Identificação e caracterização de Bacillus licheniformis e

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DOUTORADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE Bacillus licheniformis e
Geobacillus stearothermophilus.
PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE E DEGRADAÇÃO DE DIBENZOTIOFENO
(DBT) POR UMA NOVA AMOSTRA DE
Geobacillus stearothermophilus UCP 986.
MABEL CALINA DE FRANÇA PAZ
RECIFE - PE
2005
MABEL CALINA DE FRANÇA PAZ
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE Bacillus licheniformis e Geobacillus
stearothermophilus.
PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE E DEGRADAÇÃO DE DIBENZOTIOFENO (DBT) –
POR UMA NOVA AMOSTRA DE
Geobacillus stearothermophilus UCP 986.
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco,
como parte dos requisitos, para obtenção do título de
Doutor em Ciências Biológicas.
Área: Microbiologia
ORIENTADORA: Profα. Dra. GALBA MARIA CAMPOS-TAKAKI
CO-ORIENTADORA: Profa. Dra. BEATRIZ SUZANA O. DE CEBALLOS
RECIFE
Fevereiro - 2005
“O anjo do senhor acampa-se ao redor.
dos que o temem, e os livra”
Salmo 34:7
Dedico a Minerva minha mãe, a Iure meu filho,
Cristina, Múcio e Mivaldo meus irmãos,
por todos os bons momentos vividos
e as ausências compreendidas.
AGRADECIMENTOS
Algumas pessoas e instituições contribuíram, diretas ou indiretamente,
para a realização deste Curso. A todas agradeço pelo apoio nunca negado nos
momentos difíceis:
- A Deus luz que me conduziu incessantemente nesta estrada;
- À minha família, pela compreensão nos momentos mais difíceis e no
estímulo de lutar por meus ideais, tão necessária para seguir adiante;
- A Iure Augustus, grande amor da minha vida e combustível para lutar por
dias melhores;
- À Professora Galba Maria de Campos-Takaki, pela orientação e
oportunidade de realizar este trabalho;
- À Professora Beatriz Ceballos, pela orientação em todas as fases da minha
vida profissional, e até pelos “puxões de orelha” que tanto me fizeram crescer;
- Aos meus amigos do CCB – Maria de Fátima Andrade (especial), Ricardo
Kenji
Shiosaki,
Luciana
Matta,
Danielly
Bruneska,
Jorge
Brito,
Norma
Evangelista, Vânia Andrade, Thayza Stamford, Leila Cabral, Andréa Caldas entre
outros tão importantes na minha conquista, que me incentivaram e ajudaram
com conselhos, ombros e ouvidos amigos;
- Aos meus amigos do NPCIAMB – Luciana Franco, Marcos Lima, Marcos
Moraes, Danielle Renata, João Neto, Marta Lúcia, André Santiago, Raquel Rufino,
Petrusk Homero, Mabel Hanna Harrop, Clarissa Daisy Albuquerque, Patrícia
Souza, Mariluce Barbosa, Fabíola Almeida, Thayse Lima, Juliana Luna, Carolina
Buarque, Charles Bronzo pelos momentos de confraternização intensa e apoio
nas horas de trabalho;
- Aos técnicos do NPCIAMB, Severino Humberto de Almeida, Salatiel
Joaquim de Santana e Sonia Maria de Souza, pelo auxilio durante a fase
experimental;
- A Secretária do CCB, Srta. Adenilda Eugenia pelos inestimáveis conselhos
e amizade;
- As funcionárias do CCB, Liana e Jaci pelo auxilio durante o curso;
- Aos Professores do NPCIAMB, Leonie Sarubbo, Alexandra Salgueiro,
Carlos Alberto da Silva, Valdemir Alexandre dos Santos, Aline Nascimento e
Kaoru Okada, pelos bons momentos de convivência;
- Ao Professor e amigo, Bemvindo Gomes por toda amizade, apoio e
inestimáveis ensinamentos ministrados durante todos estes anos;
- Aos Professores do CCB, Luis Bezerra de Carvalho Junior, José Luiz de
Lima Filho, Laise Holanda Cavalcanti, Luana Cassandra Coelho, Ana Lucia Porto,
entre outros pelos ensinamentos ministrados ao longo do curso;
- Ao Reitor da Universidade Católica de Pernambuco, Pe. Theodoro Paulo
Severino Peters, pelo acesso ao Núcleo de pesquisas em Ciências Ambientais
(NPCIAMB);
- Ao CNPq, CNPq/ CTPETRO, FINEP, pelo financiamento dos experimentos
realizados;
- Ao Engenheiro Carlos José Holanda Gurgel – PETROBRÁS/ LUBNOR, pelo
auxilio nos estudos realizados naquela instituição.
- À Banca examinadora, pelas valiosas sugestões.
SUMÁRIO
Lista de Figuras ............................................................................................... i
Lista de Tabelas ..............................................................................................iii
RESUMO......................................................................................................... X
ABSTRACT.....................................................................................................XI
1. Introdução geral.......................................................................................... 1
2. Revisão Bibliográfica ................................................................................... 5
2.1. Considerações Gerais: Bacillus e Geobacillus............................................ 5
2.2. Surfactantes ............................................................................................ 7
2.2.1. Estrutura e origem microbiológica......................................................... 9
2.2.2. Aplicações dos biossurfactantes .......................................................... 11
2.3. Petróleo e derivados ............................................................................... 13
2.3.1 Origem e caracterização do petróleo .................................................... 13
2.3.2. Processo de refino ............................................................................... 14
2.3.3. Compostos organosulfurados .............................................................. 15
2.4. Tratamento de efluentes......................................................................... 16
2.4.1. Efluentes industriais petroquímicos ................................................... 18
2.4.2. Tratamento biológico dos efluentes petroquímicos .............................. 19
2.4.3. Tratamento biológico de compostos organosulfurados......................... 20
2.4.4. Organismos extremófilos versus Tratamento biológico de efluentes..... 24
2.4.5. Organismos redutores de compostos sulfurados ................................. 25
3. Referências Bibliográficas ......................................................................... 28
1º Artigo – Identificação e caracterização morfofisiológica e bioquímica de
amostras de bactérias da família Bacillaceae
1. Introdução e Revisão Bibliográfica..............................................................42.
2. Material e Métodos....................................................................................44.
3. Resultados e Discussão....................................................... .....................47
4. Referências Bibliográficas ......................................................................... 53
2º Artigo – Influência de cloreto de sódio e de cobre na produção de biomassa e
de biossurfactante por uma nova amostra de Geobacillus stearothermophilus
UCP 986
1. Introdução e Revisão Bibliográfica..............................................................69.
2. Material e Métodos.....................................................................................71.
3. Resultados e Discussão.............................................................................73.
4. Referências Bibliográficas ........................................................................ 78.
3º Artigo – Produção e caracterização de biossurfactantes por uma nova
amostra de Geobacillus stearothermophilus UCP 986
1. Introdução e Revisão Bibliográfica.............................................................93
2. Material e Métodos.............................................................. .................. ...95
3. Resultados e Discussão.......................................................................... ...98
4. Referências Bibliográficas .......................................... .............................102
4º Artigo – Degradação do dibenzotiofeno por uma nova amostra de Geobacillus
stearothermophilus UCP 986
1. Introdução e Revisão Bibliográfica .......................................................... 113
2. Material e Métodos.................................................................................. 116
3. Resultados e Discussão........................................................................... 118
4. Referências Bibliográficas ....................................................................... 123
4. CONCLUSÕES GERAIS........................................................................... 136
ANEXOS ..................................................................................................... 138
LISTA DE FIGURAS
Revisão Bibliográfica
Figura 1 Estrutura de surfactante (virtuallaboratory. net)............................. 10
Figura 2. Processo de refino do petróleo (Petrobrás. com.br).................... ......14
Figura 3.Dibenzotiofeno – DBT (Kropp et al, 1997) ........................................ 20
Figura 4: Vias degradativas do Dibenzotiofeno (Alves et al, 1999).................. 23
Artigo 1 – Identificação e caracterização morfofisiológica de amostras de
bactérias da família Bacillaceae
Figura 1 Dendograma apresentando a distribuição média e grau de similaridade
entre os grupos de Bacillus licheniformis isolados do Porto do Recife a 50ºC. .... 63
Figura 2 Dendograma apresentando a distribuição média e grau de similaridade
entre os grupos de B. licheniformis isolados do Lodo Têxtil a 55ºC. ................... 64
Figura 3 Dendograma apresentando a distribuição média e grau de similaridade
entre os grupos de B. licheniformis e G. stearothermophilus isolados do Porto do
Recife, de Efluente e Lodo Têxtil a 60ºC ............................................................ 65
Artigo 2 - Influência de cloreto de sódio e de cobre na produção de biomassa e
de biossurfactante por uma nova amostra de Geobacillus stearothermophilus
UCP 986
Figura 1. Diagrama de Pareto de efeitos padronizados. Variável resposta: índice de
emulsificação com 96 horas de cultivo de G. stearothermophilus.............................88
Figura 2. Diagrama de Pareto de efeitos padronizados. Variável resposta: biomassa
com 96 horas de cultivo de G. stearothermophilus ................................................. 89
Artigo 3 – Produção e caracterização e de biossurfactante por uma nova
amostra de Geobacillus stearothermophilus UCP 986
Figura 1. Cinética de crescimento consumo de glicose, curva de pH, biomassa (g),
índice e atividade de emulsificação no liquido metabólico livre de células após 48
horas de fermentação de G. stearothermophilus........................................... 107
Artigo 4 – Degradação do dibenzotiofeno por uma nova amostra de Geobacillus
stearothermophilus UCP 986.
Figura 1: Viabilidade celular do G. stearothermophilus na presença de DBT durante
30 horas de cultivo.. ................................................................................... 128
Figura 2: Consumo de glicose do G. stearothermophilus em diferentes concentrações
de DBT durante 30 horas de cultivo............................................................ 129
Figura 3: Perfil de proteínas totais do G. stearothermophilus em diferentes
concentrações de DBT durante 30 horas de cultivo..................................... 130
Figura 4: Curva do pH durante o crescimento do G. stearothermophilus UCP 986 na
presença das diferentes concentrações de DBT (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1 mM) durante
30 horas de cultivo ..................................................................................... 131
Figura 5: Biomassa total do G.stearothermophilus na presença de DBT durante 30
horas de cultivo.. ........................................................................................ 132
Figura 6. Espectrograma de massas dos metabólitos provenientes da degradação do
dibenzotiofeno com 4 horas de cultivo G.stearothermophilus ..............................
................................................................................................................... 133
Figura 7. Espectrograma de massas dos metabólitos provenientes da degradação do
dibenzotiofeno com 12 horas de cultivo G.stearothermophilus ............................
................................................................................................................... 134
Figura 8. Espectrograma de massas dos metabólitos provenientes da degradação do
dibenzotiofeno com 30 horas de cultivo de G.stearothermophilus.......................
................................................................................................................... 135
LISTA DE TABELAS
Revisão Bibliográfica
Tabela 1. Principais biossurfactantes e sua origem microbiológica ................ 11
Artigo 1 – Identificação e caracterização morfofisiológica de amostras bactérias
da família Bacillaceae
Tabela 1. Características das amostras de Bacillus licheniformis isoladas do Porto do
Recife – termofilico facultativo 50ºC .................................................................
Tabela 2. Características das amostras de Bacillus licheniformis isoladas do Porto do
Recife – termofilico facultativo 55ºC ..................................................................
Tabela 3. Características das amostras de Bacillus licheniformis e Geobacillus
stearothermophilus isoladas do Porto do Recife
– termofilico facultativo 60ºC.
.........................................................................................................................
Tabela 4. Características das amostras de Bacillus licheniformis isoladas do Porto do
Recife - termofilico facultativo 50ºC...................................................................
Tabela 5. Características das amostras de Bacillus licheniformis isoladas do Porto do
Recife – termofilico facultativo 55ºC ..................................................................
Tabela 6. Características das amostras de Bacillus licheniformis e Geobacillus
stearothermophilus isoladas do Porto do Recife – termofilico facultativo 60ºC....
.........................................................................................................................
Artigo 2 - Influência de cloreto de sódio e de cobre na produção de biomassa e
de biossurfactante por Geobacillus stearothermophilus UCP 986
Tabela 1. Valores das variáveis independentes nos níveis -1 e +1 e no ponto central
.................................................................................................................... 84.
Tabela 2.
Planejamento fatorial com resultados de pH, biomassa, índice de
emulsificação, atividade de emulsificação e tensão superficial, após 96 horas de
cultivo.......................................................................................................... 85.
Artigo 3 – Produção e caracterização e de biossurfactante por Geobacillus
stearothermophilus UCP 986.
Tabela 1. Termoestabilidade do líquido metabólico livre de células do G.
stearothermophilus UCP 986 após fermentação de 48 horas........................ 109
Tabela 2. Efeito do pH na estabilidade do biossurfactante produzido por Geobacillus
stearothermophilus UCP 986 após 48 horas de fermentação........................ 109
Tabela 3. Efeito da concentração de sal na estabilidade do biossurfactante
produzido por G.stearothermophilus UCP 986 após fermentação de 48 horas....
................................................................................................................... 109
RESUMO
Amostras de bactérias pertencentes à família Bacillaceae foram isoladas de solo do
Porto do Recife, de uma área contaminada por petróleo; de efluente e lodo de
indústria têxtil, identificadas 26 amostras como Bacillus licheniformis e 02 amsotras
de
Geobacillus
stearothermophilus,
apresentando
similaridade
quanto
as
características morfofisiológicas e bioquímicas tais como: crescimento em diferentes
temperaturas e concentrações de cloreto de sódio; utilização do citrato; redução do
nitrato a nitrito; produção de oxidase, catalase e amilase; fermentação de açúcares;
posição dos endosporos; hemólise e susceptibilidade aos antibióticos. Das espécies
estudadas, a nova amostra de G.stearothermophilus apresentou características
consideradas biotecnologicamente interessantes de termofilia e halofilia, além de
uma excelente capacidade de produção de biossurfactante, com estabilidade em
condições adversas de pH, temperatura e salinidade, demonstrando grande reduçao
da tensão superficial. O dibenzotiofeno (DBT), composto organosulfurado presente
em combustíveis como óleo diesel e lubrificantes foi analisado seu processo de
degradação por G. stearothermophilus. Observou-se que o microrganismo foi capaz
de degradar 77% do dibenzotiofeno, clivando suas ligações carbono-carbono,
retirando o átomo de enxofre, transformando-o em compostos alifáticos de fácil
degradação ambiental. O novo isolado de G. stearothermophilus UCP 986 apresenta
caracteristicas
importantes
em
condições
adversas
(termofilia
e
halofilia),
demonstrando ser um excelente candidato em tratamentos “in situ” nos processos
de melhoramento da recuperação de óleo (MEOR) em refinarias.
ABSTRACT
The strains belonging the Bacillaceae family had been isolated from soil, of
contaminated area of petroleum in the Porto of Recife, effluents, and sludge of
textile industry. The were identified 26 strains as Bacillus licheniformis and 02
strains
as
Geobacillus
stearothermophilus,
presenting
similarity
to
some
morphophysiologics and biochemical characteristics, such as: growth in different
temperatures and sodium chloride concentrations; use of the citrate; reduction of
nitrate to nitrite; fermentation of sugars; position of the endospores; production of
amylase, oxidase and catalase; hemolyse and susceptibility to antibiotics. The strain
G. stearothermophilus showed biotechnological characteristics such as: thermophilic
and halophilic; beyond an excellent capacity biosurfactant production; stability in
adverse conditions of pH, temperature, and high salinity, and demonstrating
reduction of the superficial tension. The dibenzotiophene (DBT), organosulfur
composition in fuels as oil diesel and lubrificants, had been analyzed your process
of degradation by G.stearothermophilus. It was observed that, G. stearothermophilus
was capable to 77% degradated the dibenzotiophene, breaking linking carboncarbon, removal the sulphur atom, transforming into aliphatics compounds of easy
degradation in the environment. The new isolated of G. stearothermophilus UCP 986
showed important characteristics in adverse conditions, demonstrating to be able
an excellent candidate in treatments "in situ" in the processes of improvement on
the oil recovery (MEOR) in refineries.
1. INTRODUÇÃO GERAL
O gênero Bacillus foi descrito desde o século XIX, com base na sua habilidade
de motilidade e esporulação, evidenciando a morfologia e presença de flagelos que o
diferenciava do gênero Clostridium (Forsyth et al., 1998). Segundo Sneath (1986), os
Bacillus são descritos como aeróbios que degradam gelatina e formam colônia do
tipo rizóide, e sua distinção do outro gênero da família Bacillaceae – Clostridium –
está na utilização do oxigênio e na forma de seus esporos.
O gênero Bacillus é considerado cosmopolita, pois seus representantes são
encontrados no solo, na água e até na poeira do ar. São sapróbios, embora algumas
espécies são consideradas patogênicas. Em geral são gram positivos ou gram
variáveis, móveis, aeróbios, apresentam forma de bastonetes, produzem endósporos
que os tornam resistentes ao calor e outros agentes esterilizantes (TORTORA et al.,
2003).
As espécies de Bacillus são consideradas bem distribuídas no solo, na água e
no ar e seu estudo taxonômico evoluiu bastante nos últimos anos com o
desenvolvimento das técnicas moleculares (RNA 16S), mas sua identificação e
classificação
ainda
são
dificultadas,
pois
consomem
muito
tempo
e
são
considerados laboriosos (DICKINSON et al., 2004), os que fazem necessário o
emprego de combinação dos métodos tradicionais, quimiotaxonômicos, moleculares
e genéticas para se obter um completo e definido perfil da família Bacillaceae
(FORSYTH et al. 1998).
Microrganismos capazes de degradar substratos insolúveis em água como os
hidrocarbonetos sólidos e líquidos, gorduras, óleos e graxas, causando sérios
problemas ambientais associados à poluição orgânica, usualmente produzem
substâncias com características emulsificantes, como biosurfactantes (GERSON,
1993; ROCHA, 1999; MULLIGAN, 2004). Alguns surfactantes, conhecidos como
biossurfactantes, são produzidos por leveduras ou bactérias a partir de vários
substratos solúveis, como açúcares, e insolúveis, alcanos, óleos e resíduos (LIN et
al., 1993; LIN, 1998; ROONGSAWANG et al., 1999; BODOUR, 2003).
Após a segunda Grande Guerra Mundial, a indústria petroquímica
experimentou um acelerado crescimento, que se mantêm até hoje, com produção de
resíduos orgânicos que exercem forte efeito poluidor. Atualmente, os poluentes
industriais, em especial os produzidos em refinarias de óleos provocando despejos
de hidrocarbonetos aromáticos policiclícos e compostos organosulfurados, e entre os
inorgânicos, os metais pesados (BRAILE, 1993).
O setor petroquímico produz efluentes com substâncias poluentes de
composição extremamente variável, tais como o dibenzotiofeno (DBT), que afeta a
saúde humana e aos ecossistemas em geral pelas suas características de toxicidade
e mutagenicidade (MARGESIN & SCHINNER, 1999; GIANFREDA & NANNIPIERI,
2001).
Em geral, os métodos de tratamento biológico para efluentes industriais
petroquímicos através de processos de biossorção e biodegradação os resíduos são
tratados através de uma rica população de microrganismos autóctones ou não, que
sobrevivem às condições adversas (MINO et al., 1994).
Atualmente, os efeitos causados pelos compostos sulfurados como DBT
(dibenzotiofeno) entre outros, encontrados normalmente no carvão vegetal, óleo
diesel e alguns lubrificantes, juntamente com íons metálicos, são considerados
tóxicos ao homem e aos animais em níveis elevados. Os órgãos de defesa ambiental
(IBAMA, CONAMA e Secretarias Ambientais – Estaduais e Municipais) buscam
regulamentar ou atenuar o uso de compostos que causam impactos, através do
emprego de legislações rígidas. Dentre as leis ambientais, encontra-se a resolução
CONAMA nº20/1986, que estabelece critérios de lançamentos de resíduos em
corpos aquáticos; Ministério da Saúde – Resolução 518/2004, que se refere à
qualidade para consumo humano, como também indica quais parâmetros são
necessários para avaliar a capacidade de um corpo receptor tem de autodepurar os
contaminantes nele lançados.
O uso de microrganismos no tratamento biológico de águas contaminadas
vem promovendo importantes mudanças nos processos tecnológicos de tratamentos
como sorção, acumulação e remediação, pois se mostram excelentes nestas ações,
possibilitando a retirada de substâncias consideradas tóxicas encontradas nos
rejeitos de atividades industriais do petróleo.
Considerando a escassez de água de boa qualidade que pode ser destinada ao
consumo humano, e o racionamento previsto para este milênio, estudos sobre
biorremediação devem ser realizados visando sua aplicação futura no tratamento
biológico de águas residuárias, em especial efluentes petroquímicos, criando
perspectivas de reutilização.
Procura-se, no contexto de sustentabilidade, a alternativa de tratar
biologicamente os resíduos sem alterar o meio ambiente, retirando dele as
substâncias recalcitrantes geradas pelas atividades antrópicas que formam resíduos
como os organosulfurados e íons de metais pesados, encontrados em efluentes de
indústrias petroquímicas e refinarias de óleo. Assim, torna-se importante o
isolamento, a identificação e a caracterização de novos microrganismos isolados de
ecossistemas impactados, tendo em vista o processo de adaptação às condições de
estresse e a possibilidade de apresentar propriedades degradativas diferenciadas.
Portanto, o presente trabalho foi desenvolvido visando atender aos seguintes
objetivos descritos na forma de artigos:
a) Identificar e caracterizar morfofisiológica e bioquímica das amostras de
bactérias da família Bacillaceae isoladas de solo do Porto do Recife,
contaminado por petróleo, de efluente e lodo de indústria têxtil;
b) Investigar a influência de cloreto de sódio e cobre na produção de biomassa
e biossurfactantes por uma nova amostra de Geobacillus stearothermophilus
UCP 986;
c) Realizar
a produção e caracterização de biossurfactantes por uma nova
amostra de Geobacillus stearothermophilus UCP 986;
d) Investigar a degradação de Dibenzotiofeno - DBT por uma nova amostra de
Geobacillus stearothermophilus UCP 986.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Considerações Gerais: Bacillus e Geobacillus
Bacillus é um gênero bacteriano gram-positivo, considerado ubíquo na
natureza (solo, água, ar e até na “poeira” de ossos em decomposição), e algumas
espécies são “naturais” da biota intestinal humana. Sua característica marcante é a
capacidade de formar endosporos em condições de estresse ambiental. Apenas dois
de seus representantes são considerados patogênicos à espécie humana, Bacillus
anthracis e Bacillus cereus, e os demais, são denominados sapróbios inofensivos
(MYRVIK & WEISER, 1988; LOGAN & DeVOS, 1998).
Os representantes do gênero Bacillus apresentam características fisiológicas
abrangentes, pois há espécies de caráter mesofílico, termofilico facultativos, ou
obrigatório e termófilos extremos, psicrófilos, acidófilas, halófilas, ou seja,
organismos capazes de crescer em condições extremas de temperatura, pH e
salinidade. Normalmente, a maioria dos representantes é mesofílicos, embora
existam espécies termofílicas, cujas características têm sofrido alterações conforme
o ambiente no qual tenha sido isolado, e devido a este fato, o gênero Bacillus está
dividido mais recentemente em Geobacillus (LOGAN & De VOS, 1998; MARCHANT
et al., 2003).
Apresentam-se
como
bastonetes
gram-positivos
ou
gram
variáveis,
formadores de endosporos. Em suas culturas, apresenta-se com longas cadeias com
endósporos centrais. Sua parede celular é formada por um polipeptídio constituído
pelo ácido D-glutâmico, que tem características antifagocíticas, que muitos estudos
consideram uma das principais chaves de sua virulência (MYRVIK & WEISER,
1988).
Contudo, uma das principais distinções entre os membros da família
Bacillaceae é a produção de catalase que distingue as espécies de Bacillus dos
demais. Muitas espécies formam ácido em meios com carboidratos e algumas como
B. macerans e B. polymixia, produzem também gás. Em geral, fermentam os
açúcares glicose, maltose e sacarose e raramente a lactose. Secretam enzimas
proteolíticas e hidrolisam a caseína e gelatina; algumas espécies produzem
hemolisinas e reduzem nitrato. Todas as espécies, exceto B.anthracis, são móveis.
Na grande maioria, as espécies são aeróbias, produzem enzimas como a
catalase e a superóxido dismutase, crescem em meios sintéticos que contenham
açúcares, ácidos orgânicos e álcoois como fonte de carbono e amônia como fonte de
nitrogênio e poucos isolados precisam de suplementação com vitaminas (TORTORA
et al., 2003). Outra característica extracelular, como a produção de enzimas
hidrolíticas que quebram polissacarídeos, ácidos nucléicos e lipídeos, permitem que
estes organismos utilizem os produtos da degradação como fonte de energia (LOGAN
& TURNBULL, 1998).
O uso dos microrganismos termofilicos do gênero Bacillus apresenta-se
importante nos processos de biorremediação de resíduos industriais, pelo potencial
biotecnológico de degradação de substâncias recalcitrantes.
2.2. Surfactantes
A poluição ambiental por derivados do petróleo é um problema de escala
mundial, pois a cada ano aumenta a quantidade de resíduos oleosos emitidos pelas
indústrias. Com isso, cresce o estímulo aos estudos de aplicação de microrganismos
no tratamento destes resíduos de forma que não altere a qualidade de vida da
população, que está intrinsecamente ligada à qualidade ambiental (VANCEHARROP et al, 2004; URUM et al., 2004).
Os surfactantes constituem uma classe importante de compostos químicos
amplamente utilizados em diversos setores industriais, tais como farmacêuticos,
cosméticos e alimentícios, entre outros. Suas inúmeras aplicações em diversos
setores industriais envolvem desde a ação de detergência à solubilização e dispersão
de fases. Grande parte dos surfactantes comercialmente disponível é sintetizada a
partir de derivados do petróleo (NITSCHKE & PASTORE, 2002).
Os surfactantes são substâncias anfipáticas que tendem a se localizar
preferencialmente na interface entre fases fluidas, tais como interfases óleo-água ou
gás-água, formando um filme molecular que reduz a tensão interfacial, sendo
responsável pelas propriedades singulares das moléculas surfactantes (BANAT,
1995; SARUBBO, 1997; SARUBBO et al., 2001).
Os compostos de origem microbiana, denominados biossurfactantes, são
produtos metabólicos de bactérias, fungos filamentosos e leveduras e exibem
propriedades surfactantes com alta capacidade emulsificante e redução da tensão
superficial (SOO et al., 2004). Os biossurfactantes possuem a capacidade de
emulsificar e dispersar os hidrocarbonetos em água, tornando-os disponíveis e com
isso
retirá-los
do
ambiente
“naturalmente”,
através
de
processos
como
mineralização e solubilização (MARCHESI et al., 1994; CHUN et al., 2002).
Em geral, os biossurfactantes têm aplicações diversas: terapêuticas, ao
produzir ação inibitória no crescimento do vírus do HIV em leucócitos; na
agricultura, ao promover e facilitar a homogeneização de fertilizantes no solo; na
indústria de cosméticos, produzindo ação umectante; na indústria alimentícia, no
fabrico de emulsificantes, entre outras aplicações (BANAT, 1995; SARUBBO, 1997,
NITSCHKE & PASTORE, 2002, 2004).
Os
biossurfactantes
apresentam
diversas
vantagens
em
relação
aos
surfactantes sintéticos e podem ser utilizados em uma gama de aplicações
industriais, porém ainda não são utilizados em larga escala devido aos custos de
sua produção (SARUBBO, 1997; RON & ROSENBERG, 2001), apesar de serem
produzidos a partir de recursos renováveis e apresentarem baixos custos de
produção, como também baixa toxicidade (URUM et al., 2004).
Os surfactantes produzidos por microrganismos apresentam vantagens sobre
os sintéticos, como alta bioavaliabilidade, boa biodegradabilidade, produção a partir
de substratos renováveis e estabilidade (LIN et al., 1998). Diversos microrganismos
são estudados na produção de agentes biosurfactantes; entre eles encontram-se
bactérias
como:
Arthrobacter
sp.,
Pseudomonas
aeruginosa,
Acinetobacter
calcoaceticus, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis; entre as leveduras estão:
Candida lipolytica, Candida tropicalis, Torulopsis bombicola, entre tantos outros
capazes de produzir diferentes tipos de bioemulsificantes (DESAI & BANAT, 1997,
HUA et al., 2003).
Com a globalização da indústria e a necessidade de sustentabilidade
ambiental, em que se busca tratar praticamente todos os resíduos gerados nas
atividades antrópicas, vê-se que, nesse contexto, a biotecnologia apresenta um
desafio, que é oferecer soluções viáveis para sanar os problemas ambientais gerados
pelos
grandes
Relacionados
complexos industriais, entre
ao
tratamento
desses
tipos
eles
de
a indústria petroquímica.
despejos,
os
processos
de
biorremediação e biorremoção como tecnologias inovadoras apresentam resultados
satisfatórios na remoção dos compostos derivados do petróleo na sua maioria
recalcitrante, como os hidrocarbonetos aromáticos policiclícos – HAP, metais
pesados, entre outros poluentes hidrofóbicos (RAHMAN et al., 2003; HUA et al,
2003; QUEIROGA et al., 2003).
Os biossurfactantes são produzidos com uso de diversos substratos,
incluindo açúcares, óleos, alcanos e resíduos da indústria de margarina, petróleo,
etc. São agrupados como: glicolipídeos, lipopetídeos, fosfolipídeos, ácidos graxos,
lipídeos neutros, poliméricos e compostos particulados. Muitos desses compostos
são aniônicos ou neutros e alguns são catiônicos, quando apresentam grupamento
amino (MULLIGAN, 2004).
2.2.1 Estrutura e origem microbiológica
Os biossurfactantes são classificados principalmente por sua composição química,
como apresentado na Figura 1. Observa-se, uma porção hidrofílica, constituída de
aminoácidos ou peptídeos (mono, di ou polipeptídios), e uma porção hidrofóbica de
ácidos graxos (saturados ou insaturados).
Figura 1: Estrutura de um surfactante (Fonte: http: //virtuallaboratory. net).
Os biossurfactante são produzidos por uma gama de microrganismos,
distribuídos por uma variedade de gêneros (Tabela 1) e estes podem utilizar uma
grande diversidade de substratos, desde hidrocarbonetos até substratos solúveis
(DESAI & BANAT, 1997; HEALY et al., 1996; BORDAS & LaFRANCE, 2001;
SARUBBO et al., 2001; YOUSSEF et al., 2004; AKSU, 2004; VANCE-HARROP et al,
2004 ).
Tabela 1: Principais biossurfactantes e sua origem microbiológica.
Biossurfactantes
Glicolipídeos
Rhamnolipídeos
Trealolipídeos
Lipídeos sulfurosos
Microrganismos
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas sp.
Rhodococcus erythropolis
Nocardia erythropolis
Torulopsis bombicola
T.apicola
Lipopeptídeos e lipoproteínas
Peptídeo – lipídeo
Viscosina
Surfactina
Subtilisina
Polimixina
Ácidos graxos, lipídeos neutros e
fosfolipídeos.
Bacillus licheniformis
Pseudomonas fluorescens
Bacillus subtilis
Bacillus subtilis
B.polymyxa
Ácidos graxos
Lipídeo neutros
Fosfolipídeo
Biosurfactante poliméricos
Corynebacterium lepus
Nocardia erythropolis
Thiobacillus thiooxidans
Emulsan
Biodispersan
Proteína-manana-lipídeo
Liposan
Proteína PA
Acinetobacter calcoaceticus
A.calcoaceticus
Candida tropicalis
Candida lipolytica
Pseudomonas aeruginosa
Fonte: Desai & Banat, 1997.
2.2.2. Aplicações dos biossurfactantes
Na era da globalização das indústrias, muitas delas consideradas clássicas
estão sendo modernizadas e redirecionadas para novas tecnologias, tendo um
grande desafio, gerenciar o emprego de pesquisas sem alterar a produtividade.
Segundo Banat et al. (2000), os rápidos desenvolvimentos na biotecnologia e o
aumento da consciência ambiental entre os produtores e consumidores, estão
colocando os produtos biológicos na preferência de mercado.
O maior mercado para os biossurfactantes é a indústria petrolífera, onde são
utilizados tanto para produção do petróleo quantos para a incorporação em
formulações do óleo lubrificantes (COBEÑAS et al., 1998; BORDAS & LaFRANCE,
2001).Também são aplicados em tratamentos como biorremediação e dispersão no
derramamento de óleos, remoção e mobilização de resíduos de óleo em tanques de
estocagem, e a recuperação melhorada de petróleo (MEOR) (VAN HAMME et al.,
2003; MULIGAN, 2004; NITSCHKE & PASTORE, 2004).
Outras aplicações dos biossurfactantes encontram-se na agricultura, quando
são utilizados em formulações de herbicidas e pesticidas (LIN et al, 1998); na
indústria farmacêutica na inibição da formação de coágulos, na atividade
antibacteriana e antifúngica, na atividade antiviral e antitumoral (NITSCHKE &
PASTORE, 2002a; 2004b; VANCE-HARROP, 2004); além do emprego na indústria
de papel, têxtil e cerâmica (BANAT et al., 2000).
Ainda que as excelentes propriedades físico-químicas, como redução da
tensão superficial e atividades de emulsificação, indiquem um potencial industrial
elevado dos biossurfactantes, seus custos de produção mostram-se ainda altos,
quando comparados aos produtos sintéticos, sendo necessário maior incentivo para
o estabelecimento de produtos mais viáveis economicamente.
2.3 Petróleo e derivados
2.3.1 Origem e caracterização do petróleo
O petróleo é composto de hidrocarbonetos em seus três estados e
considerado a principal fonte de energia mundial. Contém também pequenas
quantidades de compostos de enxofre, oxigênio, nitrogênio. Na antiguidade, era
usado para fins medicinais ou para lubrificação, sendo conhecido com os nomes de
óleo de pedra, óleo mineral e óleo de nafta. Atribuíam-se ao petróleo propriedades
laxantes, cicatrizantes e anti-sépticas. Os resíduos orgânicos, de bactérias, de
produtos nitrogenados e sulfurados no petróleo indicam que ele é o resultado de
uma transformação da matéria orgânica acumulada por milhões de anos nas
profundezas dos oceanos, dos mares e de solos, sob pressão das camadas de
sedimentos que foram se depositando e formando rochas sedimentares (AECIPE,
2002).
O conjunto dos produtos provenientes desta degradação, hidrocarbonetos e
compostos voláteis, misturados aos sedimentos e aos resíduos orgânicos, está
contido na rocha-mãe; a partir daí o petróleo é expulso sob efeito da compactação
provocada pela sedimentação, migrando para impregnar areias ou rochas mais
porosas e mais permeáveis, tais como arenitos ou calcários (SACCHETTA, 2003).
Os produtos derivados do petróleo como os gases (metano, etano, propano e
butano) apresentam importância pelo seu emprego como fontes de energia na
sociedade atual. A gasolina, o querosene, o diesel, os óleos, as graxas e as ceras, os
lubrificantes, sem deixar de comentar o asfalto, o produto final do processo de
refino, aplica-se em inúmeros processos de desenvolvimento atual (SACCHETTA,
2003). Todos este produtos, de alguma forma contribuem para a economia mundial
maciçamente.
2.3.2- Processo de refino
O processo (Figura 2) começa pela dessalinização do petróleo bruto em que
são eliminados os sais minerais, depois, o óleo é aquecido a 320° C em fornos de
fogo direto, passando para as unidades de fracionamento, onde podem ocorrer até
três etapas. A etapa principal do refino é realizada em uma coluna atmosférica os
petróleos aquecidos, introduzidos na parte inferior da coluna junto com vapor de
água para facilitar a destilação. Desta coluna, surgem às frações ou extrações
laterais, que serão transformadas até a obtenção dos produtos finais desejados.
Uma série de produtos é obtida, tendo em vista as necessidades dos consumidores
como carburantes gasolinas especiais, combustíveis e produtos diversos (PEREIRA
JUNIOR & LOUVISSE, 2000).
Figura 2: Processo de refino do petróleo (Fonte: www.petrobras.com.br/ petróleo/ refino).
2.3.3 - Compostos organosulfurados
Os compostos organosulfurados são encontrados nos combustíveis como óleo
diesel, gás de cozinha, gasolina e alguns lubrificantes de motores, que apresentam
uma certa quantidade de enxofre. Nos dias atuais, seu uso está sendo controlado
pelos órgãos de defesa ambiental de diversos países desenvolvidos.
Os compostos orgânicos que apresentam enxofre nos combustíveis fósseis
formam uma fração embora pequena, muito importante devido a sua baixa
degradabilidade. O petróleo bruto possui entre 0,04 a 5% de enxofre, e, quanto mais
denso maior é esta fração (KROPP et al., 1997). Na Europa, nos Estados Unidos e
Japão, o nível de enxofre permitido nos combustíveis é de cerca de 15 ppm (mg S.l-1
óleo) e foi estabelecido somente até os próximos anos (meados de 2005). A partir de
então, devem diminuir suas concentrações com a finalidade de minimizar a poluição
do ar, do solo e da água e os danos causados pela chuva ácida (FURUYA et al.
2003).
No Brasil, a legislação ambiental que é rica em regulamentações quanto à
disposição e tratamento de resíduos recalcitrantes, busca implementar leis que
visem sanar possíveis transtornos, que possam ocorrer caso não haja um controle
rígido dos resíduos gerados na queima dos combustíveis fosséis, principalmente os
produtos que contaminam o ar, o solo e água. Para cada ecossistema avaliado há
em vigência, uma gama de regulamentações no manejo destes, que buscam não
atrapalhar o desenvolvimento sócio-econômico do país e sim, buscar desenvolver
sem causar sérios danos ao meio ambiente. Entretanto, os constantes esforços da
população científica buscam alternativas de combustíveis e produtos menos
impactantes ao meio ambiente, tais como o biodiesel, e métodos de tratamento de
baixo custo e alta eficiência.
2.4 - Tratamento de Efluentes
Na natureza, a matéria orgânica é convertida em produtos mineralizados por
mecanismos naturais físicos de sedimentação, químicos de adsorção, transformação
e
precipitação,
e
biológicos
de
transformação,
adsorção
e
assimilação,
caracterizando o chamado fenômeno da autodepuração, que geralmente é demorado
e incontrolável (Von SPERLING, 1996).
Os processos de tratamento dos efluentes petroquímicos podem ser: físicos,
químicos e biológicos. Os métodos físicos mais utilizados são flotação, separação por
gravidade, adsorção e extração, correspondendo à retirada de material sólido do
efluente final. Os métodos químicos mais comuns são neutralização, coagulação
seguida de precipitação, oxidação e combustão (Van HAANDEL & MARAIS, 1999).
Os efluentes não tratados acumulam-se e produzem resíduos que causam
problemas ambientais de ordens econômicas, sociais, de saúde pública e até de
interesse político. Em geral, os efluentes contêm nutrientes que podem estimular o
crescimento desenfreado de plantas aquáticas, algas e cianobactérias, quando estes
são lançados em lagos, açudes, rios, mares etc; causam o desequilíbrio desses
corpos de água, além do que, podem apresentar composição extremamente tóxica,
como os hidrocarbonetos encontrados em resíduos petroquímicos, têxteis, os quais
são de difícil decomposição (METCALF & EDDY, 1991).
Um dos métodos mais usados no tratamento de efluentes industriais é o de
Lodos Ativados, onde uma população microbiana diversificada age na degradação
dos compostos orgânicos em geral. O tratamento biológico de efluentes industriais
com culturas puras ou consorciadas apresenta uma alta eficiência na remoção dos
compostos químicos, desde que estas estejam adaptadas a esses compostos dentro
do sistema de lodos ativados, para que então possam ter um bom desempenho no
tratamento (GONZALEZ et al., 2001).
Segundo Ururahy et al. (1998) bactérias, leveduras e fungos filamentosos têm
sido citados na literatura como agentes transformadores eficazes, face a habilidade
em degradar ampla gama de substâncias orgânicas, comumente encontradas nos
efluentes das refinarias. Os contaminantes derivados do petróleo têm sido tratados
satisfatoriamente
sob
condições
anaeróbias,
condição
que
predomina
nos
tratamentos de compostos orgânicos e inorgânicos em refinarias e aqüíferos
contaminados
por
estes
compostos,
que
podem
ser
biotransformados
ou
bioimobilizados (COATES & ANDERSON, 2000).
Para Kambourova et al. (2003), o tratamento biológico apresenta diversas
vantagens, pois a mineralização promove a destruição permanente dos resíduos e
elimina os riscos de futuras contaminações, aumentando o nível de aceitação
pública. Além disto, os processos biológicos quando combinados a outros métodos,
tais como físicos – altas temperaturas, químicos e surfactantes, possibilitam o
aumento da eficiência total do tratamento (FEITKENHAUER et al., 2003).
A proteção do meio ambiente contra agentes poluidores de origem industrial é
um problema complexo para os países em desenvolvimento. Inicialmente, torna-se
necessário caracterizar as diferentes formas de contaminação do meio ambiente
causada pela atividade industrial, sem restringir o desenvolvimento socioeconômico
de um país, mantendo equilíbrio ambiental (CAIRNCROSS, 1992). Os efluentes
produzidos pela indústria podem ser classificados conforme o tipo de poluição, em
situações diferentes como: (1) poluição total, quando os corpos receptores são
afetados “diretamente” comprometendo a saúde da população, podendo ser
reduzida com a instalação de estações de tratamento de água e esgotos; (2)
poluições químicas, que se refere a um estágio da poluição insidiosa, causada pelo
despejo contínuo da água (ANDRADE NETO & CAMPOS, 2000).
Os
compostos
químicos
mais sofisticados encontrados nos efluentes
petroquímicos são os organofosforados, sulfurados, policlorados e bifenóis, que são
poucos detectáveis pelas baixíssimas concentrações em que ocorrem disfarçando
sua presença (BRAILE & CAVALCANTI, 1993).
Segundo Bitton (1994), os maiores contaminantes encontrados nos efluentes
industriais são orgânicos biodegradáveis (menor fração), compostos orgânicos
voláteis, orgânicos recalcitrantes, metais tóxicos considerados resistentes à
biorremediação,
além
de
nutrientes
como
nitrogênio
e
fósforo
e
alguns
microrganismos, patogênicos ou não patogênicos.
2.4.1. Efluentes Industriais Petroquímicos
A poluição por matéria orgânica cresce bastante desde o fim da Segunda
Guerra Mundial, que acelerou a expansão da indústria petroquímica. A maioria dos
despejos industriais é passível de tratamento biológico, desde que os mesmos visem
à redução da demanda bioquímica de oxigênio (DBO), do teor de sólidos totais (ST),
como também a concentração de nutrientes, gorduras e toxidez (PAVLOSTHATIS,
1994).
Os resíduos petroquímicos apresentam complexa mistura de compostos
divididos em quatro famílias: hidrocarbonetos alifáticos, cíclicos, aromáticos e
compostos que apresentam enxofre em sua estrutura, denominado genericamente
como organosulfurados (ALVES et al. 1999). Os compostos organosulfurados
representam uma pequena parcela nos efluentes de refinarias, que em geral
apresentam
grande
dimetilsulfoxido,
variedade
fenilsulfeto,
as
de
compostos
sulfonas,
etc).
recalcitrantes
Embora
em
(benzotiofeno,
quantidades
consideradas pequenas, são extremamente nocivos ao homem e ao ambiente, já que
sua presença pode causar irritação das mucosas, espasmos musculares e dos
brônquios, além de provocar corrosão nos equipamentos da refinaria e chuva ácida
(DENOME et al., 1993; ALVES et al., 1999).
Existe uma variedade de compostos orgânicos sulfurados que se encontram
na combustão do petróleo, entre eles, o dibenzotiofeno (DBT), um composto
recalcitrante encontrado nos destilados médios (óleo diesel, lubrificantes finos, etc),
e o estudo do seu tratamento tem sido considerado modelo no tratamento de
combustíveis fósseis (RHEE et al., 1998).
2.4.2- Tratamento biológico dos efluentes petroquímicos
Os processos biológicos de tratamento de efluentes petroquímicos são
considerados mais econômicos, embora sejam mais complexos que o tratamento de
efluentes domésticos ou de outras indústrias (BRAILE & CAVALCANTI, 1993).
Esses tratamentos reduzem o teor de matéria orgânica e melhoram a
aparência do resíduo. Neste tratamento, o tempo é um fator importante seguido do
tamanho da molécula a ser degradada. Observa-se que quanto menor a molécula,
mais suscetível à degradação biológica, fazendo com que a biodegradabilidade seja
mais rápida nos compostos alifáticos e cíclico-alifáticos do que nos compostos
aromáticos. Também a isomerização estrutural afeta a biodegradabilidade relativa
de muitas classes de substâncias (GROUDEVA et al., 1992).
2.4.3- Tratamento biológico de compostos organosulfurados
O tratamento convencional de alguns compostos organosulfurados dos
combustíveis fósseis como o dibenzotiofeno (DBT) (Figura 3), é feito através da
técnica de hidrodesulfurização, empregada nas refinarias, a qual requer emprego de
altas temperaturas e gastos elevados de energia, e assim o mesmo não remove
efetivamente os compostos sulfurados policiclícos (FOLSOM et al., 1999).
Figura 3: Dibenzotiofeno – DBT (Fonte: Kropp et al, 1997)
Os
compostos
sulfurados
inorgânicos
e
orgânicos
são
considerados
importantes aceptores e doadores de elétrons na respiração anaeróbia e aeróbia,
respectivamente (POSTGATE, 1979). Alguns microrganismos e principalmente
bactérias, possuem a capacidade de formar H2S quando em condições de
alcalinidade na presença de íons como NH4+, Mg2++ e PO4-3 , formando um
precipitado; possuem a habilidade de oxidar sulfito, sulfeto e tiosulfato na presença
de oxigênio, nitrato e nitrito, todos como aceptores de elétrons (MARINGOLO &
KIHARA, 2002; FUSELER et al., 1996).
Existem
três
vias
de
degradação
do
dibenzotiofeno,
realizadas
por
microrganismos gram-positivos: via de Kodama, via de Afferden e via do 4S (Figura
4); esta última tem sido considerada a mais simples de ocorrer com microrganismos
como os Bacillus, segundo Alves et al. (1999).
As vias metabólicas apresentam características importantes, tais como: na
Via de Kodama (A), o átomo de enxofre não é removido, apenas ocorre uma ruptura
das ligações C-C, no final os produtos formados são 3-hidroxi-2-formilobenzotiofeno e a permanência do núcleo tiofênico, onde facilita o ataque dos
microrganismos. Na Via de Van Afferden(B) o enxofre é removido na forma de íon
sulfito que é oxidado a sulfato por oxidação abiótica, que propicia a ruptura da
estrutura carbonada e desta forma o DBT é utilizado como nutriente pelo
microrganismo como fonte de carbono e enxofre. A terceira via metabólica, Via “4S”
ou via sulfóxido-sulfona-sulfonato-sulfato, trata-se de uma via que remove o átomo
de enxofre, onde o grupo tiofênico sofre um ataque oxidativo progressivo dos
microrganismos, como Rhodococcus sp. e Bacillus sp. (ALVES et al., 1999).
Os microrganismos capazes de degradar compostos sulfurados são diversos
quanto às suas características morfofisiológicas. Os representantes do gênero
Bacillus, são capazes de reduzir o enxofre elementar (Sº), tiosulfato, sulfeto entre
outros compostos sulfurados, devido a sua característica heterotrófica, mesmo que
a maioria seja anaeróbia estrita. Os gêneros Desulfonema e Desulfovibrio, vários
autores encontraram redutores de sulfato sob condições temporária de aerobiose na
interface oxi-anóxica de sedimentos (de até 5% de oxigênio), onde cresceriam
pobremente, caracterizando-se por apresentar mecanismos de redução das
concentrações deste, assim como respostas comportamentais para se proteger,
como migração, formação de agregados e de bandas na região mais anóxica do
gradiente oxi-anóxico do sedimento ou das condições artificiais de cultura (SASS et
al. 2002).
As bactérias redutoras de enxofre (SRB), constituem um grupo de procariotos
bastante diversificado, que contribui para a manutenção de processos essenciais no
ambiente, tais como os de regulação da ciclagem da matéria orgânica e até a
metilação do mercúrio (CASTRO et al., 2000).
.
Figura 4: Vias degradativas do Dibenzotiofeno - Via A: Via de Kodama; Via B: Via de
Afferden; - Via do 4 “S” (Fonte Alves et al. 1999).
2.4.4- Organismos extremófilos versus Tratamento biológico de efluentes
Existem microrganismos capazes de proliferar em ambientes variados
caracterizados por valores extremos de temperatura, salinidade e pH, que,
inicialmente, seriam considerados inviáveis ao seu desenvolvimento. A capacidade
de adaptação a estes ambientes extremos torna-os valiosos para o homem devido a
sua ampla aplicação biotecnológica no tratamento de resíduos gerados por
atividades antrópicas, principalmente industriais.
Extremófilos
são
microrganismos
que
se
desenvolvem em ambientes
adversos, e que têm despertado grandes interesses biotecnológicos, devido à
expressão de suas enzimas que possuem alta estabilidade termodinâmica e
mostram-se inativas em temperaturas amenas, como as mesofílicas (GIUFFRÈ et
al., 1999). As enzimas produzidas em condições de extremofilia ou termoestáveis
são versáteis e importantes para uma variedade de indústrias que apresentam
resíduos de sua atividade, compostos recalcitrantes, detergentes, indústria do
açúcar, petroquímica, entre outros (FUJIWARA, 2002).
Segundo Santos et al. (2002), a extremofilia não constitui uma característica
filogenética, embora alguns casos ocorram em ambos os domínios procariotos
(Bacteria e Archaea). Encontram-se, entre as Archaea, hipertermófilos (temperatura
ótima de crescimento superior a 100ºC) como também entre os halófilos,
Halobacteriaceae (ambientes com 5.2 M de NaCl) e as acidófilas, com maior
resistência a determinados ambientes (FUJIWARA, 2002; CECH et al.,1994).
2.4.5. - Organismos redutores de compostos sulfurados
Todos os organismos requerem enxofre para a síntese de proteína e cofatores
essenciais, podendo estes ser assimilados a partir de fontes inorgânicas como os
sulfatos e os tiosulfatos, ou de fontes orgânicas, como ésteres sulfatos e sulfonatos
(COPPÉE et al., 2001).
Segundo Tortora et al. (2003), algumas bactérias dos gêneros Pseudomonas,
Proteus, Campylobacter e Salmonella são capazes de reduzir o enxofre elementar
(S0),
bem
como
outros
compostos
sulfurados
como
tiosulfato,
sulfeto
e
dimetilsulfóxido, pois apresentam uma propriedade muito comum na variedade
heterotrófica, sendo geralmente aeróbias facultativas.
Microrganismos como as bactérias púrpuras não-sulfuradas, são incapazes
de oxidar o enxofre fundamental (S0), que é produzido na oxidação do sulfito e que
não é estocado no interior da célula bacteriana; estas bactérias apresentam
metabolismo fototrófico facultativo e são capazes de crescer aerobiamente no escuro
ou anaerobiamente na presença de luz. Entretanto, as bactérias púrpuras
sulfuradas são encontradas em zonas anaeróbias ou em fontes de enxofre no
ambiente, crescendo em pH elevados, utilizando piruvato e acetato na degradação
(MELO & AZEVEDO, 1997).
Há arqueobactérias dependentes de enxofre, que são termófilas acidofílicas,
anaeróbias obrigatórias, que reduzem o enxofre fundamental (S0) a sulfeto de
hidrogênio (H2S) usando elétrons a partir da oxidação de compostos orgânicos ou
inorgânicos. Os gêneros Thermococcus e Thermoproteus são heterotróficos, oxidam
uma variedade de compostos orgânicos, em particular pequenos peptídeos, glicose e
amido anaerobiamente em presença de enxofre como aceptor de elétrons. O gênero
Sulfolobus
é
anaeróbio
e
heterótrofo
e
pode
ser
extremamente
termófilo
(MARINGOLO & KIHARA, 2002; BADE et al., 2000).
O enxofre é relativamente abundante no ambiente, e a água do mar é
considerada um grande reservatório de sulfato, além de outros materiais como os
combustíveis fósseis e a matéria orgânica. As transformações que ocorrem com o
enxofre dependem da atmosfera que predomina no ambiente, no caso da
mineralização do enxofre orgânico; este processo é realizado pela ação de
microrganismos em condições de aerobiose ou anaerobiose (BITTON, 1994).
O processo de oxidação biológica e redução de compostos sulfurados na
biosfera estão relacionado com a mobilização e imobilização de metais nos ciclos
biogeoquímicos. Bactérias capazes de oxidar enxofre, em geral o utilizam como fonte
de energia para o desenvolvimento quimiolitotrófico, produzindo sulfato de metal
solúvel e ácido sulfúrico (WHITE et al., 1998).
Bacillus subtilis e alguns microrganismos gram-positivos (Rhodococcus sp.,
Corynebacterium sp. etc), possuem a capacidade de oxidar compostos sulfurados,
tornando-os aceptores finais ou simplesmente doadores de elétrons, assim como as
demais redutoras de enxofre, que podem reduzir ou formar sulfatos em ambas
condições com e sem oxigênio, consideradas bactérias redutoras de enxofre (SRB).
Os produtos finais em ambientes anaeróbios são sulfato, sulfito e sulfeto em
ambientes aeróbios, quando a temperatura considerada ótima para que ocorra este
processo esteja na faixa de 40ºC - 52ºC (SASS et al. 2001; SPINNLER et al., 2001).
Cepas acidofílicas e autotróficas mostram-se capazes de promover a oxidação
anaeróbia do enxofre junto com a redução do íon Fe (III), evidenciando seu potencial
na ciclagem do enxofre no ambiente (KUSEL et al. 2001).
Os estudos biotecnológicos têm feito grandes esforços em aumentar a
habilidade
dos
gêneros,
Rhodococcus,
Corynebacterium,
Mycobacterium,
Desulfovibrio, Paenibacillus, Sphingomonas, na degradação de alguns compostos
sulfurados que ocorre apenas em temperaturas elevadas, contudo, os gêneros
citados apenas degradam em ambientes mesofílicos (DONALD & SOUTHAM, 1999).
A biodesulfurização de derivados do petróleo ou substâncias que apresentem
enxofre em sua composição é mais vantajosa em altas temperaturas, não sendo
necessário o emprego de um segundo tratamento, como a hidrodesulfurização, que
utilizam
produtos
químicos
e
promovem
a
catálise
dos
organosulfurados
heterocíclicos na presença de metais (ODA & OHTA, 2002; GUEDES et al., 2001).
Linhagens bacterianas classificadas como acidófilas e autotróficas promovem
a oxidação anaeróbia do enxofre e a redução do íon Fe (III), sendo consideradas
importantes na ciclagem do enxofre no ambiente. KUSEL et al, (2001), destacam
que em condições ambientais de pH neutro, a oxidação anaeróbia do enxofre é
mediada, principalmente, por bactérias quimiolitotróficas, de forma que o pH
decresce, atingindo uma faixa de 2 – 3, ocorrendo redução de produção primária no
ambiente. Contudo, esta transformação pode ser neutralizada pela ação de
microrganismos que utilizam o Fe (III) e o sulfato como aceptores elétrons, formando
um precipitado ou sedimento (VERMEIJ & KERTESZ, 1999). A desulfurização do
enxofre por ação de microrganismos, principalmente bactérias, transforma o sulfito
em enxofre livre (S0), consumindo como nutriente essencial e convencional,
oxidando HCO3 e matéria orgânica em C e CO2 no período de 120h (AWADALLAH et
al. 1998).
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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1º ARTIGO
Identificação e caracterização morfofisiológica e bioquímica de amostras de
bactérias da família Bacillaceae
Manuscrito submetido para publicação ao:
Brazillian Journal of Microbiology
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MORFOFISIOLÓGICA E BIOQUÍMICA DE
AMOSTRAS DE BACTÉRIAS DA FAMÍLIA BACILLACEAE
Mabel Calina de França Paz
1,4
; Ricardo Kenji Shiosaki4, Beatriz Susana Ovruski de
Ceballos 2; Galba Maria de Campos-Takaki
1
2
3,4*
Aluna do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – CCB/ UFPE;
Universidade Federal de Campina Grande - AESA/UFCG;
3
Departamento de Química -
4
Universidade Católica de Pernambuco - UNICAP; Núcleo de Pesquisa em Ciências
Ambientais – NPCIAMB – PE Recife, PE, Brasil.
Resumo
Neste trabalho foram identificadas amostras de bactérias da família Bacillaceae
isoladas do solo do Porto do Recife, de uma área contaminada por petróleo; de
efluente e lodo de indústria têxtil. As amostras foram avaliadas quanto às
características morfofisiológicas e bioquímicas através de crescimento em
diferentes temperaturas e concentração de cloreto de sódio, produção de amilase,
redução do nitrato a nitrito, oxidase, utilização do citrato, sensibilidade a
antibióticos, fermentação de açucares, motilidade, posição de endosporos,
hemólise, Gram e catalase. Das amostras identificadas vinte e seis são da espécie
Bacillus licheniformis, sendo 14 consideradas termofílicas facultativas com
crescimento
a
50ºC,
5
com
identificadas
como
termofílicas
moderado,
crescimento a 55ºC e 4 amostras termofílicas com crescimento a 60ºC, com
capacidade de sobrevivência em condições moderadas de salinidade; e duas
amostras pertencem à espécie Geobacillus stearothermophilus termofilico (60ºC), e
halofílico, cresce a 10 % de NaCl.
*Corresponding author: Profa. Dra. Galba Maria de Campos-Takaki, Departamento de
Química, Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais, Universidade Católica de
Pernambuco. Rua Nunes Machado, 42, Boa Vista. 500050-590, Recife-PE, Brasil, E-mail:
[email protected]
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
1. Introdução
A família Bacillaceae está constituída por uma diversidade de microrganismos
formadores de esporos, destacando-se o gênero Bacillus, considerado ubíquo na
natureza e caracterizado como formado por microrganismos aeróbios que
hidrolisam gelatina formando colônias do tipo rizóide, sendo distinguido de
Clostridium pela utilização do oxigênio e pela localização dos esporos (26).
O gênero Bacillus, de acordo com a temperatura de crescimento e alterações
ambientais, encontra-se constituído por representantes mesofílicos e termofilicos,
que se apresentam como bastonetes Gram-positivos ou variáveis e formam
endosporos que podem estar localizados na posição central, terminal e subterminal. A parede celular é constituída por peptideoglicano com características
antifagocitárias, que muitos estudos consideram uma das principais chaves de
sua virulência (17).
A
família
Bacillaceae
Alicyclobacillus;
Gracilibacillus;
está
Paenibacillus;
Ureibacillus;
e
constituída
Brevibacillus;
mais
por
gêneros
Salibacillus;
recentemente,
como
Bacillus,
Aneurinibacillus;
Geobacillus.
O
gênero
Geobacillus apresenta características de microrganismos extremófilos com
temperatura ótima de crescimento em torno de 60ºC, aeróbios ou anaeróbios
facultativos,
podendo
ser
encontrado
em
ambientes
bem
diversificados,
apresentando grande potencial para o tratamento de ambientes contaminados
por resíduos recalcitrantes (16).
Os estudos taxonômicos sobre a família Bacillaceae, seus gêneros e espécies
têm evoluído nos últimos anos com o aparecimento das técnicas moleculares
(RNA ribossomal 16S); contudo, sua completa identificação ainda é considerada
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
difícil, sendo necessário o emprego de marcadores bioquímicos, moleculares,
como métodos auxiliares à taxonomia morfológica (7).
Neste trabalho foram realizadas a identificação, caracterização morfofisiológica
e avaliação do potencial biotecnológico de amostras de microrganismos da família
Bacillaceae, isoladas de solo contaminado por petróleo, de efluente e lodo de
indústria têxtil.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
2- Material e Métodos
Microrganismos: foram utilizadas amostras de bactérias da família Bacillaceae
isoladas de solo do Porto do Recife contaminado por resíduos de petróleo; de
efluente e lodo de indústria têxtil. Os microrganismos encontram-se depositados
no Banco de Culturas do Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais NPCIAMB
– UNICAP - PE, identificados e codificados (UCP), como apresentado nas tabelas,
sendo mantidos em Ágar nutriente a 5ºC.
Características morfofisiológicas e bioquímicas:
Foram analisadas as seguintes características morfofisiológicas e bioquímicas das
amostras estudadas: crescimento em diferentes temperaturas e concentrações de
cloreto de sódio; posição dos endosporos; hemólise, coloração de Gram,
motilidade, catalase, oxidase, fermentação de açúcares (galactose, maltose,
manose, glicose, sacarose e lactose), antibiograma, utilização de nitrato e citrato,
produção de amilase.
Crescimento em diferentes temperaturas: as amostras foram repicadas para meio
liquido BHI (Brain Heart Infusion)- BIOBRAS® e colocadas para crescer a 50ºC,
55ºC e 60ºC, por um período de 24 horas. A avaliação do crescimento foi
realizada através da absorbância (D.O600).
Crescimento em diferentes concentrações de cloreto de sódio
microrganismos
foram
repicados
para
Caldo
Nutritivo
com
(NaCl): os
diferentes
concentrações de sal (7% e 10%) por um período de 72 horas a 37ºC.
Avaliação da posição dos endosporos: as amostras foram incubadas em Ágar
Nutriente contendo sulfato de manganês (5 mg/L) a 37ºC por 24 horas e depois
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
mantidas a temperatura ambiente (28 ± 2ºC), por um período de 15 (quinze) dias.
Em seguida foram feitas lâminas coradas com verde malaquita (7,18), para
observação da posição dos endosporos em microscopia de luz (aumento de 100X).
Teste de hemólise: a atividade hemolítica foi observada pelo crescimento das
amostras em placas de Petri contendo Agar sangue, incubadas a 37ºC por 24
horas. A presença de halo ao redor da colônia indicava reação positiva.
Produção de amilase: foi realizado em placas de Petri contendo Agar nutriente
adicionado de 2% de amido solúvel, semeada no centro da placa, e incubadas a
37ºC por 24 horas. Após o crescimento, a atividade amilásica foi observada ao
adicionar uma solução de iodo a 1%, para revelação do halo, o qual foi medido em
sentidos diametralmente opostos com auxílio de uma régua milimétrica.
Utilização de citrato: foi determinada através da utilização do meio Citrato
Simmons Agar em tubos inclinados, incubados a 37ºC por 24 horas. A reação
positiva foi detectada pela mudança de cor do meio de verde para azul, onde se
verifica a utilização do citrato como única fonte de carbono pelo microrganismo,
segundo (3,15).
Redução do nitrato: foi realizado utilizando o meio MN onde as amostras foram
inoculadas em tubos inclinados e após 24 horas a 30ºC, adicionou-se 0,1 ml de
cada reagente, reagente A (ácido sulfanílico) e B (ácido Laurent), quando o meio
se torna vermelho indica reação positiva (3, 7, 16).
Prova da catalase: foi executada utilizando uma suspensão bacteriana (2ml) com
turbidez entre 0.8 – 1.0 (D.O
600)
e peróxido de hidrogênio (H2O2) a 20%(m/v),
como reagente (3,18). A reação foi considerada positiva pela presença de bolhas,
que indicam a liberação de O2.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Motilidade: foi verificada com uso do meio MN em tubos pequenos com o meio
inclinado, sendo as amostras inoculadas no centro da superfície do meio para
verificação da formação do halo nessa superfície e que indica motilidade dos
microrganismos, após incubação por 24 horas a 30ºC (7,18).
Testes de fermentação dos açúcares: foram realizados com uso de um meio
básico, em tubos inclinados, suplementado de uma solução estéril a 1% de cada
açúcar investigado, num volume total de 5 ml por tubo, incubados por um
período de 24 horas a 37ºC (3,18). A reação foi considerada positiva quando
ocorria acidificação do meio, e, por conseguinte, turbidez e alteração na
coloração. Os açúcares estudados foram: galactose, maltose, manose, glicose,
sacarose e lactose.
Teste de oxidase: foram utilizados discos de oxidase da SENSOBIODISC/CECON®
em tubos de ensaio pequenos contendo 2 ml de solução salina esterilizada mais
500µL da suspensão bacteriana com leitura de 0.8 a 1.0 (D.O600) de cada amostra
em estudo com visualização imediata da reação, através do aparecimento da cor
rosa, que indica oxidase positiva.
Antibiograma: utiliza Agar Mueller-Hinton em placas de Petri com discos de
antibióticos e incubação a 37ºC por 24 horas (21). A suspensão das amostras
inoculada no Agar tinha D.O (600) de 08.-1.0. Os discos de antibióticos empregados
foram da LABTEST®, sendo eles: cloranfenicol, eritromicina, kanamicina,
estreptomicina, gentamicina e ampicilina. Os halos de inibição do crescimento no
Ágar medidos com auxílio de um halômetro, indicando o nível de sensibilidade
/resistência de cada amostra estudada.
Análise de Cluster: foi realizada através do software SPSS, versão 11.0; pelo
método de Linkagem Média entre os grupo estudados.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
3. Resultados e Discussão:
i) Características morfofisiológicas e bioquímicas:
Foram
estudadas
28
amostras
de
bactérias,
que
demonstraram
características pertencentes à família Bacillaceae, sendo identificados dois
gêneros:
Bacillus e
representados
Geobacillus,
pelas
espécies,
como
descritos
Bacillus
nas
tabelas
licheniformis
1-3.
e
Estes
Geobacillus
stearothermophilus, apresentando características semelhantes devido ao tipo de
ambiente, principalmente, o
desenvolvimento
na presença de
compostos
recalcitrantes, demonstrando habilidade de crescer em temperaturas elevadas
(50ºC a 60ºC). Quanto à temperatura de crescimento, as amostras foram
classificadas em termofilico facultativo, moderado e termofilico, segundo a
literatura (1, 5,24) (Tabelas 1-3).
A temperatura é um fator de grande influência sobre o crescimento
bacteriano
quando associado
à velocidade
das
reações
metabólicas
dos
microrganismos. Isso se deve ao fato de que tais reações são catalisadas por
enzimas específicas e desta forma, aumentam ou diminuem a atividade
enzimática
de
acordo
com
a
temperatura.
Os
procariotos
considerados
termofílicos (moderados ou extremos), em geral, são isolados de ambientes
quentes ou com grande variação térmica, apresentam grande potencial no
tratamento de compostos de difícil decomposição, como os hidrocarbonetos
encontrados no petróleo e em seus resíduos que contaminam os ecossistemas
aquáticos e terrestres (8, 29).
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
O gênero Geobacillus está dividido em grupos filogenéticos a partir da
informação da seqüência do RNA ribossomal 16S (4, 5, 13, 15). Geobacillus
stearothermophilus, pertence à nova classificação dos microrganismos da família
Bacillaceae (16,3), como espécie termofilica ou termotolerante. Encontram-se
inseridas neste gênero, após ter sido identificada fenotípica e filogeneticamente,
cinco espécies G. stearothermophilus, G. thermocatenulatus, G. thermoleovorans,
G. glicosidasius e G. thermodenitrificans; e mais recentemente foi agrupado o G.
caldoxylosilyticus (10, 11, 16).
As tabelas 4-6 apresentam os resultados da avaliação do crescimento em
diferentes níveis de concentrações de cloreto de sódio (7 e 10%), evidenciando a
característica de microrganismos extremófilos, por conseguirem sobreviver em
níveis elevados de salinidade. Com este resultado, as amostras analisadas foram
consideradas halotolerantes; entretanto, seu crescimento pode vir a ser
comprometido caso o meio torne-se hipertônico, fazendo com que suas células
provavelmente, se desidratem, ocorrendo morte celular (9, 19, 20). Nos testes de
salinidade, 80% das amostras de Bacillus licheniformis se desenvolveram até a
concentração mais elevada de cloreto de sódio (10%), após um período de
adaptação em caldo nutritivo na concentração mais baixa de cloreto de sódio
(7%). As demais, cerca de 20% das amostras, apresentaram perfil moderado de
resistência ao sal, sendo estes resultados apoiados por Pelczar et al. (20), que se
refere a esta habilidade como halotolerância.
Segundo Logan e Turnbull (15), Bacillus licheniformis pertence ao grupo do
Bacillus
subtilis,
onde
são
encontrados
microrganismos
mesofílicos,
termotolerantes e até termofilicos facultativo. Este microrganismo provoca
diversas doenças, tais como bacteremias e septicemias, abortos de ovinos e
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
bovinos, entre outros males em eucariotos. Os resultados obtidos com as
amostras estudadas indicaram que se trata de um microrganismo aeróbio,
formador de endosporos na posição terminal (Tabelas 1-3). Em geral, produzem
uma cápsula de polipeptídio (ácido poly-γ-D-glutâmico), que pode ser visualizada
quando corados com azul de metileno; são móveis, Gram-positivos ou variáveis, e
produzem antibióticos como a bacitracina, além de várias enzimas usadas na
indústria farmacêutica e no tratamento de resíduos industriais (30,31).
As bactérias do gênero Bacillus apresentam um elevado potencial
biotecnológico com relação à produção de enzimas como as proteases, entre
outras, que são utilizadas em escala industrial (19, 23). B. licheniformis, B.
pumilus e B. amyloliquefaciens, são considerados excretores de serinas-proteases
que são similares à tripsina e de grande importância no setor industrial (13). O
fato de ser um excelente produtor de enzimas dá-se devido à ubiqüidade e
resistência dos seus endosporos, que podem ser empregados na indústria,
principalmente, a alimentícia, no controle da qualidade biológica de certos
alimentos (leite em pó ou “in natura”, farináceos, biscoitos, etc), ou até mesmo
quando produzem as depolimerases extracelulares, importantes na degradação
de ácidos nucléicos, carboidratos, proteínas e outros compostos (13,23). B.
licheniformis é um excelente produtor de α-amilase em escala industrial,
empregada na produção de xaropes ricos em frutose que se destinam à fabricação
de sodas, ou ainda pode-se obter dextrinas que serão transformadas em glicose
pela ação das glicoamilases (6,25,27).
A característica de extremófilos dos microrganismos é considerada uma
“chave” no tratamento de alguns tipos de resíduos industriais recalcitrantes
(1,12,22), pois se sabe que na termofília as enzimas destes microrganismos são
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
produzidas rapidamente devido à aceleração que ocorre na velocidade das reações
bioquímicas, que em geral são afetadas por fatores externos (pH, temperatura,
pressão osmótica, etc) (2,14,28).
Os microrganismos do gênero Geobacillus apresentam a habilidade de
degradar hidrocarbonetos, devido à presença de um grupo de enzimas como as
monooxigenase alcano, que são induzidas e catalisadas pela formação de um
álcool alifático fazendo com que o microrganismo se apodere do composto. Além
das monooxigenases, existem também as hidroxilases ou sistema alcano
hidroxilase que auxiliam as anteriores no papel degradativo de compostos
recalcitrantes (14,16).
Todas as amostras aqui descritas apresentaram reação positiva ao teste de
hemólise, e, por conseguinte, produtoras de biossurfactantes, sendo estas
informações corroboradas por Youssef et al. (31), que descreve a atividade
hemolítica dos microrganismos como capacidade de produção de biosurfactantes.
Das amostras estudadas, 100% foram catalase positiva, 85% utilizaram
citrato, todas produziram amilase, todas foram móveis e com capacidade de
reduzir o nitrato a nitrito, além de possuírem a capacidade de utilizar diversas
fontes de carbono (açúcares).
Segundo
Sonnleitner
(24),
os
microrganismos
termofilicos
ou
termotolerantes são reconhecidamente excelentes produtores de enzimas e
biomassa;
seus
cultivos
são
considerados
mais
econômicos
que
os
de
microrganismos mesofílicos, por reduzir o problema de contaminação por outros
microrganismos e suas enzimas apresentarem maior estabilidade. Todas as
observações evidenciam as vantagens no emprego dos microrganismos estudados
no tratamento de resíduos ambientais.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
O uso destes microrganismos nas diversas formas de tratamento biológico
de compostos recalcitrantes, como Hidrocarbonetos Aromáticos Policiclícos
(HAP’S), compostos sulfurados (organosulfurados) e metais pesados, são de
extrema importância devido às condições e formas como se desenvolvem na
natureza. Estes compostos são encontrados nos ecossistemas terrestres e
aquáticos, e suas condições de desenvolvimento proporcionam um melhor
desempenho na retirada destes do ambiente em geral, evitando-se contaminações
da biosfera.
ii) Perfil de resistência a antibióticos:
Foram realizados testes para definir o perfil de susceptibilidade a alguns
antibióticos (21) das amostras identificadas como pertencentes aos gêneros
Bacillus e Geobacillus.
As amostras identificadas como Geobacillus (UCP 985 e 986), foram
resistentes a ampicilina e ao cloranfenicol e sensíveis para os demais antibióticos,
embora a amostra UCP 986, teve perfil intermediário ao cloranfenicol.
As amostras identificadas como Bacillus, apresentaram perfis variados. No
total foram identificadas 26 amostras de B. licheniformis; destas, 96% foram
sensíveis a kanamicina e gentamicina. Das amostras estudadas, 84% foram
resistentes a ampicilina, 61.5% à estreptomicina, 73% a cloranfenicol e 54% à
eritromicina.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
iii) Análise de Cluster:
Considerando o vetor de variáveis (Gram, citrato, posição dos endosporos,
amilase, catalase, redução do NO3 a NO2, motilidade, hemólise e oxidase), para
cada situação (50ºC, 55ºC e 60ºC). O dendograma 50ºC (Figura 1) identificou dois
grupos distintos contendo cada um 7 isolados, todos procedentes do solo do Porto
do Recife, onde ambos os grupos apresentaram similaridade, porém diferem em
relação a variável produção de oxidase.
A Figura 2, correspondente ao
dendograma que mostra os isolados com crescimento a 55ºC, identificando dois
grupos distintos; o primeiro grupo 5 amostras; e o segundo apenas uma amostra,
separados pela variável produção de oxidase. Na Figura 3 o dendograma
correspondente aos isolados com crescimento a 60ºC, identificou três grupos
distintos, contendo o primeiro grupo, duas amostras; o segundo três amostras; e
o terceiro grupo, 2 amostras, também diferenciados em relação à oxidase.
As
investigações
identificados
e
stearothermophilus
realizadas
classificados
como
apresentam
mostraram
Bacillus
que
os
licheniformis
aplicações
microrganismos
e
Geobacillus
biotecnológicas,
devido
principalmente, às suas habilidade como termofilia e halofilia, consideradas
indicativas aos tratamentos de compostos recalcitrantes, como também, na
produção de biopolímeros com atividade emulsificante.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem às agencias financiadoras CNPq
(Processos Nº141158/ 02-6 e Nº3096610/ 2003-6), FACEPE, CNPq/ CTPETRO,
as instituições UNICAP e UFPE pelo uso de suas instalações; e aos Professores
Bartolomeu Santos (UFPE) e Veridiana Santos (UPE/ UFRPE) pelas análises
estatísticas de Cluster.
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Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
30.
TURNBULL
P.C.B.;
KRAMER,
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Bacillus.
Manual
of
Clinical
Microbiology.5th Edition. Cap. 33, 296-303. 1990.
31. YOUSSEF, N.H.; DUNCAN, K.E.; NAGLE, D.P.; SAVAGE, K.N.; KNAPP, R.M.;
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Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
TÍTULOS DAS TABELAS
Tabela 1: Características das amostras de B. licheniformis isoladas do Porto do
Recife – termofilico facultativo 50ºC.
Tabela 2: Característica das amostras de B. licheniformis isoladas do Lodo têxtil termofilico moderado 55ºC.
Tabela 3: Característica das amostras de Bacillus licheniformis e Geobacillus
stearothermophilus isoladas do Porto do Recife, Lodo e efluente têxtil - termofilico
60ºC.
Tabela 4: Características das amostras de Bacillus licheniformis isoladas do Porto
do Recife – halotolerante, termofilico facultativo 50ºC.
Tabela 5: Característica das amostras de Bacillus licheniformis isoladas do Lodo
têxtil - halotolerante, termofilico moderado 55ºC.
Tabela 6: Características das amostras de Bacillus licheniformis e Geobacillus
stearothermophilus isoladas do Porto do Recife, de efluente e lodo têxtil halofílicos, termofilicos 60ºC.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Tabela 1: Características das amostras de B.licheniformis – termofilico facultativo
a 50ºC, isoladas do Porto do Recife.
UCP
890;
910;
896;
923;
908;
911;
891;
924;
964.
909;
984.
922;
917;
Características morfofisiológicas e bioquímicas
Cit. Mot. Gram Endosporos Amil. Cat. Hem. NO3
a
NO2
+
+
Terminais
+
+
+
+
-
+
+
Terminais
+
+
+
Oxi.
+
+
-
Legenda: Citrato (Cit); Motilidade (Mot); Amilase (Amil); Catalase (Cat); Hemólise (Hem);
Oxidase (Oxi).
Tabela 2: Características das amostras de B.licheniformis termofilico moderado a
55ºC, isoladas de efluente e lodo têxtil.
UCP
974; 983; 966;
979; 980.
Características morfofisiológicas e bioquímicas
Cit. Mot. Gram Endosporos Amil. Cat. Hem. NO3
a
NO2
+
+
Terminais
+
+
+
+
Oxi.
+
Legenda: Citrato (Cit); Motilidade (Mot); Amilase (Amil); Catalase (Cat); Hemólise (Hem);
Oxidase (Oxi).
Tabela 3 Características das amostras de B. licheniformis e G. stearothermophilus
termofilico a 60ºC, isoladas de efluente e lodo têxtil.
UCP
.977; 966; 987;
971; 985.
986; 978.
Características morfofisiológicas e bioquímicas
Cit. Mot. Gram Endosporos Amil. Cat. Hem. NO3
a
NO2
+
+
Terminais
+
+
+
+
+
+
+
Terminais
+
±
+
-
Oxi.
+
-
Legenda: Citrato (Cit); Motilidade (Mot); Amilase (Amil); Catalase (Cat); Hemólise (Hem);
Oxidase (Oxi).
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Tabela 4: Características das amostras de B.licheniformis – termofilico facultativo
a 50ºC, isoladas do Porto do Recife.
UCP
Cresc. a 7% NaCl*
Cresc. a 10 % NaCl**
890; 896; 891; 908;
+
+
±
+
909; 984; 922; 923;
924; 917; 964.
910; 911; 924;
Meio de cultura: *caldo nutritivo; ** Luria Bertani com culturas isoladas a 7 % de cloreto
de sódio; ±: crescimento lento.
Tabela 5: Características das amostras de B. licheniformis – termofilico moderado
a 55ºC, isoladas de efluente e lodo têxtil.
UCP
Cresc. a 7% NaCl*
Cresc. a 10 % NaCl**
983; 966; 974;
+
±
979; 980.
±
-
Meio de cultura: *caldo nutritivo; ** Luria Bertani com culturas isoladas a 7 % de cloreto
de sódio; ±: crescimento lento.
Tabela 6: Características das amostras de B. licheniformis e G. stearothermophilus
termofilico a 60ºC, isoladas de efluente e lodo têxtil.
UCP
Cresc. a 7% NaCl*
Cresc. a 10 % NaCl**
977; 966; 971; 985;
+
+
+
+
987
986; 978.
Meio de cultura: *caldo nutritivo; ** Luria Bertani com culturas isoladas a 7 % de cloreto
de sódio; ±: crescimento lento.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
LISTA DE FIGURAS:
Figura 1: Dendograma apresentando a distribuição média e grau de similaridade
entre os grupos de Bacillus licheniformis isolados do Porto do Recife a 50ºC.
Figura 2: Dendograma apresentando a distribuição média e grau de similaridade
entre os grupos de B.licheniformis isolados do Lodo têxtil a 55ºC.
Figura 3: Dendograma apresentando a distribuição média e grau de similaridade
entre os grupos de B.licheniformis e G.stearothermophilus isolados do Porto do
Recife, de Efluente e Lodo têxtil a 60ºC.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Figura 1: Dendograma apresentando a distribuição média e grau de similaridade
entre os grupos de Bacillus licheniformis isolados do Porto do Recife a 50ºC.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Figura 2: Dendograma apresentando a distribuição média e grau de similaridade
entre os grupos de B.licheniformis isolados do Lodo têxtil a 55ºC.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Figura 3: Dendograma apresentando a distribuição média e grau de similaridade
entre os grupos de B.licheniformis e G.stearothermophilus isolados do Porto do
Recife, de efluente e Lodo têxtil a 60ºC.
2º ARTIGO
Influência de Cloreto de Sódio e de Cobre na Produção de Biomassa e de
Biossurfactante por uma nova amostra de Geobacillus stearothermophilus
UCP 986
Manuscrito submetido para publicação no:
World Journal of Microbiology and Biotechnology
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
INFLUÊNCIA DE CLORETO DE SÓDIO E DE COBRE NA PRODUÇÃO DE
BIOMASSA E DE BIOSSURFACTANTE POR UMA NOVA AMOSTRA DE
GEOBACILLUS STEAROTHERMOPHILUS UCP 986
Mabel Calina de França Paz1,5; Beatriz Susana Ovruski de Ceballos2; Clarissa Daisy
Costa Albuquerque,5; Galba Maria de Campos-Takaki3,5,6*
1,5
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas - CCB/ UFPE; 2Área de
Engenharia Sanitária e Ambiental/ Universidade Federal de Campina Grande AESA/UFCG-; 3Departamentos de Química – UNICAP;
4
Estatística e Informática –
UNICAP; 5Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais – NPCIAMB, UNICAP .
Recife, PE, Brasil.
*Corresponding author: Galba Maria de Campos-Takaki, Departamento de Química,
Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco. Rua
Nunes Machado, 42, Boa Vista. 500050-590 Recife – Pe, Brasil, E-mail:
[email protected], Tel.+00-55-81-32164017; fax: +00-55-81-32164043
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
RESUMO
Cresce a contaminação de ambientes aquáticos por resíduos
recalcitrantes, tais como os metais pesados e resíduos oleaginosos. Estes tipos de
contaminantes podem ser tratados físico, químico e biologicamente. O tratamento
biológico,
em
geral,
emprega
microrganismos
autóctones
de
ambientes
impactados; estes apresentam características morfofisiológicas que viabilizam seu
ataque aos compostos considerados de difícil degradação. Em ambientes
marinhos, a concentração salina é um fator limitante para a ação dos
microrganismos, além da temperatura e do pH. Geobacillus stearothermophilus
UCP 986, isolado de efluente de indústria têxtil, apresentou características
biotecnológicas viáveis (termofília e halofilia) e produção de biopolímeros, para o
tratamento de ambientes contaminados por compostos oriundos de produtos
petroquímicos, tais como combustíveis fósseis e lubrificantes.
Palavras chaves: Geobacillus stearothermophilus, efluentes petroquímicos, metais
pesados, biossurfactantes.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
1. INTRODUÇÃO
O uso de microrganismos capazes de sobreviver em lugares com
concentrações de sal elevadas, nos dias atuais, são considerados como uma
estratégia extremamente importante para o tratamento de ambientes como
oceanos, mares e estuários contaminados por resíduos recalcitrantes, em
especial, os provenientes do petróleo. A tolerância salina de microrganismos não
halofílicos está relacionada com a compatibilidade dos solutos e os mecanismos
de transporte através da membrana celular, quando expostos a ambientes
hiperosmóticos (IKEUCHI et al., 2003).
Estudos mostram que em ambientes com pressão osmótica elevada, os
microrganismos utilizam como mecanismo de resistência. Devido a sua
organização
estrutural,
principalmente
a
parede
celular
e
presença
do
peptideoglicano. Assim, torna-se possível à regulação da concentração citosólica e
o processo de adaptação dos microrganismos às diferentes variações da
concentração
de
sal
(TORTORA
et
al.,
2003).
Diante
deste
fato,
os
microrganismos são classificados quanto à tolerância ao sal em: levemente,
moderadamente ou extremamente halófilo.
Por outro lado, o lançamento de metais pesados no ambiente dá-se por
diversos modos, desde um simples processo de treinamento militar até pela
disposição incorreta de efluentes domésticos e industriais (VEGLIÓ et al., 2003).
Em geral, os efluentes petroquímicos carream grande quantidade de poluentes,
entre eles, óleos e íons metálicos. A sorção dos metais por microrganismos
depende de alguns fatores externos tais como o pH, temperatura, outros íons da
solução, além de produtos metabólicos da célula que podem conduzir à
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
precipitação do metal (VEGLIÓ & BEOLCHINI, 1997). O processo de biossorção
de metais pesados está relacionado às características morfofisiológicas do
microrganismo utilizado, além das concentrações do metal, encontradas no
ambiente (COSTA & DUTA, 2001).
A aplicação de biossurfactantes no tratamento de resíduos do petróleo
torna-se um dos pré-requisitos importantes para que ocorram interações entre os
hidrocarbonetos encontrados nestes resíduos e a célula microbiana, devido à
redução da tensão superficial mediada entre o óleo e a fase aquosa (HUA et al.,
2003).
Os biopolímeros podem apresentar várias estruturas químicas tais como
glicolipídeos, lipopetídeos, ácidos graxos entre outros, os quais são produzidos
por uma grande variedade de microrganismos quando cultivados em substratos
insolúveis e solúveis (SARUBBO et al., 2001; VANCE-HARROP et al., 2003).
Considerando as propriedades dos biossurfactantes, torna-se possível a
aplicação em diversos processos industriais como detergência, emulsificação,
lubrificação, solubilização e dispersão de fases (NITSCHKE & PASTORE, 2002). A
maior utilização dos biossurfactantes se concentra na indústria de produtos de
limpeza, na indústria de cosméticos, na indústria farmacêutica e na indústria de
petróleo (RON e ROSENBERG, 2002).
Neste trabalho foi investigada a influência da concentração do cloreto de
sódio e do cobre na produção de biomassa e de biossurfactante pelo
microrganismo
termofílico
Geobacillus
stearothermophilus
UCP
986.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
2. MATERIAL E METODOS
Microrganismo: foi utilizado Geobacillus stearothermophilus UCP 986, isolado de
efluente de indústria têxtil, pertencente ao Banco de Culturas do Núcleo de
Pesquisas em Ciências Ambientais (NPCIAMB) da Universidade Católica de
Pernambuco (UNICAP), mantida em ágar nutriente inclinado a 5ºC.
Condições de cultivo:
G. stearothermophilus foi cultivado em caldo Luria Bertani (LIN et al., 1998)
distribuído 50 ml para frascos de Erlenmeyers de 250 ml de capacidade, em
duplicata, incubados “overnight” sob agitação orbital a 150 rpm, resultando em
uma cultura com 106UFC/mL que serviu de pré inóculo. Em seguida, 1% do préinóculo foi transferido para frascos de Erlenmeyers com capacidade de 250ml,
contendo 50 ml do meio Luria Bertani, com diferentes concentrações de cloreto
de sódio (10, 30 e 50 g/L) e da solução do metal cobre (5mM e 10mM, a partir de
uma solução estoque 100 mM de sulfato de cobre), de acordo com o planejamento
fatorial 23. Os frascos foram incubados sob agitação orbital a 150 rpm, por 96
horas às temperaturas de 50ºC, 55ºC e 60ºC, respectivamente. Após o período de
incubação, os frascos correspondentes a cada variável analisada (sal, metal e
temperatura), foram submetidos à centrifugação de 2500g por 15 minutos, à
temperatura de 15ºC e posterior filtração em filtro Millipore de 0.22 µm. A
biomassa obtida foi liofilizada para determinação do crescimento por gravimetria
e
o
líquido
metabólico
foi
utilizado
para
estimação
da
produção
de
biossurfactante – índice e atividade de emulsificação, pH e teor de proteínas
totais.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Produção biossurfactante: o líquido metabólico livre de células foi utilizado para
determinar o índice de emulsificação pelo método descrito por Cooper &
Goldenberg (1984). Para determinação do índice de emulsificação foram utilizados
2 ml de líquido metabólico e 1 ml de n-hexadecano, homogeneizado em vórtex por
2 minutos, a 25º C. Após 2 minutos a leitura foi realizada através de medição da
altura da emulsão formada. O índice foi calculado através da equação: índice da
emulsão (%) = He X 100 / Ht, onde He = altura da emulsão; Ht = altura total do
líquido. A determinação da atividade de emulsificação foi segundo Cirigliano &
Carman (1987), onde se utiliza o liquido metabólico (2 ml), livre de células,
adiciona-se 2 ml de tampão acetato de sódio (0.1M), mais 1 ml de n-hexadecano.
Agita-se por 2 minutos de aguarda-se 10 minutos; após este período, retira-se
com cautela a emulsão formada e lê-se em espectrofotômetro a 540nm. O
resultado foi calculado por ABS X 2, onde é representado por U.A.E (Unidade de
Atividade de Emulsificação). A tensão superficial foi determinada no líquido
metabólico livre de células, utilizando a técnica do anel padrão através do
emprego do tensiômetro KSV Ltd. - Sigma 70- Finland.
Proteínas totais: A concentração de proteínas totais foi determinada pelo método
colorimétrico do Biureto (LABTEST Diagnostic - Brasil ).
pH: O pH do líquido metabólico livre de células foi medido no início e final da
fermentação. Foi utilizado um pHmetro Orion, modelo 310.
Planejamento fatorial: o planejamento fatorial completo 23, com quatro (04) pontos
centrais (Tabela 1), foi realizado para analisar os efeitos principais, produção de
biomassa e de biossurfactante por G. stearothermophilus UCP 986, e as
interações das variáveis independentes em relação à temperatura de incubação, a
concentração de cobre e de cloreto de sódio.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Tabela 1....
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO:
Produção de biomassa:
Os resultados obtidos mostram que G. stearothermophilus produziu uma
quantidade expressiva de biomassa em todos os tratamentos, utilizando
diferentes níveis de cobre, cloreto de sódio e temperatura, conforme o
planejamento fatorial completo (Tabela 1). No entanto, o estudo estatístico mostra
que não houve interação significativa entre as variáveis metais e concentração de
cloreto de sódio, em relação à produção da biomassa bacteriana. Este fato
provavelmente dá-se devido ao tipo de parede celular que G. stearothermophilus
apresenta, por ser uma bactéria Gram-positiva. Em estudos com bactérias Grampositivas,
mostram
que
estes
microrganismos
apresentam
características
morfológicas consideradas relevantes no tratamento de metais pesados. (COSTA
& DUTA, 2001).
E ainda, segundo Beveridge (1989), as bactérias apresentam habilidade
para acumular metais pesados, considerando que as estruturas de superfície da
parede celular apresentam condições favoráveis de ligações entre os íons
metálicos. A acumulação na superfície ocorre através de reações químicas, como
complexação e até mesmo, troca iônica. Nas bactérias Gram-positivas, os ácidos
componentes da parede celular, como o ácido teicóico juntamente com o
grupamento fosfato, compõem a chave para realização da bioacumulação de íons
metálicos pela célula, juntamente com a camada de peptideoglicano (NITSCHKE
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
& PASTORE, 2002). O uso de G. stearothermophilus foi devido ao conhecimento
prévio de que todos os microrganismos Gram-positivos possuem maior habilidade
de acumulação de metais pesados que os microrganismos Gram-negativos,
justificando os resultados aqui descritos (TZESOS, 2001).
A morfologia das espécies de Geobacillus ressalta a importância destes
microrganismos no tratamento de resíduos em ambientes com níveis elevados de
cloreto de sódio, como mares, estuários e salinas (OREN, 2002). Esta amostra de
Geobacillus foi considerada levemente halofílica, devido às condições fornecidas
para seu crescimento e que mesmo assim continuou a crescer na presença m
concentrações elevadas de sal. A temperatura, outro fator considerado importante
no desenvolvimento dos microrganismos em geral, não apresentou influência no
seu crescimento, devido a seu caráter termofílico. E ainda, a produção de
proteínas totais durante o cultivo, sob condições consideradas adversas, sugere
que ocorreu uma adaptação do G.stearothermophilus na presença de diferentes
concentrações de metal e sal, como também nas diversas temperaturas.
Produção de biossurfactantes:
Os organismos produtores de bioemulsificantes são considerados diversos,
mas em algumas condições de cultivo, como termofília e halofília, não se dispõe
de muitas informações. Na área biotecnológica, surfactantes produzidos por
microrganismos são importantes, pois apresentam vantagens especiais sobre os
surfactantes químicos como baixa toxicidade, biodegradabilidade, produção de
substratos renováveis e estabilidade em valores extremos de pH e temperatura
(VANCE-HARROP et al., 2003). A aplicação de biossurfactantes é ampla, como em
derramamentos de petróleo, remoção de borras oleosas de tanques (limpeza) de
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
estocagem e até na produção de alimentos (VAN DYKE et al., 1991;MULLIGAN,
2004).
A tabela 2 apresenta os resultados referentes à avaliação da atividade de
emulsificação, teste qualitativo, onde se evidencia que o microrganismo em
estudo possui caráter de produtor de substância emulsificante, mesmo na
presença de metal e em concentrações de sal elevadas. Segundo Mulligan et al.
(2003), os surfactantes microbianos são considerados substâncias efetivas no
tratamento de metais, pois se sabe que a qualidade da emulsão proporciona um
decréscimo na conductividade do meio, devido ao aumento da viscosidade, que
atua diretamente na mobilidade dos íons metálicos. Destes íons foi observado
uma remoção de 73.2% de Cd e 68.1% de Ni, entretanto, para o íon Zn a remoção
foi de 85% na faixa de pH entre 8.3 - 11(MULLIGAN et al., 1999, 2001). Estudos
mostram que microrganismos Gram-positivos produtores de biosurfactantes são
considerados excelentes na remoção de íons metálicos, em ambientes aquáticos e
terrestres (BODOUR et al., 2003).
O índice de emulsificação da amostra de G. stearothermophilus (TABELA 2)
considerado
um
teste
quantitativo,
apresentou
comportamento
linear
e
satisfatório. O biopolímero avaliado com atividade de emulsificação, produzido
pelo microrganismo Geobacillus stearothermophilus, é provavelmente, da classe
dos lipopetídeos e lipoproteínas, como sugere Sarubbo et al., (2001); Nitschke &
Pastore (2002) e Urum et al., (2004).
Com relação ao teste de avaliação de tensão superficial observou-se uma
influência do metal (10mM) diretamente na redução da tensão, observando-se
que onde maior concentração de metal, com as temperaturas mais altas (60ºC),
os resultados não foram considerados satisfatórios. Entretanto, as melhores
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
condições para a redução tensão superficial foram observadas com as menores
temperaturas (50ºC) e concentrações de sal empregadas (10 g/L). Segundo
Rahman et al. (2003), em estudos com biodegradação de hidrocarbonetos do
petróleo, observou que a redução da tensão superficial está ligada ao processo de
desorção na presença de biossurfactantes produzidos por microrganismos
consorciados.
Tabela 2......
Efeitos do Planejamento Fatorial:
No diagrama de Pareto de efeitos padronizados, ilustrado na Figura 1,
observa-se que para o nível de confiança de 95%, as variáveis independentes
temperatura
e
concentração
metálica
produziram
efeitos
negativos,
estatisticamente significativos sobre o aumento do índice de emulsificação com
96 h de cultivo; sendo o efeito negativo produzido pela temperatura superior ao
produzido pela concentração metálica.
A interação da temperatura com a concentração metálica produziu efeito
positivo, estatisticamente significativo, sobre aumento do índice de emulsificação,
com 96 h de cultivo. No diagrama de Pareto de efeitos padronizados, ilustrado na
Figura 2, pode-se observar que para o nível de confiança de 95%; as variáveis
independentes: temperatura, concentração salina e concentração metálica e as
interações entre as mesmas, não exerceram efeitos estatisticamente significativo
sobre a produção de biomassa, após 96 horas de cultivo.
Ressalta-se que a variável concentração salina apresentou efeito positivo
significativo sobre aumento do índice de emulsificação, com 96 h de cultivo.
Contudo, a interação da concentração salina com a concentração metálica, e a
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
interação da concentração salina com a temperatura, ambas exercem efeitos
negativos,
estatisticamente
significativos,
sobre
aumento
do
índice
de
emulsificação com 96 h de cultivo.
AGRADECIMENTOS:
Os autores agradecem às agencias financiadoras CNPq (Processos Nº141158/
02-6 e Nº 3096610/ 2003-6), CT/PETRO, FINEP; e a UNICAP e UFPE, pelo uso de
suas instalações.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
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Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Valores das variáveis independentes nos níveis -1 e +1 e no ponto
central, no planejamento fatorial de 23.
Tabela 2: Condições avaliadas no planejamento fatorial com resultados de pH,
biomassa,
índice
de
emulsificação,
atividade
de
emulsificação
e
tensão
superficial, após 96 horas de cultivo do Geobacillus stearothermophilus UCP 986.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Tabela 1 – Valores das variáveis independentes nos níveis -1 e +1 e no ponto
central, no planejamento fatorial de 23.
Nível
Temperatura (ºC)
-1
0
+1
50
55
60
Concentração
Metálica (mM)
0
5
10
Concentração salina
(g/l)
10
30
50
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Tabela 2: Condições avaliadas no planejamento fatorial e resultados de pH,
biomassa,
índice
de
emulsificação,
atividade
de
emulsificação
e
tensão
superficial, após 96 horas de cultivo do Geobacillus stearothermophilus UCP 986.
Condição
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
pH
inicial
6.14
6.12
6.14
6.15
6.40
6.41
6.40
6.40
6.32
6.30
6.32
6.32
Biomassa
(g)
final
9.31
6.64
3.88
3.82
9.15
6.79
3.70
3.70
4.19
4.26
4.20
4.31
0.28090
0.36920
0.29970
0.70040
0.40730
0.42550
0.29810
0.38890
0.68460
0.40470
0.04300
0.41560
Índice de
Atividade de
emulsificação emulsificação
(%)
U.A. E (540nm)
28.57
8.57
11.11
8.57
55.55
22.85
22.22
0.00
14.29
20.00
14.29
17.14
5,90
5,26
4,48
3,14
5,16
3,43
1,86
1,09
0,98
0,96
1,05
3,08
Tensão
superficial
(mN/m)
33.65
48.30
46.86
48.17
49.00
50.35
48.32
48.68
49.48
47.39
46.73
46.33
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
LISTA DE FIGURAS:
Figura 1: Diagrama de Pareto de efeitos padronizados. Variável resposta: Índice
de emulsificação de Geobacillus stearothermophilus UCP 986 cultivado em
diferentes condições de metal e sal.
Figura 2: Diagrama de Pareto de efeitos padronizados. Variável resposta:
Biomassa com 96 horas de cultivo de Geobacillus stearothermophilus UCP 986
cultivado em diferentes condições de metal e sal.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Diagrama de Pareto de Efeitos Padronizados
Planejamento Experimental 2**(3-0); MS Puro Erro=7,4694
Variável Dependente: Índice de Emulsificação
p=,05
(1)TEMP
-10,0205
(2)C_METAL
-9,52634
(3)C_SALINA
5,666126
2e3
-5,00896
1e3
-4,18879
1e2
3,614419
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
Figura 1: Diagrama de Pareto de efeitos padronizados. Variável resposta: Índice
de emulsificação do Geobacillus stearothermophilus UCP 986 cultivado em
diferentes condições de metal e sal.
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Diagrama de Pareto de Efeitos Padronizados
Planejamento Experimental 2**(3-0); MS Puro Erro=,0693443
Variável Dependente: Biomassa
p=,05
(1)TEMP
,8028801
2e3
-,665665
1e2
,5169044
1e3
-,510191
(2)C_METAL
,2741607
(3)C_SALINA
-0,5
-,175076
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Efeito Estimado (Valor Absoluto)
Figura 2: Diagrama de Pareto de efeitos padronizados. Variável resposta:
Biomassa de Geobacillus stearothermophilus UCP 986 com 96 horas de cultivo em
diferentes condições de metal e sal.
3º ARTIGO
Produção de Biossurfactante por uma nova amostra de
Geobacillus stearotermophilus UCP 986
Manuscrito submetido para publicação ao:
Journal Industrial Microbiology and Biotechnology
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTE POR UMA NOVA AMOSTRA DE
GEOBACILLUS STEAROTHERMOPHILUS UCP 986
PAZ, Mabel Calina de França
SARUBBO, Leonie Asfora
1
1,4,
3,4,
CEBALLOS, Beatriz Suzana Ovruski de 2,
CAMPOS-TAKAKI, Galba Maria de
3,4*.
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – Universidade Federal de
Pernambuco-UFPE, Recife, PE, Brasil;
2Departamento
de Engenharia Civil – AESA/
Universidade de Campina Grande - UFCG; 3Departamento de Química – Universidade
Católica de Pernambuco - UNICAP, Recife, PE, Brasil; 4Núcleo de Pesquisas em Ciências
Ambientais - NPCIAMB, UNICAP, Recife, PE, Brasil.
*Corresponding author: Galba Maria de Campos-Takaki, Departamento de Química,
Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco. Rua
Nunes Machado, 42, Boa Vista. 500050-590 Recife – Pe, Brasil, E-mail:
[email protected], Tel.+00-55-81-32164017; fax: +00-55-81-32164043
91
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
RESUMO
A habilidade de produção de biossurfactante foi demonstrada por uma nova
amostra de Geobacillus stearothermophilus. O biopolímero produzido foi isolado
por precipitação ácida do líquido metabólico livre de células, resultando num
produto de 79.6 mg/L. Os testes de estabilidade realizados com o líquido
metabólico, produzido por Geobacillus stearothermophilus demonstrou alta
estabilidade frente à temperatura de 100ºC, ampla faixa de pH e concentrações
de cloreto de sódio, quando avaliados índice e atividade de emulsificação, e, pela
tensão superficial. O biossurfactante produzido durante o período de 48 horas de
fermentação na presença de glicose (0.5%) reduziu a tensão superficial para 32,7
mM/m. Os resultados obtidos do biopolímero produzido pelo Geobacillus
stearothermophilus
indicam
seu
elevado
potencial
nos
tratamentos
de
recuperação de óleos, entre outros.
Palavras chaves: biossurfactante, termofílico; Geobacillus stearothermophilus.
92
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
1. INTRODUÇÃO
Biossurfactantes
são
compostos
anfifílicos,
podem
ser
produzidos
extracelularmente ou como “constituintes” da membrana celular de bactérias,
fungos e leveduras. Alguns microrganismos produzem biosurfactantes durante
seu crescimento em uma grande
variedade
de substratos (MAKKAR &
CAMEOTRA, 1998).
Os surfactantes têm sido utilizados industrialmente como adesivos,
floculantes,
umectantes,
removedores
de
espuma,
entre
outros.
Sua
aplicabilidade é ampla, devido as suas propriedades de reduzir ao máximo a
tensão superficial, aumentar a solubilidade, apresentar potencial de detergência,
além de aumentar a solubilidade dos compostos do petróleo (MULLIGAN et al,
1999; MULLIGAN, 2004).
Em geral os biosurfactantes apresentam uma porção hidrofóbica, formada
por uma longa cadeia de ácidos graxos – saturados ou insaturados; e uma porção
hidrofílica pode ser um carboidrato, aminoácido, peptídeo cíclico, grupo fosfato,
carboxílico ou álcool. A porção hidrofóbica concentra-se na superfície, enquanto a
hidrofílica fica em contato com a solução (MULLIGAN et al., 2001; HEALY et al.,
1996). Estas porções são capazes de reduzir a tensão superficial e interfacial
entre interfaces líquidas, sólidas e gasosas, permitindo que essas se misturem ou
dispersem como emulsões ou outros líquidos (VANCE-HARROP, 2004).
Alguns microrganismos produzem biosurfactantes em diferentes substratos
e
condições;
as
bactérias
são
microrganismos
bastante
utilizados
em
experimentos que tenham este procedimento. Entretanto, em condições de
93
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
termofília, a síntese dos biosurfactantes tem sido pouco explorada, devido à
restrição da utilização de microrganismos termofilicos (YOUSSEF et al., 2004).
Os
microrganismos
biotecnológicas,
tais
como
termofilicos
são
recuperação
de
excelentes
óleos,
limpeza
em
de
aplicações
ambientes
contaminados por compostos recalcitrantes e produção de enzimas (ABED et al.,
2002). Segundo Banat (1995), o isolado Bacillus sp. termofilico cultivado em meio
contendo hidrocarbonetos, produziu biossurfactantes em temperatura em torno
de 45ºC. Outros estudos já foram realizados com microrganismos termofilicos ou
termotolerantes com resultados satisfatórios (YAKIMOV et al., 1995; BANAT,
1993).
Geobacillus é um novo gênero pertencente à família Bacillaceae, pode ser
explorado biotecnologicamente por apresentar características extremamente
interessantes, como termofília e halofilia. O que aumenta o interesse por este
microrganismo
na
produção
de
biopolímeros
tão
importante
como
os
biossurfactantes, em condições adversas para os demais microrganismos
estudados ate então.
Neste trabalho foi investigado a produção do biossurfactante sob condições
de termofília e halofilia, tendo glicose como fonte de carbono, por Geobacillus
stearothermophilus UCP 986.
94
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
2. MATERIAL E MÉTODOS
1. Microrganismo: Geobacillus stearothermophilus UCP 986, isolado de
efluente de indústria têxtil, encontra-se catalogado no Banco de Culturas
da Universidade Católica de Pernambuco (UNICAP), mantido em ágar
nutriente a 4ºC.
2
Meio de cultura e condições de cultivo: G. stearothermophilus foi crescido em
frascos de Erlenmeyers de 500 ml de capacidade com 150 ml do meio Luria
Bertani (LB) constituído por triptona 10g/L, extrato de levedura 5 g/L,
cloreto de sódio 10 g/L, suplementado com glicose 5 mg/ml, segundo
Konishi et al.(1997). O cultivo foi realizado por um período de 48 horas, em
agitação orbital (160 rpm) a 55ºC. O crescimento foi medido por turbidez
espectrofotômetro a 660nm. O inóculo correspondeu a 107 células/ml, numa
densidade óptica (D.O660 ) de 0.8. Após o tempo de cultivo de 48 horas, as
amostras foram submetidas a centrifugação de 2500 x g por 15 min a 10ºC,
para separação das células do líquido metabólico. Após este procedimento as
células foram liofilizadas para obtenção da biomassa total e o líquido
metabólico foi submetido a extração de biossurfactante, determinação do
pH, de glicose , proteínas totais, do índice e da atividade de emulsificação.
2. Proteínas totais: A concentração de proteínas totais no líquido metabólico
foi
determinada
pelo
método
colorimétrico
do
Biureto
(LABTEST
Diagnostic - Brasil).
95
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
3. Consumo de glicose: o consumo de glicose no liquido metabólico livre de
células foi determinado através do método colorimétrico (LABTEST
Diagnostic - Brasil) e medido espectrofotometricamente a 505 nm.
4. pH: o pH do liquido metabólico livre de células foi medido em pHmetro
Orion, modelo 310, ao longo da fermentação.
5. Índice de emulsificação: o índice de emulsificação foi determinado pelo
método descrito segundo Cooper & Paddock (1984), utilizando 2 ml do
líquido metabólico e 1 ml de n-hexadecano, homogeneizado em vórtex por
2 minutos, a 25º C. Após 2 minutos a leitura foi realizada através de
medição da altura da emulsão formada. O índice foi calculado através da
equação: índice da emulsão (%) = He X 100 / Ht, onde He = altura da
emulsão; Ht = altura total do líquido.
6. Atividade de emulsificação: a atividade de emulsificação foi determinada
segundo Cirigliano & Carman (1984), utilizando 2 ml do líquido
metabólico, livre de células, e adicionando 2 ml de tampão acetato de sódio
0.1M (pH 3.0) e 1 ml de n-hexadecano. A mistura foi agitada em vórtex por
2 minutos, seguido de repouso por 10 min, leitura em espectrofotômetro a
540 nm. O resultado foi expresso em Unidade
de Atividade de
Emulsificação (U. A. E), que corresponde à leitura da absorbância
multiplicada pela diluição.
7. Tensão superficial: a Tensão superficial foi determinada em tensiômetro
KSV Ltd. Finland – Sigma 70, utilizando o líquido metabólico livre de
células.
96
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
8
.Testes
de
estabilidade:
os
testes
de
estabilidade
a
diferentes
temperaturas, diferentes pH e concentrações de cloreto de sódio foram
realizados segundo a metodologia descrita por Makkar & Cameotra (1998),
no líquido metabólico livres de células.
9. Extração do biossurfactante: o líquido metabólico livre
de células foi
centrifugado (12000 x g, 20 min). Ao sobrenadante foi adicionado HCl a 6N,
ate pH 2.0, colocado a 4ºC para formar um precipitado. O precipitado foi
centrifugado (12000 x g, 20 min), redissolvido em água destilada, ajustando
o pH para 7.0, foi congelado, liofilizado e pesado, para determinação da
produção do biossurfactante, esta metodologia foi descrita por Makkar &
Cameotra (1998).
97
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Caracterização da nova amostra de Geobacillus stearothermophilus UCP 986:
A nova amostra de Geobacillus stearothermophilus, estudada no presente
trabalho, foi isolada de efluente de indústria têxtil, encontra-se catalogada no
Banco de Culturas da Universidade Católica de Pernambuco, sendo caracterizado
como termofilico e halofílico, crescendo em anaerobiose facultativa. Tem
temperatura de crescimento ótimo em torno de 55ºC e uma faixa de pH (6.3-7.8),
com o ótimo de 6.7 (PAZ et al., 2003), salinidade de até 10% NaCl, produz
atividade hemolítica e amilase, redução de nitrato a nitrito, presença de
endosporos terminais, entre outros. Considerando a importância de se produzir
um biossurfactante com estabilidade em ambientes extremos de temperatura, pH
e concentrações de sal, todas estas condições foram estudadas com o novo
isolado de G.stearothermophilus.
Características de crescimento e produção de biossurfactante:
A produção do biossurfactante e o crescimento do microrganismo foram
estudados com o meio de cultura Luria Bertani, suplementado com glicose. Na
figura 1 observa-se que o substrato foi totalmente consumido no período de 8
horas, quando então o microrganismo apresentou o fenômeno de diauxia e após
24 horas, entrou em sua fase estacionária. A curva de pH mostra que ocorreu um
98
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
leve decréscimo do pH de 7,66 para 6,73, com 8 horas de cultivo durante a fase
exponencial, e foi mantido praticamente o mesmo até o final da fermentação.
A produção de biossurfactante foi acompanhada pela determinação da
emulsificação por dois métodos, a partir do líquido metabólico livre de células.
Quando se efetuou a analise quantitativa pela atividade de emulsificação
(Cirigliano & Carman, 1984), e a análise qualitativa, o índice de emulsificação foi
calculado segundo Cooper & Goldenberg (1987), os resultados obtidos foram
distintos devido à natureza da análise realizada. Na Figura 1, observa-se que a
atividade de emulsificação apresenta duas curvas distintas, uma que acompanha
o crescimento celular e a segunda que se inicia justamente na fase estacionária.
Entretanto, a curva do índice de emulsificação, a atividade só foi detectada após 8
horas de cultivo, e se manteve a mesma até o final da fermentação. A tensão
superficial do líquido metabólico livre de células apresentou uma redução de 50
mN/m para 32,7 mN/m após 48 horas de fermentação, indicando a produção de
biopolímero em atividade surfactante.
Estudos sobre as propriedades do biossurfactante - testes de estabilidade:
A Tabela 1 mostra os resultados de termoestabilidade do líquido metabólico
livre de células de Geobacillus stearothermophilus a 100ºC. O líquido metabólico
livre de células submetido a 100ºC por diferentes intervalos de tempo,
demonstrou uma alta redução da tensão superficial e um discreto aumento do
índice de emulsificação a cada intervalo, e um comportamento específico da
atividade de emulsificação. A literatura descreve a capacidade de microrganismos
termofilicos produzirem polímeros de superfície ativa, com estabilidade em
99
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
condições
adversas
corroborando
com
os
resultados
obtidos
para
o
biossurfactante produzido por G. stearothermophilus (YAKIMOV et al, 1995;
MAKKAR & CAMEOTRA, 1998; PEREGO et al, 2003; MARCHANT et al, 2003;).
A
tabela 2 mostra a influência do pH
sobre
a estabilidade
do
biossurfactante produzido, observando-se grande redução da tensão superficial e
alto do índice de emulsificação. Em pH 6,0 observaram-se os melhores resultados
de redução da tensão superficial e do índice de emulsificação. Contudo, a
atividade de emulsificação apresentou um discreto aumento, na faixa de pH 4,0 a
12,0. No pH 2,0, foi observado uma queda significativa da atividade e índice de
emulsificação, acompanhada pelos altos valores da tensão superficial. Para
Makkar & Cameotra (1998), a estabilidade do biopolímero produzido no líquido
metabólico livre de células por Bacillus subtilis, cultivado em condições de
termofília é mantida em uma faixa ampla de pH, apoiando os resultados obtidos
para G. stearothermophilus.
A influência da concentração de sal sobre a estabilidade do líquido
metabólico livre de células de G. stearothermophilus está apresentada na Tabela
3. Os resultados obtidos mostram uma redução da tensão superficial, um
discreto aumento da atividade de emulsificação, como também do índice de
emulsificação, com a adição da solução de cloreto de sódio a 10%, confirmando
as características de halotolerância do biossurfactante produzido.
O biossurfactante produzido e isolado pelo tratamento com ácido, após 48
horas de fermentação foi de 79.6 mg/L, indicando uma excelente capacidade de
produção de biopolímero por Geobacillus stearothermophilus, sendo os resultados
corroborados pela literatura (YAKIMOV et al, 1995; DÉZIEL et al., 1996;YOUSSEF
et al., 2004).
100
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem aos órgãos de fomento à Pesquisa CNPq (Processos Nº
141158/02-6 e Nº 3096610/ 2003-6), FINEP, e às Instituições que contribuíram
para realização deste trabalho, UNICAP e UFPE.
101
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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105
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Cinética de crescimento e produção de biossurfactante por Geobacillus
stearothermophilus através do consumo de glicose (g/L), curva de pH, biomassa
(g), índice e atividade de emulsificação no liquido metabólico livre de células.
106
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
9
pH
8
5
0,12
4
3
2
4
0,10
3
0,08
0,06
2
0,04
1
0,02
0
0,00
35
5
1
0
10
20
30
40
50
0
60
30
25
20
15
10
Emulsification index (%)
6
0,14
Emulsification acitivity (540)
6
Biomass (g/L)
Glucose (g/L)
7
5
0
Time (hours)
Figura 1: Cinética de crescimento e produção de biossurfactante por Geobacillus
stearothermophilus através do consumo de glicose (g/L), curva de pH, biomassa
(g), índice e atividade de emulsificação no liquido metabólico livre de células.
107
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Termoestabilidade do biossurfactante produzido por Geobacillus
stearothermophilus UCP 986 após 48 horas de fermentação.
Tabela 2: Efeito do pH na estabilidade do biossurfactante produzido por
Geobacillus stearothermophilus UCP 986 após 48 horas de fermentação.
Tabela 3: Efeito da concentração de sal na estabilidade do biossurfactante
produzido por Geobacillus stearothermophilus UCP 986 após 48 horas de
fermentação.
108
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Tabela 1: Termoestabilidade do líquido metabólico livre de células de Geobacillus
stearothermophilus UCP 986 após 48 horas de fermentação.
Tempo de
aquecimento a
100ºC minutos
Índice de
Emulsificação
(E24) -%
Atividade de
Emulsificação
(U. A. E)
Tensão Superficial
mN/m
5
10
15
20
25
60
14,29
22,86
28,57
28,57
28,57
28,57
1,00
0,80
0,80
0,90
3,40
0,00
37,72
39,15
38,77
35,83
32,56
33,38
Tabela 2: Efeito do pH na estabilidade do biossurfactante produzido por
Geobacillus stearothermophilus UCP 986 após 48 horas de fermentação.
pH do líquido
metabólico
livre de células
Índice de
Emulsificação
(E24)
Atividade de
Emulsificação
(U. A. E)
Tensão Superficial
mN/m
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
0,00
8,57
17,14
5,00
5,71
11,43
0,70
4,90
4,80
5,50
5,50
5,60
44,99
40,36
33,39
36,63
36,91
35,10
Tabela 3: Efeito da concentração de sal na estabilidade do biossurfactante
produzido por Geobacillus stearothermophilus UCP 986 após 48 horas de
fermentação.
Concentração
de
(% NaCl)
Índice de
Emulsificação
(E24)
Atividade de
Emulsificação
(U. A. E)
Tensão Superficial
mN/m
2
4
6
8
10
28,57
28,57
28,57
28,57
28,57
1,90
5,00
5,10
4,70
5,06
49,48
47,39
46,73
46,33
35,87
109
4º ARTIGO
Degradação do Dibenzotiofeno por uma nova amostra de
Geobacillus stearothermophilus UCP 986
Manuscrito submetido para publicação ao:
International Biodeterioration and Biodegradation
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
DEGRADAÇÃO DO DIBENZOTIOFENO POR UMA NOVA AMOSTRA DE
GEOBACILLUS STEAROTHERMOPHILUS UCP 986
Mabel Calina de França Paz
1,6;
Ricardo Kenji Shiosaki 6;
Beatriz Susana Ovruski de Ceballos 2; Ricardo Luiz Longo 3;
Galba Maria de Campos-Takaki, 5,6
1
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas – CCB/ UFPE;
Engenharia Sanitária Ambiental – AESA/UFCG;
3
2
Área de
Departamento de Química
Fundamental – DQF/ UFPE; 5 Departamento de Química – UNICAP;
6
Núcleo de Pesquisa
em Ciências Ambientais – NPCIAMB- UNICAP- PE.
Corresponding author: Galba Maria de Campos-Takaki, Departamento de Química,
Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais, Universidade Católica de Pernambuco. Rua
Nunes Machado, 42, Boa Vista. 500050-590 Recife – Pe, Brasil, E-mail: [email protected]
111
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
RESUMO
Geobacillus stearothermophilus UCP 986, isolado de efluente têxtil, foi capaz de se
desenvolver na presença de diferentes concentrações de dibenzotiofeno (DBT),
composto organosulfurado encontrado na queima incompleta de óleo diesel. O
microrganismo foi capaz de utilizar o composto sulfurado num período de 30
horas de fermentação numa temperatura de 55ºC, quebrando suas ligações
carbono-carbono, retirando dele o heteroátomo de enxofre, tornando-o um
composto alifático, de fácil degradação no ambiente.
Palavras chaves: Geobacillus stearothermophilus, dibenzotiofeno, termofílico,
resíduos petroquímicos, diesel.
112
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
1. INTRODUÇÃO
Todos os combustíveis fósseis apresentam em sua composição compostos
orgânicos sulfurados. Na queima destes combustíveis fósseis, em geral, são
lançados no ambiente compostos como o dióxido de enxofre, que causam
poluição do ar e danos à natureza (23). A quantidade de enxofre presente nos
combustíveis está ligada à qualidade de sua matéria prima. Os compostos
orgânicos que apresentam enxofre em sua composição constituem uma pequena
e
importante
fração
nesses
combustíveis,
que
devido
a
sua
baixa
biodegrabilidade, são considerados recalcitrantes (1,12). A presença do elemento
enxofre nos combustíveis é considerada indesejável desde que produzem corrosão
aos equipamentos da refinaria e em sua combustão liberam poluentes na
atmosfera, sendo responsáveis pela formação das chuvas ácidas, entre outros
males aos seres humanos (9, 18, 25).
Considerando o aumento na utilização dos combustíveis fósseis pelos
países industrializados, o que constitui um sério problema ambiental e que se
agrava devido à qualidade das reservas do petróleo serem todas ricas neste
elemento, estudos estão sendo realizados no intuito de reduzir a quantidade de
enxofre
desses
combustíveis
e
conseqüentemente
no
ambiente
(19).
O
dibenzotiofeno (DBT) é um composto organossulfurado heterocíclico, presente no
óleo diesel, e o processo de sua desulfurização é considerado como reação modelo
para os tratamentos dos combustíveis fósseis (15,22).
O tratamento do DBT, a desulfurização, pode ocorrer tanto: físicoquimicamente – hidrodesulfurização, como biologicamente – a biodesulfurização,
que em geral acontece através de microrganismos capazes de utilizar o enxofre
113
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
presente no composto (4,21). O tratamento físico-químico apresenta elevados
custos, entretanto, a alternativa do tratamento biológico vem sendo considerada
como a mais eficaz por conseguir promover a quebra das ligações covalentes das
moléculas orgânicas por microrganismos (28).
Estudos de biodesulfurização vêm sendo desenvolvidos na busca de
microrganismos capazes de utilizar o enxofre presente nos combustíveis; entre
estes microrganismos encontram-se Rhodococcus, Bacillus, Corynebacterium e
Arthrobacter, que agem através de uma via degradativa especifica, onde ocorre a
separação do átomo de enxofre do composto de uma forma que não gera outro
composto recalcitrante, e também sem alterar o combustível quanto a seu valor
carburante. A forma como os microrganismos utilizam o composto DBT ainda não
está estabelecida, sabendo-se que a clivagem das ligações dos compostos podem
ser realizadas por enzimas, como as monooxigenases (1). Alguns gêneros
bacterianos são capazes de transformar o dibenzotiofeno, pelo crescimento em
sua presença, através da utilização como fonte de energia e enxofre. Processos
biológicos de oxidação e redução de compostos sulfurados na biosfera estão
intrinsicamente ligado aos processos de mineralização e imobilização nos ciclos
biogeoquímicos (28).
Segundo Martinez (25), bactérias que oxidam o enxofre utilizam este
elemento no seu estado reduzido, como fonte de energia para o crescimento
quimiolitotrófico, produzindo então sulfato metálico solúvel e ácido sulfúrico.
Para Fujiwara (13), os procariotos utilizam sulfeto de hidrogênio, enxofre, sulfitos,
tiosulfatos e vários politionatos sob condições alcalina, neutras e até ácidas,
sendo o enxofre utilizado em crescimento litotróficos aeróbio ou fototrófico
anaeróbio (11). Além das bactérias, um grande número de microrganismos
114
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
remove o enxofre do DBT através da via degradativa do hidrogênio, que
envolvendo clivagem das ligações carbono-carbono resultando numa redução do
valor carburante. Portanto, essa condição de transformação do DBT, explica a
importância do emprego de microrganismos termofílicos (6, 14, 20, 22).
Neste trabalho foi investigado o potencial de uma nova amostra de
Geobacillus stearothermophilus isolado de efluente têxtil, no processo de
degradação do dibenzotiofeno em condições de termofília.
115
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
2. MATERIAL E MÉTODOS
Microrganismo: foi utilizado G. stearothermophilus UCP 986, isolado de efluente
indústria têxtil, depositada no banco de Culturas do Núcleo em Pesquisas em
Ciências Ambientais – NPCIAMB, da Universidade Católica de Pernambuco –
UNICAP, mantida em tubos de ágar nutriente inclinado (AN) a 4ºC.
Meio de cultura e condições de cultivo: o microrganismo foi cultivado em frascos
de Erlenmeyers de 250 mL de capacidade com 50 mL de meio Luria Bertani (LB)
composto por triptona (10g/L), extrato de levedura (5 g/L), cloreto de sódio (10
g/L), suplementado com glicose (5 mg/mL) segundo Konishi et al.(21). A solução
estoque do DBT (Sigma-Aldrich®) foi preparada em etanol numa concentração de
100 mM (24). Ao meio de cultivo Luria Bertani foi adicionado as seguintes
concentrações 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1 mM do DBT, como fonte de energia,
previamente esterilizado por filtração, e mantido sob agitação orbital (160 rpm) a
temperatura de 55ºC por um período de 30 horas. O crescimento foi medido
turbidez em espectrofotômetro a 660nm. O inóculo correspondeu a 107 células/
mL, numa densidade óptica (D.O660 ) de 0.8, overnight. Alíquotas foram retiradas
a cada 2 horas até as primeiras 12 horas e depois nos intervalos de 24 e 30
horas, onde se determinou a viabilidade celular. Após tempo de cultivo as
amostras foram submetidas à centrifugação de 2500 x g por 15 min a 10ºC, para
separação das células do líquido metabólico. Após a separação, a biomassa foi
liofilizada para determinação de peso seco e do líquido metabólico foi determinado
proteínas totais, consumo de glicose e avaliação da degradação do DBT.
116
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Proteínas totais: a concentração de proteínas totais foi determinada no liquido
metabólico livre
de células, pelo
método espectrofotométrico do Biureto
(LABTEST Diagnostic - Brasil), utilizando como padrão albumina de soro bovino,
lida a espectrofotômetro Genesys® a 545 nm.
Consumo de glicose: o consumo de glicose foi determinado no líquido metabólico
livre de células pelo método colorimétrico (LABTEST Diagnostic - Brasil)
e
medido espectrofotometricamente a 505 nm.
pH: o pH do líquido metabólico livre de células, foi medido em pHmetro Orion,
modelo 310, a cada 2 horas até 12 horas de fermentação, e nos intervalos de 24 e
30 horas.
Viabilidade celular: Foi realizada através da técnica “pour plate” segundo APHA
(3), usando o meio ágar nutriente. A contagem foi realizada com o auxilio de
contador de colônias.
Análises cromatográficas – CLAE: solução de DBT foi analisada através de
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). A análise foi efetuada em
cromatógrafo Varian, consistindo de: coluna Varian C18 (4,6 x 250mm), de fase
reversa, detector UV-VIS modelo 320, sistema de liberação de solvente modelo
210 Varian Star, no comprimento de onda controlado por um software (versão
4.01). A fase móvel consistia de 75% acetonitrila (pureza HPLC) e 25% de tampão
fosfato 10mM (pH 6.0), o eluído foi detectado a 232nm (2). Foram utilizados os
seguintes padrões: soluções de dibenzotiofeno nas concentrações 0, 0.1, 0.2, 0.3,
0.4, 0.5, 0.8 e 1 mM. Os resultados foram expressos em porcentagem de DBT
removido.
117
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Análises cromatográficas – CG/ MS: As estruturas químicas dos metabólicos
formados a partir da degradação do dibenzotiofeno foram analisadas por
cromatografia gasosa (GC – 17 A. Ver. 3 – Shimadzu), acoplada de um
espectrômetro de massas (GC-MS - SHIMADZU - QP5050 A), com relação massa/
carga no intervalo de 40 a 650. A temperatura inicial da rampa de aquecimento
no cromatógrafo foi de 280ºC e a final em 310ºC. O equipamento trabalhou no
modo split, com velocidade linear 36.3 cm/sec. A coluna cromatográfica utilizada
foi a DB – 5 (30X0.257 mm, espessura do filme 0.25µm) . As amostras analisadas
foram obtidas pela extração por solvente do líquido metabólico utilizando acetato
de etila (VETEC®).
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Crescimento e viabilidade celular:
As colônias visualizadas após o período de crescimento com diferentes
concentrações de DBT não mostraram alterações morfológicas, continuando a
apresentar
aspecto
rizóide,
mucilaginoso,
de
tamanhos
e
formas
características. Endosporos não foram visualizados, o que indica que não
houve necessidade de sua formação por não haver condição de estresse
celular.
No controle, o crescimento celular (Figura 1) foi observado até 12 horas de
cultivo, após este período começou nitidamente a fase de declínio do
microrganismo, entretanto, foi detectado o fenômeno de diauxia no tratamento
118
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
controle. Para os tratamentos com dibenzotiofeno aconteceu o inverso desde
que, após o período de “adaptação” (8 horas); o microrganismo continuou a
aumentar sua população, como também a mantê-la, provavelmente devido à
utilização do composto e seus metabólitos como fonte essencial nutricional
(22,20). O Geobacillus stearothermophilus UCP 986 não só manteve-se viável,
como também aumentou sua população na presença do DBT, possivelmente
devido
por este
elemento
ser considerado
essencial
na
formação
de
aminoácidos como cisteína, cistina e metionina, de algumas vitaminas e outros
compostos importantes para a sobrevivência do microrganismo sendo esta
afirmação apoiada pela literatura (7, 17, 19).
A concentração de proteínas totais foi determinada nas amostras de líquido
metabólico livre de células, retirado a cada 2 horas até as 12 primeiras horas
de cultivo, e posteriormente no tempo 24 e 30 horas, quando cessou a
fermentação. A figura 3 mostra que as proteínas produzidas extracelularmente
aumentaram após 8 horas de cultivo. Assim, os microrganismos produziram
uma quantidade expressiva de enzimas para proporcionar a adaptação ao
composto, como também para degradá-lo clivando suas ligações carbonocarbono, e assim reduzindo a compostos menos complexos (6,11).
Comportamento
semelhante
foi
observado
em
Geobacillus
stearothermophilus, inicialmente no período de adaptação ao composto, que
acarretou numa produção de proteínas extracelulares. Na presença de
compostos recalcitrantes, nas primeiras horas de cultivo, os microrganismos
buscam adaptar-se para posteriormente vir a utilizá-los como fonte de energia.
119
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
O consumo da glicose foi expressivo nas primeiras 6 horas de crescimento
como mostra a Figura 2, isto devido à intensa atividade do microrganismo para
se manter viável na presença do composto organosulfurado (DBT), e assim
degradá-lo do meio de cultura. Por ser a glicose uma fonte de energia e
carbono de fácil utilização, esta foi consumida praticamente nas primeiras
horas de fermentação, confirmando que neste período o composto DBT foi
utilizado pelo Geobacillus stearothermophilus, possivelmente, como fonte
energética e até mesmo de enxofre para biossíntese de aminoácidos e
vitaminas.
O pH do meio apresentou um pH inicial foi de 6,6, e ao longo da
fermentação houve uma discreta alteração chegando a 5,4 no final do
experimento. Para Konishi et al. (20), o pH do meio tende a se acidificar devido
à presença de compostos fenólicos oriundos da utilização do DBT pelo
microrganismo. Este fato sugere que houve clivagem das ligações entre o
elemento enxofre e os demais compostos (25,28).
3.2 Processo de degradação do DBT:
A cromatografia líquida de alta eficiência mostrou que G.stearothemophilus
foi capaz de retirar do líquido metabólico livre de células, o composto DBT nas
primeiras horas de fermentação. Os resultados da cromatografia mostram que
após 2 horas de fermentação o DBT foi degradado a 93,43 a 77,46%,
respectivamente, para as concentrações entre 0,2 e 1,0 mM, do líquido
metabólico.
Isto
evidencia
a
capacidade
de
degradação
do
composto
organosulfurado pelo microrganismo sob condições de termofilia.
120
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
A cromatografia gasosa, associada à espectrometria de massas, indicou a
presença
de
produtos
de
metabolização
do
DBT
por
Geobacillus
stearothermophilus nos períodos de 4, 12 e 30 horas de fermentação. Os
metabólitos formados pela degradação do dibenzotiofeno quando analisados
em GC-MS mostram que o átomo de enxofre foi removido do composto da
solução de acetato de etila obtida pela extração por solvente do líquido
metabólico. Esta conclusão deve-se ao fato de não terem sido encontrados, nos
espectros de massa, os picos correspondentes a M+1 e M+2 do íon molecular.
Estes resultados são corroborados por Konishi et al. (1997) (20), os quais
observaram também a diminuição do pH no decorrer da fermentação. Onde
provavelmente, o DBT foi degradado a sulfatos (orgânico e inorgânico) que são
reaproveitados no ambiente e /ou solúveis em água. O cromatograma GC da
amostra colhida após quatro horas de fermentação (Figura 6), apresentou dois
picos principais que totalizaram mais de 80% do material metabolizado. As
análises por espectrometria de massas deste dois picos apresentam espectros
praticamente idênticos, com massa do íon molecular em 90 e os seguintes
picos principais na relação massa/ carga (m/z): 88, 73, 70, 61, 45 e 43 (29).
Estes picos principais correspondem a perda de OH (17), H2O (18), C2H3 (27),
C2H5 (29), sendo o número entre parênteses a massa molecular dos
fragmentos. Com estes dados das fragmentações, as seguintes estruturas
moleculares foram propostas para o íon molecular e os picos principais:
121
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
(m/z)
=
90
CH3CH2CH(OH)CH2OH
ou
CH2(OH)CH2CH2CH2OH
ou
CH3CH(OH)CH2CH2OH ;
(m/z) = 88 CH2=CHCH(OH)CH2OH ;
(m/z) = 73 CH3CH2CH2CH2O e isômeros;
(m/z) = 61 CH(OH)=CHOH ou HOCH=CHOH
(m/z) = 45 CH3CH2O
(m/z) = 43 CH2CH =O
O cromatograma da amostra colhida após 12 horas (Figura 7) de
fermentação, apresentou dois picos principais que totalizaram mais de 98% do
material metabolizado. Os picos apresentaram espectro de massas com m/z do
íon molecular igual a 90 e o próximo pico principal em 73. Este último
corresponde à perda de OH (17), e as prováveis estruturas destes compostos
são as mesmas apresentadas anteriormente.
As estruturas propostas para os compostos presentes na solução de acetato
de etila são bastante oxigenadas (oxidadas), pois se espera que a degradação
do DBT ocorra com a utilização de oxigenases, as quais devem, inicialmente,
romper as ligações C- S- C mais fraca do tiofeno, que após oxidações podem
levar a sulfinatos (R1SO2-) e sulfatos (R1SO3-) orgânicos ou inorgânicos (SO32-;
SO42-) que são solúveis em água , e, portanto, não estariam presentes na
solução de acetato de etila. A oxidação continuada da parte orgânica do DBT
deve levar a compostos alifáticos oxigenados, como os dióis, trióis e epóxidos.
122
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
Os picos no GC (Figura 8) com maiores tempos de retenção que fornecem
espectros de massas com m/z para íons moleculares maiores que 300,
provavelmente referem-se a compostos residuais do meio de cultura,
considerado complexo por apresentar em sua composição extrato de levedura e
triptona.
Estes
resultados
evidenciam
a
capacidade
de
biodegradação
de
G.stearothermophilus no tratamento do dibenzotiofeno sob condições de
termofília, reafirmando que a ação de microrganismos pode constituir prérequisito para implantação do processo de biodesulfurização na refinarias,
quando se usa uma cepa eficiente. A degradação de compostos xenobióticos
por microrganismos termofilicos sob os mesofílicos apresenta uma vantagem
crucial na aplicação em processos biotecnológicos, diminuindo o tempo de
degradação desses compostos e seus custos operacionais.
AGRADECIMENTOS:
Os
autores
agradecem
as
agências
financiadoras
CNPq
(Processos
Nº141158/02-6 e Nº3096610/2003-6), CT-PETRO, FINEP e FACEPE,
pelo
suporte financeiro, e as instituições UNICAP e UFPE.
123
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
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127
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
LISTA DE FIGURAS:
Figura 1: Viabilidade celular do G. stearothermophilus na presença de
concentrações diferentes de DBT (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1mM) durante 30 horas
de cultivo.
Figura 2: Consumo de Glicose pelo Geobacillus stearothermophilus com DBT em
diferentes concentrações (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1mM) durante 30 horas de
cultivo.
Figura 3: Histograma de proteínas totais do G. stearothermophilus com diferentes
concentrações (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1mM) de DBT durante 30 horas de cultivo.
.
Figura 4: Curva do pH durante o crescimento do G.stearothermophilus UCP 986
na presença das diferentes concentrações de DBT (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1mM)
durante 30 horas de cultivo.
Figura 5: Biomassa total do G. stearothermophilus na presença das diferentes
concentrações de DBT (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1mM) durante 30 horas de cultivo.
Figura 6: Espectrograma de massas dos metabólitos formados na degradação do
dibenzotiofeno após 4 horas de cultivo.
Figura 7: Espectrograma de massas dos metabólitos formados na degradação do
dibenzotiofeno após 12 horas de cultivo.
Figura 8: Espectrograma de massas dos metabólitos formados na degradação do
dibenzotiofeno após 30 horas de cultivo.
128
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1 mM
Log (UFC/mL)
10,00
1,00
0
2
4
6
8
10
12
24
30
tempo( horas)
Figura 1. Viabilidade
celular do
G. stearothermophilus
na presença de
concentrações diferentes de DBT (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1mM) durante 30 horas
de cultivo.
129
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1 mM
Glicose (mg/dL)
1000,00
800,00
600,00
400,00
200,00
0,00
0
2
4
6
8
10
12
24
30
tempo( horas)
Figura 2: Consumo de glicose por Geobacillus stearothermophilus UCP 986 com
DBT em diferentes concentrações (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1mM) durante 30 horas
de cultivo.
130
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1 mM
4000,0
(PT mg/dL)
3000,0
2000,0
1000,0
0,0
0
2
4
6
8
10
12
24
30
tempo (horas)
Figura 3: Histograma de proteínas totais de Geobacillus stearothermophilus UCP
986 com diferentes concentrações (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1mM) de DBT durante
30 horas de cultivo.
131
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1 mM
8
pH
6
4
2
0
0
2
4
6
8
10
12
24
30
tempo (horas)
Figura 4: Curva do pH durante o crescimento do G.stearothermophilus UCP 986
na presença das diferentes concentrações de DBT (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1mM)
durante 30 horas de cultivo.
132
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
0,6
biomassa (g)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
DBT (mM)
Figura 5: Biomassa total do G. stearothermophilus na presença das diferentes
concentrações de DBT (0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 e 1mM) durante 30 horas de cultivo.
133
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
A
B
C
Figura 6: Espectrograma de massas (principal-A, M+1-B, M+2-C) dos metabólitos
formados na degradação do dibenzotiofeno (DBT) após 4 horas de cultivo de
G.stearothermophilus UCP 986.
134
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
A
B
Figura 7: Espectrograma de massas (principal-A, M+1-B, M+2-C) dos metabólitos
formados na degradação do dibenzotiofeno (DBT) após 12 horas de cultivo de
G.stearothermophilus UCP 986.
135
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
A
B
C
Figura 8: Espectrograma de massas (principal-A, M+1-B, M+2-C) dos metabólitos
formados na degradação do dibenzotiofeno (DBT) após 30 horas de cultivo de
G.stearothermophilus UCP 986.
136
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
CONCLUSÕES GERAIS
1º ARTIGO:
- Os microrganismos isolados do solo do Porto do Recife, de efluente e lodo
de indústria têxtil foram identificados como: Bacillus e Geobacillus;
- Bacillus licheniformis e Geobacillus stearothermophilus apresentam
habilidade para se desenvolver em condições adversas de temperatura e
salinidade, mostrando características biotecnológicas importantes e viáveis em
tratamentos de compostos xenobióticos;
- Bacillus licheniformis e Geobacillus stearothermophilus apresentam
similaridade
entre
os
grupos
estudados
nas
diversas
características
morfofisiológicas e bioquímicas. Os isolados foram agrupados em dois grupos,
diferenciados pela temperatura e a variável produção de oxidase.
2º ARTIGO:
- Ao reduzir ou manter a temperatura de incubação a concentração do
cobre em seu nível inferior induz a produção de biossurfactante e o aumento da
biomassa por G. stearothermophilus UCP 986;
- O aumento da concentração salina acima do seu nível superior (50g/L),
não causa inibição na formação de biomassa e na produção do biossurfactante;
-
Geobacillus
stearothermophilus
mostra-se
como
produtor
de
biossurfactante em condições adversas com alta redução da tensão superficial;
- O biossurfactante produzido sugere seu emprego no tratamento de
efluentes petroquímicos ou de ambientes aquáticos em geral.
137
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
3º ARTIGO:
- O novo isolado de Geobacillus stearothermophilus UCP 986 é capaz de
produzir compostos de superfície ativa durante seu crescimento, tendo glicose
como substrato, em condições de termofília.
- Os polímeros produzidos demonstram ação emulsificante apresentando
características preliminares de um surfactante ideal para tratamento de resíduos
de indústrias ou refinarias;
- O biossurfactante produzido por G.stearothermophilus UCP 986, em
condições de termofília e halofilia, evidencia a habilidade de sobrevivência em
ambientes extremos;
- A nova amostra de G.stearothermophilus UCP 986 é um excelente
candidato nos tratamentos “in situ” como o MEOR (melhoramento de recuperação
de óleos).
4º ARTIGO:
- G.stearothermophilus UCP 986, em condições de termofilia é capaz de
degradar o dibenzotiofeno -DBT, em um período de 30 horas de fermentação,
transformando em composto alifáticos de fácil aproveitamento no meio ambiente;
- As reações de oxidação do DBT, tornaram o pH do meio de cultura
levemente ácido, indicando a remoção do átomo de enxofre do composto
organosulfurado pelo G.stearothermophilus;
- Os produtos de degradação do DBT podem ser facilmente mineralizados
no meio ambiente;
-
Os
resultados
sugerem
a
aplicação
da
nova
amostra
de
G.stearothermophilus no tratamento de efluentes de refinarias de petróleo.
138
Paz, M.C.F – Identificação e Caracterização de Bacillus licheniformis e.........
ANEXOS
139