COMPARAÇÃO DE MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA DE

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COMPARAÇÃO DE MÉTODOS DE EXTRAÇÃO DE DNA DE BACTÉRIAS
ESPORULADAS DE INTERESSE NA CADEIA DO LEITE
Bruna Fritegoto Soares, Vaneli Beloti, e-mail:[email protected]
Universidade Estadual de Londrina/Departamento de Medicina Veterinária
Preventiva
Medicina Veterinária/ Inspeção de Produtos de Origem Animal
Palavras-chave: Extração, esporos e 16S rRNA
Resumo
Bactérias esporuladas são de grande importância no processo de deterioração do
leite. A identificação desses micro-organismos no leite é de essencial importância
para sabermos a origem de contaminação, para isso há análises que se baseiam na
sequência de nucleotídeos após a amplificação de determinado fragmento de DNA.
O objetivo desse trabalho foi determinar metodologias rápidas e eficientes de
extração de DNA de bactérias esporuladas. Observou-se nesse estudo que o
método de fervura simples demonstrou a mesma eficiência quando comparado com
o kit comercial, ambos apresentaram resultados satisfatórios na PCR tanto para o
gene rpoB quanto para 16S rRNA.
Introdução e objetivos
A contaminação do leite cru por esporos bacterianos é originária do solo, alimentos
dos animais, água, fezes, tetos e equipamentos de ordenha. Para a identificação
desses micro-organismos esporulantes que causam a contaminação do leite, o DNA
deve ser extraído das células de bactérias para que possa ser amplificado na
Polymerase Chain Reaction (PCR) e sequenciado.
Métodos rápidos e menos laboriosos para a análise desses microorganismos podem auxiliar na identificação e caracterização biomolecular desses
micro-organismos no Brasil.
O objetivo geral do trabalho é verificar a eficiência dos métodos de extração
de DNA disponíveis na literatura para os micro-organismos esporulados com
atividade deteriorante do leite.
Procedimentos metodológicos
Foram avaliadas a eficiência de cinco diferentes métodos de extração de DNA
genômico de micro-organismos. Os micro-organismos esporulados foram
selecionados na bacterioteca do Laboratório de Inspeção de Produtos de Origem
Animal (LIPOA) da Universidade Estadual de Londrina.
As cepas que anteriormente estavam congeladas, foram repicadas para ágar
leite (Acumedia, Baltimore, USA) suplementado com solução estéril de leite em pó
desnatado reconstituído à 10% na proporção de 9:1 e em ágar tributirina (Himedia,
Mumbai, India) suplementado com tributirina (Himedia, Mumbai, Índia) na proporção
de 99:1.
As colônias de bactérias formadoras de esporos que apresentaram atividade
proteolítica e/ou lipolítica foram cultivadas em caldo cérebro coração (BHI)
(Acumedia, Baltimore, USA) por 24 horas a 35ºC para extração de DNA.
Na preparação das cepas para verificação da pureza, os caldos foram
semeados por esgotamento em placas contendo ágar padrão.
Uma colônia de cada micro-organismo foi repicada novamente em outro tubo de
caldo BHI.
Foram utilizados cinco protocolos de extração de DNA senso denominados
de método A- fervura simples (estudo proposto), B- Extração com precipitação com
partículas de sílica (BOOM et al. 1990), C- lise em micro-ondas (BOLLETet al. 1955),
D- lise em fenol sem precipitação de DNA (CHENG e JIANG 2006) e E- Kit comercial
(ChargeSwitch® gDNA Mini Bacteria Kit (invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Para as análises foi realizada a amplificação parcial do gene 16S rRNA
(1500 pb) por Polymerase Chain Reaction (PCR). A amplificação foi realizada em
termocilador (AerisTM Thermal Cycler, Esco® Micro Pte, Singapore).
Para visualização da PCR as amostras amplificadas foram aplicadas em gel
de agarose 1% (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA. Os géis foram corados em solução
de brometo de etídio a 0,2 µg/mL por 20 min e visualizados em transiluminador UV.
Resultados e discussão
Diante dos resultados quantitativos obtidos podemos observar uma grande variação
nos resultados apresentado por todos os métodos de extração. Nos resultados
apresentados no PCR, observamos que o método de extração por fervura simples e
o método de extração por kit comercial os resultados foram muito satisfatórios e
semelhantes, tanto por rpoB (740pb) quanto por 16S rRNA (1465pb), podendo ser
melhor observado na figura 1 e 2.
A extração de DNA pelo método de precipitação com partículas de sílica
demonstrou melhor proporção de 260/280 sobre a pureza do DNA extraído e melhor
coeficiente de correlação entre os métodos quantitavos. Entretanto quando se
observa os resultados da PCR para o mesmo método de extração vemos que não
foi eficaz para extração de DNA de todas as bactérias esporuladas que compõe a
microbiota do leite, sendo apenas eficiente para as espécies L. massiliensis, B.
licheniformis e Paenibacillus sp. Entre os testados.
Isto pode estar relacionado com a composição da parede celular dos
microrganismos Gram-positivos de microbiota esporos do leite, que tem
peptidoglicano responsável por uma maior rigidez à parede das bactérias gramnegativas microorganismos que facilmente ter a sua célula paredes interrompido por
ebulição.
No estudo podemos observar no PCR em ambos os genes amplificados que
o método de extração de DNA por fervura foi muito eficaz para bactérias grampositivas, ou seja, este é um método rápido, barato e fácil de executar, e provou ser
eficaz para estudos moleculares deste microorganismos esporulados da microbiota
do leite.
Conclusão
Conforme o estudo proposto o método de extração por fervura simples comprovou
ser eficaz tanto quanto o kit comercial, ambos apresentaram resultados satisfatórios
na PCR tanto para o gene rpoB quanto para 16S rRNA.
A
740 pb
B
740 pb
Figura 1. Resultados do PCR utilizando o gene rpoB (740pb) sendo a (A) o kit comercial e
(B) fervura simples. Linha 1: DNA marcador; 2: Bacillus sp.; 3: Lysinibacillus massiliensis; 4:
Bacillus licheniformis; 5: Bacillus sp.; 6: Bacillus sporothermodurans; 7: Bacillus pumilus; 8:
Paenibacillus sp.; 9: Paenibacillus sp.; 10: Bacillus circulans; 11: Bacillus licheniformis; 12:
Brevibacillus borstelensis; 13: controle negativo.
Figura 2. Resultados do PCR do gene 16S rRNA (1465pb) extraídos da microbiota
esporulada do leite pelo método (a) kit comercial e (B) fervura. Linha 1: DNA marcador; 2:
Bacillus sp.; 3: Lysinibacillus massiliensin; 4: Bacillus licheniformi; 5: Bacillus sp; 6: Bacillus
sporothermodurans; 7: Bacillus pumilus; 8: Paenibacillus sp.; 9: Paenibacillus sp.; 10:
Bacillus circulans; 11: Bacillus licheniformis; 12: Brevibacillus borstelensis; 13: controle
negativo.
Referências bibliográficas
BELOTI, V. Leite: Obtenção, Inspeção e Qualidade (1ª ed.), Londrina: Editora Planta,
417 p., 2015.
BOOM, R.; SOL, J.S.; SALIMANS, M.M.; JANSEN, C.L.; WERTHEIM-VAN, P.M.;
NOORDA, J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of
Clinical Microbiology, v.28, n 3, p. 495-503, 1990.
CHENG, H.R.; JIANG, N. Extremely rapid extraction of DNA from bacteria and
yeasts. Biotechnology Letters v. 28, p. 55-59, 2006.
PEREIRA, J.R.; TAMANINI, R.; RIOS, E.D.; OLIVEIRA, V.H.S.; YAMAMURA,
A.A.M.; BELOTI, V. Microbiota mesophilic aerobic contaminant UHT milk. Revista do
Instituto de Laticínios Cândido Tostes, Juiz de Fora, v. 68, p. 25-31, 2013.
RIBEIRO JÚNIOR, J.C.; ALCÂNTARA, B.K.; BELOTI, V. Spoilage potential of
Paenibacillus sp. in Brazilian raw milk. Ciência Rural, Santa Maria, v. 46, n. 4, p. 637640, 201
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