada do tipo esquizogonia, que ocorre no hospedeiro vertebrado – o
homem - inicia quando esporozoítos infectantes são inoculados no homem pelo
vetor; após um curto período na circulação sangüínea (30-60 minutos), alojam-se
nos hepatócitos onde, por esquizogonia tissular, formam merozoítos, que são
lançados na circulação e vão invadir os eritrócitos; reproduz-se por esquizogonia,
formando novos merozoítos e, por ruptura das células sangüíneas, ao final do ciclo,
8
se libertam para em seguida invadir novos eritrócitos, reiniciando o ciclo. Depois de
algumas gerações de merozoítos sangüíneos, algumas formas se diferenciam em
estágios sexuados (os gametócitos) que não mais se dividem e continuarão os seus
desenvolvimentos nos mosquitos vetores. A esquizogonia sangüínea se repete em
intervalos regulares para cada espécie: a cada 48 horas, nas infecções pelo P.
falciparum e P. vivax, e a cada 72 horas nas infecções por P. malariae (NEVES,
1979; SOUZA et al., 1997).
1.4 Características das Drogas Antimaláricas
A eficácia de um agente terapêutico no tratamento da malária depende da
interação de três fatores: humano (imunidade), do parasito (resistência à droga) e da
farmacocinética (variação individual). A quimioterapia adequada e oportuna da
malária é hoje fundamental no controle da doença. Tão importante quanto é o
conhecimento das características químicas e farmacológicas dos antimaláricos é o
entendimento das propriedades farmacocinéticas, eficácia, grau de tolerância e a
capacidade de induzir os efeitos tóxicos do parasito (PAGE et al., 1999) (Figura 1).
Farmacocinética
Farmacogenética
(Efeitos adversos)
Imunidade
Humano
(DNA)
Parasito
(DNA)
Droga
Farmacodinâmica
(Resistência à droga)
Figura 1: Quimioterapia da malária
9
Os antimaláricos podem ser classificados de acordo com as
características químicas, farmacológicas, locais de ação no ciclo biológico do
parasito, entre outras. Dois grandes grupos de drogas têm sido muito utilizados no
tratamento da malária: os alcalóides, que são substâncias encontradas em alguns
grupos vegetais, em geral nitrogenados, heterocíclicos, com pronunciada ação sobre
os animais, e os antifolatos que agem sobre a síntese do DNA, representados pelos
inibidores da dihidrofolato-redutase (DHFR) e as sulfas.
As drogas antimaláricas podem ser classificadas pelo grupo químico e de
acordo com o local de ação no ciclo do parasito (RANG e DALE, 1993; PAGE et al.,
1999; BRASIL/MS/FNS, 2001) e os principais em uso são:

4-aminoquinolinas
(cloroquina
e
amodiaquina)
–
o
complexo
mecanismo de ação envolve a fragmentação do RNA do parasito e é
capaz de se intercalar no DNA. Atua por concentrar-se nos lisossomos
dos parasitos, inibindo a digestão da hemoglobina, reduzindo o
suprimento de aminoácidos necessários para a viabilidade do parasito.

8-aminoquinolinas (primaquina) – agem inibindo a respiração
mitocondrial do parasito; são particularmente ativas contra as fases
estacionárias (sem crescimento) do parasito.

Peróxido de lactona sesquiterpênica (derivados de artemisinina) –
são os princípios ativos de um tradicional medicamento chinês para o
tratamento da malária – a erva quinghao. O composto ativo foi isolado
e caracterizado em 1971. A artemisinina e seus derivados possuem
uma configuração peróxido (trioxano), responsável pela ação no
metabolismo das proteínas.
10

Antibióticos (tetraciclina, doxiciclina e clindamicina) – possuem uma
ação marcante, porém lenta, sobre os estágios eritrocitários da malária.
São agentes inibidores da síntese de proteínas ribossômicas.

Arilaminoálcoois (quinino, mefloquina, e halofantrina) - os metanóis
da quinolina e o fenantreno metanol são esquizonticidas sangüíneos
eficazes nos estágios sangüíneos do parasito da malária envolvidos na
digestão da hemoglobina. As duas quinolina-metanóis mais usadas
são: o quinino e a mefloquina (Figura 2).
CH=CH2
NH
N
CHOH
CHOH
CH3O
CF3
N
N
CF3
Quinino
Mefloquin
Figura 2: Representação estrutural das Quinolinas-metanóis
A porção quinolina é representada em cor laranja
O quinino é o principal alcalóide derivado da casca da cinchona, também
conhecida como casca peruana; as propriedades dessa planta foram reconhecidas
em 1630 na América do Sul (TRACY e WEBSTER Jr., 1996). O mecanismo de ação
11
como antimalárico não é bem conhecido, mas, como a cloroquina, sabe-se que inibe
a polimerização da hemina tóxica em hemozoína (pigmento malárico), esse grupo
heme quando livre é tóxico para o parasito, e acredita-se que seja inserida no DNA.
A droga é eficaz esquizonticida de ação contra cepas de P. falciparum.
A mefloquina é um composto quinolina-metanol, quimicamente relacionada ao
quinino e como tal, também se liga ao pigmento malárico (hemozoína), mas ao
contrário deste (quinino), não se insere no DNA. É um esquizonticida sangüíneo de
ação prolongada (até 30 dias), eficaz contra todas as espécies de malária, incluindo
parasitos P. falciparum multi-resistentes.
As pressões seletivas das drogas antimaláricas são geralmente classificadas
em termos de ação contra os diferentes estágios do ciclo do parasito (Figura 3):
 Esquizonticidas teciduais ou hipnozoiticidas - atuam nas formas
exoeritróciticas no fígado, destruindo os hipnozoítas latentes de P.
vivax e P. ovale.

Esquizonticidas sangüíneos - atacam os parasitos nas células
sangüíneas, prevenindo ou terminando a crise clínica.

Gametocitocidas - destroem as formas sexuadas do parasito
(gametócitos) no sangue, impedindo a transmissão.

Esporontocidas
-
interrompem
o
desenvolvimento
da
fase
esporogônica nos mosquitos que se alimentaram de portadores de
gametócitos, de modo que os mosquitos não conseguem transmitir a
infecção. Até o momento não existe nenhuma droga desse grupo
disponível para uso em humanos.
12
DROGAS ESQUIZONTICIDAS
TECIDUAIS:
8-aminoquinolinas
Inibidores de folato
Inoculação dos
esporozoítas
pelo Anopheles
MOSQUITO
TROFOZOÍTOS
DROGAS
ESQUIZONTICIDAS
SANGÜÍNEAS:
Artemisinina
Quinolinas
Inibidores de folato
GAMETÓCITOS
DROGAS GAMETOCITOCIDAS
8-aminoquinolinas
Figura 3: Ação dos antimaláricos no ciclo biológico do P. falciparum
1.5 Resistência do P. falciparum aos antimaláricos
O início da resistência do plasmódio falciparum à cloroquina marcou um
capítulo novo na história da malária.
A cloroquina foi sintetizada 1934 e representou nas últimas quatro décadas a
droga mais importante no tratamento da malária (RIDLEY, 1998). É o antimalárico
mais amplamente prescrito nos trópicos, entretanto, o seu uso atualmente não é
13
recomendado para o tratamento das infecções pelo P. falciparum, em razão do
elevado nível de resistência em vários países (FOOTE et al., 1990; TRIGG e
KONDRACHINE, 1998; BRAY et al., 1998), conduzindo ao aumento significativo da
taxa de mortalidade (THIMASARN, 1999). Apesar da alta prevalência da resistência
do parasito à cloroquina, essa droga ainda permanece como uma das mais
importantes para o tratamento da malária pelo P. falciparum em muitas regiões da
África (KYLE et al., 2002), embora exista a necessidade de antimaláricos
alternativos.
A rápida propagação mundial da malária falciparum resistente à cloroquina
levou em 1973, finalmente, à substituição dessa droga pela combinação de
sulfadoxina+pirimetramina (SP) como esquema de tratamento de primeira escolha.
O problema da resistência tornou-se ainda mais grave pela crescente
prevalência de resistência do parasito às associações de drogas. Nos anos 80 a
mefloquina se tornou à droga de escolha em áreas onde as 4-aminoquinolinas e os
antifolatos não eram mais suficientemente efetivos (WERNSDORFER, 1998).
O desenvolvimento rápido da resistência à mefloquina (WONGSRICHANALAI
et al. 1992a) conduziu, na metade da década de 90, à introdução da artemisinina e
seus derivados, tendo o combate à malária assumido novas perspectivas. De fato,
esta droga propicia um rápido clareamento parasitário, com boa evolução clínica do
paciente. Suas propriedades têm levado ao uso indiscriminado da droga, o que
gerou opiniões consensuais sobre o possível desenvolvimento de resistência,
especialmente quando ingeridos por via oral (WHO, 1998).
14
Desde a adaptação da Estratégia Global para o Controle da Malária (EGCM)
no ano de 1992, em Amsterdã, o Brasil e outros países seguiram a recomendação
da OMS, transformando o antigo programa de erradicação em programa de controle
da malária, re-direcionando objetivos, metodologia e estratégias. Vários problemas
de
ordem
administrativos,
financeiros
e
técnicos
(esses
representados
principalmente pela resistência dos plasmódios aos antimaláricos) contribuíram para
que os programas de erradicação ou controle no Brasil não atingissem seus
objetivos finais (ANDRADE et al., 1992; HAWLEY et al., 1998; HEPPNER e
BALLOU, 1998; BRASIL/FUNASA, 2000).
A resistência do P. falciparum às drogas antimaláricas emergiu como um dos
maiores desafios a ser enfrentado para o controle de malária, com implicações no
aumento da mortalidade nas áreas hiper e holoendêmicas (HOWELLS, 1992;
TRAPE et al., 2002) e contribuiu para o aparecimento e ampliação de novos focos
de malária falciparum, mas acima de tudo foi identificado como um fator no
contingenciamento econômico do controle da malária (BLOLAND, 2001).
Diferentes mecanismos podem modificar o padrão de sensibilidade de vários
organismos às drogas (BEALE, 1980). No caso particular do P. falciparum, o
aparecimento da resistência, atribuído em primeiro lugar à ocorrência de mutações
gênicas
espontâneas
(embora
não
exista
ainda
comprovação
científica
demonstrando que os antimaláricos utilizados rotineiramente exerçam efeitos
mutagênicos sobre os plasmódios) e, em segundo lugar, à pressão seletiva
desenvolvida pelos medicamentos sobre as populações de parasitos sensíveis e
parasitos resistentes, independentes da dose utilizada. Assim, a resistência que
15
aparece em casos tratados com pequenas doses torna os plasmódios refratários
também
a
altas
doses
da
droga
(WHO,
1973;
ROSÁRIO,
1976,
WONGSRICHANALAI et al., 2002).
1.6 História da resistência do P. falciparum
Historicamente, a resistência do P. falciparum aos antimaláricos é conhecida
desde o início do século passado quando Neiva (1910) e Nocht e Werner (1910)
assinalaram no Brasil os primeiros insucessos no tratamento da malária com
quinino. Em 1947, começaram a surgir referências ao aparecimento de plasmódios
resistentes de regiões tratadas com antimaláricos sintéticos.
Peters (1970) descrevem, a primeira evidência da diminuição da sensibilidade
do P. falciparum à cloroquina em 1957 na Tailândia. Em 1958, Bustamante referiu
que o aparecimento da resistência do P. falciparum ao quinino se tornou um sério
problema à terapêutica da malária.
Moore e Lanier (1961) notificaram o primeiro caso de P. falciparum
cloroquina-resistente em dois pacientes procedentes de Bogotá. No mesmo ano,
Young e Moore, em estudo posterior, comprovaram a resistência da cepa à
cloroquina.
No Brasil, no início da década de 60, foram descritos os primeiros casos de
resistência à cloroquina, em pacientes com malária falciparum procedentes da
região Amazônica e do Nordeste (RODRIGUES, 1961; SILVA, 1961a; 1961b; SILVA
16
et al., 1961). Ferraroni e Hayes (1979) descreveram resistência à cloroquina em
índios do Estado do Amazonas.
Na década de 80, Alecrim (1981, 1986), em estudos in vivo e in vitro sobre a
resistência às drogas antimaláricas na Amazônia, demonstra 100% de resistência in
vitro à cloroquina.
Santos et al., (1987), em estudo in vitro, no período de 1983 a 1986, com
cepas da Amazônia Brasileira, mostraram 83% de resistência à cloroquina, 56% e
51% ao quinino e à amodiaquina, respectivamente, e 2,3% à mefloquina.
Kremsner et al., (1989a; 1989b), no Estado do Acre, em área de colonização,
verificaram através de testes in vitro cepas resistentes à cloroquina (84%),
amodiaquina (73%) e quinino (2,3%) e 100% de sensibilidade à mefloquina.
Couto et al., (1993a), avaliando a resposta de cepas de P. falciparum em
testes in vitro em sete municípios do sul do Estado do Pará em diferentes períodos,
observaram resistência elevada para cloroquina (71%), relativamente baixa para
amodiaquina (25,8%) e para o quinino apenas 8,2%. Para a mefloquina, apesar de
não ter sido evidenciada resistência em nenhum dos isolados, os resultados
demonstraram perda da sensibilidade, quando comparada a resistência em dois
períodos distintos. Evidenciaram também cepas multi-resistentes em dois dos
municípios estudados.
17
Wongsrichanalai et al., (1992a, 1992b), na Tailândia, no período de 1980 a
1990, identificaram a modificação do padrão de resistência do P. falciparum às
drogas antimaláricas, em um estudo epidemiológico onde os dados demonstravam
claramente a expansão e o aparecimento da resistência a mefloquina.
Couto et al., (1995), ao realizarem os resultados análise temporal do perfil de
resistência no período de 1983 a 1991, com cepas isoladas de Paragominas (PA) e
Lourenço (AP), revelaram nas duas áreas uma aparente semelhança no padrão de
resposta do P. falciparum, com alta prevalência de resistência à cloroquina (68,4% e
79,8%, respectivamente) flutuação, dependendo do período, para amodiaquina e
quinino, e sensibilidade para mefloquina, embora descreva discreta perda de
sensibilidade nas amostras coletadas no Amapá quando comparadas com as do
Pará.
Alin e Bjorkman (1997), na Tanzânia, em estudos in vitro com isolados de P.
falciparum, mostraram alta sensibilidade à mefloquina e artemisinina.
Cerutti et al., (1999b), testando a suscetibilidade do P. falciparum às drogas
antimaláricas in vivo e in vitro, no Estado do Mato Grosso, constataram in vivo uma
elevada sensibilidade ao quinino e à mefloquina e reportaram in vitro a resistência
de 96,6% à cloroquina, 3,3% ao quinino, enquanto 100% dos isolados foram
sensíveis à mefloquina.
Segundo FUNASA (2000), a migração na Amazônia é um importante fator
para o aumento da transmissão e disseminação de cepas multi-resistentes entre
18
localidades e Couto (2001), observou esta forte influência no estudo de
caracterização das cepas de P. falciparum e monitoramento longitudinal da
resistência às drogas em duas áreas da Amazônia Brasileira.
Calvosa et al., (2001) relataram pela primeira vez resistência à mefloquina in
vitro em cepas isoladas na parte oriental da Amazônia Brasileira, no município de
Marabá, no Estado do Pará.
Noeld et al., (2003c), em um estudo in vitro com cepas de P. falciparum de
Bangladesh e da Tailândia, observaram altos níveis de resistência à cloroquina e
acentuada para mefloquina. Os resultados demonstraram também, na maioria dos
isolados, alta sensibilidade para quinino e 100% para artemisinina. Os autores
concluíram que a alta prevalência da resistência do parasito à mefloquina em
Bangladesh sugere a necessidade de uma ação de vigilância para verificar
problemas de difusão de cepas multi-resistentes na área.
1.7 Métodos de avaliação de resistência aos antimaláricos
Um importante fator limitante do sucesso no tratamento da malária é a
resposta variada dos parasitos às drogas usadas. Considerando esse fato,
recomenda-se que o estudo da resistência seja sistemático, como instrumento para
o controle da endemia (KROGSTAD et al., 1987; SUROLIA e PADMANABAN, 1991;
SANCHEZ e LANZER, 1997; VASCONCELOS et al., 2000).
19
Os estudos de eficácia terapêutica, testes in vitro e marcadores moleculares
tornaram-se ferramentas que se complementam para o entendimento de uma visão
global da suscetibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas (WHO, 2002a).
O primeiro protocolo padronizado para avaliação da resposta in vivo do
P. falciparum à droga foi elaborado pouco tempo depois do conhecimento sobre a
resistência dessa espécie à cloroquina (WHO, 1965). Esse sistema de avaliação foi
posteriormente revisado em 1967, modificado em 1972 (WHO, 1973) sendo a versão
mais atual de 2001 (WHO, 2003). Esses protocolos foram editados originalmente
para cloroquina, entretanto, com as modificações pertinentes, são aplicáveis
também para avaliar a resposta a outros medicamentos esquizonticidas sangüíneos.
Em 1973, a OMS, baseada em observações clínicas e parasitológicas, definiu
como resistência à capacidade do plasmódio de sobreviver e multiplicar-se, apesar
da administração e absorção de um medicamento em doses iguais ou superiores às
prescritas habitualmente, observando-se os limites de tolerância dos pacientes
(WHO, 1973; WERNSDORFER e PAYNE, 1988).
Os estudos de seguimento da eficácia terapêutica e a resposta qualitativa ao
tratamento permitem a interpretação do nível de suscetibilidade do plasmódio sem
excluir o papel da imunidade inata do organismo nos pacientes com malária. O perfil
de resposta dos parasitos assexuados às drogas esquizonticidas sangüíneas segue
o modelo direcionado geralmente para o clareamento parasitário e a ocorrência da
recrudescência dentro de um período de observação, que varia entre o início do
tratamento, ou seja, dia zero (D0) num período de observação de 28 dias (D28) de
20
acordo com a classificação em sensível (S) e três níveis de resistência (RI, RII e RIII)
(Tabela 1).
Tabela1: Classificação da resistência in vivo do P. falciparum às drogas
antimaláricas (MS/FNS, 2001)
Resposta
Símbolo
Sinais Observados
Sensibilidade
S
Negativação da parasitemia assexuada
dentro de sete dias após o 1º dia de
tratamento, sem recrudescência.
RI
Negativação da parasitemia assexuada
como na sensibilidade, porém seguida da
recrudescência.
Resistência
RII
Redução
acentuada
da
parasitemia
assexuada, porém sem negativação.
RIII
Não apresenta redução acentuada da
parasitemia assexuada.
Nas áreas de alta transmissão da doença, os métodos de avaliação in vivo
tanto de sete dias (RII) quanto o de 14 dias (RIII) só são capazes de detectar
resistência em nível avançado, o que dificulta e retarda as medidas de avaliação e
ações de intervenção. Além disso, casos verdadeiros de resistência da droga podem
não ser identificados devido a variações da farmacocinética, re-infecção, múltiplas
infecções e interferência da resposta imune adquirida (BASCO e RINGWALD, 2000).
Em 2000, Basco e Ringwald propuseram estabelecer novos critérios para
resistência a drogas, baseados no fracasso terapêutico, no valor alto da
21
concentração inibitória 50% (IC50), nas populações de parasitos idênticos no início e
durante o tratamento, na presença de mutações associadas com a resistência da
droga in vitro e em concentrações plasmáticas adequadas da droga.
A vigilância da sensibilidade dos plasmódios às drogas antimaláricas se
tornou mundialmente uma ação de importância extrema para a conduta terapêutica,
bem como para o planejamento de políticas de controle da malária.
1.8 Testes in vitro
As dificuldades associadas à avaliação da resistência às drogas antimaláricas
in vivo levaram, no final dos anos 70, à introdução de uma variedade de testes in
vitro capazes de medir a suscetibilidade do P. falciparum aos medicamentos.
Embora as provas in vitro de sensibilidade do P. falciparum aos
medicamentos antimaláricos não substituam as observações verificadas in vivo, elas
constituem ferramenta útil na investigação básica que serve de suporte para a
elaboração e avaliação das políticas de saúde em malária (WHO, 1990). É um
importante instrumento de avaliação na estimativa da resposta temporal e geográfica
aos medicamentos, na vigilância da introdução de novos isolados em uma dada
região e fundamentalmente no estudo pré-clínico de uma nova droga antimalárica
(WHO, 1994).
O teste in vitro permite com a remoção do parasito da circulação sangüínea
do paciente e sua transferência para um ambiente de laboratório altamente
22
controlável, uma avaliação mais específica da sensibilidade do parasito à droga,
independentemente do sistema imune do hospedeiro, e revela com maior precisão a
resistência à droga antimalárica. Esses métodos não só expressam resultados
quantitativos como também determinam o fenótipo do parasito, independente da
imunidade e das condições fisiopatológicas do hospedeiro (TALISUNA et al., 2004),
além de oferecer a oportunidade de executar ensaios com múltiplos isolados, avaliar
várias drogas simultaneamente e testar drogas experimentais (BLOLAND, 2001).
Tradicionalmente os testes in vitro de sensibilidade do plasmódio às drogas
são todos baseados na medida do efeito da droga no crescimento e
desenvolvimento dos parasitos da malária. Tal efeito permite observar o grau de
inibição do crescimento e/ou morte parasitário, refletindo o grau de suscetibilidade
do parasito a um determinado fármaco e a uma determinada concentração.
Inicialmente, as investigações in vitro com plasmódios de malária humana
eram limitadas, principalmente pela indisponibilidade de método apropriado para a
produção de biomassa parasitária suficiente para a realização das técnicas.
A possibilidade de manter in vitro cepas de P. falciparum em cultura contínua
(TRAGER e JENSEN, 1976) revolucionou as investigações sobre a malária humana,
dando início a uma nova fase de grande importância no estudo da malária. A
capacidade de cultivar o P. falciparum in vitro representou um avanço importante
para a evolução de muitos estudos na bioquímica, parasitologia, imunologia e
quimioterapia,
além
de
propiciar
a
criopreservação
de
parasitos
vivos,
principalmente para entender a biologia dos parasitos que causam a malária
23
falciparum (DIGGS et al., 1975; TRAGER e JENSEN, 1997) e a identificação de
populações de diferentes áreas geográficas (CARTER e VOLLER, 1985; ROSÁRIO
et al., 1986a, 1986b).
O primeiro ensaio laboratorial descrito capaz de medir a capacidade do
parasito se desenvolver da fase de anel jovem para esquizonte, usando as
mudanças morfológicas para o monitoramento dos antimaláricos, foi o macroteste,
desenvolvido por Rieckmann et al. (1968). O método foi aplicado pela primeira vez
no mundo em 1969, num estudo realizado em Cuiabá, no Brasil, com cepas
cloroquina-resistentes (RIECKMANN e LOPEZ-ANTUÑANO, 1971).
Dez anos depois Rieckmann et al. (1978), vislumbrando determinar as áreas
"cloroquina-resistentes", pelas evidências da resistência do P. falciparum às drogas,
simplificaram o procedimento em microcultura para medir a inibição de maturação de
esquizonte em 24 horas, que passou a ser conhecida como microtécnica. O
aprimoramento da técnica teve por objetivo tornar sua execução mais prática e de
baixo custo para utilização no monitoramento da sensibilidade do P. falciparum às
drogas antimaláricas em condições de campo (PAYNE, 1984), e permanece até o
presente como uma das técnicas mais simples para a avaliação de sensibilidade de
drogas in vitro.
Os estudos com cepas cloroquina-resistentes foram bem sucedidos e os
autores começaram a usar a técnica para testar outras drogas. Desjardins et al.
(1979b), avaliaram cepas já resistentes e sensíveis in vivo à cloroquina, quinino,
primaquina, amodiaquina e mefloquina, mostrando predomínio da sensibilidade para
24
a mefloquina. Richards e Maples (1979) testaram o efeito da cloroquina e
pirimetamina para inibir o crescimento do parasito em cultura contínua. Nguyen-Dinh
e Trager (1980) e Nguyen-Dinh e Payne (1980), estudaram a resistência do P.
falciparum in vitro, com modificação da microtécnica de Rieckmann, que teve como
justificativa o período de incubação de 48 horas para completar o ciclo biológico do
parasito.
Em 1981, foi produzida uma grande quantidade de kits para a execução da
microtécnica, a pedido da OMS, que investia numa técnica simples a ser aplicada
em condição de campo, altamente efetiva para o monitoramento emergencial de
áreas de resistência do P.falciparum às drogas antimaláricas (PAYNE e
WERNSDORFER, 1989).
O método de maturação de esquizontes fundamenta-se na avaliação dos
processos metabólicos do P. falciparum em cultura, e a susceptibilidade às drogas
antimaláricas e combinações fundamenta-se no crescimento e desenvolvimento do
plasmódio, baseado na observação morfológica e quantitativa do parasito. Embora
extremamente útil em situações de campo, a microtécnica tem como desvantagens
ser bastante laboriosa e exaustiva devido ao resultado do teste requerer leitura por
microscopia ótica. As limitações naturais do processo, aliadas ao resultado subjetivo
propenso à variabilidade de interpretação, não recomendam o método como o mais
apropriado para avaliação de grandes amostragens (KYLE et al., 2002). Diante da
necessidade de métodos mais adequados, surgiram, então, outras técnicas que
permitem leitura automatizada.
25
Desjardins et al. (1979a), desenvolveram um ensaio para o estudo da
suscetibilidade do P. falciparum com o emprego de material radioativo baseado na
inibição da incorporação da hipoxantina tritiada pelo parasito para demonstrar o
efeito da droga. Esse método tem alto grau de reprodutibilidade, consideravelmente
mais rápido na sua execução do que o teste baseado na avaliação morfológica de
crescimento do parasito, além de ser mais sensível e objetivo, reduzindo os fatores
relacionados à falha humana. Porém, essa técnica apresenta limitação para ser
executada em campo, por necessitar de equipamentos específicos, envolve a
manipulação de material radioativo (regulamentos relativos à manipulação de
material radioativo desde os anos 70 ficaram consideravelmente mais restritivos), e a
necessidade que o método requer de densidade elevada de parasitos (KYLE et al.,
2002; NOEDL et al., 2003b).
Com base no conhecimento de que a atividade da enzima lactado
desidrogedonase do Plasmodium (pLDH) é distinguível da atividade de LDH humano
na base do epítopo da proteína usado o 3-Acetil Piridina Adenina Dinucleotídeo
(APAD) análogo da Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo (NAD), na conversão do
lactado a piruvato, Makler et al. (1993a), Makler e Hinrichs (1993b) desenvolveram
um ensaio que determina o perfil da inibição da sensibilidade do parasito à droga,
medindo a atividade enzimática de pLDH através de espectrofotometria. Esse
método tem a vantagem sob o método com radioisótopos, por ser simples e não
usar material radioativo, porém, requer densidade parasitária inicial de 1-2% e, em
testes com isolado a fresco, o resultado não foi suficientemente sensível para
recomendar sua aplicação em campo (BASCO et al., 1995).
26
As limitações associadas ao teste conduziram ao desenvolvimento de um
novo ensaio, também baseado na LDH. Entretanto, nesse caso, ao invés de
determinar a atividade enzimática, o método quantifica a enzima produzida pelo
plasmódio através do método de ELISA (enzyme-linked immunosorbent) sanduíche
de alta sensibilidade, utilizando dois anticorpos monoclonais (captura e revelador)
direcionados contra epítopos distintos da LDH. É conhecido como chamado DELItest, e é consideravelmente mais sensível que a versão anterior (DRUILHE et al.,
2001).
Estudos realizados na África, comparando o teste radiométrico com o DELItest, na avaliação da resistência dos plasmódios aos antimaláricos, demonstraram
resultados comparáveis entre os dois métodos (MORENO et al., 2001a; 2001b). Na
Tailândia, um estudo de campo com DELI-Test usando anticorpo e kit comercial,
comparando com a técnica de radioisótopo em isolados de sangue a fresco, permitiu
concluir ser o método de ELISA sensível mesmo com baixa densidade parasitária,
factível de prover uma avaliação in vitro relativamente rápida e precisa dos padrões
de suscetibilidade da droga nas populações de parasitos e não usar material
radiativo (BROCKMAN et al., 2004).
A mais recente adição à lista de testes in vitro de sensibilidade aos
antimaláricos para o P. falciparum fundamenta-se na medida quantitativa da
Proteína 2 Rica em Histidina (HRP2) produzida pelo plasmódio, que tem meia vida
longa principalmente na fase de trofozoíto. É detectável aproximadamente por duas
semanas, é muito estável, e tem maior concentração nos eritrócitos do que no
plasma (NOEDL et al., 2002).
27
A HRP2 tem sido usada no diagnóstico rápido para malária (BEADLE et al.,
1994). A meia-vida longa dessa enzima presente em pacientes com malária
falciparum, tratados com sucesso limita a utilização do teste imunocromatográfico
para o monitoramento da eficácia terapêutica (MAYXAY et.al., 2001), por outro lado
para análise in vitro de suscetibilidade às drogas, a estabilidade desta proteína pode
ser a principal vantagem.
A quantidade de HRP2 produzida pelo P. falciparum está associada ao
desenvolvimento e multiplicação do parasito, e serve como indicador para refletir
inibição do crescimento na medida de suscetibilidade à droga (DESAKORN et al.,
1997). A técnica que quantifica a produção de HRP2 é baseada na medida do
aumento da proteína produzida pelo P. falciparum (PfHRP2) no curso de
crescimento, desenvolvimento e multiplicação, em 72 horas de cultivo. A
concentração de HRP2 produzida pelo parasito é medida pelo método de ELISA. A
inibição do crescimento do parasito pela droga antimalárica é quantificada pelo nível
de produção da HRP2 (Figura 4).
CULTURA
INICIAL
CULTURA
APOS 72 H
HRP2
Anti-HRP2
COMPLEXO Ag-AC
Figura 4: Princípio do método imunoenzimático da quantificação da PfHRP2
(Adaptado de www.malaria.farch.net)
28
Na luta contra a malária, torna-se cada vez mais importante, iminente e
indispensável para a avaliação in vitro, o desenvolvimento e aplicação de novos
métodos simples e confiáveis para a avaliação de droga-resistência, particularmente
sob condições de campo. Os métodos tradicionalmente usados há mais de 20 anos
(maturação
de
esquizontes/OMS
e
radioisótopos)
apresentam
limitações
econômicas e operacionais para a utilização em campo (NOELD et al., 2004).
Considerando as questões pertinentes de operacionalização, executou-se um
estudo experimental de avaliação quantitativa in vitro da sensibilidade de P.
falciparum às drogas antimaláricas utilizando um método imunoenzimático baseado
na captura do antígeno HRP2 em amostras de sangue a fresco do paciente,
cultivada, por 72 horas (NOELD, 2003) usando como padrão ouro o microteste MARK III (WHO, 2001a).
O estudo propõe validar o teste ELISA-sanduiche para detecção de HRP2
para estudos de sensibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas, no
Laboratório da Gerência de Malária da Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas, estimando seu desempenho, vantagens e limitações a fim de
recomendar sua aplicação já que é tão sensível quanto e menos laboriosa que o
microteste/OMS, podendo assim facilitar estudos dessa natureza no futuro.
29
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Verificar o desempenho do ensaio imunoenzimático para a medida da Proteína 2
Rica em Histidina (HRP2) na avaliação in vitro da sensibilidade do P. falciparum às
drogas antimaláricas, na cidade de Manaus.
2.2 ESPECÍFICOS
•
Estimar a sensibilidade do P. falciparum ao quinino e à mefloquina, pelo
método da maturação de esquizontes (microteste/OMS) em amostras de
sangue frescas de pacientes infectados.
•
Estimar a sensibilidade do P. falciparum ao quinino e à mefloquina, pela
quantificação da HRP2 pelo método imunoenzimático ELISA em amostras de
sangue frescas de pacientes infectados.
•
Comparar o desempenho da técnica imunoenzimática com detecção da
HRP2, com o microteste (OMS).
•
Descrever as vantagens e as limitações do método de estudo in vitro de
resistência do P. falciparum aos antimaláricos.
30
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Modelo do estudo
Executou-se um estudo, comparativo de dois métodos de avaliação in vitro da
sensibilidade do P. falciparum às quinolinas-metanóis (quinino e mefloquina).
3.2 Local do estudo
A Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM) está situada na
cidade de Manaus, desenvolvendo atividades nas áreas de assistência à saúde,
pesquisa científica e formação de recursos humanos em doenças tropicais.
Atualmente está sendo considerada como Centro de Referência nacional e
internacional para o tratamento de enfermidades tropicais. A FMTAM tem importante
participação no diagnóstico e tratamento da malária sendo responsável por 25% das
notificações de casos de malária de todo o município de Manaus (FMTAM, 2005)
(Figura 5).
3.3 População estudada
Os parasitos da malária estudados foram isolados de 59 amostras de
sangue doadas por pacientes de livre demanda que procuraram a Gerência de
Malária da FMTAM para o diagnóstico de malária. A determinação do número de
amostras foi considerada com base na recomendação da OMS (2001a) de série
de no mínimo 10 testes e 30 ou mais como ideal para o modelo do estudo.
Tratou-se de uma amostra de conveniência, sem qualquer técnica de
aleatorização empregada.
31
Figura 5a: FMTAM
Figura 5c: Atendimento diagnóstico
Figura 5e: Sala de microscopia
Figura 5b: Recepção
Figura 5d: Coleta gota espessa
Figura 5f: Entrevista
Figura 5: Setores da Gerência de Malária da FMTAM
32
3.4 Critérios de inclusão e exclusão
Para o estudo foram selecionados aqueles portadores de malária causada
exclusivamente por P. falciparum pelo diagnóstico parasitológico utilizando a
distensão sangüínea espessa (gota espessa) corada pelo método descrito por
Walker
(OPS/OMS,
1975),
com
parasitemia
mínima
de
1000
parasitos
assexuados/µL de sangue, idade igual ou maior que 12 anos, de ambos os sexos,
sem quadro clínico de malária grave, e sem uso de antimaláricos nos últimos 30
dias, em função de provável efeito residual durante a realização dos testes.
3.5 Aspectos éticos
O estudo foi conduzido com pacientes voluntários que, após entrevista
individual, entenderam os objetivos do estudo e aceitaram participar através do
termo de consentimento livre e esclarecido dentro dos preceitos da ética em
pesquisa com humanos, sem prejuízo para o seu atendimento ou seu tratamento
(Anexo A).
Esse estudo fez parte de um protocolo científico multicêntrico com a participação
de outros países latino-americanos integrantes da Rede Amazônica de Vigilância da
Resistência às Drogas Antimaláricas (RAVREDA), sob a supervisão da Organização
Pan-americana da Saúde (OPS) e, no Brasil, pelo Ministério da Saúde/Secretaria de
Vigilância em Saúde (Anexo B). O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da FMTAM em 15.12.2003 (Anexo C).
33
3.6 Recursos financeiros
O estudo foi financiado com recursos do projeto RAVREDA oriundos do
Convênio
USAID
(United
States
Agency
for
International
Development)/
OPAS/MINISTÉRIO DA SAÚDE/SECRETARIA DE VIGILÂNCIA EM SAÚDE - Carta
Acordo FMTAM/OPAS/MINISTÉRIO DA SAÚDE/RAVREDA, nº BRA/03/00679-5 e
pela Superintendência da Zona Franca de Manaus (SUFRAMA).
3.7 Procedimentos laboratoriais
O planejamento da metodologia foi padronizado para os dois métodos na
execução de: coleta de sangue, preparação da suspensão de hemácias
parasitadas, utilização do mesmo meio de cultura RPMI 1640 (Roswell Park
Memorial Institute®), sob as mesmas condições de parasitemia e hematócrito, em
duplicata, em volumes iguais distribuídos na mesma placa com a droga
correspondente.
3.7.1 Placas pré-dosadas de quinino e mefloquina
Para a avaliação da suscetibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas
foram utilizadas placas padronizadas de 96 poços, sendo 12 em cada uma das
oito filas, estéril, de formato quadrangular, medindo 12,5 cm de comprimento por
8,0 cm de largura, pré-dosadas: no poço “A” livre de droga, usado como controle,
e nos poços B ao H com as quantidades ascendentes de dihidrosulfato de quinino
(PM: 785.06) e hidrocloridrato de mefloquina (PM: 414.778) nas concentrações
34
finais de 4–256pmol (0,08-5,12µmol/lBMM) e 2–128pmol (0,4–25,6µmol/lsangue)
respectivamente;
adquiridas comercialmente de fabricante recomendado pela
OMS (Figura 6).
1 2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
1 2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
A
A
4
B
B
C
C
D
D
E
E
F
F
G
256
GH
2
H
Quinino
128
Mefloquina
Poço A* = sem droga ¨Controle¨
Poços B – H = concentrações ascendentes das drogas (pmol)
Figura 6: Concentração das drogas nas microplacas
3.7.2 Coleta e preparação do sangue
Foram coletados 5 mL de sangue venoso periférico de cada paciente pelo
método a vácuo (Vacuntainer) em tubos com anticoagulante (EDTA) e em seguida
confeccionada uma distensão sangüínea fina (esfregaço) corada pelo método
hematológico de coloração rápida (panótico) para determinar a densidade
parasitária.
O sangue obtido diretamente do paciente foi centrifugado e lavado por três
vezes consecutivas com meio RPMI 1640 tamponado com 35 mM de HEPES, 24
mM de bicarbonato de sódio, 0,5% de Albumax®, 1mg/L de hipoxantina e 5 μg/mL de
35
gentamicina. Foram preparados 20 mL de suspensão de hemácias parasitadas em
hematócrito de 1,5%, aproximadamente.
As amostras de sangues com densidade parasitária inicial acima de 1%
tiveram a parasitemia ajustada para 0,5% com hemácias do grupo sanguíneo O,
obtidas da agência transfusional da FMTAM (Figura 7).
3.7.3 Cultura e Teste de sensibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas
(Microteste (OMS))
Empregamos o protocolo MARK III (OMS, 2001a) com modificações, sendo
elas: remoção dos leucócitos, meio de crescimento (RPMI1640) suplementado com
Albumax® e incubação das amostras de sangue na presença de mistura de gases.
Imediatamente após a preparação da suspensão de hemácias parasitadas,
conforme detalhado no item anterior, alíquotas de 100μL foram distribuídas em
duplicatas diretamente nos poços das microplacas pré-dosadas com as drogas
quinino e mefloquina. As placas foram incubadas sob tensão de mistura de gases
(5% CO 2 , 5% O 2 balanceado com 90% N 2 ) a 37°C por 24 - 30 horas (considerando
que as amostras de sangue não foram pré-selecionadas, as culturas foram
monitoradas para finalizar sempre que o parasito tivesse amadurecido a esquizonte).
Ao fim de cada período de incubação foram confeccionados, com alíquotas de
sedimento de hemácias retiradas de cada poço, esfregaços corados, seguidos de
leitura por microscopia ótica (Figura 7).
Todas as leituras microscópicas foram feitas por duas únicas pessoas com
reconhecido treinamento nesta técnica.
36
Diagnóstico positivo
P. falciparum
Coletar 5 mL de sangue venoso
com anticoagulante
Lavar
3
vezes
RPMI 1640
HEPES/NaHCO3/Antibiótico/
Albumax
Suspensão hemácias
parasitadas 1,5% Hematócrito
Placas pré-dosadas
100µL/poço duplicata
Incubar a 37ºC
Mistura de gases
(5% CO2, 5%O2, 90%N2)
24h – 30h ................. 72h
Microteste/OMS
Gota espessa
Leitura microscópica
ELISA HRP2
Gota espessa (crescimento de parasito)
Armazenamento das placas a –20ºC
Figura 7: Preparação do sangue e teste in vitro de sensibilidade do P. falciparum
37
Os resultados dos testes de maturação de esquizonte (Microteste (OMS))
foram expressos pela contagem de pré-esquizontes e esquizontes com 3 ou mais
núcleos visíveis em 200 parasitos, observados em microscópio ótico. O teste foi
considerado válido quando a maturação dos esquizontes no poço controle (poço A
sem droga) foi observado crescimento de 10% ou mais de esquizontes com 3 ou
mais núcleos em 200 parasitos (OMS/2001a).
O total de parasitos do poço controle (100%) foi à base do cálculo para
comparação da maturação dos parasitos nos poços com droga. O cálculo segue a
fórmula:
Percentual
de
Nº esquizontes por 200 parasitos do poço com droga
=
inibição
X100
Nº de esquizontes por 200 parasitos do poço controle
Para a avaliação da sensibilidade/resistência, foram empregados na
interpretação dos resultados dois critérios:
 Concentração mínima inibitória (CMI) – concentração mínima da droga
que inibe a completa maturação dos esquizontes no ponto de corte (PC)
para cada uma das drogas (WHO, 2001a) (Tabela 2).

Concentração inibitória 50% (IC50) – concentração da droga na qual
são inibidos 50% do crescimento dos parasitos (IC50). O PC do IC50 usado para
cada droga foi o determinado previamente por Brasseur et al (1988), pelo método
isotópico sendo: > 300 nM para quinino e >30nM para mefloquina.
38
Tabela 2
Concentração das drogas in vitro para os níveis de sensibilidade/resistência
DROGA
Quinino
Mefloquina
SENSÍVEL (*)
RESISTENTE (**)
128 pmol ou menos
256 pmol ou mais
16 pmol ou menos
32 pmol ou mais
(*) Inibição da maturação de esquizontes
(**) Ocorrência da maturação de esquizontes
3.7.4 Teste in vitro de sensibilidade do P. falciparum pela quantificação da
Proteína 2 Rica em Histidina (PfHRP2) pelo ensaio imunoenzimático-ELISA.
A técnica de ELISA utilizada corresponde ao método descrito por Noedl,
(2003a) com modificação, onde incluímos a lavagem das hemácias.
1ª Fase - cultura
Os procedimentos seguiram os mesmos descritos na técnica do Microteste
(OMS), diferindo apenas no período de incubação que foi de 72 horas.
No final das primeiras 24 horas de incubação o volume de um poço “controle”
(sem droga) foi transferido para um tubo eppendorf e armazenado em freezer a
-20ºC, esta amostra foi usada como background no ELISA. O desenvolvimento dos
parasitos foi verificado por esfregaço sangüíneo com as hemácias de um poço
controle livre de droga.
No tempo final de incubação (72 horas) o acompanhamento do aumento da
densidade parasitária foi verificado por um novo esfregaço de outro poço controle.
39
As placas de culturas foram armazenadas a -20ºC e processados posteriormente o
teste de ELISA.
2ª Fase - Hemólise das hemácias - As hemácias parasitadas após cultura
foram lisadas pelo processo de congelamento e descongelamento.
3ª etapa – Técnica imunoenzimática – Teste de ELISA
Os kits para o ELISA usado para quantificar a HRP2 produzido pelo parasito
em cultura de sangue (Malaria Ag CELISA®, Cellabs Pty. Ltd., Brookvale, NSW,
Austrália) foram adquiridos comercialmente.
As amostras de cultura das placas pré-dosadas com quinino e mefloquina,
após o processo de congelamento e descongelamento, foram diluídas com água
destilada, de acordo com a densidade parasitária inicial para obter uma
parasitemia com aproximadamente 0,05 % no equivalente de 100 µL de
suspensão por poço, em duplicata, diretamente na microplaca de ELISA com os
poços previamente recobertos com o anticorpo monoclonal PfHRP2. O mesmo
procedimento se repetiu para as amostras de 24 horas (background).
As microplacas foram incubadas por 1 hora em câmara úmida à
temperatura ambiente (TA). Os poços foram lavados quatro vezes com PBSTween em lavadora automática de microplacas marca (Organon®). Em seguida,
100 µL do conjugado anti-P. falciparum foi adicionado em todos os poços. As
microplacas foram mais uma vez incubadas por 1 hora em câmara úmida à
temperatura ambiente e posteriormente os poços foram lavados novamente
quatro vezes com PBS-Tweem. Aplicaram-se 100 µL de substrato cromógeno em
40
todos os poços. Incubadas por 15 minutos ao abrigo da luz à temperatura
ambiente. Interrompe-se a reação pela adição de 50 µL de ácido sulfúrico.
Para a leitura dos testes foi usado um espectrofotômetro para microplacas
(Organon® Teknika Reader 230S, Version 1.23) em comprimento de onda 450nm
(Figura 8), sendo aferida a densidade óptica (DO).
Foram considerados nos teste os valores das DOs para os controle positivo
entre 1,2 a 2,0, e para o background 0,2 a 0,4.
Placas com poços previamente
recobertos com anticorpos
monoclonal PfHRP2
Suspensão de hemácias após
congelamento/descongelamento
1 hora/TA/Câmara úmida
Lavar PBS/Tween 4 vezes
POD
S
POD
S
POD
S
B
POD
S
CONJUGADO
1 hora/TA/Câmara úmida
Lavar PBS/Tween 4 vezes
POD
S
B
POD
S
B
POD
S
B
POD
S
B
SUBSTRATO CROMÓGENO
15 minutos - TA/Câmara úmida
Abrigo da luz
Reação interrompida com
Ácido sulfúrico
Leitura em 450nm
Figura 8: Técnica ELISA PfHRP2
41
3.8 ANÁLISES ESTATISTICAS
Os dados foram armazenados e analisados no programa EPI Info, versão 6.0.
As concentrações inibitórias individuais IC50 para os dois ensaios foram
determinadas por análise de regressão não linear usando o software HN-NonLin
V.1.05
Beta,
com
acesso
disponível
gratuitamente
na
internet
http://malaria.farch.net. baseado no modelo de regressão de polinômio (Anexo D).
O Teste do qui-quadrado ou o Teste de Fischer foram utilizados para
determinar a existência de diferenças significativas entre proporções.
O Coeficiente de correlação entre variáveis quantitativas foi determinado pelo
teste paramétrico de Pearson ou pelo teste não-paramétrico de Spearman.
Para a análise de concordância entre os dois métodos, foi utilizado o
coeficiente kappa.
42
4 RESULTADOS
4.1 Dados epidemiológicos
No total das amostras de sangue coletadas de pacientes sintomáticos com
malária falciparum, 21 (35,6%) foram do gênero feminino e 38 (64,4%) do
masculino. A idade variou de 12 a 75 anos, com média de 36,4 anos (Figura 9).
Masculino
Feminino
>60
3
41-60
1
12
21-40
8
19
7
12-20
4
25
20
15
10
5
5
0
2
4
6
8
10
Figura 9: Distribuição dos pacientes segundo sexo a faixa etária
O local de infecção informado no momento da entrevista revela que 54,2%
suspeitaram ter contraído a infecção em Manaus, enquanto 42,4% acreditaram ter
adquirido em outros municípios do estado do Amazonas (sendo a maioria nos
municípios adjacentes de Manaus), 1,7% de outro estado da federação (Porto
Velho-RO) e um de outro país (Guiana) (Figura 10).
43
Guyana
(1)
IRANDUB
(5)
PRESIDENTE FIGUEIREDO
(1)
SAO SEBASTIAO
DO UATUMA
(1)
MANAUS
(32)
CAREIRO
DA
(1)
AUTAZES
(4)
MANAQUIRI
(2)
CAREIRO
(8)
PROTO
(1)
MANACAPURU
(1)
Figura 10: Distribuição dos 59 pacientes por local provável de infecção malárica
Entre os 32 pacientes que relataram o município de Manaus como local
provável de infecção, constatou-se que 18 pacientes eram oriundos da Zona Oeste
(56,2%), 10 da Zona Norte (31,6%) e 4 distribuídos pelas Zonas Leste e Sul (12,2%)
(Figura 11).
44
Zona Oeste
(18)
Zona Norte
(10)
Zona Leste
(3)
Zona Sul
(1)
Figura 11: Distribuição dos 32 pacientes quanto ao local provável de infecção no
município de Manaus
Evidenciaram-se nos relatos de antecedentes de malária dos 59 participantes
que 25 (42,4%) eram primoinfectados, 34 (57,6%) não-primoinfectados, destes,
10 (29,4%) referiam mais de três infecções maláricas.
4.2 Considerações sobre as técnicas
O tempo médio de incubação para as culturas dos microtestes (OMS) foi de
28 horas (24–30 horas). Os testes de ELISA HRP2 mostraram-se de execução
simples, sendo realizados em média de três horas para um grupo de seis amostras
em duplicatas.
45
A figura 12 mostra quatro momentos de um microteste: em 12a, a amostra
original no momento de sua aplicação na placa pré-dosada, onde se evidenciam as
formas de trofozoítos; em 12b, notam-se trofozoítos e pré-esquizontes e 12c e 12d
esquizontes indicando a maturação das formas anteriores em concentrações de
droga não suficiente para inibir o desenvolvimento do parasito.
Figura 12a: Trofozoítos pela gota espessa Figura 12b: Trofozoitos e pré-esquizontes
Figura 12c: Esquizontes
Figura 12d: Esquizonte
46
A albumina comercial (Albumax, Gibco®) em substituição ao soro humano
apresentou praticidade, com bom desempenho.
Do total dos 59 testes realizados, duas (3,4%) amostras contaminaram 18
(30,5%) não mostraram crescimento adequado do parasito em nenhuma das duas
análises (ELISA HRP2 e microteste-OMS) e 39 (66,1%) isolados completaram o
ciclo biológico dos parasitos com maturação de esquizontes nos poços controles em
ambos os ensaios para as drogas quinino e mefloquina (Figura 13).
Testes válidos
66,1 %
Contaminação;
3,4 %
Crescimento
insatisfatório;
30,5 %
Figura 13: Distribuição dos resultados das culturas de P. falciparum após o
período de incubação.
4.3 Comparação entre as técnicas
Dos 18 isolados que tiveram crescimento insatisfatório dos parasitos nos
poços livres de droga, 8 (44,4%) foram testados pelo método imunoenzimático pela
captura HRP2, para as drogas quinino e mefloquina. A densidade ótica (DO) nessas
47
amostras revelou, de fato, uma leitura muito baixa, com 100% de concordância com
os resultados da leitura microscópica do microteste (OMS), assumindo-se como
verdadeiramente negativos.
Os 39 isolados testados nos dois métodos nesse estudo experimental
comparativo, em quatro (10,2%) as DO’s foram muito baixas (menor que 0,8) não
permitindo avaliar essas amostras pelo teste ELISA HRP2 para as duas drogas,
tendo resultado apenas pela visualização microscópica da maturação de
esquizontes.
Quando analisada a concordância entre os testes, a co-positividade foi de
89,7%, [Intervalo de confiança 95% (IC95) de 74,8 a 96,7%] e a co-negatividade de
100% [IC95 78,1 a 100,0%] e o coeficiente kappa de 0,860, considerado ótimo
(Tabela 3).
Tabela 3
Concordância dos resultados entre os métodos Microteste (OMS) e ELISA HRP2
MICROTESTE (OMS)
TOTAL
ELISA HRP2
+
-
+
35
0
35
-
4
18
22
TOTAL
39
18
57
Co-positividade= 89,74%
Co-negatividade= 100%
Coeficiente kappa= 0,860
48
A média geométrica da densidade de parasitas nas amostras de sangue
colhidas foi de 0,3 % (0,07–1,8 %), com 15,453µL-1 de sangue, e o intervalo de
confiança 95% (IC95): 9,374–21,531µL-1. Sete amostras de sangue tiveram
densidades parasitárias maior de 1% (1,2–1,8%).
A correlação da densidade parasitária com o IC50 de ambos os métodos e as
drogas estudadas não foi estatisticamente significante (teste de Pearson; p>0,005).
Analisando-se os 39 resultados do Microteste (OMS) a relação de maturação
de esquizontes e inibição do crescimento dos parasitos sob as diversas
concentrações das drogas testadas, demonstrou que 82,63% da população de
parasitos exibem inibição da maturação de trofozoítos para esquizontes na
concentração limite entre sensibilidade e resistência (128pmol) para quinino (Figura
14) e 73,63% para mefloquina na concentração limite (32pmol) de parasitos com
maturação de esquizontes (Figura 15). Os níveis de cepas resistentes detectáveis
foram de 9/39 (23,1%) ao quinino e 16/39 (41,0 %) para mefloquina.
Figura 14: Resultados dos 39 Microteste (OMS) relação de maturação de
esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas concentrações do quinino
49
Figura 15: Resultados dos 39 Microteste (OMS) relação de maturação de
esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas concentrações da mefloquina
Estes 39 ensaios quando analisados também em função da concentração de
inibição (IC50), ou seja, a concentração da droga capaz de inibir o desenvolvimento
de 50% da população dos parasitos, individualmente 35,89% (14/39) e 51,28%
(20/39) para as drogas quinino e mefloquina respectivamente, tiveram a
concentração inibitória acima do limiar de sensibilidade (Tabela 4).
As médias do IC50 neste grupo de 39 amostras foram de 236,61 nM (IC95%:
192,92-280,30 nM) para o quinino e 38,15 nM (IC95%: 32,06-44,25 nM) para a
mefloquina (Tabela 4).
50
Tabela 4
Avaliação dos 39 isolados pela (CMI %), IC50% do P. falciparum ao quinino (QN)
e mefloquina (MF) pelo microteste (OMS)
DROGA
QUININO
MEFLOQUINA
N
39
39
CMI
(%)
I IC50
(%)
9
23,01%
14
35,89%
16
41,02%
20
51,28%
IC50%
(IC95%)
236,61
(192,92 -280,30)
38,15
(32,06 – 44,25)
Analisando-se os resultados dos 35 concordantes em ambos os métodos a
relação de maturação de esquizontes e inibição do crescimento dos parasitos sob as
diversas concentrações das drogas testadas, demonstrou que 80,52% da população
de parasitos exibem inibição da maturação de trofozoítos para esquizontes na
concentração limite entre sensibilidade e resistência (128pmol) para quinino (Figura
16) e 71,22% para mefloquina na concentração limite (32pmol) de parasitos com
maturação de esquizontes (Figura 17). Os níveis de cepas resistentes detectáveis
foram de 8/35 (22,85%) ao quinino e 15/35 (42,85 %) para mefloquina.
51
Figura 16: Resultados dos 35 Microteste(OMS) relação de maturação de
esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas concentrações do quinino
Figura 17: Resultados dos 35 Microteste (OMS) relação de maturação de
esquizontes e inibição do crescimento sob as diversas concentrações da mefloquin
A avaliação dos 35 testes concordantes em ambos os métodos as respostas
individuais dos IC50 foram 37,14% (13/35) e 54,28% (19/35) às drogas respectivas
pelo microteste (OMS) e 31,42% (11/35) e 45,71% (16/35) para quinino e
mefloquina, pelo método do ELISA HRP2.
52
As médias das concentrações inibitórias 50% (IC50) com os intervalos de
confiança dos 35 testes concordantes para o experimento ELISA HRP2 foram
225,19 nM (IC95%: 182,24–268,14 nM) e 40,03 nM (IC95% 32,54–47,52 nM), para
quinino e mefloquina, respectivamente (Figura 18).
500
400
300
200
100
0
Maxima
Minima
Média
Quinino (nM)
Mef loquina (nM)
483,94
70,79
225,19
95,53
11,8
40,03
Figura 18: Média do IC50% nos 35 testes concordantes da sensibilidade do
P. falciparum às drogas quinino e mefloquina pelo método de ELISA HRP2
No método de maturação de esquizontes (OMS) o valor médio do IC50% e os
intervalos de confiança (IC95%) foram 246,54 nM (IC95%: 200,81–292,81 nM) e
38,88 nM (IC95%: 32,13–45,64 nM) para quinino e mefloquina, respectivamente,
(Figura 19).
53
600
500
400
300
200
100
0
Maxima
Minima
Média
Quinino (nM)
Mef loquina (nM)
528,86
77,12
246,54
85,32
12,41
38,88
Figura 19: Média do IC50% nos 35 testes concordantes da sensibilidade do
P. falciparum às drogas quinino e mefloquina pelo microteste (OMS)
A análise de correlação dos resultados do ELISA HRP2 com às duas drogas
antimaláricas, individualmente, mostrou uma associação fortemente significante com
aqueles obtidos dos microteste (OMS) em análise de IC50 (n= 35; R= 0.977; P <
0.001) para quinino (Figura 20) e (n=35; R = 0.946; P < 0.001) para mefloquina
(Figura 21).
54
IC50 determinado por microteste/WHO
600
QUININO
R^=0,977
p<0,001
500
400
300
200
100
0
0
100
200
300
400
500
IC50 determinado por ELISA/HRP-2
Figura 20: Análise de correlação do IC50 do quinino determinado pelos
métodos ELISA HRP2 e Microteste (OMS)
IC50 determinado pelo microsteste/WHO
100
MEFLOQUINA
R^= 0,946
p<0,001
80
60
40
20
0
0
20
40
60
80
100
IC50 determinado pelo ELISA/ HRP-2
Figura 21: Análise de correlação do IC50 da mefloquina determinado pelos
métodos ELISA HRP2 e Microteste (OMS)
55
Quanto aos resultados de IC50 obtidos da análise do ELISA HRP2 para
avaliar indícios de resistência cruzada dos parasitos entre os dois compostos
químicos, não houve associação estatisticamente significante (r=0,369; p=0,019),
sugerindo, portanto que não há resistência cruzada evidente entre estas drogas. Os
padrões de sensibilidade foram idênticos aos testados pelo método microteste
(OMS).
56
5 DISCUSSÃO
A história da resistência aos antimaláricos, exaustivamente investigados,
documenta que antes do fracasso do tratamento acontece uma redução progressiva
da sensibilidade, facilmente detectável pela avaliação da mudança na concentração
inibitória 50% (IC50) da droga in vitro. Os resultados dos estudos in vitro regulares
emitem precocemente sinais de iminente resistência desses parasitos às drogas de
uso habitual ou em fase experimental, podendo nortear a tomada de decisões na
política dos antimaláricos nos paises onde há a endemia malárica (OMS, 2005b).
5.1 Dados epidemiológicos
A topografia de Manaus é caracterizada por inúmeros igarapés e coleções de
água formadas pela estação das chuvas, os quais propiciam condições adequadas
para o desenvolvimento da população anofélica. A periferia da cidade tem como
particularidade tipos de moradias toscas, edificadas com madeira e em muitas
situações encontram-se estruturas quando muito protegidas apenas por papelão,
lona ou palha, localizadas freqüentemente próxima a coleções hídricas.
Quanto as informações relativas a presente avaliação, observou-se a maior
incidência da malária em pacientes adultos do sexo masculino, possivelmente este
dado relaciona-se com à exposição mais freqüente pelo exercício de sua atividade
tais como: agricultor, caseiro, no desmatamento de áreas para assentamentos
desordenados (invasões) em horários de maior vulnerabilidade na cadeia de
transmissão da doença.
57
Neste estudo 54,2%, de pacientes com suspeita de terem contraído a doença
malárica em Manaus observou-se que as maiores concentrações foram em três
zonas geográficas (Oeste, Norte e Leste), possivelmente como resultado da
explosão demográfica urbana desordenada pelo movimento migratório em
conseqüência da expansão da fronteira econômica, com invasões dando origem a
novos bairros formados por bolsões de carências sociais, originados por alterações
ambientais. A movimentação constante da população exibe o perigo potencial de
disseminação de cepas de parasitos sensíveis ou resistentes aos medicamentos. A
OMS (1987) e Di Souza (1992) associaram a migração humana à disseminação de
cepas de parasitos resistentes, principalmente em áreas de elevada transmissão.
Estudos sobre fatores de risco relacionados com padrões socioeconômicos e
ambientais têm apresentado fortes associações com a transmissão da malária em
diversas regiões do mundo (BANGUERO, 1984; BUTRAPORN et al., 1986; KORAM
et al., 1995). No Brasil, Terrazas et al. (2004), analisando a distribuição espacial da
malária em Manaus, por meio de geoprocessamento, demonstraram que as zonas
Leste e Norte e parte da Oeste são as que mais concentram as localidades de alto
risco de transmissão da doença, superpondo-se às áreas de invasão guardando
semelhança com o que foi observado no presente.
Suárez Mutis (1997), estudando o processo de transmissão da malária em
área de invasão recente na cidade de Manaus, constatou não poder afirmar a
existência da urbanização da malária, embora a população se encontre em processo
de periferização, em condições precárias do espaço ocupado, propiciando a
ocorrência de surto da doença durante o período de consolidação de infra-estrutura
58
socioeconômico e ambiental. Similarmente na avaliação, 57,6% dos pacientes
mencionaram terem sido acometidos por vários episódios de malária ao longo dos
anos, evidenciando, assim, habitual exposição com conseqüente risco de contrair a
doença, particularmente em áreas próximas ao habitat do vetor.
5.2 Considerações sobre as técnicas
Tendo como único critério para a seleção das amostras de sangue a
densidade parasitária inicial, as culturas de P. falciparum realizadas sob as mesmas
condições em ambos os métodos testados, após os respectivos períodos de
incubação (30h e 72h), tiveram aproveitamento final (66,1%) em ambas as técnicas,
sugerindo que um ciclo eritrocítico assexuado completo (48h) produz um aumento
significativo nas concentrações da HRP2 correspondente à elevação do nível de
parasitemia. Estes achados divergiram dos encontrados por Noedl et al. (2004), que
relataram uma taxa de sucesso, diferenciado de 87% após 72 horas de cultivo
(HRP2) comparado com 61% do microteste/OMS com o tempo de incubação que
não excedeu a 30 horas, sugerindo que a incubação longa (72 horas) permite testar
drogas de ação lenta (antifolatos e antibióticos) sem necessidade de modificar o
protocolo. Não podendo ser estas informações comparadas com outros estudos
realizados na Bacia Amazônica, uma vez que os critérios metodológicos não
guardam similaridades.
A opção neste experimento de substituir o soro humano pela albumina
comercial (Albumax, Gibco) como fonte de proteína para os parasitos foi de ordem
metodológica do protocolo, justificado pelo padrão mais uniforme e o controle da
59
qualidade das proteínas. Na execução dos testes, a utilização do Albumax também
demonstrou praticidade conforme os estudos que mostraram ser o soro bovino fetal
ou Albumax® um substituto satisfatório para o soro humano no cultivo in vitro do P.
falciparum (BASCO, 2003), além de eliminar a necessidade de armazenamento e
controle do soro no campo (BASCO 2004). Embora os resultados com albumina
comercial não sejam necessariamente idênticos aos obtidos com o soro humano, o
resultado final facilita a comparação (RINGWALD et al., 1999).
A maturação de parasitos das formas de anéis jovens em esquizontes, em
ambos os métodos, não foi satisfatória em 30,5% das culturas, supõe-se que este
fato tenha relação com automedicação recente. O critério adotado para a exclusão
do uso de antimaláricos foi determinado apenas pela informação verbal no momento
da entrevista, contrariando o recomendado para a confirmação da ausência do uso
de antimaláricos pelo exame de urina. Provavelmente esta dificuldade técnica pode
ter contribuído para o não sucesso com diversas amostras, inclusive aquelas com
baixas parasitemias. Em acordo com o observado por Basco et al. (2002), nas
amostras de sangue de paciente com medicação recente, o ciclo biológico do
parasito foi incompleto ou teve pouco crescimento, com a diminuição do IC50 pela
presença da droga no sangue. Cravo e Rosário (2004) citaram como um dos
problemas de execução dos testes in vitro a dificuldade no controle dos níveis dos
fármacos em cultura devido à ingestão prévia de antimaláricos pelo doente.
5.3 Comparação entre as técnicas
Apesar da concordância entre os resultados do método de ELISA HRP2 e o
microteste (OMS) mostrarem especificidade de 100% e a co-positividade 89,74%,
60
com índice kappa ótimo, quatro (10,2%) isolados testados pelo ELISA HRP2 para as
droga tiveram valores muito baixos de densidades óticas (DOs), o que condicionou
avaliar as mesmas apenas pela leitura microscópica. As observações sugerem certa
dificuldade para o reconhecimento do teste, primeiramente atribuída a problemas
logísticos, no armazenamento e transporte dos kits, no processo de importação da
Austrália para Manaus em condição recomendável de temperatura. Outra hipótese
recai sobre a sensibilidade do kit, quando se observa que a densidade parasitária
mínima no estudo foi de 0,07%, bem acima da parasitemia inicial (0,01%) descrita
pelo fabricante. Todavia, tornam-se imperiosa a condução de novos estudos para
uma caracterização mais clara e mais precisa dos questionamentos acima.
Noedl et al. (2004) fazem referência ao ensaio supra citado como sensível o
bastante para detectar parasitemias de 0,01%, comparável ao microteste (OMS) e
dez vezes mais sensível que o método isotópico. Entretanto, ressalvam os
pesquisadores que a densidade parasitária de 0,03% seria valor mínimo ideal para o
início dos testes nos quais se incluem a maioria dos casos de malária falciparum
sintomáticos.
O IC50 do ensaio ELISA HRP2 não indicou associação significativa com a
densidade parasitária inicial (p>0,05), sugerindo que a densidade parasitária nesse
teste não tem grande relevância. Duraisingh et al. (1999) e Noedl et al. (2002) fazem
referência ao ajuste da parasitemia, diluindo a amostra original de sangue para
eliminar completamente qualquer efeito inócuo ao parasito.
A preferência neste estudo pelo kit de ELISA (Malaria Ag CELISA®) para a
quantificação da PfHRP2 em relação outras apresentações de anticorpos
61
monoclonais específicos comercializados por diversos laboratórios, se deu por ser
dispensável a padronização do procedimento de análise e pela aparente facilidade
de reprodução do teste em avaliação, este comercializado atualmente para o
diagnóstico em Bancos de Sangue e ainda em fase de estudos no Brasil pela
RAVREDA.
O presente estudo, realizado em condições de laboratório, teve um bom
desempenho e foi de fácil execução, mostrando-se ser factível sua implementação,
quando adaptado, em condições de campo. Os resultados dessa avaliação com o
método do ELISA foram comparáveis aos do microteste (OMS), concordando com o
que referem Noeld et al. (2002) avaliando o ELISA HRP2 em laboratório com cepas
adaptadas em cultura. O método provou ser tão seguro quanto o ensaio tradicional
(microtécnica/OMS) e tão sensível quanto o ensaio isotópico, mais fácil de executar
e de baixo custo em relação a este último.
Em outro estudo com isolados frescos de P. falciparum cultivados por 72
horas, em condições de campo, omitindo os procedimentos de centrifugação,
lavagens das hemácias, uso de soro e diluição com células vermelhas de sangue,
evidenciaram resultados muito próximos aos comparados com o ensaio modificado
de maturação de esquizontes da OMS (NOEDL et al., 2004).
O elevado custo do kit comercial para a realização das provas em nosso
estudo apresentou-se como sendo uma desvantagem. Noeld et al. (2005) testando o
desempenho de um novo teste de ELISA, com anticorpos monoclonais disponíveis
comercialmente, descrevem resultados de sensibilidade comparáveis aos obtidos
62
usando o kit ELISA HRP2, com uma redução considerável de 80% no custo final.
Pode ser uma nova perspectiva de alternativa no futuro a aplicação nas avaliações
de sensibilidade do plasmódio as drogas antimaláricas.
Melo (2004), ao fazer uma revisão das vantagens e desvantagens dos
métodos disponíveis usando anticorpos monoclonais específicos para os estudos in
vitro, observa a nova geração dos ensaios de sensibilidade sinalizando na direção
de recursos essenciais, tais como, alta sensibilidade, alta reprodutibilidade, semiautomatização, não utilização de material radioativo, viabilidade técnica de aplicação
sob condições de campo, particularmente em regiões endêmicas. Com argumentos
semelhantes, Moreno et al. (2001a) referem que métodos imunoenzimáticos
apresentam facilidade de reprodução e podem despertar um interesse renovado
neste campo de pesquisa essencial similar a Noedl et al. (2005), os autores atentam
para importância do sucesso dos ensaios de resistência às drogas antimaláricas em
campo, pela simplicidade de implementação e execução e alta sensibilidade do
teste.
5.4
Limiar
de
sensibilidade/resistência
do P.
falciparum
às
drogas
antimaláricas
Devido às peculiaridades de cada um dos ensaios (microteste/OMS e ELISA
HRP2), tornou-se realmente impossível executá-los sob condições idênticas e,
embora as leituras das duas técnicas sejam diferentes, ainda assim, o método do
ELISA HRP2 demonstrou resultados muito próximos quando correlacionados com os
produzidos pelo microteste/OMS, este padrão ouro. É necessário entender que as
modificações dos protocolos podem alterar os resultados obtidos, ajuntando-se a
63
isso os diversos fatores com influencia com a resposta in vitro do parasito. Alguns
desses fatores são citados por Basco (2004), como a substituição do soro como
fonte de proteína para os parasitos, o ajuste do hematócrito e da parasitemia inicial,
o período de incubação e a mistura de gases. Entre as orientações da MIM/TDR
(2002) destacam-se os métodos atuais disponíveis para a avaliação do perfil da
sensibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas mais seguras, porém, faz
ressalvas para as variações nas técnicas que nem sempre originam resultados
uniformes, impossibilitando comparações entre diferentes estudos.
As constatações mencionadas fazem ver com clareza a necessidade de se
adotar um protocolo padronizado que permita a comparação de resultados entre os
testes de sensibilidade executados em diversas regiões, em condições laboratoriais
controladas, assim como para pesquisa em campo, com a possibilidade de validar,
in vitro, os limites de resistência na Bacia Amazônica.
As análises do limiar de sensibilidade/resistência interpretadas de formas
distintas, CMI/OMS e IC50 nos dois métodos, ofereceram dificuldades na análise
global dos dados. Basco e Ringwald (2000) referem que os resultados do microteste
isotópico e o microteste (OMS) não são comparáveis, mencionando que um dos
principais problemas com os testes in vitro é a determinação dos valores do limiar do
IC50 que distingue parasitos sensíveis de resistentes. Contudo, comentam que o
IC50 resultante do método enzimático que detecta a presença da desidrogenase
láctica produzida pelo parasito (pLDH) está altamente correlacionada com IC50
obtida pelo microteste isotópico.
64
A associação fortemente significativa dos resultados encontrados com o
ELISA HPR2 e os obtidos pelo microteste (OMS) estão em concordância com os
resultados de outros estudos in vitro de sensibilidade realizados com o método
imunoenzimático, em paralelo com o método isotópico e o de maturação de
esquizontes/OMS (NOEDL et al., 2002; NOEDL et al., 2004).
De acordo com a OMS (2005b), a padronização do método e dos resultados
está ganhando importância crescente para o estudo in vitro.
Refere que os
resultados não deveriam ser expressos em percentual de resistência, especialmente
quando não são validados os limites de resistência, e sim relatados como média
geométrica do IC50 ou CMI, permitindo dessa forma uma comparação quantitativa
mais precisa entre regiões de um determinado país na relação tempo-espaço.
5.5 Avaliação da sensibilidade do P. falciparum às drogas quinolinas-metanóis
Os resultados deste ensaio mostram característica distinta da sensibilidade do
P. falciparum para cada uma das drogas estudadas. Diversos fatores sugerem
associação à emergência e disseminação da quimiorresistência dos parasitos da
malária, como o uso inadequado dos medicamentos, a automedicação, sendo
provavelmente a pressão de seleção dos antimaláricos um dos mais importantes
(YOUNG e MOORE, 1961; PETERS, 1970; 1998; DE SOUZA, 1992).
A resistência do P. falciparum ao quinino (22,85% com IC50: 246,54 nM pelo
microteste/OMS) observada corrobora resultados in vitro similares de outros
investigadores, em diversas regiões do país, utilizando a mesma técnica (Reickmann
65
et al.) por Rosário et al. (1986a) (Acre, Amazonas, Roraima, 11,8%), Santos et al.
(1987) (Pará e Amapá, Rondônia, Maranhão - 56,5%), Di Santi et al. (1988) (Pará,
Acre - 2%), Kremsner et al. (1989) (Acre - 2,3%), Couto et al. (1993a) (Pará - 8,2%),
Cerutti et al. (1999b) (Mato Grosso - 3,3%) pelo método isotópico com cepas
adaptadas em cultivo e Zalis et al. (1998) (Mato Grosso) pelo método modificado de
Desjardins et al, e Lebras e Deloron, que citam a redução da sensibilidade (IC50=40280nM). Esses achados previsíveis são indicativos da evolução natural da
resistência do plasmódio ao quinino em áreas onde a pressão da droga sobre a
população de parasitos é usada no tratamento padrão para malária não grave ou
complicada e onde se observa uma elevada ocorrência de infecções não curadas
(SUEBSAENG et al., 1986).
Cerutti Jr (1999a), em estudo comparativo in vivo e in vitro da sensibilidade do
P. falciparum em área endêmica de malária na Amazônia Brasileira, faz referência a
10,6% dos isolados que apresentaram resistência ou baixa sensibilidade ao quinino,
com o IC50 igual a 1,13µmol/l. Não houve correlação entre as concentrações
inibitórias e o clareamento parasitário.
A média do IC50 (225,19 nM) detectada no estudo pelo método ELISA HRP2
apresenta um perfil da sensibilidade P. falciparum ao quinino. Noeld et al. (2002), no
período de 1994 a 2001, avaliando a suscetibilidade parasitária aos antimaláricos na
Ásia (Tailândia, Myanmar e Bangladesh), com cepas criopreservadas e adaptadas
em cultura, registram a média geométrica do IC50 343,86 nM, e, em 2004, Noedl et
al obtiveram com isolados frescos de P. falciparum, em estudo de campo, em região
endêmica da Tailândia, IC50 igual a 326,75 nM ao quinino.
66
Por recomendação do Ministério da Saúde do Brasil, o esquema de primeira
linha no tratamento da malária falciparum não complicada, continua sendo o quinino
em associação com antibióticos (BRASIL/MS/SVS, 2001). O perfil do P. falciparum
ao antimalárico observado neste estudo, avaliando-se a média do IC50 por ambos
os métodos, sugere boa suscetibilidade parasitária à droga, porém não sendo
possível correlacionar com a eficácia da droga in vivo, uma vez que já se observou,
na Amazônia Ocidental, falhas terapêuticas com esta droga (ALECRIN, et al., 1986;
ALECRIN et al., 1988; SILVA et al., 1988; SAMPAIO et al., 1991; SAMPAIO et al.,
1992).
Em ensaio multicêntrico de avaliação da eficácia do quinino realizado pela
RAVREDA, em 14 municípios da Amazônia Legal, os dados preliminares advertem
para fracasso terapêutico em 14,3% dos pacientes, atribuindo os resultados
encontrados à qualidade do medicamento utilizado ou à resistência dos parasitos ao
esquema de tratamento (BRASIL/MS/SVS, 2005). No Amazonas avaliando-se a
sensibilidade do P. falciparum in vivo no município de Coari, no ano em curso, os
resultados provisórios, demonstram alto percentual de fracasso terapêutico
observado nos pacientes tratados com quinino sinalizam um aumento da tolerância
dos parasitos ao fármaco (Alecrim, MGC; comunicação pessoal).
Naquelas áreas onde as cepas do P. falciparum ainda não desenvolveram
resistência ao quinino, freqüentemente a resistência é superestimada, associada à
baixa adesão ao esquema terapêutico de múltiplas doses durante sete dias,
raramente respeitados, e o limiar para resistência in vitro não está claramente
definido (SUEBSAENG et al., 1986; WHO, 2005b). No entanto, dados oriundos da
67
sensibilidade dos plasmódios nos estudos in vitro podem predizer a ocorrência de
pouca efetividade curativa dos antimaláricos, observando-se maior número de
fracassos terapêuticos em áreas onde já se percebe a resistência parasitária.
Os resultados dos testes in vitro para mefloquina mostraram que 42,85% dos
isolados de P. falciparum resistentes ao antimalárico, sugerindo a emergência de
resistência no Amazonas. A resistência teria sido muito mais alta (54,28%) se o valor
de limiar padrão de 30nM para o IC50 como referência tivesse sido usada (Brasseur
et al., 1988). Estes achados advertem para a diminuição da sensibilidade dos
plasmódios, corroborando os dados de outros estudos realizados na região
Amazônica Brasileira e em outros países, reportando o aumento da resistência do P.
falciparum à droga.
A diminuição da sensibilidade do P. falciparum in vitro à mefloquina é notória,
com maior relevância na Ásia. Na Tailândia, após introdução do uso da droga em
1985, a resistência ao fármaco vem sendo observada desde década de 90,
tornando-se um problema de saúde pública em áreas onde a mefloquina foi
intensamente
empregada
(WHITE,
1994;
MOCKENHAUPT,
1995;
WONGSRICHANALAI et al., 2002). Wongsrichanalai et al. (2001) estudando a
suscetibilidade do P. falciparum na Ásia com cepas adaptadas em cultura isoladas
de
quatro
regiões
de
Myanmar
(Myitkyina,
Lashio,
Mawlamyine,
Dawei),
identificaram Mawlamyine como a área de transmissão de P. falciparum mefloquinaresistente na região de fronteira com a Tailândia.
68
A alta prevalência da resistência in vitro à mefloquina em Bangladesh foi
documentada por Noedl, et al. (2003c). No Gabão (Ramharter et al., 2004),
avaliando-se atividade das quinolinas pelo método de maturação de esquizontes no
intervalo de 24 horas, apontam para diminuição significativa da sensibilidade do
P. falciparum à mefloquina. Um estudo na África Ocidental mostrou a existência de
parasitos com sensibilidade diminuída para mefloquina antes mesmo de sua
introdução na região para uso terapêutico (WHO, 2005b).
Na América do Sul, em particular na Colômbia e na Venezuela, Espinal et al.
(1985) e Maynadie et al. (1989) reportaram populações de parasitos resistentes ou
com redução da sensibilidade observada na análise in vitro.
No Brasil, Alecrim (1981) fez o primeiro relato de resistência a mefloquina e já
alertava para a diminuição da sensibilidade à mefloquina quando a droga ainda
encontrava-se em estudo clínico em fase de validação da dose terapêutica.
Cronologicamente, estudos que correlacionaram a resposta de sensibilidade in vivo
e in vitro, realizados no decorrer das últimas décadas no Brasil, também
manifestaram a preocupação com a redução da sensibilidade ou resistência do
plasmódio à mefloquina devido à provável ocorrência da pressão de seleção da
droga pelo uso inadequado no que se refere a posologia diferentes áreas da
Amazônia Brasileira ( ALECRIM, 1986; ALECRIM et al., 1986; COUTO et al, 1993b;
CERUTTI. Jr et. al., 1999; Di Santi et al.,1986,1988; CALVOSA et al., 2001; COUTO,
2001).
69
Noronha et al. (2000) relatam a ocorrência de resistência ao nível de RIII, à
mefloquina, em crianças com malária falciparum não complicada tratadas na
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, em Manaus.
A redução da sensibilidade do P. falciparum in vitro à mefloquina observada
no estudo pode estar relacionada ao provável reflexo do uso precoce da droga com
entrada ilegal pela Guiana Francesa, antes mesmo de ser usada oficialmente em
1987 pelo Governo do Brasil (BRASIL. MS/SUCAM/DR.PA, 1986). A ocorrência da
pressão da mefloquina sob a população de parasitos circulantes pelo uso facilitado
com o comércio livre clandestino, principalmente nos garimpos, pode ter provocado
seleção de parasitos menos sensíveis. Ainda que a mefloquina faça parte do
esquema terapêutico como droga de segunda escolha para o tratamento de malária
falciparum no Brasil, o emprego rotineiro desse medicamento tem sido usual em
alguns estados.
Com base nas informações das avaliações recentes de resistência dos
plasmódios divulgadas pela RAVREDA, as médias das IC50 de 40,03 nM e IC50 de
38,88 nM à mefloquina obtidas pelos métodos ELISA HRP2 e Microteste/OMS,
respectivamente não guardam relação com o nível da resistência in vivo do P.
falciparum ao fármaco dos estudos de eficácia desenvolvidos na Bacia Amazônica.
Estes mostraram à resposta terapêutica dos parasitos ao antimalárico foi satisfatória
apresentando baixo percentual de fracassos terapêuticos (4,3%). O alto nível de
resistência in vitro observado no presente estudo guardada semelhança com os
observados em relatório do MS recentemente divulgado (42,8%) (BRASIL, 2005).
70
Para Di Santi et al. (1988), o fato da meia-vida de eliminação da mefloquina
ser longa (21 dias) tornar-se importante fator na seleção de cepas resistentes. O uso
generalizado da mefloquina provavelmente poderá acelerar o desenvolvimento da
resistência como ocorreu no sudeste da Ásia (FONTANET et al., 1993). A taxa de
fracasso terapêutico da mefloquina como monoterapia em regiões de fronteira na
Ásia (Tailândia/Camboja e Myanamar/Tailândia), excede a 50%, principalmente
como resistência de nível I e II (WERNSDORFER, 1998).
O uso isolado da mefloquina em algumas áreas da Amazônia Brasileira, como
na cidade de Manaus, bem como o seu emprego indistintamente para qualquer caso
de malária falciparum, sem respeitar a sua indicação como droga de segunda
escolha, pode ter contribuindo para a maior tolerância dos parasitos ao fármaco.
Sabe-se que pela comodidade posológica a mesma é usada mais freqüentemente
do que é recomendado, e é mais aceitável pelos pacientes em virtude de não
apresentar tantos efeitos indesejados.
A
utilização
de
ferramentas
moleculares
no
mapeamento
da
quimiorresistência da malária está ainda numa fase inicial. Na última década, os
progressos no conhecimento molecular da resistência do P. falciparum a diversos
antimaláricos foram significativos, devido à decodificação do genoma do P.
falciparum (GARDNER et al., 2002). Mutações nos genes Pfdhfr e Pfdhps foram
assosciadas à resistência à SP (sulfadoxina-pirimetamina), enquanto que as
mutações nos genes Pfcrt à resistência à cloroquina. Os polimorfismos no Pfmdr1
parecem alterar a suscetibilidade dos parasitos à mefloquina, quinino e cloroquina.
Embora os marcadores moleculares não tenham sido objetos deste estudo, a
71
aplicação dessa ferramenta é de real importância para a compreensão dos
mecanismos de resistência da droga, na definição concreta dos perfis do
P. falciparum aos antimaláricos e no planejamento de estratégias no controle da
malária e na padronização do uso de antimaláricos.
Como observado, a aplicação do ensaio imunoenzimático ELISA HRP2 de
sensibilidade do P. falciparum às drogas antimaláricas neste experimento, poderia
ser recomendada em estudos epidemiológicos, na medida em que a técnica
demonstrou ser sensível rápida e de simples execução, sendo adaptada às
exigências de laboratórios individuais sem dificuldades, podendo ser empregada
com diferentes densidades de parasitemias. O procedimento da cultura do
plasmódio é semelhante ao microteste (OMS).
vantagem
por
ser
automatizado,
o
cultivo
O método ELISA apresenta a
dos
parasitos,
em
diferentes
concentrações de antimaláricos, pode ser realizado in loco e a placa de
experimentação pode ser congelada e enviada posteriormente para um laboratório
de referência. Como observações desvantajosas constatadas, o método enzimático
apresenta um custo elevado de aquisição, a dificuldade no processo de importação,
a manutenção dos kits dos anticorpos monoclonais inalterados frente às variações
de temperatura e umidade no seu transporte e acondicionamento local e a
necessidade de uma leitora de ELISA, nem sempre disponível em laboratórios de
pequeno porte.
A despeito da variedade de métodos empregados nos estudos publicados,
tem se observado uma mudança do perfil de sensibilidade in vitro do P. falciparum
aos antimaláricos utilizados na Amazônia Brasileira. Contudo, evidencia-se a
72
necessidade de se rever o limiar in vitro da sensibilidade das cepas de plasmódio às
drogas na região amazônica brasileira, em concordância com Di Santi et al. (1988),
Couto et al. (1995) e Zalis, et al. (1998).
Uma amostragem maior de isolados a serem avaliados pela RAVREDA, os
estudos de monitoramento da resistência às drogas antimaláricas em toda a Região
Amazônica, utilizando protocolos padronizados para avaliação in vitro da
sensibilidade dos parasitos aos medicamentos, possibilitarão o esclarecimento de
algumas situações particulares, como as observadas em nosso estudo e por outros
pesquisadores.
Será
possível
futuramente
comparação entre os países signatários da Rede.
se
estabelecer
parâmetros
de
73
6. CONCLUSÃO
1. Com base na concentração mínima inibitória pelo microteste (OMS), a
resistência do P. falciparum foi de 22,8% e 42,8% ao quinino e à
mefloquina respectivamente.
2. Com base na concentração de inibição 50% pelo microteste (OMS), a
resistência do P. falciparum ao quinino foi de 37,2% e à mefloquina de
54,3% , com a média da IC50 de 246,5 nM e 38,9 nM respectivamente
3. Pelo ELISA HRP2, a resistência do P. falciparum ao quinino foi de
31,4% e à mefloquina de 45,7%, com a média da IC50 de 225,19 nM e
40,03 nM respectivamente.
4. Os níveis de IC50 determinados pelo ELISA-HRP2 apresentaram alta
correlação com os determinados pelo microteste (OMS).
5. O teste de sensibilidade pelo método do ELISA HRP2 demonstrou
vantagens operacionais, tais como:

Fácil execução técnica.

Possibilidade
de
análises
de
múltiplas
amostras
simultaneamente em curto período de tempo.

Conveniência de armazenamento da placa de cultura a –20ºC
após a fase de incubação por longo período.

Não utilização de material radioativo.

Semi-automação, evitando os riscos de falha humana na
interpretação dos resultados.

Fácil adaptação às exigências de laboratórios individuais.
74
7. Referências Bibliográficas
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88
8. ANEXOS
89
ANEXO A
Código:......................
..
TERMO DE CONSENTIMENTO INFORMADO LIVRE E ESCLARECIDO AO
PACIENTE
“AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE in vitro DO Plasmodium falciparum AOS
ANTIMALÁRICOS PELA CAPTAÇÃO DA PROTEINA RICA HISTIDINA 2”
Patrocinador: Fundação de Medicina Tropical do Amazonas (FMTAM)
Universidade do Estado do Amazonas (UEA)
Equipe responsável:
Orientadora: Profª Drª MARIA DAS GRAÇAS ALECRIM
Co-orientadores: Profª Drª MARIA DAS GRAÇAS BARBOSA
Prof MSc. WILSON DUARTE ALECRIM
Mestranda: Yonne Francis Chehuan Melo
DESCRIÇÃO E OBJETIVO DO ESTUDO
Este é um estudo que estamos fazendo na Fundação de Medicina Tropical
(FMTAM), com o objetivo de estudar, in vitro, a sensibilidade do Plasmodium
falciparum as drogas antimaláricas em pacientes atendidos na Fundação de
Medicina Tropical do Amazonas (FMT/AM).
Para isso, é preciso que sejam colhidos 5 mL de sangue da veia do antibraço
para se realizar exames de sangue. Os possíveis desconfortos e riscos, se
ocorrerem, são aqueles relacionados com a retirada de sangue, como dor local
e/ou hematoma (“rouxidão”) no local da punção, com duração de 3 a 4 dias. Após
a coleta o (a) paciente será atendido pelo médico.
BENEFÍCIOS:
Participando desse estudo o (a) paciente não receberá qualquer benefício
adicional, nem ganhará dinheiro, mas estará contribuindo para o conhecimento
científico da malária.
Todos os cuidados apropriados serão tomados, como o uso de seringa,
agulha e gaze descartável assim como álcool para assepsia local, entre outros.
90
Em caso de prejuízo ou dano a saúde decorrente da pesquisa, a
responsabilidade indenizatória caberá ao coordenador do estudo e a Fundação de
Medicina Tropical do Amazonas.
O (a) paciente receberá informações sobre os mecanismos de transmissão
da doença e as formas de evitar uma nova infecção.
QUEM VAI FICAR SABENDO DO RESULTADO DOS EXAMES?
A participação nesse estudo será confidencial e os resultados dos exames
serão mostrados as pessoas da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas que
trabalham com malária ou pesquisadores de outras cidades ou países, mas o nome
da pessoa que participa nunca será revelado.
O QUE ACONTECE SE O PACIENTE QUISER DESISTIR DE PARTICIPAR DA
PESQUISA?
A pessoa que participa da pesquisa tem todo o direito de desistir a qualquer
momento do estudo. E mesmo que isso aconteça, a pessoa será tratada e terá um
médico para atendê-la sempre que for possível.
NENHUM PESQUISADOR PODE DEIXAR DE TRATAR BEM O PACIENTE QUE
NÃO QUEIRA PARTICIPAR DA PESQUISA !!!!
O PACIENTE GUARDARÁ ALGUM PAPEL DIZENDO QUE PARTICIPOU DA
PESQUISA?
A pessoa que aceitar participar da pesquisa guarda uma cópia deste
documento que será assinado duas vezes, uma cópia fica com o pesquisador e a
outra com o paciente.
E O QUE FAZER SE ACONTECER ALGUMA COISA COM O PACIENTE DEPOIS
DA PESQUISA?
A Dra. YONNE FRANCIS C. MELO, cujo número de telefone é 238-1711
(ramal 219), terá disponibilidade para atender e esclarecer quaisquer dúvidas.
91
CONSENTIMENTO PÓS-INFORMAÇÃO:
Eu,.....................................................................................................................,
recebi a explicação de que serei um (a) dos (as) participantes dessa pesquisa. Se
eu não souber ler ou escrever, uma pessoa de minha confiança lerá este
documento para mim e depois escreverá nesta página o meu nome.
E por estar devidamente informado e esclarecido sobre o conteúdo deste
termo, livremente, sem qualquer pressão por parte dos pesquisadores, expresso
meu consentimento para minha inclusão nesta pesquisa.
Data......../......./.........
......................................................................
Assinatura do (a) paciente ou representante legal
Impressão do polegar direito do (a) paciente,
caso esta não saiba escrever seu nome.
................................................................................ ..........
Nome do pesquisador que conversou com o (a) paciente
............................................................................................
Assinatura do pesquisador que conversou com o (a) paciente
92
ANEXO B
93
ANEXO C
94
ANEXO D – HN- NonLin V.1.05 Beta