XX Curso Novos Enfoques na Produção e

“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
Efeito das inflamações e da condição de saúde sobre o desenvolvimento e a fertilidade de gado
de leite
R.L.A. Cerri1, E. Ribeiro2, A.C.C. Fernandes1, C.C. Campos1,
L.F.S.P.Barbosa3, J.L.M. Vasconcelos3, W.W. Thatcher4, J.E.P. Santos4
1
Applied Animal Biology Program, Faculty of Land and Food Systems, University of British Columbia
2
Department of Animal Biosciences, University of Guelph
3
Department of Animal Production, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science, Sao Paulo State University
4
Department of Animal Sciences, University of Florida, Gainesville
Fertilização e estágios iniciais do desenvolvimento embrionário
Capacitação dos espermatozoides para o transporte e a maturação dos oócitos
Após o acasalamento ou a inseminação artificial, os espermatozoides se deslocam pelo
trato reprodutivo feminino e ficam armazenados na porção inferior do oviduto. A interação
espermatozoide-oviduto no istmo aumenta a viabilidade dos espermatozoides e desempenha
papel importante na manutenção da viabilidade até o momento da ovulação.
A capacitação é a sequência de alterações que normalmente ocorrem nas células e nas
membranas do trato reprodutivo feminino, permitindo que os espermatozoides passem pela
reação acrossômica e fertilizem os óvulos (Petrunkina et al., 2001a). Essa série de modificações
parece ser modulada, em parte, durante o período em que o espermatozoide está fixado ao
oviduto. Revah et al. (2000) demonstrou que, durante a capacitação, os espermatozoides de
touros perdem a capacidade se ligar à fucose e adquirem a capacidade de se ligar à manose. Essa
modificação permite que os espermatozoides se desconectem do oviduto e expressem proteínas
que se acredita serem importantes para a interação espermatozoide-zona pelúcida.
A crença é que diversos fatores desempenham uma função essencial na iniciação e
manutenção da maturação do oócito. Um sinal inicial que invade o complexo cumulus-oócito,
em resposta ao estímulo do LH, é o Ca++ (Davis et al., 1987). Em 1998, Mattioli et al.
demonstrou que após o estímulo do LH, observou-se o aumento imediato dos níveis de Ca++ nas
células cumulus, e cinco minutos depois, o aumento da concentração de Ca++ dentro do oócito.
Esse resultado indica que a comunicação entre as células cumulus e o oócito é dinâmica e rápida.
Durante o bloqueio da atividade meiótica, o nível citoplasmático de adenosina 3',5'-monofosfato
cíclico (cAMP) no oócito é alto, notando-se uma queda significativa no início da maturação
(Trounson et al., 2001). A remoção da cAMP durante o reinício da meiose está associada com o
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efeito inibidor que a cAMP exerce sobre a maturação do oócito, apesar de alguns autores talvez
não considerarem a cAMP como um inibidor geral, dado que logo após o aumento de LH, ocorre
uma elevação temporária de cAMP dentro do oócito. Um terceiro fator associado à reiniciação
meiótica é a despolarização das membranas das células cumulus e do oócito. A despolarização
pode induzir a translocação das proteínas quinase C da membrana plasmática para a nuclear,
onde podem contribuir para o rompimento da vesícula germinativa (Kong et al., 1991). He et al.,
1997 observou que durante a maturação houve um aumento a liberação de Ca++ subiu
gradualmente, o que é essencial para iniciar as oscilações nos oócitos dos mamíferos durante a
fertilização.
Singamia e desenvolvimento embrionário inicial
A zona pelúcida do oócito contém glicoproteínas responsáveis pela adesão do
espermatozoide ao oócito. Essas glicoproteínas são chamadas de proteínas da zona pelúcida,
classificadas como ZP1, ZP2 e ZP3. Em camundongos, a ZP3 reage com as regiões de ligação da
zona pelúcida da membrana plasmática do espermatozoide que, por sua vez, inicia uma cascata
de reações as quais, em última instância, levam à reação acrossômica. A reação acrossômica é
uma fusão ordenada de membranas plasmáticas de espermatozoides com a membrana
acrossomal externa (Senger, 2003), formando poros que permitem que as enzimas acrossômicas
atravessem e digiram a matriz extracelular que forma a zona pelúcida. Uma vez que o
espermatozoide atravessa a zona pelúcida ele se funde ao oócito. Em seguida, o embrião, em seu
estágio inicial, começa uma série de divisões celulares que produzem 2,4, 8, 16 células
embrionárias e, consequentemente, uma massa compacta de células ligadas por junções
comunicantes ("gap") e de oclusão ("tight"), denominada mórula. Durante o estágio inicial, ao
atingir o estágio de quatro células, os embriões de bovinos iniciam a atividade transcritiva
própria (transição maternal-zigótica) (Viuff et al., 1998), apesar de ser possível observar a
presença de transcrições em estágios mais iniciais (Hyttel et al., 1996). A ativação genômica do
embrião é um processo gradual que passa por mudanças na estrutura nuclear e na cromatina, que
regulam a transição para a transcrição embrionária total (Latham & Schultz, 2001). A
modificação morfológica ocorre após o estágio de mórula, com a formação de uma cavidade
preenchida por fluido, denominada blastocélio, que polariza duas subpopulações de células: a
massa de células interiores e o trofoblasto. A massa de células interiores dará origem ao embrião
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propriamente dito, e o trofoblasto formará as membranas extraembrionárias, inclusive a placenta
(Senger, 2003).
Reconhecimento maternal da gestação em vacas
Durante os primeiros estágios da gestação, o embrião recém-formado emite um sinal para
a vaca, indicando que está presente no útero, aproximadamente no 16o ou 17º dia do ciclo estral
(Thatcher et al., 1997). Esse sinal evita que o endométrio libere PGF2, ação que mantém a
atividade do CL e, dessa forma, a sobrevivência do embrião. O único sinal antiluteolítico
conhecido para o reconhecimento da gestação em vacas é a citoquina da família do interferon, a
interferon-τ (IFN-τ), produzida já no dia 10 do embrião, e a produção dessa citoquina parece
aumentar na medida em que o embrião muda, passando da morfologia esférica para a
filamentosa. O IFN-τ é produzido por células de trofoblásticas mononucleadas e atua de maneira
parácrina no trofectoderma – interface do endométrio, inibindo a síntese de PGF2 (Bazer et al.,
1996). O IFN-τ atua localmente no epitélio superficial do endométrio, ligando-se a receptores do
tipo IFN I e ativando um sistema de mensageiro secundário que, em última instância, inibe a
expressão dos receptores de estrógeno no endométrio, e, consequentemente, a expressão dos
receptores de ocitocina e a síntese de PGF2.
Os mecanismos que permitem que o embrião se desenvolva após a mãe reconhecer a
gestação é complexo e todavia não completamente entendido, apesar de os conhecimentos terem
avançado muito na última década (Spencer et al., 2004). Não há dúvidas de que a progesterona é
necessária para manter a gestação, porém os receptores de progesterona no útero apresentam
expressão espacial e temporal complexa. Os receptores de progesterona se expressam sempre no
endométrio e no miométrio do estroma durante a gestação, porém não está presente no lúmen
epitelial e na superfície epitelial glandular após sofrer queda na produção a partir dos dias 13 e
14 do ciclo estral. Parece que a diminuição da atividade dos receptores de progesterona nos
epitélios luminal e glandular é necessária para a morfogênese das glândulas uterinas necessárias
para nutrir o embrião e iniciar a placentação. Também se aceita que os receptores de
progesterona presentes no estroma endometrial podem desempenham uma função de maneira
parácrina para permitir mudanças morfológicas apropriadas no útero para sustentar o embrião.
No miotélio, a ação da progesterona é pivotal para evitar contrações musculares que poderiam
expelir o embrião, terminando a gestação prematuramente. Em ovelhas, as células binucleadas
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do trofectoderma começam a produzir lactogênio placental por volta do 16o dia de gestação. A
placenta de ovinos também produz hormônio de crescimento (HC) entre os dias 35 e 70 da
gestação. Ambos os hormônios, o lactogênio placental e o HC, apresentam importância
particular com a remodelagem das glândulas uterinas, uma vez que seus receptores se encontram
no epitélio glandular do endométrio. Acredita-se que exposição sequencial à progesterona, ao
lactogênio placental e ao HC é importante para ativar e manter a remodelação endometrial, a
função secretória e o crescimento uterino durante a gestação (Spencer et al., 2004).
Inflamação, estresse e doenças
A queda na fertilidade da vaca de leite atual tem, provavelmente, origem multifatorial e
está associada à alta produção de leite (Lucy, 2001; Santos et al., 2004). A associação entre a
baixa fertilidade e o aumento da lactação podem ser considerados resultados das mudanças
homeoréticas necessárias para sustentar a produção de leite, o que afeta diretamente os tecidos
reprodutivos. A maior produção de leite está associada a mudanças fisiológicas que podem
reduzir a fertilidade, tais como o agravamento do balanço energético negativo (Wathes et al.,
2007), concentrações plasmáticas de progesterona e estradiol menores (Wiltbank et al., 2006), e
interrupção do eixo do hormônio de crescimento-fator de crescimento semelhante à insulina tipo
1, que ocorre no fígado (Kobayashi et at., 1999). Infelizmente, os mecanismos que levam a essa
perda embrionária e fetal não são conhecidos no nível molecular. Sartori et al. (2002) observou
que, em uma única ovulação, novilhas e vacas secas produziram um número maior de embriões
de boa qualidade que vacas em lactação . Durante experimentos de transferência de embriões, foi
relatado que as taxas de prenhez são mais baixas quando as recipientes são vacas em lactação,
comparado com vacas não lactantes ou novilhas (Hasler, 2001; Chagas e Silva et al., 2002;
Wilson et al., 2006). Juntos, esses estudos sugerem que a lactação pode reduzir a qualidade tanto
dos embriões como dos endométrios.
Vacas de leite em lactação ficam sujeitas a diversas dificuldades, inclusive a estressantes
metabólicos e ambientais, especialmente durante o período imediatamente após o parto. Estudos
epidemiológicos demonstraram que de 40–60% das vacas vão sofrer um ou mais episódios
clínicos de doença durante os primeiros 60 dias após o parto (Santos et al., 2010). Acredita-se
que esse número alarmante de distúrbios de saúde, que provavelmente mascaram um número
ainda maior de doenças subclínicas, está associado às exigências energéticas para a produção de
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leite e do estresse metabólico decorrente. A drástica redução no desenvolvimento embrionário e
das taxas de concepção e de aumento em perdas relativas à gestação (Santos et al., 2010) em
vacas que vivenciaram um ou mais distúrbios de saúde é uma área mal compreendida e está
diretamente relacionada às falhas reprodutivas em gado de leite. O perfil de expressão dos genes
durante o início do desenvolvimento embrionário foi amplamente descrito para camundongos
(Zeng et al., 2004; Wang et al., 2013), mas apenas recentemente foi estudado em bovinos
(Vallée et al., 2009). A superabundância de genes e de transcritos expressos diferentemente ao
passarem do estágio de oócito para o de blastocisto enfatiza a complexidade das rotas de
sinalização necessárias para que o desenvolvimento embrionário seja exitoso. Da fertilização ao
termo da gestação, diversas moléculas e sistemas trabalham aparentemente em sincronia para
preparar o útero para receber e manter o embrião. O interferon-tau, é sintetizado pelas células do
trofectoderma do embrião, é essencial para manter o corpo lúteo durante a gestação (Hansen et
al., 1985). Ele induz uma série de mudanças no útero ao promover a expressão dos genes
estimulados pelo interferon (Spencer et al., 2008). Esses genes–relacionados à remodelação,
adesão e invasão, orientação e polarização celular, angiogênese e transportadores de glicose e
lipídeos–são ativados pela gestação e pela progesterona (Bauersachs et al., 2006; Forde et al.,
2010). Entretanto, há poucas informações sobre as mudanças moleculares causadas pelo estresse
crônico e pela inflamação no endométrio, bem como pelo concepto. Um dos principais objetivos
do meu programa de pesquisas é proporcionar essas informações. Recentemente, nosso grupo
descreveu mudanças na expressão genética do endométrio no concepto (Cerri et al., 2012)
causadas exclusivamente pela lactação. Eu pude identificar novos genes relacionados com o
desenvolvimento embrionário (DKK1, RELN, PDK4), especialmente com células B e γδ T
(IGHG1, IGLL1, IGK, e TRD). Essas descobertas expandiram nosso entendimento sobre os
mecanismos que estão possivelmente relacionados com perdas de embriões.
Entender a complexa interação da lactação, o meio ovariano contendo esteroides, a
condição de saúde e a condição de estresse/inflamação são componentes essenciais para
solucionar o problema das perdas de embriões resultantes do desenvolvimento uterino subótimo.
Os principais objetivos de minha pesquisa são aprofundar os conhecimentos sobre os complexos
mecanismos envolvidos e a intercomunicação entre o endométrio e o concepto em condições
estressantes, bem como determinar de que forma é possível melhorar o ambiente endócrino e
uterino da vaca para aumentar a sobrevivência de embriões. A vaca de leite é um modelo muito
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bom para estudar condições relacionadas ao estresse metabólico e a distúrbios crônicos de saúde,
normalmente observados no período que sucede ao parto. As perdas embriônicas excessivas
observadas em vacas de leite podem melhorar muito a partir do momento em que soubermos de
que forma o concepto e o endométrio são modificados para adaptar essas condições adversas.
Estresse e inflamação
O conceito de estresse está associado ao fracasso em expressar o potencial genético e a
incapacidade de o animal se relacionar positivamente com o ambiente. Atualmente, o estresse
está intimamente relacionado com a subfertilidade, tendo sido estudado como um fator que
influencia negativamente a eficiência do gado de leite (Dobson & Smith, 2000). Em gado, a
expressão combinada de dois tipos de estresse, físico (extremos de temperatura, privação de
alimento e/ou de água, choques elétricos, cirurgia, dor e doenças) e psicológico (p. ex., medo,
mudanças na rotina e/ou no ambiente, inserção em um novo grupo, isolamento) (Grandin, 1997,
1998; Lynch, 2010). Independentemente, a resposta neuroendócrina estimulada por um fator
estressante leva à ativação dos eixos hipotalâmico-pituitário-adrenal (HPA) e Simpáticoadrenomedular (SAM), bem como à liberação de glicocorticoides (p. ex., cortisol) e
catecolaminas (adrenalina e noradrenalina).
O estreito relacionamento do eixo hipotalâmico-pituitário (HP) com o sistema nervoso
central (SNC), bem como o controle exercido por seus hormônios sobre diferentes sistemas
fisiológicos, demonstram a importância desse eixo em resposta ao estresse. Ao mesmo tempo,
reconhecer a importância do eixo HP sobre a fisiologia da reprodução nos leva a considerar que
toda resposta ao estresse poderia interferir no controle neuroendócrino da reprodução (Moberg,
1985). Os efeitos do estresse sobre o tecido reprodutivo foi apontado como um fator de
interferência sobre o crescimento folicular, a ovulação, o padrão de liberação dos hormônios
reprodutivos e comportamento estral nas vacas de leite (Morris et al., 2011).
Um ciclo ovulatório satisfatório está associado a uma série de eventos neuroendócrinos
executados pelo eixo hipotalâmico-pituitário-gonadal. Durante a fase folicular, o hormônio
liberador de gonadotrofina (GnRH) controla a liberação dos hormônios folículo estimulante
(FSH) e luteinizante (LH), responsáveis pelo recrutamento de novos folículos e por mantê-los em
crescimento, respectivamente. O crescimento folicular leva ao aumento da concentração do
estrogênio (E2), produzindo um feedback positivo no hipotálamo, seguido por um pico pré6
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ovulatório de GnRH e LH (Hafez, 2004). A principal influência do estresse sobre a atividade
ovariana é a redução dos pulsos de GnRH/LH, seguidos de apoio folicular inadequado de LH.
Portanto, haverá um folículo crescendo lentamente bem como uma diminuição da liberação de E2
e, consequentemente, efeitos sobre a ovulação, como ausência ou atraso (Dobson & Smith,
2000). Nesse contexto, Morris et al. (2011), considerando que a claudicação é um fator de
estresse, demonstrou que 21% das vacas mancas deixaram de expressar estro ou de ovular. Além
disso, 29% das vacas mancas não foram capazes de produzir um folículo funcional em resposta
ao estímulo hormonal exógeno. Eles consideraram a possibilidade dessas falhas estarem
associadas à redução na frequência das pulsações de LH, a concentrações mais baixas de
estradiol ou à resposta ao estradiol e à ausência de picos de LH. Dobson & Smith (2000) apoiam
essa ideia. Eles demonstraram que quando o eixo HPA é ativado por condições estressantes, a
ativação do hipotálamo e da glândula pituitária produz uma pulsação menor de GnRH/LH,
expondo o folículo ovariano a um suporte inadequado de LH. Diferentes situações podem levar a
diferentes interferências sobre o controle GnRH/LH, como por exemplo, durante estresse crônico
e claudicação severa, quando a frequência do pulso de GnRH/LH virá estimular o crescimento
folicular, porém de maneira insuficiente para impulsionar o crescimento durante os estágios
finais e a ovulação. Outra situação está associada à ocorrência de cistos ovarianos. Essa ocorre
quando a frequência das pulsações leva o folículo a alcançar estágios mais avançados de
desenvolvimento, porém não rápido o suficiente para sincronizar com os níveis adequados de E2.
Além dos efeitos sobre o ovário, o agente estressante pode interferir na eficiência
reprodutiva por afetar o ambiente uterino e o desenvolvimento do concepto através de processos
infecciosos e suas complexas respostas imunológicas. Por exemplo: ao enfrentar um desafio
imunológico, citoquinas pró-inflamatórias são liberadas, como por exemplo, o fator de necrose
tumoral α (TNFα), dando suporte à resposta imunológica. Por outro lado, o TNFα afeta o
funcionamento uterino por desempenhar um importante papel na regulação da produção de
PGF2α (Miyamoto et al., 2000). Skarzynski et al. (2000) sugeriu que, portanto, a ação do TNFα
sobre as células do estroma uterino que produzem PGF2α pode desencadear a luteólise em gado,
seguida de um feedback positivo entre a PGF2α e a ocitocina lútea. Dessa forma, níveis altos de
TNFα poderiam ser seguidos de níveis suficientemente altos de PGF2α, levando à luteólise e
consequentemente à perda de embriões nos seus estágios iniciais no caso de vacas prenhas
(Staples et al., 1998). Outras citoquinas pró-inflamatórias, bem como interleucinas (IL-1 e IL-2),
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podem ser expressas no endométrio e também têm sido consideradas fatores luteolíticos
consequentes de processos infecciosos. Bany & Kennedy (1995) apresentaram evidências de que
a IL-1 induz a produção de prostaglandinas ao aumentar a expressão do ciclooxigenase (COX-2),
uma importante enzima envolvida na síntese da PGF2α. Além disso, Leung et al. (2000) mostrou
que a IL-2 tem grande capacidade de estimular a PGF2α durante o final da fase lútea, capacidade
essa não verificada dias mais tarde, quando os receptores de ocitocina já estavam mais ativos;
nessa fase houve um efeito mais pronunciado da produção da prostaglandina E2 (PGE2).
Portanto, o efeito do estresse sobre o controle neuroendócrino no ovário é uma área amplamente
estudada, o que não é o caso dos efeitos sobre o ambiente uterino, mais especificamente sobre a
expressão genética no nível do endométrio.
Da mesma forma como não existe uma definição simples de estresse, também não é fácil
definir se o estresse é crônico ou agudo, principalmente pelo fato de haver diferentes tipos de
agentes de estresse. Porém, ao considerarmos o estímulo estressante clássico sobre os eixos HPA
e S-adenosilmetionina (SAM), verificamos que o estresse crônico está ligado à alta reatividade
do eixo HPA e, consequentemente, aos altos níveis de cortisol, conhecido por resposta passiva.
Por outro lado, respostas agudas a agentes estressantes estão associadas à alta reatividade do eixo
SAM através da liberação de catecolaminas, conhecidas como resposta ativa ou "ataque/fuga
ativa" (Koolhaas et al., 1999; Cohen, 2000; Susan & Caryl, 2007). Outra forma de estresse que
pode ser classificada como aguda ou crônica é a inflamação. Nesse caso, o estresse está
associado principalmente às citoquinas e às proteínas da fase aguda (PFA) que podem ativar o
eixo HPA direta ou indiretamente e estimular a resposta clássica ao estresse, que leva à liberação
de cortisol. Portanto, inflamações crônicas são caracterizadas por um aumento moderado porém
constante de citoquinas e de PFA. Por outro lado, a inflamação aguda está associada a um
aumento significativo no nível plasmático de citoquinas pró-inflamatórias e de outros
mediadores imunológicos, inclusive de PFA (Andreasen et al., 2008).
Considerando-se que as a respostas às inflamações levam ao aumento das concentrações
plasmáticas de cortisol como forma de feedback para bloquear a resposta imunológica e
caracterizando uma resposta a um estresse, alguns estudos avaliaram o relacionamento entre a
resposta inflamatória e parâmetros reprodutivos, bem como a qualidade e o desenvolvimento de
oócitos e embriões, do ambiente uterino e da função ovariana. Após um desafio imunológico
com bactérias Gram-negativas ou pela infusão de endotoxinas, houve a liberação de citoquinas
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IL-1, IL-6 e do fator de necrose tumoral TNF-α, bem como de PGF2α e de óxido nítrico (ON),
além de outros mediadores imunológicos. Nesse contexto, desempenhos reprodutivos menores
podem estar associados ao fato de que o TNF-α interfere na maturação de oócitos em bovinos
(Soto et al., 2003). Além disso, estudos feitos em meios de cultura demostraram que o TNF-α, a
PGF2α e o ON interferem em embriões, que apresentaram um aumento no número de células
apoptóticas e desenvolvimento insatisfatório até a fase de blastocisto (Pampfer et al., 1994; Chen
et al., 2001; Soto et al., 2003).
A resposta imunológica é mediada por uma complexa rede de sinais entre os sistemas
nervoso, endócrino e imunológico. Portanto, assim como ocorre no controle reprodutivo
endócrino, fatores estressantes podem afetar a resposta imune através da ativação dos eixos SAM
e HPA, bem como seus hormônios, catecolaminas e glicocorticoides, respectivamente. A
modulação imunitária feita por esses hormônios sobre as células de defesa podem ocorrer
diretamente, através de receptores, ou indiretamente, através da indução da desregulação da
liberação de citoquinas (Glaser & Kiecolt-Glaser, 2005), levando a mudanças na migração
celular, à secreção de citoquinas, à atividade humoral e à proliferação celular (Madden & Livnat,
1991). As células de defesa são muito sensíveis ao aumento de glicocorticoides, e isso pode ser
verificado pelo aumento na taxa de circulação periférica após exposição a esses, o que leva à
leucose, caracterizada por neutrofilia e linfopenia
Radicais livres e os estágios embrionários iniciais
A fosforilação oxidativa é o principal e mais eficiente processo usado pela maioria dos
organismos superiores para produzir energia. O processo usa energia proveniente da oxidação
dos nutrientes para sintetizar adenosina trifosfato (ATP), a principal fonte de energia para o
metabolismo celular. Esse processo ocorre na mitocôndria e utiliza uma série de complexos
enzimáticos que bombeiam íons H+ para o espaço intermembranar da mitocôndria, criando
potencialmente uma redução oxidativa, usada para sintetizar ATP por meio de uma enzima
denominada ATP sintetase. O principal receptor de elétrons ao final do processo é o oxigênio, o
que é pivotal para permitir que o processo tenha continuidade e remova os elétrons gerados
durante a formação de íons H+, especialmente nos complexos I e III do processo de fosforilação
oxidativa (Valko et al., 2007). Entretanto, a fosforilação oxidativa não reduz todo o oxigênio a
água. Aproximadamente 1–3% dos elétrons são liberados prematuramente da cadeia de
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transporte e produzem espécies reativas de oxigênio (ERO), tais como O2- e H2O2 (Valko et al.,
2007). Essas ERO são extremamente reativas com moléculas que atuam como aceptoras de
elétrons e podem causar graves prejuízos às membranas das células, especialmente as que
contêm ácidos graxos poli-insaturados (PUFA), RNA e DNA. O papel dos antioxidantes é
proteger a célula contra danos potencialmente resultantes da produção de ERO durante o
metabolismo oxidativo da célula. Moléculas como as das enzimas superóxido dismutases e
glutationa peroxidase (GSH-Px) são alguns dos principais antioxidantes dos compartimentos
intra e extracelular.
As ERO formadas são, de fato, necessárias para que algumas reações ocorram na célula.
Entretanto, em excesso elas podem afetar diversas etapas da fertilização e do desenvolvimento
embrionário inicial. A capacitação espermática, por exemplo, foi induzida prematuramente e
afetou negativamente a reação acrossômica dos espermatozoides e a penetração na zona
pelúcida. Embriões bovinos in vitro no estágio de 4–6 células, cultivados sob condições de alta
tensão de oxigênio ou na presença de gerador de radicais livres apresentaram menor
probabilidade de se desenvolverem até o estágio de blastocisto (Fujitani et al., 1997). Embriões
de murinos, cultivados na presença de um indutor de síntese de glutationa sob estresse térmico
(Aréchia et al., 1995) apresentaram uma melhora no percentual de células vivas, de formação de
blastocistos e de blastocistos incubados que; isso foi possibilitado talvez pelo aumento na
remoção de radicais livres gerados durante o choque térmico (Loven, 1988). A presença de
Selênio teve um efeito profundo no desenvolvimento in vitro de partenotos, observado através da
maior taxa de blastocistos, do maior número de células e da expressão da GSH-Px, bem como
pelo pequeno número de células apoptóticas, de Caspase-3 e de genes apoptóticos, tais como
BAX:BCL-xL (Uhm et al., 2007). Coletivamente, prevenir danos oxidativos e apoptose parece
ser pivotal nos estágios iniciais do desenvolvimento embrionário.
Episódios de doença e tecidos reprodutivos
A transição do estágio de prenhe não lactante para o de não prenhe porém lactante torna
necessário que a vaca de leite ajuste seu metabolismo drasticamente, de forma que os nutrientes
possam ser orientados de forma a apoiar a síntese do leite, um processo denominado homeorese
(Bauman & Currie, 1980). Normalmente, há um aumento abrupto das exigências de nutrientes no
início da lactação, período em que o consumo de alimentos fica normalmente deprimido, o que
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leva à ampla mobilização de tecidos corporais, especialmente de gordura corporal, mas também
de aminoácidos, minerais e vitaminas (Santos et al., 2010). A incidência de doenças infecciosas é
uma consequência substancial da diminuição da competência imune durante o início da lactação.
Um estudo que avaliou distúrbios de saúde nos dois primeiros meses após o parto em 5.719
vacas em cinco propriedades de manejo confinado determinou que 44,2% das vacas
apresentaram ao menos um problema clínico e 17,2% apresentaram ao menos dois problemas
clínicos (Santos et al., 2010). As doenças identificadas foram problemas relacionados ao parto,
14,6%; metrites, 16,1%; endometrites clínicas, 20,8%; febre, 21,0%; mastite 12,2%; cetose,
10,4%; claudicação, 6,8%; problemas digestivos, 2,8%; e pneumonia, 2,0%. Em outro estudo
que avaliou distúrbios de saúde pós-parto, antes de inseminação, em 957 vacas em duas
propriedades de manejo extensivo, a incidência clínica de doenças era de 37,5%, a incidência de
problemas subclínicos era de 59,0% e apenas 27,0% das vacas não apresentou nenhum tipo de
problema de saúde. As doenças verificadas foram: problemas de parto, 8,5%; metrites, 5,3%;
endometriose clínica, 15,0%; endometriose subclínica 13,4%; mastites, 15,3%; problemas
respiratórios, 2,5%; problemas digestivos, 4,0%; claudicação, 3,25; níveis elevados de NEFA,
20,0%; cetose subclínica, 35,4%; e hipocalcemia subclínica, 43,3%. Além disso, de todas as
vacas que deixam uma propriedade de leite por descarte ou morte, quase 12% ocorre nas
primeiras três semanas após o parto, e 24% nos dois primeiros meses de lactação (Godden et al.,
2003), sendo que a maioria está associada a problemas de saúde. As doenças têm grande impacto
sobre a reprodução de rebanhos de gado de leite dada a alta prevalência e pela associação com
outros fatores estressantes, tais como ovulação e baixa condição corporal (Santos et al., 2009;
Santos et al., 2010).
Os mecanismos biológicos que explicam as doenças que ocorrem no pós-parto,
entretanto, não estão claramente entendidos. A maioria dos estudos é de natureza epidemiológica
e a grande maioria está associado aos efeitos negativos de doenças durante o estágio inicial da
lactação, com redução da taxa de prenhez por inseminação artificial ou com intervalos maiores
até o início da gestação. Questões importantes sobre a forma como as doenças afetam a biologia
do desenvolvimento, se as doenças de origem uterinas ou não uterinas afetam a fertilidade de
maneira diferente, o momento da incidência da doença em relação à inseminação e o papel de
outros fatores de risco associados que deprimem a fertilidade, tais como a não ovulação e
condição corporal baixa - mais prevalentes em vacas que são acometidas por doenças; tudo isso
11
“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
continua sem resposta. De maneira geral, a biologia por trás da subfertilidade atribuída às
doenças, continua esquiva e merece ser investigada.
Em propriedades que adotam o manejo confinado, a taxa de prenhez por IA baixou de
51,4% para 43,3% nas vacas com uma doença clínica após o parto, e para 34,7% nas vacas com
dois ou mais casos de doença clínica após o parto (Santos et al., 2010). Em propriedades que
adotam o manejo confinado, a taxa de prenhez por IA aumentou de 8,9% para 13,9% nas vacas
com uma doença clínica após o parto, e para 15,8% nas vacas com dois ou mais casos de doença
clínica após o parto (Santos et al., 2010). Em propriedades que adotam o sistema de pastejo, a
taxa de prenhez por IA baixou de 66,9% para 56,5% nas vacas com uma doença clínica após o
parto, e para 40,8% nas vacas com dois ou mais casos de doença clínica após o parto (Santos et
al., 2013). Além disso, os abortos entre 30 e 65 dias de gestação após IA aumentaram de 9,2%
em vacas sadias para 12,3% em vacas com uma doença clínica após o parto, e para 26,7% nas
vacas com dois ou mais casos de doença clínica após o parto. Apesar de a maioria das doenças
(aproximadamente 75%) ser diagnosticada no primeiro mês após o parto, a maioria das primeiras
inseminações ocorre após o segundo mês de lactação (Ribeiro et al., 2016). Portanto, de alguma
forma as doenças têm efeitos prejudiciais sobre a fertilidade de vacas de leite. Os mecanismos
biológicos envolvidos, entretanto, não estão totalmente entendidos.
Os bovinos afetados por doenças geralmente têm uma redução do apetite, aumento da
perda de peso corporal e alteração na partição de nutrientes (Gifford et al., 2012). A redução do
apetite depois do estabelecidmento de uma doença parece ser um comportamento preservado em
mamíferos e aves, que é explicado pela comunicação entre o sistema imunológico e o cérebro
(Dantzer & Kelley, 2007; McCusker & Kelley, 2013). As citocinas pró-inflamatórias produzidas
no tecido infectado agem no cérebro para induzir sintomas comuns de doença, um fenômeno que
que a ciência comportamental denomina comportamento de doença induzida por citocina
(Dantzer & Kelley, 2007). A ação de citocinas poderia ocorrer através da comunicação neuronal
ou através da circulação e extravasamento da barreira hematoencefálica (McCusker & Kelley,
2013). Acredita-se que a resposta fisiológica de febre e as respostas comportamenIATFs como
redução do apetite, sonolência e comportamento antisocial, facilitem a recuperação e melhoram a
sobrevida. Ainda assim, nas vacas de leite no período pós-parto estes eventos piorariam o
balanço energético, com consequências adicionais para o sistema imunológico.
12
“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
Além de reduzir a ingestão de energia, a infecção aumenta também o gasto energético,
considerando-se que montar uma resposta imunológica contra a infecção tem um custo
energético (Colditz, 2002; Demas et al., 2003; Romanyukha et al., 2006; Hotamisligil & Erbay,
2008). Este custo energético retira recursos de outros processos fisiológicos, incluindo produção,
reprodução e talvez o próprio sistema imunológico (Gifford et al., 2012; Pastorelli et al., 2012).
Em um estudo estimando o gatso energético para a defese imunológica contra pneumonia, o
aumento na taxa metabólica induzido pela febre respondeu por até 90% dos custos energéticos
(Romanyukha et al., 2006). Isto estaria de acordo com a observação de que a metrite puerperal,
quando as vacas não apresentam apenas uma inflamação maciça do útero, mas também sinais
sistêmicos de doença, como anorexia e febre,têm um impacto maior sobre a fisiologia do animal
do que a metrite sem febre (Lima et al., 2014).
A redução da ingestão de energia, aumento do gasto energético para construir uma
resposta imunológica e a alteração na partição de nutrientes resultantes da inflamação podem,
potencialmente, piorar o balanço energético e a função das células imunológicas nas vacas em
transição que, por sua vez, aumenta ainda mais a susceptibilidade a doenças metabólicas e
infecciosas. Cria-se assim um ciclo vicioso que inclui a redução no balanço energético,
comprometimento da competência das células imunológicas, aumento na incidência de doenças e
de volta à redução no balanço energético. Não é surpresa que a ocorrência de um problema de
saúde aumenta a susceptibilidade a outros problemas e tem sérias consequências para o
desempenho produtivo e reprodutivo (Santos et al., 2010; Ribeiro et al., 2013).
Estudos: Estressores e tecidos reprodutivos
O objetivo desta seção é descrever uma série de estudos realizados por nosso grupo e
colaboradores próximos. A razão fundamental é mostrar ao leitor como experimentos recentes
(tanto epidemiológicos como alterações induzidas pelo tratamento), com grau variável de
estresse imposto ao animal, comprova o efeito significativo da inflamação/doença/estresse sobre
os tecidos reprodutivos, particularmente o endeométrio e o embrião na fase inicial. Esta pesquisa
enfoca a identificação e a caracterização dos mecanismos básicos responsáveis redução da
eficiência reprodutiva de vacas de leite em lactação. Para começar, foi realizado um estudo
comparando animais em lactação com os que não estavam em lactação (Cerri et al., 2012;
Thompson et al., 2012), com o objetivo de verificar como a própria lactação (minimizando o
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“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
efeito metabólico) induz alterações nos tecidos reprodutivos. Mais recentemente, meu laboratório
estudou os efeitos de concentrações elevadas de amônia e ureia sobre o desenvolvimento
embrionário in vitro (Gunaretnam et al., não publicado) e sobre a expressão gênica no
endométrio in vivo. Uma segunda parte irá descrever dois experimentos em que LPS, um potente
indutor de estado inflamatório, foi consecutivamente administrado a novilhas e vacas após a IA.
Os resultados irão mostrar como este estado pró-inflamatório afeta embriões no dia 15 e a
expressão gênica do endométrio neste estágio. Finalmente, uma compilação de diversos estudos
(Ribeiro et al., 2016) revelou um conjunto de dados singular que claramente ilustra os
significativos efeitos carry-over de episódios de doença no primeiro mês após o parto sobre o
posterior desenvolvimento embrionário e o ambiente uterino,
Estudos 1. Lactação
Lactação e Prenhez 1 (Cerri et al., 2012): Os objetivos eram determinar os efeitos da lactação e
da prenhez sobre a expressão gênica endometrial no dia 17 do ciclo estral e sobre a prenhez.
Depois da parição, as novilhas (n=33) foram divididas aleatoriamente em dois grupos, um
lactante (L, n=17) e um não lactante (NL, n=16) grupos. As vacas foram submetidas a um
programa de sincronização da ovulação para uma inseminação artificial em rempo fixo (IATF),
10 vacas em L e 12 em NL foram inseminadas. O abate ocorreu 17 dias após o dia equivalente à
IATF e os tecidos endometriais intercarunculares foram coletados. A expressão gênica foi
determinada por análise de DNA pela técnica de microarray para vacas prenhes (L, n=8; NL,
n=6) e vacas ciclando não inseminadas L, n=7; NL, n=4). Foram selecionados genes com
expressão diferencial com valor de P < 0,01 e com expressão absoluta > 40, Além disso, um
efeito > 1,5 vezes foi usado como critério para genes afetados pela prenhez. Havia 210 genes
com regulação diferencial pela lactação (136 com infra regulação e 74 com supra regulação) e
702 genes com regulação diferencial pela prenhez (407 com infra regulação e 295 com supra
regulação). O efeito da interação entre prenhez e lactação afetou 61 genes. Genes com supra e
com infra regulação em vacas prenhes estavam associados com vários termos de ontologia
gênica (OG), como resposta de defesa e fator regulatório de interferon, adesão celular e matriz
extracelular. As análises OG de genes com supra e infra regulação de vacas em lactação
revelaram termos relacionados com prega semelhante a imunoglobulina, resposta imune,
domínio COMM e organela não ligada a membrana. Diversos genes supra regulados pela
lactação, como IGHG1, IGLL1, IGK e TRD estavam todos relacionados à função imune,
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“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
particularmente para células B e T γδ. Genes do desenvolvimento, relacionados ao
desenvolvimento neural e de membros e hemostase da glicose (DKK1, RELN, PDK4) estavam
infra regulados pela lactação, e interação também foi detectada para RELN. Os genes indicados,
associados com a função imune e os genes de desenvolvimento expressos no endométrio que são
impactados pela lactação são possíveis genes candidatos para intervenções com objetivo de
melhorar a fertilidade de vacas de leite em lactação.
Resumo: Concluindo, o efeito da lactação sobre o endométrio revelou genes que são possíveis
candidatos como sendo responsáveis pela sub-fertilidade das vacas de leite em lactação. FCGRT,
IGHG1, IGLL e TRD estavam supra regulados pela lactação, mas não alterados pela prenhez.
Estes genes indicam um possível aumento na atividade celular de linfócitos B e T γδ, que poderia
impactar de forma negativa o delicado equilíbrio imunológico do útero, necessário para aceitar o
embrião semi-alogênico. Além disso, a lactação afetou DKK1 e RELN, dois genes envolvidos
com o desenvolvimento embrionário neural e dos membros, opondo-se aos efeitos da prenhez
sobre estes genes. A via de sinalização Wnt foi infra regulado pela prenhez e o aumento no
DKK1 pela lactação pode mostrar ser um processo importante que regula a perda embrionária em
vacas de leite em lactação. Houve uma abundância de expressão coordenada de genes
necessários para dar suporte à prenhez. A regulação de diferentes funções imunológicas parece
ser o evento mais importante no endométrio prenhe no dia 17, como foi observado pelos vários
genes e os termos OG relacionados ao sistema imunológico, e é provável que a lacatação afete
alguns destes mecanismos. Representada por caderinas, claudinas e L-galectinas, a adesão
celular foi uma função principalmente com infra regulação pela prenhez, neste estágio da
prenhez, e pode indicar uma forte remodelagem celular, bem como uma janela de tempo que
facilita o fluxo de substratos da luz uterina para dar suporte ao alongamento do embrião. As
consequências da lactação sobre a via de sinalização Wnt também poderiam interferir com a
remodelagem do endométrio e, juntamente com RELN, tem impacto sobre a diferenciação e o
desenvolvimento embrionário. Como consequência da maior atividade no tecido endometrial no
dia 17 da prenhez, todos os genes relacionados ao metabolismo e transporte de carboidratos,
lipídios e aminoácidos estão com supra regulação pela prenhez, mas a supra regulação de PDK4
pela lactação é indicativa de um papel negativo sobre a homeostase de glicose, causada pela
lactação.
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“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
Figura a. Validação dos resultados de microarray usando qRT-PCR da expressão de transcritos
que foram inicialmente encontrados com supra ou com infra regulação em resposta aos efeitos da
lactação (lactantes vs. não lactantes). Ao lado de cada barra, * indica que os valores de P das
análises de microarray e qRT-PCR estão em concordância.
Lactação e Prenhez 2 (Thompson et al., 2012): Os objetivos foram caracterizar as diferenças
metabólicas e hormonais no pós-parto e as diferenças hormonais entre vacas de leite lactantes e
não lactantes, avaliar os efeitos da lactação e da prenhez sobre o endométrio e a expressão gênica
do concepto, e caracterizar associações entre o concepto e a expressão endometrial de genes no
início da prenhez (dia 17). Novilhas prenhes foram aleatoriamente divididas depois da parição
em um grupo lactante (L, n=17) e um grupo não lactante (NL, n=16). As vacas L receberam uma
ração mista total (1,65 Mcal NEL/kg, 16,5% PB) à vontade. As vacas NL receberam uma ração
de manutenção ration (1,45 Mcal NEL/kg, 12,2% PB) uma vez por dia. Todas as vacas foram
pré-sincronizadas e incluídas em um protocolo de inseminação artificial em tempo fixo (IATF),
10 vacas L e 12 NL. No dia 17 depois de GnRH/IATF, as vacas foram abatidas e foi feita a
coleta dos tecidos endometriais e do concepto. Para avaliar a expressão gênica endometrial e do
concepto foi usado o Microarray Affymetrix de DNA do Genoma Bovino. Não houve diferenças
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“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
entre o ECC (escore de condição corporal) e PC (peso corporal) entre as vacas L e NL. As vacas
L tiveram temperatura corporal mais alta do que as vacas NL (38,4 vs 38,2ºC), e as vacas NL
ciclaram mais cedo do que as L (26,3 vs 34,7 dias de lactação). Não houve diferenças nas
concentrações plasmáticas de NEFA e insulina entre NL e L. as vacas do grupo L, entretanto,
tiveram concetrações plasmáticas mais altas de BHBA (4,90 vs 2,97 mg/dl), BUN (11,6 vs 6,5
mg/dl) e concentrações menores de glicose (74,0 vs 79,9 mg/dl) do que as vacas NL. IGF-1 foi
menor no grupo L do que no NL (140,5 vs 198,2 ng/ml) e maior para as vacas prenhes em
comparação com as que estavam ciclando (191,0 vs 147,6 ng/ml). As concnetrações de
progesterona de GnRH ou IATF (dia 0) até o dia 17 foi menor para as vacas L do que para as
NL. As análises de expressão gênica indicaram que todos os conceptos (n = 13) expressaram os
genes de Glicoproteína Associada à Prenhez (PAG) PAG2, PAG8, PAG11 e PAG12. Os mesmos
genes da família PAG foram observados no endométrio de algumas vacas prenhes. Análises de
correlação simples e padrão detectaram associações de PAG11 do concepto com os genes
reguladores de prostaglandina. No endométrio, além disso, PAG11 estava associado a genes
reguladores de prostaglandina, genes específicos de células do trofoblasto, genes envolvidos com
invasão e implantação e genes reguladores de progesterona. Concluindo, a lactação alterou o
estado metabólico, o retardo do início da ciclicidade e as menores concentrações de progesterona
em vacas prenhes. A expressão precoce de genes PAG no concepto e no endométrio de vacas
prenhez pode contribuir para o sucesso do desenvolvimento inicial da prenhez.
Resumo: Concluindo, a lactação alterou o estado metabólico ainda que o PC e o ECC fossem os
mesmos entre L e NL. A lactação retardou o início da ciclicidade e reduziu as concentrações de
progesterona em vacas L prenhes durante um período programado, após a indução da ovulação.
A expressão precoce de genes PAG no concepto e no endométrio de vacas prenhes e sua
associação com outros genes permitem inferir um possível papel de PAG na manutenção e
implantação da prenhez pela regulação do desenvolvimento embrionário, invasão de células do
trofoblasto, regulação imune e metabolismo da prostaglandina.
Estudos 2. Desafios por LPS
LPS 1. Intravenoso (Fernandes et al., 2015). Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito de
estímulos intravenosos repetidos com lipopolissacarídeos (LPS) sobre a expressão gênica
endometrial de transcritos candidatos de novilhas não lactantes na fase lútea tardia. As novilhas
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“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
(n=22; 11 meses de idade) foram sincronizadas pelo protocolo ovsynch e incluídas no grupo
controle (CON; n=11), que recebeu solução fisiológica estéril IV ou no grupo LPS (LPS; n=11),
submetido a repetidas injeções IV de LPS (0,1; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 ug/kg) iniciadas dois
dias depois da IA (dia 0) e depois em dias alternados. A cada injeção de LPS, a temperatura retal
foi medida durante seis horas. Amostras de sangue foram coletadas do dia -1 ao dia 13 para
análise de TNF-α, haptoglobina e progesterone, e contagem diferencial e de leucócitos. No dia
15, foram coletadas biópsias de tecido do endométrio, mantidas a -80°C até a análise qRT-PCR
de 30 genes alvo relacionados ao sistema imunológico, moléculas de adesão e receptividade do
endométrio. A normalidade dos dados foi avaliada e os dados foram analisados por ANOVA
para medidas repetidas, usando proc MIXED e UNIVARIATE. Depois de cada injeção de LPS,
a temperatura foi maior nas primeiras 6 horas no grupo LPS em comparação com o grupo CON
P<0,05). TNF-α (P=0,05) e haptoglobina (P<0,01) estavam aumentados no grupo LPS com
tratamento significativo (P<0,05) por dia de interações. Não houve diferenças entre os grupos
com ralção à contagem total de leucócitos (P=0,29), mas a contagem diferencial foi maior para
neutrófilos, bastões e monócitos, mas reduzida para linfócitos e eosinófilos no grupo LPS
comparado com CON (P<0,01). Durante o período experimental, não houve diferenças entre os
grupos com relação às concentrações de progesterona. Dos 30 genes alvo analisados, apenas três
transcritos foram diferencialmente expressos. IDO (P=0,04; Fold=0,48) e PTX3 (P=0,01;
Fold=0,38) or “multiplied the number of times
(P=0,01; Fold=0,38) com infra regulação, enquanto que MX1 (P=0,02; Fold=2,85) estava com
supra regulação no grupo LPS. A concentração de IFN-tau no lavado uterino foi similar entre os
tratamentos. As injeções sequenciais de LPS foram capazes de induzir um estado sistêmico próinflamatório com efeito limitado, mas intenso sobre a expressão gênica de transcritos
relacionados ao sistema imunológico, sugerindo uma possível explicação para a sub-fertilidade
relacionada a transtornos de saúde em vacas de leite.
LPS 2: Intramário (Campos et al.). Além das consequências da mastite clínica sobre os
parâmetros produtivos, esta doença tem um impacto negativo sobre o desempenho reprodutivo
de vacas de leite, devido às respostas inflamatórias e imunes relacionadas à infecção da glândula
mamária que compromete a fertilidade, estabelecimento e manutenção da prenhez (Barker et al.,
1998; Santos et al., 2004; Lavon et al., 2008). Algumas moléculas produzidas pelos patógenos ou
reações imunes do hospedeiro, como citocinas, proteínas de fase aguda (PFA) e outras
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“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
biomoléculas ativas, podem influenciar a maturação e fertilização do oócito e o desenvolvimento
inicial do embrião (Soto et al., 2003). Alguns fatores de estresse, como a mastite clínica, afetam
a eficiência reprodutiva por alterar o comportamento estral e o crescimento folicular ovariano em
vacas de leite, bem como a influência sobre o momento esato da liberação do hormônio
reprodutivo na fase folicular e a ausência ou retardo do início do pico de hormônio luteinizante
(LH) (Dobson & Smith, 2000; Morris et al., 2011). O objetivo do estudo foi avaliar o efeito da
resposta inflamatória em consequência da mastite crônica, induzida pela endotoxina
lipopolissacarídea (LPS) da infusão de Escherichia coli na glândula mamária, sobre a expressão
gênica no endométrio de transcritos candidatos de vacas Holandesas lactante durante a fase de
pré-implante do desenvolvimento embrionário inicial. Neste estudo, LPS foi infundido na
glândula mamária nos dias 5 e 10 após a IA. Todos os marcadores inflamatórios fisiológicos e
sistêmicos foram modificados no grupo LPS. Todos os parâmetros de temperatura reticular,
haptoglobina e TNF-α no plasma e CCS no leite estavam elevados no período pós-infusão
(P<0,01). A produção de leite foi diminuída pela infusão de LPS, mas a concentração plasmática
de progesterona foi similar entre os grupos. Contudo, a parte sobre expressão gênica deste estudo
ainda está incompleta, o tamanho e o peso dos conceptos recuperados foram modificados pelas
infusões intramamárias de LPS.
Resumo: A expressão menor, cerca de três vezes, dos genes IDO e PTX3 foi observada nas
novilhas do grupo LPS em comparação com o grupo CON. Isso pode sinalizar uma possível ação
dos mediadores pró-inflamatórios envolvidos na resposta inflamatória sistêmica sobre o perfil
anti-inflamatório necessário para estabelecer a imuno tolerância ao embrião. Os resultados
confirmam o estudo de Walker et al (2012), que avaliou a expressão gênica endometrial durante
o início da prenhez em vacas consideradas férteis e sub-férteis, e observaram que os genes IDO e
PTX3 também eram menos expressos no grupo sub-fértil do que nas vacas férteis. Além da
supressão de genes responsáveis pelo perfil anti-inflamatório endometrial durante o início da
prenhez, como IDO e PTX3, a aparente desregulação na expressão de MX1, expressa cerca de
3,5 vezes mais no Grupo LPS do que no CON, apoia a ideia de uma possível mudança no perfil
imunológico do endométrio, sugerindo um perfil pró-inflamatório. Apesar destes achados, a falta
de importantes mudanças nas concentrações de IFN-tau no lavado uterino (intravenoso) e no
tamanho do concepto (intramamário) e as mudanças importantes, mas relativamente pequenas,
na expressão gênica do endométrio demonstra a grande lacuna no conhecimento relacionando
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“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
saúde e inflamação com a fertilidade. Como foi observado no próximo estudo, no caso da mastite
estão claras as extraordinárias consequências da saúde sub-ótima sobre a fertilidade. Neste ponto,
entretanto, não há uma base clara capaz de explicar as causas moleculares e celulares destes
efeitos do ponto de vista do concepto inicial e do ambiente uterino.
Contagem de células somáticas e infecção da glândula mamária sobre a fertilidade (Barbosa et
al.): Estes estudos tiveram como objetivos determinar a sensibilidade (Se) e a especificidade
(Sp) dos diferentes limiares da contagem de células somáticas (CCS) para identificar a mastite
sub-clínica e para availar o impacto das bactérias causadoras de mastite e da CCS durante o
protocolo da transferência de embrião em tempo fixo (TETF) sobre a prenhez por transferência
de embrião (P/TE) nas receptoras, vacas de leite em lactação. No estudo 1, foram incluídas
2.516 vacas Holandesas e Girolando em lactação, provenientes de 8 rebanhos. Em cada vaca,
foram coletadas duas amostras de leite em estágio da lactação aleatório, para avaliar a CCS e
fazer a cultura bacteriana. No estudo 2, 1.397 vacas Girolando em lactação foram submetidas a
um protocolo TETF. As amostras de leite foram coletadas dois dias antes da TETF para cultura
bacteriana e CCS. Os diagnósticos de prenhez foram realizados nos dias 31 e 66 após a TETF.
Os animais foram agrupados de acordo com as recomendações do NMC (National Mastitis
Council): bactérias ambientais Gram-positivas (EV+; Bacillus spp., Enterococcus spp.,
Streptococcus spp, Micrococcus spp.), bactérias ambientais Gram-negativas (EV-, Citrobacter
freundii, Coliformes, Enterobacter spp., Klebsiella spp., Proteus spp., Pseudomonas spp.),
bactérias contagiosas Gram-positivas (C+; Corynebacterium bovis, Staphylococcus aureus,
Streptococcus agalactiae), estafilococos coagulase-negativos (CNS) e controle (sem crescimento
bacteriano). No estudo 1, a prevalência geral de IIM (infecção intra-mamária) foi 61,8% e a
sensibilidade e especificidade de limiares selecionados de CCS variaram de acordo com o grupo
de patógenos. A maior Se (78,1%) foi observada com o limiar de 100.000 células/ml. No estudo
2, o crescimento bacteriano reduziu (P <0,01) a P/TE nos dias 31 e 66. A P/TE foi menor
(P<0,05) no dia 31 nos grupos [EV-] (30,1% [68/201]) e [EV +] (29,9% [24/82]) e tenderam (P =
0,09) a ser menores no grupo [C +] (36,6% [85/245]) do que no controle (44,0 [367/869]). As
vacas com CCS acima de 400.000 células/ml tiveram P/TE (30,4% [75/247]) menor (P<0,01) do
que os animais com CCS inferior a 200.000 células/ml (40,8% [292/716]). O uso de uma única
análise CCS pode não ser um parâmetro eficaz para detectar IIM, porque Se. e Sp. foram baixas.
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“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
A CCS elevada e o isolamento bacteriano intramamário reduziram a P/TE de receptoras, vacas
de leite em lactação.
Resumo: O uso de uma única análise CCS pode não ser o parâmetro mais eficaz para detectar
IIM, uma vez que Se. e Sp. foram baixos nos limiares estudados. CCS elevada e isolamento
bacteriano intramamário reduzem a P/TE nas vacas de leite lactantes, sugerindo que alguns dos
efeitos são sobre o útero ou sobre o embrião depois do dia 7.
Estudos 3. Doença
Doença 1: Desenvolvimento Embrionário para o Estágio de Mórula (Ribeiro et al., 2016). De
um total de 635, 597 (94%) tiveram ovulação sincronizada depois da IA e tiveram lavado uterino
no dia 5 ou 6 após a IA, para recuperação de óvulos ou embriões. Destes, 419 lavados (70,2%)
resultaram em um óvulo-embrião recuperado dos quais 347 (82,8%) estavam clivados. Um total
de 280 embriões foi considerado como vivo, enquanto que 67 estavam degenrados. Os embriões
vivos representaram 66,8% de todos os óvulos-embriões recuperados e 80,7% de todos os
embriões recuperados. Um total de 233 óvulos-embriões foi classificado como de alta qualidade,
o que representou 55,6% de todos os óvulos-embriões e 67,1% dos embriões recuperados.
A incidência de doença antes da IA foi 41,9%. A incidência de doença uterina (DUT) e
doença não uterina (DNUT) foi 22,0 e 28,8%, respectivamente. A incidência de doença antes da
IA reduziu a proporção de embriões clivados, vivos e de alta qualidade em relação aos óvulosembriões recuperados (Figura a), bem como a proporção de embriões vivos e de alta qualidade
em relação aos embriões recuperados. Os resultados foram similares quando os dados foram
modelados de acordo com DUT e NDUT separadamente, exceto pela proporção de óvulos
clivados que foram afetados pela DUT mas não por NDUT.
Doença 2: Desenvolvimento Pré-implantação do Concepto e Transcrpitoma (Ribeiro et al.,
2016). Interferon-τ foi detectado no fluido uterino em 70 das 148 vacas (47,3%), e estas vacas
foram consideradas prenhes. Destas, 52 conceptos foram recuperados. A incidência de doenças
antes da IA foi 45,3%. As incidências de DUT e NDUT foram 32,4 e 21,6%, respectivamente. A
doença não afetou (P = 0,93) a prenhez no dia 15-16. Mas resultou em conceptos mais curto e
redução da concentração de IFN-τ no lavado uterino (Figura b). resultados similares foram
observados quando os dados foram modelados de acordo com DUT ou NDUT. As vacas
diagnosticadas com DUT tiveram conceptos mais curtos (P < 0,01) do que as vacas sem doença
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“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
uterina. As vacas com NDUT também tiveram conceptos mais curtos (P = 0,02) do que as vacas
sem NDUT. Por causa do concepto mais curto, as vacas com DUT (P = 0,06) e as com NDUT (P
= 0,07) tenderam a ter concentrações reduzidas de IFN-τ no lavado uterino. A doença reduziu (P
< 0,05) a concentração de progesterona em todas as vacas (Figura b). As análises do
transcriptoma revelaram poucos genes com expressão diferente entre os conceptos recuperados
de vacas previamente diagnosticadas e as não diagnosticadas com NDUT antes da IA. Apenas 7
transcritos tiveram expressão diferente, 4 com infra regulação e 3 com supra regulação no dia 15
em conceptos de vacas NDUT. Em conceptos do dia 16 de vacas NDUT, 35 transcritos tiveram
expressão diferente, 9 com infra regulação e 26 com supra regulação. A análise funcional revelou
que as principais doenças e transtornos associados com os genes expressos nos conceptos do dia
16 foram doença inflamatória (11 moléulas; OP < 0,04), doença imunológica (11 moléculas; OP
< 0,05) e transtornos do tecido conjuntivo (8 moléculas; OP < 0,05). Foram identificados três
reguladores upstream potenciais de alterações no transcriptoma e todos tinham atividade
aumentada prevista. Eram lipopolissacarídeo OP = 8,5E-04, ZS = 2,4), interferon-γ (OP = 4,1E03, ZS = 2,4), e fator de necrose tumoral (OP = 5,7E-02, ZS = 2,2). Dois efeitos downstream
potenciais dos genes expressos de forma diferente, com valores OP muito pequenos, foram
ativação das células (OP = 4,2E-05, ZS = 1,7) e síndrome autoimune sistêmica (OP = 4,8E-05,
efeito não previsto). Além disso, as vias reconhecidas, mais significativas, incluíram a via de
sinalização OX40 (OP = 5,0E-05), sinalização diabetes mellitus tipo I (OP = 6,5E-04), via de
apresentação de antígeno (OP = 1,1E-03), sinalização da doença enxerto versus hospedeiro (OP
= 1,1E-03) e sinalização de rejeição do aloenxerto (OP = 1.4E-03).
A
No disease
100
%
P = 0.05
P < 0.01
B
Disease
P < 0.01
P < 0.01
No UTD
100
P = 0.02
P = 0.02
P < 0.01
C
UTD
P < 0.01
P < 0.01
No NUTD
100
P = 0.03
90
90
90
80
80
80
70
70
70
60
60
%
50
P = 0.05
P = 0.03
P = 0.05
50
40
40
30
30
30
20
20
20
10
10
10
0
0
High
*Live
*High
quality embryos quality
embryos
embryos
P = 0.05
60
%
50
40
Cleaved
Live
embryos embryos
P = 0.63
NUTD
0
Cleaved
Live
embryos embryos
High
*Live
*High
quality embryos quality
embryos
embryos
Cleaved
Live
embryos embryos
High
*Live
*High
quality embryos quality
embryos
embryos
22
“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
Figura a. Embriões clivados, embriões vivos (graus 1 a 3) e embriões de alta qualidade (graus 1
e 2) como porcentagem de óvulos-embriões recuperados (sem asterisco) ou como
porcentagem de embriões recuperados (com asterisco), de acordo com a incidência de
doença (Painel A), doenças uterinas (DUT; Painel B) e doenças não uterinas (NDUT; Painel
C). as barras de erro representam o EPM.
No disease
B
Disease
No disease
Length of conceptus, mm
30
Pregnant d 15, %
50
40
30
20
10
25
20
15
10
5
0
Disease
8.0
E
P = 0.02
800
600
400
200
No disease
7.0
7.0
6.0
6.0
P = 0.06
4.0
3.0
P = 0.50
1.0
0.0
Disease
P = 0.22
8.0
P < 0.01
5.0
Disease
0
Progesterone, ng/mL
Progesterone, ng/mL
No disease
0
No disease
2.0
C
P < 0.01
P = 0.93
60
D
Disease
IFN-τ in uterine flush, pg/mL
A
5.0
P = 0.21
4.0
3.0
2.0
P = 0.54
1.0
0.0
Day 0
Day 7
Day 15
Day 0
Day 7
Day 15
Figura b. Prenhez por AI no dia 15 baseada na detecção de interferon-τ (IFN-τ) no lavado
uterino (Painel A); comprimento dos conceptos intactos recuperados (Painel B); concentração de
IFN-τ no lavado uterino de vacas prenhes (Painel C); concentração de progesterona nos dias 0, 7
e 15 em relaçãp à IA em todas as vacas (Painel D) ou em vacas prenhes (Painel E), de acordo
23
“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
com a incidência de doença antes da IA. As barras de erro representam o EPM para todos os
painéis, com exceção do Painel C, que representa 95%.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Andreasen, A. S., K. S. Krabbe, R. Krogh-Madsen, S. Taudorf, B. K. Pedersen, K. Møller. 2008. Human
endotoxemia as a model of systemic inflammation. Curr Med Chem. 15(17):1697-705.
Aréchiga, C.F., A.D. Ealy, and P.J. Hansen. 1995. Evidence that glutathione is involved in
thermotolerance of preimplantation murine embryos. Biol. Reprod. 52:1296-1301.
Bany, B. M. & T. G. Kennedy. 1995. Interleukin-1β regulates prostaglandin production and
cyclooxygenase activity in sensitized rat endometrial stromal cells in vitro. Biol. Reprod. 53:126–
132.
Barker, A. R.; F. N. Schrick, M. J. Lewis, H. H. Dowlen, S. P. Oliver. 1998. Influence of clinical mastitis
during early lactation on reproductive performance of Jersey cows. Journal of Dairy Science,
Champaign, v. 81, p.1285-1290,
Bauersachs, S., S.E. Ulbrich, K. Gross, S.E. Schmidt, H.H. Meyer, H. Wenigerkind, M. Vermehren, F.
Sinowatz, H. Blum, and E. Wolf. 2006. Embryo induced transcriptome changes in bovine
endometrium reveal species-specific and common molecular markers of uterine receptivity.
Reproduction 132:319-331.
Bauman, D. E. & W. B. Currie. 1980. Partitioning of nutrients during pregnancy and lactation: a review
of mechanisms involving homeostasis and homeorhesis. J. Dairy Sci. 63:1514-1529.
Bazer, F. W., R. E. Spencer, and T. L. Ott. 1996. Interferon tau: Pregnancy recognition signal in
ruminants. Proc. Exp. Biol. Med. 213:215-229.
Cerri, R.L.A.; Thompson, I.M.; Kim, I.H.; Ealy, A.D.; Hansen, P.J.; Staples, C.R.; Li, J.L.; Santos, J.E.P.;
Thatcher, W.W. 2012. Effects of lactation and pregnancy on gene expression of endometrium of
Holstein cows at day 17 of the estrous cycle or pregnancy. Journal of Dairy Science, Champaign,
v.95, n.10, p.5657-5675.
Chagas e Silva, J., L. Lopes da Costa, and J. Robalo Silva. 2002. Plasma progesterone profiles and factors
affecting embryo-fetal mortality following embryo transfer in dairy cattle. Theriogenology. 58:5159.
Chen, H. W., W. S. Jiang, and C. R. Tzeng. 2001. Nitric oxide as a regulator in preimplantation embryo
development and apoptosis. Fertil. Steril. 75:1163.
Cohen J. I. 2000. Stress and mental health: a biobehavioral perspective. Issues Ment Health Nurs. 21:185202.
Colditz, I.G. 2002. Effects of the immune system on metabolism: implication for production and disease
resistance in livestock. Livest. Prod. Sci. 75:257-268.
Dantzer, R., and K. W. Kelley. 2007. Twenty years of research on cytokine-induced sickness behavior.
Brain Behav. Immun. 21:153-160.
24
“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
Demas, G. E., D. L. Drazen, and R. J. Nelson. 2003. Reductions in total body fat decrease humoral
immunity. Proc. Biol. Sci. 270: 905-911.
Dobson, H. & R. F. Smith. 2000. What is stress, and how does it affect reproduction? Anim Reprod Sci.
60-61:743–752
Forde N., T.E. Spencer, F.W. Bazer, G. Song, J.F. Roche, and P. Lonergan. 2010. Effect of pregnancy
and progesterone concentration on expression of genes encoding for transporters or secreted
proteins in the bovine endometrium. Physiol. Genom. 41:53-62.
Fujitani, Y., K. Kasai, S. Ohtani, K. Nishimura, M. Yamada, and K. Utsumi. 1997. Effect of oxygen
concentration and free radicals on in vitro development of in vitro-produced bovine embryos. J.
Anim. Sci. 75:483-489.
Gifford C.A., B. P. Holland, R. L. Mills, C. L. Maxwell, J. K. Farney, S. J. Terrill, D. L. Step, C. J.
Richards, L. O. Burciaga-Robles, and C. R. Krehbiel. 2012. Growth and development symposium:
Impacts of inflammation on cattle growth and carcass merit. J. Anim. Sci. 90:1438-1451.
Glaser, R. & J. K. Kiecolt-Glaser. 2005. Stress-induced immune dysfunction: implications for health.
Nature Reviews Immunology. 5:243-251.
Godden, S., P. Rapnicki, S. Stewart, J. Fetrow, A. Johnson, R. Bey, R. Farnsworth. 2003. Effectiveness of
an internal teat seal in the prevention of new intramammary infections during the dry and earlylactation periods in dairy cows when used with a dry cow intramammary antibiotic. J. Dairy Sci.
86:3899-3911.
Grandin, T. 1997. Assessment of stress during handling and transport. J Anim Sci. 75:249-257.
Grandin, T. 1998. Review: Reducing handling stress improves both productivity and welfare. Anim Sci.
14:1-10.
Hafez, E. S. E., B. 2004. Hafez. Animal Reproduction. 7. ed. São Paulo – Brazil. Manole. p. 513 .
Hansen, P.J., R.V. Anthony, F.W. Bazer, G.A. Baumbach, and R.M. Roberts. 1985. In vitro synthesis and
secretion of ovine trophoblast protein-1 during the period of maternal recognition of pregnancy.
Endocrinology 117:1424-1430.
Hasler, P.F. 2001. Factors affecting frozen and fresh embryo transfer pregnancy rates in cattle.
Theriogenology. 56:1401-1415.
He, C.L., P. Damiani, J.B. Parys, and R.A. Fissore. 1997. Calcium, calcium release receptors, and meiotic
resumption in bovine oocytes. Biol. Reprod. 57:1245-1255.
Hotamisligil GS, Erbay E. 2008. Nutrient sensing and inflammation in metabolic diseases. Nat Rev
Immunol. 8(12):923–34.
Hsu, P., C. Hsu, and Y.L. Guo. 1999. Hydrogen peroxide induces premature acrosome reaction in rat
sperm and reduces their penetration of the zona pellucida. Toxycology 139:93-101.
Hyttel, P., D. Viuff, B. Avery, J. Laurincik, and T. Greve. 1996. Transcription and cell cycle-dependent
development of intranuclear bodies and granules in two-cell bovine embryos. J. Reprod. Fertil.
108:263-270.
Kobayashi, Y., C. K. Boyd, C. J. Bracken, W. R. Lamberson, D. H. Keisler, and M. C. Lucy. 1999.
Reduced growth hormone receptor (GHR) messenger ribonucleic acid in liver of periparturient
cattle is caused by a specific down-regulation of GHR 1A that is associated with decreased insulinlike growth factor I. Endocrinology 140:3947-3954.
25
“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
Kong, S.H., Y.M. Choy, K.P. Fung, and C.Y. Lee. 1991. Membrane depolarization induces protein kinase
C translocation and voltage operated calcium opening in PU cells. Sec. Messeng. Phosph. 13:117130.
Koolhaas, J. M., S. M. Korte, S. F. De Boer, B. J. Van Der Vegt, C. G. Van Reenen, H. Hopster, I. C. De
Jong, M. A. W. Ruie, and H. J. Blokhuis. 1999. Coping styles in animals: Current status in
behavior and stress-physiology. Neurosci. Biobehav. Rev. 23:925–935.
Latham, K. E., and R. M. Schultz. 2001. Embryonic genome activation. Rev. Front. Biosci. 6:748-759.
Lavon, Y., G. Leitner, T. Goshen, R. Braw-Tal, S. Jacoby, and D. Wolfenson. 2008. Exposure to
endotoxin during estrus alters the timing of ovulation and hormonal concentrations in cows.
Theriogenology 70:956-967.
Leung, S. T., K. Derecka, G. E Mann, A. P. Flint, D. C. Wathes. 2000. Uterine lymphocyte distribution
and interleukin expression during early pregnancy in cows. J Reprod Fertil 119: 25-33.
Lima, F. S., A. Vieira-Neto, G. S. F. M. Vasconcellos, R. D. Mingoti, E. Karakaya, E. Solé, R. S.
Bisinotto, N. Martinez, C. A. Risco, K. N. Galvão, and J. E. P. Santos. 2014. Efficacy of ampicillin
trihydrate or ceftiofur hydrochloride for treatment of metritis and subsequent fertility in dairy cows.
J. Dairy Sci. 97:5401-5414.
Loven, D.P. 1988. A role for reduced oxygen species in heat induced cell killing and the induction of
thermotolerance. Med. Hypotheses 26:39-50.
Lucy, M.C. 2001. Reproductive loss in high-producing dairy cattle: where will it end? J. Dairy Sci.
84:1277-1293.
Lynch, E. M. 2010. Characterisation of physiological and immune-related biomarkers of weaning stress
in beef cattle. Thesis submitted to the National University of Ireland.
Madden, K. S. & S. Livnat. 1991. Catecholamine action and immunologic reactivity. In
Psychoneuroimmunology, 2nd ed, (Ader, R. et al., ed), Academic Press.
Mattioli, M, L. Gioia, and B. Barboni. 1998. Calcium elevation in sheep cumulus-oocyte complexes after
luteinising hormone stimulation. Mol. Reprod. Dev. 50:361-369.
McCusker, R. H., and K. W. Kelley. 2013. Immune-neural connections: how the immune systemʼs
response to infectious agents influences behavior. J. Exp. Biol. 216:84-98.
Miyamoto, Y., D. J. Skarzynski, K. Okuda. 2000 Is tumor necrosis factor a trigger for the initiation of
prostaglandin F2a release at luteolysis in cattle? Biol Reprod; 62:1109–1115.
Moberg, G.P. 1985. Influence of stress on reproduction: Measure of well-being. Animal Stress. 245-267
Morris, M. J., K. Kaneko, S. L. Walker, D. N. Jones, J. E. Routly, R. F. Smith, H. Dobson. 2011.
Influence of lameness on follicular growth, ovulation, reproductive hormone concentrations and
estrus behavior in dairy cows. Theriogenology. 1;76(4):658-68.
Pampfer, S., Y. D. Wuu, I. Vanderheyden, and R. de Hertogh. 1994. Expression of tumor necrosis factorb (TNF-b) receptors and selective effect of TNFb on the inner cell mass in mouse blastocyst.
Endocrinology. 134: 206.
Pastorelli H., J. Van Milgen, P. Lovatto, L. Montagne. 2012. Meta-analysis of feed intake and growth
responses of growing pigs after a sanitary challenge. Animal. 6:952-961.
Petrunkina, A.M., R. Gehlhaar, W. Drommer, D. Waberski D, and E. Topfer-Petersen. 2001. Selective
sperm binding to pig oviductal epithelium in vitro. Reprod. 121:889-896.
26
“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
Revah, I., B. M. Gadella, F. M. Flesch, B. Colenbrander, and S. S. Suarez. 2000. Physiological state of
bull sperm affects fucose- and mannose-binding properties. Biol. Reprod. 62:1010-1015.
Ribeiro E. S., F. S. Lima, L. F. Greco, R. S. Bisinotto, A. P. A. Monteiro, M. Favoreto, H. Ayres, R. S.
Marsola, N. Martinez, W. W. Thatcher, and J. E. P. Santos. 2013. Prevalence of periparturient
diseases and effects on fertility of seasonally calving grazing dairy cows supplemented with
concentrates. J. Dairy Sci. 96:5682-5697.
Ribeiro, E.S., G. Gomes, L.F. Greco, R.L.A. Cerri, A. Vieira-Neto, P.L. Monteiro Jr., F.S. Lima, R.S.
Bisinotto, W.W. Thatcher, and J.E.P. Santos. 2016. Carryover effect of postpartum inflammatory
diseases on developmental biology and fertility in lactating dairy cows. J Dairy Sci. 99:2201-2220.
Romanyukhaa, A. A., S. G. Rudneva, and I. A. Sidorov. 2006. Energy cost of infection burden: An
approach to understanding the dynamics of host-pathogen interactions. J. Theor. Biol. 241:1-13.
Santos, J. E. P., W. W. Thatcher, R. C. Chebel, R. L. A. Cerri, K.N. Galvão. 2004. The effect of
embryonic death rates in cattle on the efficacy of estrus synchronization programs. Anim Reprod
Sci. 82-83:513-535.
Santos, J.E.P., H.M. Rutigliano, and M.F. Sá Filho. 2009. Risk factors for resumption of postpartum
cyclicity and embryonic survival in lactating dairy cows. Anim. Reprod. Sci. 110:207-221.
Santos, J.E.P., R.S. Bisinotto, E.S. Ribeiro, F.S. Lima, L.F. Greco, C.R. Staples, and W.W. Thatcher.
2010. Applying nutrition and physiology to improve reproduction in dairy cattle. Soc. Reprod.
Fertil. Suppl. 67:387-403.
Sartori, R., G.J. Rosa, and M.C. Wiltbank. 2002. Fertilization and early embryonic development in heifers
and lactating cows in summer and lactating and dry cows in winter. J. Dairy Sci. 85:2813-2822.
Senger, P. L. 2003. Pathways to pregnancy and parturition. 2nd ed. Current conceptions, Inc. pp. 266-303.
Skarzynski, D. J., Y. Miyamoto, K. Okuda. 2000. Production of prostaglandin f(2alpha) by cultured
bovine endometrial cells in response to tumor necrosis factor alpha: cell type specificity and
intracellular mechanisms. Biol Reprod. 62(5):1116-20.
Smith, T. T., and R. Yanagimachi. 1990. The viability of hamster spermatozoa stored in the isthmus of
the oviduct: The importance of sperm-oviduct contact for sperm survival. Biol. Reprod. 42:450457.
Soto, P., R. P. Natzke, and P. J. Hansen. 2003. Identification of possible mediators of embryonic
mortality cause by mastitis: actions of lipopolysaccharide, prostaglandin F2α, and the nitric oxide
generator, sodium nitroprusside dihydrate, on oocyte maturation and embryonic development in
cattle. Am. J. Reprod. Immunol. 50: 263.
Spencer, T.E., G.A. Johnson, R.C. Burghardt, and F.W. Bazer. 2004. Progesterone and placental hormone
actions on the uterus: insights from the domestic animals. Biol. Reprod. 71:2-10.
Spencer, T.E., O. Sandra, and E. Wolf. 2008. Genes involved in conceptus-endometrial interactions in
ruminants: insights from reductionism and thoughts on holistic approaches. Reproduction 135:165179.
Staples, C.R., J. M. Burke, and W. W. Thatcher. 1998. Influence of supplemental fats on reproductive
tissues and performance of lactating cows. J. Dairy Sci. 81:856-871.
Susan J. T. & A. N. Caryl. 2007. Relationship between stress, eating behavior and obesity. Nutrition.
23(11-12):887-894.
Thatcher, W.W., M. Binelli, J. Burke, C.R. Staples, J.D. Ambrose, and S. Coelho. 1997. Antiluteolytic
signals between the conceptus and endometrium. Theriogenology 47:131-140.
27
“XX Curso Novos Enfoques na Produção e Reprodução de Bovinos”
Thatcher, W.W., M.D. Meyer, G. Danet-Desnoyers. 1995. Maternal recognition of pregnancy. J. Reprod.
Fertil. Suppl. 49:15-28.
Thompson, I. M., R. L. A. Cerri, I. H. Kim, A. D. Ealy, P. J. Hansen, C. R. Staples, and W. W. Thatcher.
2012. Effects of lactation and pregnancy on metabolic and hormonal responses and conceptus and
endoametrial gene expression of Holstein dairy cattle. J. Dairy Sci. submitted.
Trounson, A., C. Anderiesz, and G. Jones. 2001. Maturation of human oocytes in vitro and their
developmental competence. Reproduction 121:51-75.
Uhm, S.J., M.K. Gupta, J.H. Yang, S. Lee, and H.T. Lee. 2007. Selenium improves the developmental
ability and reduces the apoptosis in porcine parthenotes. Mol. Reprod. Dev. 74:1386-1394.
Valko, M., D. Leibfritz, J. Moncol, M. T. D. Cronin, M. Mazur, and J. Telser. 2007. Free radicals and
antioxidants in normal physiological functions and human disease. The Int. J. Biochem. Cell Biol.
39:44-84.
Vallée, M., I. Dufort, S. Desrosiers, A. Labbe, C. Gravel, I. Gilbert, et al. 2009. Revealing the bovine
embryo transcript profiles during early in vivo embryonic development. Reproduction. 138:95–105
Viuff, D., P. Hyttel, B. Avery, G. Vajita, T. Greve, H. Callesen, and PD Thomsen. 1998. Ribossomal
ribonucleic acid is transcribed at the 4-cell stage in in vitro-produced bovine embryos. Biol.
Reprod. 59:626-631.
Walker, C. G.; M. D. Littlejohn, M. D. Mitchell, J. R. Roche, S. 2012. Meier. Endometrial gene
expression during early pregnancy differs between fertile and subfertile dairy cow strains.
Physiological genomics, 44:47–58.
Wang, D., M. Garcia, R.S. Bisinotto, N. Martinez, F. S. Lima, L. F. Greco, J. H. Shin, A. M. M. Calaça,
A. L. Ranieri, B. L. Artiaga, E. K. Ganda, G. C. Gomes, L. F. V. Becker, S. C. Soares, V. S.
Rezende, M. A. Engstrom, J. E. P. Santos, and C. R. Staples. 2013. Effect of supplementing
vitamin E and β-carotene to prepartum Holstein cattle on health and reproductive responses. J.
Dairy Sci. 96 (Suppl. 1):253 (Abstr.).
Wathes, D. C., M. Fenwick, Z. Cheng, N. Bourne, S. Llewellyn, D. G. Morris, D. Kenny, J. Murphy, and
R. Fitzpatrick. 2007. Influence of negative energy balance on cyclicity and fertility in the hight
producing dairy cows. Theriogenology 68:232-241.
Wilson, R. D., P. M. Fricke, M. L. Leibfried-Rutledge, J. J. Rutledge, C. M. Penfield, and K. A. Weigel.
2006. In vitro production of bovine embryos using sex-sorted sperm. Theriogenology, 65:10071015.
Wiltbank, M., H. Lopez, R. Sartori, S. Sangsritavong, and A. Gumen. 2006. Changes in reproductive
physiology of lactating dairy cows due to elevated steroid metabolism. Theriogenology 64: 17-29.
Zeng, F., Baldwin, D. A. & Schultz, R. M. 2004. Transcript profiling during preimplantation mouse
development. Dev. Biol. 272:483–496.
28