Tese -

DANIEL MANZONI DE ALMEIDA
Desenvolvimento e caracterização do modelo de infecção de
leishmaniose mucocutânea no camundongo deficientes do receptor 1 do
TNF- α e avaliação das lesões cutâneas crônicas nestes animais infectados
com L. major após o tratamento com células mononucleares purificadas da
medula óssea.
Tese apresentada para o Programa de PósGraduação em Ciências Biológicas do Núcleo de
Pesquisa em Ciências Biológicas da Universidade
Federal de Ouro Preto para obtenção do título de
Doutor em Ciências Biológicas
(ênfase em Imunobiologia de Protozoários)
Ouro Preto (MG), 2012
DANIEL MANZONI DE ALMEIDA
Desenvolvimento e caracterização do modelo de infecção de
leishmaniose mucocutânea no camundongo deficientes do receptor 1 do
TNF- α e avaliação das lesões cutâneas crônicas nestes animais infectados
com L. major após o tratamento com células mononucleares purificadas da
medula óssea.
Profa. Dra. Leda Quercia Vieira
(Orientadora)
Laboratório de Gnotobiologia e Imunologia – Depto de Bioquímica e Imunologia
Universidade Federal de Minas Gerais
Profa. Dra. Rosa Maria Esteves Arantes
(Co-Orientadora)
Laboratório de Neuro-Imuno-Patologia – Depto de Patologia Geral
Universidade Federal de Minas Gerais
Para minha família:
Aos meus pais Iraídes e Marli de Almeida e meu irmão Vinícius pelo apoio, incentivo e
amor incondicional.
To Matthew DeCarlo, my husband, my partner for all the love, support and
friendship
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora Profa Dra Leda Quercia Vieira pela orientação, oportunidades,
ensinamentos e amizade que irie levar por toda minha vida. Leda me aceitou em seu
laboratório de forma absolutamente receptiva, apoiando e incentivando todas as minhas
ideias, meus planos profissionais e pessoais. Sempre presente e de forma generosa
contribuiu pela minha formação de um jeito singular. Muito obrigado por ter me
proporcionado os quatro anos de maior aprendizado e um dos anos mais importantes da
minha vida. Serei eternamente grato pela oportunidade. O profissional que sou hoje tem
grande parte dos ensinamentos éticos, generosos e humanos que vejo e aprendi com
você;
À minha co-orientadora Profa Dra Rosa Maria Esteves Arantes pelos ensinamentos,
paciência e exemplo de sabedoria. Rosa sempre demostrou presença na minha formação,
abrigou a mim e os estudantes de iniciação científica que estavam no meu projeto por
seis meses em seu laboratório. Uma ajuda que só me fez crescer mais. Terei sempre
minha admiração pela pessoa e profissional, sensível e humana que Rosa é. Muito
obrigado pela orientação que irei levar por toda minha vida;
Ao Dr. Phillip Scott pela orientação de parte da minha tese nos EUA, paciência, bom
humor e por ter me proporcionado aprender em seu laboratório;
À Paula Melo Seixas, minha grande amiga, pela amizade, auxílio nos experimentos,
companheirismo nos momentos mais difíceis, por me abrigar em sua casa por várias
vezes, pela alegria de aprender em todos os momentos dessa tese;
Ao Caio Cotta Natale, meu grande amigo, pela amizade, auxílio nos experimentos,
sabedoria, alegria nos momentos não alegres, aprendizado em todos os momentos dessa
tese;
Ao Sérgio Alexandre Cruz pela paciência e discussões de clínica médica que sempre
tivemos. Pelo incentivo e alegria de conviver durante esse projeto;
À Luiza da Silva Miranda, pela oportunidade de aprender, auxílio nos experimentos de
morfometria;
À Júlia Assiat, pela oportunidade de aprender com seu conhecimento, cultura e alegria;
À Nádia Maheso, pela oportunidade de aprender com seu conhecimento, cultura, alegria
e espírito aventureiro;
Ao Danilo Scherrer, meu grande amigo, pela amizade, conselhos, oportunidade de
aprender e me orgulhar de suas vitórias;
À Dra Claudia Zuleida Gonzales, pela amizade, ensinamentos, ajuda quando comecei a
tese no Brasil e nos EUA, momentos de alegrias intensos. Tenho uma admiração imensa
por você, mamita!
Ao Prof Dr. Luís Carlos Crocco Afonso pela oportunidade de aprender em seu
laboratório e sugestões sempre interessantes para o trabalho e crescimento profissional;
À Pós-Graduação em Ciências Biológicas, por ter me recebido de “braços abertos” para
essa empreitada. Muito obrigado pela oportunidade;
À Cida Tropia, da secretaria do NUPEB, e a Universidade Federal de Ouro Preto por ter
me recebido de forma tão carinhosa, sempre prestativa na secretária do NUPEB;
Ao Mateus Kochem por toda a ajuda necessária na secretaria da pós-graduação;
Aos meus amigos do LAGI, Paula Melo Seixas, Caio Cotta Natale, Luciana Brito,
Matheus Heitor Carneiro, Louisa Andrade, Liliane Martins dos Santos, Waldionê de
Castro, Magda Elane, Leonardo, Lara Ustch, Juan Macedo, Marcelo Silva, Eric Roma,
Ana Clara Matoso, Yure, Warley Tavares, Ricardo Reis, Syed Hassan, Fernanda Ferraz,
Carolina Oliveira, Antônio Paulino e Antônio Vaz por todos os momentos de discussão,
aprendizado, sofrimento e alegria que passei com cada um de vocês. Vou leva-los
eternamente no meu coração;
Ao meu amigo Matheus Heitor Carneiro pela amizade, generosidade e ajuda técnica em
muitos momentos;
Aos colegas do Scott Lab Patrícia Petritus, Fernanda Novais, Venkata Yaramili, Cláudia
Lombana, Érika Krosby; Ba Nyugume pelo aprendizado e um ano de muita alegria;
Aos amigos do Laboratório de NeuroImunoPatologia pela oportunidade de aprender um
pouco de patologia e por terem me recebido de forma tão paciente num período difícil de
6 meses;
Aos amigos do Laboratório de Imuno Parasitologia do ICBE pelo aprendizado e por
terem me recebido de forma tão carinhosa no período que estive em Ouro Preto;
Aos amigos do laboratório do Prof. Dr. Renato França, em especial Samyra Nassif, pelo
apoio e ajuda técnica em alguns experimentos de migração celular;
Ao Prof Dr Ricardo Gonçalves pelos auxílios em citometria;
Ao Prof. Dr. Alexandre Reis, Profa Dra Fabiana Simão Machado e Prof Dr André
Talvani pela participação e sugestões valorosas na minha banca de qualificação;
À Dra Dulciene Maria Magalhães de Queiroz pela oportunidade de aprendizado e
colaboração em diversos projetos;
Ao CNPq pela bolsa de doutorado no país e para o exterior;
À Universidade da Pensilvânia e o NHI por 1 ano de convivência, aprendizado e
financiamento de parte do meu projeto de doutorado nos EUA;
Aos meus amigos e companheiros do curso de bases celulares de 2008;
Aos professores, alunos e monitores das edições do UFMG & Escolas de 2008, 2009 e
2010;
À Profa Dra Maria de Fátima Horta (Patiu) e os estudantes da turma de Farmácia do
segundo semestre de 2008 pelo aprendizado no estágio de docência;
À minha amiga Dra Eliana Bline Marengo pelo incentivo, amizade, leituras, conselhos e
presença em todos os momentos de nossa tão valiosa amizade;
Ao meu grande amigo Fabrício Freire Melo por toda amizade incondicional, incentivo e
companheirismo em todos os momentos. Abriu meus caminhos quando eu achei que
nada mais iria dar certo. Muito obrigado. Sem sua participação nessa história eu não
teria tido coragem de começar;
À minha família, meu pai Iraídes de Almeida, minha mãe Marli Manzoni de Almeida,
meu irmão Vinícius Manzoni de Almeida e minha cunhada Gabriela Rosa por todo
apoio incondicional. Amo vocês!
Ao meu marido e companheiro Matthew DeCarlo pela cumplicidade, amor, paciência e
dedicação;
A todos aqueles de forma direta ou indireta participaram desse trabalho e para minha
formação, meu muito obrigado!
“Apesar das ruínas e da morte, onde sempre acabou cada ilusão, a força dos meus
sonhos é tão forte, que tudo renasce a exaltação e nunca as minhas mãos ficam vazias”
(Sophia de Mello Breyner Andresen)
“Todo conhecimento começa num sentimento”
(Leonardo da Vinci)
RESUMO
A leishmaniose é causada por parasitas do gênero Leishmania. A forma mucocutânea da
leishmaniose apresenta lesões crônicas com baixo número de parasitas no local da
infecção causando uma resposta inflamatória exagerada. Camundongos TNFR1 KO,
quando infectados com L. major, conseguem controlar o crescimento do parasita no
local da infecção, porém mantém um intenso infiltrado inflamatório quando comparados
aos animais selvagens. O objetivo desse estudo foi a caracterização das lesões cutâneas
crônicas desenvolvidas nos animais TNFR1 KO infectados por L. major e a análise do
efeito da terapia celular nessas lesões. Os camundongos selvagens e TNFR1 KO foram
inoculados na pata com L. major e foram acompanhados por 15 semanas de infecção
para análise do perfil da imunopatologia desenvolvida. Os resultados mostraram que as
lesões crônicas dos camundongos TNFR1 KO infectados por L. major apresentaram
níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ, TNF-α e IL-17) e das quimiocinas
CCL2 e CCL5 quando comparados aos animais selvagens. A persistência dessas lesões
em camundongos TNFR1 KO é devida a um infiltrado inflamatório intenso e persistente,
rico de células Ly6G+ e TCD8+ no local da infecção. Para testar a terapia celular, os
camundongos TNFR1 KO foram tratados na fase crônica (15 semanas após a infecção)
com três preparados de células mononucleares purificadas da medula óssea,
semanalmente, por via endovenosa e as análises realizadas um e dois meses após o
tratamento. O tratamento com células mononucleares derivadas da medula óssea
mostrou eficácia no controle das lesões crônicas dos camundongos TNFR1 KO. Após
sete dias da transferência, as células transferidas foram localizadas nas lesões
diferenciadas em células CD11c+ e MHCII+; Após um e dois meses dos tratamentos, as
lesões reduzidas apresentaram aumento da expressão de IL-10 e diminuição da
expressão de IL-17; as análises histológicas mostraram porcentagens reduzidas de
células polimorfonucleares nas lesões dos animais tratados com as células quando
comparados aos animais tratados com veículo. Esses resultados mostraram que as
células mononucleares purificadas da medula óssea promovem o controle das lesões
crônicas desenvolvidas em camundongos TNFR1 KO infectados.
Palavras-chaves: leishmaniose; TNFR1; Leishmania major; terapia celular; leishmaniose
muco-cutânea
ABSTRACT
Leishmaniasis is caused by parasites of the genus Leishmania. The mucocutaneous form
is characterized by a low number of parasites at the site of infection and chronic lesions
caused by an exacerbated inflammatory response. We showed that TNFR1 KO mice,
when infected with L. major, control parasite growth at the site of infection, but maintain
an intense inflammatory infiltrate and develop chronic lesions when compared to wildtype mice (WT). The aim of this study was the characterization of inflammatory profile
in chronic infection in L. major-infected TNFR1 KO mice and analysis of the effect of
cell therapy in these chronic lesions. WT and TNFR1 KO mice were inoculated in the
foot-pad with L. major and were followed for 15 weeks of infection for analysis of the
immunopathology profile. Our results showed that chronic lesions from L. majorinfected-TNFR1 KO presented high levels of pro-inflammatory cytokines (IFN-, TNFα and IL-17) and chemokines (CCL2 and CCL5) when compared with WT animals.
Persistence of these lesions in TNFR1 KO mice is due to intense inflammatory infiltrate
with increase percentage of Ly6G+and TCD8+ cells at site of infection compared to WT
mice. Treatment with mononuclear cells derived from bone marrow caused lesions
repair. TNFR1 KO mice, in the chronic phase of infection, were treated with of purified
mononuclear cells from bone marrow and analyses were performed 1 and 2 months after
the treatment. After the treatment, donor-cells were located at the site of infection and
differentiated in CD11c+ e MHCII+ profile 7 days after the transfer; these lesions
showed significantly smaller showing evidence of healing; increased expression of IL10 and decreased expression of IL-17; and decreased number of polymorph nuclear cells
was found in the lesions when compared to animals treated with PBS. These results
showed that mononuclear cells derived from bone-marrow are effective for the treatment
for control of chronic lesion in L.major-infected TNFR1 KO mice.
Keywords: leishmaniasis; TNFR1; Leishmania major; cell therapy; muco-cutaneous
leishmaniasis
LISTA DE GRÁFICOS E FIGURAS
Figura 1: Curva de infecção e parasitismo nos camundongos TNFR1 KO e selvagens
infectados por L. major.......................................................................................................... 38
Figuras 2: Análises histopatológicas das lesões cutâneas crônicas dos camundongos
TNFR1 KO e selvagens infectados por L. major ................................................................... 39
Figura 3: Análise da expressão de IFN-γ, TNF-α, IL-17 e IL-10 nas lesões cutâneas
crônicas dos camundongos TNFR1 KO e selvagens infectados por L. major ......................... 41
Figura 4: Análise da expressão de FoxP3 nas lesões cutâneas crônicas dos
camundongos TNFR1 KO e selvagens infectados por L. major............................................. 42
Figura 5: Análise da expressão de CCL2 e CCL5 nas lesões cutâneas crônicas dos
camundongos TNFR1 KO e selvagens infectados por L. major ............................................. 44
Figura 6: Análise do infiltrado inflamatório nas lesões crônicas nos camundongos
TNFR1 KO e selvagens infectados com L. major .................................................................. 46
Figura 7: Análise do infiltrado inflamatório de células dendríticas nas lesões crônicas
nos camundongos TNFR1 KO e selvagens infectados com L. major...................................... 47
Figura 8: Efeito dos tratamentos com células da medula óssea nas lesões crônicas dos
camundongos TNFR1 KO e selvagens infectados com L. major ............................................ 49
Figura 9: Análise da expressão de IFN-γ e TNF-α nas lesões cutâneas crônicas dos
camundongos TNFR1 KO infectados por L. major e tratados com células purificadas da
medula óssea ......................................................................................................................... 51
Figura 10: Análise da expressão de IL-10 e TGF-β nas lesões cutâneas crônicas dos
camundongos TNFR1 KO infectados por L. major e tratados com células purificadas da
medula óssea. ........................................................................................................................ 52
Figura 11: Análise da expressão de IL-17 e FoxP3 nas lesões cutâneas crônicas dos
camundongos TNFR1 KO infectados por L. major e tratados com células purificadas da
medula óssea ......................................................................................................................... 53
Figura 12: Análise da expressão de arginase I e iNOS nas lesões cutâneas crônicas dos
camundongos TNFR1 KO infectados por L. major e tratados com células purificadas da
medula óssea ......................................................................................................................... 54
Figura 13: Análise da produção de IL-10 e IFN-γ por células órgãos linfoides
secundários dos camundongos TNFR1 KO infectados por L. major e tratados com
células purificadas da medula óssea. ...................................................................................... 56
Figura 14: Análise da carga de parasitas nas lesões cutâneas crônicas dos camundongos
TNFR1 KO infectados com L. major e após o tratamento com células purificadas da
medula óssea ......................................................................................................................... 58
Figura 15: Análise da migração das células purificadas da medula óssea de
camundongos TNFR1 KOGFP+ para as lesões cutâneas crônicas de camundongos TNFR1
KO infectados por L. major ................................................................................................... 60
Figuras 16: Análises histopatológicas das lesões cutâneas crônicas dos camundongos
TNFR1 KO infectados por L. major e tratados com células purificadas da medula óssea ....... 62
Figura 17: Tratamento de camundongos selvagens, infectados com L. major, com
células purificadas da medula óssea ....................................................................................... 64
Figura 18: Modelo para análise da diferenciação de células purificadas da medula óssea
em células dendríticas in vivo ................................................................................................ 66
Figura 19: Análise da participação do TNFR1 na diferenciação de células purificadas da
medula óssea em células dendríticas in situ............................................................................ 67
Figura 20: Análise das células produtoras de citocinas no local de infeção de
camundongos TNFR1 KO infectados com L. major e tratados com células purificadas da
medula óssea ......................................................................................................................... 69
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Lista de camundongos utilizados no estudo ........................................................... 24
Tabela 2: Características comuns descritas entre as lesões cutâneas de pacientes com
leishmaniose mucocutânea e as lesões crônicas desenvolvidas nos camundongos TNFR1
KO infectados por L. major .................................................................................................. 79
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
BSA: Soro albumina bovina
C: Graus Celsius
CCL#: Ligantes de receptores de quimiocinas CC
CCR#: Receptor de quimiocinas CC
CD: Cluster of differentiation
cDNA: DNA complementar
CO2: Gás carbônico
CR: Receptor do complemento
CXCL#: Ligantes de receptores de quimiocinas CXC
DEPC: Dietilpirocarbonato
dNTP: Desoxinucleotídeos
DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium
DMSO: Dimetilsulfóxido
DTT: Ditiotreitol
EDTA: Ácido etileno-diamino-tetra-acético
ELISA: Ensaio imunoenzimático (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
g: Gravidade
g: Grama
HETAB: Brometo de hexadeciltrimetilamônio
H2O2: Peróxido de hidrogênio
HPRT: Hipoxantina fosforibosil transferase
H2SO4: Ácido sulfúrico
IFN: Interferon
Ig: Imunoglobulina
IL-#: Interleucina
iNOS: Óxido nítrico sintase indutível
L: Litro
m: Metro
M: Molar
MHC: Complexo de histocompatibilidade principal
MMP: Metaloproteinase da matriz extracelular
mRNA: Ácido ribonucléico mensageiro
NaCl: Cloreto de sódio
NaHCO3: Bicarbonato de sódio
Na3PO4: Fosfato de sódio
NAG: N-acetilglicosaminidase
NK: Células exterminadoras naturais
NO: Óxido nítrico
OD: Densidade óptica
OPD: o-fenileno-diamina
PBS: Salina tamponada com fosfato 0,1 M, pH 7,3 (Phosphate Buffered Saline)
PCR: Reação em cadeia da polimerase (Polimerase Chain Reaction)
PGE2: Prostaglandina E2
RT: Transcriptase reversa
SBF: Soro bovino fetal
SSA: Solução saturada de sulfato de amônia
TGF: Fator de crescimento transformante
Th#: Células T auxiliares do tipo #
TMB: Tetrametilbenzina
TNF: Fator de necrose tumoral
TNFR: receptor do TNF-α
U: Unidades
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 1
OBJETIVOS ................................................................................................................... 19
MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................ 22
RESULTADOS ............................................................................................................... 35
DISCUSSÃO ................................................................................................................... 70
CONCLUSÕES ............................................................................................................... 92
REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 94
ANEXOS ................................................................................................................. 117
INTRODUÇÃO
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 A Leishmaniose: formas clínicas e tratamentos farmacológicos
Leishmaniose é a denominação dada para doenças provocadas pela infecção por
protozoários do gênero Leishmania que, dependendo da espécie, podem produzir vários
tipos de manifestações clínicas (locais e sistêmicas), sendo um problema importante de
saúde pública mundial, principalmente nos países em desenvolvimento, como por
exemplo, o Brasil. São doenças endêmicas das regiões tropicais e subtropicais,
abrangendo áreas de florestas úmidas nas Américas aos desertos no oeste da Ásia,
estando presente em áreas rurais e urbanas (Herwaldt, 1999). O número de casos em
todo mundo é de aproximadamente 12 milhões e há estimativas do surgimento de
400.000 novos casos anuais dessa doença. Segundo a Organização Mundial de Saúde,
cerca de 350 milhões de pessoas estão ameaçadas de contrair a doença em 88 países
(Organização Mundial de Saúde). Desde 1993, a Organização Mundial de Saúde
considera a Leishmaniose como a segunda doença de importância pública causada por
protozoários, depois da malária (Desjeux, 2004a; Desjeux, 2004b; Reithinger e cols.,
2007).
Há duas principais formas das manifestações clínicas da leishmaniose: a
tegumentar e a visceral. A forma visceral pode ser causada pela infecção pelas espécies
L. donovani e L. infantum no Velho Mundo e L. chagasi no Novo Mundo e é
caracterizada por febre, hepatoesplenomegalia, linfodenopatia, hipergamaglobulina,
emagrecimento, edema e estado de debilidade progressiva podendo levar a caquexia e ao
óbito (Lainson, 1983; Lainson e cols., 1987; Herwaldt, 1999; Silveira e cols., 2004). A
forma cutânea pode ser causada pela infecção das espécies de parasitas L. major e L.
tropica descrita em casos no Velho Mundo; e L. amazonensis, L. pifanoi, L. panamensis,
L. braziliensis, L. guyanensis, L. laisoni e L. mexicana nos casos do Novo Mundo. A
leishmaniose tegumentar é uma manifestação multifacetada que pode atingir a pele e em
alguns casos as mucosas, podendo assim, ser denominadas clinicamente como forma
2
cutânea e mucocutânea, respectivamente. A leishmaniose cutânea é caracterizada pela
formação de úlceras únicas ou múltiplas. O espectro de suas manifestações inclui lesões
localizadas e bem delimitadas que são resolvidas, em indivíduos que desenvolvem uma
resposta imune protetora mediada por células (Lainson, 1983; Lainson e cols., 1987;
Weigle & Saraiva, 1996; Desjeux, 2004a; Silveira e cols., 2004; Silveira e cols., 2005).
No Brasil, a leishmaniose mucocutânea é manifestada em cerca de 3% dos pacientes e é
principalmente causada pela L. braziliensis, do complexo “braziliensis” (Jones e cols.,
1987; Barral-Netto e cols., 1995; Marsden, 1994). A leishmaniose mucocutânea é
caracterizada por lesões destrutivas e crônicas que acometem regiões de mucosa nasal e
cartilagens das regiões adjacentes, meses ou anos após uma lesão cutânea preliminar
causando mutilações e morbidade nos indivíduos afetados (Marsden, 1986; Castes e
cols., 1993).
Há pouco entendimento dos mecanismos imunopatológicos que envolvem o
aparecimento da forma clínica mucocutânea. Os estudos efetuados até o presente
momento são concebidos e foram analisados em amostras de lesões e sangue de
humanos infectados ou em infecções experimentais de cobaias para mimetizar essa
forma de leishmaniose, pois não há modelo murino para esta forma da doença. As
hipóteses mais discutidas sobre as possíveis causas do acometimento das mucosas
compreendem: 1) a resposta imune exacerbada devido à resistência de alguns parasitas à
eliminação (como por exemplo, a resistência dos parasitas ao estresse oxidativo e assim
promovendo a metástase do mesmo pelo organismo) (Acestor e cols., 2006); 2) a
persistência de antígenos que provocam reações de hipersensibilidade ou fenômenos de
auto-imunidade relacionados às reações cruzadas entre parasitas e tecidos do hospedeiro
(Alcover e cols., 1984); e 3) os fenômenos inflamatórios exacerbados não seriam
regulados negativamente pelo hospedeiro, devido a falhas nesses mecanismos.
A hipótese da resposta imune exacerbada é apoiada por estudos realizados com
células obtidas do sangue e amostras de lesões de pacientes acometidos da forma
mucocutânea.
3
Os resultados obtidos de células do sangue dos pacientes que desenvolveram a
forma mucocutânea mostraram que há predomínio de uma reposta imune inflamatória do
tipo Th1 (altos níveis de IFN-γ e TNF-α) quando comparados aos pacientes com a forma
cutânea (Faria e cols., 2005). Outro fato interessante mostra que no soro dos pacientes
com forma mucosa há maiores concentrações de TNF-α que no soro dos pacientes com a
forma cutânea (Da-Cruz e cols., 1996; Gaze e cols., 2006), sugerindo a participação do
TNF-α na cronicidade da doença e destruição tecidual.
Análises de células do sangue periférico mostraram que pacientes acometidos
pela forma mucocutânea produziam níveis semelhantes de TNF-α e IL-10 aos
produzidos por pacientes acometidos pela forma cutânea Quando se compararam lesões
de pacientes com leishmaniose mucocutânea com as de pacientes com leishmaniose
cutânea, notou-se que nos dois grupos havia expressão similar de IL-10 e TNF-.
Entretanto, nas lesões mucosas encontrou-se uma expressão menor de receptores para a
citocina reguladora IL-10, sugerindo que o dano tecidual era causado pela falta de
resposta a IL-10 (Faria e cols., 2005).
Nas lesões dos pacientes com a forma mucocutânea há um predomínio de
expressão para citocinas da resposta Th1 (IFN-γ e TNF-α) exacerbada, como descrito
para células mononucleares. Há uma maior expressão de IL-17 nas lesões obtidas de
pacientes que sofriam da forma mucocutânea que na pele de indivíduos sadios. Quando
compararam-se lesões mucocutâneas com as cutâneas, encontraram-se maior número de
células T CD4+, T CD8+ e neutrófilos nas lesões mucocutâneas (Amato e cols., 2003;
Antonelli e cols., 2004; Silveira e cols., 2004; Amato e cols., 2008; Bacellar e cols.,
2009; Boaventura e cols., 2010).
Esse conjunto de dados obtidos de pacientes mostra que as lesões crônicas dos
pacientes com a forma mucocutânea apresentam uma inflamação exacerbada não
controlada. Dessa forma, pode-se sugerir a utilização de novas estratégias para o
tratamento desta forma clínica da doença, como inibidores da resposta imune celular ou
anti-inflamatórios em associação.
4
O tratamento da leishmaniose é feito à base de diversos fármacos descobertos ao
longo do século XX. Entretanto, ainda há uma carência de um tratamento mais
específico e eficaz que possa acarretar menos efeitos colaterais nos indivíduos. Os
medicamentos disponíveis atualmente no mercado são: Glucantine ® (antimoniato de
metilglucamina), Lomidina® (pentamidina), Gabbrox® (sulfato de paramomicina),
Anfotericina B ou AmBisomeTM (sua forma capsulada) o Impavido ® (miltefosina) (Croft
& Olliaro, 2011). No Brasil, o medicamento utilizado como primeira escolha na
terapêutica da leishmaniose é o antimoniato de metilglucamina (Frezard e cols., 2009).
Esse fármaco é eficaz no tratamento da leishmaniose cutânea, mucocutânea e visceral
(Michel & Vacheron, 1964; Koerber e cols., 1978; Aram & El-on, 1986; Ait-Oudhia e
cols., 2011a; Ait-Oudhia e cols., 2011b; Pourmahammadi e cols., 2011). O efeito na
leishmaniose provocado pelo medicamento é a rápida regressão das manifestações
clínicas e hematológicas da doença. Entretanto, devido às baixas dosagens e tratamentos
descontínuos, podem ocorrer falhas na terapia e como consequência o aumento das
formas resistente dos parasitas. Há relatos que em determinados casos, além de matar o
parasita, o medicamento acaba por levar o paciente ao óbito (Frezard e cols., 2009;
Sundar & Chakrarty, 2010). Além dos antimoniais, outras drogas têm sido empregadas
no tratamento das diversas formas da leishmaniose nos países endêmicos da doença,
entre as quais se destacam a pentamidina, anfotericina B, paramomicina e o miltefosina.
A pentamidina é particularmente útil em casos que não respondem ao antimonial ou para
pacientes com calazar, a leishmaniose visceral, que sejam hipersensíveis ao antimônio.
A alta toxicidade dessa droga também é fator limitante para o uso. Hipoglicemia,
hipotensão, alterações cardiológicas, nefrotoxidade e até mesmo morte repentina já
foram descritas após o uso do medicamento. A anfotericina B é um antibiótico
antifúngico derivado de uma cepa de Streptomyces nodosus, sendo indicada para o
tratamento da leishmaniose mucocutânea, embora não seja considerado fármaco de
primeira escolha no tratamento. Outro fármaco utilizado com eficiência é a
paramomicina (também chamada de aminosidine). É um antibiótico aminoglicosídeo
que é ativo contra espécies de leishmanias in vitro e in vivo. Estudo clínico para se testar
a eficácia da paramomicina injetável contra a leishmaniose visceral foram realizados na
5
Índia, onde o tratamento antimonial padrão não é muito efetivo e as taxas de mortalidade
por leishmaniose são altas. Os resultados mostraram eficácia similar à anfotericina B.
Atualmente, todos os medicamentos disponíveis para o tratamento da leishmaniose são
injetáveis. Foi verificado que a miltefosina, uma droga anti-câncer alquilfosfolipídica, é
ativa contra Leishmania spp in vitro e in vivo e pode vir a ser o primeiro tratamento oral
para a leishmaniose visceral (Croft & Olliaro, 2011). Resultados de estudos de fase II, na
Índia, indicam que quando a miltefosina é administrada por via oral é bem tolerada. Em
todas as doses testadas, a droga produziu excelentes resultados de cura parasitológica
(contra L. donovani). Estudos clínicos foram planejados e conduzidos contra
leishmaniose visceral na Índia e formas cutâneas na Índia e no Brasil (Soto e cols., 2007;
Dorlo e cols., 2008; Chrusciak-Talhari e cols., 2011; Madke e cols., 2011) mostrando
eficácia.
1.2 Modelos em camundongos: susceptibilidade e resistência à infecção por L.
major
Os modelos murinos têm sido de extrema utilidade para testar hipóteses sobre a
leishmaniose em humanos. A grande maioria do conhecimento sobre a imunidade à
leishmaniose cutânea vem dos estudos realizados em camundongos isogênicos e
nocautes de moléculas de importância na resposta imune, infectados com L. major. Nas
linhagens isogênicas, é estabelecido que camundongos BALB/c são susceptíveis à
infecção com L. major, desenvolvendo lesões cutâneas progressivas, crescimento
descontrolado do parasita com consequente visceralização e morte do animal. Algumas
outras linhagens de camundongos isogênicos, como por exemplo, C3H/HeJ e C57BL/6,
são ditas resistentes à infecção por L. major, uma vez que são capazes de controlar a
lesão causada após a infecção. Estes camundongos apresentam uma pequena lesão que é
geralmente limitada ao local da infecção e que se cura espontaneamente. Entretanto,
apesar da aparente cura da doença, o parasita permanece no hospedeiro e novas lesões
podem aparecer se o camundongo for imuno-suprimido (Sacks & Noben-Trauth, 2002).
O fenômeno de resistência e susceptibilidade à infecção por L. major no modelo murino
6
pode ser dependente de inúmeros fatores como, por exemplo, a dose de parasitas
inoculados no animal (alta ou baixa dose de parasitas), fatores genéticos do camundongo
e a resposta imune desenvolvida e predominante frente aos parasitas e espécies dos
parasitas.
Sobre a resposta imune mediando a resistência e a susceptibilidade à infecção por
L. major, em meados da década de 80 do século XX foi estabelecido o paradigma da
dicotomia da resposta imune mediada por células T CD4+ em células T helper 1 (Th1) e
células T helper 2 (Th2) (Coffman e cols., 1991). Basicamente, o paradigma da
polarização de células T CD4+ em perfis Th1 ou Th2 é identificado pela produção de
um perfil de citocinas característicos durante a infecção. Sendo assim, os camundongos
C57BL/6 infectados com L. major desenvolvem uma resposta predominantemente Th1
com a produção de IL-12, IFN-γ, TNF-α, produção de IgG2a e ativação de macrófagos
com eliminação dos parasitas possibilitando assim uma lesão auto-limitante. Por outro
lado, camundongos BALB/c tendem a desenvolver uma reposta do tipo Th2,
caracterizada pela produção de IL-4, IL-5, IL-13 e produção de IgG1 (Sacks & NobenTrauth, 2002). Entretanto, atualmente, outros estudos mostram que a indução do
fenômeno de resistência e susceptibilidade à infecção por L. major envolvem outros
fatores como a cepa de L. major utilizada na infecção, ativação de populações de células
T regulatórias, produção de IL-10 e uso da via da arginase em detrimento da óxido
nítrico sintase (iNOS) no metabolismo da arginina e participação de IL-17 na resistência
à infecção (Belkaid e cols., 2001; Lopez e cols., 2009).
Os macrófagos desempenham um papel importante no curso da infecção causada
por Leishmania. Eles servem como células hospedeiras para o parasita e como células
apresentadoras de antígeno, que modulam a resposta imune celular específica (Halliwell
e cols., 1992). Além disso, esta célula possui vários mecanismos microbicidas incluindo
as espécies reativas do oxigênio (O2-, H2O2, OH), o pH ácido nos lisossomas, as
enzimas lisossômicas (fosfatase ácida, -glicuronidase, catepsina D)
(Cohn, 1978;
Karnovsky & Lazdins, 1978) e óxido nítrico (NO) (Nathan e cols., 1984; Belosevic e
cols., 1988). Mais recentemente, outro mecanismo de resistência a parasitas
7
intracelulares, dependente de IFN-, mediado por guanosina tri-fosfatases foi descrito
(Macmicking e cols., 2003). A ativação de macrófagos por citocinas e agentes próinflamatórios exacerba esses mecanismos microbicidas e promove a eliminação de
parasitas intracelulares. Embora o óxido nítrico seja o fator leishmanicida mais aceito
(Belosevic e cols., 1988; Green e cols., 1990a; Cunha e cols., 1993) reativos de oxigênio
também parecem ser importantes na resistência sistêmica a Leishmania (Linares e cols.,
2001; Blos e cols., 2003).
As células dendríticas também desempenham um papel importante no curso da
infecção causada por L. major. Elas servem como células apresentadoras de antígeno
que,assim como os macrófagos podem modular a resposta imune. A infecção por
Leishmania é iniciada pela entrada de parasitas na pele. Estudos realizados em
camundongos infectados por L. major mostraram que vários subtipos de células
dendríticas estão envolvidos na infecção (Soong, 2008). Células dendríticas
plasmocitóides, subtipos de células dendríticas residente da pele, participam da resposta
imune inicial à infecção por L. major. Essas células não respondem à infecção depois da
fagocitose ou endocitose dos parasitas, porém podem ser ativadas pelo reconhecimento
do DNA genômico dos parasitas e podem produzir IFN-α/β e IL-12 de maneira
dependente de TLR-9 (Schleicher e cols., 2009; Bajénoff e cols., 2006; Soong, 2008).
Entretanto, a resposta imune celular na infecção experimental por L. major pode ser
orquestrada por outros tipos de células dendríticas. Acredita-se que parasitas e antígenos
dos parasitas são transportados a partir do local de infecção para os linfonodos drenantes
por células dendríticas CD11c+ e CD8α+. Estas células migram para o local de infecção
ao invés provenientes da medula óssea (Leon e cols., 2007). Estas células da medula
óssea foram responsáveis pela indução de resposta Th1, com produção de IFN-γ, em
linfonodos drenantes nos animais C57BL/6 (Leon e cols., 2007). Coletivamente, estes
estudos in vivo sugerem a dinâmica da rede de células dendríticas durante a infecção e a
importância de células dendríticas derivadas de monócitos (CD86 high, CD40high, CCR7+
e IL-12+) para ativação de células natural killer (NK) e na geração de respostas Th1 de
proteção a infecção por L. major (Soong, 2008).
8
As citocinas IL-12 e IFN-γ são críticas para o desenvolvimento da resistência à
infecção por L. major (Heinzel e cols., 1993; Sypek e cols., 1993; Afonso e cols., 1994;
Heinzel e cols., 1994). Essas citocinas são importantes na diferenciação de células T
CD4+ em células Th1, efetoras contra parasitas intracelulares na ativação de macrófagos.
A citocina mais importante para a polarização de células T CD4+ em Th1 é a IL-12
(Hsied e cols., 1993; Heinzel, 1994; Heinzel e cols., 1995a; Heinzel e cols., 1995b;
Mattner e cols., 1996). Estudos mostraram que camundongos BALB/c quando tratados
com IL-12 exógena durante a primeira semana de infecção com L. major apresentaram o
desenvolvimento de uma resposta mediada por células CD4 + do tipo Th1 associada ao
controle das lesões (Heinzel e cols.,1993; Sypek e cols., 1993). Outros dados mostram
que a neutralização da IL-12 em camundongos resistentes à L. major ou a utilização de
animais nocautes para IL-12 geraram um fenótipo de suscetibilidade com
desenvolvimento de lesões progressivas (Heinzel e cols., 1993a; Mattner e cols., 1996).
A IL-12 promove a produção de IFN-γ por células T CD4+ (Wakil e cols., 1998), T
CD8+ (Scharton-Kersten e cols., 1995; Satoskar e cols., 1999) e NK (Scharton-Kersten e
cols., 1995). Sua participação na eliminação do parasita e recrutamento celular foi
demonstrada em vários estudos. A administração de anticorpos anti-IFN- em linhagens
resistentes nos dois primeiros dias de infecção fez com que estes camundongos fossem
incapazes de controlar a lesão e levou ao desenvolvimento de uma resposta Th2
(Belosevic e cols., 1989; Scott, 1991; Mattner e cols., 1996; Launois e cols., 2002).
Resultados semelhantes foram obtidos quando camundongos de fundo genético
resistente, mas deficientes de IFN- ou receptor para IFN- foram incapazes de
controlar o crescimento do parasita (Wang e cols., 1994; Swihart e cols., 1995; Wakil e
cols., 1998). Estes dados sugerem uma função do IFN- na inibição do desenvolvimento
de uma resposta Th2. A ativação de macrófagos para eliminação do parasita por IFN- é
o principal mecanismo efetor anti-Leishmania. Esta citocina aumenta a síntese da
enzima iNOS, levando à produção, a partir de L-arginina, de óxido nítrico, que por sua
vez pode gerar radicais reativos de nitrogênio ainda mais tóxicos para o parasita (Green
e cols., 1990; Assrey e cols., 1994; Sacks & Noben-Trauth, 2002). A ativação de
macrófagos por IFN- pode ser regulada por outras citocinas produzidas pelas células
9
Th2 ou células T regulatórias (Treg) tais como IL-4 (Liew e cols., 1989), IL-10
(Mosmann, 1994; Belkaid e cols., 2001) e TGF-β (Bogdan & Rollinghoff, 1999).
Outra citocina importante descrita na infecção experimental por L. major é a IL17. A IL-17 promove a migração de células polimorfonucleares, como os neutrófilos,
com função de eliminação de parasitas extracelulares (Gaffen, 2011). Os neutrófilos são
células importantes na fase inicial da infecção por L. major. Estas células fagocitam os
parasitas e os eliminam (Peters e cols., 2008). Entretanto, alguns autores acreditam que a
permanência de L. major no interior de neutrófilos e, como consequência, a fagocitose
desses neutrófilos apoptóticos por macrófagos seja uma forma de entrada “silenciosa” de
parasitas na célula hospedeira (Laufs e cols., 2002; Laskay e cols., 2003; Ribeiro e cols.,
2004). De outra forma, foi mostrado que camundongos BALB/c nocautes para IL-17
apresentam menor número de neutrófilos nas lesões, correlacionando com menores
lesões nesses animais (Lopez e cols., 2009).
A susceptibilidade à infecção por L. major, por outro lado, é mediada por IL-4,
produzida por células T CD4+ ou células B, que são incapazes de induzir uma ativação
efetiva em macrófagos para a eliminação dos parasitas intracelular (Sacks & NobenTrauth, 2002; Ronet e cols., 2010; Nakaya e cols., 2011). Um mecanismo sugerido
responsável pelo perfil de suscetibilidade seria a inibição da produção de IL-12 pela IL4. Alguns trabalhos mostram que a IL-4 produzida logo após a infecção por L. major
inibe a expressão do receptor de IL-12 pelas células T CD4+ (Launois e cols., 1995;
Mattner e cols., 1996). Desta forma, estas células não respondem à IL-12 e portanto não
se diferenciam no sub-tipo Th1. Além disso, a IL-4 é a principal citocina que promove a
diferenciação de células T CD4+ no sub-tipo Th2 (Chatelain e cols., 1992; Launois e
cols., 1997).
A IL-10 medeia à ativação alternativa de macrófagos e consequente
sobrevivência e replicação do parasita intracelular (Scharton-Kersten e Scott, 1995;
Vouldoukis e cols., 1997; Belkaid e cols., 2001; Viana Da e cols., 2002; Noben-Trauth
e cols., 2003) mostrando que a participação da IL-10 na infecção cutânea por L. major é
importante para a regulação da inflamação cutânea. Entretanto, a presença de IL-10
10
permite a manutenção do parasita no tecido. Podemos dizer que, uma vez estabelecida à
infecção, o sistema imune do hospedeiro inicia processos regulatórios que diminuem a
lesão tecidual, mas, ao mesmo tempo, permitem a permanência do parasita no
hospedeiro.
Para estudos da leishmaniose de mucosas não há modelo murino experimental.
Barral e colaboradores (1983), fazendo cruzamentos entre camundongos C57BL/6 e
BALB/c, fizeram a primeira tentativa de desenvolver um modelo de leishmaniose
mucocutânea murino. Nesse estudo foram observados a visceralização de parasitas, o
aparecimento e o desenvolvimento de lesões em regiões nasais dos camundongos após
25 semanas de infecção por L. major. Entretanto, os parasitas no local da lesão não
foram eliminados e outras determinações para caracterizar esse modelo não foram
realizadas. Desde então não houve outros relatados na literatura que avaliassem o
desenvolvimento de lesões em mucosas de camundongos infectados por espécies de
Leishmania. Entretanto, as várias linhagens de camundongos experimentais são capazes
de desenvolver lesões crônicas, delimitadas e que apresentam algumas características
moleculares similares às encontradas em humanos que apresentam as lesões em
mucosas. Por exemplo, camundongos C57BL/6 infectados com L. amazonensis não
controlam a lesão, como na infecção por L. major, e desenvolvem lesões crônicas que
permanecem até 20 semanas de infecção, pelo menos, mostrando um primeiro modelo
de lesão crônica pela infecção por esse parasita. Porém, neste modelo o parasitismo não
é contido (Afonso & Scott, 1993). De outra forma, camundongos C57BL/6 e BALB/c
infectados com cepas de L. braziliensis não apresentam lesões progressivas e
descontroladas, ao contrário, apresentam a capacidade de eliminar e curar os parasitas
nas lesões, lesões autolimitadas e resposta pro-inflamatória como os animais resistentes
a infecção por L. major (De Souza-Neto e cols., 2004; De Moura e cols., 2005).
Por
outro lado, as lesões causadas pela infecção com L. major em camundongos C57BL/6
nocautes para o gene do receptor 1 do TNF-α que foi deletado por recombinação
homóloga (TNFRp55-/- ou TNFR1 KO) guardam algumas semelhanças com aquelas de
pacientes com este tipo de forma clínica da doença. Vieira e colaboradores (1996)
descreveram, pela primeira vez, que camundongos TNFR1 KO infectados com L. major
11
desenvolvem uma lesão não cicatrizante, não progressiva e que também não é autolimitante, como encontrada em camundongos C57BL/6. Interessantemente, esses
animais, após a 11ª semana de infecção, controlam o parasitismo de forma semelhante
aos camundongos selvagens. Entretanto, as lesões permanecem pelo menos até 20
semanas de infecção. Nashleanas & Scott (2000) mostraram que macrófagos derivados
desses camundongos são incapazes de produzir NO e controlar o parasitismo após o
estímulo com IFN-γ in vitro. Entretanto, in vivo, esses animais conseguem produzir uma
resposta Th1, expressar iNOS no sítio da infecção e controlar a replicação de L. major,
sugerindo que células T podem ativar os macrófagos desses animais. Estes macrófagos
produzem NO por uma via independente de TNF-α, como por exemplo, por meio da
ativação do receptor CD40 pelo seu ligante (Nashleanas & Scott, 2000). Nesses animais
infectados, mesmo após a eliminação dos parasitas, o infiltrado inflamatório permanece
até pelo menos 25 semanas. Os resultados do nosso laboratório mostram que essas
lesões são caracterizadas por um infiltrado rico em células mononucleares e neutrófilos
que permanecem no local da infecção, ao contrário do que ocorre nos camundongos
selvagens que além de controlar o parasitismo, controlam o infiltrado inflamatório
(Vieira e cols., 1996). Além disto, as células do baço e linfonodos dos camundongos
TNFR1 KO apresentam alta produção de IFN- e TNF no local da infecção. Outras
características da infecção por L. major em camundongos TNFR1 KO foram
determinadas. Há maior produção de quimiocinas CCL5 e CCL2 nas lesões destes
camundongos que em camundongos selvagens tardiamente na infecção, o que sugere um
afluxo de células constante e manutenção das mesmas no local da lesão (Oliveira e cols.,
2012).
O TNF-α é uma citocina que exerce várias atividades biológicas, como por
exemplo, a apoptose celular mediada pelo receptor 1 em vários tipos celulares (Zhao e
cols., 2000). Na infecção por L. major a eliminação de linfócitos da lesão inflamatória é
um componente crítico na resolução da doença uma vez que o patógeno foi eliminado da
lesão (Kanaly e cols., 1999). Nosso grupo mostrou deficiência na apoptose em
camundongos TNFR1 KO quando comparados aos camundongos selvagens, em fase
12
tardia da infecção quando o controle do parasitismo foi obtido, sugerindo que também
há um defeito na resolução do infiltrado inflamatório por este mecanismo mantendo a
lesão persistente na ausência do parasita no local da lesão (Oliveira e cols., 2012). O fato
de termos em mãos um modelo experimental que mimetiza parcialmente algumas
características moleculares, as lesões de pacientes acometidos de leishmaniose mucosa
permite-nos propor maneiras de interferir no curso destas lesões.
1.3 Terapias celulares: uma proposta de tratamento para lesões crônicas em tecidos
As terapias celulares são um conjunto de metodologias e abordagens
tecnológicas fundamentadas no conhecimento de várias ciências que visam à utilização
de células para o tratamento de inúmeras doenças. A transfusão de componentes do
sangue de um indivíduo saudável para outro acometido de alguma doença é a terapia
celular mais antiga descrita (De La Morena & Gatti, 2010; Schimidt, 2012). O
transplante de células-hematopoiéticas (transplante de medula óssea) é atualmente a
única forma de tratamento com células indiferenciadas ou células imaturas (célulastronco) cuja aplicação faz parte do arsenal médico disponível. Atualmente, o principal
foco da terapia celular é a medicina regenerativa, que objetiva a substituição de células e
tecidos lesados, senescentes ou perdidos por estruturas novas restaurando assim sua
capacidade orgânica (Charbord, 2010; Arnous e cols., 2012; Cassino e cols., 2012;
Cerqueira e cols., 2012). Os mecanismos pelos quais as células indiferenciadas
transplantadas atuam ainda não são totalmente esclarecidos. Um conjunto de resultados
sugere que além dos efeitos diretos na substituição de células nos tecidos lesados, as
células transplantadas podem exercer efeitos indiretos nos tecidos, como estimulação do
sistema imunológico e secreção de fatores que induzem migração, crescimento,
proliferação de outros tipos celulares nos tecidos induzindo reparo tecidual (Muller e
cols., 2008).
Dentro desse contexto, as células imaturas ou indiferenciadas da linhagem
hematopoiética se apresentam como uma fonte de tecidos para transplantes e terapias
celulares. As células-tronco podem ser definidas como células com grande capacidade
13
de proliferação, auto-renovação e capacidade de responder a estímulos externos, além de
dar origem a diferentes linhagens celulares mais especializadas (Kondo e cols., 2003).
Em adultos, uma fonte de células imaturas hematopoiéticas é a medula óssea que, desde
a década de 1950, são utilizadas no tratamento de diferentes doenças que afetam o
sistema hematopoiético. Na medula óssea encontram-se as células indiferenciadas
hematopoiéticas que podem dar origem a todos os diferentes tipos de células do sangue
(De La Morena & Gatti, 2010).
A medula óssea é um tecido encontrado na cavidade medular dos ossos longos e
nos interstícios dos ossos esponjosos, sendo um tecido altamente vascularizado. Este
tecido tem uma estrutura anatômica característica, formando microambientes compostos
de células do estroma, matriz extracelular, fatores de crescimento, que permite a
sobrevivência, multiplicação e diferenciação de células progenitoras de células do
sangue, as conhecidas como células-tronco da medula óssea (Kondo e cols., 2003). As
células-tronco presentes na medula óssea de organismos adultos originam as células
sanguíneas, além de células que formam e mantém o estroma medular. As células-tronco
hematopoiéticas apresentam extensivo potencial de auto-renovação e proliferação
associado à capacidade de se diferenciar em progenitoras e manter todos os elementos
sanguíneos (eritrócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos, mastócitos, monócitos,
macrófagos, linfócitos T, B e NK e células dendríticas). Essas características são
mostradas pela capacidade de reconstituir a hematopoiese completa, após transplante,
em recipiente cuja medula óssea foi destruída completamente. (Kirchhof e cols., 2002;
Kondo e cols., 2003).
Um dos tipos celulares imaturos mais predominantes na série mononuclear
encontrada na medula óssea são os monócitos. Os monócitos são originados na medula
óssea e infiltram nos tecidos periféricos pela corrente sanguínea. Tanto na situação de
homeostase quanto na inflamação, os monócitos circulantes deixam a corrente sanguínea
e migram para os tecidos periféricos condicionados por fatores de crescimento tecidual
local, citocinas pro-inflamatórias e produtos microbianos (Auffray e cols., 2009; Shi &
Pamer, 2011). Em camundongos, as populações dos monócitos podem ser dividas de
14
acordo com a expressão de receptores Ly6C. Monócitos classificado como Ly6C high e
CD115 positivos (CD115 é o receptor de GM-CSF) são células que infiltram nos tecidos
periféricos rapidamente em situações de dano tecidual agudo, como descrito na infecção
por Toxoplasma gondii (Dunay e cols., 2008; Dunay e cols., 2010a; Dunay & Sibley,
2010b). Entretanto, monócitos Ly6Clo e CD115+ é um subtipo de monócitos que
migram tardiamente para os tecidos periféricos lesionados e estão envolvidos com
processos de reparo tecidual (Dunay e cols., 2008; Cuervo e cols., 2011; Davison &
King, 2011; Donnely e cols., 2011; Pereira e cols., 2011). Essas células podem
diferenciar-se em populações de células dendríticas ou macrófagos (Leon e cols., 2007;
Davison & King, 2011). Dessa forma, o recrutamento de monócitos é essencial para o
controle efetivo da remoção de vírus, bactérias e protozoários (Serbina & Pamer, 2006;
Hokeness e cols., 2005; Robben e cols., 2005; Dunay e cols., 2008; Serbina e cols.,
2008) e pode contribuir para a patogênese de doenças inflamatórias e degenerativas bem
como em processos regenerativos de doenças crônicas como descrito em modelos de
doenças cardíacas ou doenças auto-imunes (King e cols., 2009; Salama e cols., 2011; Shi
& Pamer, 2011; Wrigley e cols., 2011 Ellrichman e cols., 2012)
Um dos estudos pioneiros que versa sobre o potencial terapêutico com células
mononucleares indiferenciadas ou células imaturas da linhagem hematopoiética da
medula óssea foi realizado por pesquisadores italianos no modelo experimental de lesão
muscular
induzida
quimicamente.
Esse
trabalho
mostrou
que
células-tronco
hematopoiéticas injetadas em músculos esqueléticos lesados quimicamente diferenciamse em células desse tecido, os miócitos. Outro protocolo testado foi a inoculação destas
células pela via endovenosa. Este protocolo mostrou que estas células são capazes de
migrar para a lesão e diferenciaram-se em células do tecido lesado (Ferrari e cols.,
1998). A partir de então, o potencial das células-tronco da medula óssea foi testado em
diversos modelos e em testes clínicos em humanos que sofreram lesões agudas e
crônicas com sucesso na migração e reparo tecidual, como por exemplo, em modelos de
cardiopatias, doenças auto-imunes (diabetes, artrite), lesão muscular e lesões no sistema
15
nervoso (Ferrari e cols., 1998; Peron e cols., 2011; Zhang e cols., 2011; Arnous e cols.,
2012; Wu e cols., 2012).
Há poucos estudos sobre o tratamento com células da medula óssea no curso de
infecções, mecanismos de reparo tecidual após alguma terapia celular, em especial, nas
parasitoses que acometem milhões de pessoas em países em desenvolvimento. Soares e
colaboradores (2004) mostraram que camundongos infectados com Trypanosoma cruzi,
tratados com células mononucleares purificadas da medula óssea, por via endovenosa,
mostraram melhoras nas lesões. Essas células tiveram a capacidade de migrar para o
coração lesionado e induzir reparo tecidual. O reparo tecidual foi caracterizado pela
diminuição de infiltrado inflamatório de forma dose dependente pela apoptose dessas
células inflamatórias no tecido cardíaco. Entretanto, esse tratamento não foi capaz de
interferir no número de parasitas determinados na infecção após o tratamento. Apesar
desse fato, esses resultados foram encorajadores para a realização de testes clínicos em
humanos com falência cardíaca ocasionada pela infecção por T. cruzi. O procedimento
em um paciente humano foi realizado aspirando células da medula óssea do próprio
individuo. Posteriormente, essas células foram purificadas e as células mononucleares
foram marcadas com um reagente fluorescente e logo em seguida foram inoculadas
diretamente no ventrículo esquerdo do coração do paciente. Esse procedimento mostrouse seguro e houve sucesso no reparo da lesão cardíaca nesse indivíduo (Villas-Boas e
cols., 2006). Ainda em humanos, a terapia celular mostrou-se interessante quando se
implantaram células-tronco hematopoiéticas de um doador homozigoto recessivo para o
receptor da quimiocina CCL5 (CCR5-/-) em um paciente HIV+ crônico que havia
desenvolvido um tipo de leucemia. Nesse indivíduo o transplante desse tipo particular de
células-tronco, além da recuperação do tecido medular sadio, houve eliminação da
infecção pelo vírus e recuperação da população de células TCD4 + por um tempo
prolongado (Hutter e cols., 2009).
Também foram realizados transplantes de células da medula óssea em
camundongos infectados com Schistosoma mansoni. Os granulomas formados em torno
dos ovos do parasita aprisionados no fígado e intestinos de camundongos causam a
16
patologia e fibrose crônica nestes órgãos. O tratamento de camundongos infectados com
S. mansoni na fase crônica com células-tronco purificadas da medula óssea mostrou
potencial na redução de granulomas e áreas de fibrose no fígado. Nesse mesmo estudo,
foi mostrado que, tanto após a transferência de células pela via endovenosa ou após o
inoculo local essas células migraram, instalaram-se e fusionaram-se com as células do
fígado no local da lesão hepática por tempos iguais ou superiores 2 a 4 semanas após o
tratamento, ressaltando a capacidade terapêutica e participativa dessas células no reparo
tecidual do local da injúria. Entretanto, esse tratamento não foi capaz de induzir
eliminação os vermes adultos (Oliveira e cols., 2008).
Recentemente, no modelo de infecção por Pseudomonas aeroginsa (que causa
lesão com fibrose crônica nos pulmões) em camundongos, avaliaram-se a migração e a
substituição das células lesadas dos pulmões por células totais da medula óssea. Esses
autores mostraram que após o tratamento as células não migraram para o local de
infecção. Entretanto, células-tronco hematopoiéticas purificadas foram localizadas no
local de fibrose do pulmão após o tratamento local. Esses dados mostram que as célulastronco derivadas da medula óssea podem substituir as células do tecido lesado (Rejman e
cols., 2009).
Há poucos estudos mostrando a participação de células imaturas da linhagem
hematopoiética nas lesões cutâneas causadas pela infecção por parasitas do gênero
Leishmania. Estudos mostraram que células com o perfil Ly6C+ e Ly6G- (monócitos
imaturos circulantes) infiltraram do sangue periférico para as lesões causadas pelo
parasita, participando de mecanismos de indução da resposta imune para morte do
parasita, controle das lesões e diferenciação em macrófagos e células dendríticas (Leon e
cols., 2007; Gonçalves e cols., 2011). Outros estudos mostraram que células dendríticas
diferenciadas in vitro a partir de culturas de células indiferenciadas obtidas da medula
óssea autóloga e transferidas para camundongos infectados com L. major induziram o
controle das lesões por mecanismos de estimulação do sistema imune (Carrion e cols.,
2007; Remer e cols., 2007; Remer e cols., 2010). Dessa forma, esses resultados sugerem
que células imaturas obtidas da medula óssea podem ser importantes no controle das
17
lesões cutâneas crônicas de camundongos infectados por L. major. O camundongo
TNFR1 KO infectado por L. major é um bom modelo para esses estudos, visto que as
lesões não são resolvidas.
Em outros modelos descritos na literatura para estudo de lesões crônicodegenerativas, as terapias celulares foram promissoras no reparo dos tecidos lesados.
Não há estudos disponíveis versando sobre as possíveis intervenções terapêuticas
experimentais, recuperação das lesões após o tratamento em períodos prolongados de
infecção por Leishmania. O tratamento com células de medula óssea pode ser promissor
para tratamento das lesões nos casos humanos de leishmaniose que apresentam quadros
de difícil cicatrização cutânea ou em outras doenças de pele com patogênese similar.
18
OBJETIVOS
19
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral:
Desenvolver e caracterizar o modelo de infecção de leishmaniose mucocutânea no
camundongo TNFR1 KO e avaliar as lesões cutâneas crônicas nestes animais infectados
com L. major, após o tratamento com células mononucleares purificadas da medula
óssea.
2.2 Objetivos específicos:
2.2.1 Desenvolvimento do modelo murino para leishmaniose mucocutânea:
- avaliar o curso das lesões e carga parasitária nas lesões dos camundongos
selvagens (C57BL/6) e TNFR1 KO infectados com L. major;
- avaliar as lesões histológicas das lesões dos camundongos selvagens (C57BL/6)
e TNFR1 KO infectados com L. major;
- avaliar o infiltrado inflamatório em camundongos selvagens e TNFR1 KO
infectados com L. major;
- avaliar a expressão das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-17 e de FoxP3 nas
lesões cutâneas de camundongos selvagens e TNFR1 KO infectados com L.
major.
20
2.2.2 Analisar o potencial da terapia celular com células mononucleares purificadas
da medula óssea nas lesões de camundongos TNFR1 KO infectados com L. major:
- analisar o curso e controle das lesões cutâneas em camundongos TNFR1 KO
infectados com L. major e tratados com células mononucleares purificadas da medula
óssea;
- analisar o efeito do tratamento com células mononucleares purificadas da
medula óssea na expressão das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10, TGF-β e IL-17 e de
FoxP3 nas lesões e produção de IFN-γ e IL-10 por células de linfonodos drenantes e
baço dos camundongos tratados;
- analisar a produção de citocinas em células CD11b+ e CD11b- nas lesões de
TNFR1 KO infectados com L. major e tratados com células mononucleares purificadas
da medula óssea;
- analisar a diferenciação, in situ, das células mononucleares purificadas da
medula óssea nos camundongos receptores e infectados com L. major.
21
MATERIAL E MÉTODOS
MÉTODOS
22
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
3.1.1 Camundongos
Camundongos C57BL/6 foram obtidos do Centro de Bioterismo da
Universidade Federal de Minas Gerais (CEBIO); camundongos C57BL/6 EGFP+
(positivos para Green Fluorescent Protein (gene da actina) (linhagem C57BL/6-Tg
[CAG-EGFP] 10sb/J) foram fornecidos, gentilmente, pelo Dr. Mauro Martins Teixeira e
Dra. Danielle Glória de Souza, do Laboratório de Imunofarmacologia. Os camundongos
TNFR1 KO (linhagem B6.129-Tnfrsf1atm1Mak/J , do Jackson Laboratories, (Bar Harbor,
Maine, EUA) foram fornecidos pelos Drs. Phillip Scott (University of Pennsylvania,
Filadélfia, Pensilvânia, EUA) e Klaus Pfeffer (Universität Düsseldorf, Düsseldorf,
Renânia do Norte-Vestfália, Alemanha) e mantidos no Laboratório de Gnotobiologia e
Imunologia já por vários anos. Os animais C57BL/6 TNFR1 KO GFP+ foram obtidos
por Daniel Manzoni-de-Almeida e Dra Leda Quercia Vieira por cruzamento entre
animais TNFR1 KO x C57BL/6 GFP+ (no Laboratório de Imunologia e Gnotobiologia.
O fenótipo dos camundongos TNFR1 KO GFP+ foi confirmado por PCR pela ausência do
receptor 1 do TNF-α e presença do gene GFP. Para determinar o fenótipo GFP+,
amostras do sangue periférico dos animais TNFR1 KO foram coletadas e analisadas por
microscopia de fluorescência. Os animais foram mantidos no biotério experimental do
Laboratório de Gnotobiologia e Imunologia do Depto de Bioquímica e Imunologia do
ICB-UFMG em estante ventilada, recebendo ração, cama e água estéreis. Camundongos
C57BL/6 CD45.1 e CD45.2 (linhagens C57BL/6 Thy-1.1/1.2) foram obtidos do
departamento de Pathobiology da Universidade da Pensilvânia ou das colônias
comercias da Jackson Laboratory Bar Harbor, Maine, EUA) e mantidos no biotério de
criação e experimentação do Laboratório do Dr. Phillip Scott, no departamento de
Pathobiology da Universidade da Pensilvânia. A Tabela 1 representa a lista das
linhagens de camundongos utilizados nesse estudo. Todos os procedimentos foram
executados de acordo com os protocolos institucionais e internacionais que regulam a
23
experimentação em animais. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em
Experimentação Animal da Universidade Federal de Minas Gerais (CETEA), protocolo
55/2009.
Tabela 1: Lista de camundongos utilizados no estudo
camundongos
C57BL/6 TNFR1 KO
C57BL/6 TNFR 1 KO GFP+
C57BL/6
C57BL/6 CD45.1
C57BL/6 CD45.2
C57BL/6 GFP+
3.2 Parasitas e antígeno
Leishmania major (MHOM/IL/1980/Friedlin) foi mantida em meio de Grace
conforme descrito (Afonso e Scott, 1993). Para infecção foram utilizadas formas
promastigotas metacíclicas purificadas por centrifugação em gradiente de Ficoll (Spath e
Beverley, 2001). Para obtenção do antígeno particulado, os parasitas foram obtidos de
culturas de fase estacionária. Após lavagem dos parasitas com PBS, os parasitas foram
congelados e descongelados por sete vezes. O extrato resultante da lise dos parasitas foi
ajustado a uma concentração de proteína de 1mg/mL.
3.3 Infecções subcutâneas e intradérmicas dos camundongos com L. major
Para as análises das populações de células dendríticas, análise da diferenciação das
células transferidas em células CD11c+ e análises da produção de IFN-γ e TNF-α nas
24
células das lesões, camundongos selvagens (C57BL/6) e TNFR1 KO foram infectados
pela via intradérmica da orelha com 10 µL de PBS na orelha contendo 1x10 6 de parasitas
na forma promastigota metacíclica de L. major. Para os demais experimentos, os
camundongos selvagens e TNFR1 KO foram inoculados pela via subcutânea com 30 µL
de PBS contendo 1x106 parasitas na forma promastigota metacíclica de L. major na pata
direita. A análise do desenvolvimento e das lesões foi acompanhada e medida com
auxílio paquímetro digital (Starrett ® 727, Itu, SP, Brasil) e os resultados expressos com a
diferença de espessura entre a pata ou orelhas não infectadas dos camundongos controle
C57BL/6 e TNFR1 KO.
3.4. Análise do infiltrado inflamatório, por citometria de fluxo, das lesões cutâneas
dos camundongos selvagens e TNFR1 KO infectados com L. major.
Após duas, seis e quinze semanas de infecção, as lesões foram coletadas,
maceradas manualmente em PBS e incubadas por 1 hora e 30 minutos a 37 C com meio
RPMI 1640 sem soro fetal bovino contendo colagenase (1 mg/mL) (Sigma, Aldriech,
MO, EUA). Posteriormente, os tecidos foram lavados com meio RPMI 1640 com soro
fetal bovino e triturados manualmente. Após esse processo as células obtidas foram
centrifugadas com PBS a 600 x g por 10 minutos a 4 C. A concentração de células foi
ajustada (0,5x106) por contagem por exclusão de azul de tripan e marcadas com
anticorpos anti-Ly6C PercepCy5 (clone HK.14) (1:250), anti-Ly6G Pacific Blue (clone
1A.8) (1:200), anti-CD11b PE (clone M1/70) (1:200), anti-CD11c PeCy7 (clone N418)
(1:200), anti-MHCII (I-A/I-E) Pacific Blue (clone M5/114.15.2) (1:200), anti-CD4 FITC
(clone RM4-5) (1:200), anti-CD8 FITC (clone DK25) (1:200), anti-CD3 PE (eBio G4.18
[G4.18]) (1:200), anti-F4/80 Percep (clone BM8) (1:200) (eBioscience, San Diego, CA,
EUA). As células foram incubadas por 15 minutos a 4 C e posteriormente lavadas com
PBS e fixadas em tampão contendo 2% de paraformaldeído. As amostras de células
foram analisadas (100.000 células por amostra) em citometria de fluxo (BD
FacsCANTO II, Franklin Lakes, NJ, EUA) e os resultados obtidos analisados pelo
software FlowJo v7.6.5 Versão, Tree Star, Inc., Ashland, OR, EUA)
25
3.5 Obtenções de células totais e das células mononucleares purificadas da medula
óssea
3.5.1 Obtenção das células totais da medula óssea
Para obtenção das células da medula óssea, camundongos selvagens C57BL/6,
TNFR1 KOGFP+ e TNFR1 KO foram eutanasiados e os fêmures e tíbias retirados. As
extremidades dos ossos foram cortadas e a medula óssea retirada com meio RPMI sem
soro fetal bovino (Sigma Chemical Co) acrescido de penicilina (10.000 U) e
estreptomicina (100 µg/mL) (GIBCO BRL, Grand Island, NY, EUA) utilizando-se uma
seringa com agulha BD30G para obter células totais de medula num tubo de 50 mL. O
meio contendo as células foi centrifugado a 600 x g por 10 minutos a 4 C. O
sobrenadante foi desprezado e as células foram novamente suspendidas em 1,0 mL em
meio e o número de células viáveis foi determinado pelo método de exclusão por azul de
tripan em câmara de Neubauer.
3.5.2 Purificação das células mononucleares da medula óssea
As células totais da medula óssea foram obtidas como descrito no item 3.5.1.
Nesse estudo nós utilizamos duas técnicas de purificação de células mononucleares da
medula óssea: por separação por gradiente utilizando reagente Ficoll, para os
tratamentos, e utilizando anticorpos específicos e colunas magnéticas, para análise da
diferenciação das células doadoras in situ. Para a metodologia do gradiente de Ficoll, a
fração de células mononucleares foi obtida segundo descrito por Soares e colaboradores
(2004) e Oliveira e colaboradores (2008). Resumidamente, após a coleta das células
totais da medula óssea foi realizada a separação das células mononucleares em gradiente
de FICOLL-HYPAQUE - densidade de 1,077 (Sigma Chem Co). Para esse
procedimento a mistura Ficoll-Hypaque é colocada no fundo do tubo (50 mL) e as
células da medula coletadas são vagarosamente colocadas sobre a fase de Ficoll (na
proporção 1:1). Após a centrifugação de 40 minutos a 600 x g a separação ocorre da
seguinte maneira: na fase superior ficam as células mononucleares, em seguida o Ficoll
e então os eritrócitos e granulócitos, que ficam sob a forma de um sedimento celular no
26
fundo do tubo. A camada de células mononucleares foi removida assepticamente e
transferida para um tubo estéril 15 mL. As células foram lavadas por duas vezes com
meio DMEM, devido à toxicidade do Ficoll. Após esta etapa, a viabilidade das células
foi determinada por exclusão de azul de tripan, contadas em câmara de Neubauer e a
concentração ajustada.
Na metodologia utilizando anticorpos específicos e colunas magnéticas
(MACS® MicroBeads LS columms; Miltenyi Biotecnology, Cambridge, MA, EUA)
como descrevemos em John e colaboradores (2011), as células totais da medula óssea de
camundongos não infectados foram obtidas de tíbias e fêmures. As hemácias foram
lisadas com solução de lise (NaCl 10 nM, MgCl2 5 mM, Tris-HCl 10 nM, pH 7,0) por 1
minuto a 25 C e as células restantes foram incubadas, por 15 min a 4 C, com anticorpo
biotinilado anti-Ly6G (clone 1A.8) (Miltenyi Biotecnology, Cambridge, MA, EUA) e
selecionadas para o marcador Ly6G por colunas magnéticas. Após lavagens, as células
obtidas foram incubadas, por 15 minutos a 4 C em ausência de luz, com anticorpo antiCD11b PE ou APC (clone M1/70) (eBioscience) e positivamente selecionadas para o
marcador CD11b . Após finalizar essa etapa, a viabilidade das células foi determina por
exclusão de azul de tripan, contadas em câmara de Neubauer e a concentração ajustada.
A presença de marcadores das células nas amostras de células totais ou
purificadas da medula óssea foi avaliada pela expressão dos marcadores para CD11b,
CD11c, Ly6C, Ly6G, CD115 e CD117 (c-kit). As células obtidas foram transferidas
para placas de 96 poços na concentração de 5x106 células por poço e incubadas durante
30 minutos a 4 C com solução de bloqueio PBS/BSA 5%. Posteriormente, as células
foram lavadas com PBS e incubadas com anticorpo anti-CD11b (clone M1/70) (1:200)
PE, anti-CD11c PEcy7 (clone N418) (1:200), anti-Ly6C PercpCy5 (clone HK1.4)
(1:200), anti-Ly6G Pacific Blue (clone 1A.8) (1:200), anti-CD115 APC (clone AFS98)
(1:200) (eBioscience) e anti-CD117 (anti-c-kit) PercpCy5 (clone 2B8) (1:200) (BD
Pharmingen, San Diego, CA, EUA) diluído em PBS/BSA 1% durante 15 minutos. Após
a incubação, as células foram lavadas e fixadas com 200 µL de tampão paraformaldeído
2%. Foram analisadas 50.000 células por amostra em citometria de fluxo (BD
27
FacsCANTO II, Franklin Lakes, NJ, EUA) e os resultados obtidos analisados pelo
software FlowJo.
3.6 Tratamentos dos camundongos infectados com L. major com células totais ou
purificadas da medula óssea
Nos experimentos de tratamento dos animais selvagens com células da medula
óssea, grupos de camundongos C57BL/6 foram infectados por via intradérmica e
simultaneamente tratados com três doses semanais de células mononucleares purificadas
da medula óssea (1x106/50 µL/camundongo), pela via endovenosa. O curso das lesões
foi seguido pela medida semanal das lesões com auxílio de paquímetro digital (Starrett ®
727, Itu, SP, Brasil). A orelha contralateral foi utilizada como controle negativo da
infecção.
Para avaliar o efeito do tratamento com células mononucleares da medula óssea
nas lesões cutâneas crônicas de camundongos TNFR1 KO, grupos de camundongos
TNFR1 KO foram infectados na pata direita com 1x106 formas metacíclica de L. major.
Após quinze semanas de infecção, quando observamos lesões persistentes e a carga
parasitária baixa (Oliveira e cols., 2012), as células totais ou mononucleares purificadas
da medula óssea de camundongos selvagens e de camundongos TNFR1 KO foram
administradas como nos protocolos de transferência de células obtidas da medula óssea
descritos nos modelos experimentais por Menges e colaboradores (2002), Soares e
colaboradores (2004) e Oliveira e colaboradores (2008). Para nossos experimentos,
grupos de camundongos TNFR1 KO infectados na décima quinta semana por L. major e
receberem três injeções de células totais ou mononucleares purificadas da medula óssea
provenientes de camundongos selvagens ou TNFR1 KO (10 7/50 µL/camundongo),
semanalmente administradas pela via endovenosa. As lesões foram acompanhadas e
medidas semanalmente até a vigésima quinta semana de infecção. Após quatro e oito
semanas do último tratamento (vigésima primeira e vigésima quinta semana de infecção)
grupos de camundongos tratados e não tratados com as células foram sacrificados para
análises das lesões da expressão de citocinas, análise da carga parasitária e do infiltrado
28
inflamatório. O curso das lesões foi seguido pela medida semanal das lesões com auxílio
de paquímetro digital (Starrett ® 727, Itu, SP, Brasil). A pata contralateral foi utilizada
como controle negativo da infecção.
3.7. Análise da carga parasitária
Camundongos selvagens e TNFR1 KO após seis, quinze semanas da infecção ou
com um e dois meses após o tratamento com células mononucleares purificadas da
medula óssea foram eutanasiados e as lesões coletadas. O número de parasitas nas lesões
dos camundongos infectados foi determinado pela da técnica de diluição limitante a
partir de uma suspensão de células obtidas das lesões. Resumidamente, os homogenatos
das patas foram obtidos após maceração manual das lesões. O material foi centrifugado
a 250 x g, e os sobrenadantes recuperados foram submetidos a uma posterior
centrifugação de 1.000 x g. O sedimento obtido foi suspenso em 400 µL de meio de
Grace completo e duzentos microlitros dessa suspensão foram colocados em duplicata
em placas de cultura de 96 poços. Posteriormente foram serialmente diluídas 1:10 ou 1:4
e incubadas a 25 C durante 15 dias para seguir o crescimento das promastigotas. O
número de parasitas foi expresso em forma de logaritmo negativo da última diluição em
que foi constatada a presença dos parasitas.
3.8. Análise da migração das células da medula óssea no local de lesão após o
tratamento
3.8.1 Análise dos tecidos por citometria de fluxo
Para análise da migração das células transferidas para as lesões cutâneas dos
camundongos TNFR1 KO na décima quinta semana de infecção, receberam uma dose de
células mononucleares TNFR1 KOGFP+ (1x107/50 µL/camundongo) purificadas da
medula óssea, pela via endovenosa e as lesões avaliadas após 24 horas e sete dias após
as transferências. Após 24 horas ou sete dias da transferência das células TNFR1
KOGFP+ mononucleares, os camundongos foram eutanasiados e o local de lesão,
linfonodos e baço foram coletados. As amostras dos tecidos foram maceradas
29
manualmente em PBS e incubadas por 1 hora e 30 minutos a 37 C com meio RPMI sem
soro fetal bovino contendo colagenase (1 mg/mL). Posteriormente, os tecidos foram
lavados com meio RPMI com soro fetal bovino e triturados manualmente. Após esse
processo as células obtidas foram centrifugadas com PBS a 600 x g por 10 minutos a 4
C. A concentração de células foi ajustada (0,5x106) por contagem por exclusão de azul
de tripan e as amostras analisadas (100.000 células por amostra) em citometria de fluxo
e os resultados obtidos analisados pelo software FlowJo.
3.9 Análises histopatológicas
Amostras das lesões de camundongos selvagens e TNFR1 KO, nos tempos de
seis, quinze semanas de infecção ou lesões dos camundongos TNFR1 KO infectados ou
após um e dois meses de tratados com células mononucleares purificadas da medula
óssea foram coletadas, fixadas em formol 4% tamponado com PBS pH 7,2, desidratadas
em concentrações crescentes de álcool, diafanizadas em xilol, embebidas e incluídas em
parafina. Foram obtidos cortes de 3 a 5 µm de espessura. Foi realizada a coloração de
Hematoxilina e Eosina e as lesões foram analisadas em microscópio de luz. O número de
células inflamatórias totais e de polimorfonucleares foi determinado utilizando
aproximadamente 10 campos microscópicos, medindo 250 µm, representativos das
lesões e foram automaticamente analisados em KS 300 (Carl Zeiss, Oberkochen,
Alemanha) determinando o número de células totais do infiltrado ou a porcentagem de
polimorfonucleares das lesões com quinze semanas após infecção entre os animais
selvagens e TNFR1 KO ou entre as lesões dos animais TNFR1 KO infectados e tratados
com células purificadas da medula óssea após um mês da terapia.
3.10. Determinação das citocinas
3.10.1 Por ELISA
Os esplenócitos dos camundongos TNFR1 KO infectados e tratados com as
células purificadas da medula óssea foram coletados, processados, colocados em cultura
e estimulados por 72 horas com antígeno particulado de L. major (50 µg/mL). A
30
determinação das concentrações de IFN-γ e IL-10 nos linfonodos drenantes e baço
foram ensaiados pelo método de ELISA de captura. As placas de ELISA (Nalgene
NUNC, Rochester, NY, EUA) foram cobertas com os anticorpos de captura
desenvolvidos em cabra anti-IL-10 ou anti-IFN-γ diluídos em tampão de revestimento
(8,4 g/L de NaHCO3 e 5,8 g/L de NaCl em água destilada; pH 9,6) em um volume total
de 100 µL/poço nas concentrações definidas pelo manual do fabricante. As placas foram
incubadas a 4 C por 18 horas, e após tal período as placas foram lavadas quatro vezes
com tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% de Tween 20) e bloqueadas com
albumina bovina 1% (BSA) em PBS por 1 hora em temperatura ambiente em um
volume de 200 µL/poço. Após o bloqueio, as placas foram lavadas e as amostras e os
padrões foram diluídos em solução diluente (BSA 0,1% e Tween 20 0,1% em PBS, pH
7,4) e adicionados às placas em um volume total de 100 µL/poço. As placas foram
incubadas durante a noite a 4 C e no dia seguinte as mesmas passaram por um novo ciclo
de lavagem, após o qual anticorpos de detecção biotinilados produzidos em cabra foram
adicionados na concentração definida pelo manual do fabricante em solução diluente
num volume de 100 µL/poço e incubados à temperatura ambiente por 2 horas. Após esse
período de incubação e novo ciclo de lavagem, estreptavidina conjugada com peroxidase
foi adicionada à placa na proporção 1:4 em solução diluente num volume de 100
µL/poço e incubada à temperatura ambiente por 30 minutos. A placa foi lavada
novamente e adicionou-se a solução do substrato o-fenileno-diamina (OPD, Sigma
Chemical Co.) a 0,4 mg/mL e H2O2 a 0,005% em tampão citrato-fosfato (0,15 M, pH
5,0) acompanhando-se a formação da cor. A reação foi interrompida após 15 a 20
minutos de incubação com 50 µL/poço de H2SO4 1 M. A leitura das placas foi feita a
492 nm em leitor de microplacas (Multiskan EX, Labsystems, Finlândia).
3.10.2 Por PCR em tempo real
As lesões dos camundongos selvagens e TNFR1 KO infectados, nos tempos de
seis e quinze semanas de infecção com L. major ou um e dois meses do tratamento com
células da medula óssea foram coletadas, triturados em tubos de prolipropileno em
solução de Trizol. Após a adição de 0,2 mL de clorofórmio, a mistura foi
31
homogeneizada em vortex e colocadas por 15 minutos no gelo. Em seguida, foi
centrifugada por 15 minutos a 13.000 x g a 4 C, a fase aquosa foi transferida para um
tubo de microcentrífuga e misturada 1:1 com isoproponol. Nova homogeneização da
mistura foi realizada e deixada repousar por 15-30 minutos a -20 C. Novamente a
mistura foi centrifugada nas mesmas condições anteriores e o sobrenadante foi
desprezado. Um mililitro de etanol 95% foi adicionado ao microtubo, à mistura foi
agitada no vortex e novamente centrifugada. Os sobrenandantes foram desprezados, o
sedimento foi deixado para secar por 5 minutos e foi suspenso em água deionizada e
autoclavada contendo 1mM de EDTA. As amostras de RNA foram mantidas a -70 C até
o uso.
O RNA foi transcrito (0,5 µg por ensaio, quantificado por espectrofotometria)
usando-se transcriptase reversa AMV (GIBCO BRL, Grand Island, NY, EUA) em 25 µL
de mistura de reação contendo dNTP 250 mM, Tris-HCl 50 mM, pH8,3, KCl 75 mM,
MgCl2 3 mM, di-tiotreinol 10 mM, 10 unidades de RNAsin e oligo DT15 (Promega
Corp, Madison, WL, EUA). As misturas foram incubadas por 5 minutos a 95 C, 5
minutos no gelo e 5 minutos a 25 C, nesse passo 100 unidades de transcriptase reversa
foram adicionadas e a mistura incubada por 60 minutos a 37 C. A temperatura foi
elevada por 95 C por 5 minutos e os tubos foram transferidos para o gelo por 5 minutos.
O produto de cDNA foi diluído em 0,2 mL de água destilada estéril e 5 µL foram usados
para cada amplificação por reação de polimerase em cadeia.
A amplificação da expressão de mRNA específica foi realizada através de PCR
em tempo real (RT-PCR) usando iniciadores com seqüências especificas para IL-10,
IFN-γ, TNF-α, TGF-β, IL-17 e arginase I, iNOS e FoxP3 e as reações foram
desenvolvidas sob um sistema de detecção de seqüência ABI PRISM®7900HT (Applied
Biosystems, Foster City, CA, EUA) usando 20% da reação de cDNA em volume total de
15uL de mistura de PCR. Todas as reações foram desenvolvidas em duplicatas usando
SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) de acordo
com as especificações do fabricante. A quantificação relativa do produto foi determinada
pelo método de limiar de ciclos para determinar o incremento em vezes do produto. O
programa de PCR para amplificação de cDNA foi desenvolvido sob as seguintes
32
condições: 2 min a 50 C , ativação da AmpliTaq a 95 C durante 10 min, desnaturação a
95 C por 15 segundos. Para o anelamento e extensão final, as amostras foram
submetidas a 60 C por 1 min durante 45 ciclos. Para a geração da curva de dissociação,
as amostras foram aquecidas a 95 C por 15 segundos, em seguida a 60 C por 5 segundos.
Finalmente, as amostras foram esfriadas por 1 min a 4 C. O gene de interesse foi
normalizado em relação à expressão da enzima expressa constitutivamente hipoxantina
fosforibosil transferase (HPRT), baseado no calculo do CT. A mudança na expressão
foi representada como relativa aos animais não infectados.
3.10.3 Por citometria de fluxo
Para avaliar o perfil da produção de citocinas das células inflamatórias nas lesões
dos camundongos TNFR1 KO infectados com L. major, após duas semanas de infecção,
os camundongos receberam o tratamento com células mononucleares purificadas da
medula óssea (10x106/camundongo) ou PBS. Após sete dias da transferência, as lesões
foram coletadas, as células isoladas e estimuladas ex vivo com estímulo policlonal (antiCD3 [10 µg/mL] e anti-CD28 [10 µg/mL] por 12 horas), para análise de produção de
citocinas anti- e pró-inflamatórias em populações de células CD11b positivas e negativas
do recipiente para produção de TNF-α e IFN-γ. Resumidamente, as células obtidas das
lesões foram coletadas, a concentração ajustada e estimuladas, com estímulos
policlonais, com anti-CD3 (10 µg/mL), anti-CD28 (10 µg/mL) por 12 horas.
Posteriormente as células foram incubadas com brefeldina A e ionomicina (10 µg/mL)
(Sigma, Chemical Co) durante 4 horas a 37 graus. Posteriormente, as células foram
lavadas com PBS e incubadas com anticorpo anti-CD11b (clone M1/70) (1:200) PE,
anti-IFN-γ PEcy7 (clone XMG 1.2) (1:200), anti-TNF-α PE (MP6-XT22) (1:200), antiCD4 Pacific Blue (clone RM4-5) (1:200), anti-CD8 PercepCy5.5 (clone DK25) (1:200)
(eBioscience) diluído em PBS/BSA 1% durante 15 minutos. Após a incubação, as
células foram lavadas e fixadas com 200 µL de tampão paraformoldeído 2%. Foram
analisadas 100.000 células por amostra em citometria de fluxo e os resultados obtidos
analisados pelo software FlowJo.
33
3.11. Análise da migração e diferenciação das células mononucleares purificadas da
medula óssea nas lesões in vivo
Para análise do comportamento das células transferidas nas lesões dos animais
infectados por L. major, camundongos C57BL/6 com marcador CD45.2
foram
infectados pela via intradérmica (na orelha) com L. major (1x106). Após duas semanas
de infecção, o concentrado de células CD11b+ de camundongos com marcador CD45.1
obtido da medula por purificação com anticorpos foi transferido para camundongos
CD45.2 pela via endovenosa (10x106/50 µL/camundongo). Em 24 horas e sete dias após
a transferência, os animais foram sacrificados e o baço, o linfonodo drenante e a lesão
foram coletados para análise dos marcadores Ly6C, CD11b+, CD11c, MHCII, Ly6G,
CD45.1, CD45.2 nas células transferidas por citometria de fluxo. As células obtidas
foram e incubadas durante 30 minutos a 4 C com solução de bloqueio PBS/BSA 5%.
Posteriormente, as células foram lavadas com PBS e incubadas com anticorpo antiCD11b (clone M1/70) (1:200) PE, anti-CD11c PEcy7 (clone N418) (1:200), anti-Ly6C
PercpCy5 (clone HK1.4) (1:200), anti-Ly6G (clone 1A.8) Pacific Blue (1:200), antiMHCII APC (clone M5/114.15.2) (1:200), anti-CD45.1 (clone A20) Pacific Blue
(1:200) e anti-CD45.2 FITC (clone 104) (1:200) (eBioscience) diluído em PBS/BSA 1%
durante 15 minutos. Após a incubação, as células foram lavadas e fixadas com 200 µL
de tampão paraformoldeído 2%. Foram analisadas 50.000 células por amostra em
citometria de fluxo e os resultados obtidos analisados pelo software FlowJo.
3.13. Análises Estatísticas
Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente pelo teste t de Student,
sendo consideradas significativas as diferenças com p<0,05*.
34
RESULTADOS
35
4. RESULTADOS
4.1. Desenvolvimento do modelo para lesões crônicas nos camundongos TNFR1 KO
infectados por L. major
4.1.1 Caracterização do desenvolvimento crônico das lesões cutâneas
Primeiramente, os camundongos selvagens e TNFR1 KO foram infectados com
L. major pela via intradérmica (orelha), como descrito no modelo experimental para
infecção por parasitas do gênero Leishmania (Côrtes e cols., 2010). Os resultados
mostraram que os animais TNFR1 KO infectados na orelha com L. major perdem o
tecido da orelha (cartilagem) após 4-6 semanas de infecção devido à reação inflamatória
intensa desenvolvida. Esse resultado nos impediu de infectar os camundongos TNFR1
KO com L. major na orelha para acompanhar a progressão das lesões em fases mais
avançadas de infecção (dados não mostrados).
Dessa forma, nesse estudo, camundongos C57BL/6 e TNFR1 KO foram
inoculados com L. major pela via subcutânea nas patas e as lesões foram acompanhados
e medidos por 20 semanas para caracterizar as lesões cutâneas crônicas desenvolvidas
pelos camundongos TNFR1 KO. Os camundongos TNFR1 KO, a partir da oitava
semana de infecção, desenvolveram lesões maiores quando comparados aos animais
selvagens C57BL/6 (Figura 1A e 1B) (p<0.05). Além disso, foi observado um controle
do parasitismo no local de infecção, como os camundongos selvagens, na décima quinta
semana de infecção (Figura 1C).
As análises histopatológicas das lesões cutâneas crônicas dos animais TNFR1
KO infectados mostraram lesões com infiltrado inflamatório difuso e intenso nas lesões
desses animais, após seis semanas de infecção, permanecendo essas características até a
décima quinta semana de infecção, quando comparados aos camundongos selvagens
(Figura 2A, B, C e D). Na décima quinta semana de infecção, há redução significativa
do infiltrado inflamatório nos camundongos selvagens, entretanto, nas lesões dos
camundongos TNFR1 KO há intenso infiltrado inflamatório (Figura 2E), edema
36
eosinofílico, evidente presença de infiltrado misto com grande representação de
polimorfonucleares e debris celulares.
37
A
C
2.5
C57BL/6
C57BL/6
Lesão (mm)
2.0
TNFR1 KO
1.5
1.0
0.5
0.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
semanas após infecção
Carga parasitária (-log título)
B
D
*
10
TNFR1 KO
*
8
n.s.
6
4
2
0
6 semanas
15 semanas
Figura 1: Crescimento da área da lesão pela infecção e parasitismo nos camundongos TNFR1 KO e
selvagens infectados por L. major. (A) os camundongos foram infectados com 1x106 formas
estacionárias de L. major na pata. As lesões foram semanalmente medidas com paquímetro e a média dos
valores das patas de camundongos não infectados foi subtraída de cada pata infectada para estimativa da
lesão. Após 6 e 15 semanas de infecção, os camundongos foram eutanasiados e as lesões foram removidas
para determinação da carga parasitária por meio da técnica de diluição limitante. A carga dos parasitas foi
determinada individualmente e as médias das diluições máximas de cada grupo foram expressas pelo
logaritmo negativo do título (última diluição positiva) (B). (C e D) aspecto macroscópico das lesões de
camundongos C57BL/6 e TNFR1 KO após 15 semanas de infecção. Cada ponto é representativo de cinco
animais por grupo. * representa p<0,05 pelo t de Student. Os resultados são representativos de dois
experimentos independentes.
38
A
B
C
D
2m
2m
20m
Células inflamatórias
(area nuclear/lesão m2)
E
x104
25
20
C57BL/6
TNFR1 KO
15
10
5
0
Figuras 2: Análises histopatológicas das lesões cutâneas crônicas dos camundongos TNFR1 KO e
selvagens infectados por L. major. Os camundongos foram infectados, de forma subcutânea na pata, com
L. major (1x106). Após 6 (A-B) e 15 (C-D) semanas de infecção as lesões foram removidas para análise
histológica. (E) Quantificação do infiltrado inflamatório (celularidade) por morfometria na décima quinta
semana de infecção. Cada ponto é representativo de três camundongos por grupo. Os resultados são
representativos de dois experimentos independentes.
39
4.1.2. Análise do perfil de citocinas e FoxP3 nas lesões crônicas desenvolvidas nos
camundongos TNFR1 KO e selvagens infectados por L. major
Os animais TNFR1 KO infectados apresentaram maior expressão e concentração
de IFN-γ e TNF-α nas lesões cutâneas crônicas quando comparadas às lesões dos
selvagens. Entretanto, não foram encontradas diferenças na expressão e concentração de
IL-4 entre os animais selvagens e TNFR1 KO (Oliveira e cols., 2012). Dessa forma, com
o objetivo de caracterizar os fatores envolvidos na persistência das lesões cutâneas
desenvolvidas nos camundongos TNFR1 KO infectados, mesmo na presença de baixo
parasitismo, analisamos a expressão de citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-17, assim
como a expressão de FoxP3, nas lesões.
Houve maior expressão de IFN-γ e TNF-α nas lesões cutâneas crônicas nos
animais TNFR1 KO infectados (p<0.05) (Figura 3A e 3B). Houve maior expressão de
IL-17 nas lesões dos camundongos TNFR1 KO que os animais selvagens (p<0.05)
(Figura 3C), após quinze semanas de infecção. Para IL-10 e FoxP3 não houve diferença
entre os camundongos selvagens e TNFR1 KO após quinze semanas de infecção.
Entretanto, para esses dois fatores, podemos observar menor expressão em ambos os
grupos de camundongos comparados na décima quinta semana de infecção que na sexta
semana de infecção (Figura 3D e Figura 4).
40
TNF-
A
1000
IFN-
B
*
C56BL/6
*
1000
TNFR1 KO
800
800
Aumento da expressão de mRNA
(aumento em vezes/HPRT)
*
600
600
400
400
200
200
0
NI
6
15
*
0
NI
C
6
15
D
30
15
IL-10
20
10
10
5
0
NI
6
15
semanas após infecção
IL-17
*
0
NI
6
15
semanas após infecção
Figura 3: Expressão de IFN-γ, TNF-α, IL-10 e IL-17 nas lesões cutâneas crônicas dos camundongos
TNFR1 KO e selvagens infectados por L. major. Os camundongos foram infectados com 1x106 L. major
na pata e após 6 e 15 semanas de infecção os animais foram eutanasiados e as patas coletadas para a
análise da expressão de mRNA para TNF-α (A), IFN-γ (B), IL-10 (C) e IL-17 (D) por PCR em tempo
real. Barras representam a média ± desvio padrão de quatro camundongos por grupo. * representa p<0,05
pelo teste t de Student. Os resultados são representativos de dois experimentos independentes.
41
Aumento da expressão de mRNA
(aumento em vezes/HPRT)
200
FoxP3
*
C56BL/6
TNFR1 KO
150
100
50
0
NI
6
15
semanas após infecção
Figura 4: Expressão de FoxP3 nas lesões cutâneas crônicas dos camundongos TNFR1 KO e
selvagens infectados por L. major. Os camundongos foram infectados com 1x106 L. major na pata e
após 6 e 15 semanas de infecção os camundongos foram eutanasiados e as patas coletadas para a análise
da expressão de mRNA para de FoxP3 por PCR em tempo real. Barras representam a média ± desvio
padrão de quatro animais por grupo. * representa p<0,05 pelo t de Student. Os resultados são
representativos de dois experimentos independentes.
42
4.1.3 Avaliação da expressão das quimiocinas CCL2 e CCL5 nas lesões cutâneas
crônicas dos camundongos TNFR1 KO e selvagens infectados com L. major
As lesões cutâneas crônicas dos camundongos TNFR1 KO infectados
apresentam maior expressão de IFN-γ, TNF-α e IL-17 quando comparados aos animais
selvagens, houve maior expressão de CCL2 (Figura 5A) e CCL5 (Figura 5B) nas
lesões dos camundongos TNFR1 KO após quinze semanas de infectados com L. major
(p<0.05).
43
A
C56BL/6
CCL2
15000
TNFR1 KO
*
Aumento da expressão de mRNA
(aumento em vezes/HPRT)
10000
*
5000
0
NI
6
15
B
30
CCL5
20
*
10
0
NI
6
15
semanas após infecção
Figura 5: Expressão de CCL2 e CCL5 nas lesões cutâneas crônicas dos camundongos TNFR1 KO e
selvagens infectados por L. major. Os camundongos foram infectados com 1x106 L. major na pata e após
6 e 15 semanas de infecção os animais foram eutanasiados e as patas coletadas para a análise da expressão
de mRNA de (A) CCL2 e (B) CCL5 por PCR em tempo real. Barras representam a média ± desvio padrão
de quatro animais por grupo. * representa p<0,05 pelo t de Student. Os resultados são representativos de
dois experimentos independentes.
44
4.1.4 Avaliação do infiltrado inflamatório nas lesões crônicas desenvolvidas nos
camundongos TNFR1 KO infectados por L. major
Houve persistência de números maiores de neutrófilos (Ly6G+) e células T
CD8+ nas lesões dos camundongos TNFR1 KO infectados após quinze semanas de
infecção, quando comparados aos animais selvagens (p<0.05). Não foram detectadas
diferenças no número de macrófagos (F4/80) e de células T CD4+ entre os
camundongos selvagens e os TNFR1 KO nos pontos de infecção estudados (Figura 6AD).
Foi investigado também o infiltrado de células dendríticas nas lesões. Em duas
semanas de infecção foi encontrado um número similar de células dendríticas CD11c+ e
Ly6C+ e CD11c+ e MHCII+ em ambas linhagens. Entretanto, após seis semanas de
infecção, nossos resultados mostraram uma porcentagem menor de células dendríticas
CD11c+ e MHCII+ e CD11c+ e Ly6C+ nas lesões dos camundongos TNFR1 KO
infectados em comparação aos camundongos selvagens (p<0.05) (Figura 7A e B).
45
B
A
2000
C56BL/6
TNFR1 KO
CD4+
1500
1000
TNFR1 KO
CD4
C57BL/6
500
0
88.8%
66.3%
C
2000
24.6%
CD8
Ly6G
0.51%
8.83%
Contagem de células
37%
9.02%
F4/80
Número de Células nas lesões
CD8+
3.91%
1500
*
1000
500
0
D
250
200
150
100
C57BL/6 (MFI 31.2)
50
TNFR1
KO (MFI
TNFR1KO
(MFI339)
339)
0
C57BL/6 (MFI 31.2)
F4/80
E
800
Ly6G+
*
600
400
200
0
Figura 6: Infiltrado inflamatório nas lesões crônicas nos camundongos TNFR1 KO e selvagens
infectados com L. major. Os camundongos foram infectados com 1x106 L. major na pata e após 15
semanas de infecção os animais foram eutanasiados e as patas coletadas para a análise do infiltrado
inflamatório por citometria de fluxo. (A) dot plots das células da lesão. Números absolutos das células
TCD4+ (B), TCD8+ (C), F4/80 (D) e Ly6G+ (E). Barras representam a média ± desvio padrão de quatro
animais por grupo. * representa p<0,05 pelo t de Student.
46
% de células CD11c+ e MHCII+
A
50
C57BL/6
40
TNFR1 KO
*
30
20
10
0
2
6
% de células CD11c+ e Ly6C+
B
50
40
*
30
20
10
0
2
6
semanas após infecção
Figura 7: Infiltrado inflamatório de células dendríticas nas lesões nos camundongos TNFR1 KO e
selvagens infectados com L. major. Grupos de camundongos selvagens C57BL/6 e TNFR1 KO foram
infectados com 1x106 L. major pela via intradérmica na orelha. Após 2 e 6 semanas de infecção a lesão foi
coletada e processada para análise das porcentagens das populações CD11c+ e MHCII+ (A) CD11c+ e
Ly6C+ (B) por citometria de fluxo. Barras representam a média ± desvio padrão de quatro animais por
grupo. * representa p<0,05 pelo t de Student.
47
4.2. Caracterização do processo de redução das lesões crônicas desenvolvidas nos
camundongos TNFR1 KO infectados por L. major e tratados com células
mononucleares purificadas da medula óssea
4.2.1 Avaliação da terapia com células mononucleares purificadas da medula óssea
nas lesões crônicas nos camundongos TNFR1 KO infectados por L. major
Nas preparações de células mononucleares por gradiente de Ficoll há maior
porcentagem de células expressando CD115 e CD117 (c-kit) e menor porcentagem de
células Ly6G+ quando comparadas com a expressão desses marcadores nos preparados
de células totais da medula óssea. Esses resultados mostram que a separação células
mononucleares tem maior porcentagem de monócitos (p<0.05). Não houve diferenças na
porcentagem de células CD11b+ e Ly6C+ entre as preparações de células totais e células
mononucleares purificadas da medula óssea (Figura 8A).
O tratamento com células de medula óssea é capaz de reduzir as lesões cutâneas
crônicas na pata dos animais infectados, quando comparados aos animais tratados com
PBS (p<0.05) (Figura 8B). Interessantemente, não houve diferenças significativas nas
medidas das lesões entre os camundongos TNFR1 KO que receberam células purificadas
suficientes ou deficientes do receptor 1 do TNF-α, entretanto há diferença significativa e
qualitativa entre os tratamentos com células totais e células mononucleares purificadas
da medula óssea quando comparados entre si (p<0.05) (Figura 8B-D).
48
B
A
Células da medula óssea
3.0
Células mononucleadas purificadas
2.5
60
*
40
*
*
Lesão (mm)
% de células positivas
80
20
+ PBS
+ células da medula óssea do TNFR1 KO
2.0
**
1.5
*
** *
1.0
*
0.5
0.0
0
0
CD11b+ Ly6C+ Ly6G+ CD115+ c-Kit+
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
semanas após infecção
D
C
+ PBS
3.0
+ Células mononucleares do TNFR1+/+
2.0
*
1.5
1.0
*
* ** ***
0.5
Lesão (mm)
Lesão (mm)
2.5
3.0
+ PBS
2.5
+ Células mononucleares do TNFR1 KO
2.0
*
1.5
1.0
**
** * ** *
0.5
0.0
0.0
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
semanas após infecção
0
2
4
6
8
10 12 14 16 18 20 22 24 26
semanas após infecção
Figura 8: Efeito dos tratamentos com células da medula óssea nas lesões crônicas dos camundongos
TNFR1 KO e selvagens infectados com L. major. (A) Células de medula óssea e uma fração de células
mononucleares purificadas da medula óssea por gradiente de ficoll foram obtidas de camundongos TNFR1
KO não infectados e posteriormente marcadas com anticorpo anti-CD11b, anti-Ly6C, anti-Ly6G, antiCD115 e anti-c-kit. Cinqüenta mil células foram analisadas por amostra, por citometria de fluxo. Barras
representam a média ± desvio padrão da porcentagem de marcadores nos preparados de células de cada
animal analisado (n=2). Grupos de camundongos TNFR1 KO (n=5) foram infectados com L. major e após
15 semanas da infecção os camundongos foram tratados com três injeções consecutivas, pela via
endovenosa, de células de medula óssea (B) ou células mononucleares purificadas de medula óssea
TNFR1+/+ (C) ou TNFR1 KO (D) (1x107/por injeção). Camundongos controles foram tratados com PBS.
As lesões foram acompanhadas e medidas semanalmente. *representa p<0,05 pelo teste t de Student.
Experimento representativo de três repetições independentes.
49
4.2.2 Avaliação do efeito na expressão de citocinas, arginase I, iNOS e FoxP3 após o
tratamento com células mononucleares purificadas da medula óssea nas lesões
crônicas nos camundongos TNFR1 KO infectados por L. major
Os camundongos TNFR1 KO infectados (décima quinta semana de infecção)
apresentam maior expressão de IFN-γ, TNF-α, IL-17 e expressão semelhante de IL-10 e
FoxP3 quando comparados aos camundongos selvagens. Dessa forma, amostras de
lesões de animais TNFR1 KO tratados e não tratados com células purificadas da medula
óssea foram coletadas após um e dois meses do último tratamento (vigésima primeira e
vigésima quinta semana de infecção) processadas e analisadas para expressão de mRNA
de IFN-γ, TNF-α, IL-17, IL-10, TGF-β e para arginase I, iNOS e FoxP3.
Houve maior expressão de IFN-γ e IL-10 nas lesões dos camundongos TNFR1
KO infectados e tratados com células purificadas da medula óssea após um e dois meses
do último tratamento com células purificadas da medula óssea em comparação aos
camundongos
que
receberam
PBS
(Figuras
9A-B
e
10A-B)
(p<0.05).
Interessantemente, houve menor expressão de IL-17 nas lesões dos animais TNFR1 KO
infectados e tratados com células após um e dois meses do tratamento quando
comparados aos camundongos que receberam PBS (Figuras 11A-B) (p<0.05).
Entretanto, não foram detectadas diferenças entre as expressões de TNF-α (Figuras 9CD), TGF-β (Figuras 10C-D), FoxP3 (Figuras 11C-D), iNOS (Figuras 12A-B) e
arginase I (Figuras 12C-D) nas lesões dos camundongos TNFR1 KO infectados e
tratados com células purificadas da medula óssea após um e dois meses de tratamento.
50
1 mês
2 meses
A
B
IFN-
*
40
Aumento da expressão de mRNA
(aumento em vezes/HPRT)
30
40
não infectado
infectado + PBS
infectado + células
20
20
10
10
0
0
C
50
40
*
30
D
TNF-
50
40
30
30
20
20
10
10
0
0
Figura 9: Expressão de IFN-γ e TNF-α nas lesões cutâneas crônicas dos camundongos TNFR1 KO
infectados por L. major e tratados com células purificadas da medula óssea. Grupos de camundongos
TNFR1 KO foram infectados com L. major e após 15 semanas da infecção os camundongos foram
tratados com três injeções consecutivas, por via endovenosa, de células mononucleares TNFR1 KO
purificadas da medula óssea (1x107/por dose). Camundongos infectados foram tratados com PBS como
controles. Após 1 e 2 meses do último tratamento (21 e 25 semanas de infecção), os camundongos foram
eutanasiados e as patas coletadas para análise da expressão de mRNA para IFN-γ (A-B) e TNF-α (C-D).
Barras representam a média ± desvio padrão de quatro animais por grupo. *representa p<0,05 pelo t de
Student. Os resultados são representativos de dois experimentos independentes.
51
1 mês
2 meses
A
IL-10
*
Aumento da expressão de mRNA
(aumento em vezes/HPRT)
30
20
B
não Infectado
Infectado + PBS
Infectado + células
*
30
20
10
10
0
0
C
25
D
TGF-
25
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
Figura 10: Expressão de IL-10 e TGF-β nas lesões cutâneas crônicas dos camundongos TNFR1 KO
infectados por L. major e tratados com células purificadas da medula óssea. Grupos de camundongos
TNFR1 KO foram infectados com L. major e após 15 semanas da infecção os camundongos foram
tratados com três doses consecutivas, por via endovenosa, de células mononucleares TNFR1 KO
purificadas da medula óssea autóloga (1x107/por dose). Camundongos infectados foram tratados com PBS
como controles. Após 1 e 2 meses do último tratamento (21 e 25 semanas de infecção) os camundongos
foram eutanasiados e as patas coletadas para análise da expressão de mRNA para IL-10 (A e B) e TGF-β
(C e D) por PCR em tempo real. Barras representam a média ± desvio padrão de quatro animais por
grupo. *representa p<0,05 pelo t de Student. Os resultados são representativos de dois experimentos
independentes.
52
1 mês
A
20
2 meses
B
IL-17
*
15
Aumento da expressão de mRNA
(aumento em vezes/HPRT)
20
não Infectado
infectado + PBS
15
Infectado + células
10
10
5
5
0
0
C
60
D
FoxP3
60
40
40
20
20
0
*
0
Figura 11: Expressão de IL-17 e FoxP3 nas lesões cutâneas crônicas dos camundongos TNFR1 KO
infectados por L. major e tratados com células purificadas da medula óssea. Grupos de camundongos
TNFR1 KO foram infectados com L. major e após 15 semanas da infecção os camundongos foram
tratados com três doses consecutivas, por via endovenosa de células mononucleares TNFR1 KO
purificadas da medula óssea autóloga (1x107/por dose). Camundongos infectados foram tratados com PBS
como controles. Após 1 e 2 meses do último tratamento (21 e 25 semanas de infecção) os camundongos
foram eutanasiados e as patas coletadas para análise da expressão de mRNA para IL-17 (A e B) e FoxP3
(C e D) por PCR em tempo real. Barras representam a média ± desvio padrão de quatro animais por
grupo. *representa p<0,05 pelo t de Student. Os resultados são representativos de dois experimentos
independentes.
53
1 mês
A
B
iNOS
20
não infectado
infectado + PBS
infectado + células
15
Aumento da expressão de mRNA
(aumento em vezes/HPRT)
2 meses
10
8
6
10
4
5
2
0
0
C
D
Arginase I
20
20
15
15
10
10
5
5
0
0
Figura 12: Expressão de arginase I e iNOS nas lesões cutâneas crônicas dos camundongos TNFR1
KO infectados por L. major e tratados com células purificadas da medula óssea. Grupos de
camundongos TNFR1 KO foram infectados com L. major e após 15 semanas da infecção os camundongos
foram tratados com três doses consecutivas, por via endovenosa, de células mononucleares TNFR1 KO
purificadas da medula óssea autóloga (1x107/por dose). Camundongos infectados foram tratados com PBS
como controles. Após 1 e 2 meses do último tratamento (21 e 25 semanas de infecção) os camundongos
foram eutanasiados e as patas coletadas para análise da expressão de mRNA para iNOS (A e B) e arginase
I (C e D) por PCR em tempo real. Barras representam a média ± desvio padrão de quatro animais por
grupo. Os resultados são representativos de dois experimentos independentes.
54
4.2.3 Avaliação do efeito de IFN-γ e IL-10 provenientes de células do linfonodo
drenante e baço após o tratamento com células mononucleares purificadas da medula
óssea nas lesões crônicas nos camundongos TNFR1 KO infectados por L. major
Diante dos resultados que mostraram diferenças na expressão de IFN-γ e IL-10
nas lesões dos camundongos tratados, os esplenócitos provenientes dos linfonodos
drenantes e baço foram estimuladas com antígeno de L. major por após 72 horas. Houve
aumento na produção de IL-10 e IFN-γ em comparação com as células provenientes dos
animais que receberam apenas PBS (p<0.05). Não foram observadas diferenças nas
concentrações de IFN-γ e IL-10 nas culturas de células provenientes do baço dos
animais tratados com células purificadas da medula óssea e estimuladas com antígeno de
L. major em comparação ao grupo que recebeu PBS (Figuras 13A-D).
55
IL-10
A
IFN-γ
B
*
600
*
Infectado + PBS
Infectado + Células
mononucleares
300
2000
pg/mL
pg/mL
450
*
2500
1500
1000
150
500
0
Sem estímulo
0
+ ag de L. major
sem estímulo
C
D
600
3000
400
pg/mL
pg/mL
+ ag de L. major
200
2000
1000
0
0
sem estímulo
+ ag de L. major
sem estímulo
+ ag de L. major
Figura 13: Produção de IL-10 e IFN-γ por células órgãos linfoides secundários dos camundongos
TNFR1 KO infectados por L. major e tratados com células purificadas da medula óssea. Grupos de
camundongos TNFR1 KO foram infectados com L. major e após 15 semanas da infecção os camundongos
foram tratados com três doses consecutivas, por via endovenosa com células mononucleares TNFR1 KO
purificadas da medula óssea autóloga (1x107/por dose). Camundongos infectados foram tratados com PBS
como controles. Após 1 mês do último tratamento, os camundongos foram sacrificados e as linfonodos
drenantes e baço foram coletados, processados e as células estimuladas com antígeno de L. major por 72
horas. Após esse período os sobrenadantes foram coletados e as concentrações de IL-10 (A e C, linfonodo
e baço, respectivamente) e IFN-γ (B e D, linfonodo e baço, respectivamente) determinados por ELISA.
Barras representam a média ± desvio padrão de quatro animais por grupo. *representa p<0,05 pelo t de
Student. Os resultados são representativos de dois experimentos independentes.
56
4.2.4 Avaliação do efeito, na carga parasitária, após o tratamento com células
mononucleares purificadas da medula óssea nas lesões crônicas nos camundongos
TNFR1 KO infectados por L. major
A carga parasitária dos camundongos tratados com células purificadas da medula
óssea após um e dois meses do último tratamento por diluição limitante. Não foram
detectadas diferenças entre o número de parasitas nos grupos de camundongos que
receberam injeções de PBS e o grupo de camundongos tratados com células purificadas
da medula óssea nos períodos analisados (Figuras 14).
57
A
10
8
n.s.
6
Carga parasitária
(-log10)
4
2
0
+PBS
+ celulas
B
10
n.s.
8
6
4
2
0
+ PBS
+ celulas
Figura 14: Carga de parasitas nas lesões cutâneas crônicas dos camundongos TNFR1 KO infectados
com L. major e após o tratamento com células purificadas da medula óssea. Grupos de camundongos
TNFR1 KO (n=9) foram infectados com L. major e após 15 semanas da infecção os camundongos foram
tratados com três doses consecutivas, por via endovenosa, de células mononucleares TNFR1 KO
purificadas da medula óssea. Após 1 (A) e 2 (B) meses do último tratamento (21 e 25 semanas de
infecção) os camundongos foram eutanasiados e as lesões coletadas para análise das cargas parasitárias. A
quantificação de parasitas foi determinada individualmente e as médias das diluições máximas de cada
grupo foram expressas pelo logaritmo negativo do título (última diluição positiva). Experimento
representativo de duas repetições independentes.
58
4.2.5 Análise da migração das células mononucleares transferidas para as lesões
cutâneas nos camundongos TNFR1 KO infectados por L. major
Foram encontradas células GFP+ nas lesões cutâneas crônicas dos animais
TNFR1 KO infectados com L. major, após 24 horas e sete dias da transferência. Houve
também maior presença de células transferidas GFP+ após 24 horas do que com sete
dias. Células transferidas GFP+ também foram localizadas nos linfonodos drenantes e
baço, após 24 horas e sete dias, dos animais TNFR1 KO infectados (Figura 15).
59
Lesão
Linfonodo drenante
Baço
10000
7500
5000
2500
di
as
7
ho
ra
s
24
di
as
7
ho
ra
s
24
di
as
7
ho
ra
s
0
24
Número de células GFP+ por órgão
12500
Figura 15: Análise da migração das células purificadas da medula óssea de camundongos TNFR1
KOGFP+ para as lesões cutâneas crônicas de camundongos TNFR1 KO infectados por L. major.
Camundongos TNFR1 KO (n=4) foram infectados com L. major na pata e após 15 semanas da infecção
foram tratados com células purificadas da medula de camundongos não infectados TNFR1 KO GFP+ (1x107
células/camundongo). Após 24 horas ou 7 dias da transferência das células, a pata infectada e os órgãos
linfóides secundários foram coletados e analisados por citometria de fluxo (100.000 eventos/análise). Os
resultados estão expressos por número absoluto de células GFP+ nos órgãos analisados. Barras
representam a média ± desvio padrão de quatro animais por grupo Experimento representativo de duas
repetições independentes
60
4.2.6 Avaliação do infiltrado inflamatório, por histopatologia, nas lesões cutâneas nos
camundongos TNFR1 KO infectados por L. major após o tratamento com células
mononucleares purificadas da medula óssea
Após quatro semanas do último tratamento as lesões cutâneas dos camundongos
TNFR1 KO infectados e tratados com PBS (Figura 16A) ou células mononucleares
purificadas da medula óssea (Figura 16B) foram registradas. Nas lesões do grupo que
recebeu apenas PBS há grande reatividade vascular, associada com infiltrados
compactos e por vezes associada a intensos graus de lesão celular, e presença de restos
celulares, com predomínio de fenômenos degenerativos. Entretanto, nas lesões dos
animais tratados, há presença de infiltrado inflamatório associado com deposição de
material intercelular e edema, além de intensa reatividade celular das células do tecido
conjuntivo, bem como aspecto de tecido de granulação com vasos neo-formados em
maior quantidade. As lesões necrótico-degenerativas estão ausentes, e o padrão do
infiltrado é predominantemente mononuclear. Tal cenário poderia sugerir ação das
células transplantadas nos mecanismos de regeneração tecidual (Figura 16 C e D). Os
resultados quantitativos das análises histopatológicas mostraram uma menor
porcentagem de células polimorfonucleares nas lesões dos camundongos TNFR1 KO
tratados com células purificadas da medula óssea em comparação aos animais tratados
com PBS (p<0.05) (Figura 16E).
61
B + CÉLULAS
+ PBS
A
C
D
20m
% de células polimorfonucleares
do número total de células inflamatórias
E
10
8
*
6
4
2
0
+ PBS
+ Células
Figuras 16: Análises histopatológicas das lesões crônicas dos camundongos TNFR1 KO infectados
por L. major e tratados com células purificadas da medula óssea. Grupos de camundongos TNFR1 KO
(n=3) foram infectados com L. major e após 15 semanas da infecção os camundongos foram tratados com
três doses consecutivas, por via endovenosa com células mononucleares TNFR1 KO purificadas da
medula óssea. Após 1 mês do último tratamento (21 semanas de infecção) os animais foram eutanasiados
e as lesões coletadas para as análises histopatológicas. (A e B) aspecto macroscópico das lesões de
camundongos, após 1 mês do tratamento com células. (C e D) aspecto histológico das lesões após 1 mês
do tratamento com células. (E) quantificação diferencial de polimorfonucleares do infiltrado inflamatório
total por morfometria.
O ponto de infecção e tratamento analisado (1 mês após o tratamento) é
representativo de três camundongos por grupo. * representa p<0,05 pelo t de Student. Os resultados são
representativos de dois experimentos independentes.
62
4.2.7 Tratamento de camundongos selvagens infectados com L. major com células
mononucleares purificadas da medula óssea
Para essa análise do fenômeno de cicatrização das lesões cutâneas em outras
linhagens de camundongos utilizamos camundongos C57BL/6 selvagens. Entretanto,
essa linhagem de camundongos cura espontaneamente as lesões desenvolvidas pela
infecção por L. major. Dessa forma, para avaliar esse fenômeno, após infectarmos
grupos de camundongos C57BL/6 com L. major, transferimos, simultaneamente, células
purificadas da medula óssea (10x106/50 µL/camundongo). O grupo controle recebeu
apenas o veículo, PBS. Esses mesmos tratamentos foram repetidos por mais dois tempos
em duas semanas. A progressão das lesões foi acompanhada e medida por oito semanas.
Nossos resultados mostraram que as células purificadas da medula óssea induziram
proteção no desenvolvimento das lesões no animal selvagem, quando comparadas aos
controles com PBS (p>0.05) (Figura 17).
63
1.5
PBS
Lesão (mm)
Células
1.0
0.5
* *
*
2
4
*
0.0
0
6
8
semanas após infecção
Figura 17: Tratamento de camundongos selvagens, infectados com L. major, com células purificadas
da medula óssea. Grupos de camundongos C57BL/6 (n=5 por grupo) foram infectados com L. major
(1x106) e simultaneamente tratados com injeção, pela via endovenosa, com células purificadas
(10x106/por injeção). Os animais receberam mais duas injeções de células semanalmente. As lesões foram
acompanhadas por oito semanas e medidas semanalmente com paquímetro. *representa p<0,05 referente
ao teste t de Student.
64
4.2.8 Análise da diferenciação, in situ, das células mononucleares purificadas da
medula óssea nas lesões cutâneas de camundongos infectados com L. major
Para avaliar a diferenciação das células purificadas da medula óssea, nós
construímos um modelo na leishmaniose experimental para avaliar a diferenciação de
células purificadas da medula óssea in situ. Dessa forma, infectamos animais selvagens
com L. major e após duas semanas de infecção transferimos células purificadas da
medula óssea. O fenótipo das células das lesões foi analisado 24 horas e sete dias após a
transferência. Após 24 horas da transferência, as células permanecem com o fenótipo
similar antes da transferência (CD11clo). Entretanto, após sete dias da transferência, as
células transferidas estavam diferenciadas em células dendríticas (CD11c high) (Figuras
18A e B).
Para avaliar o efeito da diferenciação das células purificadas da medula óssea nos
camundongos TNFR1 KO infectados, infectamos camundongos selvagens CD45.1 e
após duas semanas, transferimos células CD11b+ purificadas da medula óssea de
doadores CD45.2 TNFR1+/+ e TNFR1KO. Após sete dias da transferência, o local de
lesão e linfonodos drenantes foram analisados e a população de células transferidas
marcadas para células dendríticas. Nossos resultados mostraram que não houve
influência significativa do receptor 1 do TNF-α na diferenciação das células purificadas
da medula óssea em tipos de células dendríticas (CD11c+ e MHCII+) nas lesões de
animais infectados (Figuras 19A e B)
65
A
B
24 horas
Infectado + células
Infectado
Infectado + células
CD45.2
Infectado
7 dias
Ly6C
10.8%
CD11c
CD11c
CD45.1
62.2%
Ly6C
Figura 18: Modelo para análise da diferenciação de células purificadas da medula óssea em células
dendríticas in vivo. Grupos de camundongos selvagens CD45.2+ (n=3) foram infectados com L. major de
forma intradérmica na orelha (1x106). Após duas semanas de infecção, grupos de camundongos
receberam, de forma endovenosa, uma injeção com células de camundongos CD45.1+ purificadas da
medula (10x106/50µL/camundongo) e o grupo controle PBS. Após 24 horas (A) e sete (7) dias (B) da
transferência, as lesões foram coletadas e analisadas para marcadores de monócitos e células dendríticas
(Ly6C e CD11c) por citometria. Foram analisados 100.000 eventos por amostra. Os plots são
representativos de gates originários de populações de células vivas e CD11b+ . Os resultados mostrados
são representativos de quatro experimentos independentes.
66
A
+ PBS
0%
0.9 %
+ células TNFR1 KO
% de células CD11c+ e MHCII+
CD45.1
+ células TNFR1+/+
100
0.3 %
n.s.
80
60
40
20
0
+ células
TNFR1+/+
+ células
TNFR1 KO
CD45.2
Figura 19: Análise da participação do TNFR1 na diferenciação de células purificadas da medula
óssea em células dendríticas in situ. Grupos de camundongos selvagens CD45.1+ foram infectados com
L. major por via intradérmica na orelha (1x106). Após duas semanas de infecção, grupos de animais
(n=3por grupo) receberam, por via endovenosa, células CD11b+TNFR1+/+ ou CD11b+TNFR1KO, todas
de camundongos CD45.2+, purificadas da medula óssea. Sete dias após a transferência, as lesões foram
coletadas e a população transferida analisada para marcadores de células dendríticas (CD11c+ e MHCII+).
Em (A), representa-se a população de células TNFR1+/+ e TNFR1KO CD45.2+ localizada na lesão e em
(B) representa-se a população CD11c+ e MHCII+ na população transferida após 7 dias da transferência.
Foram analisados 100.000 eventos por amostra. Os plots são representativos de gates originários de
populações de células vivas e CD11b+. *representa p<0,05 pelo t de Student. Os resultados mostrados são
representativos de dois experimentos independentes.
67
4.2.9 Avaliação do perfil de células produtoras de citocinas nas lesões de animais
infectados e tratados com células mononucleares purificadas da medula óssea
Células do infiltrado inflamatório de animais TNFR1 KO infectados foram
coletadas e analisadas para a produção de citocinas após a transferência de células
purificadas da medula. Nossos resultados mostraram que após sete dias da transferência,
as lesões dos animais TNFR1 KO tratados com as células de medula apresentaram uma
menor porcentagem de células T CD8+ produtoras de IFN-γ e também menor
porcentagem de células T CD4+ e T CD8+ produtoras de TNF-α quando comparadas às
lesões dos animais tratados com PBS (p<0.05). Não houve diferença significativa na
produção de TNF-α em células CD11b+ dos animais recipientes entre os grupos (Figura
20A a C).
68
A
B
Infectado
+ células
Infectado
Infectado
+ células
Infectado
3.8%
31%
1.8%
31%
TNF-α
IFN-γ
*
CD4
CD4
2.7%
9.9%
0.9%
4.1%
*
*
CD8
C
CD8
Infectado
6.1%
TNF-α
7.5%
Infectado
+ células
CD11b
Figura 20: Análise das células produtoras de citocinas nas lesões de camundongos TNFR1 KO
infectados com L. major e tratados com células purificadas da medula óssea. Grupos de camundongos
(n=3 por grupo) TNFR1 KO foram infectados com L. major por via intradérmica na orelha (1x106). Após
duas semanas de infecção, grupos de animais receberam, por via endovenosa, células CD11b+ TNFR1 KO
purificadas da medula óssea (10x106/camundongo). Sete dias após a transferência dessas células os
camundongos foram sacrificados, as células das lesões foram coletadas, estimuladas com brefeldina A e
ionomicina, marcadas e analisadas por citometria para produção de citocinas IFN-γ e TNF-α. (A) análise
de IFN-γ na população de células TCD4+ e TCD8+ (CD11b-) da lesão de camundongos infectados por L.
major e tratados com células da medula óssea; (B) representa a análise de TNF-α na população de células
TCD4+ e TCD8+ (CD11b-) das lesão de camundongos infectados com L. major e tratados com células
da medula óssea; (C) representa a análise de células TNF-α+ na população de células CD11b+ das lesões
de camundongos infectados com L. major e tratados com células da medula óssea. Foram analisados
100.000 eventos por amostra. *representa p<0,05 pelo t de Student Os resultados mostrados são
representativos de dois experimentos independentes.
69
DISCUSSÃO
70
5. DISCUSSÃO
5.1 O modelo
A infecção por parasitas do gênero Leishmania pode gerar lesões cutâneas
autolimitadas e que podem cicatrizar espontaneamente. Entretanto, aproximadamente
3% dos indivíduos que obtiveram cura espontânea ou farmacológica da primeira
infecção desenvolvem muitos anos depois, lesões ulcerativas que atingem e destroem as
regiões das mucosas causando morbidade, estigma social e em alguns casos a morte do
individuo afetado. O tratamento para esses tipos de lesões é complicado pela difícil
cicatrização e pelas mutilações ocorridas nessas regiões acometidas como a região
nasofaringe (Amato e cols., 2003; Amato e cols., 2008). Outro desafio, no âmbito do
estudo da leishmaniose mucocutânea, é ausência de um modelo experimental bem
estabelecido que simule as características apresentadas nas lesões em humanos e
também que seja de fácil manejo laboratorial. Neste trabalho caracterizamos as lesões
cutâneas crônicas de camundongos TNFR1 KO e mostramos que as características
descritas coincidem com as encontradas nas lesões de humanos. Além disso, na vertente
da medicina regenerativa, as terapias celulares, nos últimos anos, mostraram um grande
potencial no tratamento de doenças crônicas. Existem poucos estudos que elucidam os
benefícios da terapia celular e nesse seguimento, nossa proposta é tratar as lesões
crônicas dos animais TNFR1 KO com células mononucleares provenientes da medula
óssea.
A leishmaniose mucocutânea é causada por L. braziliensis, L. guyanensis
(Marsden, 1994; Guerra e cols., 2011) ou L. amazonensis (Junqueira e cols., 2003).
Nesse trabalho, nós infectamos os camundongos TNFR1 KO com L. major em
continuação aos trabalhos iniciados por Vieira e colaboradores (1996). Resultados de
nosso laboratório tem mostrado que a infecção de camundongos TNFR1 KO por L.
braziliensis ou L. amazonensis reproduz o mesmo fenótipo de quando estes animais são
infectados com L. major na manutenção das lesões cutâneas por mais de 10 semanas de
infecção e o controle do parasitismo no local, similar às lesões dos animais selvagens
71
(comunicação pessoal entre os integrantes do laboratório de Gnotobiologia e Imunologia
Matheus Heitor Carneiro, Leonardo Vaz e Paula Melo Seixas sobre projetos em
desenvolvimento no presente momento de infecção dos camundongos TNFR1 KO com
outras espécies de Leishmania, 2011-2012). Os resultados mostraram que as lesões
cutâneas desenvolvidas nos camundongos TNFR1 KO não disseminam para tecidos de
mucosas, como relatado nos pacientes que desenvolvem a forma mucocutânea. A causa
do desenvolvimento das lesões nas mucosas dos pacientes ainda não é conhecida, mas
alguns fatores, como a espécie da Leishmania e a genética do individuo infectado,
parecem ser cruciais nessa forma de manifestação da doença. Por isso, essas
informações podem ser usadas para explicar o não acometimento das mucosas em
camundongos TNFR1 KO infectados. O fato de camundongos TNFR1 KO não
desenvolverem lesões invasivas nas mucosas no nosso modelo pode ser explicado pelo
fato de a L. major não ser a causadora dos casos de leishmaniose mucocutânea. É
conhecido que espécies de Leishmania que causam a forma mucocutânea podem estar
infectadas por certos tipos de vírus e essa pode ser uma característica particular que está
correlacionada ao desenvolvimento das lesões crônicas nos pacientes e em camundongos
(Ives e cols., 2011). Outro fator relevante pode estar ligado ao hospedeiro. Apesar dos
poucos relatos do acometimento de regiões de mucosas em camundongos infectados
com Leishmania, foi mostrado que espécies de Leishmania causadoras da forma
mucocutânea invadiram tecidos de mucosas de cobaias (Zeledon e cols., 1982). Outros
estudos envolvendo Leishmania braziliensis infectadas ou não com vírus, serão
conduzidos por nosso grupo para avaliar o acometido de mucosas nos camundongos
TNFR1 KO.
Os dados mostram, para o modelo murino da leishmaniose mucocutânea, que as
lesões crônicas dos camundongos TNFR1 KO infectados com L. major são persistentes
devido à permanência de um processo inflamatório com alta expressão de IFN-γ, TNF-α
e IL-17. Este infiltrado inflamatório é rico de células T CD8+ e neutrófilos. Outros
dados mostraram que o perfil inflamatório local nos camundongos TNFR1 KO é
caracterizado por baixa taxa de apoptose e expressão de IL-4 (Oliveira e cols., 2012), IL-
72
10 e FoxP3, em período mais avançado da infecção, quando comparados aos animais
selvagens C57BL/6. Esses dados se mostram interessantes quando comparados com o
perfil de humanos acometidos pela forma mucocutânea: as lesões são crônicas
apresentam baixo parasitismo no local de lesão (Amato e cols., 2003 ; Amato e cols.,
2008), altos níveis de IFN-γ, TNF-α e presença de IL-17 (Castes e cols., 1993; Bacellar
e cols., 2002); um infiltrado inflamatório rico em linfócitos e polimorfonucleares
(Barral-Neto e cols., 1995; Boaventura e cols., 2010); e defeitos na regulação do
processo inflamatório na lesão (Faria e cols., 2005).
Sobre o controle do parasitismo local nas lesões cutâneas de camundongos
infectados sabe-se que a resolução do crescimento de L. major em camundongos é
mediada por óxido nítrico produzido por óxido nítrico sintase 2 (NOS2), que é induzida
por IFN-γ e TNF-α (Liew e cols., 1990; Cunha e cols., 1992).
O fato de os
camundongos TNFR1 KO apresentarem alta produção de TNF-α e IFN-γ nas lesões os
torna aptos a controlar o parasitismo local. O TNF-α induz a produção de óxido nítrico
via TNFR1, sugerindo que a indução de NOS2 observada nesses animais é proveniente
de uma via alternativa como de sinalização via CD40/CD40L. Dessa forma, como
previamente descrito (Vieira e cols., 1996; Nashleanas e cols., 1998), a persistência das
lesões não é devido à carga parasitária nas lesões cutâneas nos camundongos TNFR1
KO infectados.
O TNF-α é um dos primeiros fatores que medeiam à infiltração de células para o
sítio de infecção, estando muitas vezes associado ao dano tecidual (Malek e cols., 1998).
Em contrapartida, foi mostrado em infecções por outros patógenos que camundongos
TNFR1 KO não controlam o infiltrado inflamatório e a lesão tecidual
(Yap e cols.,
1998; Kanaly e cols., 1999; Di Genaro e cols., 2007; Eliçabe e cols., 2010). Entretanto,
em outro modelo, o murino de encefalomielite por HSV-1, camundongos TNFR1 KO
apresentam pequeno infiltrado inflamatório e pequena lesão, como consequência da
ausência das células na lesão (Vilela e cols., 2010). Nossos resultados mostraram que
camundongos TNFR1 KO apresentam um infiltrado inflamatório exacerbado e
permanente após quinze semanas de infecção quando comparados aos animais
73
selvagens, o que pode ser explicado pelos altos níveis de CCL2 e CCL5 detectados nas
lesões cutâneas destes animais também na décima quinta semana de infecção. Não
observamos aumento de outras quimiocinas nas lesões dos camundongos TNFR1 KO
em comparação aos animais selvagens quando infectados com L. major (dados não
mostrados). CCL2 e CCL5 são quimiocinas importantes na migração de monócitos,
macrófagos, células T e células NK em locais de lesão (Allavena e cols., 1994; Ritter &
Moll, 2000; Oghumu e cols., 2010). Dessa forma, podemos explicar o grande acúmulo
de células nas lesões ao aumento da expressão dessas duas quimiocinas.
Os resultados mostraram que o infiltrado inflamatório de células T CD8+ e
neutrófilos é persistente nos camundongos TNFR1 KO infectados quando comparados
aos animais selvagens. m camundongos, os linfócitos T CD8+ são essenciais para o
controle da infecção primária com atividade importante contra células que apresentam
antígeno de Leishmania (Stern e cols., 1998; Tsagozis e cols., 2003; Stager e cols.,
2010). No nosso trabalho relacionamos a persistência das lesões cutâneas nos animais
TNFR1 KO com a manutenção das células T CD8+ no infiltrado inflamatório, sugerindo
um provável papel destas células na manutenção das lesões. Esse é um fato interessante,
quando correlacionado ao envolvimento das células T CD8+ nas lesões mucocutâneas
em humanos, uma vez que alguns trabalhos relacionam a presença destas células com a
persistência das lesões crônicas nessa forma da doença (Barral-Netto e cols., 1995;
Brodskyn e cols., 1997). Foi mostrado que T CD8+, obtidas do sangue de indivíduos não
infectados, quando estimuladas in vitro com antígeno de L. amazonensis, expressam
marcadores de ativação de superfície e maior produção de IFN-γ que células T CD4+
(Pompeu e cols., 2001). Outros estudos mostraram que as células mononucleares do
sangue provenientes de pacientes com leishmaniose mucocutânea apresentam maior
atividade citotóxica mediada por células NK e células T CD8+ (Brodskyn e cols., 1997).
Um maior recrutamento de linfócitos T CD8+ expressando granzima A está associado à
progressão desta doença (Faria e cols., 2009). Podemos, assim, supor que o papel destes
linfócitos é a produção de IFN-γ, TNF-α e IL-17, embasados em alguns trabalhos que
74
mostram a importância dos mesmos na manutenção da inflamação em infecção por
Leishmania (Vargas-Inc e cols., 2008; Boaventura e cols., 2010).
Outros dados interessantes foram à persistência de neutrófilos e a maior
expressão de IL-17 nas lesões crônicas dos camundongos TNFR1 KO infectados quando
comparados aos animais selvagens. A presença de IL-17 em altos níveis está associada
ao desenvolvimento e progressão de lesões em doenças crônicas em modelos
experimentais e em humanos. Um dos mecanismos de ação da IL-17 nas lesões crônicas
está ligado ao recrutamento de neutrófilos para as lesões (Hemdan e cols., 2010).
Camundongos BALB/c quando infectados com L. major apresentavam lesões
progressivas associadas a maior concentração de IL-17. Quando o gene para IL-17 foi
deletado esses camundongos infectados com L. major não apresentaram mais lesões
progressivas. Esses dados sugerem que a presença de IL-17 era responsável por um
número maior de neutrófilos nas patas, e, como consequência, maiores lesões (Lopez e
cols., 2009). Em humanos, estudos mostraram que pacientes com a forma mucocutânea
da leishmaniose apresentam maior infiltrado celular, em especial de neutrófilos, nas
áreas de nasofaringe, quando comparados àqueles que foram tratados com fármacos
anti-Leishmania (Guerreiro e cols., 2000). Foi descrito que pacientes com a
leishmaniose mucocutânea apresentam expressão de IL-17 por células T CD4+, T CD8+
e CD14+ nas lesões (Bacellar e cols., 2009; Boaventura e cols., 2010). Boaventura e
colaboradores (2010) mostraram que as lesões de pacientes com a leishmaniose
mucocutânea
apresentam
infiltradas
de
neutrófilos
positivo
para
elastase,
mieloperoxidase e MMP-9, que estão relacionados com dano tecidual nos pacientes
infectados com L. braziliensis que desenvolveram a leishmaniose mucocutânea. Outros
estudos mostraram que a indução de MMP-9 na infecção por L. braziliensis está
relacionada às lesões mucocutânea (Maretti-Mira e cols., 2011). Dessa forma, a
persistência de IL-17 e neutrófilos nas lesões dos camundongos TNFR1 KO sugerem
que ambos são fatores importantes na persistência das lesões cutâneas crônicas.
Em resumo, a persistências das lesões nos camundongos TNFR1 KO infectados
por L. major, poderia estar associada a um processo inflamatório intenso caracterizado
75
por uma resposta do tipo Th1 e Th17, assim como relatados nas lesões em humanos com
a leishmaniose mucocutânea (Amato e cols., 2003; Antonelli e cols., 2004; Silveira e
cols., 2004; Faria e cols., 2005; Gaze e cols., 2006; Amato e cols., 2008; Bacellar e
cols., 2009; Boaventura e cols., 2010) e outros tipos de lesões crônicas em modelo
experimentais em camundongos (Sarkar e cols., 2009; Ma e cols., 2010; Batoulis e cols.,
2011; Grigorian e cols., 2011; Kroenke & Segal, 2011; Postigo e cols., 2011). Para
outros tipos celulares, como macrófagos (F4/80), nós observamos um número similar
entre o camundongo selvagem e o animal TNFR1 KO. Entretanto, a presença de células
dendríticas nas lesões parece ser importantes em processos de regulação da inflamação
nas lesões cutâneas crônicas dos camundongos TNFR1 KO infectados por L. major
como iremos discutir adiante.
Uma das formas de regulação do processo inflamatório pode ser realizada
eliminando-se células inflamatórias, por apoptose. Trabalhos indicam que a apoptose de
células inflamatórias na leishmaniose experimental é um fator importante para o controle
do desenvolvimento das lesões (Desbarats e cols., 2000; Savill e cols., 2002). Nós
mostramos que as lesões crônicas dos camundongos TNFR1 KO apresentam menor taxa
de apoptose, quando comparadas aos animais selvagens, sugerindo que esse é um
processo importante para eliminação das células inflamatórias das lesões e manutenção
das lesões (Oliveira e cols., 2012).
Outro fator interessante é que as lesões de camundongos selvagens e TNFR1 KO
em fases iniciais da infecção apresentam números similares de células dendríticas. Já na
sexta semana (fase crônica) o número de células dendríticas em camundongos TNFR1
KO foi baixo, quando comparados aos animais selvagens.
Trabalhos mostram a
importância do TNF-α para induzir a migração e a maturação de células dendríticas
(Ritter e cols., 2008; Wiethe e cols., 2008; De e cols., 2009; Vohra e cols., 2010; Ding e
cols., 2011), dessa forma podendo contribuir para o reparo tecidual. Assim, a ausência
de seu principal receptor nos camundongos em estudo constitui um empecilho para
eliminação das células inflamatórias via sinalização por TNF-α. (Allenbach e cols.,
2006; Richter & Topham, 2007; Allenbach e cols., 2008). Dessa forma, a não
76
eliminação das células inflamatórias não permite o estabelecimento de tipos celulares
importantes para o reparo tecidual.
A regulação da resposta imune na lesão cutâneas é importante para
estabelecimento da homeostase (Belkaid & Rouse, 2005; Belkaid e cols., 2006; Belkaid
e cols., 2007). Células dendríticas são tipos celulares importantes para manutenção e
regulação da integridade de tecidos cutâneos. Na imunologia de pele, as células
dendríticas são participantes importantes de processos de captura de antígeno presentes
nesses tecidos e ativação da resposta imune adquirida. Outro fato importante desse
processo é a participação de células dendríticas nos processos de reparo tecidual com
ativação de linfócitos T regulatórios, com produção de citocinas anti-inflamatórias (IL10), que migram para os tecidos cutâneos mantendo ou restabelecendo a integridade
tecidual durante a inflamação (Chu e cols., 2011). Assim sendo, a presença de células
dendríticas e fatores anti-inflamatórios são importantes para regulação da resposta
inflamatória intensa nas lesões cutâneas. Leon e colaboradores (2007) mostraram, no
modelo de infecção por L. major, que as células dendríticas derivadas de monócitos
provenientes da circulação, diferenciam-se no local de lesão, migram para linfonodos
drenantes e atuam na ativação de células T CD4+ para produção de IFN-γ e consequente
controle do parasitismo local. Nossos resultados mostraram que as lesões crônicas de
camundongos TNFR1 KO apresentam menores porcentagens de subtipos de células
dendríticas (Ly6C+ e CD11c+ e CD11c+ e MHCII+) quando comparadas às lesões dos
camundongos selvagens. Esses resultados podem ser explicados pela importância do
TNF-α na indução de migração de células dendríticas para lesão ou na participação do
TNFR1 para diferenciação de monócitos em células dendríticas (Van Lieshout e cols.,
2005). Entretanto, esses resultados sugerem que na infecção cutânea do camundongo
selvagem a migração destas células pode ser importante no reparo tecidual via ativação
de linfócitos T FoxP3+ e produtores de IL-10. Coerentemente, os camundongos TNFR1
KO apresentam números baixos de células dendríticas (Ly6C+ e CD11c+; CD11c+ e
MHCII+) nas lesões e menor expressão de IL-10 e FoxP3. Esses dados sugerem que a
participação de células dendríticas na infecção cutânea dos camundongos TNFR1 KO
77
pode estar relacionada à ativação de células T regulatórias produtoras de IL-10,
importante em reações anti-inflamatórias.
Esse conjunto de dados mostra que as lesões persistentes dos camundongos
TNFR1 KO são dependentes da persistência do infiltrado inflamatório exacerbado
predominante de células T CD8+, neutrófilos e falha na regulação desse infiltrado
inflamatório via apoptose e mecanismos de regulação dependente de ativação de células
regulatórias por células dendríticas. Dessa forma, apesar da ausência de acometimento
das mucosas, essas características da infecção e desenvolvimento da patogênese das
lesões cutâneas nos camundongos TNFR1 KO infectados por L. major coincidem com
as características descritas nas lesões crônicas dos pacientes com a leishmaniose
mucocutânea (Tabela 2). Esse modelo em camundongo pode servir para estudos da
patologia, terapias farmacológicas e biotecnológicas, para a leishmaniose mucocutânea.
78
Tabela 2: Características comuns descritas entre as lesões cutâneas de pacientes com leishmaniose
mucocutânea e as lesões crônicas desenvolvidas nos camundongos TNFR1 KO infectados por L. major
Características
Leishmaniose
mucocutânea
Referências
Jones e cols., 1987;
Amato e cols., 2003;
Amato e cols., 2008
Camundongos
TNFR1 KO
infectados com
L. major
Lesões cutâneas
crônicas
Sim
Sim
Infiltrado inflamatório
intenso nas lesões
crônicas
Sim
Guerreiro e cols., 2000;
Carvalho e cols., 2007
Sim
Carga parasitária baixa
nas lesões
Sim
Amato e cols., 2003;
Amato e cols., 2008
Sim
Altos níveis de IFN-γ e
TNF-α nas lesões
Sim
Castes e cols., 1993;
Da-Cruz e cols., 1996;
Blackwell e cols., 1999;
Gaze e cols., 2006;
Bacellar e cols., 2002
Defeito na regulação da
resposta imune
inflamatória nas lesões
Sim
Faria e cols., 2005
Sim
Sim
Barral e cols., 1995;
Brodskyn e cols., 1997;
Guerreiro e cols., 2000;
Faria e cols., 2009;
Boaventura e cols., 2010
Sim
Presença de altos
números de células
TCD8+ e neutrófilos
nas lesões
Presença de IL-17
Sim
Destruição de
cartilagens
Sim
Invasão dos tecidos de
mucosas
Sim
Barcelar e cols., 2009;
Boaventura e cols., 2010
Jones e cols., 1987;
Guerreiro e cols., 2000;
Maretti-Mira e cols., 2011
Jones e cols., 1987;
Amato e cols., 2003;
Amato e cols., 2008
Sim
Sim
Sim
Não
79
5.2. Transferência de células da medula óssea
A segunda parte desse trabalho foi o teste e caracterização do efeito da terapia
celular nas lesões cutâneas crônicas nos camundongos TNFR1 KO infectados por L.
major.
O tratamento para a leishmaniose mucocutânea é realizado pela administração de
fármacos como o antimônio pentavalente (Amato e cols., 2007). Essa terapia
farmacológica causa morte do parasita pelo fármaco, sugerindo que a eliminação dos
parasitas é importante para a cura das lesões. Entretanto, apesar do baixo número de
parasitas nas lesões dos pacientes com a forma mucocutânea, as lesões persistem
(Carvalho e cols., 2007). Interessante notar que a melhora das lesões induzida pelo
tratamento farmacológico da leishmaniose mucocutânea também reflete e está associada
à diminuição de tipos específicos de células do infiltrado inflamatório, como, por
exemplo, das células T CD4+, T CD8+ IFN-γ+ e TNF-α+ e neutrófilos (Guerreiro e
cols., 2000; Amato e cols., 2003; Amato e cols., 2007). Esses dados sugerem que os
diferentes tipos celulares presentes nas lesões mucocutâneas são importantes para o
progresso da cura ou permanência das lesões nos pacientes acometidos. Entretanto,
outros dados mostram que o uso prolongado de medicamentos anti-Leishmania podem
induzir resistência ao fármaco, ocasionando falha do tratamento ou novo aparecimento
das lesões, com seu infiltrado inflamatório típico (Grogl e cols., 1992; Ait-Oudhia e
cols., 2011a; Ait-Oudhia e cols., 2011b.). Dessa forma, novas propostas de terapias
alternativas, com o intuito de modular a resposta imune inflamatória intensa nas lesões
da leishmaniose mucocutânea, são necessárias.
Na vertente da medicina regenerativa, recentemente, trabalhos têm mostrado o
uso das terapias celulares, com células originadas da medula óssea autóloga, para o
reparo tecidual no tratamento de doenças crônicas (Fassas & Kazis, 2003; Annaloro e
cols.,
2009; Sullivan e cols., 2010; Ou-Yang e cols., 2012). A medula óssea é um
tecido rico de tipos celulares importantes, como células indiferenciadas da linhagem
hematopoiética. Quando utilizadas de forma terapêutica, participam de mecanismos de
80
reparo tecidual em injúrias (Soares & Santos, 2009; Deng e cols., 2011; Kang e cols.,
2011; Van e cols., 2011; Pai e cols.,
2012). Em especial em doenças crônicas
degenerativas ocasionadas por agentes infecciosos, os resultados mostraram que
camundongos infectados com T. cruzi ou S. mansoni apresentavam melhoras e reparo
tecidual nos órgãos afetados pela doença, como o coração e fígado lesionados,
respectivamente, após o tratamento com células purificadas de medula óssea. Esse
processo de reparo foi correlacionado com a chegada das células da medula óssea (GFP +
transferidas por via endovenosa) no local de lesão (Soares e cols., 2004; Oliveira e cols.,
2008). Baseado nesses relatos e dispondo do modelo para lesões crônica cutâneas da
leishmaniose, foi avaliado o potencial da terapia celular na leishmaniose.
Nossos resultados mostram que camundongos TNFR1 KO infectados quando
tratados com preparações enriquecidas de células mononucleares purificadas da medula
óssea (que contém porcentagem reduzida de células Ly6G+) apresentam lesões menores
quando comparados aos animais que receberam PBS. Esse controle das lesões crônicas
está correlacionado com a chegada e diferenciação em células dendríticas nas lesões e
aumento da resposta anti-inflamatória. Esses resultados podem ser explicados pela
importância de células dendríticas na estimulação de respostas anti-inflamatórias para o
controle da inflamação crônicas.
Soares e colaboradores (2004) mostraram que tratamentos com células
purificadas da medula óssea autóloga são capazes de induzir apoptose das células do
infiltrado inflamatório na cardiopatia crônica induzida pela infecção T. cruzi e esse fato
está relacionado e sugere que a melhora da cardiopatia desenvolvida nos camundongos é
pela substituição e diferenciação das células transferidas em células do músculo
cardíaco. Nos nossos resultados, as reduções das lesões não alteraram o número total de
células do infiltrado inflamatório, como o esperado, baseado nos achados do modelo de
infecção por T. cruzi (dados não mostrados). Porém, as reduções das lesões estão
associadas com a migração das células transferidas para o local, diferenciação em
células CD11c+, são tipos de células importantes no controle das lesões crônicas dos
camundongos TNFR1 KO infectados. Nos animais tratados houve redução no número
81
de células polimorfonucleares e da expressão de IL-17; da mesma forma aumento de IL10. Dessa forma, os resultados sugerem uma mudança no perfil das células inflamatórias
nas lesões dos camundongos TNFR1 KO infectados, após o tratamento com as células
mononucleares, sendo importante no processo de reduções das lesões crônicas.
Nós investigamos a participação da ausência do receptor 1 do TNF-α nas células
transferidas na diferenciação das células dendríticas nas lesões dos camundongos
TNFR1 KO. O receptor 1 do TNF-α apresenta diferentes funções na resposta à
sinalização a essa citocina, como apoptose e diferenciação celular (Vujanovic e cols..,
2010). O TNF-α é importante para a diferenciação de monócitos em células dendríticas,
bem como exerce importante função na migração dessas para a lesão em camundongos
infectados por L. major, refletindo na susceptibilidade desses animais a infecção
(Baldwin e cols., 2004; Van Lieshout e cols, 2005). No modelo de infecção por L. major
nós avaliamos a influência do TNFR1 na diferenciação celular após a transferência de
células purificadas da medula óssea em animais infectados. Nossos resultados
mostraram que o TNFR1 não exerceu influência significativa na diferenciação das
células da medula óssea em células CD11c+ e MHCII+ in vivo no modelo de infecção
por L. major. Assim não houve diferenças entre a presença ou ausência do TNFR1 no
efeito do controle das lesões nos tratamentos dos camundongos TNFR1 KO infectados
que avaliamos. Esses dados sugerem que o processo de diferenciação das células da
medula óssea em células dendríticas é similar em animais selvagens e animais TNFR1
KO. Dessa forma, em concordância com os dados que obtivemos do perfil de células
dendríticas das lesões de TNFR1 KO, acredita-se que a manutenção da migração e
funções desse tipo celular nas lesões é importante para a redução das lesões. De forma
similar, Leon e colaboradores (2007) mostraram que camundongos BALB/c infectados
com L. major, que apresentam lesões cutâneas não cicatrizantes e ulcerativas, em
comparação aos animais C57BL/6, apresentam menor migração de monócitos e
diferenciação de células dendríticas para as lesões. O mesmo nós descrevemos com
esses camundongos infectados com L. mexicana (Manuscrito em redação: “Leishmania
mexicana induces limited recruitment and activation of monocytes and monocyte-
82
derived dendritic cells early during infection” Patricia M. Petritus; Daniel Manzoni-deAlmeida; Ciara Gimblet; Cláudia Gonzales Lombana; Phillip Scott). É interessante notar
que trabalhos mostraram que camundongos BALB/c infectados com L. major e tratados
com células dendríticas apresentaram melhor proteção contra a infecção e reduções das
lesões cutâneas (Remer e cols., 2007; Remer e cols., 2010). A correlação desse conjunto
de informações sugere que a “reposição” ou inserção de células dendríticas nas lesões
pode induzir um processo de redução das lesões.
As lesões de pacientes que desenvolvem a forma mucocutânea da leishmaniose
são ricas de um infiltrado inflamatório com células T CD4+, T CD8+ e neutrófilos,
citocinas TNF-α, IFN-γ e IL-17 e apresentam baixa regulação da inflamação via IL-10,
uma vez que apresentam baixa expressão do receptor de IL-10 nos leucócitos,
diferentemente das lesões auto-limitantes da leishmaniose cutânea (Amato e cols., 2003;
Faria e cols., 2005; Amato e cols., 2008). Esses relatos sugerem a importância dos tipos
celulares que povoam e persistem no infiltrado inflamatório dessas lesões cutâneas para
o desenvolvimento ou do reparo das injúrias teciduais. O infiltrado inflamatório nas
lesões de camundongos TNFR1 infectados por L. major são ricos de neutrófilos, células
T CD8+, TNF-α e IFN-γ (Oliveira e cols., 2012).
Os resultados mostraram, ainda, que as lesões dos camundongos TNFR1 KO
apresentam alta expressão de IL-17 e apresentam baixa porcentagem de células
dendríticas (CD11c+ e Ly6C+ e CD11c+ e MHCII+) em comparação com aos animais
selvagens. Outros estudos de doenças crônicas de pele em humanos, como a psoríase,
relatam a correlação da presença de neutrófilos com o dano tecidual desenvolvido (Lin e
cols., 2011). Nos mesmos relatos dos mecanismos imuno patológicos da psoríase foi
destacada a importância de células dendríticas no controle do processo inflamatório das
lesões (Schmid e cols., 1994; Gilliet e cols., 2004.). Da mesma forma, a gama de
células dendríticas residentes ou que migram para a pele em processos inflamatórios,
como na hipersensibilidade tardia são fatores no processo de reparo tecidual (Bennet e
cols., 2007; Kaplan e cols., 2008; Martin & Jakob, 2008). Sabe-se que nos modelos de
infecção por L. major um infiltrado inflamatório rico em monócitos, macrófagos e
83
células dendríticas é importante para resistência à infecção em camundongos C57BL/6
(Leon e cols., 2007; Gonçalves e cols., 2011), além disso, outros relatos mostram que
um infiltrado rico em neutrófilos está correlacionado ao desenvolvimento de lesões e à
suscetibilidade a infecção (McFalane e cols., 2008). Em humanos acometidos pela forma
mucocutâneo da leishmaniose a presença de neutrófilos e MMP-9 estão associadas ao
dano tecidual desenvolvido nas lesões (Boaventura e cols., 2010; Marretti-Mira e cols.,
2011). De forma contrária, trabalhos mostram que células dendríticas residentes da pele
são importantes fatores no desenvolvimento da resposta imune efetiva ou reparo tecidual
por diferentes mecanismos, como por exemplo, induzindo processos anti-inflamatórios
(Sullivann e cols., 1986; Merad e cols., 2004.). Esses dados sugerem que em humanos e
no modelo experimental os neutrófilos são células importantes na patogênese das lesões
cutâneas da leishmaniose. Entretanto, células dendríticas podem ser importantes células
do infiltrado inflamatório que trabalham no processo do reparo tecidual nas lesões
cutâneas crônicas. Dessa forma, a chegada das células transferidas e diferenciação em
células dendríticas nas lesões sugerem a importância de células dendríticas no controle
das lesões crônicas nos camundongos TNFR1 KO.
Células dendríticas podem estimular a resposta imune mediada por células T.
Relatos mostram que a as células dendríticas podem induzir ativação de diversas
populações de células T induzindo resposta pró-inflamatória ou anti-inflamatória
(Geissmann e cols., 2010). Os resultados mostraram que o tratamento com preparações
enriquecidas com células mononucleares purificadas da medula óssea reduziu a lesão
crônica de camundongos TNFR1 KO infectados com L. major. Interessante que a
redução das lesões correlaciona-se com a chegada das células de medula óssea ao local
da inflamação, com a sua diferenciação em células dendríticas e o aumento de processo
anti-inflamatório como maior expressão de IL-10 nas lesões e diminuição de fatores
inflamatórios como presença de polimorfonucleares, IL-17 e células T CD8+IFN-γ+. As
células dendríticas CD11c+ e MHCII+ podem ser diferenciadas de monócitos (CD11b+,
CD11c-, Ly6C+, CD115+, Ly6G-) originados da medula óssea (Serbina e cols., 2008;
Geissmann e cols., 2010; Liu e cols., 2010). Monócitos são células presentes em grande
84
quantidade na medula óssea e são originadas de células-tronco precursoras da linhagem
hematopoiética (células c-kit+) (Geissman e cols., 2010; Shi e cols., 2010). Essas células
não são dotadas da capacidade de captura, processamento, apresentação de antígeno e
ativação de células T CD4+ via MHCII e moléculas co-estimulatórias (CD80, CD86 e
CD40), como as células dendríticas e macrófagos (Kim e cols., 2011; Gregory e cols.,
2012), importantes na geração da resposta Th1 para eliminação dos parasitas
intracelulares como Leishmania (Leon e cols.,
2007; Dos Santos e cols., 2008;
Gonçalves e cols., 2011); o mecanismo de ação dessas células, em modelo de infecção
por bactérias, fungo e vírus, consiste em migrar do sangue periférico para as lesões para
diferenciação em células dendr(Crane e cols., 1999; Serbina e cols., 2008; Osterholzer e
cols., 2009). Na leishmaniose, ainda não é claro se os monócitos indiferenciados ganham
os locais de lesão via CCR2, como em outros modelos. Foi íticas para execução da
função de ativação da resposta imune mediada por células T descrito, que na
leishmaniose cutânea experimental a migração de monócitos para lesão e ativação
específica da resposta Th1 e a eliminação do parasitismo local (com a morte intracelular
do parasita por mecanismos via superóxido) são associadas à resistência a infecção por
L. major (Gonçalves e cols., 2011).
Interessantemente,
Gonçalves
e
colaboradores
(2011)
mostraram
que
camundongos deficientes de CCR2 apresentam lesões maiores e suscetibilidade quando
infectados por L. major, sugerindo a importância da migração de monócitos Ly6C+ para
a lesão via mecanismos de passagens de monócitos circulantes do sangue para as lesões.
Células Ly6C+ apresentam diferentes funções em processos inflamatórios. É conhecido
que células Ly6Chigh presentes no sangue entram nas lesões, diferenciam em células
dendríticas inflamatórias, participando da geração da resposta Th1, entretanto células
Ly6Clo infiltram nas lesões diferenciando-se em células apresentadoras de antígeno que
participam de processos de reparo tecidual (Nahrendorf e cols., 2007; Dunay e cols.,
2008; Geissmann e cols., 2010). As células CD11b+ e Ly6C+ induzem processos antiinflamatórios em lesões crônica (Garcia e cols., 2010; Zhu e cols., 2011). Zhu e
colaboradores (2007) mostraram que células CD11b+ e Ly6C+ induzem a melhora das
85
lesões cerebrais de camundongos no modelo de encefalomielite aguda experimental
(EAE), promovendo regulação negativa da co-estimulação em células T, sugerindo que
esse tipo celular proveniente da medula óssea participa da regulação da resposta antiinflamatória em lesões crônicas. A participação de células CD11b+ e Ly6C+, com papel
imunossupressor, nas lesões cutâneas da leishmaniose é ainda pouco esclarecida. Pereira
e colaboradores (2011) mostraram que essas células são importantes para a morte do
parasita, mas também para supressão da resposta de células T de forma e que ambos
dependem de NO. Nossos resultados mostraram a relação direta da ausência de células
dendríticas nas lesões crônicas com a reposição dessas células, o que pode induzir
reduções significativas das lesões e aumento de IL-10. É interessante notar que trabalhos
utilizando células dendríticas diferenciadas de células da medula óssea mostraram
resultados terapêuticos promissores como vacinas celulares para estimulação da resposta
imune com produção de IFN-γ e morte do parasita (Remer e cols., 2007; Remer e cols.,
2010; Gonçalves e cols., 2011). Aqui, nós utilizamos “células imaturas” da linhagem
hematopoiética que são incapazes de realizar ativação pela ausência de sistema coestimulador, podendo induzir tolerância e resposta imune anti-inflamatória importante
para o reparo tecidual.
Outro tipo celular importante relacionado ao dano tecidual das lesões de
pacientes que que desenvolvem a leishmaniose mucocutânea e nas lesões de
camundongos TNFR1 KO infectados são as células T CD8+ (Brodskyn e cols., 1997;
Pompeu e cols., 2001; Oliveira e cols., 2012). Os resultados mostraram que após o
tratamento com as células purificadas da medula óssea foi observada redução da
porcentagem de células T CD8+ IFN-γ+ nas lesões de camundongos TNFR1 KO
infectados. Entretanto, nós observamos aumento da expressão e concentrações de IFN-γ
nas lesões e produção de citocinas por células dos linfonodos drenantes (ex vivo) dos
animais tratados com as células em comparação aos animais não tratados. Esse fato pode
ser explicado pela manutenção de células T CD4+ IFN-γ+ nas lesões dos animais
tratados com PBS e tratados com células purificadas da medula óssea. Essa permanência
e aumento da expressão e produção de IFN-γ pode ser correlacionada à não alteração da
86
carga parasitária nos animais tratados com as células da medula óssea, visto que animais
TNFR1 KO infectados com L. major conseguem controlar o parasitismo via
mecanismos alternativos de ativação de células apresentadores de antígeno por IFN-γ
(Nashleanas e Scott, 2000).
Os resultados também mostraram que após o tratamento com células purificadas
da medula óssea houve redução de porcentagem de células T CD4+ e T CD8+
produtoras de TNF-α nas lesões de camundongos TNFR1 KO infectados. Entretanto,
esses camundongos não respondem ao TNF-α via receptor 1. Dessa forma esses dados
podem não explicar as reduções das lesões encontradas nos camundongos TNFR1 KO,
mas tais resultados podem ser interpretados como importantes para a administração de
células indiferenciadas da medula óssea e estimulação de processos anti-inflamatórios
em tecidos danificados, mediados via TNF-α, como os relatados em pacientes
acometidos pela forma mucocutânea da leishmaniose (Da-Cruz e cols., 1996; Blackwell,
1999; Menges e cols., 2002)
A redução das lesões cutâneas nos camundongos TNFR1 KO infectados com L.
major e tratados com células da medula óssea pode ser explicada pela correlação da
redução da expressão de IL-17 e o menor número de células polimorfononucleares e
aumento da expressão de IL-10 nas lesões. Sabe-se que uma das ações da IL-17 é o
recrutamento de células polimorfonucleares, neutrófilos
mais especificamente.
Trabalhos recentes mostram que a ação de células Th17+ são controladas pela
sinalização de IL-10 proveniente de células T regulatórias FoxP3+ (Chaudhry e cols.,
2011; Huber e cols., 2011). Bai e colaboradores. (2009) mostraram que após o
tratamento com células derivadas da medula óssea no modelo de encefalomielite crônica
houve diminuição de células Th17+ e aumento de células produtoras de IL-4. Esses
fenômenos estão associados à melhora das lesões cerebrais. Nossos dados mostraram
que as lesões dos camundongos TNFR1 KO infectados com L. major após o tratamento
com células purificadas da medula óssea apresentam menor expressão de IL-17 e maior
expressão nas lesões e concentração de IL-10 produzida por células dos linfonodos
drenantes estimuladas por antígeno. Entretanto, não observamos aumento da expressão
87
de FoxP3 nas lesões dos animais tratados com células purificadas da medula óssea.
Outras análises da quantificação de células T regulatórias FoxP3+ e FoxP3- serão
realizadas nas lesões e órgãos linfoides secundários, visto que os dados da produção de
IL-10 por células nos linfonodos drenantes sugerem ativação específica de células
produtoras de IL-10 que podem ser responsáveis pelas melhoras das lesões após o
tratamento com células purificadas da medula óssea.
Células polimorfonucleares são importantes para defesa do organismo em
infecções. Entretanto em diferentes modelos experimentais para doenças mediadas por
reação excessiva de células polimorfonucleares mostrou que a presença dessas células
pode ocasionar dano tecidual (Hemdan e cols., 2010). Na infecção experimental por L.
major, a questão da presença de células polimorfonucleares na susceptibilidade ou
resistência a infecção é ainda discutida. É sabido que mastócitos contribuem para a
susceptibilidade à infecção por L. major (Wershil e cols., 1994; Romão e cols., 2009).
Um infiltrado inflamatório rico em polimorfonucleares, em especial neutrófilos, está
relacionado ao desenvolvimento de lesões e susceptibilidade à infecção por L. major
(McFalane e cols., 2008). A presença de neutrófilos está associada à regiões em que se
encontra a expressão de IL-17 nas lesões na leishmaniose mucocutânea (Boaventura e
cols., 2010). Acompanhando o lavado celular das lesões nasofaringeas de pacientes com
lesões mucocutâneas da leishmaniose mostrou-se que a presença de neutrófilos
correlaciona-se inversamente com a cura das lesões (Guerreiro e cols., 2000). Em
correlação ao descrito em humanos, a infecção experimental por L. major mostrou a
associação direta de neutrófilos e altos níveis de IL-17 para desenvolvimento da
patogenese das lesões cutâneas em camundongos BALB/c (Lopez e cols., 2009).
Interessante que o tratamento com células purificadas da medula óssea mostra
associação direta das melhoras das lesões crônicas com a diminuição de IL-17 (Bai e
cols., 2009). Nossos dados mostraram que após o tratamento com células purificadas da
medula óssea há diminuição do número de células polimorfonucleares e da expressão de
IL-17 nas lesões quando os animais tratados são comparados aos animais não tratados.
Dessa forma, os resultados sugerem que o controle das lesões cutâneas crônicas dos
88
camundongos TNFR1 KO infectados com L. major e tratados com células purificadas da
medula óssea é via inibição de IL-17, talvez por IL-10.
Células dendríticas maduras são importantes estimuladoras da resposta imune em
linfócitos T. Essas células são capazes de capturar o antígeno nas lesões, migrar para
órgãos linfóides secundários e induzir a estimulação de células T via apresentação de
antígeno. Na leishmaniose experimental, as células dendríticas são responsáveis pela
captura de antígenos e estimulação das células T CD4+ produtoras de IFN-γ (Moll e
cols., 1995; Leon e cols., 2007). Entretanto, células dendríticas imaturas podem induzir
tolerância com produção de IL-10 (Menges e cols., 2002). O tratamento com células
dendríticas imaturas no modelo experimental de EAE mostrou a capacidade de estimular
a resposta anti-inflamatória com expansão de células T CD4+ produtoras de IL-10 e
proteger o desenvolvimento das lesões cerebrais (Menges e cols.,
2002). A IL-10
durante a infecção por L. major exerce diferentes funções nas inflamações em cada
modelo de infecção. Em camundongos C57BL/6 infectados por L. major a estimulação e
o aumento do número de células T CD4+ produtoras de IL-10 em fases crônicas da
infecção são importantes para regulação da inflamação e redução das lesões (Belkaid,
2003; Mendez e cols., 2004). Nossos dados mostraram que injeções repetidas de células
purificadas da medula óssea induzem redução das lesões em animais selvagens e TNFR1
KO, que é, interessantemente, correlacionada ao aumento da expressão de IL-10 e IFN-γ
nesses locais. Tais resultados também podem ser comparados à concentração de IL-10
antígeno específico que detectamos em cultura de células dos linfonodos drenantes em
camundongos TNFR1 KO infectados com L. major e tratados com células purificadas da
medula óssea. Esses dados sugerem que a indução de IL-10, é devida a repetidas
transferências com células imaturas purificadas da medula óssea.
Uma das funções da IL-10 é a sinalização em células apresentadoras de antígeno
induzindo a ativação da chamada via alternativa com expressão de arginase (Munder e
cols., 1998; Munder e cols., 1999). Os dados mostraram que as lesões de camundongos
TNFR1 KO infectados e tratados com células purificadas da medula óssea não
apresentam diferentes expressões de arginase I, iNOS e TGF-β como esperado na
89
correlação com o aumento da expressão de IL-10 nas lesões após o tratamento (Stenger
e cols., 1994; Li e cols., 1999; Iniesta e cols., 2002; Padigel & Farrel, 2005; Muller e
cols., 2008; Muleme e cols., 2009; Biswas e cols., 2011). O papel da arginase na
ativação de macrófagos tem sido investigado em células in vitro (Shearer e cols., 1997).
Em processos de cicatrização encontrou-se um aumento da atividade de arginase e iNOS
em queratinócitos. Entretanto não havia mudança na expressão de arginase em regiões
de hiper-proliferação das regiões de epitélio. Nesses trabalhos, os autores criaram a
hipótese de que a baixa expressão de arginase e NO pode favorecer a re-epitelização,
favorecendo a cicatrização de tecidos com injúrias (Kampfer e cols., 2003; Kavaluka e
cols., 2011). Kavaluska e colaboradores (2011) mostraram que a inibição farmacológica
específica da atividade de arginase após lesão tecidual cutânea num modelo de cirurgia
experimental induziu maior cicatrização das lesões de pele. Esses dados sugerem que a
não modulação da expressão de arginase e iNOS no nosso modelo pode ser fruto do
processo similar de redução das lesões como descrito acima para as lesões de pele.
Em conclusão, nossos dados mostraram que as lesões cutâneas crônicas de
camundongos TNFR1 KO infectados com L. major apresentam características que
coincidem com as encontradas nas lesões de pacientes com leishmaniose mucocutânea.
Nossos resultados também mostraram a eficiência da terapia celular com células
imaturas purificadas da medula óssea. Estas células se diferenciam em células
dendríticas nas lesões, o que sugere que estejam envolvidas no reparo tecidual nas lesões
com produção de IL-10 por essas células ou estimulando a produção de IL-10 que por
sua vez inibem a IL-17 e impedem a persistência de polimorfonucleares em animais
TNFR1 KO infectados com L. major. Esse fenômeno de redução das lesões cutâneas não
é restrito apenas as lesões crônicas dos camundongos TNFR1 KO infectados. Nós
observamos o mesmo fenômeno em camundongos BALB/c (dados não mostrados) e
C57BL/6 selvagens infectados com L. major: quando tratados com células purificadas
da medula óssea, estes camundongos apresentam as lesões diminuídas e com presença
de células transferidas nas lesões. O mesmo é válido para outras infecções, com
camundongos C57BL/6 selvagens infectados com L. mexicana (Patrícia Petritus; Daniel
90
Manzoni-de-Almeida, Ciara Gimblet; Cláudia Gonzales Lombana e Phillip Scott manuscrito em redação). Nosso trabalho abre perspectivas de estudos de estratégias para
tratamentos de lesões cutâneas crônicas da leishmaniose com intervenções
farmacológicas para estimulação da migração desses tipos celulares para a lesão ou
inibição específica de células do perfil Th17, como consequência eliminação de
polimorfonucleares envolvidos nas lesões crônicas, como as lesões de pacientes que
desenvolvem a leishmaniose mucocutânea.
91
CONCLUSÕES
92
6. CONCLUSÕES:

A infecção cutânea crônica do camundongo TNFR1 KO por L. major apresenta
características que coincidem às encontradas em lesões e pacientes com a forma
mucocutânea da leishmaniose;

O tratamento com células mononucleares purificadas de medula óssea induziu
reduções significativas das lesões, com a regulação do infiltrado inflamatório e
aumento do processo anti-inflamatório nas lesões em camundongos TNFR1 KO
infectados por L. major.
93
REFERÊNCIAS
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