sobrevivência ou morte: o dilema do linfócito maduro exposto à

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SOBREVIVÊNCIA OU MORTE: O DILEMA DO
LINFÓCIT
O MADUR
O EXPOS
TO À OU
ABAÍNA
LINFÓCITO
MADURO
EXPOST
OUABAÍNA
M ABEL B ARBOSA E STEVES
O TTÍLIA R ODRIGUES A FFONSO -M ITIDIERI
V IVIAN M ARY R UMJANEK
Resumo: A ouabaína, um potente inibidor da Na+,K+-ATPase, é um esteróide
extraído das sementes e raízes de algumas plantas da família Apocynaceae. Em
1991, foi descoberta no plasma humano uma substância indistinguível da
ouabaína extraída de vegetais, e a partir de então iniciou-se uma investigação
mais detalhada sobre seu papel endógeno. Linfócitos ativados por lectinas
mitogênicas apresentam mudanças no potencial de membrana, proliferação e/
ou morte celular induzida por ativação (AICD). Baixas concentrações de ouabaína
suprimem a proliferação induzida por mitógenos e aumentam a morte celular. O
objetivo desta revisão é discutir os mecanismos envolvidos, visto que, apesar de
inibir a proliferação de linfócitos ativados por mitógenos, a ouabaína é capaz de
aumentar a expressão da molécula de superfície CD69 (característica por se
apresentar precocemente em situações de ativação celular), indicando que a
célula foi estimulada; porém, esta não consegue prosseguir no ciclo celular, onde
observa-se um bloqueio na transição das fases G1-S com aumento das células
hipodiplóides característico de morte celular por apoptose. É possível que o
efeito inibitório da ouabaína em linfócitos de sangue periférico humanos ativados
envolva a potencialização de alguns aspectos do processo apoptótico e reflita
uma exacerbação do mecanismo AICD.
Palavras-chave: Linfócitos; Ouabaína; Proliferação Apoptose.
Abstract: Ouabain, a potent inhibitor of Na+,K+-ATPase pump, is a steroid obtained
from seeds of some Apocynaceae. In 1991, Hamlyn´s group succeeded in isolating
a sufficient quantity of an ouabain-like compound from human plasma, which
was identical to ouabain from plants. The existence of an endogenous ouabain
led to need of a more detailed investigation of its physiological role. Lymphocytes
activated by mitogenic lectins can exhibit changes in transmembrane potential,
proliferation and/or activation induced cell death (AICD). Low concentrations of
ouabain suppress mitogen-induced proliferation and increase cell death. The
aim of this work is to understand the mechanisms involved because ouabain is
capable of modifying immune responses by inhibiting lymphocyte proliferation
induced by mitogens and is able to increase the expression of CD69, which
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134 SOBREVIVÊNCIA OU MORTE
usually presents an early expression during cell activation indicating that the cells
must perceive the stimulus, but do not proceed in cell cycle. There was a block in the
transition from G1 to S phases of the cell cycle with an increase in the amount of
hypodiploid cells, characteristic of cell death. It is possible that the inhibitory effect
of ouabain on activated peripheral blood lymphocytes involves the potentiation of
some of the steps of the apoptotic process and reflects an exacerbation of the
mechanism of AICD.
Key-words: Linfócitos; Ouabaína; Proliferation Apoptose.
1 OUABAÍNA
A ouabaína é um glicosídeo extraído das cascas e raízes da árvore do gênero Ouabaio
(Acocanthera ouabaio) e de sementes do gênero Strophanthus (S. gratus e S. kombé),
ambos pertencentes à família das Apocynaceae, as quais contêm a G-estrofantina.
Os glicosídeos compõem uma classe de compostos orgânicos derivados de plantas,
usados como agentes terapêuticos desde o ano 1250 por médicos galeses. São
também os únicos inibidores específicos da adenosina-trifosfatase dependente de
Na+ e K+ (Na+,K+-ATPase), em baixas concentrações (10-7 a 10-9 M) (GOTO; cols.,
1992).
A ouabaína é um composto hidrofílico, formado a partir da união de um
esteróide (ouabagenina) e um açúcar (ramnose) por uma ligação glicosídica (Figura
1).
Figura 1. Estrutura química da ouabaína. Retirado de KEENAN e cols.,
2005.
Em 1942, Wood e Moe demonstraram que o efeito cardiotônico dos
digitálicos estaria associado com a perda do potássio intracelular (WOOD; MOE,
1942 apud BLAUSTEIN, 1993). Alguns anos mais tarde, Schatzmann fez uma
importante observação sobre o fato de os esteróides cardiotônicos serem inibidores
DIÁLOGOS & CIÊNCIA - REVISTA DA REDE DE ENSINO FTC.
Ano II, n. 7, dez. 2008
135
potentes e seletivos da bomba de Na+ (SCHATZMANN, 1953, apud BLAUSTEIN,
1993).
Um grande avanço na compreensão da bomba de Na+,K+ ocorreu a partir
da descoberta, em 1957, de uma enzima expressa na membrana de muitas células
eucarióticas, que hidrolisa ATP a ADP e fosfato e requer Na+ e K+ para ter atividade
máxima (SKOU, 1957; PORTIUS; REPKE, 1961; SKOU, 2004). Tal fato foi confirmado
por Charnock e Post que mostraram, pela primeira vez, o mecanismo de inibição da
Na+,K +-ATPase por ouabaína, através da ligação desta aos intermediários
fosforilados da enzima, formados durante seu ciclo catalítico (CHARNOCK; POST,
1963).
A afinidade muito grande da Na+,K+-ATPase pelos glicosídeos sugeriu que
poderia haver um ligante endógeno de estrutura semelhante. Essa afinidade devese à existência de um sítio de ligação de glicosídeos na subunidade a da enzima (a
Na+,K+-ATPase é composta minimamente por duas subunidades, a-catalítica e breguladora – SKOU, 2004). A partir desta informação, Kelly e Smith (1989) sugeriram
que a Na+,K+-ATPase seria capaz de funcionar tanto como uma proteína efetora
quanto receptora, reconhecendo e ligando fatores extracelulares e, a partir daí,
gerar um sinal intracelular.
A existência de um composto endógeno similar aos digitálicos foi proposta
inicialmente por Ringer, em 1885, e depois por Rein, em 1942 (LaBELLA, 1985;
HINSON, DAWNAY; RAVEN, 1995). Tal fato foi confirmado somente em 1991, através
de estudos feitos por Hamlyn e seu grupo, que detectaram no plasma humano uma
substância estruturalmente, biologicamente e imunologicamente idêntica à ouabaína
extraída de plantas. Essa ouabaína endógena é produzida pela adrenal, hipófise e
hipotálamo (DORIS; STOCCO, 1989; YAMADA, IHARA; SANO, 1987; TYMIAK; e cols.,
1993; FERRANDI e cols., 1997).
2 O EFEITO DA OUABAÍNA SOBRE AS CÉLULAS DO
SISTEMA IMUNE
2.
1 U
ma q
uestão de sobre
vivência
2.1
Uma
questão
sobrevivência
Devido ao seu uso de origem na clínica, o papel da ouabaína foi mais
estudado em células cardíacas e renais, e pouco estudado em outros tecidos.
Linfócitos maduros de sangue periférico têm aproximadamente 43.000 sítios de
ligação à ouabaína por célula (PEDERSEN; KLITGAARD, 1983, apud ECHEVARRIALIMA; RUMJANEK, 2006). No entanto, sob um estímulo mitogênico qualquer, há um
aumento na síntese de moléculas de Na+,K+-ATPase, além de um aumento na sua
atividade, ocorrendo uma mudança conformacional que aumenta sua afinidade
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136 ELETROESTIMULAÇÃO NEURO-
pela ouabaína (MARAKHOVA; COLS, 2005, APERIA, 2007). Por outro lado, na
presença de um estímulo, a ouabaína atua como uma potente inibidora da
proliferação linfocitária (QUASTEL; KAPLAN, 1968; MORAES e cols., 1989; OLEJ e
cols, 1998; ESTEVES, 2002). Em contrapartida, a ouabaína, por si só, não é
capaz de interferir na viabilidade dessas células. Em alguns sistemas, como em
células ganglionares da retina e outros sistemas neurológicos, ou ainda em células
endoteliais de veias umbilicais, esse esteróide é capaz de induzir, em
concentrações muito baixas, a sobrevivência dessas células (CORRÊA e cols.,
2005; GOLDEN; MARTIN, 2006; TREVISI e cols., 2004).
Um dos primeiros trabalhos a demonstrar a ação inibitória dessa droga
em linfócitos surgiu no final da década de 60. Quastel e Kaplan (1968), sabendo
que a ouabaína era capaz de inibir o transporte de Na+ e K+, observaram linfócitos
de sangue periférico na presença de fitohemaglutinina (PHA) e verificaram que a
ouabaína, em uma concentração de 1mM, era capaz de inibir completamente a
proliferação linfocitária induzida por aquele mitógeno. Entretanto, o excesso de
K+ extracelular era capaz de diminuir ou mesmo evitar o efeito dessa droga.
Outros autores, como Stoeck, Northoff e Resch (1983), demonstraram que a
ação inibitória de ouabaína sobre a proliferação linfocitária induzida por PHA
interferia com a produção e a ação da Interleucina-2 (IL-2) (DORNAND e cols.,
1986; SZAMEL e cols., 1995; ESTEVES, 2002). A ouabaína é capaz de inibir a
proliferação de linfócitos, induzida não só por mitógenos, mas, também, pelo
éster de forbol TPA (OLEJ e cols., 1994; BRODIE e cols., 1995; ESTEVES, 2002),
ionomicina (BRODIE e cols., 1995), anti-CD3 (SZAMEL e cols., 1995), ionóforo de
cálcio (JENSEN, WINGER; NOWELL, 1977) e reações mistas de linfócitos préativados (MLR) (ROY e cols., 1985; ESTEVES, 2002). Brodie e seu grupo
demonstraram que a inibição da proliferação produzida por ouabaína é similar
em linfócitos T CD4+ e T CD8+ (1995).
A ação dessa droga também foi testada sobre a função celular de células
citotóxicas. Estudos demonstraram que, apesar de a ouabaína inibir a resposta
proliferativa a diferentes estímulos, não era capaz de inibir a atividade citotóxica
de células NK (natural killer cells) (MORAES e cols., 1989) e células LAK
(lymphokine-activated killer cells) (OLEJ e cols, 1994).
Estudos posteriores (PIRES e cols., 1997; ESTEVES, 2002) demonstraram
ainda que, apesar de não proliferarem, as células ativadas por PHA, na presença
de ouabaína, eram capazes de expressar CD69, uma molécula que é expressa
precocemente e está relacionada ao processo de ativação celular (AUSSEL,
1996), sugerindo que as células percebem o estímulo, mas não são capazes de
prosseguir no ciclo celular.
Qualquer célula, para entrar no processo de divisão, tem que progredir
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137
através do ciclo celular. Para a célula passar da fase G1 para S, onde há um check
point, é necessário um fator de progressão, que no caso do linfócito é basicamente
a IL-2. A progressão se dá no final de G1 pela expressão de receptores de IL-2
(CD25) e síntese da interleucina, que se liga ao seu receptor de forma autócrina
ou parácrina. A inibição da expressão de CD25 e da síntese de IL-2 impediria
essa transição. Já foi descrito que a ouabaína inibe a síntese de IL-2 (DORNAND
e cols., 1986; SZAMEL e cols., 1995) assim como a expressão de CD25
(DORNAND e cols., 1986; OLEJ e cols., 1994). Corroborando essas observações,
foi verificado que ouabaína inibe a progressão G1-S nas linhagens leucêmicas
M07 e MEG-01 (WANG e cols., 2007) e em linfócitos estimulados por PHA (BRODIE
e cols., 1995; PIRES e cols., 1997; ESTEVES, 2002) (Figura 2)
Ausência de OUA
Presença de OUA
Controle
OUA 100 nM
PHA 5ug/ml
PHA 5ug/ml + OUA
Figura 2
2. Efeito de ouabaína na progressão do ciclo celular de linfócitos
ativados por PHA em 72 horas. Retirado de ESTEVES, 2002.
Legenda: • Sub-G1 • G1 • S • G2
Vários estudos demonstraram que durante a fase G1, dependendo do
estímulo, a célula é capaz de deflagrar a proliferação, a diferenciação, ou uma
ativação funcional que resultará em atividades efetoras específicas, ou ainda
acionar o seu próprio processo de morte celular (apoptose). Na Figura 2, é possível
observar a presença de células hipodiplóides em culturas ativadas por PHA na
presença de ouabaína, sugerindo um processo apoptótico em andamento, pois
durante o processo de apoptose ocorre fragmentação de DNA com perda de
material nuclear, o que estaria de acordo com os resultados de Olej e
colaboradores (1998). Esse grupo relatou um aumento de mRNA para c-Myc em
linfócitos humanos estimulados com PHA na presença de ouabaína. Por outro
lado, Esteves (2006) observou que os níveis de c-Myc das células ativadas por
PHA estavam aumentados, mas a adição de ouabaína não foi capaz de modificar
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138 ELETROESTIMULAÇÃO NEURO-
esse aumento. É possível que o aumento de mRNA não se reflita na estabilidade
da proteína ou na expressão da proteína funcional. Outros autores, utilizando
modelos diversos, mostraram uma correlação entre expressão de c-Myc e indução
de apoptose (ADHIKARY; EILERS, 2005; FACCHINI; ; PELENGARIS; KHAN, 2003;
PENN, 1998).
2.2 Um indutor de morte celular
A apoptose, previamente conhecida como um mecanismo ativo de morte
celular programada, é um modelo de suicídio celular, geneticamente regulado,
que possui um papel vital durante a embriogênese, desenvolvimento e
homeostase tecidual (STELLER, 1995; McCONKEY; ORRENIUS, 1994). Apresenta
características bioquímicas e morfológicas próprias, tais como degradação de
proteínas, alterações na assimetria da membrana plasmática lipídica, com
diminuição do volume celular, ruptura do citoesqueleto e alterações na
permeabilidade da membrana, além de despolarização das mitocôndrias e
condensação e fragmentação da cromatina nuclear. Esse processo também
ocorre em situações patológicas. Estas células são então fagocitadas, sem
ocasionar resposta inflamatória local (ALBERTS e cols., 2002; KERR e cols., 1972;
WYLLIE e cols., 1980).
Diversos estímulos internos e externos podem iniciar a apoptose através
de um complexo de transdução de sinais dependentes de caspases (Figura 3 a
e b).
Extracelular
Estímulo de
morte
Membrana
citoplasma
Mitocôndria
Mitocôndria
Mitocôndria
Apoptose
Célula T
Apoptose
Célula alvo
Núcleo
Fragmentação
de DNA
Cascata de
caspases
Figura 3. a. Esquema simplificado de morte celular por apoptose,
envolvendo a via extrínseca Fas/FasL. Adaptado de BRUNNER, T.
b: Esquema de morte celular por apoptose, envolvendo a via intrínseca
da mitocôndria. Retirado de http://www.mitosciences.com/apoptosis.html em
19/09/2008.
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Ano II, n. 7, dez. 2008
139
O mecanismo de morte por apoptose vem sendo amplamente estudado
em diferentes sistemas, com prevalência no sistema nervoso central em
desenvolvimento, onde diversos neurônios morrem assim que são formados
(GORMAN, ORRENIUS e CECCATELLI, 1998) e também no sistema imune, incluindo
timócitos e linfócitos (GORMAN, ORRENIUS e CECCATELLI, 1998; RAFF, 1992;
WESSELBORG; KABELITZ, 1993). Anner e cols. (1994) descreveram que linfócitos
tratados com a isoforma da ouabaína endógena produzida no hipotálamo morriam
por apoptose.
A morte celular por apoptose pode seguir através da via intrínseca ou
extrínseca, dependendo dos sinais que receber. A via extrínseca, capaz de induzir
apoptose, caracteriza-se pela ativação de receptores de morte, após a ligação
com seu ligante. No sistema imune, a apoptose fisiológica de linfócitos ativados
é importante e necessária, e ocorre através de um processo conhecido como
AICD (activation-induced cell death). Esse processo é precedido pela expressão
do receptor de morte Fas (CD95) e seu ligante Fas-L, seguido da interação de
ambos na superfície celular (NAGATA; GOLSTEIN, 1995; GREEN, DROIN; PINKOSKI,
2003). A expressão de Fas-L é regulada por c-Myc (GENESTIER e cols., 1999;
KASIBHATLA, 2000; BRUNNER e cols., 2000), visto que o promotor de Fas-L
pode ser ativado por superexpressão de c-Myc e inibidores funcionais de myc
inibem a transcrição de Fas-L (BRUNNER e cols., 2000).
Apesar de não haver encontrado um aumento significativo de c-Myc,
Esteves e colaboradores (2005) estudaram a possibilidade de que a apoptose
induzida por ouabaína em linfócitos ativados fosse resultado da superexpressão
de Fas-L e perceberam que tanto o receptor Fas (CD95) quanto o seu ligante FasL estão aumentados durante o estímulo, porém a ouabaína não foi capaz de
interferir com essa expressão. No entanto, através da externalização de fosfatidil
serina, constataram que linfócitos ativados por PHA morrem por apoptose e que
a utilização de um anticorpo anti-Fas aumenta ainda mais a sensibilidade à
morte pela via extrínseca de linfócitos ativados expostos à ouabaína.
Outra característica da morte celular por apoptose é a diminuição de
volume celular. A submissão de linfócitos ativados à presença de ouabaína mostra
uma redução do volume, sendo mais um indício de favorecimento à apoptose
(ESTEVES, 2006) (Figura 4). A regulação de volume celular é um processo
complexo e não totalmente compreendido, envolvendo a homeostase de íons
intracelulares como cloreto, sódio e potássio (BORTNER e cols., 2001;
DALLAPORTA e cols., 1998; SZABÒ e cols., 1998). Em linfócitos existe uma
regulação da diminuição de volume (RVD – regulatory volume decrease) que
envolve a ativação de canais aniônicos, produzindo uma despolarização e a
abertura de canais de potássio ativados por voltagem. Isso produz uma perda de
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KCl, diminuindo a osmolaridade intracelular e levando à perda de água pela
célula (BORTNER; CIDLOWSKI, 1996; BORTNER, HUGHES; CIDLOWSKI, 1997).
Alguns autores descreveram que a sinalização através de Fas/Fas-L ativa o canal
retificador de cloreto (ORCC- outwardly rectifying chloride channel) (SZABÒ e
cols., 1998) e que isso é mediado pela tirosina cinase p56lck (LEPPLE-WIENHUES
e cols.,1998). Além disso, bloqueando a regulação de volume por esses canais,
é possível resguardar essas células da morte por apoptose (MAENO e cols.,
2000; SZABÒ e cols., 1998). Em adição à redução de volume celular, a ativação
da via Fas/Fas-L utilizando um anticorpo anti-Fas também produz perda de K+ e
inibição da Na+K+-ATPase (BORTNER, GÓMEZ-ANGELATS; CIDLOWSKI, 2001).
Quando esses autores utilizaram anti-Fas e ouabaína ao mesmo tempo,
observaram uma potencialização da diminuição de volume celular semelhante
ao encontrado por Esteves e colaboradores (2005).
Controle OUA
PHA
PHA + OUA
Figura 4. Morfologia celular de linfócitos de sangue periférico após 6h
em cultura. OUA = ouabaína 100nM e PHA = fitohemaglutinina 5mg/ml. Retirado
de Esteves, 2006
Bortner e colaboradores (2001) já haviam descrito em células tumorais
Jurkat que anti-Fas era capaz de inibir a Na+,K+-ATPase, causando assim a
despolarização da membrana plasmática. Também demonstraram que esse
efeito poderia ser potencializado pela ouabaína, produzindo um aumento da
apoptose dessas células (BORTNER e cols., 2001; NOBEL e cols., 2000, XIONG e
cols., 2006). Em uma situação mais fisiológica, em linfócitos estimulados a
proliferar, alguns dos quais morrerão por AICD, já foi descrita uma despolarização
da membrana plasmática (MANN e cols., 2001; ESTEVES e cols., 2005). Essa
despolarização inicial parece ser resultado da inibição da Na+,K+-ATPase, e é
compensada mais tarde por um aumento na síntese dessa proteína (MARAKHOVA
e cols., 2005). Apesar da ouabaína sozinha, na concentração de 100nM, não ser
capaz de despolarizar os linfócitos, de forma semelhante ao que foi descrito por
Bortner e colaboradores (2001), essa concentração foi capaz de produzir um
sinergismo com a despolarização produzida por PHA (ESTEVES, 2005). Estudos
DIÁLOGOS & CIÊNCIA - REVISTA DA REDE DE ENSINO FTC.
Ano II, n. 7, dez. 2008
141
in vitro mostraram que níveis elevados de ouabaína, a partir de 1mM, causam
despolarização da membrana plasmática de timócitos, aumentando ainda mais
os efeitos dos glicocorticóides (MANN e cols., 2001; ECHEVARRIA-LIMA e cols.,
2003, RODRIGUES-MASCARENHAS e cols., 2008)
A via intrínseca da morte celular por apoptose está relacionada com a
via mitocondrial e envolve estímulos como stress oxidativo, agentes intercalantes
de DNA, radiação ionizante ou isquemia. As moléculas que conduzem esses
estímulos de morte para a mitocôndria são aquelas pertencentes à família de
Bcl-2 (WILLIS e cols., 2003; DONOVAN e COTTER, 2004; SCHINZEL, KAUFMANN
e BORNER, 2004). Após a recepção dos sinais pró-apoptóticos, as mitocôndrias
liberam várias proteínas apoptogênicas para o citosol, entre elas o citocromo c e
Smac/Diablo. A partir daí, a cascata de ativação das caspases é deflagrada,
culminando na morte por apoptose (DONOVAN e COTTER, 2004).
Alguns autores descreveram que o colapso mitocondrial é um dos
primeiros eventos que antecedem a apoptose, sendo então responsável pelo
fenômeno. Dallaporta e colaboradores (1998) demonstraram que a perda do K+
citosólico ocorre antes mesmo da despolarização mitocondrial, liberação do
citocromo c e ativação das caspases, sendo crucial para a ativação das
endonucleases. Entretanto, a perda do potencial da membrana mitocondrial só
ocorreu quando as células ativadas estavam em presença de ouabaína, ainda
assim de forma tardia, sugerindo ser esse, um efeito da apoptose e não a causa
(ESTEVES, 2005). Em cultura de células de eritroleucemia humana K562, foi
verificado que a ouabaína, por si só, não é capaz nem de modificar o status da
mitocôndria, em células de eritroleucemia humana, K562 (MARQUES-SANTOS,
COQUEIRO e RUMJANEK, 2006), nem de reduzir o potencial de membrana
mitocondrial de sinaptossomas, apesar de promover uma ligeira redução no
potencial de membrana plasmática tanto em sinaptossomas (SCOTT e NICHOLLS,
1980) quanto em linfócitos (WILSON e CHUSED, 1985). Apesar disso, Bortner e
colaboradores demonstraram que a inibição da Na+,K+-ATPase por ouabaína
promove a despolarização da membrana plasmática e apoptose em células
Jurkat e timócitos (BORTNER, GÓMEZ-ANGELATS e CIDLOWSKI, 2001; MANN e
cols., 2001).
3 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O fato de a ouabaína ser um esteróide endógeno, podendo ser liberado
em situações fisiológicas, levanta a possibilidade de que essa substância fosse
capaz de afetar muitos outros sistemas, além do cardíaco e do renal, que são os
sistemas estudados com o uso farmacológico da droga.
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142 ELETROESTIMULAÇÃO NEURO-
Existem várias evidências (BRODIE e cols., 1995; ESTEVES, 2002; PIRES
e cols., 1997) de que a ouabaína é capaz de inibir a progressão de linfócitos
ativados no ciclo celular, embora seja capaz de apresentar alguns sinais de
ativação como, por exemplo, a expressão de CD69 (PIRES e cols., 1997; ESTEVES,
2002), e de não duplicarem o seu DNA. A expressão dessa molécula sugere que
o linfócito ativado percebe o estímulo, apesar de não conseguir prosseguir no
ciclo celular. Por outro lado, evidências mostraram que à ouabaína induzia a
morte por apoptose em linfócitos ativados (OLEJ e cols., 1998, ESTEVES e cols.,
2005), o que também foi verificado por outros autores em células Jurkat (ORLOV
e cols., 1999).
Através do mecanismo AICD, células ativadas percorrem algumas etapas
antes de morrerem por apoptose. A apoptose em células ativadas pode ser
exacerbada por ouabaína, sugerindo que esse glicosídeo seja capaz de amplificar
o processo de morte já existente: redução no volume celular, externalização de
fosfatidilserina e, em seguida, despolarização da membrana plasmática. Ao
mesmo tempo, c-Myc irá aumentar a expressão de Faz-L, que por sua vez se
ligará ao receptor Fas para desencadear a cascata das caspases. As caspases
são inibidas por íons K+; a ouabaína, através da inibição da Na+,K+-ATPase, reduz
o K+ intracelular, favorecendo as caspases que estarão livres para ser ativadas.
E, finalmente, em tempos tardios, a ouabaína despolariza a membrana
mitocondrial.
Não há dúvida de que a ouabaína é capaz de regular os linfócitos em
várias instâncias, mas ainda assim, conhece-se muito pouco sobre seu
mecanismo de ação. Isso porque devem-se levar em consideração a interação
da ouabaína endógena com os outros hormônios que podem estar presentes
em níveis alterados no momento de sua liberação. Essas interações poderão, no
caso do linfócito, aumentar ou diminuir a sensibilidade deles à ouabaína
endógena, existindo inclusive a possibilidade de que essa regule a via a ser
seguida pelo linfócito: sobrevivência e ativação, ou morte.
REFERÊNCIAS
ADHIKARY, S. e EILERS, M. (2005). Transcriptional regulation and transformation
ev. Mol. Cell Biol. 6: 635 – 645.
by myc proteins. Nat. R
Re
ALBERTS, B., JOHNSON, A., LEWIS, J., RAFF, M. ROBERTS, K e WALTER, P (2002) In.
Molecular Biology of the Cell ed. Garland Science
Science, New York.
ANNER, B.M., LACOTTE, D., ANNER, R.M. e MOOSMAYER, M. (1994) Interaction of
hypothalamic Na,K-ATPase inhibitor with isolated human peripheral blood
ep. 14: 231 – 242.
mononuclear cells. Biosci. R
Rep.
DIÁLOGOS & CIÊNCIA - REVISTA DA REDE DE ENSINO FTC.
Ano II, n. 7, dez. 2008
143
APERIA, A. (2007) New roles for an old enzyme: Na,K-ATPase emerges as an
ern. Med. 261:44-52.
interesting drug target. J. Int
Intern.
AUSSEL, C., MARHABA, R., PELASSY, C. e BREITTMAYER, J.P. (1996) Submicromolar
La+++ concentrations block the calcium release-activated channel, and impair
CD69 and CD25 expression in CD3 or thapsigargin-activated Jurkat cells. Biochem.
J. 313: 909 – 913.
BLAUSTEIN, M.P. (1993) Physiological effects of endogenous ouabain: control of
intracellular Ca2+ stores and cell responsiveness. Am. J. Physiol. 264: c1367
- c1387.
BORTNER C.D. e CIDLOWSKI J.A., (1996). Absence of volume regulatory mechanism
contributes to the rapid activation of apoptosis in thymocytes. Am. J. Physiol.
271: C950 – C961.
BORTNER, C.D., HUGHES, F.M.Jr. e CIDLOWSKI, J.A., (1997). A primary role for K+
and Na+ efflux in the activation of apoptosis. J. Biol. Chem. 272: 32436 –
32442.
BORTNER, C.D., GÓMEZ-ANGELATS, M. e CIDLOWSKI, J.A., (2001). Plasma
membrane depolarization without repolarization is an early molecular event in
anti-Fas-induced apoptosis. J. Biol. Chem. 276: 4304 – 4314.
BRODIE, C., TORDAI, A., SALOGA, J., DOMENICO. J. e GELFAND, E.W. (1995). Ouabain
induces inhibition of the progression phase in human T-cell proliferation. J. Cell.
ysiol. 165: 246 – 253.
Ph
Physiol.
BRUNNER, T Death receptor-induced apoptosis. Instituto de Patologia,
Universidade de Bern. http://www.pathology.unibe.ch/Forschung/apoptosis/
TBrunner_res.htm.
BRUNNER, T., KASIBHATLA, S., PINKOSKI, M.J., FRUTSCHI, C., YOO, N.J., ECHEVERRI,
F., MAHBOUBI, A. e GREEN, D.R. (2000). Expression of Fas Ligand in activated T
cells is regulated by c-Myc. J. Biol.Chem. 275: 9767 – 9772.
CHARNOCK, J.S. e POST, R.L. (1963) Evidence of the mechanism of Ouabain
inhibition of cation activated adenosine triphosphatase. Nature 199: 910 –
911.
CORRÊA, G.R., dos SANTOS, A.A., FONTES, C.F.L. e ARAÚJO, E.G. (2005) Ouabain
induces an increase of retinal ganglion cell survival in vitro: the involvement of
protein kinase C. Brain Res. 1049: 89 – 94.
DALLAPORTA B., HIRSH, T., SUSIN, S.A.; ZAMZAMI N., LAROCHETTE,
N., BRENNER, C., MARZO I. e KOEMER G., (1998) Potassium leakage
during the apoptotic degradation phase. J. Immunol. 160: 5605 – 5615.
DONOVAN, M. e COTTER, T.G. (2004) Control of mitochondrial integrity by
Bcl-2 family members and caspase-independent cell death. Biochim.
Biophys. Acta 1644: 133 – 137.
ISSN 1678-0463
http://www.ftc.br/dialogos
144 ELETROESTIMULAÇÃO NEURO-
DORIS, P.A. e STOCCO, D.M. (1989) An endogenous digitalis-like factor
derived from the adrenal gland. Endocrinol. 125: 2573 – 2579.
DORNAND, J., FAVERO, J., BONNAFOUS, J.C. e MANI, J.C. (1986) Mechanism
whereby ouabain inhibits human T lymphocyte activation: effect on the interleukin
2 pathway. Immunobiol. 171(4-5): 436 – 450.
ECHEVARRIA-LIMA, J., de ARAÚJO, E.G., de MEIS, L., e RUMJANEK, V.M. (2003) Ca+2
mobilization induced by ouabain in thymocytes involves intracellular and
extracellular Ca+2 pools. Hyper
Hyperttension 41: 1386 – 1392.
ECHEVARRIA-LIMA, J. e RUMJANEK, V.M (2006) Effect of ouabain on the immune
ev. 2: 83 – 95.
system. Cur
Cur.. Hyper
Hyperttens. R
Re
ESTEVES, M.B. (2002) Efeito modulatório da ouabaína sobre linfócitos de sangue
periférico. Orientador: Vivian M. Rumjanek. Rio de Janeiro: UFRJ/Química Biológica
dissertação (mestrado).
ESTEVES, M.B., MARQUES-SANTOS, L.F, AFFONSO-MITIDIERI, O.R. e RUMJANEK,
V.M. (2005) Ouabain exacerbates activation-induced cell death in human
cad. Bras. Cienc. 77(2):281 – 292.
peripheral blood lymphocytes. An. A
Acad.
FACCHINI, l.M. e PENN, L.Z. (1998) The molecular role of c-myc in growth and
transformation: recent discoveries lead to new insights. FASEB J. 12: 633 – 51.
FERRANDI, M., MANUNTA, S.B., HAMLYN, J.M., BIANCHI, G. e FERRARI, P. (1997)
Ouabain-like factor quantification in mammalian tissues and plasma. Comparison
of two independent assays. Hypertension 30: 886 – 896.
GENESTIER, L.; KASIBHATLA, S., BRUNNER, T. e GREEN, D.R (1999) Transforming
growth factor b1 inhibits Fas ligand expression and subsequent activation-induced
cell death in T cells via downregulation of c-Myc. J. Exp. Med. 189: 231 – 239.
GOLDEN, WC e MARTIN, L.J. (2006) Low-dose ouabain protects against excitotoxic
oscience 137: 133 –
Neuroscience
apoptosis and up-regulates nuclear Bcl-2 in vivo. Neur
144.
GORMAN, A.M., ORRENIUS, S. e CECCATELLI, S. (1998) Apoptosis in neuronal
cells: role of caspases. Neuroreport 13; 9: 49 – 45.
GOTO, A., YAMADA, K., YAGI, N. YOSHIOKA, M. e SUGIMOTO, T. (1992) Physiology
ev. 44:
and pharmacology of Endogenous Digitalis-like Factors. Pharmacol. R
Re
377 – 399.
GREEN, D.R.; DROIN, N. e PINKOSKI, M. (2003) Activation-induced cell
death in T cells. Immunol. Rev. 193: 70 – 81.
HAMLYN, J.M., BLAUSTEIN, M.B., BOVA, S., DuCHARME D.W., HARRIS, D.W., MANDEL F., MATHEWS W.R. e LUDENS J.H., (1991) Identification and characterization of a ouabain-like compound from human plasma.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 6259 – 6263.
HINSON, J.P., HARWOOD, S. e DAWNAY, A.B. (1998) Release of ouabainlike compound (OLC) from the intact perfused adrenal gland. Endocr. Res.
24: 721 – 724.
DIÁLOGOS & CIÊNCIA - REVISTA DA REDE DE ENSINO FTC.
Ano II, n. 7, dez. 2008
145
JENSEN, P., WINGER, L. e NOWELL, P. (1977). The mitogenic effect of A23187 in
ys. A
cta 496 (2): 374 – 383.
human peripheral lymphocytes. Biochim. Bioph
Biophys.
Acta
KASIBHATLA, S., BEERE, H.M; BRUNNER, T.; ECHEVERRI, F e GREEN, D.R (2000) A
“non-canonical” DNA-binding element mediates the response of the Fas-ligand
promoter to c-Myc. Curr
Curr.. Biol. 10: 1205 – 1208.
KEENAN, S.M.; DeLISLE, R.K.; WELSH, W.J.; PAULA, S. e BALL JR, W.J. (2005)
Elucidation of Na+,K+-ATPase digitalis binding site J. Molec. Graph. Model.
23:465 – 475.
KELLY, R.A. e SMITH, T.W. (1989). The search for the endogenous digitalis: An
ysiol. 256: C937 – C950.
alternative hypothesis. Am. J. Ph
Physiol.
KERR, J.F.R; WILLIE, A.H. e CURRIE A.R (1972). Apoptosis: a basic biological
phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. Br
Br.. J. Cancer
26:239 – 257.
LaBELLA, F.S. (1985) Endogenous digitalis-like factor. Introductory remarks. Fed.
Pr
oc. 44: 2780 – 2781.
Proc.
LEPPLE-WIENHUES A., SZABÒ I., LAUN T., KABA N.K., GULBINS, E. and LANG, F.
(1998). The tyrosine kinase p56lck mediates activation of swelling-induced
chloride channels in lymphocytes. J. Cell. Biol. 141: 281-286.
MAENO E., ISHIZAKI Y., KANASEKI T., HAZAMA A. and OKADA Y. (2000) Normotonic
cell shrinkage because of disordered volume regulation is an early prerequisite
cad. Sci. USA. 97: 9487-9492.
oc. Natl. A
Acad.
Proc.
to apoptosis. Pr
MANN C.L., BORTNER C.D., JEWELL C.M. e CIDLOWSKI J.A. (2001). Glucocorticoidinduced plasma membrane depolarization during thymocyte apoptosis:
association with cell shrinkage and degradation of Na +/K +- adenosine
triphosphatase. Endocrinol. 142: 5059 – 5068.
MARAKHOVA, I., KARITSKAYA, I., AKSENOV, N., ZENIN, V. e VINOGRADOVA, T. (2005)
FEBS
Interleukin-2-dependent regulation of Na/K pump in human lymphocytes .FEBS
tt. 23: 2773 – 2780.
Le
Lett.
MARQUES-SANTOS, L.F., COQUEIRO V. e RUMJANEK, V.M. (2006) Cyclosporin A
does not protect the disruption of the inner mitochondrial membrane potential
induced by potassium ionophores in intact K562 cells. Cell Biol Int. 30:197 –
204.
McCONKEY, D.J. e ORRENIUS, S. (1994) Signal transduction pathways to
apoptosis. Trends in cell biology 4: 370 – 375.
MORAES, V.L.G., OLEJ, B., de LA ROCQUE, L. e RUMJANEK, V.M. (1989) Lack of
sensitivity to Ouabain in natural killer activity. FASEB J. 3: 2425 – 2429.
NAGATA, S., e GOLSTEIN, P. (1995) The Fas death factor. Science 267: 1449 –
1456.
ISSN 1678-0463
http://www.ftc.br/dialogos
146 ELETROESTIMULAÇÃO NEURO-
NOBEL, C.S.I., ARONSON, J.K., VAN DEN DOBBELSTEEN, D.J. e SLATER, A.F.G. (2000)
Inhibition of Na+/K(+)-ATPase may be one mechanism contributing to potassium
efflux and cell shrinkage in CD95-induced apoptosis. Apoptosis 5: 153-163.
OLEJ, B, de LA ROCQUE, L., CASTILHO, F.P.D., MEDIANO, I.F., CAMPOS, M.M., e
RUMJANEK, V.M. (1994) Effect of ouabain on lymphokine – activated killer cells.
Int. J. Immunopharmacol. 16: 769 – 774.
OLEJ, B., dos SANTOS, N.F., LEAL, L. e RUMJANEK, V.M. (1998) Ouabain induces
ep. 18: 1 – 7.
apoptosis on PHA – activated lymphocytes. Biosc. R
Rep.
ORLOV, S.N., THORIN-TRESCASES, N., KOTELEVTSEV, S.V., TREMBLAY, J. e HAMET,
P. (1999) Inversion of the intracellular Na+/K+ ratio blocks apoptosis in vascular
smooth muscle at a site upstream of caspase-3. J. Biol. Chem. 274: 16545 –
16552.
PELENGARIS, S. e KHAN, M. (2003) The many faces of c-Myc Arch. Biochem.
Bioph
ys. 416: 129 – 136.
Biophys.
PIRES, V., HARAB, R., OLEJ, B. e RUMJANEK, V.M. (1997) Ouabain effects on
activated lymphocytes: augmentation of CD25 expression on TPA – stimulated
cells and of CD69 on PHA – and TPA – stimulated cells. Int. J.
Immunopharmacol. 19: 143 – 148
PORTIUS H.J. e REPKE K.R.H. (1961) Darstellung des Na+ + K+-aktivierten, Mg++abh ängigen Adenosintriphosphat Phosphohydrolase-Systems des Herzmuskels
durch Isolierung der Zellmembran. Acta biol. med. germ 19: 879 – 906.
QUASTEL, M.R. e KAPLAN, J.G. (1968) Inhibition by Ouabain of human lymphocyte
transformation induced by phytohaemagglutinin in vitro. Nature 219: 198 –
200.
RAFF, M.C. (1992) Social controls on cell survival and cell death. Nature 356:
397 – 400.
RODRIGUES-MASCARENHAS, S., DE OLIVEIRA, A.S., AMOEDO, N.D., AFFONSOMITIDIERI, O.R., RUMJANEK, F.D e RUMJANEK, V.M. (2008) Modulation of the
immune system by Ouabain. Ann N Y Acad Sci. In Press.
ROY, C., LAPP, W.S., BROWN, D.L. e KAPLAN, J.G. (1985) Stimulation of the murine
mixed leukocyte reaction: optimal proliferation of responders requires activation
of stimulators. Immunobiology 169 (2): 103 – 115.
SCHINZEL, A., KAUFMANN, T. e BORNER, C. (2004) Bcl-s family members: intracellular targeting, membrane-insertion, and changes in subcellular localization. Biochim. Biophys. Acta 1644: 95 – 105.
SCOTT, I.D. e NICHOLLS, D.G. (1980) Energy transduction in intact synaptosomes.
Influence of plasma-membrane depolarization on the respiration and membrane
potential of internal mitochondria determined in situ. Biochem. J. 186:21 –33.
SKOU, J.C. (1957) The influence of some cations on an Adenosine Triphosphatase
from peripheral nerves. Biochim. Biophys. Acta 23: 394 – 401.
DIÁLOGOS & CIÊNCIA - REVISTA DA REDE DE ENSINO FTC.
Ano II, n. 7, dez. 2008
147
ep. 24: 436
SKOU, J.C. (2004) The identification of the sodium pump. Biosc. R
Rep.
– 451.
STELLER, H. (1995) Mechanism and genes of cellular suicide. Science 267:
1445 – 1449.
STOECK, M., NORTHOFF, H. e RESCH, K. (1983) Inhibition of mitogen-induced
lymphocyte proliferation by Ouabain: interference with interleukin 2 production
and interleukin 2 action. J. Immunol. 131: 1433 – 1437.
SZABÒ I., LEPPLE-WIENHUES A., KABA N.K., ZORATTI M., GULBINS, E. and LANG, F.
(1998) Tyrosine kinase-dependent activation of a chloride channel in CD95oc. Natl. A
cad. Sci. USA 95: 6169induced apoptosis in T lymphocytes. Pr
Proc.
Acad.
6174.
SZAMEL, M., LEUFGEN, H., KURRLE, R. e RESCH, K. (1995) Differential signal
transduction pathway regulating interleukin –2 synthesis and interleukin –2
receptor expression in stimulated human lymphocytes. Biochim. Biophys Acta
12; 1235(1): 33 – 42.
SZAMEL, M., SCHNEIDER, S. e RESCH, K. (1981) Functional interrelationship
between (Na+ K+)-ATPase and lysolecitithin acyltransferase in plasma membranes
of mitogen-stimulated rabbit thymocytes. J. Biol. Chem. 256: 9198 – 9204.
TREVISI L., VISENTIN B., CUSINATO F., PIGHIN I. e LUCIANI S. (2004) Antiapoptotic
effect of ouabain on human umbilical vein endothelial cells.
es. Comm. 27: 716 – 721.
ys. R
Biochem. Bioph
Res.
Biophys.
TYMIAK, A.A, NORMAN, J.A., BOLGAR, M., DiDONATO, G.C., LEE, H., PARKER, W.L.,
LO, L-C, BEROVA, N., NAKANISHI, K., HABER, E. e HAUPERT, G.T. (1993)
Physicochemical characterization of Ouabain isomer isolated from bovine
cad. Sci. USA 90: 8189 – 8193.
oc. Natl. A
Acad.
Proc.
hypothalamus. Pr
WANG, M., JIM, R.M., QIU, Y.N., LIN, W. e MENG, B. (2007) Effects of ouabain at
e
an Xue YYe
low concentrations on growth of leukemia cells Zhongguo Shi YYan
Xue Za Zhi. 15: 1165 – 1168.
WESSELBORG, S. e KABELITZ, D. (1993) Activation-driven death of human T-cell clones: time course kinetics of the induction of cell shrinkage.
Cell Immunol. 148: 234 - 241.
WYLLIE, A.H., KERR J.F.R. e CURRIE, A.R. (1980) Cell death: the significance of apoptosis. Int. Rev. Cytol. 68: 251 – 306.
WILLIS, S., DAY, C.L., HINDS, M.G. e HUANG, D.C.S. (2003) The bcl-2regulated apoptotic pathway. J. Cell. Sci. 116: 4053 – 4056.
WILSON, H.A. e CHUSED, T.M. (1985) Lymphocyte membrane potential
and Ca2+-sensitive potassium channels described by oxonol dye fluorescence measurements. J. Cell. Physiol. 125: 72 – 81.
XIONG, A.X., WANG, M., JIM, R.M., BAI, Y. e LIN, W (2006) Ouabain-induced apoptosis
of Jurkat cells correlates with activation of caspase-3 and regulation of Bcl-2
an Xue YYe
e Xue Za Zhi
gene family. Zhongguo Shi YYan
Zhi14:891 – 894.
ISSN 1678-0463
http://www.ftc.br/dialogos
148 ELETROESTIMULAÇÃO NEURO-
YAMADA, K., IHARA, N. e SANO, Y. (1987) Morphological evidence of endogenous
digitalis-like substance (EDLF) in the rat and macaque hypothalamus, using
digoxin-immunohistochemistry. Endocrinol. Jap. 34: 319 – 323.
DOUTORA – UFRJ. PROFESSORA SUBSTITUTA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA E DOCENTE DA
FACULDADE DE TECNOLOGIA E CIÊNCIAS – EAD. E-MAIL: [email protected]
PESQUISADORA TITULAR MINISTÉRIO DA SAÚDE. PROFESSORA CONVIDADA DA UFRJ.
DOUTORA UNIVERSITY OF LONDON. PROFESSORA TITULAR DA UFRJ
DIÁLOGOS & CIÊNCIA - REVISTA DA REDE DE ENSINO FTC.
Ano II, n. 7, dez. 2008