universidade do vale do paraíba instituto de pesquisa e

UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA
INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
PROGRAMA DE ENGENHARIA BIOMÉDICA
LÁZARO PINTO MEDEIROS NETO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E BIOQUÍMICA DE LESÕES DE
TIREÓIDE PARA DIAGNÓSTICO CLÍNICO
São José dos Campos, SP
2014
LÁZARO PINTO MEDEIROS NETO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E BIOQUÍMICA DE LESÕES DE
TIREOIDE PARA DIAGNÓSTICO CLÍNICO
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de
Pós graduação em Engenharia Biomédica, como
complementação dos créditos necessários para
obtenção do título de Mestre em Engenharia
Biomédica.
Orientador: Profa. Dra. Renata de Azevedo Canevari
Co-orientador: Prof. Dr. Aírton Abrahão Martin
São José dos Campos, SP
2014
LÁZARO PINTO MEDEIROS NETO "CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E BIOQUÍMICA DE LESÕES DE TIREOIDE PARA O DIAGNÓSTICO CLÍNICO." Dissertação aprovada como requisito parci al à obtenção do grau de Mestre em Engenharia
Biomédica, do Programa de Pós-Gradu ação em Engenharia Biomédica, do Instituto de Pesquisa
e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte
banca examinadora :
Prof. Dr. AIRTON ABRAHÃO MARTIN (UNIVAP)
pror. Ora. RENATA DE AZEVEDO CANEV ARI
Prof'. Ora. Sandra Maria Fonseca da Costa
Diretor do IP&O - UniVap
São José dos Campos, 26 de fevereiro de 2014.
_
(UNIVAP) ~:
'
A esta nova conquista permitida por Deus em minha vida compartilho e dedico a
pessoas especiais que estiveram ao meu lado a todo o tempo.
Aos meus pais, Luís e Flávia pelo imenso amor e tempo dedicado e as minhas irmãs
Pâmela e Amanda, pessoas que sempre me apoiaram e que eu amo muito.
A minha família pela torcida e pelos incentivos de que tudo daria certo.
Aos meus amigos Leonel, Lia, Luciana Crumoe Liliane que souberam entender o
silêncio e o desânimo em vários momentos e sempre com as palavras certas me ajudaram.
Momentos difíceis foram vencidos e obstáculos ultrapassados com luta. Como
resultado de toda esta etapa conquistada restam as amizades verdadeiras e os belos momentos
que ficarão eternizados.
AGRADECIMENTO
Agradecer é demonstrar gratidão e a Deus eu agradeço pela vida, pela sabedoria e por
poder levantar a cada dia e compartilhar do seu amor. Em todo o tempo a orientação e o
caminho foramtraçados por Ele.
“Tudo procede para o bem daqueles que amam a Deus”Rom. 8.28.
A minha família, pais e irmãs que dedicaram grande parte de suas vidas para que mais
um sonho pudesse ser alcançado. Aos meus pais, Luís e Flávia eu agradeço por terem desde
minha infância me preparado e me ensinado a nunca desistir e batalhar sempre para
conquistar meus sonhos. As minhas irmãs Pâmela e Amanda agradeço pela cumplicidade e
pelo apoio durante esta caminhada. Agradeço a Deus pela oportunidade de realizar minha
caminhada ao lado de uma família feliz como a nossa.
Aos meus amigos... a estes não posso deixar de agradecer. Como não faço da busca de
amigos uma prioridade na minha vida, sempre sou agraciado com o surgimento de amizades
verdadeiras e que só contribuem para o meu crescimento. Agradeço muito a aluna Selen pelos
momentos passados dentro do laboratório e a biomédica Luciana Crumo que foi uma parceira
muito importante e que contribuiu muito para que eu conseguisse atingir este objetivo. Juntos
no laboratório, eu, Selen e Lu formamos uma verdadeira equipe. A Luciana Marques eu
agradeço muito pela atenção e pelos ensinamentos em biologia molecular, pois sem isso este
projeto não seria concretizado. Agradeço ao meu amigo Leonel por toda a ajuda e por tudo
que tem feito por mim e a Lia, pessoa maravilhosa que surgiu na minha vida para deixar os
dias de mestrado mais alegres. Agradeço também aos amigos que pela distância não estão ao
meu lado, mas sempre estão nos meus pensamentos.
Agradeço muito aos meus orientadores Renata Canevari e Aírton Martin pelo esforço
realizado e pela oportunidade de desenvolver este projeto tão importante. O verdadeiro mestre
é aquele que acredita em seu aluno e o proporcionam maneiras de desenvolver seus talentos.
Agradeço especialmente ao prof. Aírton pela oportunidade de desenvolver uma pesquisa em
uma área que eu não imaginava ser capaz de atuar. Isso foi muito importante e me mostrou
que nada é tão difícil que com esforço não possa ser realizado.
Aos professores e alunos do LEVB e do programa agradeço pelos ensinamentos, em
especial as professoras Renata Amadei e Maria Teresa Dejuste, com as quais eu tive a
oportunidade de desenvolver projetos que acrescentaram muito em minha vida acadêmica.
Agradeço ao professor Claudio Tellez que com muita atenção e dedicação me ensinou
importantes conceitos sobre espectroscopia Raman e ao professor Wellington Ribeiro pela
orientação durante meu estágio docência. Agradeço aos alunos Juliana Guerra, João,
Nicholas, Nathanne e Guilherme que disponibilizaram parte de seu tempo me ajudando e me
ensinando e aos meus colegas de mestrado Liliane, Cléber, Sidnei e Lia que fazem parte desta
conquista.
Agradeço ao Dr. André Bandiera, Dr. Evandro Sobroza, Dr. Claudio Cernea e Dr.
Lenine Brandão, médicos do HC-FMUSP, pela concessão das amostras para a realização
deste projeto, pela ajuda clínica e por terem desempenhado um papel importante para que os
excelentes resultados fossem alcançados. A bióloga Marina Pereira, pela grande ajuda na
confecção de lâminas histológicas e em todo o desenvolvimento do projeto.
Agradeço também a CAPES e a Fundação Valeparaibana de Ensino (FVE) pela bolsa
concedida durante todo o mestrado.
“As pessoas felizes lembram o passado com gratidão, alegram-se com o presente e encaram o
futuro sem medo”.
Epícuro (2014)
RESUMO
Os carcinomas de tireoide são os principais tipos de malignidades endócrinas com uma
incidência crescente nos últimos anos. Seu diagnóstico pode apresentar resultados
inconclusivos para algumas lesões, trazendo a necessidade da utilização de novas técnicas.
Diante disso, a espectroscopia Raman tem apresentado excelentes resultados na diferenciação
de carcinomas, por avaliar as alterações bioquímicas presentes nos tecidos bem como a
técnica de análise de expressão gênica na busca de marcadores de diagnóstico específicos.
Portanto, nosso objetivo foi buscar melhorias na discriminação entre tecido normal, lesões
benignas e malignas de tireoide pela espectroscopia Raman confocal e pela análise de
expressão gênica por Reação em Cadeia da Polimerase em tempo real (qRT-PCR). Para isso
foi utilizado um total de 35 amostras de tecido de tireoide, sendo 10 normais, 10 bócios, 10
carcinomas papilíferos (CPT) e 5 carcinomas foliculares (CFT), que foram analisadas pela
técnica de espectroscopia Raman confocal e os espectros obtidos processados pelos
softwaresLabspec5, Origin 8.6 e OPUS®. A análise estatística para a separação das amostras
foi realizada pelo programa Minitab®. Para a análise de expressão gênica foram utilizados 33
amostras sendo 4 normais, 14 bócios, 11 CPT e 4 CFT. Foi extraído o RNA das amostras
seguido pela síntese do cDNA e análise por qRT-PCR. A análise dos resultados foi feita pelo
método Delta-Delta Ct (ΔΔCt) e do método da curva-padrão e a estatística pelo software
GraphPad 3.0. Importantes diferenças de intensidade em alguns modos vibracionais foram
encontradas entre os tipos histológicos analisados em relação ao tecido normal pela
espectroscopia Raman. A análise multivariada possibilitou uma discriminação de 63% entre
todos os tipos histológicos, 77% para a comparação entre tecido normal e bócio, 88,9% entre
normal e CPT, 91,1% entre normal e CFT, 85,5% entre bócio e CPT, 84,8% entre bócio e
CFT e de 84,6% entre CPT e CFT. Pela análise de expressão gênica foi encontrado diferenças
significativas para genesLGALS3 nas comparações entre bócio versus CPT e bócio versus
CFT, SERPINA1 para o grupo bócio versus CPT e CPT versus CFT, TG na comparação entre
bócio versus CPT e TFF3 para o grupo bócio versus CFT e CPT versus CFT. Com base nos
resultados obtidos, a técnica de espectroscopia Raman confocal e a análise de expressão
gênica apresentaram importantes resultados na detecção de alterações bioquímicas e
moleculares das lesões de tireoide e na discriminação entre os tecidos, se mostrando
excelentes ferramentas no auxílio diagnóstico de lesões de tireoide bem como de outras
patologias.
Palavras-chave: Espectroscopia Raman. Análise de Expressão Gênica. Câncer de Tireoide;
Tireoide.
ABSTRACT
Thyroid carcinomas are the main types of endocrine malignancies with a growing incidence in
recent years. Its diagnosis may produce inconclusive results for some injuries bringing the
need for new techniques. Thus, Raman spectroscopy has shown excellent results in the
differentiation of carcinoma by assessing the biochemical alterations present in the tissuesas
well as analysis of gene expression in the search for specific markers for diagnosis. Therefore
our goal was to find improvements in the discrimination between normal tissue, benign and
malignant thyroid lesions by confocal Raman spectroscopy and analysis of gene expression
by qRT-PCR. In this work, a total of 35 samples from thyroid tissue being 10 normal tissues,
10 goiter tissues, 10 papillary carcinomas (PTC) and 5 follicular carcinoma (FTC) were
analyzed by confocal Raman spectroscopy and the spectra obtained were processed by the
Labspec5 software, Origin 8.6 and OPUS ®. The statistical analysis for the separation of
samples was performed by Minitab ®.For gene expression analysis 33 samples were used
being 4 normal, 14 goiters, 11 PTC and 4FTC. The RNA was extracted from the samples
followed by cDNA synthesis and analysis by qRT-PCR. The analysis of results was
performed by the Delta-Delta Ct (ΔΔCt) method and the standard curve method. Statistical
analysis was performed by GraphPad 3.0 software.Important differences in the intensity of
some vibrational modes were found between histologic types analyzed in relation to normal
tissue by Raman spectroscopy. The multivariate analysis allowed discrimination of 63%
among all the histological types, 77% for the comparison between normal tissue and goiter,
88.9 % between normal and PTC, 91.1% between normal and FTC, 85.5% between goiter and
PTC, 84.8% between goiter and FTC and 84.6 % between PTC and FTC. The gene
expression analysis found significant differences for genes: LGALS3in the comparisons
between goiter vs PTC and goiter vs FTC, SERPINA1 for goiter group vs PTC and PTC vs
FTC, TG in the comparison between goiter vs PTC and TFF3 for goiter group vs FTC and
PTC vs FTC.Based on these results,the confocal Raman spectroscopy and gene expression
analysis showed significant results in the detection of biochemical and molecular changes of
thyroid lesions and discrimination between tissues, showing excellent tools for the diagnosis
of thyroid lesions as well as other pathologies.
Keywords: Raman Spectroscopy. Gene Expression Analysis. Thyroid Cancer. Thyroid.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Anatomia da glândula tireoide ..................................................................................20
Figura 2: Esquema da produção de hormônios T3 e T4 pela glândula tireoide........................22
Figura 3: Esquema do controle da liberação dos hormônios tireideanos..................................23
Figura 4: Histologia normal da glândula tireoide.....................................................................24
Figura 5: Histologia do bócio....................................................................................................27
Figura 6: Histologia do tecido de tireoide com Doença de Graves..........................................28
Figura 7: Histologia de um adenoma folicular de tireoide.......................................................29
Figura 8: Tecido histológico da glândula tireoide com tireoidite de Hashimoto......................31
Figura 9: Histologia do tecido glandular com carcinoma papilífero de tireoide (CPT) A:
arquitetura do CPT; B: núcleos em vidro fosco; C: corpos psamomatosos; D: fendas
nucleares....................................................................................................................................34
Figura 10: Histologia do tecido glandular com CFT A: arquitetura do CFT; B: presença de
mitoses indicando proliferação celular; C: cromatina condensada e salpicada; D: invasão da
cápsula fibrosa indicando a malignidade..................................................................................35
Figura 11: Histologia do carcinoma anaplásico de tireoide......................................................36
Figura 12: Histologia do carcinoma medular de tireoide, com presença de células com
diferentes formatos e núcleo central.........................................................................................37
Figura 13: Liberação de um fóton pela molécula após sua excitação.......................................42
Figura 14: Representação do espalhamento Rayleigh, Raman Stokes e Raman anti-stokes....42
Figura 15: Modelo representativo dos modos vibracionais exercidos pelas moléculas após a
excitação com a luz laser para o metileno (CH2)......................................................................43
Figura 16: Comparação da média dos espectros bócio, CPT e CFT.........................................45
Figura
17:
Espectros
médios
para
o
tecido
normal,
bócio,
CPT
e
CFT...........................................................................................................................................63
Figura 18: Espectro médio para o grupo de amostras de tecido normal com os principais picos
marcados...................................................................................................................................64
Figura 19: Espectro médio para o grupo bócio com os principais picos marcados..................64
Figura 20: Espectro médio para o grupo CPT com os principais picos marcados....................65
Figura 21: Espectro médio para o grupo CFT com os principais picos marcados....................65
Figura 22: Comparação entre o grupo normal e bócio por meio da média de cada grupo.......67
Figura 23: Comparação da média do grupo normal e CPT.......................................................68
Figura 24: Comparação da média dos grupos normal e CFT...................................................68
Figura 25: Comparação da média dos grupos bócio e CPT......................................................70
Figura 26: Comparação da média do grupo bócio em relação ao CFT.....................................71
Figura 27: Comparação para os grupos CPT e CFT.................................................................72
Figura 28: Loading plot da PC1, obtida em todo o intervalo espectral....................................74
Figura 29: Scatterplots das comparações realizadas pela análise de PCA...............................75
Figura 30: Resultados obtidos pela análise de cluster (normalização vetorial)........................77
Figura 31: Loading plot da PC1, obtida em todo o intervalo espectral....................................83
Figura 32:Scatterplots das comparações realizadas pela análise de PCA................................84
Figura 33: Resultados obtidos pela análise de cluster (normalização pico 1450 cm-1)............86
Figura 34: Eletroforese em gel de agarose para amostras de RNA..........................................94
Figura 35: Curva padrão para os genes SERPINA1, TFF3, LGALS3, TG, PDGFB,
TPO,PPIA.................................................................................................................................95
Figura 36: Curva de dissociação para os genes SERPINA1, TFF3, LGALS3, TG, PDGFB,
TPO, PPIA...............................................................................................................................97
Figura 37: Curvas de amplificação para os genes SERPINA1, TFF3, LGALS3, TG, PDGFB,
TPO, PPIA...............................................................................................................................99
Figura 38: Resultados obtidos pelo teste de Mann Whitney não paramétrico para a
comparação entre o grupo bócio versus CPT .......................................................................104
Figura 39: Resultados obtidos pelo teste de Mann Whitney não paramétrico para a
comparação entre o grupo bócio versus CFT .......................................................................105
Figura 40: Resultados obtidos pelo teste de Mann Whitney não paramétrico para a
comparação entre o grupo CPT versus CFT .........................................................................106
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Principais hormônios tireoideanos, função e local de produção...............................21
Tabela 2: Classificação histológica do câncer da tireoide........................................................32
Tabela 3: Principais modos vibracionais encontrados em tecidos de tireoide .........................44
Tabela 4: Vias de sinalização envolvidas no processo de carcinogênese da tireoide ..............46
Tabela 5: Expressão gênica dos principais genes presentes na literatura (2003-2013)............49
Tabela 6: Amostras utilizadas no projeto e técnicas utilizadas.................................................53
Tabela 7: Genes avaliados e respectivas funções, amplicons e sequências de iniciadores ......59
Tabela 8: Principais picos e atribuições encontradas para os tecidos tireoideanos...................66
Tabela 9: Eingenvalue PCA da comparação entre tecidos: normal, bócio e tumorais............73
Tabela 10: Valores discriminatórios baseados no intervalo espectral de 400 a 1800 cm-1.......74
Tabela 11: Valores discriminatórios após a escolha de novas regiões espectrais.....................75
Tabela 12: Eingenvalue PCA da comparação entre tecidos: normal, bócio e tumorais..........82
Tabela 13: Valores discriminatórios baseados no intervalo espectral de 400 a 1800 cm-1.......83
Tabela 14: Valores discriminatórios após a escolha de novas regiões espectrais ....................84
Tabela 15:Valores de discriminação para as regiões encontradas pela normalização vetorial
sobre espectros normalizados pelo pico de 1450 cm-1 .............................................................91
Tabela 16: Valores de discriminação para as regiões encontradas pela normalização pelo pico
de 1450 cm-1 sobre espectros normalizados vetorialmente.......................................................92
Tabela 17: Valores relacionados a concentração e razões dos RNAs extraídos ......................93
Tabela 18: Valores obtidos pela curva padrão demonstrando a eficiencia dos primers diante
dos valores de slope e do coeficiente de linearidade (R2).........................................................95
Tabela 19: Valores de QR obtidos para todas as amostras e genes........................................102
Tabela 20: Percentual de aumento e diminuição de expressão para os genes .......................103
Tabela 21: Resultados referentes a análise estatística pelo método de Mann Whitney sobre os
valores de QR para os genes avaliados...................................................................................107
LISTA DE ABREVIATURAS
A:
Adenina
AFT:
Adenoma Folicular de Tireoide
BMN:
Bócio Multinodular
BNS:
Bócio Nodular Simples
C:
Citosina
CAT:
Carcinoma Anaplásico de Tireoide
CCD:
Charge-Coupled Device
cDNA:
DNA complementar
CEA:
Antígeno Carcinoembrionário
CFT:
Carcinoma Folicular de Tireoide
CMT:
Carcinoma Medular de Tireoide
CPT:
Carcinoma Papilífero de Tireoide
CPTVF:
Carcinoma Papilífero de Tireoide Variante Folicular
Ct:
Ciclo Threshold
CT:
Calcitonina
DNA:
Ácido Desoxirribonucleico
EGF:
Fator de Crescimento Epidermal
FT-Raman:
Raman por Transformada de Fourier
G:
Guanina
HCA:
Análise Hierárquica de Cluster
HE:
Hematoxilina-Eosina
IHC:
Imunohistoquímica
LGALS3:
Lectin, Galactoside-Binding, Soluble, 3
MIR:
Imagem por Ressonância Magnética
PAAF:
Punção Aspirativa por Agulha Fina
PCA:
Principal Componente de Análise
PCR:
Reação em Cadeia da Polimerase
PDGFB:
Platelet-Derived Growth Factor subunit B
PET:
Tomografia por Emissão de Pósitrons
PPIA:
Peptidylprolyl Isomerase A
QR:
Quantificação Relativa
qRT-PCR:
PCR quantitativa em Tempo Real
RNA:
Ácido Ribonucleico
SBP:
Sociedade Brasileira de Patologia
SERPINA1:
Serpin Peptidase Inhibitor, Clade A
T:
Timina
T3:
Triiodotironina
T4:
Tiroxina
TBE:
Tris-Borato-EDTA
TC:
Tomografia Computadorizada
TFF3:
Trefoil Factor 3 (intestinal)
TG:
Tireoglobulina
TGFβ:
Fator Transformador de Crescimento Beta
TPO:
Tireoperoxidase
TSH:
Hormônio Tireoestimulante
TSHR:
Receptor do Hormônio Tireoestimulante
U:
Uracila
US:
Ultrassom
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO... ............................................................................................. 16
2
OBJETIVOS ..................................................................................................... 19
2.1
OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 19
2.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................... 19
3
REVISÃO DE LITERATURA....................................................................... .20
3.1
GLÂNDULA TIREOIDE .................................................................... .............20
3.2
ALTERAÇÕES NA GLÂNDULA TIREOIDE ........................................................ 24
3.3
PATOLOGIAS BENIGNAS ............................................................................. 26
3.3.1 Bócio .................................................................................................................26
3.3.2 Doença de Graves ...........................................................................................27
3.3.3 Bócio Nodular Tóxico .....................................................................................28
3.3.4 Bócio Adenomatoso ........................................................................................29
3.3.5 Tireoidite .........................................................................................................30
3.4
PATOLOGIAS MALIGNAS ............................................................................ 31
3.4.1 Carcinoma Papilífero de Tireoide .................................................................33
3.4.2 Carcinoma Folicular de Tireoide...................................................................34
3.4.3 Carcinoma Anaplásico de Tireoide................................................................35
3.4.4 Carcinoma Medular de Tireoide....................................................................36
3.5
DIAGNÓSTICO ............................................................................................ 38
3.6
ESPECTROSCOPIA ÓPTICA ........................................................................... 40
3.6.1 Espectroscopia Raman ........................................................................... 41
3.7
MUTAÇÕES GENÉTICAS E LESÕES DE TIREOIDE .........................................46
3.8
ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO GÊNICA E NEOPLASIAS DE TIREOIDE....................48
3.9
TRATAMENTO ....................................................................................................50
4
METODOLOGIA...........................................................................................53
4.1
AQUISIÇÃO DAS AMOSTRAS ..............................................................................53
4.2
ESPECTROSCOPIA RAMAN .................................................................................55
4.2.1 Preparação das Amostras ..............................................................................55
4.2.2 Obtenção e Análise dos Espectros..................................................................55
4.2.3 Tratamento Espectral ....................................................................................56
4.2.4 Análise Estatística ...........................................................................................56
4.3
ANÁLISE HISTOLÓGICA .....................................................................................57
4.3.1 Preparação das Lâminas ................................................................................57
4.3.2 Análises das Lâminas .....................................................................................57
4.4
ANÁLISE DE ESPRESSÃO GÊNICA........................................................................57
4.4.1 Amostras ..........................................................................................................58
4.4.2 Extração e Quantificação do RNA ................................................................58
4.4.3 Síntese do cDNA .............................................................................................58
4.4.4 Análise Quantitativa pela RT-PCR em Tempo Real ...................................59
4.4.5 Análise dos Resultados ...................................................................................60
4.4.6 Análise Estatística ...........................................................................................61
4.5
DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO ....................................................................61
5
RESULTADOS................................................................................................62
5.1
ESPECTROSCOPIA RAMAN..................................................................................62
5.1.1
Normalização Vetorial....................................................................................73
5.1.2
Normalização pelo Pico de 1450 cm-1............................................................82
5.2
ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA.......................................................................93
6
DISCUSSÃO............... ..................................................................................109
7
CONCLUSÃO ........ ......................................................................................125
REFERÊNCIAS.......................................................................................... . 126
REFERÊNCIAS CONSULTADAS............................................................141
16
1
INTRODUÇÃO
O câncer de tireoide é a malignidade endócrina mais comum que acomete
principalmente mulheres. No Brasil, esta malignidade representa 2 a 5% do total de tumores
malignos que acometem mulheres e 2% nos homens, com incidência anual duplicada durante
a última década. Em 2014, é esperado para cada 100.000 habitantes o surgimento de 1.150
novos casos de câncer em homens, representando um percentual de 0,4%, e de 8.050 novos
casosnas mulheres, representando 2,9% (INSTITUTO NACIONAL DO CANCER, 2012).
A maior parte do aumento de incidência no câncer de tireoide tem sido atribuída ao
diagnóstico do microcarcinoma papilífero (<2cm) com nenhuma alteração significante nas
variantes menos comuns (folicular, medular e anaplásico) (DAVIES; WELCH, 2006).
Entretanto, Morris e Myssiorek (2010) apontam duas hipóteses para esse crescimento: um
verdadeiro aumento da incidência (CRAMER et al., 2010), mas também o aprimoramento na
triagem e no desenvolvimento das técnicas de diagnóstico. Sipos e Mazzaferri (2010) afirmam
que a razão para esta ascensão parece ser multifatorial, com o aumento das taxas de detecção
representando um termo da equação. Corroborando com estes autores, Gomes et al. (2011)
afirma que não pode se determinar a real causa do aumento no índice de carcinomas de
tireoide, pois este pode ter inúmeras variáveis, tais como um verdadeiro crescimento no
número de casos, resultados falso-positivos obtidos pelas técnicas de diagnóstico ou uma
maior eficiência no rastreio de nódulos pequenos. Portanto, o aumento da incidência deste
carcinoma, independente da atribuição a ser considerada, é um problema atual.
O diagnóstico das lesões de tireoide é realizado principalmente por meio da técnica de
punção aspirativa por agulha fina (PAAF), que é uma ferramenta útil e o procedimento mais
aceito por possuir um custo acessível, ser rápida, sem grandes complicações e considerada
atualmente o melhor teste diagnóstico para diferenciar entre neoplasias de tireoide benignas e
malignas. De acordo com Rodrigues, Ponte e Adan (2012), a PAAF representa uma das
primeiras técnicas escolhidas para o diagnóstico devido a sua simplicidade e a seu baixo
custo, favorecendo a escolha correta dos pacientes que realmente necessitam do procedimento
cirúrgico. Contudo, a eficácia da PAAF depende da experiência do profissional para
selecionar e aspirar nódulos palpáveis a fim de se obter esfregaços com quantidades celulares
importantes; da preparação correta dos esfregaços, envolvendo a fixação e coloração; e
finalmente, do conhecimento sobre a histopatologia de lesões tireoideanas (PECCIN et al.,
2003).
17
Além da técnica PAAF, o exame de ultrassom (US) atualmente também é utilizado no
diagnóstico dos nódulos tireoidianos benignos e malignos. O ultrassom é de grande
importância devido a sua maior sensibilidade na verificação de nódulos que não são palpáveis
no momento do diagnóstico clínico. Tal fato faz com que atualmente se utilizem as duas
técnicas associadas para o diagnóstico do câncer de tireoide, com o objetivo de melhorar a
confiabilidade do diagnóstico (LIN, 2010).
A acurácia na detecção das lesões de tireoide pela PAAF é de aproximadamente 65 a
95% para os cânceres papilífero, medular e anaplásico, contudo esta metodologia não
distingue entre adenoma e carcinoma folicular, ou entre adenoma de célula de Hurthle e
carcinoma
(RAVETTO;
COLOMBO;
DOTTORINO,
2000;
RENSHAW,
2001;
BLANSFIELD; SACK; KUKORA, 2002; CASTRO; GHARIB, 2003), porém dependendo
dos parâmetros clínicos individuais de cada paciente, a sensibilidade da PAAF pode ser muito
baixa, aproximadamente 66% (TEE et al., 2007).O grande problema envolvido que ainda não
define muito bem a diferença entre os casos de adenomas dos carcinomas foliculares
(minimamente invasivos e variantes foliculares) é que a técnica PAAF não permite a
observação da invasão da cápsula, que é o principal critério para a confirmação da
malignidade. Há ainda discordâncias entre diversos patologistas no que realmente representa a
invasão da cápsula, haja vista que outros atributos convencionais de malignidade como
hipercromatismo, atividade mitótica, alargamento nuclear entre outros estão ausentes nestes
tipos de lesões (SUSTER, 2006; BALOCH; LIVOLSI, 2002). Quando o resultado usual de
padrão folicular não faz diagnóstico diferencial com bócios, adenomas e tireoidites crônicas,
estes são considerados resultados suspeitos para malignidade e o tratamento frequentemente é
cirúrgico (FERRAZ et al., 2001). Em adição, as variantes foliculares do câncer de tireoide
papilífero são frequentemente difíceis de diagnosticar citologicamente (BALOCH et al., 2002;
CASTRO; GHARIB, 2003; SUSTER, 2006).
Existem quatro categorias gerais de achados citológicos pela PAAF: benigno (70%),
maligno (10%), indeterminado ou suspeito (10-20%) e insuficientes (<10%). Os resultados
indeterminados e insuficientes são as principais limitações da PAAF. Os resultados
indeterminados ocorrem devido à sobreposição das características citológicas que estão
presentes tanto em nódulos de tireoide benignos quanto nos malignos, sendo que os resultados
suspeitos de biópsia por PAAF, comumente ocorrem devido à presença de atipias nucleares
focais inconclusivas ou de amostras insuficientes do epitélio folicular. Esse grupo de lesões
que apresentam estas dificuldades de interpretação é o que dificulta a distinção das
características benignas ou malignas das lesões, podendo determinar um diagnóstico
18
impreciso, permitindo assim, que talvez vários pacientes sejam levados à cirurgia sem a
urgência e indicação apropriada.
Diante disso, o surgimento de novas técnicas que proporcionem um diagnóstico mais
rápido e eficaz associadas à histologia, conhecida como técnica padrão ouro é extremamente
importante. Considerando estes aspectos, este trabalho teve como objetivo, a realização do
estudo de diferenças bioquímicas entre os diferentes tecido de tireoide pela técnica de
espectroscopia Raman confocal, associado à busca de marcadores moleculares de
diagnósticos dessas lesões através da técnica de análise molecular e ambos resultados,
confrontados com os resultados da análise histológica. Estas análises poderão assim, serem
realizadas na rotina clínica com o intuito de aumentar a precisão do diagnóstico das lesões
suspeitas ou indeterminadas, e futuramente tornar o tratamento dos pacientes acometidos por
estes tumores mais efetivo.
As seções 3.1, 3.2, 3.3 e 3.4 descrevem, respectivamente,a glândula tireoide, os efeitos
dos hormônios e outros fatores externos na sua função e as principais patologias que
acometem a glândula. Os métodos de diagnóstico das principais lesões de tireoide estão
descritos na seção 3.5. Os conceitos da espectroscopia Raman e da análise de expressão
gênica são relatados nas seções 3.6, 3.7 e 3.8e as formas de tratamento das lesões de tireoide
descritas na seção 3.9. Seguido a estes tópicos, faz-se menção da metodologia, resultados,
discussão e conclusão.
19
2
OBJETIVOS
A seguir, os objetivos que guiaram este trabalho.
2.1 OBJETIVO GERAL
Caracterizar bioquimicamente e molecularmente tecidos normais e diferentes lesões
da glândula tireoide por meio das análises de espectroscopia Raman e de expressão gênica,
respectivamente, fomentadas pela análise histológica.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Estudar as diferenças bioquímicas entre os espectros característicos dos tecidos não
tumorais e tumorais pelas amostras obtidas e submetidas à espectroscopia Raman por meio da
análise dos modos vibracionais e análise estatística multivariada;
Correlacionar os espectros Raman com as diferentes estruturas morfológicas das
glândulas de tireoide;
Analisar os genes (TG, TPO, PDGFB, SERPINA1, TERT e LGALS3), candidatosa
marcadores moleculares diagnósticos,por meio da técnica de PCR quantitativa em tempo real;
20
3 REVISÃO DE LITERATURA
Abaixo serão exibidos os principais conceitos acerca desta pesquisa.
3.1
GLÂNDULA TIREOIDE
A glândula tireoide é uma das maiores glândulas do nosso corpo exercendo
importantes papéis no processo de desenvolvimento (SARANAC et al., 2011). Esta se situa
na porção baixa do pescoço, sendo constituída por dois lobos (direito e esquerdo) unidos por
uma banda de tecido glandular, o istmo (Figura 1). Possui em média, 15 a 20 gramas, sendo
circundada por uma rede de vasos sanguíneos, os quais levam os hormônios produzidos para
o corpo. Ela é responsável principalmente pela produção dos hormônios T3 (triiodotironina) e
T4 (tiroxina), importantes para o metabolismo do organismo, além do hormônio calcitonina,
envolvido na homeostase do cálcio. A ação desta glândula na produção destes hormônios é
regulada pela ação do TSH (hormônio tireoestimulante ou tireotrofina) que é controlado pelo
eixo hipotálamo-hipofisário (CAPUZZO, 2012) (Tabela 1).
Figura 1: Anatomia da glândula tireoide.
Fonte: (NETTER, 2001).
21
Tabela 1: Principais hormônios tireoideanos, função e local de produção.
HORMONIO
LOCAL DE PRODUÇÃO
FUNÇÃO
TSH
Hipófise
Modulação da função tireoideana
T3
T4
CALCITONINA
Células foliculares
Células parafoliculares
Modulador de diversos processos metabólicos
celulares
Diminuição dos níveis séricos de cálcio e fosfato
Fonte: O autor.
O ciclo de produção dos hormônios tireoideanos se inicia a partir do hormônio
liberador de tireotrofina (TRH), que é formado no hipotálamo medial e que segue pelo
sistema porta hipotálamo-hipofisário para a hipófise anterior ou adenoipófise, que se liga a
células tireotróficas, causando a produção e liberação do TSH. O TSH é o principal hormônio
modulador da função tireoideana, pois exerce um efeito trófico e diferenciador nas células
foliculares, o que garante a síntese e liberação de T3 e T4 além do estímulo das etapas da
biossíntese hormonal, tais como a produção da tireoglobulina (TG), transporte do iodeto,
produção da enzima tireoperoxidase (TPO), síntese de H2O2 (peróxido de hidrogênio) e
liberação hormonal (BUESCO; VIOLANTE, 2003) (Figura 2).
22
Figura 2: Esquema da produção dos hormônios T3 e T4 pela glândula tireoide.
Fonte: O autor.
Enquanto a produção dos hormônios tireoideanos é controlada pela liberação do TSH,
o controle da liberação destes hormônios é realizado pelo feedback hipotálamo-hipófisetireoide, que causa a conversão do T4 em T3, bem como pela ação da dopamina
(neurotransmissor) e pela somatostatina (hormônio) a nível hipofisário, inibindo assim a
síntese do TSH (BUESCO; VIOLANTE, 2003) (Figura 3).
23
Figura 3: Esquema do controle da liberação dos hormônios tireoideanos.
Fonte: O autor.
Histologicamente, a glândula tireoide apresenta estruturas foliculares que em seu
interior produzem os hormônios T3 e T4 além do tecido interfolicular, produtor do hormônio
calcitonina. Cada folículo consiste em uma camada de células foliculares cúbicas que irão
envolver o lúmen central, que contém o colóide, substância onde estão presentes os
hormônios produzidos pela glândula e as células parafoliculares, que se localizam entre as
células foliculares ou em agregados entre os folículos, sendo somente responsáveis pela
produção da calcitonina. Os folículos podem variar de tamanho e forma de acordo com a
necessidade de produção hormonal, liderada pelo hormônio TSH (Figura 4).
24
Figura 4: Histologia normal da glândula tireoide.
Fonte: (FRANKHAUSER, 2010).
Muitas patologias podem acometer a glândula tireoide, seja alterando o seu formato ou
sua função, onde as principais consistem na presença de bócios, que podem se apresentar em
nódulos solitários ou únicos ou em bócios multinodulares (BMN) (FRILLING; LIU;
WEBER, 2004; BAIER et al., 2009). Segundo Hegedüs, Bonnema e Bennedbaek (2003), o
bócio nodular é uma alteração funcional e/ou estrutural no tecido de tireoide normal, que na
maioria das vezes é visualizado pelo aumento da glândula tireoide, sendo colocado no grupo
de doenças complexas juntamente com as tireoidites, doenças autoimunes da tireoide ou
malignidades da tireoide.
3.2 ALTERAÇÕES NA GLÂNDULA TIREOIDE
Diversos tipos de patologias podem acometer a glândula tireoide a partir de uma
desordem hormonal estimulada por fatores externos, endógenos e/ou genéticos. As principais
patologias benignas visualizadas na glândula tireoide são a presença de nódulos, o bócio, as
tireoidites, representadas principalmente pela tireoidite de Hashimoto, a doença de Graves e
os adenomas. Porém, malignidades também podem acometer a glândula tireoide devido a uma
perda de controle das funções da glândula, sendo caracterizadas pelo carcinoma papilífero de
tireoide (CPT), carcinoma folicular de tireoide (CFT), carcinoma medular de tireoide (CMT),
carcinoma anaplásico de tireoide (CAT), além de algumas variantes como o carcinoma
papilífero de tireoide variante folicular (CPTVF) e o carcinoma de células de Hurthle.
25
O desenvolvimento de um nódulo simples, caracterizado pelo crescimento de tecido
tireoideano, é caracterizado e classificado no grupo das doenças referidas como doenças
complexas, pois sua origem é multifatorial, onde aspectos ambientais, genéticos e endógenos
influenciam no surgimento e desenvolvimento dos mesmos (HEGEDÜS; BONNEMA;
BENNEDBAEK, 2003). Segundo Brix et al. (2000), é sabido que a principal causa do
surgimento de nódulos simples é a deficiência de iodo na população (KNOBEL;
MEDEIROS-NETO, 2004), estando presente em 5% da população e em 10% em áreas
endêmicas. A ausência de iodo, caracterizado pela deficiência na absorção, ou a presença do
mesmo é determinante em diversos aspectos da tireoide.
Os níveis de iodo no organismo determinam grandes diferenças nos processos
fisiológicos tireoideanos quando comparados à deficiência do mesmo, pois, permitem um
volume médio normal da glândula e uma diminuição na prevalência do bócio (KNUDSEN et
al., 2000). No entanto, deve-se ressaltar que níveis normais de iodo no organismo não são
determinantes para que não ocorra a presença de nódulos, pois segundo Laurberg et al. (2001)
tanto a deficiência quanto o aumento de níveis de iodo são responsáveis pelo surgimento de
doenças na tireoide.
A determinação da origem de um nódulo, seja ela, endêmica ou esporádica, irá
depender de interações genéticas, ambientais, além de fatores endógenos. Além da deficiência
de iodo, que é considerado o principal fator para o desenvolvimento de nódulos em regiões
endêmicas, os principais fatores externos relacionados são: processos infecciosos
(FARWELL; BRAVERMAN, 1996); tabagismo (UTIGER, 1998; BRIX et al., 2000);
presença de bocígenos naturais, responsáveis por promover uma deficiência na captação do
iodo pelo organismo (PAYNTER et al., 1988; GAITAN et al., 1994; KNOBEL; MEDEIROSNETO, 2004); exposição à radiação (TREROTOLI et al., 2005; IMAIZUMI et al., 2006) e o
estilo de vida (WATT et al., 2006).
Além disso, processos bioquímicos como o estresse oxidativo (PONCIN et al., 2010)
e fatores fisiológicos, tais como a idade e o sexo de cada paciente exercem grandes
influências na etiologia das doenças tireoideanas. As mulheres são as mais afetadas pelo
surgimento de nódulos tireoideanos (MAIA, 2007), contudo há também grande incidência nos
idosos (TAN; GHARIB, 1997), em crianças com deficiência de iodo (HEGEDÜS;
BONNEMA; BENNEDBAEK, 2003) ou expostas à radiação (NIEDZIELA, 2006). Segundo
Dean e Gharib (2008), em um estudo que avaliou a epidemiologia dos nódulos de tireoide, a
incidência dos nódulos aumenta de acordo com a idade, sendo maior em mulheres e em
pessoas com deficiência de iodo. Considerando a alta incidência em mulheres, uma maior
26
atenção deve ser direcionada as gestantes, pois a deficiência no nível de iodo e as diversas
mudanças, principalmente dos níveis dos hormônios tireoideanos que ocorrem durante a
gestação (KUNG et al., 2002, MACIEL; MAGALHÃES, 2008) fazem com que a gestante
possa desenvolver doenças na tireoide, além da disfunção da glândula, poder determinar
diversas alterações no feto, tais como um déficit neurológico irreversível na criança (POP et
al., 1999; SMIT et al., 2000).
Outros tipos de nódulos também podem se desenvolver, porém nestes casos foi
constatada uma relação com alterações nos hormônios T3, T4 e TSH, como ocorre com as
doenças autoimunes tireoidite de Hashimotoe doença de Graves, e com os cistos, nódulos que
possuem líquido em seu interior (PINHEIRO, 2010). Nestes casos, a ação do TSH em excesso
leva ao aumento da proliferação celular, mediada pelo fator de crescimento epidermal (EGF),
a diminuição da produção do fator de transformação do crescimentoβ1)
(TGF
além do
aumento da angiogênese (KNOBEL; MEDEIROS-NETO, 2007). As tireoidites têm papel
importante nas doenças tireoideanas, pois causam importantes mudanças na tireoide, como
visto na tireoidite de Hashimoto, que pode gerar uma predisposição ao surgimento de
determinados tipos de patologias na glândula tireoide (GRAF, 2004) bem como a simples
presença de nódulos (INTENZO et al., 2001), que associadas a fatores genéticos e ambientais
podem influenciar o surgimento de carcinomas (INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER,
2011).
3.3 PATOLOGIAS BENIGNAS
A seguir as patologias benignas.
3.3.1 Bócio
O bócio é caracterizado pelo aumento do volume da glândula da tireoide e pode ser
causado pela existência de nódulos simples ou múltiplos, pela presença de um aumento difuso
da glândula ou por doenças inflamatórias, também conhecidas como tireoidites (CAPUZZO,
2012). Estas alterações na tireoide são vistas como comuns a população e normalmente são
lesões benignas (DEAN; GHARIB, 2008; BAHN; CASTRO, 2011). Histologicamente, o
bócio é caracterizado por folículos de tamanhos irregulares (macro e microfolículos), os quais
podem conter presença abundante de colóide ou não. O aspecto das células foliculares podem
27
ser colunares, achatadas ou cúbicas, o que indica uma variação funcional da glândula (Figura
5).
Normalmente a presença do bócio nodular é assintomática (BOMELI; LEBEAU;
FERRIS, 2010), porém os sintomas podem surgir de acordo com algumas características dos
nódulos, como localização, tamanho e quantidade, pois desta forma pode haver a compressão
de estruturas como o esôfago, traqueia ou mediastino, o que pode resultar em casos de
disfagia, sensação de sufocamento, obstrução de vias aéreas, dispneia entre outros
(FRILLING; LIU; WEBER, 2004).
O principal fator de risco para o desenvolvimento do bócio é a deficiência de iodo, o
que faz com que as áreas endêmicas, onde não há adição de iodo na alimentação, apresentem
uma maior incidência de casos de bócio quando comparadas a áreas não endêmicas. Tal fato
foi controlado nas regiões que passaram a acrescentar o iodo ao sal de cozinha na tentativa de
suprir a carência de iodo na alimentação de algumas pessoas. Além desse, outros fatores,
como o cigarro, bocígenos naturais e estresse, também estão associados com o
desenvolvimento do bócio. O tamanho e a quantidade dos nódulos presentes na glândula estão
diretamente relacionados à sua função, pois a falta de iodo leva a uma alteração na produção
do TSH que consequentemente prejudica a função da glândula possibilitando o surgimento
deste tipo de lesão.
Figura 5: Histologia do bócio.
Fonte: (UNIVERSIDADE DE CAMPINAS, 2013).
3.3.2 Doença de Graves
28
A doença de Graves, também denominada como bócio difuso tóxico, é classificada
como uma doença autoimune onde a infiltração de linfócitos locais leva a uma ativação do
receptor de hormônio tireotrófico (TSHR) o que reativa as células B, desenvolvendo o quadro
de hipertireoidismo (TOMER, 2010). O diagnóstico clínico desta patologia é determinado
pela diminuição do hormônio TSH associado a um valor aumentado do hormônio T4 livre,
onde a associação dos níveis hormonais em pacientes com bócio difuso juntamente com um
quadro clínico de oftalmopatia (globos oculares projetados para fora) e dermopatia já é
suficiente para finalizar o diagnóstico (BUESCU; VIOLANTE, 2003).
Histologicamente, a doença de Graves apresenta estruturas foliculares com diâmetros
menores com pouco ou nenhum colóide. Estas estruturas são compostas por células
volumosas e com citoplasma abundante. Os núcleos variam de forma e tamanho, sendo
predominante maiores, com cromatina frouxa e nucléolo evidente. Além disso, ocorre a
presença de um infiltrado linfocitário local (UNIVERSIDADE DE CAMPINAS, 2013)
(Figura 6).
Figura 6: Histologia do tecido de tireoide com Doença de Graves.
Fonte: (UNICAMP, 2013).
3.3.3 Bócio Nodular Tóxico
No bócio nodular tóxico, também conhecido como doença de Plummer, o paciente
pode apresentar um ou mais nódulos que produzem e secretam quantidades excessivas de
hormônios tireoidianos e que não são controlados pelo hormônio TSH. Portanto, os sintomas
29
serão os mesmos do hipertireoidismo, porém sem a presença dos sinais clínicos da
oftalmopatia (VAISMAN; REIS, 2003).
3.3.4 Bócio Adenomatoso
O bócio adenomatoso, também chamado de nódulo adenomatoso, displasia nodular ou
adenoma folicular de tireoide (AFT) é caracterizado pela presença de adenomas encapsulados
completos e de padrão micro ou macrofolicular. Outra característica importante do bócio
adenomatoso é que o mesmo se apresenta de forma difusa, afetando todo o órgão, possuindo
uma característica multinodular. Além disso, esta patologia é classificada como uma doença
da tireoide altamente endêmica que, dependendo de seu tamanho e forma,pode causar
disfonia, disfagia e algumas vezes dispneia pela possibilidade de compressão de estruturas
cervicais próximas (VAISMAN; REIS, 2003).
Na histologia do AFT, é verificada a presença de estruturas foliculares bem pequenas e
geralmente sem colóide, porém, sem atipias celulares. Como esta lesão é classificada como
um nódulo, o mesmo é envolvido por uma cápsula fibrosa que não é invadida pelo tecido e
nem pelos vasos, porém, podem ocorrer hemorragias, edemas, fibroses e calcificações
(HEDINGER, 1988) (Figura 7).
Figura 7: Histologia de um adenoma folicular de tireoide.
Fonte: (UNIVERSIDADE DE CAMPINAS, 2013).
30
3.3.5 Tireoidite
A tireoidite é classificada como uma inflamação da glândula tireoide que apresenta um
hipertireoidismo temporário com uma frequente transição para um estado de hipotireoidismo
temporário ou em alguns casos para nenhuma mudança na função glandular. Os três tipos
principais de tireoidite são a tireoidite de Hashimoto, a tireoidite granulomatosa subaguda e a
linfocítica silenciosa.
A tireoidite de Hashimoto, também conhecida como tireoidite autoimune, é a mais
incidente entre a população, com uma frequência média de 10 a 20 mulheres para cada
homem no Brasil (COMANDAROBA et al., 2009),sendo causada pela produção elevada de
anticorpos anti-TPO, os quais têm a função de atacar as células da glândula tireoide causando
a apoptose celular (EGUCHI, 2001). Este tipo de tireoidite é a causa mais comum de
hipotireoidismo e normalmente é caracterizada pela atrofia glandular, porém pode se
apresentar com um volume aumentado da glândula e presença de nódulos (TOMER, 2010). A
avaliação destes nódulos é importante, pois estes podem ser infiltrados linfocitários
provenientes da tireoidite, representando pseudonódulos (BAHN; CASTRO, 2011).
Clinicamente, nesta patologia ocorre a elevação do TSH e uma diminuição dos
hormôniostireoideanos T3 e T4, possuindo grande relação com casos de CPT (REPPLINGER
et al., 2007).
Histologicamente, a tireoidite de Hashimoto apresenta folículos atróficos e
praticamente ausentes de colóide. As suas características histológicas são bastante
semelhantes com as características da Doença de Graves, contudo a presença aumentada de
infiltrado inflamatório e dos folículos atróficos, que indicam uma diminuição ou paralisação
da função da glândula (hipotireoidismo), a diferem da Doença de Graves (hipertireoidismo)
(Figura 8).
31
Figura 8: Tecido histológico da glândula tireoide com tireoidite de Hashimoto.
Fonte: (UNIVERSIDADE DE CAMPINAS, 2013).
A tireoidite granulomatosa subaguda, também chamada de tireoidite de células
gigantes ou de De Quervain, é provavelmente causada por infecção viral, causando dor na
glândula, febre baixa e hipertireoidismo seguido por hipotireoidismo temporário.
A tireoidite linfocítica silenciosa ou tireoidite indolor é considerada como uma
variante da tireoidite de Hashimoto (DESAILLOUD; HOBER, 2009). Esta inflamação
acomete principalmente mulheres após o parto, causando um aumento da glândula, porém
sem dor. Inicialmente, a paciente apresenta um quadro de hipertireoidismo seguido por
hipotireoidismo até a normalização da função glandular, não necessitando de tratamento.
3.4 PATOLOGIAS MALIGNAS
Os cânceres de tireoide são subdivididos em tumores específicos da glândula tireoide e
tumores que também são encontrados em outros órgãos, como os linfomas e sarcomas,que
possuem características específicas quando localizados na tireoide (Tabela 2). Os carcinomas
tireoideanos que se originam a partir das células foliculares são classificados em diferenciados
(carcinoma papilífero da tireoide - CPT, e carcinoma folicular da tireoide - CFT), pouco
diferenciados (carcinoma insular da tireoide - CIT) e não diferenciados (carcinoma anaplásico
de tireoide - CAT). Os carcinomas derivados das células parafoliculares são classificados
como carcinoma medular de tireoide (CMT). Algumas variantes também são encontradas,
como o carcinoma papilífero de tireoide variante folicular (CPTVF) e carcinoma de células de
Hurthle, sendo a presença de vascularidade e a invasão da cápsula os principais critérios
32
utilizados no diagnóstico dessas patologias (NATIONAL COMPREHENSIVE CANCER
NETWORK, 2013).
Tabela 2: Classificação histológica do câncer de tireoide.
NÓDULOS TIREOIDIANOS
Benignos
Diferenciados
Tumores derivados de células
foliculares
Adenoma folicular
Malignos
Carcinoma papilífero
Carcinoma folicular
Pouco diferenciados
Carcinoma insular
Indiferenciados
Carcinoma anaplásico
Tumores derivados das células parafoliculares (C)
Carcinoma medular
Linfomas
Outros tumores
Sarcomas
Fonte: (FREIRE, 2008).
Embora o carcinoma de tireoide represente somente 1% de todas as neoplasias
epiteliais malignas, ele representa a malignidade endócrina mais comum (GOMES, 2011). O
câncer de tireoide de origem folicular acomete aproximadamente 95% dos casos
diagnosticados, destes, os carcinomas papilíferos são os mais incidentes, seguidos pelos
carcinomas foliculares (COELI et al., 2005; INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER, 2011).
Ainda que a incidência destes tumores seja pequena quando comparada a outros tipos
de câncer, ela tem aumentado continuamente. Além disso, outro fato que deve ser levado em
consideração em relação ao aumento da sua incidência é a apresentação clínica dos
carcinomas de tireoide diferenciados, que são normalmente assintomáticos por longos
períodos,podendo se apresentar como simples nódulos solitários (LAYFIELD et al., 2009).
Apesar dos carcinomas bem diferenciados possuírem uma alta probabilidade de se
metastatizarem, os pacientes acometidos por estes tumores possuem uma excelente taxa de
sobrevida (RIESCO-EIZARRIGUE; SANTISTEBAN, 2007). Contudo, pelo fato da taxa de
recorrência para estes carcinomas ser alta, há ainda controvérsias quanto ao seguimento dos
pacientes (AHMADIEH; AZAR, 2012).
Os carcinomas pouco diferenciados ou indiferenciados representam os tumores que
perderam parte ou a totalidade das características celulares iniciais presentes em um tecido
normal no seu processo de diferenciação. O carcinoma medular de tireoide (CMT), que se
desenvolve nas células parafoliculares ou células C não é classificado como os outros
carcinomas de tireoide devido a sua origem. Embora estes tumores possuam uma baixa
33
incidência na população, apresentam diversos sintomas relacionados às estruturas adjacentes a
glândula tireoide, pior prognóstico, com baixa taxa de sobrevida e grande possibilidade de
metástases e de óbito (HUNT, 2002).
A etiologia do câncer de tireoide ainda não é totalmente conhecida, contudo sabe-se
que diversos fatores podem influenciar no surgimento destes tumores, tais como, a dieta,
devido à deficiência na ingestão de iodo na alimentação; a idade, o sexo, com maior
prevalência nas mulheres, exposição à radiação ionizante e predisposições e/ou mutações
genéticas (COELI et al., 2005; IMAIZUMI et al., 2006) e a radiação ionizante, que pode ser
considerada o fator ambiental mais conhecido no desenvolvimento destes carcinomas
(NATIONAL COMPREHENSIVE CANCER NETWORK, 2013), especialmente os
carcinomas papilíferos, onde crianças são frequentemente atingidas pela vulnerabilidade da
glândula à ação carcinogênica da radiação ionizante (SCHNEIDER et al., 1985; 1986; 1993;
RON et al., 1995).
3.4.1
Carcinoma Papilífero de Tireoide
O carcinoma papilífero da tireoide (CPT) é a malignidade mais incidente,
representando um total de 80 a 90% de todos os cânceres da tireoide (FAGIN; MITSIADES,
2008; HUGHES; DOHERTY, 2011; HTWE, 2012). A incidência deste tumor tem aumentado
significativamente por motivos ainda não muito bem esclarecidos, mas Davies e Welch
(2006) afirmaram que provavelmente isto seja devido a realização do diagnóstico precoce,
além da consequente maior facilidade na detecção dos microcarcinomas papilares de tireoide
(MCPT), tumores com diâmetros menor ou igual a 1 cm, geralmente detectados sem nenhum
tipo de sinal clínico (SINNOTT; RON; SCHNEIDER, 2010; MAZZAFERRI, 2012).
A principal característica clínica do CPT é o crescimento lento e em sua maioria
assintomático, o que favorece a progressão da doença, e as frequentes metástases em
linfonodos regionais. Porém, este tumor apresenta um bom prognóstico, com baixo índice de
metástases distantes, cujas taxas de sobrevida global são excelentes, em torno de 95%
(COELI et al., 2005; LIN; HSUEH; HUANG, 2011). Contudo, a presença de diferentes
padrões histológicos e variantes de CPT podem exercer influências no prognóstico do
paciente (ITO et al., 2008).
O CPT produz modificações histológicas bem características que são úteis na
determinação do diagnóstico, as quais se podem citar: coloração nuclear pálida, mudanças
34
nucleares com sobreposição dos mesmos, corpos psamomatosos, alongamentos e
pseudoinclusões (HEDINGER, 1998; HUNT, 2002) (Figura 9).
Figura 9: Histologia do tecido glandular com carcinoma papilífero da tireoide (CPT). A:
arquitetura do CPT; B: núcleos em vidro fosco; C: corpos psamomatosos; D: fendas
nucleares.
A
B
C
D
Fonte: (UNIVERSIDADE DE CAMPINAS, 2013).
3.4.2
Carcinoma Folicular de Tireoide
O carcinoma folicular da tireoide (CFT) é o segundo tipo mais incidente de todos os
cânceres de tireoide, o qual apresenta incidência relativamente rara, atingindo menos de 10%
de todas as neoplasias malignas da tireoide (HUNT, 2002; HORN-ROSS et al., 2011). O CFT
pode ser classificado em minimamente invasivo, caracterizado por invasão dentro da cápsula
e amplamente invasivo, quando ocorre um processo de invasão além da cápsula. Estes
carcinomas apresentam um pior prognóstico quando comparados ao CPT, com taxa de
sobrevida em torno de 80% após 10 anos, pois os pacientes têm maior chance de
desenvolverem metástases distantes para órgãos como pulmão, cérebro e ossos.
(AHMADIEH; AZAR, 2012).
35
Figura 10: Histologia do tecido glandular com CFT. A: arquitetura do CFT; B: presença de
mitoses indicando proliferação celular; C: cromatina condensada e salpicada; D: invasão da
cápsula fibrosa indicando a malignidade.
A
B
C
D
Fonte: (UNIVERSIDADE DE CAMPINAS, 2013).
A grande diferença do CFT quando comparado com o CPT é que não há mais a
presença das características nucleares, o que faz com que haja um maior número de
diagnósticos de CPT variante folicular e uma queda nos casos de CFT (SOBRINHO-SIMÕES
et al., 2011). Contudo, pode-se notar nos núcleos desses tecidos uma cromatina mais
condensada e salpicada. A morfologia desses carcinomas apresenta grande variação, o que faz
com que suas atipias estruturais e citológicas, tais como o índice de atividade mitótica não
sejam indicadores de malignidade eficientes (NATIONAL COMPREHENSIVE CANCER
NETWORK, 2013). Assim, a característica mais importante para se determinar o diagnóstico
desse tumor é o processo infiltrativo da cápsula, o que também permite que ocorra a
diferenciação entre adenoma folicular (AFT) e CFT (Figura 10).
3.4.3
Carcinoma Anaplásico de Tireoide
Determinado como carcinoma indiferenciado de tireoide pela ausência de
característica histológicas típicas do tecido de origem, o carcinoma anaplásico de tireoide
(CAT) é um carcinoma altamente agressivo, mas que raramente é encontrado na rotina
36
clínica. A sua incidência atinge de 1 a 2 pessoas a cada 1.000.000 habitantes, com uma maior
incidência nos países latino-americanos e europeus (CARVALHO; GRAF, 2005). Estes
carcinomas acometem principalmente pessoas acima de 60 anos, sendo geralmente fatais, com
um tempo de sobrevida após o diagnóstico de apenas seis meses (GIUFFRIDA; GHARIB,
2000).
O CAT possui apresentação clínica como uma massa rígida não encapsulada,
causando um rápido aumento da região do pescoço com compressão de estruturas gerando
alguns sintomas, tais como disfagia, estridor, rouquidão e dor cervical. Ao diagnóstico, na
maioria dos casos são detectadas metástases cervicais, metástases ósseas em 50% dos casos e
invasões traqueais em aproximadamente de 25% dos casos (PORTELLA et al., 2002). A
histologia destes carcinomas é caracterizada por células extremamente atípicas com múltiplas
mitoses, aneuploidias, necrose e infiltração por polimorfonucleares (AIN; EGORIN;
DESIMONE, 2000). Em adição, também é possível ocorrer regiões com CFT ou CPT
(diferenciados) juntamente com o tecido atípico. Este fato indica que o CAT pode resultar do
processo de desdiferenciação dos tumores diferenciados primários (YANG et al., 2003)
(Figura 11).
Figura 11: Histologia do carcinoma anaplásico de tireoide.
Fonte: (WIKIMEDIA COMMONS, 2009).
3.4.4
Carcinoma Medular de Tireoide
Diferente dos carcinomas que tem origem em células foliculares, o carcinoma medular
de tireoide (CMT) tem sua origem nas células parafoliculares, que são células secretoras do
37
hormônio calcitonina. Este carcinoma é raro, representando de 3 a 10% de todos os tumores
tireoidianos e possui um alto grau de malignidade (MAGALHÃES et al., 2003). O CMT se
apresenta macroscopicamente, como uma massa branca acinzentada, bem circunscrita, dura e
sem a formação de cápsula. As células podem apresentar diversos formatos, como poligonais,
fusiformes ou ovais, com um citoplasma granuloso e um núcleo central. Há uma baixa
frequência de mitoses observadas, porém uma característica importante no diagnóstico deste
carcinoma é a presença de amiloide (depósitos de calcitonina) (EZABELLA et al., 1998)
(Figura 12).
Figura 12: Histologia do carcinoma medular de tireoide, com presença de células com
diferentes formatos e núcleo central.
Fonte: (LOOKFORDIAGNOSIS, 2009).
O CMT possui grande importância clínica pelo fato de 10 a 25% dos casos serem
hereditários e de 75 a 90% serem de origem esporádica, afetando desse modo pacientes jovens
nos casos familiares e pacientes entre a quinta e sexta década de vida nos casos esporádicos.
Estes carcinomas apresentam herança autossômica dominante possuindo alto grau de
penetrância e expressividade variável nos casos de origem hereditária (RODRIGUES et al.,
2010). A apresentação clínica ocorre pela presença de uma ou mais nodulações cervicais que
podem ser seguidas de dor, rouquidão e disfagia pela compressão local, além de dor óssea,
rubor facial, diarreia e síndrome de Cushing devido à síndrome paraneoplásica, caracterizada
pela liberação de hormônios pelas células neoplásicas (VITALE et al., 2001).
38
3.5 DIAGNÓSTICO
O diagnóstico das patologias de tireoide inicialmente é feito levando-se em conta o
histórico e a avaliação clínica do paciente (COOPER et al., 2009). Usualmente a avaliação
clínica é feita pela palpação da glândula na região anterior do pescoço, onde o médico avalia a
presença ou não de nódulos que possam caracterizar algum tipo de anormalidade e por meio
de testes bioquímicos onde são avaliados os níveis séricos do TSH (hormônio
tireoestimulante), T3 (triiodotironina), T4 (tiroxina), a dosagem de anticorpos como:
anticorpo anti-tireoperoxidase (ac TPO), anticorpo anti-tireoglobulina (ac TG) e anticorpo
anti- receptor de TSH (TRAB) pra diagnóstico de doenças autoimunes além da dosagem de
calcitonina (CT) para alguns cânceres específicos, o CEA (antígeno carcino-embrionário)
(LADENSON, 1996; BUESCO; FARIAS, 2003; CAPUZZO, 2012).
Os nódulos da tireoide possuem diferentes características que variam entre os
pacientes, apresentando variações desde o tamanho até ao aspecto, composição e quantidade
de nódulos, o que pode determinar sua natureza benigna ou maligna (BOMELI; LEBEAU;
FERRIS, 2010). A caracterização de um nódulo como simples ou não tóxico, não determina
que sua evolução não possa ocorrer para processos fisiológicos mais graves. A mesma
afirmação pode ser feita quando se compara a presença de BNS com BMN, pois não há
diferenças estatísticas de uma maior incidência de carcinoma de tireoide quando se tem a
presença de BMN (MCCALL et al., 1986; SACHMECHI et al., 2000). Assim, o tamanho e a
quantidade do nódulo (BAHN; CASTRO, 2011) não caracterizam a patologia, porém, são
considerados fatores de risco e bons indicadores para determinação do seguimento clínico
(GANDOLFI et al., 2004).
Contudo, apesar de serem ferramentas diagnósticas importantes, somente as avaliações
clínicas e bioquímicas não são conclusivas para se determinar o diagnóstico com precisão
(JARLØV et al., 1992; MARQUSSE et al., 2000; HEGEDÜS, 2001; HEGEDÜS;
BONNEMA; BENNEDBAEK, 2003). Desse modo, houve o desenvolvimento e aplicação de
várias técnicas,tais como a TC (tomografia computadorizada), MIR (imagem por ressonância
magnética), PET (tomografia por emissão de pósitrons), a cintilografia e a elastografia, na
tentativa de aumentar a sensibilidade da detecção dos nódulos. No entanto, devido ao seu alto
custo, apenas parte da população consegueter acesso às mesmas, tanto para o diagnóstico
inicial quanto para o seguimento do nódulo (SHAHA, 2003; GRAF, 2004; BOMELI;
LEBEAU; FERRIS, 2010), sendo classificadas como técnicas auxiliares e indicadas
seletivamente.
39
As principais técnicas utilizadas atualmente para realizar a detecção de nódulos é a
punção aspirativa por agulha fina (PAAF), considerada padrão ouro para o diagnóstico
citológico de alguns cânceres de tireoide (BLANSFIELD; SACK; KUKORA, 2002;
CASTRO; GHARIB, 2003; TAN et al., 2007; BONGIOVANNI; CIBAS; FAQUIN, 2010),
auxiliada pelo ultrassom (US) (RENSHAW, 2001; MARQUSSE et al., 2000; HEGEDUS,
2001; HEGEDÜS; BONNEMA; BENNEDBAEK, 2003; GRAF, 2004; RAGO; VITTI, 2008;
KIHARA et al., 2012), onde devido a maior sensibilidade desta técnica, tem-se verificado um
aumento na detecção do número de nódulos diagnosticados previamente pelo exame clínico
(TAN; GHARIB; READING, 1995; WIEST et al., 1998, KIM; SONG; KIM, 2008). Os
nódulos que não são percebidos pelo exame clínico, chamados de incidentalomas, são em sua
maioria muito pequenos e detectados de forma inesperada (TAN; GHARIB, 1997;
GIUFFRIDA; GHARIB, 2000; PECCIN et al., 2003; GOUGH; SCOTT-COOMBES;
PALAZZO, 2008; LIN, 2010; CHOI et al., 2012).
Embora a acurácia do diagnóstico de biópsias por PAAF guiadas por US interpretadas
como benignas ou malignas seja alta, a interpretação dos resultados pode ser imprecisa em
cerca de 10% dos casos (BALOCH et al., 2001; 2002; YEH; DEMIRCAN; ITUARTE, 2004).
Ravetto, Colombo e Dottorini (2000) e Vierlinger et al. (2011) afirmam que os casos
suspeitos ou indeterminados podem levar os pacientes a procedimentos cirúrgicos
desnecessários, pois somente 20% dos casos indeterminados possuem malignidades. Deste
modo, é extremamente importante encontrar novos caminhos para detectar as alterações
bioquímicas, celulares e genéticas que acometem a tireoide com o objetivo de aperfeiçoar o
diagnóstico e prognóstico das lesões que surgem nesta glândula. Atualmente, muitos estudos
avaliando o perfil genético das lesões de tireoide têm sido realizados auxiliando os
patologistas na determinação de um diagnóstico mais preciso.
Segundo as diretrizes clínicas na saúde suplementar, formuladas pela Associação
Médica Brasileira (AMB) e pela Agência Nacional de Saúde Suplementar (ANSS),
conduzidas por Ward et al. (2011), a utilização de marcadores moleculares no diagnóstico de
carcinomas diferenciados de tireoide é de grande importância para uma melhor eficiência e
precisão no diagnóstico dos nódulos de tireoide, com grande especificidade e sensibilidade em
relação aos métodos utilizados atualmente (RODRIGUES; PONTES; ADAN, 2012).
As principais alterações genéticas que têm sido encontradas em CPT e pesquisadas
como marcadores diagnósticos são as translocações RET/PTC, presentes em 8 a 60% dos
casos, as mutações no gene BRAF, presentes em aproximadamente 40% dos casos e mutações
no gene RAS, presentes em 15% dos casos de CPT e em50% casos de CFT. Nestes
40
carcinomas, além das mutações no gene RAS, translocações PAX8/PPARgamatambém são
comuns, ocorrendo em aproximadamente 10% dos casos, sendo assim considerada um
importante marcador molecular juntamente com o gene RAS. Além de serem encontradas nos
CFT, as alterações no gene RAS e PAX8/PPARgama foram detectadas nos casos de AFT com
taxas de 50% para o gene RAS (RUSINEK; SZPAK-ULCOK; JARZAB, 2011).
Adicionalmente, afirma-se que a pesquisa de mutações nos gene LGALS3, HBME e CK19,
podem alcançar para alguns tipos de lesões uma sensibilidade e especificidade de 100% e
82%, respectivamente (SOBRINHO-SIMÕES et al., 2005). A descoberta desses genes como
marcadores moleculares diagnósticos nos carcinomas de tireoide também foram relatados por
outros estudos (XING et al., 2005; LIU et al., 2008; POLLER; GLAYSHER, 2013; XING et
al., 2013).
Contudo, embora houvesse progressos na identificação de alguns marcadores
moleculares de diagnóstico para a neoplasia maligna de tireoide, atualmente ainda é
particularmente difícil determinar com total precisão o diagnóstico de um nódulo. Diante
disso, alguns trabalhos têm sugerido a utilização de uma série de novos marcadores
moleculares descobertos pelas técnicas de análise de expressão gênica para serem aplicados
em conjunto com a PAAF e com a utilização das técnicas de espectroscopia óptica, que tem
apresentado excelentes sensibilidades na diferenciação de carcinomas (MACIEL; KIMURA;
CERUTTI, 2005).
3.6 ESPECTROSCOPIA ÓPTICA
O entendimento das bases bioquímicas nas doenças humanas é uma das áreas mais
importantes no desenvolvimento da medicina moderna. Poucos métodos analíticos satisfazem
estes requerimentos e são sensíveis o suficiente para revelar detalhes da composição e de
estrutura desta glândula. As técnicas que mais tem se destacado neste sentido são as de
tomografias computadorizadas, ressonância magnética nuclear e espectroscopia óptica (LIU et
al., 2003; LEVIN; BHARGAVA, 2005; SAHU; MORDECHAI, 2005; BHARGAVA, 2007;
HUANG et al., 2010; ZHANG et al. 2010).
A espectroscopia óptica se destaca como uma das novas técnicas de aperfeiçoamento
do diagnóstico porque é sensível a alterações nas estruturas celulares e também na
composição molecular, cujas mudanças quanto à geração e à progressão do câncer precedem
às morfológicas (MOVASAGHI; REHMAN; REHMAN, 2007; MOVASAGHI; REHMAN;
41
REHMAN, 2008; NAUMANN, 2001). Além disso, esta técnica identifica diferentes
assinaturas bioquímicas como resultado das mudanças intracelulares (LIU et al., 2003).
Nos tecidos, processos patológicos sempre causam mudanças bioquímicas e
morfológicas e usualmente utilizamos as técnicas histológicas para fazer a análise a nível
microscópico das modificações na composição tecidual, porém, a utilização da técnica de
espectroscopia Raman traz uma avaliação mais específica, pois analisa a nível molecular e
bioquímico, sendo vista como uma técnica ideal para o diagnóstico (LESLIE et al., 2012),
pois mesmo sem a presença de modificações morfológicas, a técnica consegue detectar
mudanças bioquímicas que posteriormente irão originar as mudanças teciduais. Além disso, se
destaca de outras técnicas de espectroscopia, pois não sofre a influência da hidratação
tecidual, fato que interfere a análise de outras técnicas como FTIR (Espectroscopia no
Infravermelho por Transformada de Fourier) (BELLISOLA; SORIO, 2012; PUJARY et al.,
2011).
3.6.1
Espectroscopia Raman
O conhecimento a respeito da espectroscopia Raman teve início em 1928 com o físico
indiano Chandrasekhara Venkata Raman que, relatou pela primeira vez a existência de uma
radiação secundária da interação da luz com a matéria. Esta técnica passou a ser muito
utilizada na indústria, porém, somente a algumas décadas a técnica passou a ser aplicada a
estudos envolvendo tecidos biológicos (STONE et al., 2000; LYNG et al., 2007; CHAN et al.,
2006; KELLER et al., 2008; LIEBER et al., 2008; MARTINHO et al., 2008; TEIXEIRA et
al., 2009; KAMEMOTO et al., 2010; SAHA et al., 2011).
A espectroscopia Raman utiliza uma luz laser (fótons) para interagir com as moléculas
presentes no material alvo, estas são excitadas a um estado quântico parcial, apresentando
uma vibração. A partir deste momento os fótons sofrem dispersão com determinadas
frequências energéticas, dando origem ao espalhamento Stokes, anti-Stokes ou Rayleigh. O
espalhamento Stokes é caracterizado quando a energia do fóton incidente é diferente da
energia do fóton espalhado, o que significa que um quantum de energia foi adicionado ao
material, o espalhamento anti-Stokes é quando a energia do fóton espalhado é maior a energia
do fóton incidente e a estes dois tipos de espalhamento dão-se o nome de espalhamento
inelástico ou efeito Raman,cujas frequências são específicas para cada tipo de molécula
(Figura 13).
42
Figura 13: Liberação de um fóton pela molécula após sua excitação.
Fonte: (HORIBA, 2013).
O espalhamento Rayleigh, também conhecido como espalhamento elástico, é
caracterizado quando não ocorre a interação do fóton com o material, demonstrando a
ausência de ganho ou perda de energia quando comparado com a energia do fóton incidente
(Figura 14).
Figura 14: Representação energética do espalhamento Rayleigh, Raman Stokes e Raman antistokes.
Fonte: Pontifícia Universidade Católica - Rio (2011).
Assim que as moléculas sofrem excitação pela luz laser, realizam movimentos
característicos de acordo com as ligações químicas presentes em sua constituição bem como a
massa de cada átomo. Estes movimentos exercidos pelas moléculas são conhecidos como
modos vibracionais e podem se apresentar na forma de estiramento, visto em moléculas com
43
dois átomos; em sistemas com a presença de três átomos, os movimentos de vibração podem
ser visualizados de forma simétrica e assimétrica (Figura 15).
Figura 15: Modelo representativo dos modos vibracionais exercidos pelas moléculas após a
excitação com a luz laser para o metileno (CH2).
Fonte: (EXPERTSMINDS.COM, 2013).
Como resultado da interação da luz com a molécula bem como o aumento da vibração
das mesmas, ocorre a liberação de fótons que são captados por um detector CCD (chargecoupled device), em seguida processados, transformando o sinal coletado em espectros
Raman, que se baseiam na intensidade da radiação espalhada em função de sua energia, que é
dada na unidade de comprimento de onda ou cm-1(HOGIU; WEEKS; HUSER, 2009;
BRAUCHLE; SCHENKE-LAYLAND, 2013).
Com as frequências específicas, a técnica permite então estabelecer a impressão digital
bioquímica da amostra alvo (HARRIS et al., 2009; KOLJENOVIC et al., 2005). Por isso, os
espectros Raman são de muita importância para o diagnóstico, pois trazem informações
precisas sobre a composição, estrutura e interações moleculares do tecido analisado
(KOLJENOVIC et al., 2005).
Estudos afirmam que a espectroscopia Raman é eficaz na diferenciação de neoplasias
em diversas aplicações, indicando a possibilidade de verificação de componentes bioquímicos
de tecidos biológicos, com resultados em tempo real e minimamente invasivos (NUNES,
2003; BITAR, 2004; HARRIS et al., 2009; TEIXEIRA et al., 2009; BERGHOLT et al., 2010;
HUANG et al., 2010; LIU et al., 2003; LOPES et al., 2011). Harris et al. (2009) estudaram
44
por espectroscopia Raman duas linhagens de células de tireoide humana, uma normal e uma
de carcinoma anaplásico. Com a aplicação dos dados em uma rede neural, foi possível fazer a
separação entre as duas linhagens celulares de 95%, com uma sensibilidade de 92%.
Em um estudo prévio do nosso grupo (TEIXEIRA et al., 2009) demonstraram que a
espectroscopia Raman é uma técnica que pode ser aplicada na análise de alterações de tecidos
tireoideanos. Através da técnica de FT-Raman, foi realizada a atribuição dos principais modos
vibracionais dos tecidos de tireoide,assim como, a análise discriminante em vários tipos de
tecidos (Tabela 3).
Tabela 3: Principais modos vibracionais encontrados em tecidos de tireoide.
BANDA (cm-1)
ATRIBUIÇÃO
573
Triptofano/citosina, guanina
600
Conformação de nucleotídeo
678
Respiração de anel aromático das bases nitrogenadas de DNA
720
DNA (Adenina, Coenzima A)
780
Respiração de anel aromático da base nitrogenada uracila
856
Aminoácidos da cadeia lateral de prolina e hidroxiprolina; (C-C) de colágeno
estrutural
879
Hidroxiprolina, triptofano
937
Prolina, hidroxiprolina, ν(C-C)
960
ν1 PO-34
1000
Fenilalanina; NADH
1087 – 90
Estiramento C-C e PO-2
1123
(C-N) proteínas e lipídeos; glicose
1208
ν C-C6H5); triptofano, fenilalanina; amida III (proteína)
1246
Amida III (colágeno)
1268/9
Amida III (colágeno)
1319
Guanina; CH2-CH3
1337/9
Triptofano; colágeno; ácidos nucleicos
1401
Grupo metil (de colágeno)
1448
Deformação CH2-CH3
1552
ν (C=C); triptofano
1585
(C=C); Fenilalanina
1603
Estiramento de fenil; (C=C); fenilalanina
1618
ν (C=C); triptofano; porfirina; NADH
1665
Amida I
Fonte: (TEIXEIRA et al., 2009).
45
Na comparação dos espectros obtidos por meio da análise de espectroscopia FTRaman, o grupo de amostras de tecido adjacente ao bócio e o grupo da região nodular do
bócio adenomatoso foram considerados similares, como descritos pela histologia, com
percentual de classificação abaixo de 58.3 %. Este percentual confirma a dificuldade de
diferenciação da região periférica com relação à região central do bócio. Entretanto, pela
análise dos espectros observaram-se alterações bioquímicas entre os dois tipos de tecidos,
evidenciadas pela diferença nos modos vibracionais. Na comparação das amostras de bócio
(tecido adjacente e região nodular) versus amostras de carcinoma papilífero, o índice de
classificação pela técnica FT-Raman, foi de apenas 64.9 % e na comparação entre os grupos
de tecidos benignos (bócio e adenoma folicular) versus tecidos malignos (carcinomas
papilífero e folicular) a análise dos espectros mostrou o percentual de 72,5 %, demonstrando
desta forma que a análise espectral por meio da técnica Raman consegue classificar os
diferentes tipos de tecidos (Figura 16).
Figura 16: Comparação da média dos espectros de bócio, CPT e CFT.
Fonte: (TEIXEIRA et al., 2009).
Com excelentes taxas de sensibilidade e especificidade, a espectroscopia Raman tem
se mostrado uma importante ferramenta de diagnóstico já sendo utilizada em canceres de
pulmão, pele, detecção cervical e gastrintestinal (HOGIU; WEEKS; HUSER, 2009). Diante
dos casos onde há uma imprecisão no diagnóstico, como é visto nas lesões de tireoide, o
mesmo consegue determinar diferenças bioquímicas que se bem aplicadas podem evitar que
os pacientes sejam levados sem necessidade ao tratamento cirúrgico (BELJEBBAR et al.,
2010).
46
Portanto, a espectroscopia Raman se destaca por realizar a análise tecidual de forma
indolor, em tempo real e por possuir especificidade para determinar com exatidão mudanças
bioquímicas indicando futuras modificações morfológicas quando as mesmas ainda não
estiverem presentes, sendo assim, nosso trabalho selecionou a técnica de espectroscopia
Raman confocal para realizar a identificação de diferentes tipos de lesões da tireoide na
tentativa de caracterizar os principais modos vibracionais dos tecidos de tireoide,
estabelecendo desta forma um padrão espectral para cada tipo de tecido da glândula tireoide
analisada.
3.7 MUTAÇÕES GENÉTICAS E LESÕES DE TIREOIDE
Várias alterações genéticas foram descritas nas neoplasias malignas de tireoide, sendo
as mais frequentes as mutações puntuais, amplificações, translocações e metilações, sendo os
oncogenes BRAF, RET, RAS, TRK e PAX8-PPARgammaos mais frequentemente mutados.De
acordo com Guerrero e Clark (2011), a pesquisa de mutações nos genes pertencentes à
viaMAPK, especialmente os genes BRAF, RET/PTC e RAS para os pacientes com CPT é uma
ferramenta importante para auxiliar na decisão do melhor acompanhamento e tratamento para
o paciente.
Mutações também têm sido observadas em genes supressores de tumor, tais como os
genes TP53, PTEN, TP16, entre outros (revisado por HUNT, 2002). Além disso, várias vias
de sinalização foram descritas como diretamente envolvidas no desenvolvimento dos cânceres
de tireoide, que estão descritas na Tabela 4 (XING, 2013).
Tabela 4: Vias de sinalização envolvidas no processo de carcinogênese da tireoide.
VIAS
CARCINOMAS
ESPECÍFICOS
MAPK
CPT
PI3K-AKT
AFT / CFT
WNT-β catenina
CPDT / CAT
FUNÇÃO
Regulação da proliferação e sobrevivência
celular
Fundamental na tumorigênese
Regulação do crescimento celular, associado à
agressividade do câncer
Mediador da resposta a hipóxia e indução de
HIF1α
CAT
genes relacionados ao metabolismo de células
tumorais e angiogênese
47
Regulação inflamatória associada à
---*
NF-kB
tumorigênese, controle da proliferação celular e
ação anti-apoptótica
RASSF1-MST1-FOXO3
---*
Controle do processo de apoptose
*Vias não envolvidas com tipos histológicos específicos.
Fonte: (XING, 2013).
Várias mutações em genes que contribuem para o correto funcionamento da glândula
tireoide foram descritas estarem relacionadas, com o desenvolvimento do bócio, entre eles, os
genes da tireoglobulina (TG), tireoperoxidase (TPO), membro 5 transportador de sódio-iodina
(NIS) e receptor de tirotrofina (TSHR) (CORRAL et al., 1993; PASCHKE et al., 1996;
MEDEIROS-NETO, 2013), além de mutações no proto-oncogene RAS, que atua na
transdução de sinal (GOLBERT et al., 2003; GIORDANO et al., 2005).
O AFT é caracterizado pela mutação no gene do receptor de TSH (TSHR), que ao
aumentar a proliferação celular, pode promover o surgimento de novas mutações (MATSUO
et al., 2004), como por exemplo no gene RAS, com presença de mutações em 48% dos casos
(NIKIFOROVA et al., 2003). Esta alteração é considerada um evento primário na
tumorigênese do AFT, porém, como esta lesão é presumidamente pré-maligna, a sua
transformação para carcinoma somente acontecerá com a ocorrência de eventos genéticos
adicionais (XING et al., 2013).
Um dos genes mais frequentemente mutados nos CPT e considerado a causa mais
comum de CPT é o oncogene BRAF, que está alterado em 45 a 50% destes tumores.
Alterações neste gene estão relacionadas ao pior prognóstico do paciente, que apresenta
características patológicas agressivas e não responde adequadamente ao tratamento (XING et
al., 2005; MACIEL; KIMURA; CERUTTI, 2005). O CPT também é amplamente
caracterizado por translocações no gene RET/PTC, que está diretamente associado às
alterações morfológicas detectadas neste carcinoma (ALDRED et al., 2004). As principais
translocações RET/PTC são a RET/PTC1, onde o rearranjo intracromossomal ocorre entre o
proto-oncogene RET e H4, ambos localizados no braço longo do cromossomo 10 e
RET/PTC3, cuja translocação ocorre entre os genesRET e ELE1 (GAO et al., 1999;
MAROTTA et al., 2011). Mutações no proto-oncogene TRK, mapeado em 1q21 e codificador
de um receptor de membrana tirosina quinase cujo ligante é o fator de crescimento do nervo
(NGF), também são observadas em até 10% dos casos de CPT esporádicos ou após irradiação
cervical (LACROIX et al., 2005).
48
A alteração genética mais característica do CFT é a translocação entre os genes
PPARgamma1, mapeado em 2q13, e PAX8, mapeado em 3p25, originando o oncogene PAX8PPARgamma1 (HUNT, 2002). Esta alteração é específica para estes carcinomas, contudo há
trabalhos que detectaram a presença dessa alteração em AFT, neste caso, a presença dessa
alteração, pode ser atribuída a progressão tumoral (NIKIFOROVA et al., 2003; WARD et al.,
2011). Mutações no gene RAS também foram encontradas em carcinomas foliculares
amplamente invasivos, carcinomas foliculares minimamente invasivos bem como em
adenomas foliculares, sugerindo que esta alteração é um evento mutacional primário comum
entre essas lesões (PUXEDDUN; FAGIN, 2001; NIKIFOROVA et al., 2003). Mutações ou
deleções no gene supressor de tumor PTEN ou no gene PIK3CA, os quais atuam na ativação
da via PIK3-AKT, representam a base genética da tumorigênese para este tipo de carcinoma
por desempenhar papéis fundamentais na divisão e crescimento celular bem como sua
sobrevivência (LIU et al, 2008).
A mutação no gene TP53 foi encontrada em 75% dos pacientes com CAT
(TACCALITI et al., 2012). Assim como as outras mutações detectadas nos vários tipos de
carcinomas de tireoide, esta mutação leva a perda da função celular e consequentemente, a
capacidade da célula de concentrar o iodo e a diminuição dos receptores de TSH, causando
assim o crescimento celular desordenado, a inibição da apoptose e a ausência do controle
exercido pelo hormônio TSH (AIN; EGORIN; DESIMONE, 2000).
O CMT se inicia a partir de uma mutação herdada que causa a hiperplasia de células C
ou parafoliculares que associada a mais uma mutação somática leva a transformação maligna
(JAKSON et al., 1979). Este carcinoma é caracterizado por mutações no proto-oncogene RET
(membro da família dos genes receptores de tirosina) (HUNT, 2002). Este carcinoma é
caracterizado por mutações no gene RET (HUNT, 2002). Segundo Kudo et al. (2011), 70%
dos casos de CMT são de origem esporádica e os outros 30% relacionados a herança familiar.
3.8 ALTERAÇÕES NA EXPRESSÃO GÊNICA E NEOPLASIAS DE TIREOIDE
Os recentes avanços nas técnicas de biologia molecular têm permitido o uso de
técnicas de alta resolução para o descobrimento de marcadores moleculares. Em câncer de
tireoide, a análise de expressão gênica por microarray têm sido utilizada em vários estudos
porque permite a correlação do perfil de expressão gênica com variáveis clínicas, a
classificação e definição dos diferentes tipos tumorais até a identificação de genes ou vias de
genes envolvidos na carcinogênese (Tabela 5).
49
A análise de microarray em câncer de tireoide tem identificado aproximadamente 47
a 627 genes que estão diferencialmente expressos nas neoplasias de tireoide benignas e
malignas dependendo do critério de seleção e o método de análise dos dados (BARDEN et al.,
2003; MAZZANTI et al., 2004; FINLEY et al., 2004a; WEBER et al., 2005; MATHUR et al.,
2010). A acurácia desses genes diferencialmente expressos em distinguir entre neoplasias da
tireoide benignas e malignas tem uma sensibilidade de 87,5 a 93% e uma especificidade de
87,1 a 100% (BARDEN et al., 2003; FINLEY et al., 2004b; MAZZANTI et al., 2004;
VIERLINGER et al., 2011; PFEIFER, et al., 2013; WOJTAS et al., 2013). Embora alguns dos
genes diferencialmente expressos relatados possuam um papel estabelecido na tumorigênese
de tireoide, o desenho dos experimentos e os métodos de análise dos dados de microarraysão
diferentes e assim não há resultados em um grupo consistente de genes marcadores
diagnósticos. Poucos estudos têm validado os resultados da análise de microarray por PCR
quantitativa em tempo real (qRT-PCR) ou imuno-histoquímica (BARDEN et al., 2003;
ALFRED et al., 2004). Esta limitação é importante visto que alguns trabalhos sugerem que a
análise de microarray identifica erroneamente 30% de genes e níveis de expressão gênica
(KOTHAPALLI et al., 2002). Outro obstáculo para a aplicação da análise de microarray em
distinguir entre neoplasias benignas e malignas de tireoide é a dificuldade técnica de usar a
análise de microarray em amostras de biopsia por PAAF devido a quantidade limitada de
RNA total que pode ser extraído dessas amostras.
Tabela 5: Expressão gênica dos principais genes presentes na literatura (2003-2013).
GENES ANALISADOS
METODOLOGIA
REFERENCIAS
MUC-1, CD26, galectin-3 e receptor de TSH
qRT-PCR
PINEDA et al. 2003
qRT-PCR e IHC*
CERUTTI et al. 2004
Ckit, Hs.24183, LSM7, SYNGR2, C21orf4
qRT-PCR
ROSEN et al. 2005
Htert
qRT-PCR
ASAAD et al. 2006
ECM1, TMPRSS4, ANGPT2, TIMP1, EGFR
qRT-PCR
KEBEBEW et al. 2006
Plataforma microarray Labelling Kit v 2.0
Microarray e qRT-PCR
FINN et al. 2007
qRT-PCR e IHC*
FOUKAKIS et al. 2007
qRT-PCR
SAPIO et al. 2007
DDIT3, ARG2, C1orf24, PCSK2, ODZ1, ACO1,
DNASE2, FLJ13576, ITM1, PDK4,, PPP1R14B,
COL14A1, TARSH, Emu1, NID2
CITED1, ABI3BP, EGR2, ARG2, JUN, ITM1, TERT,
TFF3, LGALS3, NIS, TG, TPO, DIO1, TSHR, TITF1,
PAX8, PPARG, RASSF1, PTEN
Oncogenes: RET/PTC, TRK e BRAF(V600E)
50
PDGFA, PDGFB, PDGFC, PDGFD
BRAF V600E, NRAS, KRAS, RET/PTC1, RET/PTC3,
NTRK1
qRT-PCR
BRULAND et al. 2009
qRT-PCR
MATHUR et al. 2010
VIERLINGER et al.
SERPINA1
Microarray e qRT-PCR
ADM3, HGD1, LGALS3, PLAB, TFF3, TG
qRT-PCR
KARGER et al. 2012
c-KIT
qRT-PCR
TOMEI et al. 2012
BRAF V600
PCR
2011.
POLLER; GLAYSHER
2013.
*Autores utilizaram a técnica de imuno-histoquímica na pesquisa de genes associado a técnica de
qRT-PCR.
Fonte: O autor.
Kebebew et al. (2005a; 2005b; 2006) usaram a análise de cDNA array em vias
genéticas específicas para identificar candidatos a marcadores diagnósticos para as neoplasias
de tireoide indeterminadas ou suspeitas na citologia de PAAF. Esses autores identificaram 28
genes diferencialmente expressos nas neoplasias malignas de tireoide de um total de 288
genes com funções relacionadas à invasão celular e metástase, ciclo celular e angiogênese. A
avaliação pela qRT-PCR em 95 pacientes com neoplasias de tireoide confirmou que os níveis
de expressão de 16 dos 28 genes foram significativamente diferentes entre as neoplasias
benignas e malignas da tireoide. Quatro novos marcadores de diagnóstico (ECM1, TMPRSS4,
ANGPT2, TIMP1) de neoplasia maligna foram confirmados pela qRT-PCR (KEBEBEW et
al., 2006). Estes quatro genes em conjunto tiveram uma sensibilidade de 100%, especificidade
de 94,6%, um valor preditivo positivo de 96,5% e um valor preditivo negativo de 100% nas
95 amostras de tumores de tireoide indeterminadas ou suspeitas na biópsia por PAAF
(KEBEBEW et al., 2006). De igual forma, Pfeifer et al. (2013) realizou uma busca de
marcadores candidatos para a diferenciação dos carcinomas foliculares (CFT) de adenomas
foliculares (AFT) pelas técnicas de microarray e qRT-PCR. Estes autores encontraram cinco
genes (ELMO1, EMCN, ITH5, KCNAB1 e SLCO2A1) que diferenciaram estas lesões, porém
com sensibilidade e especificidade de apenas 71% e 72%, respectivamente.
Diante desta imensa necessidade de se encontrar melhores formas de diagnóstico, a
pesquisa de novos marcadores moleculares é intensa. Assim como Kebebew et al. (2006),
diversos outros estudos na literatura como Belge et al. (2008); Bruland et al. (2009); Spitzweg
e Morris (2010) e Prasad et al. (2012) utilizaram a análise de expressão gênica para buscar
marcadores moleculares diagnósticos que diferenciem neoplasias benignas dos carcinomas de
51
tireoide ou que diferenciem os diferentes tipos histológicos de carcinomas de tireoide,
contudo muitos desses ainda apresentaram baixa sensibilidade e especificidade.
3.9 TRATAMENTO
Melhorias na forma diagnóstica foram aplicadas pelo avanço de diversas técnicas
baseadas em imagem, porém o tratamento e seguimento permanecem os mesmos, onde em
sua maioria é caracterizada pela tireoidectomia total, ablação por iodo radioativo, tratamentos
supressivos e o acompanhamento constante do nível sérico de tireoglobulina (Tg), TSH e
exames de imagem (FERRAZ et al., 2001; BUESCU; GREGO FILHO, 2002; RIESCOEIZAGUIRRE; SANTISTEBAN, 2007). Segundo Cramer et al. (2010), as tireoidectomias
totais e parciais são as principais formas de tratamento diante de carcinomas de tireoide.
Segundo Vartanian (2013), o estadiamento dos pacientes é realizado através da
classificação TNM proposta pela União Internacional Contra o Câncer (UICC - 2010) para
tumores da tireoide, sendo utilizada somente para os carcinomas. Para a classificação
histopatológica (pTNM), utilizam-se os dados obtidos através do exame anatomopatológico
da peça cirúrgica, o qual deve conter informações como a confirmação histológica da doença
e divisão por tipo histológico. É através do estadiamento dos pacientes que ocorre a decisão
sobre o tratamento mais adequado e sobre a necessidade de tratamento complementar póscirúrgico e seguimento mais ou menos rigoroso. As tireoidectomias, tratamento cirúrgico
amplamente utilizado pode ser realizado de três formas: Tireoidectomia parcial ou lobectomia
com istmectomia, menor procedimento aceitável para o tratamento do carcinoma da tireoide,
consistindo na retirada de um lobo tireoidiano mais o istmo; Tireoidectomia total, a qual
compreende a remoção de toda a glândula tireoide e Tireoidectomia total ampliada,
consistindo de uma ressecção além da tireoide de uma parte ou da totalidade de estruturas
adjacentes (laringe, traqueia, esôfago, faringe e/ou nervo laríngeo recorrente). A escolha do
melhor tipo de tireoidectomia a ser aplicada em cada paciente depende do tipo de carcinoma,
tamanho e características da doença no momento diagnóstico.
Além da tireoidectomia, quando existe a suspeita de metástases, a análise dos
linfonodos é de extrema importância. Nos casos de pacientes com linfonodos positivos o
processo de esvaziamento linfonodal cervical é realizado cuja quantidade e locais são
determinados pelo corpo clínico. Outras formas de tratamento também são realizadas como a
terapia de supressão do TSH, com L- tiroxina sódica, em todos os casos de carcinomas bem
diferenciados, o iodo-radioativo (I-131) em pacientes com carcinoma bem diferenciado que se
52
enquadram nos grupos intermediário e de alto risco (classificação proposta pelo Memorial
Sloan Kettering Cancer Center), nos casos de doença residual, doença multifocal, metástase
linfonodal e à distância e em casos de recorrência da doença. Nos pacientes diagnosticados
com carcinoma medular, a radioterapia adjuvante convencional está indicada quando ocorre a
invasão de partes moles e na presença de múltiplos linfonodos positivos. A radioterapia
também é utilizada como tratamento primário alternativo no carcinoma anaplásico, associada
à quimioterapia (VARTANIAN, 2013).
Associado ao tratamento, o seguimento dos pacientes é de extrema importância. Este
seguimento é realizado pela dosagem dos hormônios tireoglobulina (Tg), T3, T4 e TSH
permanentemente, além do mapeamento de todo o corpo do paciente pelo I-131 na busca de
metástases a distância no primeiro ano pós-tratamento (NATIONAL COMPREHENSIVE
CANCER NETWORK, 2013; VARTANIAN, 2013).
53
4
METODOLOGIA
A seguir, os processos metodológicos que foram usados nesta pesquisa.
4.1 AQUISIÇÃO DAS AMOSTRAS
Este projeto foi submetido e aprovado pelo comitê de ética em pesquisa sob o número
221.402/CEP/2013 que segue a resolução CNS/MS 196/96. As amostras dos tecidos da
tireoide foram obtidas junto à disciplina de cirurgia de cabeça e pescoço do Hospital das
Clínicas da Faculdade de Medicina - USP. A coleta das amostras foi realizada por
procedimento cirúrgico com biópsias incisionais, no momento do diagnóstico conhecido por
congelação, somente após ter sido especificado ao paciente todos os procedimentos e este ter
assinado o termo de consentimento livre e esclarecido. Todas as amostras de tecido
identificadas ficaram armazenadas em tubos criogênicos Nalgene® mantidos em freezer -80°C
até o momento do corte pelo criostato (Leica® Modelo CM 1100) para a análise espectral e da
extração de RNA pela análise molecular. Para confirmação dos resultados da espectroscopia
Raman confocal e da análise de expressão gênica, as amostras foram submetidas
anteriormente por um diagnóstico histopatológico e os laudos foram assinados pelo médico
patologista, que seguiu os critérios de diagnóstico para câncer de tireoide da sociedade
brasileira de patologia (Tabela 6).
Tabela 6: Amostras utilizadas e respectivos tipos histológicos e técnicas utilizadas.
ANÁLISE DE
AMOSTRAS
TIPO HISTOLÓGICO
ANÁLISE RAMAN
4N
N
X
6N
N
X
7N
N
X
8N
N
X
12N
N
X
30N
N
X
32N
N
X
38N
N
X
39N
N
X
44N
N
X
57N
N
X
59N
N
X
3N
B
X
EXPRESSÃO GÊNICA
X
X
54
3T
B
X
10T
B
X
17T
B
X
18N
B
X
18T
B
X
20T
B
X
X
25T
B
29T
B
X
X
30T
B
X
34T
B
X
36T
B
X
39T
B
44T
B
X
51N
B
X
52T
B
X
53T
B
57T
B
X
58T
B
X
4T
CPT
X
5T
CPT
X
6T
CPT
X
11T
CPT
X
X
12T
CPT
X
X
13N
CPT
X
13T
CPT
X
X
16T
CPT
X
X
19T
CPT
X
X
22T
CPT
X
X
33T
CPT
X
X
35T
CPT
X
46T
CPT
X
23T
CFT
X
28T
CFT
X
X
31T
CFT
X
X
41T
CFT
X
X
61T
CFT
X
X
X
X
X
X
X
X
N: tecido normal; B: tecido bócio; CPT: carcinoma papilífero de tireoide; CFT: carcinoma folicular de
tireoide; X: análise realizada.
Fonte: O autor.
55
4.2 ESPECTROSCOPIA RAMAN
A seguir a espectroscopia de Raman.
4.2.1
Preparação das Amostras
Para a análise espectral foi utilizado um total de 35 amostras distribuídas nos seguintes
tipos histológicos: tecido normal (10 amostras), bócio (10 amostras), carcinoma papilífero de
tireoide (10 amostras) e carcinoma folicular de tireoide (5 amostras). As amostras foram
armazenadas a -80º C e cortadas na espessura de 10µm no criostato (Leica® Modelo CM
1100), entre - 15 a - 20°C.
Os tecidos foram limitados a pequenas porções e embebidos em Jung Tissue Freezing
(Leica Microsystems GMBH) para a realização do corte. Os cortes do tecido foram
seccionados e, colocados sobre janelas de CaF2 (fluoreto de cálcio), utilizadas para que não
ocorresse a presença de sinais nos espectros obtidos que não fossem os da amostra em
questão. A temperatura das amostras foi monitorada durante toda a análise para não perderem
as suas características morfológicas.
4.2.2
Obtenção e Análise dos Espectros
A obtenção dos espectros e a análise dos mesmos foram realizadas no Laboratório de
Espectroscopia Vibracional Biomédica (LEVB) da Universidade do Vale do Paraíba
(UNIVAP) em São José dos Campos, São Paulo, sob a orientação do Professor Doutor Aírton
Abrahão Martin, responsável pelas análises de Raman confocal.
O equipamento utilizado para obtenção dos espectros foi o espectrômetro Raman
confocal modelo 3510 (Holanda). O laser aplicado sobre as amostras teve um comprimento de
onda de 785nm, sendo utilizado como energia de excitação no espectrômetro Raman, cuja
potência utilizada foi de 20 mW, tempo de integração 10 segundos com 4 acumulações e o
sinal Raman coletado por um detector CCD resfriado a -95oC (Andor iDus 416 CCD).
56
Para captação dos espectros cada lâmina de CaF2 com os cortes de tecidos foram
mantidas sobre refrigeração sendo retiradas somente no momento da análise. As regiões onde
forem feitas as obtenções dos espectros foram marcadas com lápis dermográfico de modo que
durante o procedimento de coloração, realizado no mesmo corte de tecido analisado pela
técnica Raman confocal, ou qualquer presença de umidade não retirasse as marcações,
garantindo que a análise histopatológica fosse realizada no mesmo local onde o laser foi
incidido para coleta dos espectros Raman.
4.2.3
Tratamento Espectral
Foram obtidos 100 espectros de tecidos de tireoide sendo 30 de tecidos normais, 31 de
bócio, 24 de carcinoma papilífero (CPT) e 15 de carcinoma folicular (CFT). Os dados
espectrais foram submetidos primeiramente a subtração de fluorescência através do cálculo da
linha de base pelo software, utilizando um ajuste linear de grau 8. O processo de normalização
vetorial também foi realizado, no intervalo espectral de 400 a 1800 cm-1 através do
softwareLabspec5 (Horiba Jobin Yvon) e a normalização pelo pico de 1450 cm-1 através do
software Origin8.5, com a finalidade de encontrar mudanças nos valores de discriminação
entre os dois tipos de normalização.
A escolha das melhores regiões discriminantes foi realizada através da análise do
loading plot de todo o intervalo espectral sobre as duas normalizações utilizadas neste
trabalho. A análise do loading plot foi realizada através do gráfico da primeira componente
principal (PC1), onde foram observadas as regiões que englobam a maior quantidade de
variações entre os tecidos.
4.2.4
Análise Estatística
O primeiro procedimento realizado foi a obtenção dos espectros médios de regiões
determinadas por uma análise prévia do local de maior diferença entre todos os espectros
obtidos de cada grupo, Normal, Bócio, Carcinoma papilífero de tireoide e Carcinoma folicular
de tireoide, e em seguida, analisados utilizando-se o programa OriginPro 8 (OriginLAB).
Para a classificação dos espectros Raman, utilizamos a Análise de Componentes
Principais (PCA), método matemático que separa as variáveis originais de um grupo de
57
acordo com as suas semelhanças e métodos supervisionados como a Análise de Discriminante
Linear (LDA) e não-supervisionados de Análise de Agrupamento Hierárquico (HCA). O
programa Minitab® foi utilizado para estas análises, bem como a formação de grupos
(cluster) das amostras, que consiste na separação das amostras de acordo com suas
características bioquímicas. Esta separação foi de fundamental importância na determinação
das diferentes estruturas morfológicas, assim como pequenas alterações entre os constituintes
das amostras.
4.3 ANÁLISE HISTOLÓGICA
Abaixo estão especificados os procedimentos para a análise histológica.
4.3.1 Preparação das Lâminas
As lâminas para a análise foram confeccionadas com os cortes de tecido obtidos pelo
criostato Leica® Modelo CM 1100, com uma espessura de 10µm. Os cortes foram colocados
sobre uma janela de CaF2 e armazenados sobre refrigeração, onde após a análise Raman
sofreram o processo de coloração por hematoxilina-eosina (HE).
4.3.2 Análise das Lâminas
Após todo o processo de coloração das lâminas pela técnica de hematoxilina-eosina
(HE), as regiões previamente marcadas no local onde foi realizado a análise Raman foram
fotografadas e analisadas na tentativa de correlacionar as estruturas presentes nos locais com
os espectros Raman. Na impossibilidade de se realizar a reanálise dos pontos por meio das
imagens obtidas, foi realizada uma comparação com os resultados provenientes da análise
anatomopatológica do paciente obtidos no momento de diagnóstico e tratamento realizado
pelo centro responsável pela doação das amostras HCFM-USP. A determinação dos
componentes presentes nas lâminas seguiu os padrões estabelecidos pela Sociedade Brasileira
de Patologia (SBP).
4.4
ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA
58
A seguir os procedimentos para a analise de expressão gênica.
4.4.1 Amostras
Para a análise de expressão gênica foi utilizado um total de 33 amostras de tireoide,
sendo 14 amostras classificadas histologicamente como tecidos de bócio, 11 amostras de
CPT, quatro amostras de CFT e quatro amostras de tecido normal, utilizadas como
normalizadoras na análise de expressão gênica pela técnica de qRT-PCR. As amostras ficaram
armazenadas a temperatura de -80°C até o seu processamento.
4.4.2 Extração e Quantificação do RNA
A extração do RNA foi realizada utilizando o protocolo estabelecido para o Trizol®
Reagent (Life Technologies). A quantificação e a qualidade do RNA foram avaliadas pela
espectroscopia de absorção no ultravioleta no equipamento NanoDrop (ND-1000
Spectrophotometer v.3.0.1, Labtrade), que faz a análise das razões 280/260 e 260/230, onde a
leitura de absorvância do RNA a 260 nm serve para avaliar a pureza das amostras em relação
à contaminação com proteínas na razão 260/280, que deverá estar em torno de 1,8 a 2,0, e em
relação à contaminação com reagentes utilizados no processo de extração na razão 260/230,
que deverá estar entre 1,7 e 2,2. Aproximadamente 500ng de RNA foi utilizado para a
avaliação de integridade em gel de agarose a 1,5% em Tris-Borato-EDTA 1X (TBE) corado
com brometo de etidio. Este reagente se intercala entre as bases nitrogenadas do RNA
permitindo a visualização das bandas cromossômicas 18S e 28S, de acordo com o marcador
de peso molecular de 100pb (Invitrogen).
4.4.3 Síntese do cDNA
Para os experimentos de qRT-PCR foi utilizado 1 μg de RNA total de cada
amostra.Após a digestão do DNA (RNase-Free DNase Set, Qiagen) foi realizada a síntese de
cDNA pelo sistema de pré-amplificação SUPERSCRIPTTM III, que inclui, RNaseOUT ™
Enzime Mix, @x First-Strand Mix, e Buffer de anelamento. O protocolo consistiu em
adicionar 0,5 de oligo (dT), 0,5 µl de random primers, e 1µl de tampão de anelamento em 1µl
de RNA. O volume da reação foi completado com água ultra pura livre de RNases para um
volume final de 8 µl. Em cada reação foi adicionado 2 µl de SuperScript ® III reverse
59
Transcriptase já incluída na enzime mix como o objetivo de reduzir a atividade de RNase e
proporcionar uma maior estabilidade térmica, que inclui 10 µl de 2x First-strand Reaction
Mix que inclui 10 nM de MgCl2 e 1mM de cada dNTP, que otimiza a síntese de cDNA fita
simples. Esta reação foi realizada no termociclador BIOCYCLER, MJ96G.
4.4.4 Análise Quantitativa pela RT-PCR em Tempo Real
Os iniciadores para a amplificação dos genes selecionados para estudo e as condições
de reação foram determinados utilizando o software Primer Express (versão 3.0) (PE Applied
Biosystems, Foster City, CA, USA). A sequência dos iniciadores e a localização
cromossômica para cada gene estão representadas na Tabela 6. A detecção de alterações de
expressão gênica pela PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR) foi realizada no
equipamento ABI Prism 7500 Sequence Detection Systems (Life Technologies, USA) e
processadas pelo sistema de detecção após um número variável de ciclos em fase exponencial.
Tabela 7: Genes avaliados e respectivas funções, amplicons e sequências dos iniciadores.
GENES
TPO
TG
LGALS3
NOME
FUNÇÃO
AMPLICON
Função datireoide
60 pb
thyroglobulin
Função da tireoide
59 pb
lectin,
Relacionada a
galactoside-
apoptose,
binding,
imunidade inata e
soluble, 3
adesão celular.
trefoil factor 3
definida. Implicado
thyroid
peroxidase
65 pb
SEQUENCIA DE INICIADORES
5’- CACTTGCCTGGCGAACAAAT -3’
5’- GGGTGGTCTCTGTTGTTGCA -3’
5’- GCTTTTCAAGCACCTGTTTTCA -3’
5’- CACAACGAGAAAGGCACCATAG -3’
5’- CCCAATGCAAACAGAATTGCT -3’
5’- GGGTTAAAGTGGAAGGCAACAT -3’
Função não
TFF3
(intestinal)
anteriormente como
69 pb
5’- GAACTGACCTCTCCCCTTTGG -3’
5’- TGTTCTCTCCTGCATGCCTTT -3’
marcador para FTC.
plateletPDGFB
Fatores mitogênicos
derived growth
para células de
factor beta
origem
polypeptide
mesenquimal
55 pb
5’- AGGAGCAGCGAGCCAAAA -3’
5’- ACTCGCACCGTCCGAATG -3’
serpin
peptidase
SERPINA1
inhibitor, clade
A (alpha-1
antiproteinase,
antitrypsin),
Codifica uma
proteína inibidora
de protease serina
71 pb
5’- AAGGAGCTTGACAGAGACACAGTTT -3’
5’- GGTCTCTCCCATTTGCCTTTAA -3’
60
member 1
peptidylprolyl
PPIA
isomerase A
(cyclophilin A)
Imunossupressão
mediada
70 pb
5’-GCACTGGAGAGAAAGGATTTGG-3’
5’-TCACCACCCTGACACATAAACC-3’
Fonte: O autor.
Os genes alvos selecionados para a análise de expressão gênica pela qRT-PCR foram
TPO, TG, PDGFB, LGALS3, TFF3 e SERPINA1. Estes genes foram escolhidos por trabalhos
da literatura que os determinam com grande potencial de diagnóstico em diferentes lesões de
tireoide. Os valores obtidos para todas as amostras foram normalizados pela razão obtida
entre o gene de interesse e o gene referência, que neste estudo foi o PPIA. Este gene foi
escolhido por ser citado na literatura como um importante gene endógeno e que possui grande
estabilidade em diversos tipos de câncer (SHARUNGBAM et al., 2012; WEI; STEWART;
AMAOKU, 2013) e por ter sido utilizado por Vierlinger et al (2011) em seu estudo na busca
de marcadores específicos para carcinomas de tireoide.
Os dados das amplificações de cada amostra foram traduzidos por um software
específico (Sequence Detection System software, versão 2.1, PE Applied Biosystems) e
plotados em um gráfico (intensidade de fluorescência versus o número de ciclos). A
concentração “uso” de todos os iniciadores foi ajustada para 10M.
Para a detecção da fluorescência utilizou-se o corante Platinum SYBR Green qRT-PCR
SuperMix UDG (Invitrogen, Carlsbad, CA), que contém todos os componentes necessários
para a realização da PCR. Este corante apresenta alta especificidade de ligação à dupla fita de
cDNA, pois um grande número de moléculas do corante se liga ao DNA de dupla fita recém
sintetizado e o aumento na intensidade de fluorescência pode ser monitorado em tempo real.
Em adição, em cada reação foi adicionado um corante (ROX®), utilizado como
referência passiva. O experimento foi realizado com um volume final de reação de 10µl e as
amplificações dos genes, feitas em reações separadas. As condições de reações foram
estabelecidas para cada gene em particular. A curva de dissociação foi elaborada para
comprovar a especificidade da amplificação, com as seguintes condições: 1 ciclo de 95°C15s; 60°C-20s e 95°C-15s. Para garantir a ausência de contaminação, em cada amplificação
utilizou-se um controle negativo (ausência de cDNA) contendo os iniciadores do gene
amplificado.
4.4.5 Análise dos resultados
61
Os resultados foram analisados pelo método de Delta-Delta Ct (ΔΔCt) e do método da
curva-padrão. Este primeiro método normaliza a quantidade e a qualidade do RNA. Para cada
amostra, o valor de ΔCt foi determinado subtraindo a média das duplicatas dos valores de Ct
do gene de interesse, da média das duplicatas dos valores de Ct do gene referência.
Posteriormente, para determinar o ΔΔCt, o valor de ΔCt de cada amostra foi subtraído do
valor da média deΔCt das amostras normais. Esteú ltimo valor foi adicionado a fórmula 2(ΔΔCt) e o fold change computado, o qual se refere a quantidade de transcrito para cada
amostra (N vezes > ou < que o normal) determinada pela comparação com amostras de tecido
de tireoide normal.
Os valores médios obtidos dos Cts obtidos para os genes alvos e comparados com a
média dos Cts gene endógeno foram normalizados pela média das amostras normais e
resultando nos valores de QR (quantificação relativa) ou fold change, A diminuição de
expressão gênica foi considerada quando os valores de QR obtidos foram menores que 0,5
(QR≤0,5), e a expressão aumentada, quando os valores de QR foram superiores a 2,0
(QR>2,0).
4.4.6 Análise Estatística
As análises estatísticas para os dados de qRT-PCR foram realizadas utilizando-se o
software GraphPad InStat version 3.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA,
www.graphpad.com), incluindo o teste de Mann Whitney não paramétrico. Os resultados
foram considerados estatisticamente significantes com p≤0,05.
4.5 DIAGNÓSTICO HISTOPATOLÓGICO
Para confirmação dos resultados obtidos pela técnica de espectroscopia Raman
confocal e de biologia molecular, as amostras foram comparadas com o diagnóstico
histopatológico e os laudos assinados pelo médico patologista, o qual seguiu os critérios de
diagnóstico para câncer de tireoide da Sociedade Brasileira de Patologia (SBP). Todos os
resultados passaram pela revisão do Dr. Evandro Sobroza de Mello, médico patologista
responsável pelas amostras.
62
5
RESULTADOS
A seguir serão apresentados os resultados deste trabalho.
5.1 ESPECTROSCOPIA RAMAN
Neste estudo foi realizada a análise de 100 espectros obtidos de um total de 35
amostras de tecidos de tireoide normal, tecidos acometidos por bócio, carcinoma papilífero
(CPT) e carcinoma folicular (CFT).A análise realizada considerou os tipos histológicos
presentes nos resultados do laudo emitido sobre uma parte específica do tecido
microdissecado. Foram realizadas duas normalizações para a verificação das diferenças nos
resultados finais da caracterização dos tecidos: normalização vetorial, realizada em todo o
espectro (400 a 1800 cm-1) e a normalização pelo pico de 1450 cm-1. O processo de linha de
base foi realizado da mesma forma para todos os espectros.
Os resultados abaixo demonstrados representam a análise baseada no laudo histológico
da amostra. O espectro médio foi realizado a partir de todas as amostras classificadas
previamente pela histologia como sendo amostras provenientes de tecido normal, bócio,
tecidos com a presença de carcinomas papilíferos de tireoide (CPT) e carcinomas foliculares
de tireoide (CFT).Na figura 17 é apresentado o espectro médio normalizado vetorialmente
para cada tipo histológico analisado.
63
Figura 17: Espectros médios para o tecido normal, bócio, CPT e CFT.
Fonte: O autor.
As principais diferenças de intensidade foram visualizadas nas regiões de Amida I
(1506 a 1670 cm-1), Amida III (1200 a 1420 cm-1), regiões de variação angular normal dos
grupos CH2 e CH3 (1300 a 1400 cm-1), estando presente nestas três regiões componentes de
proteínas e lipídeos além da região de DNA/RNA (648 a 802 cm-1). Dentro destas regiões
observamos diversos picos que foram utilizados para a caracterização do tipo histológico. A
média espectral para o tecido normal, bócio, CPT e CFT são mostradas nas figuras 18, 19, 20
e 21, respectivamente. Na tabela 8 é mostrada a posição dos principais modos vibracionais
característicos e suas respectivas atribuições para os tecidos de tireoide.
64
Figura 18: Espectro médio para o grupo de amostras de tecido normal com os principais picos
marcados.
Fonte: O autor.
Figura 19: Espectro médio para o grupo bócio com os principais picos marcados.
Fonte: O autor.
65
Figura 20: Espectro médio para o grupo CPT com os principais picos marcados.
Fonte: O autor.
Figura 21: Espectro médio para o grupo CFT com principais picos marcados.
Fonte: O autor.
66
Tabela 8: Principais picos e atribuições encontrados para os tecidos tiroideanos.
PICOS (cm-1)
510
534
543
571
621
642
664
698
718
745
781
757
828
855
877
891
923
937
960
969
1003
1032
1064
1082
1101
1128
1158
1173
1208
1251
1257
1264
1271
1283
1301
1315
1341
1371
1398
1448
ATRIBUIÇÃO
υ(S-S) disulfide stretching banda de colágeno, υ(S-S) gauche-gauche-gauche (aminoácido cisteína)
Colesterol éster.
υ(S-S) trans-gauche-trans (aminoácido cisteína)
Triptofano, Citosina, Guanina
δ(C-C) twisting modos de fenilalanina (proteínas).
δ(C-C) twisting modos de tirosina, δ(C-C) twisting modos de fenilalanina (proteínas).
υ(C-S) stretching modos de cistina (colágeno tipo I), Timina, Guanina (ring breathing modos em
bases de DNA) Tirosina-G backboneem RNA.
Colesterol, Colesterol éster, υ(C-S) trans (aminoácido metionina).
υ(C-N) (fosfolipídios de membrana) / Adenina, CN-(CH3)3 (lipídeos).
Timina (ring breathing modos das bases de DNA/RNA), DNA.
Citosina /Uracila ring breathing (nucleotídeos), DNA/RNA, Timina.
Symmetric breathing de triptofano.
υ(O-P-O) stretch de DNA, ring breathing em tirosina, Prolina, Hidroxiprolina, Tirosina υ(PO2-)
stretchde ácidos nucleicos.
υ(C-O-C) skeletal modos de α-anomeros (polissacarídeos), Ring breathing em tirosina (proteínas),
Glicogênio, Prolina e υ(C-C) stretchem prolina.
υ(C-C-N+) symmetric stretching (lipídeos), δ(C-O-C) ring (carboidratos), Hidroxiprolina,
Triptofano.
Banda de proteínas, β-anomeros.
υ(C-C) stretch em prolina/glicose/ácido lático, υ(C-C), anel de pralina (colágeno).
Prolina (colágeno tipo I), Side chain vibrations de prolina e hidroxiprolina, υ(C-C) vibrações de
estruturas do colágeno, Glicogênio, υ(C-C) resíduos (a-helix),υ(C-C) stretching, υ(C-O-C)
glicosídeos (carboidratos), υ(C-C) stretching modos de prolina, valina e proteínas.
Carotenóides, Colesterol, Symmetric stretching vibration ofυ(PO43).
Grupos de fosfato monoester de proteínas fosforiladas e ácidos nucleicos.
Fenilalanina, υ(C-C) skeletal.
δ(HCH)(CH2, CH3) bending modo de colágeno e fosfolipídios, υ(C-C) skeletal stretch, δ(C-H) in
plane bending modos de fenilalanina, Resíduos de carboidratos de colágeno, Fenilalanina, υ(C-N)
stretchingde proteínas.
Skeletalυ(C-C)stretchde lipídeos, Acyl chains, υ(C-C) trans.
Resíduos de carboidratos de colágeno, Ácidos nucleicos, υ(C-N) stretching modos de proteína e
modos de lipídeos em menor quantidade, Grupos fosfodiéster em ácidos nucleicos, υ(C-C) gauche.
Vibrações em υ(C-C), υ(C-C) em lipídeos e ácidos graxos.
υ(C-N) stretching (proteínas), υ(C-O) stretching (carboidratos).
Lipídeos, υ(C-C)skeletal stretching,Chainυ(C-C)stretching (lipídeos), υ(PO2-)stretching
(DNA/RNA), υ(C-O), υ(C-C) stretching (carboidratos).
Citosina, Guanina, Tirosina (colágeno tipo I),Fenilalanina, δ(C-H) bend (proteínas).
υ(C-C6H5), Triptofano, Fenilalanina (proteínas), Adenina, Timina (ring breathing modos em bases
deDNA/RNA) - Amida III (proteínas).
Amida III, Guanina, Citosina δ(NH2).
Adenina, Timina (ring breathing modos em bases de DNA/RNA) - Amida III (proteínas), Lipídeos.
Triglicerídeos (ácidos graxos), Amida III do colágeno, υ(C-N), δ(N-H) Amida III, α-helix,
Triptofano (proteínas).
Amida III, υ(C-N) stretch de proteínas α-helix, Amida III bandas em proteínas, Fosfolipídios.
Amida III e δ(CH2) wagging vibrations de estruturas de glicina e vibrações de cadeia de prolina,
Colágeno, Ácidos nucleicos e fosfatos.
Triglicerídeos (ácidos graxos), δ(C-H) vibrações em lipídeos, δ (CH2) twisting (lipídeos), δ(CH2),
δ(CH3) twisting (colágeno), Amida III (proteínas), δ(CH2), δ(CH3) twisting or bending modos de
lipídeos/colágeno.
Guanina (B, Z-marker).
Modos em ácidos nucleicos, Colágeno, Guanina (DNA/RNA), δ(C-H) deformation (proteínas e
carboidratos).
A mais pronunciada banda de sacarídeos.
υ(C=O) symmetric stretch,δ(CH2) deformation.
δ(CH2), δ(CH3) deformation, Colágeno, δ(CH2) bending de lipídeos e proteínas, δ(CH2)
deformation (vibrações de proteínas) – um marcador da concentração de proteínas, δ(C-H)
vibrações em proteínas/lipídeos, δ(CH2) bending modos em tecidos cancerígenos.
67
1541
1557
1585
1606
1620
1664
1730
1750
Vibrações do grupo carbonila da amida e hidrogénios aromáticos.
Triptofano, υ(C=C) em porfirinas, Tirosina.
υ(C=C) olefinic stretch (proteínas), Fenilalanina, Hidroxiprolina, υ(C=C).
Citosina (NH2), Ringυ(C=C) stretchof phenyl, Fenilalanina, Tirosina, υ(C=C) (proteínas).
υ(C=C), Porfirinas.
Amida I, Amida I (proteínas), Amida I (colágeno), Lipídeos, υ(C=C) groups em ácidos graxos
insaturados, Ácidos nucleicos, DNA.
Grupo éster, υ(C=O), υ(C=O) stretching (lipídeos).
υ(C=O) stretch (lipídeos), υ(C=O) lipídeos em tecidos normais, Ácidos graxos.
Número de ondas está em um intervalo de confiança de ± 4 cm-1.
Fonte: Movasaghi, Rehman e Rehman (2007).
Na comparação entre os grupos histológicos, foram observadas variações de
intensidade nos espectros que possibilitam a diferenciação dos tecidos analisados. Esta
comparação foi realizada nos espectros normalizados vetorialmente do grupo normal em
relação as lesões de tireoide avaliadas (Figuras 22, 23 e 24).
Figura 22: Comparação entre o grupo normal e bócio por meio da média obtida de cada
grupo.
Fonte: O autor.
68
Figura 23: Comparação da média do grupo normal e CPT.
1448
Fonte: O autor.
Figura 24: Comparação da média dos grupos normal e CFT.
Fonte: O autor.
Por meio das diferenças de intensidades podemos caracterizar o tipo de tecido como
normal ou patológico. Na comparação entre os grupos de tecidos normais e de bócio, as
principais bandas que apresentaram um aumento de intensidade para o grupo bócio foram 650
69
a 757 cm-1 (DNA/RNA), 1306 a 1350 cm-1 (variação angular normal dos modos dos grupos
CH2, CH3) e 1564 a 1637 cm-1 (Amida I), estando as de 778 a 943 cm-1 (DNA/RNA) e 1020 a
1103 cm-1 [região envolvendo os picos de variação angular normal dos grupos CH3, CH2
modos de colágeno (1032 cm-1), lipídeos (1065 cm-1) e vibrações de fosfato e fosfolipídeos
(1180 cm-1)] com intensidades diminuídas. Para o grupo de tecidos normais e de CPT, as
bandas com aumento de intensidade em CPT foram 685 a 746 cm-1 (DNA/RNA), 1060 a 1130
cm-1 [contendo picos relacionados ao grupamento fosfodiéster em ácidos nucléicos (1085 cm1
), vibrações de estiramento υ(C-C) (1101 cm-1) e vibrações de estiramento υ(C-N) em
proteínas (1128 cm-1)], 1290 a 1350 cm-1 (Amida III) e 1564 a 1620 cm-1 (Amida I). Na
comparação entre os grupos normal e CFT encontramos aumentos de intensidade para o grupo
CFT nas bandas de 478 a 555 cm-1 [relacionadas aos picos de estiramento (S-S) dissulfeto em
colágeno (509 cm-1) ao estiramento (S-S) dissulfeto em proteínas (523 cm-1) e ao aminoácido
cisteína (540 cm-1) e a região de 1301 a 1350 cm-1 (Amida I)] com diminuição de intensidade
nas bandas 779 a 880 cm-1 (DNA/RNA), 1235 a 1292 cm-1 (amida I) e 1516 a 1586 cm-1
(amida III) (MOVASAGHI; REHMAN; REHMAN, 2007).
Na comparação entre os grupos dos tecidos acometidos pelas patologias foi realizada a
identificação dos principais picos, bem como a análise se apresentavam diminuição ou
aumento de intensidade. As atribuições destes picos estão listadas na tabela 7. No grupo de
amostras de bócio, os picos com um aumento de intensidade em relação ao CPT foram: 510,
622, 757, 855, 877, 923, 936, 958, 1003, 1032, 1208, 1555, 1620 e 1664 cm-1, estando estes
mesmos picos com intensidade diminuída no grupo de amostras de CPT. No que diz respeito
ao grupo CPT em relação ao grupo bócio, os picos com aumento de intensidade foram: 571,
644, 718, 781, 830, 891, 970, 1064, 1085, 1101, 1128, 1156, 1303, 1317, 1340, 1371, 1394,
1448, 1583 e 1747 cm-1, sendo que os mesmos se encontram diminuídos para o grupo bócio
(Figura 25).
70
Figura 25: Comparação da média dos grupos bócio e CPT.
1448
* Neste gráfico os picos marcados que se encontram aumentados para uma patologia estão
consequentemente diminuídos para a outra.
Fonte: O autor.
Na comparação do grupo bócio e CFT, uma comparação entre uma patologia benigna
e outra maligna, respectivamente, observou-se que para o grupo bócio os picos com aumento
de intensidade em relação ao CFT foram: 571, 664, 698, 746, 757, 922, 936, 969, 1103, 1158,
1251, 1264, 1555, 1583, 1606 e 1620 cm-1, sendo que estes mesmos picos apresentaram
intensidades diminuídas para o grupo CFT. Na avaliação do grupo CFT em relação ao bócio,
os picos com aumento de intensidade foram:510, 532, 621, 645, 830, 877, 892, 1031, 1064,
1082, 1317, 1340, 1371, 1396, 1448, 1664 e 1748 cm-1, sendo os mesmos picos diminuídos
para o grupo bócio (Figura 26).
71
Figura 26: Comparação da média do grupo bócio em relação ao grupo CFT.
* Os picos marcados com aumento de intensidade para um grupo consequentemente estão
diminuídos para o outro grupo comparado.
Fonte: O autor.
Em seguida à comparação do grupo de patologias benignas e malignas, realizou-se
uma comparação entre as duas patologias malignas, envolvendo os carcinomas papilífero e
folicular, para a identificação das principais diferenças de intensidades. Para o grupo CPT, foi
verificado os seguintes picos com um aumento de intensidade: 664, 720, 746, 781, 853, 970,
1064, 1086, 1101, 1128, 1156, 1252, 1283, 1303, 1557, 1583, 1604 e 1620 cm-1, sendo estes
picos diminuídos para o grupo CFT. Os picos encontrados com uma maior intensidade para o
grupo CFT foram: 510, 532, 621, 645, 877, 892, 920, 937, 960, 1031, 1208, 1448 e 1664 cm1
, cujas intensidades estavam diminuídas para o grupo CPT (Figura 27).
72
Figura 27: Comparação para os grupos CPT e CFT.
Os mesmos picos com aumento de intensidade para um grupo apresentam uma diminuição de
intensidade para o outro grupo de comparação.
Fonte: O autor.
Quando realizada a comparação entre as lesões, as principais bandas com aumento de
intensidade na comparação do grupo bócio versus CPT foram 1040 a 1131 cm-1 [picos
relacionados ao grupamento fosfodiéster em ácidos nucléicos (1085 cm-1), vibrações υ(C-C)
(1101 cm-1) e estiramento υ(C-N) em proteínas (1128 cm-1)], 1281 a 1397 cm-1 (Amida III) e
1565 a 1600 cm-1 (Amida I) para o grupo CPT, sendo as bandas 852 a 886 cm-1 [relacionada
ao aminoácido tirosina (854 cm-1) e estiramento simétrico υs(C-C-N+)em lipídeos (877 cm-1)]
aumentadas para o grupo bócio. Na comparação do grupo bócio versus CFT as bandas 1020 a
1099 cm-1 [contendo os picos de lipídeos (1064 cm-1) e ácidos nucléicos e colágeno (1082 cm1
)] e 1298 a 1383 cm-1 (Amida III) estavam aumentadas para o grupo CFT e as bandas 655 a
758 cm-1 (DNA/RNA), 1235 a 1280 cm-1 (Amida III) e 1509 a 1636 cm-1 (amida I),
aumentadas para o grupo bócio. Para a comparação entre os carcinomas CPT e CFT, as
bandas 659 a 751 cm-1 (DNA/RNA), 1055 a 1130 cm-1 [contendo picos relacionados a
lipídeos (1064 cm-1) ao grupamento fosfodiéster em ácidos nucléicos (1085 cm-1), vibrações
υ(C-C) (1101 cm-1) e estiramento υ(C-N) em proteínas (1128 cm-1)], 1238 a 1329 cm-1
(Amida III) e 1505 a 1622 cm-1 (Amida I) apresentaram aumento de intensidade para o grupo
73
CPT e as bandas 849 a 960 cm-1 [relacionadas ao aminoácido tirosina (854 cm-1), colágeno
(920 cm-1), aminoácido prolina (937 cm-1) e estiramento simétrico υs(C-C-N+)em lipídeos
(877 cm-1)], 995 a 1041 cm-1 [envolvendo o pico de fenilalanina (1003 e 1031 cm-1)]
aumentadas para o grupo CFT (MOVASAGHI; REHMAN; REHMAN, 2007).
5.1.1 Normalização Vetorial
Após todos os espectros serem normalizados vetorialmente no intervalo de 400 a 1800
cm-1, aplicou-se a análise multivariada conhecida como Análise de Componentes Principais
(PCA), para promover a separação espectral para fins de diagnóstico Esta análise tem como
fundamentação a separação dos dados espectrais em grupos por meio de grau de similaridade,
permitindo assim a discriminação entre os espectrospara fins de diagnóstico. A PCA, baseada
na comparação entre os dados de tecido normal, tecidos acometidos por bócio, amostras de
CPT e CFT, foi, realizada em todo o intervalo espectral, onde valores próprios para cada
componente foram obtidos, para determinar o grau de variação presente em cada componente
(Tabela 9).
Tabela 9: Eigenvalue PCA da comparação entre tecidos: normal, bócio e tumorais.
PCs
EIGENVALUE
VARIABILIDADE %
ACUMULADA %
PC1
0,07121
39,4*
---
PC2
0,03750
20,8
60,2
PC3
0,02079
11,5
71,7
PC4
0,01481
8,2
79,9
PC5
0,0067
3,8
83,7
PC6
0,0051
2,8
86,5
*PC1 corresponde a maior variação entre os grupos (39,4%).
Fonte: O autor.
O percentual de discriminação obtido por meio da técnica de Análise de Discriminante
Linear (LDA) para todos os grupos (normal, bócio, CPT e CFT) foi de 57%, ressaltando
assim a grande heterogeneidade entre os tecidos analisados. Comparações realizadas entre os
grupos de tecidos benignos (normal e bócio) versus malignos (CPT e CFT) apresentaram
resultados que variaram de 73,3 a 85,2%. No confronto isolado, na comparação dos grupos
CPT e CFT foi encontrado um percentual de discriminação de 84,6%; 85,2% na comparação
do grupo normal e CPT, 73,3% na comparação do grupo normal versus CFT, e 65,6% na
74
comparação entre o grupo normal versus bócio. A análise do grupo bócio versus CPT
permitiu uma discriminação de 81,8%, e quando comparado com o grupo CFT o valor de
discriminação obtido foi de, 82,6% (Tabela 10).
Tabela 10: Valores discriminatórios baseados no intervalo espectral de 400 a 1800 cm-1.
COMPARAÇÕES
DISCRIMINANTE %
Todas
57,0%
Normal x CPT
85,2%
Normal x CFT
73,3%
Normal x Bócio
65,6%
Bócio x CPT
81,8%
Bócio x CFT
82,6%
CPT x CFT
84,6%
Fonte: O autor.
A análise do loading plot, realizada na região de 400 a 1800 cm-1 por meio dos
resultados da PC1, com o objetivo de se obter regiões que discriminassem com uma maior
precisão os tipos histológicos, está demonstrada na Figura 28.
Figura 28: Loading plot da PC1, obtida de todo o intervalo espectral.
*Para todas as amostras normalizadas vetorialmente, representando os principais picos que contribuem
para a discriminação entre os grupos analisados.
Fonte: O autor.
75
Desta forma, a análise de loading plot permitiu a identificação das regiões que
poderiam contribuir para uma melhor diferenciação entre os tecidos e consequentemente
melhorar os valores de discriminação. Baseados nesta nova análise, diferentes regiões foram
escolhidas para a discriminação entre os tecidos, sendo a região de 780 a 1140 cm-1 na
discriminação entre todos os grupos, a região de 1180 a 1720 cm-1 para o grupo normal versus
bócio, normal versus CFT e bócio versus CPT. Porém, para a comparação dos grupos CPT
versus CFT, bócio versus CFT e normal e CPT, nenhuma região obteve valores
discriminantes maiores do que a comparação realizada em todo o intervalo espectral.
Após a escolha destas novas regiões, foi novamente realizado a técnica de PCA entre
os grupos, cujos valores de discriminação são listados na Tabela 11. A distribuição das
amostras de cada grupo pode ser visualizada por meio dos scatterplots (Figura 29).
Tabela 11: Valores discriminatórios após a escolha de novas regiões espectrais.
COMPARAÇÕES
DISCRIMINANTE %
Todas
63,0%
Normal x CPT
85,2%
Normal x CFT
82,2%
Normal x Bócio
77,0%
Bócio x CPT
85,5%
Bócio x CFT
82,6%
CPT x CFT
84,6%
Fonte: O autor.
Figura 29: Scatterplots das comparações realizadas pela análise de PCA.
Scatterplot of PC1 vs PC3
Scatterplot of PC1 vs PC2
0,4
Legenda:
CPT
NORMA L
0,3
0,2
0,2
0,1
0,1
0,0
0,0
PC1
PC1
Legenda:
BOCIO
CFT
0,3
-0,1
-0,1
-0,2
-0,2
-0,3
-0,3
-0,4
-0,4
-0,5
-0,5
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
PC3
0,2
0,3
0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
PC2
0,2
0,3
0,4
76
Scatterplot of PC1 vs PC2
Scatterplot of PC1 vs PC2
0,5
0,4
0,3
0,3
0,2
0,2
0,1
Legenda:
CFT
NORMA L
0,4
PC1
PC1
0,5
Legenda:
BOCIO
CPT
0,1
0,0
0,0
-0,1
-0,1
-0,2
-0,2
-0,3
-0,3
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
PC2
0,2
0,3
-0,6
0,4
-0,5
Legenda:
BOCIO
NORMA L
0,3
-0,2
-0,1
PC2
0,0
0,1
0,2
0,3
Legenda:
CFT
CPT
0,50
0,25
0,2
0,1
PC1
PC1
-0,3
Scatterplot of PC1 vs PC2
Scatterplot of PC1 vs PC3
0,4
-0,4
0,00
0,0
-0,1
-0,25
-0,2
-0,50
-0,3
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
PC3
0,1
0,2
0,3
0,4
-0,5
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
PC2
*Sobre os espectros normalizados vetorialmente. No gráfico observa-se sempre a comparação
entre PCs. A disposição dos scatterplots na ordem da esquerda para a direita é: CPT versus
normal; bócio versus CFT, bócio versus CPT; CFT versus normal; bócio versus normal; CPT
versusCFT.
Fonte: O autor.
Após a análise de PCA e LDA, foi realizado a Análise Hierárquica de Cluster (HCA),
pela qual foi possível verificar a separação de cada amostra em clusters baseados na
similaridade das amostras. Para cada comparação foi aplicado o método HCA, cujo intervalo
espectral foi o selecionado a partir da análise do loading plot da região de 400-1800 cm-1. A
análise partiu da comparação de todos os grupos, seguidas da comparação entre as amostras
normais e patologias, lesões benignas e malignas e somente entre as neoplasias malignas. Os
resultados das análises de cluster obtidos para estas comparações são visualizados na Figura
30 (a-g).
NORMAL 4N1
NORMAL 4N2
NORMAL 6N3
NORMAL 6N4
NORMAL 44N4
CPT 22T4
NORMAL 6N2
NORMAL 38N2
NORMAL 32N3
CPT 16T2
CPT 11T2
CPT 12T3
CPT 16T3
CPT 13T2
CPT 22T3
NORMAL 4N4
CPT 46T3
NORMAL 44N1
NORMAL 38N4
CPT 46T2
NORMAL 38N1
NORMAL 39N1
NORMAL 57N2
NORMAL 12N1
NORMAL 59N1
CPT 12T2
CPT 22T1
NORMAL 12N2
CPT 11T4
CPT 19T3
CPT 19T4
CPT 33T1
CPT 46T5
CPT 35T2
CPT 46T4
NORMAL 6N5
NORMAL 30N2
NORMAL 32N2
CPT 33T3
NORMAL 32N1
NORMAL 30N3
NORMAL 32N4
NORMAL 44N2
NORMAL 44N3
CPT 33T2
NORMAL 30N1
NORMAL 57N1
NORMAL 57N3
NORMAL 12N3
NORMAL 12N4
CPT 13N1
CPT 13N2
CPT 13N4
CPT 19T2
Similaridade
NORMAL 4N1
BOCIO 18N4
NORMAL 4N2
CPT 22T4
NORMAL 39N1
NORMAL 57N2
NORMAL 6N2
NORMAL 6N3
BOCIO 18N3
BOCIO 18T6
NORMAL 12N1
NORMAL 12N2
NORMAL 12N3
BOCIO 29T4
NORMAL 12N4
NORMAL 6N4
BOCIO 17T2
BOCIO 39T2
CFT 41T2
CPT 12T3
CPT 13T2
CPT 16T3
CPT 16T2
NORMAL 38N2
NORMAL 59N1
CPT 22T3
CPT 11T2
CPT 13N1
CFT 23T1
NORMAL 32N3
CFT 23T4
NORMAL 57N1
NORMAL 57N3
NORMAL 44N4
CFT 41T1
CFT 28T4
BOCIO 17T1
NORMAL 4N4
BOCIO 3N6
CPT 46T3
NORMAL 30N1
NORMAL 38N1
BOCIO 20T1
NORMAL 30N3
BOCIO 10T2
BOCIO 10T3
BOCIO 20T3
NORMAL 32N4
NORMAL 44N1
CFT 31T8
CFT 31T6
CPT 46T2
CFT 41T3
NORMAL 6N5
BOCIO 10T5
CPT 46T4
BOCIO 18T3
NORMAL 30N2
NORMAL 32N1
NORMAL 32N2
BOCIO 10T1
CPT 33T3
BOCIO 39T3
BOCIO 39T1
BOCIO 39T4
NORMAL 44N2
BOCIO 3N5
NORMAL 44N3
BOCIO 17T5
CFT 61T1
CFT 61T4
BOCIO 20T2
BOCIO 3N2
CFT 28T3
CFT 61T3
CPT 33T1
CPT 46T5
CFT 28T1
CFT 61T2
CPT 33T2
CFT 28T2
NORMAL 38N4
BOCIO 20T4
CPT 11T4
CPT 35T2
BOCIO 17T3
CPT 12T2
CPT 22T1
CPT 19T3
BOCIO 3N4
CPT 19T2
CPT 19T4
BOCIO 3T2
BOCIO 3T4
BOCIO 3T3
BOCIO 18T4
CPT 13N2
CPT 13N4
BOCIO 29T2
BOCIO 53T3
Similaridade
77
Figura 30: Resultados obtidos pela análise de cluster (normalização vetorial).
A
Dendrogram
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
-1490,69
-960,46
-430,23
CLUSTER 5
CLUSTER 1
B
CLUSTER 2
100,00
CLUSTER 3
CLUSTER 4
Variáveis
Comparação entre o grupo normal e CPT na região espectral de 400 a 1800 cm-1.
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
Dendrograma - Normal vs CPT
-459,62
-273,08
-86,54
100,00
Variáveis
Comparação entre o grupo normal e CFT na região espectral de 1180 a 1720 cm-1.
D
NORMAL 4N1
NORMAL 6N2
NORMAL 6N4
NORMAL 39N1
NORMAL 57N2
NORMAL 38N1
NORMAL 4N4
BOCIO 3N6
NORMAL 44N1
BOCIO 20T1
NORMAL 4N2
NORMAL 6N3
BOCIO 17T2
BOCIO 39T2
NORMAL 32N3
BOCIO 18N3
BOCIO 18N4
BOCIO 18T6
NORMAL 38N2
NORMAL 44N4
NORMAL 12N1
NORMAL 12N2
NORMAL 59N1
BOCIO 18T3
BOCIO 17T1
BOCIO 20T2
BOCIO 17T3
BOCIO 20T4
NORMAL 38N4
BOCIO 10T3
BOCIO 20T3
NORMAL 44N2
NORMAL 44N3
BOCIO 3N5
BOCIO 17T5
BOCIO 3N2
BOCIO 10T2
NORMAL 6N5
NORMAL 32N1
BOCIO 10T1
BOCIO 39T1
BOCIO 39T4
BOCIO 39T3
BOCIO 53T3
NORMAL 12N3
BOCIO 18T4
NORMAL 30N2
NORMAL 32N2
BOCIO 3T2
BOCIO 3T4
BOCIO 3N4
BOCIO 3T3
BOCIO 10T5
NORMAL 12N4
BOCIO 29T4
NORMAL 30N3
NORMAL 32N4
BOCIO 29T2
NORMAL 30N1
NORMAL 57N1
NORMAL 57N3
Similairdade
Variáveis
Comparação entre grupo bócio e CPT na região espectral de 1180 a 1720 cm-1.
NORMAL 57N1
NORMAL 57N3
NORMAL 30N1
NORMAL 12N4
NORMAL 32N1
NORMAL 12N3
NORMAL 32N2
CLUSTER 2
NORMAL 6N5
NORMAL 30N2
CFT 41T3
NORMAL 32N4
CFT 61T4
NORMAL 30N3
CFT 61T1
NORMAL 44N2
NORMAL 44N3
NORMAL 38N4
CFT 31T6
NORMAL 44N1
CFT 31T8
NORMAL 4N4
CFT 41T2
CFT 41T1
CFT 28T4
NORMAL 44N4
CFT 28T2
NORMAL 38N2
CFT 61T3
CFT 28T3
CFT 28T1
CFT 61T2
CFT 23T4
NORMAL 59N1
CFT 23T1
NORMAL 12N2
NORMAL 12N1
C
NORMAL 6N3
NORMAL 32N3
NORMAL 4N2
NORMAL 57N2
NORMAL 38N1
NORMAL 39N1
NORMAL 6N4
NORMAL 4N1
NORMAL 6N2
Similaridade
78
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
Dendrograma - Normal vs CFT
-327,83
-185,22
CLUSTER 1
-42,61
CLUSTER 3
100,00
Variáveis
Comparação entre grupo normal e bócio na região espectral de 1180 a 1720 cm-1.
Dendrograma - Normal vs Bócio
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
-823,16
-515,44
-207,72
CLUSTER 1
CLUSTER 2
CLUSTER 3
100,00
Variáveis
Comparação entre o grupo CPT e CFT na região espectral de 400 a 1800 cm-1.
BOCIO 53T3
CFT 23T1
BOCIO 39T3
BOCIO 18T3
BOCIO 39T4
BOCIO 10T5
BOCIO 29T4
BOCIO 10T1
BOCIO 39T1
BOCIO 18T4
BOCIO 29T2
BOCIO 3T4
BOCIO 3T3
CLUSTER 2
BOCIO 3N4
BOCIO 3T2
BOCIO 18T6
BOCIO 18N4
CFT 23T4
BOCIO 18N3
CFT 41T1
CFT 41T2
BOCIO 39T2
CFT 28T4
BOCIO 17T1
BOCIO 17T2
CFT 41T3
CFT 31T6
CLUSTER 1
BOCIO 20T3
CFT 31T8
BOCIO 20T1
BOCIO 10T3
CFT 28T2
BOCIO 3N6
-94,17
CFT 28T3
CFT 61T3
BOCIO 3N2
BOCIO 10T2
BOCIO 3N5
BOCIO 17T5
BOCIO 10T3
BOCIO 20T3
CPT 46T2
BOCIO 3N6
BOCIO 20T1
CPT 46T3
BOCIO 17T1
BOCIO 20T4
CPT 12T2
BOCIO 17T3
BOCIO 20T2
CPT 11T4
CPT 19T3
BOCIO 17T2
CPT 16T2
BOCIO 39T2
CPT 13T2
CPT 12T3
CPT 16T3
CPT 22T1
CPT 22T3
CPT 22T4
BOCIO 18N3
BOCIO 18T6
BOCIO 18N4
CPT 11T2
CPT 13N1
BOCIO 3N4
BOCIO 3T2
BOCIO 3T4
CPT 13N4
BOCIO 18T4
BOCIO 3T3
CPT 13N2
CPT 19T2
BOCIO 29T2
BOCIO 29T4
BOCIO 10T1
CPT 33T3
CPT 33T2
BOCIO 10T5
BOCIO 39T1
BOCIO 39T4
CPT 35T2
CPT 46T4
BOCIO 18T3
BOCIO 39T3
CPT 46T5
BOCIO 53T3
CPT 19T4
CPT 33T1
Similaridade
E
CFT 28T1
CFT 61T2
F
BOCIO 17T3
BOCIO 20T4
CFT 61T1
CFT 61T4
BOCIO 20T2
BOCIO 3N5
BOCIO 17T5
BOCIO 3N2
BOCIO 10T2
Similaridade
79
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
Dendrograma - Bócio vs CPT
-699,84
-433,23
-166,61
CLUSTER 3
100,00
Variáveis
Comparação entre o grupo bócio e CFT na região espectral de 400 a 1800 cm-1.
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
Dendrograma - Bócio vs CFT
-482,50
-288,33
CLUSTER 1
CLUSTER 2
CLUSTER 3
100,00
80
Dendrograma - CPT vs CFT
G
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
Similaridade
-352,88
-201,92
CLUSTER 2
-50,96
CLUSTER 3
CLUSTER 1
CPT 11T2
CPT 16T2
CPT 12T3
CPT 16T3
CPT 13T2
CPT 22T3
CFT 23T4
CPT 22T4
CFT 41T1
CFT 41T2
CFT 28T4
CPT 11T4
CPT 12T2
CPT 22T1
CPT 19T3
CFT 28T1
CFT 61T2
CFT 28T3
CFT 61T3
CFT 61T1
CFT 61T4
CFT 28T2
CPT 46T2
CFT 31T8
CPT 46T3
CFT 41T3
CFT 31T6
CPT 13N1
CPT 13N2
CPT 13N4
CPT 19T2
CPT 19T4
CPT 33T1
CPT 46T5
CPT 35T2
CPT 46T4
CFT 23T1
CPT 33T2
CPT 33T3
100,00
Variáveis
* Análise de cluster nas amostras normalizadas vetorialmente comparando os grupos de tecido
normal, bócio, CPT e CFT. A: Comparação realizada entre todas as amostras no intervalo
espectral de 780 a 1140 cm-1; B: Grupo normal versus CPT (intervalo de 400 a 1800 cm-1); C:
Grupo normal e CFT (intervalo de 1180 a 1720 cm-1); D: Grupo normal versus bócio
(intervalo de 1180 a 1720 cm-1); E: Grupo bócio versus CPT (intervalo de 1180 a 1720 cm-1);
F: Grupo bócio e CFT (intervalo de 400 a 1800 cm-1); Grupo CPT e CFT (intervalo de 400 a
1800 cm-1).CPT: carcinoma papilífero de tireoide; CFT: Carcinoma folicular de tireoide.
Comparação de todas as amostras (normal, bócio CPT e CFT) na região espectral de 780 a 1140 cm1.
Fontes: O autor.
Pela análise de cluster foi realizada a classificação dos espectros baseando-se nas
semelhanças entre os tecidos classificados pelo laudo histológico. Na comparação entre todos
os grupos (figura 30A) nenhum cluster foi formado completamente por apenas um tipo
histológico, porém no cluster 1 (vermelho) verifica-se uma concentração de 93,3% de
espectros de amostras benignas (14 espectros) e somente um espectro de amostra maligna
(6,7%). No cluster 2 (azul) 57,2% são referentes a espectros de amostras malignas e 42,8% de
amostras benignas; no cluster 3 (verde) foi encontrado 68,75% de espectros de amostras
benignas e 31,25% de amostras malignas. No cluster 4 (laranja) foi encontrado 57,2% de
espectros de amostras benignas e 42,8% de espectros de amostras malignas e no cluster 5
(rosa), observa-se 52,6% de espectros obtidos de amostras benignas e de 47,4% de amostras
malignas.
Para a análise do grupo normal versus CPT (figura 30B), o cluster 1 (vermelho)
apresentou 15 espectros, sendo oito de tecidos normais (53,4%) e sete de CPT (46,6%), porém
81
dentro deste grande cluster observa-se a formação de outros dois clusters menores, onde
houve somente um espectro obtido de CPT entre os espectros normais e um espectro obtido
de tecido normal entre os espectros de CPT. No cluster 2 (verde) observa-se 20 espectros,
sendo nove obtidos de tecido normal (45%) e 11 de CPT (55%). Novamente dentro deste
grande cluster outros três espectros foram formados, sendo um deles formado somente por
espectros de CPT. No cluster 3 (azul) foram obtidos 19 espectros, sendo 13 referentes a
tecidos normais (68,4%) e seis de CPT (31,6%). Observa-se que dois clusters foram formados
dentro do grande cluster, sendo que apenas dois espectros referentes a amostras normais
estiveram entre as amostras de CPT e dois espectros de CPT estiveram entre os espectros
normais.
A análise dos clusters entre o grupo normal versus CFT (figura 30C) apresentou
24espectros dentro do cluster 1 (vermelho), sendo 14 normais (58,3%) e 10 referentes a CFT
(41,7%). Dentro deste cluster, outros dois foram criados, onde em um cluster hásomente a
presença de amostras normais e no outro, foram observados quatro clusters menores, sendo
que em três houve total separação dos espectros normais em relação aos espectros obtidos de
CFT. No cluster 2 (verde) foi observado a presença de 12 espectros, sendo sete de amostras
normais (58,3%) e cinco de amostras de CFT (41,7%) e no cluster 3 (azul), nove espectros
foram encontrados e todos foram provenientes de tecido normal (100%).
Na comparação entre tecido normal versus bócio (figura 30D), no cluster 1 (vermelho)
foram observados 28 espectros sendo 16 oriundos de tecidos normais (57,1%) e 12 de bócios
(42,9%). No cluster 2 (azul) foram visualizados nove espectros, sendo três obtidos de tecidos
normais (33,4%) e seis de bócios (66,6%). Dentro do cluster 3 (verde) foram observados 24
espectros, sendo 11 referentes a tecidos normais (45,8%) e 13 provenientes de amostras de
bócios (54,2%). Para todos os clusters formados nesta comparação, foram formadosclusters
menores, onde se observou a completa separação entre tecidos normais e de bócio dentro de
cada um deles.
Na comparação entre bócio versus CPT (figura 30E), foi encontrado no cluster 1
(vermelho) 17 espectros, sendo 12 referentes a amostras de bócio (70,5%) e cinco de CPT
(29,5%) e no cluster 2 (azul) foi detectado a presença de 14 espectros, compreendendo cinco
de amostras de bócio (35,7%) e nove de CPT (64,3%). Para o cluster 3 (verde) foi observado
24 espectros, sendo 14 provenientes de bócio (58,3%) e 10 de CPT (41,7%). Na análise dos
clusters menores também foram visualizadas 100% de separação entre bócio e CPT.
A análise do grupo bócio versus CFT (figura 30F) apresentou importantes separações.
No cluster 1 (vermelho) foi observado 21 espectros, compreendendo 11 provenientes de
82
bócios (52,4%) e 10 de CFT (47,6%) e no cluster 2 (azul) foi observado 10 espectros, sendo
seis referentes a bócios (60%) e quatro a CFT (40%). No cluster 3 (verde) foram encontrados
15 espectros, onde 14 foram provenientes de bócio (93,4%) e apenas um de CFT (6,6%),
demonstrando uma excelente separação.
Pela análise do grupo CPT versus CFT (figura 30G), foi observado 11 espectros no
cluster 1 (vermelho), sendo sete referentes a CPT (63,6%) e quatro a CFT (36,4%), além da
formação de dois clusters menores, onde apenas um espectro de CPT estava entre a amostras
de CFT e um espectro de CFT estava presente entre as amostras de CPT. No cluster 2 (verde)
16 espectros foram visualizados, onde seis eram CPT (37,5%) e 10 de CFT (62,5%). Além
disso, dos três menores clusters presentes, dois apresentaram total separação para amostras de
CPT e de CFT. No cluster 3 (azul) foi encontrado 12 espectros, sendo 11 referentes a CPT
(91,6%) e um proveniente de CFT (8,4%), caracterizando assim uma boa classificação.
5.1.2 Normalização pelo Pico de 1450 cm-1
As mesmas análises foram realizadas para os espectros normalizados pelo pico de
maior intensidade, 1450 cm-1, com a finalidade de se verificar se o tipo de normalização
poderia influenciar nos resultados de discriminação para as amostras de tecido de tireoide. Os
valores obtidos pela análise de PCA estão descritos na Tabela 12.
Tabela 12: Eigenvalue PCA da comparação entre tecidos: normal, bócio e tumorais.
PCs
EIGENVALUE
VARIABILIDADE
ACUMULADA
PC1
0,14348
44,2
---
PC2
0,06757
20,8
65,0
PC3
0,04566
14,1
79,1
PC4
0,01899
5,9
85,0
PC5
0,01433
4,4
89,4
PC6
0,00888
2,7
92,1
Fonte: O autor.
A análise de LDA, aplicada após o processo de PCA para verificar a discriminação
entre os grupos, resultou na discriminação de 57% para todos os grupos confrontados juntos.
Na comparação do grupo normal versus CPT, o valor discriminante foi de 88,9%, para o
normal e CFT e normal e bócio, os percentuais de discriminação foram de 73,3% e 67,2%,
83
respectivamente. Quando se comparou os grupos bócio versus CPT, foi obtida uma
discriminação de 78,2% e de 80,4% para o grupo bócio versus CFT, sendo que na
comparação dos grupos tumorais, CPT versus CFT, a discriminação foi de 82,1% (Tabela 13).
Tabela 13: Valores discriminatórios baseados no intervalo espectral de 400 a 1800 cm-1.
COMPARAÇÕES
DISCRIMINANTE %
Todas
57,0%
Normal x CPT
88,9%
Normal x CFT
73,3%
Normal x Bócio
67,2%
Bócio x CPT
78,2%
Bócio x CFT
80,4%
CPT x CFT
82,1%
Fonte: O autor.
Diante de alguns valores com baixa discriminação entre alguns grupos, foi realizado o
loading plot da PC1 obtida anteriormente com o objetivo de se verificar áreas mais
específicas e que poderiam contribuir para uma melhor separação e discriminação entre as
amostras (Figura 31).
Figura 31: Loading plot da PC1, obtida de todo o intervalo espectral.
* para todas as amostras normalizadas pelo pico de 1450 cm-1, demonstrando os principais picos que
contribuem para a discriminação entre os grupos.
Fonte: O autor.
84
Após ter sido feita a análise do loading plot, novas regiões foram determinadas para
ser aplicada na discriminação entre os tecidos. As regiões que poderiam apresentar melhores
resultados foram a de 1500 a 1700 cm-1 para a comparação de todos os grupos, a região de
1180 a 1430 cm-1 para a comparação do grupo normal versus bócio, a de 940 a 1180 cm-1 para
os grupos de amostras normais e CPT, a de 600 a 930 cm-1 para os grupos de amostras
normais e CFT. Para a comparação entre bócio e CPT, a região escolhida foi a de 1500 a 1700
cm-1, na comparação do grupo bócio versus CFT, a região foi a de 1180 a 1430 cm-1 e para o
grupo CPT versus CFT, a região determinada foi a de 400 a 1800 cm-1. Determinadas as
regiões, uma nova análise de PCA e de LDA foi realizada com os mesmos objetivos de
separação e discriminação dos grupos, respectivamente (Tabela 14).
Tabela 14: Valores discriminatórios após a escolha de novas regiões espectrais.
COMPARAÇÕES
DISCRIMINANTE %
61%
Todas
Normal x CPT
88,9%
Normal x CFT
91,1%
Normal x Bócio
77,0%
Bócio x CPT
83,6%
Bócio x CFT
84,8%
CPT x CFT
82,1%
Fonte: O autor.
A fim de proporcionar uma melhor visualização da separação encontrada por meio da
análise de LDA, foi construído o scatterplot para cada comparação (Figura 32).
Figura 32: Scatterplots das comparações realizadas pela análise de PCA.
Scatterplot of PC1 vs PC2
Scatterplot of PC1 vs PC4
0,4
Legenda:
CPT
NORMA L
0,3
0,2
0,1
0,2
0,0
PC1
PC1
0,1
0,0
-0,1
-0,2
-0,1
-0,3
-0,2
-0,4
-0,5
-0,3
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
PC4
0,1
0,2
0,3
0,4
Legenda:
BOCIO
CFT
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
PC2
0,1
0,2
0,3
85
Scatterplot of PC3 vs PC6
Scatterplot of PC2 vs PC4
0,4
0,2
0,3
0,1
0,2
0,0
0,1
-0,1
PC3
PC2
Legenda:
CFT
NORMA L
-0,2
0,0
-0,1
-0,3
-0,4
-0,2
Legenda:
BOCIO
CPT
-0,5
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
-0,3
-0,3
0,6
-0,2
-0,1
0,0
PC4
0,5
0,3
0,4
0,5
Legenda:
CFT
CPT
0,4
0,1
0,3
0,0
0,2
-0,1
PC2
PC3
0,2
0,2
Scatterplot of PC2 vs PC4
Scatterplot of PC3 vs PC4
Legenda:
BOCIO
NORMA L
0,3
0,1
PC6
-0,2
0,1
0,0
-0,3
-0,1
-0,4
-0,2
-0,5
-0,3
-0,6
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
PC4
0,1
0,2
0,3
-0,4
-0,3
-0,2
-0,1
0,0
PC4
0,1
0,2
0,3
0,4
*Sobre os dados normalizados pelo pico de 1450 cm-1. No gráfico observa-se sempre a
comparação entre PCs. A disposição dos scatterplots na ordem da esquerda para a direita é:
CPT versus normal; bócio versus CFT, bócio versus CPT; CFT versus normal; bócio versus
normal; CPT versusCFT.
Fonte: O autor.
A Análise Hierárquica de Cluster (HCA), realizada sobre as novas regiões escolhidas
por meio da análise do loading plot (400-1800 cm-1) demonstrou disposição das amostras em
cada cluster baseados na similaridade entre as mesmas. As comparações foram feitas com
todos os grupos, seguidas da comparação entre as amostras normais e patologias, lesões
benignas e malignas e somente entre as neoplasias malignas. Os resultados das análises de
cluster obtidos para estas comparações são mostrados na Figura 33(a-g).
B
NORMAL 4N1
NORMAL 4N2
NORMAL 39N1
NORMAL 57N2
NORMAL 6N3
NORMAL 12N2
CPT 22T4
NORMAL 12N1
NORMAL 59N1
CPT 22T1
CPT 12T2
NORMAL 6N4
NORMAL 32N3
NORMAL 44N4
NORMAL 38N2
CPT 12T3
CPT 16T2
CPT 13T2
CPT 16T3
CPT 11T2
CPT 13N1
CPT 22T3
NORMAL 4N4
CPT 46T3
CPT 46T2
NORMAL 6N2
NORMAL 30N1
NORMAL 38N1
NORMAL 12N3
NORMAL 12N4
CPT 13N2
CPT 13N4
CPT 19T2
CPT 11T4
CPT 35T2
CPT 19T3
CPT 19T4
NORMAL 6N5
NORMAL 57N1
NORMAL 57N3
NORMAL 30N2
NORMAL 32N1
NORMAL 32N2
CPT 33T2
CPT 33T3
CPT 33T1
CPT 46T5
CPT 46T4
NORMAL 30N3
NORMAL 32N4
NORMAL 44N1
NORMAL 38N4
NORMAL 44N2
NORMAL 44N3
Similaridade
NORMAL 4N1
NORMAL 39N1
NORMAL 57N2
NORMAL 6N4
NORMAL 6N2
NORMAL 6N3
CFT 28T2
NORMAL 44N4
CFT 28T4
BOCIO 17T2
NORMAL 4N2
NORMAL 12N2
CPT 16T3
NORMAL 59N1
CPT 12T3
CPT 13T2
CPT 22T1
NORMAL 12N1
BOCIO 18T3
CPT 19T4
CPT 33T1
NORMAL 32N3
CFT 41T2
BOCIO 18N3
BOCIO 18T6
CFT 41T1
BOCIO 18N4
NORMAL 38N2
BOCIO 39T2
CPT 16T2
CPT 22T4
CPT 11T2
CPT 13N1
CPT 13N2
CPT 19T2
CPT 22T3
NORMAL 6N5
NORMAL 32N1
BOCIO 10T1
BOCIO 10T5
NORMAL 57N1
NORMAL 57N3
CPT 46T4
NORMAL 12N3
BOCIO 3N4
BOCIO 3T2
BOCIO 3T4
CPT 13N4
NORMAL 30N2
NORMAL 32N2
BOCIO 3T3
BOCIO 18T4
NORMAL 12N4
BOCIO 29T4
BOCIO 29T2
BOCIO 39T1
BOCIO 39T4
CPT 33T2
CPT 33T3
BOCIO 53T3
CPT 46T5
CFT 23T1
CFT 23T4
CPT 35T2
NORMAL 4N4
BOCIO 3N6
CPT 46T3
NORMAL 38N1
NORMAL 44N1
BOCIO 20T3
BOCIO 20T1
NORMAL 38N4
CFT 31T8
CFT 41T3
BOCIO 10T3
CPT 46T2
CFT 31T6
NORMAL 44N2
NORMAL 44N3
BOCIO 3N5
BOCIO 17T5
BOCIO 10T2
CFT 61T1
CFT 61T4
NORMAL 30N1
NORMAL 30N3
NORMAL 32N4
BOCIO 3N2
CFT 28T3
CFT 28T1
BOCIO 39T3
BOCIO 17T1
BOCIO 20T2
CFT 61T2
BOCIO 17T3
BOCIO 20T4
CPT 11T4
CPT 12T2
CFT 61T3
CPT 19T3
Similaridade
86
Figura 33: Resultados obtidos pela análise de cluster (normalização pico 1450 cm-1).
Comparação entre todas as amostras (normal, bócio CPT e CFT) na região espectral de 1500 a 1700
cm-1.
A
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
Dendrograma
-1365,94
-877,29
-388,65
CLUSTER 1
CLUSTER 5
CLUSTER 2
CLUSTER 3
-177,51
CLUSTER 4
100,00
Variáveis
Comparação entre grupo normal e CPT na região espectral de 940 a 1180 cm-1.
Dendrograma - Normal vs CPT
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
-732,53
-455,02
CLUSTER 2
CLUSTER 1
CLUSTER 3
100,00
Variáveis
D
-136,53
NORMAL 4N1
BOCIO 18N4
NORMAL 39N1
BOCIO 18T6
NORMAL 57N2
BOCIO 18N3
NORMAL 4N2
NORMAL 12N2
NORMAL 4N4
BOCIO 3N6
NORMAL 6N2
NORMAL 38N1
NORMAL 6N3
NORMAL 6N4
NORMAL 32N3
BOCIO 17T2
NORMAL 12N1
NORMAL 59N1
BOCIO 17T1
BOCIO 39T2
NORMAL 6N5
NORMAL 32N1
BOCIO 10T1
BOCIO 39T1
NORMAL 38N4
NORMAL 44N2
NORMAL 44N3
BOCIO 3N5
BOCIO 17T5
BOCIO 39T3
BOCIO 39T4
NORMAL 38N2
NORMAL 44N4
BOCIO 3N2
NORMAL 44N1
BOCIO 20T1
BOCIO 10T3
BOCIO 20T3
BOCIO 10T2
BOCIO 17T3
BOCIO 20T4
BOCIO 20T2
BOCIO 18T3
NORMAL 12N3
BOCIO 29T2
NORMAL 12N4
BOCIO 29T4
NORMAL 30N3
NORMAL 32N4
NORMAL 30N2
NORMAL 32N2
BOCIO 3T3
BOCIO 10T5
BOCIO 3N4
BOCIO 3T2
BOCIO 3T4
BOCIO 18T4
NORMAL 30N1
NORMAL 57N1
NORMAL 57N3
BOCIO 53T3
Similaridade
CLUSTER 1
Variáveis
NORMAL 38N2
NORMAL 59N1
NORMAL 12N4
CFT 23T1
CFT 61T2
NORMAL 12N1
CFT 61T3
CFT 28T2
CFT 28T3
CFT 28T1
NORMAL 32N2
NORMAL 6N5
NORMAL 30N2
CFT 61T1
CFT 61T4
NORMAL 44N3
NORMAL 44N2
NORMAL 32N1
CFT 31T6
CFT 41T3
CFT 31T8
NORMAL 44N1
NORMAL 30N3
NORMAL 32N4
CLUSTER 1
NORMAL 12N3
NORMAL 57N3
CFT 23T4
NORMAL 57N1
NORMAL 32N3
CFT 28T4
NORMAL 38N4
CFT 41T1
CFT 41T2
NORMAL 44N4
NORMAL 6N4
NORMAL 6N3
C
NORMAL 6N2
NORMAL 30N1
NORMAL 38N1
NORMAL 39N1
NORMAL 57N2
NORMAL 4N2
NORMAL 12N2
NORMAL 4N1
NORMAL 4N4
Similaridade
87
Comparação entre grupo normal e CFT na região espectral de 600 a 930 cm-1.
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
Dendrograma - Normal vs CFT
-575,26
-350,18
-125,09
CLUSTER 2
CLUSTER 3
100,00
Variáveis
Comparação entre grupo normal e bócio na região espectral de 1180 a 1430 cm-1.
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
Dendrograma - Normal vs Bócio
-609,59
-373,06
CLUSTER 2
CLUSTER 3
100,00
Variáveis
BOCIO 18N4
BOCIO 18T6
BOCIO 20T1
BOCIO 18N3
BOCIO 10T3
BOCIO 20T3
BOCIO 3N6
CFT 31T8
CFT 41T3
CLUSTER 1
CFT 23T1
CFT 23T4
BOCIO 10T5
BOCIO 53T3
BOCIO 10T1
BOCIO 39T1
BOCIO 29T2
BOCIO 29T4
BOCIO 18T4
BOCIO 3T3
BOCIO 3T2
BOCIO 3T4
BOCIO 18T3
BOCIO 3N4
-221,98
BOCIO 20T4
BOCIO 20T2
BOCIO 17T2
BOCIO 17T3
BOCIO 17T1
BOCIO 39T2
CFT 41T2
CFT 31T6
CFT 28T4
CFT 41T1
-112,61
BOCIO 39T3
BOCIO 39T4
BOCIO 3N2
BOCIO 10T2
BOCIO 3N5
BOCIO 20T1
BOCIO 20T3
BOCIO 17T5
BOCIO 3N6
CPT 46T3
BOCIO 10T3
CPT 46T2
BOCIO 17T1
BOCIO 20T2
BOCIO 20T4
CPT 11T4
BOCIO 17T3
CPT 12T2
CPT 19T3
BOCIO 3N4
BOCIO 3T2
BOCIO 3T4
CPT 13N4
BOCIO 3T3
BOCIO 18T4
CPT 46T4
CPT 11T2
CPT 13N1
CPT 13N2
CPT 19T2
CPT 22T3
CPT 19T4
CPT 33T1
BOCIO 10T1
BOCIO 39T1
BOCIO 39T4
CPT 33T2
CPT 33T3
BOCIO 29T2
BOCIO 29T4
BOCIO 10T5
BOCIO 39T3
BOCIO 53T3
CPT 46T5
CPT 35T2
BOCIO 17T2
CPT 16T3
BOCIO 18T3
CPT 12T3
CPT 13T2
CPT 22T1
BOCIO 18N3
BOCIO 18T6
BOCIO 18N4
BOCIO 39T2
CPT 16T2
CPT 22T4
Similaridade
E
CFT 61T1
CFT 61T4
F
BOCIO 3N5
BOCIO 17T5
CFT 61T2
CFT 61T3
BOCIO 10T2
CFT 28T2
CFT 28T3
BOCIO 3N2
CFT 28T1
Similaridade
88
Comparação entre grupo bócio e CPT na região de 1500 a 1700 cm-1.
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
Dendrograma - Bócio vs CPT
-865,93
-543,96
CLUSTER 2
CLUSTER 3
100,00
Variáveis
Comparação entre grupo bócio e CFT na região espectral de 1180 a 1430 cm-1.
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
Dendrograma - Bócio vs CFT
-537,83
-325,22
CLUSTER 1
CLUSTER 2
CLUSTER 3
100,00
89
Comparação entre grupo CPT e CFT na região espectral de 400 a 1800 cm-1.
Dendrograma - CPT vs CFT
G
Ward Linkage; Correlation Coefficient Distance
Similaridade
-331,62
-187,75
CLUSTER 2
-43,87
CLUSTER 1
CLUSTER 3
CPT 11T2
CPT 13N1
CFT 23T4
CPT 12T3
CPT 13T2
CPT 16T2
CPT 16T3
CPT 22T3
CPT 22T4
CFT 28T4
CFT 41T1
CFT 41T2
CPT 11T4
CPT 19T3
CPT 12T2
CPT 22T1
CFT 28T1
CFT 61T2
CFT 28T3
CFT 61T3
CFT 28T2
CPT 46T2
CFT 31T8
CFT 41T3
CPT 46T3
CFT 31T6
CFT 61T1
CFT 61T4
CPT 13N2
CPT 13N4
CPT 19T2
CPT 19T4
CPT 33T1
CPT 46T5
CPT 35T2
CPT 46T4
CFT 23T1
CPT 33T2
CPT 33T3
100,00
Variáveis
* Análise de cluster nas amostras normalizadas pelo pico de 1450 cm-1comparando os grupos
de tecido normal, bócio, CPT e CFT. A: Comparação realizada entre todas as amostras no
intervalo espectral de 1500 a 1700 cm-1; B: Grupo normal versus CPT (intervalo de 940 a
1180 cm-1); C: Grupo normal e CFT (intervalo de 600 a 930 cm-1); D: Grupo normal versus
bócio (intervalo de 1180 a 1430 cm-1); E: Grupo bócio versus CPT (intervalo de 1500 a 1700
cm-1); F: Grupo bócio e CFT (intervalo de 1180 a 1430 cm-1); Grupo CPT e CFT (intervalo de
400 a 1800 cm-1).CPT: carcinoma papilífero de tireoide; CFT: Carcinoma folicular de tireoide.
Fonte: O autor.
A análise de cluster dos espectros normalizados pelo pico de 1450 cm-1nos permitiu
observar posições diferentes quanto à separação dos espectros nos clusters, porém as amostras
que se misturavam com outros tipos histológicos se mantiveram de acordo com a comparação
realizada para os espectros normalizados vetorialmente.
Na comparação entre todos os grupos (Figura 33A), observamos que não houve
separações entre grupos em um cluster específico. Porém foi observado que no cluster 1
(vermelho), dos 21 espectros presentes 13 eram provenientes de tecidos benignos (61,9%) e 8
de malignos (38,1%). No segundo cluster (laranja), 15 espectros foram visualizadas sendo 6
benignos (40%) e 9 malignos (60%), para o cluster 3 (azul), 18 espectros estiveram presentes
e 16 destes foram classificados pela histologia como benignos (88,8%) e dois como malignos
(11,2%). No cluster 4 (rosa) encontramos 10 espectros, onde seis eram malignos (60%) e 4
90
benignos (40%); no cluster 5 (verde), 36 espectros foram observados, sendo 22 de tecidos
benignos (61,1%) e 14 de tecidos malignos (38,9%).
Para a análise do grupo normal versus CPT (Figura 33B), no cluster 1 (vermelho)
foram observados 22 espectros, sendo 12 normais (54,5%) e 10 CPT (45,5%) e no cluster 2
(verde) dos 15 espectros, 6 eram normais (40%) e 9 CPT (60%). Para o cluster 3 (azul), dos
17 espectros presentes 12 eram referentes ao tecido normal (70,5%) e 5 ao CPT (29,5%).
Clusters menores foram visualizados e na maioria houve discriminação entre os tecidos.
Na análise de cluster do grupo normal versus CFT, 20 espectros foram visualizados no
cluster 1 (vermelho), onde 16 eram normais (80%) e 4 CFT (20%); dois clusters menores
foram observados dentro deste grande cluster, sendo que em um deles há total separação para
espectros normais. No cluster 2 (azul) houve 12 espectros, sendo 7 de tecido normal (58,3%)
e 5 CFT (41,7%) e no cluster 3 (verde), dos 13 espectros presentes, 7 foram normais (53,8%)
e 6 CFT (46,2%).
Para a comparação entre o grupo normal e bócio, no cluster 1 (vermelho) foi
observado 20 espectros, onde 13 foram normais (65%) e 7 bócio (35%). No cluster 2 (verde)
dos 23 espectros presentes, 8 eram de tecidos normais (34,7%) e 15 eram de bócio (65,3%) e
neste grande cluster dois clusters menores foram observados, sendo que um deles apenas um
espectro normal impediu a separação completa dos espectros de bócio. No cluster 3 (azul), 18
espectros foram observados, sendo 9 normais (50%) e 9 bócios (50%).
Para a análise de cluster do grupo bócio versus CPT, no cluster 1 (vermelho) dos 17
espectros presentes, 12 eram referentes ao tecido de bócio (70,5%) e 5 CPT (29,5%), sendo
observado neste cluster, grande similaridade entre os espectros. No cluster 2 (verde) 26
espectros foram visualizados, onde13 foram obtidos de bócio e 13 CPT, representando 50%
para ambas; neste caso, clusters menores foram observados onde houve discriminação total
para o grupo CPT. Na análise do cluster 3 (azul), 12 espectros foram classificados como bócio
(50%) e 6 CPT (50%).
Para os grupos bócio e CFT, foi observado no cluster 1 (vermelho) 24 espectros, sendo
13 de bócio (54,1%) e 11 referentes a CFT (45,9%) e neste grande cluster quatro menores
foram observados, sendo que em um deles houve a separação total para as amostras de bócio.
No cluster 2 (verde) dos 13 espectros presentes, apenas 2 foram classificados como CFT
(15,4%) estando localizadas em um cluster menor separado, porém mantendo um grau de
similaridade com os 11 espectros de bócio (84,6%) presentes. No cluster 3 (azul) 9 espectros
foram visualizados, sendo 7 de tecido de bócio (77,7%) e 2 de CFT (22,3%).
91
Na análise de cluster do grupo CPT versus CFT, o cluster 1 (vermelho) obteve 12
espectros, onde 8 foram classificadas como CPT e 4 como CFT (33,4%) e ao observarmos os
três menores clusters, percebemos somente à presença de espectros de CPT em um deles. Para
o cluster 2 (verde), dos 16 espectros visualizados, 6 foram referentes a CPT (37,5%) e 10 CFT
(62,5%) e nos clusters menores, houve separação completa para espectros de CPT e CFT. No
cluster 3 (azul) houve a presença de 11 espectros, sendo 10 classificados como CPT (90,9%) e
apenas 1 como CFT (9,1%), demonstrando que neste cluster somente uma amostra foi
agrupada em outro grupo histológico.
Considerando todos os clusters analisados pelos dois tipos de normalizações
aplicadas,os espectros referentes às amostras que apresentaram uma classificação não
esperada quando comparadas com os resultados histopatológicos, sejam pela normalização
vetorial ou pela normalização pelo pico de 1450 cm-1,são justificados pela grande
heterogeneidade observada em tecidos biológicos. Esta heterogeneidade fez com durante a
análise Raman fosse analisado a bioquímica do tipo histológico pesquisado bem como a
bioquímica de regiões normais ou pouco alteradas. Desta forma, o local de escolha para a
aplicação do laser foi decisiva para a separação de nossos espectros na análise de cluster, uma
vez que não foi possível escolher pontos que tivessem um único tipo histológico e que fossem
similares para todas as amostras.
Pela comparação dos resultados de discriminação obtidos das regiões específicas pelos
dois tipos de normalizações aplicadas foram identificadas diferenças sutis na discriminação
final dos tipos histológicos. Foram realizadas as análises de PCA e LDA sobre as regiões
escolhidas pela normalização vetorial que melhor contribuíram para a discriminação dos
tecidos sobre os espectros normalizados pelo pico de 1450 cm-1. Verificou-se uma menor
discriminação dos tecidos em três regiões analisadas: 780 a 1140 cm-1, na comparação entre
todas as amostras; 1180 a 1720 cm-1: na comparação entre tecido normal versus bócio e
normal versus CFT; e 400 a 1800 cm-1: na comparação entre bócio versus CFT. Contudo, um
maior valor discriminante foi verificado na região de 1180 a 1720 cm-1 para o grupo bócio
versus CPT e um mesmo valor discriminatório nas regiões de 400 a 1800 cm-1 para o grupo
normal versus CPT e CPT versus CFT (Tabela 15).
Tabela 15: Valores de discriminação para as regiões encontradas pela normalização vetorial
sobre espectros normalizados pelo pico de 1450 cm-1.
COMPARAÇÕES
Todos
REGIÕES (cm-1)
780 a 1140
NOVOS
VALORES**
58%
VALORES***
NORM. PICO 1450 cm-1
61%
92
Normal x Bócio
1180 a 1720
75,4%
77%
Normal x CPT
1500 a 1700
88,9%
88,9%
Normal x CFT
1180 a 1720
73,3%
91,1%
Bócio x CPT
400 a 1800
87,3%
83,6%
Bócio x CFT
400 a 1800
80,4%
84,8%
CPT x CFT
400 a 1800
82,1%
82,1%
**Valores encontrados pela nova análise de PCA e LDA sobre os espectros normalizados pelo pico de
maior intensidade (1450 cm-1);
*** Valores de discriminação encontrados pela normalização pelo pico de 1450 cm-1 para simples
comparação com os novos valores encontrados.
Fonte: O autor.
Na aplicação das melhores regiões discriminantes encontradas pela normalização pelo
pico de 1450 cm-1 sobre os espectros normalizados vetorialmente também não foi observado
importantes mudanças em relação aos valores de discriminação entre os tecidos. Porém, foi
visualizado um aumento nos valores discriminatórios para algumas regiões (940 a 1180 cm-1,
600 a 930 cm-1 e 1180 a 1430 cm-1). Para a região de 1500 a 1700 cm-1 houve uma
diminuição na discriminação na comparação de todas as amostras e entre bócio e CPT.
Nenhuma mudança foi encontrada na região de 1180 a 1430 cm-1 na comparação entre os
tecidos de normal e bócio e na região de 400 a 1800 cm-1 na comparação entre CPT e CFT,
cujos valores se mantiveram os mesmos. Aumentos no valor de discriminação foram
visualizados nas regiões de 940 a 1180 cm-1 para o grupo normal versus CPT, 600 a 930 para
o grupo normal versus CFT e região de 1180 a 1430 para o grupo bócio versus CFT (Tabela
16).
Tabela 16: Valores de discriminação para as regiões encontradas pela normalização pelo pico
de 1450 cm-1 sobre espectros normalizados vetorialmente.
COMPARAÇÕES
REGIÕES (cm-1)
Todos
1500 a 1700
NOVOS
VALORES**
59%
VALORES***
NORM. VETORIAL
63%
Normal x Bócio
1180 a 1430
77%
77%
Normal x CPT
940 a 1180
88,9%
85,2%
Normal x CFT
600 a 930
91,1%
82,2%
Bócio x CPT
1500 a 1700
80%
85,5%
Bócio x CFT
1180 a 1430
84,8%
82,6%
CPT x CFT
400 a 1800
84,6%
84,6%
**Valores encontrados pela nova análise de PCA e LDA sobre os espectros normalizados
vetorialmente;
*** Valores de discriminação encontrados pela normalização vetorial para simples comparação com
os novos valores encontrados.
93
Fonte: O autor.
5.2 ANÁLISE DE EXPRESSÃO GÊNICA
Neste estudo foram avaliados seis genes pela técnica de qRT-PCR, sendo eles: TPO,
TG, LGALS3, TFF3, PDGFB e SERPINA1, em 33 amostras de tecidos de tireoide,
classificadas histologicamente como tecido normal (4 amostras), bócio (14 amostras), CPT
(11 amostras) e CFT (4 amostras). Os RNAs extraídos de todas as amostras foram
quantificados e, dependendo da quantidade de tecido utilizada, apresentaram concentrações
variando entre 160ng e 3800ng, possibilitando que a síntese de cDNA fosse realizada. As
razões 260/230 e 260/280 apresentaram valores superiores a 1,8, o que representa a ausência
de contaminação por reagentes e proteínas, respectivamente (Tabela 17). A avaliação da
integridade do RNA extraído das 33 amostras também foi avaliada pela eletroforese em gel de
agarose, cujos RNAs apresentaram bandas 18S e 28S bem definidas e com ausência de
degradação (Figura 34).
Tabela 17: Valores relacionados a concentração e razões dos RNAs extraídos.
CONCENTRAÇÃO
RAZÃO
RAZÃO
(ng/ul)
260/280 nm
260/230 nm
4T
1418,76
1,98
2,26
5T
208,87
1,91
2,04
6T
737,51
1,98
2,26
7N
1003,68
1,96
2,25
8N
476,70
1,94
2,17
11T
1104,78
1,97
2,22
12T
734,11
1,96
2,19
13T
782,13
2,11
2,00
16T
1447,94
2,08
2,08
18N
510,74
1,95
1,80
19T
3863,07
1,89
1,66
20T
1731,11
2,03
2,21
22T
503,94
1,91
2,28
25T
686,05
1,90
2,20
28T
332,81
1,91
2,10
29T
295,24
1,79
1,83
30T
471,26
1,79
2,14
30N
307,29
1,84
1,95
31T
153,04
1,74
1,85
33T
1033,02
1,88
2,20
AMOSTRA
94
34T
194,19
1,78
1,56
36T
676,52
1,82
2,28
39T
747,52
1,89
2,28
41T
197,73
1,74
1,52
44T
543,65
1,87
2,22
44N
302,00
1,78
2,24
46T
3670,49
1,80
2,12
51N
503,94
1,84
2,34
53T
552,13
1,87
2,16
52T
924,36
1,85
2,32
57T
300,81
1,75
1,85
58T
317,27
1,79
1,50
61T
304,78
1,84
2,14
Fonte: O autor.
Figura 34: Eletroforese em gel de agarose para amostras de RNA.
Ladder
18N20T 4T 5T
6T 11T 12T 13T 16T 8N 7N
* Amostras de RNA extraídas do tecido de tireoide em gel de agarose a 1,5% em Tris-BoratoEDTA 1X (TBE) corado com brometo de etídeo. Ladder: padrão de peso molecular de 100pb.
Fonte: O autor.
A análise da curva padrão foi realizada para todos os genes TPO, TG, LGALS3, TFF3,
PDGFB e SERPINA1e para o endógeno PPIA, o que possibilitou a determinação da eficiência
de amplificação dos primers e a obtenção da melhor diluição da amostra a ser utilizada. Por
esta análise, com exceção do gene TG, foi obtido valores do slope próximos de -3,32,
representando assim a boa eficiência de amplificação dos primers utilizados. A eficiência das
reações (E=10-1/slope -1) para cada primer está apresentada na Tabela 18.
95
Tabela 18: Valores obtidos pela curva padrão demonstrando a eficiência dos primers pelos
valores de slope e coeficiente de linearidade (R2).
GENE
SLOPE
COEFICIENTE DE
LINEARIDADE (R2)
EFICIÊNCIA
TPO
-3,57
0,99
0,90
TG
-4,28
0,99
0,71
PDGFB
-3,28
0,99
1,00
LGALS3
-3,43
1,00
0,94
TFF3
-3,30
0,99
1,00
SERPINA1
-3,39
0,99
0,97
PPIA
-3,61
0,99
0,89
Fonte: O autor.
A curva-padrão para os seis genes e do gene referência PPIA estão apresentadas na
(Figura 35 (a-g)).As curvas de dissociação, que demonstrouausência de produtos
inespecíficose de primer dimers estão apresentadas na Figura 36 (a-g).As curvas de
amplificação estão representadas na Figura 37 (a-g).
Figura 35: Curva padrão para os genes SERPINA1(A), TFF3, LGALS3(C), TG(D), PDGFB
(E), (F) e PPIA(G).
96
97
*Realizada com amostra de pool de cDNA nas seguintes diluições: 1000, 200, 40, 8 e
1,6ng/µl. No gráfico standard curve é mostrado a concentração de cDNA utilizada versus
ciclo de amplificação e no amplification plot, o número de ciclos versus intensidade da
fluorescência.
Fonte: O autor.
Figura 36: Curva de dissociação para os genes: SERPINA1(A),TFF3(B),LGALS3(C),
TG(D),PDGFB(E),TPO(F) e PPIA(G).
98
*No gráfico é mostrado a temperatura do pico de amplificação característico para o gene
analisado (melt curve) versus a intensidade da fluorescência.
Fonte: O autor.
99
Figura 37: Curvas de amplificação para os genes SERPINA1(A),TFF3B, LGALS3(C), TG
(D),PDGFB(E), TPO(F) e PPIA(G).
.
No gráfico é mostrado o número de ciclos versus intensidade da fluorescência.
Fonte: O autor.
100
Na tabela 19 estão apresentados os valores de QR (quantificação relativa) obtida para
todos os genes e amostras avaliadas. A diminuição de expressão gênica em relação ao tecido
normal foi considerada quando os valores de QR obtidos foram menores que 0,5 (QR<0,5), e
a expressão aumentada, quando os valores de QR foram superiores a 2,0 (QR>2,0).
Para o gene TG, foi encontrado expressão aumentada em relação ao tecido normal em
duas amostras do grupo bócio (QR: 4,56 a 5,51) e em cinco amostras do grupo CPT (QR: 2,24
a 8,49). A diminuição de expressão foi detectada em 12 amostras do grupo bócio (QR: 0,0 a
0,06), em quatro amostras do grupo CPT (QR: 0,01) e em todas as amostras do grupo CFT
(QR: 0,01 a 0,02). Expressões normais foram observadas somente em duas amostras do grupo
CPT (QR: 0,92 a 1,77) (Tabela 19). No total, 85,70% das amostras de bócio apresentaram
diminuição de expressão e 14,30% apresentaram aumento. Para o grupo de CPT, 45,40%
apresentaram aumento de expressão, 27,30% mostraram diminuição e 27,30% apresentaram
expressão normal. Para o grupo CFT, 100% das amostras apresentaram expressão reduzida
(Tabela 20).
Na análise realizada para o gene TPO foi encontrado um aumento de expressão para
apenas uma amostra do grupo CPT (QR: 5,19). Expressões diminuídas foram encontradas em
doze amostras do grupo bócio (QR: 0,01 a 0,21), em sete amostras do grupo CPT (QR: 0,0 a
0,12) e em quatro amostras do CFT (QR: 0,02 a 0,40) e valores normais foram observados em
duas amostras do grupo bócio (QR: 1,30 a 1,57) e em três amostras do grupo CPT (QR: 0,80 a
1,23) (Tabela 19). No total, 85,70% das amostras do grupo bócio apresentaram uma expressão
diminuída, e 14,30% com expressão normal. Para o gene CPT foi observado 63,60% de
diminuição de expressão, 9,10% das amostras com aumento de expressão e 27,30% com
expressividade normal. Para o grupo CFT, 100% das amostras apresentaram expressão
reduzida (Tabela 20).
Para o gene PDGFB, foram encontrados aumentos de expressão para quatro amostras
do grupo CPT (QR: 2,17 a 4,69) e em uma amostra do grupo bócio (QR: 3,54). Expressões
diminuídas foram observadas em dez amostras do grupo bócio (QR: 0,0 a 0,30), em três
amostras do grupo CPT (QR: 0,0 a 0,06) e em todas as amostras do grupo CFT (QR: 0,02 a
0,05). Níveis de expressão normal foram observados em uma amostra do grupo bócio (QR:
1,96) e em quatro amostras do grupo CPT (QR: 0,62 a 1,71) (Tabela 19). Para o grupo bócio,
83,40% das amostras apresentaram uma baixa expressividade, 8,30% um aumento e 8,30%
expressão normal. Para o grupo CPT foi observado 27,20% de amostras com expressão
diminuída, 36,40% de expressão aumentada e 36,40% com expressão normal. Para o grupo
CFT, 100% das amostras apresentaram expressão reduzida (Tabela 20).
101
Nos resultados obtidos para o gene SERPINA1, percebemos expressões aumentadas
para nove amostras do grupo CPT (QR: 3,83 a 4004,79) e em três amostras do grupo bócio
(QR: 2,49 a 1073,05). Diminuições de expressão foram encontradas em todas as amostras do
grupo CFT (QR: 0,03 a 0,35), em nove amostras do grupo bócio (QR: 0,02 a 0,45) e em duas
amostras do grupo CPT (QR: 0,0 a 0,09). Valores com expressão normal foram obtidos em
apenas uma amostra do grupo bócio (QR: 0,63)(Tabela 19). No total, 69,20% das amostras de
bócio apresentaram uma diminuição de expressão, 23,10% apresentaram um aumento e
7,70% apresentaram expressão normal. Para o grupo CPT, 18,20% das amostras apresentaram
uma baixa expressividade e 81,80% uma expressão aumentada. Para o grupo CFT, 100% das
amostras apresentaram expressão reduzida (Tabela 20).
Para o gene TFF3, foi observado um aumento de expressão em todas as amostras do
grupo bócio (QR: 2,41 a 13,49) e do grupo CFT (QR: 5,16 a 11,34) e em oito amostras do
grupo CPT (QR: 2,68 a 17,27). Valores de expressão diminuída foram encontrados em apenas
uma amostra do grupo CPT (QR: 0,43) e expressões normais também só foram obtidas de
duas amostras do grupo CPT (QR: 1,48 a 1,94) (Tabela 19). Para as amostras do grupo bócio,
foi encontrado 100% de expressão aumentada. No total, 9% das amostras do grupo CPT
apresentaram diminuição de expressão, 72,80% aumento de expressão e 18,20% expressão
normal. Para o grupo CFT, 100% das amostras apresentaram expressão aumentada (Tabela
20).
Foi encontrado para o gene LGALS3, um total de apenas três amostras com expressão
aumentada para o grupo CPT (QR: 2,77 a 8,31). Valores de expressão diminuída foram
observadas para todas as amostras do grupo CFT (QR: 0,08 a 0,33), para doze amostras do
grupo bócio (QR: 0,01 a 0,06) e em seis amostras para o grupo CPT (QR: 0,0 a 0,23). Valores
com expressão normal foram encontrados em duas amostras para o grupo CPT (QR: 0,57 a
0,87) (Tabela 19). No total, 85,70% das amostras do grupo bócio apresentaram diminuição de
expressão e 14,30% expressão normal. Para o grupo CPT, foi encontrada uma expressão
diminuída em 54,50% das amostras, um aumento de expressão em 45,40% e uma expressão
normal em 27,30%. Para o grupo CFT, 100% das amostras apresentaram expressão reduzida
(Tabela 20).
102
Tabela 19: Valores de QR obtidos para todas as amostras e genes.
AMOSTRA
TG
TPO
PDGFB
SERPINA1
TFF3
LGALS3
BÓCIO
18N
5,51
1,57
3,54
1073,05
2,98
1,51
20T
4,56
1,30
1,96
87,88
2,90
1,19
25T
0,00
0,01
0,03
2,49
3,86
0,05
29T
0,00
0,01
0,07
0,63
3,17
0,06
30T
0,00
0,04
0,02
0,09
2,74
0,02
34T
0,06
0,21
0,30
0,02
13,49
0,04
36T
0,00
0,02
0,00
0,09
3,10
0,01
39T
0,00
0,12
0,05
0,14
3,78
0,03
44T
0,00
0,06
0,00
0,13
5,85
0,03
51N
0,01
0,04
0,08
0,25
3,06
0,04
52T
0,01
0,01
0,00
0,17
2,41
0,01
53T
0,02
0,04
0,05
0,02
3,25
0,06
57T
0,00
0,01
NR
NR
2,70
0,03
58T
0,00
0,05
NR
0,45
12,20
0,04
CPT
12T
8,49
5,19
4,69
29,29
17,27
8,31
13T
4,83
1,23
4,67
830,31
3,50
7,47
5T
4,65
0,94
2,62
3,83
3,41
2,77
16T
2,55
0,80
2,17
500,59
2,91
0,87
6T
2,24
0,12
1,71
561,25
2,89
0,57
11T
1,77
0,02
1,17
17,42
8,16
0,17
19T
0,92
0,01
0,69
4004,76
2,68
0,16
46T
0,00
0,00
0,62
2473,78
4,28
0,10
33T
0,01
0,05
0,01
4,83
1,94
0,00
22T
0,01
0,00
0,00
0,00
1,48
0,05
4T
0,01
0,00
0,06
0,09
0,43
0,23
CFT
28T
0,01
0,02
0,05
0,06
11,34
0,15
31T
0,01
0,04
0,03
0,03
5,16
0,08
41T
0,01
0,03
0,02
0,27
8,84
0,33
61T
0,02
0,40
0,04
0,35
6,7
0,21
CPT: carcinoma papilífero de tireoide; CFT: carcinoma folicular de tireoide; em azul: aumento de
expressão (QR>2,0), em vermelho: diminuição de intensidade (QR≤0,5) em preto: valores normais
(QR entre 0,5 e 2,0). NR: não realizado.
Fonte: O autor.
103
Quando comparado o percentual de amostras que apresentaram expressão diferencial
em cada grupo avaliado foi observada diferenças entre os grupos. Para o grupo de amostras de
bócio, os genes TG, TPO, PDGFB, SERPINA1, TFF3 e LGALS3 apresentaram expressão
reduzida em uma maior porcentagem de amostras (QR≤0,5) e o gene TFF3 expressão
aumentada (QR>2,0) em relação às amostras de tecido normal. Para o grupo de CPT,os genes
TPO e LGALS3,apresentaram expressão reduzida em um maior número de amostras, os genes
TG, TFF3e SERPINA1apresentaram expressão aumentada e o gene PDGFB apresentou uma
porcentagem igual de amostras com expressão normal e elevada em relação ao tecido normal.
Para o grupo de CFT, foi observada a diminuição de expressão para todos os genes em relação
ao tecido normal, exceto para o gene TFF3. [Tabela 20 (a-c)].
Tabela 20: Percentual de aumento e diminuição de expressão para os genes.
Gene TG
A
Gene TPO
Normal
↑ expressão
↓ expressão
0
14,30%
85,70%
CPT
27,30%
45,40%
CFT
0
0
BOCIO
Normal
↑ expressão
↓ expressão
BOCIO
14,30%
0
85,70%
27,30%
CPT
27,30%
9,10%
63,60%
100%
CFT
0
0
100%
B
Gene PDGFB
Gene SERPINA1
Normal
↑ expressão
↓ expressão
Normal
↑ expressão
↓ expressão
BOCIO
8,30%
8,30%
83,40%
BOCIO
7,70%
23,10%
69,20%
CPT
36,40%
36,40%
27,20%
CPT
0
81,80%
18,20%
CFT
0
0
100%
CFT
0
0
100%
C
Gene TFF3
Gene LGALS3
Normal
↑ expressão
↓ expressão
0
100%
0
CPT
18,20%
72,80%
CFT
0
100%
BOCIO
Normal
↑ expressão
↓ expressão
BOCIO
14,30%
0
85,70%
9%
CPT
18,20%
27,30%
54,50%
0
CFT
0
0
100%
CPT: carcinoma papilífero de tireoide, CFT: carcinoma folicular de tireoide.
Fonte: O autor.
Com o objetivo de identificar os diferentes tipos de lesões de tireoide e validar os
resultados obtidos pela análise Raman, foi realizada a análise de expressão de genes
considerados candidatos a marcadores moleculares na literatura. Para isso, foram realizadas
104
comparações entre os diferentes grupos de tecidos avaliados. A primeira análise realizada foi
entre o grupo bócio e CPT, seguida da comparação entre bócio e CFT e por último entre os
grupos CPT e CFT. Estes resultados estão apresentados nas figuras 38, 39 e 40,
respectivamente (teste de Mann Whitney,P ≤0,05).
Figura 38: Resultados obtidos pelo teste de Mann Whitney não paramétrico para a
comparação entre o grupo bócio versus CPT.
Fonte
*Comparação entre as médias dos níveis de expressão por qRT-PCR dos genes SERPINA1,
TFF3,LGALS3, TG, PDGFB, TPO para o grupo de amostras de bócio versus CPT.QR:
quantificação relativa do gene; CPT: carcinoma papilífero de tireoide; CFT: carcinoma
folicular de tireoide. No gráfico a linha tracejada corresponde ao intervalo dos valores de fold
change (intervalo de 0,5 a 2,0) considerados normais, onde valores superiores ao intervalo
representam aumento de expressão e abaixo da linha, diminuição de expressão. As linhas
contínuas entre as amostras correspondem a média dos valores de QR para cada grupo. Os
valores relacionados ao nível de expressão (QR) foram plotados em uma escala logarítmica de
10. Resultados obtidos pelo teste de Mann Whitney não paramétrico, com valores
significativos de P ≤0,05.
Fonte: O autor.
105
Figura 39: Resultados obtidos pelo teste de Mann Whitney não paramétrico para a
comparação entre o grupo bócio versus CFT.
*Comparação entre as médias dos níveis de expressão por qRT-PCR dos genes
SERPINA1,TFF3, LGALS3, TG, PDGFB,TPO para o grupo de amostras de bócio versus CFT.
QR: quantificação relativa do gene; CPT: carcinoma papilífero de tireoide; CFT: carcinoma
folicular de tireoide. Resultados obtidos pelo teste de Mann Whitney não paramétrico, com
valores significativos de P ≤0,05.
Fonte: O autor.
Figura 40: Resultados obtidos pelo teste de Mann Whitney não paramétrico para a
comparação entre o grupo CPT versus CFT .
106
* Comparação entre as médias dos níveis de expressão por qRT-PCR dos genes
SERPINA1,TFF3,LGALS3, TG, PDGFB, TPO para o grupo de CPT versus CFT. QR:
quantificação relativa do gene; CPT: carcinoma papilífero de tireoide; CFT: carcinoma
folicular de tireoide. Resultados obtidos pelo teste de Mann Whitney não paramétrico, com
valores significativos de P ≤0,05.
Fonte: O autor.
Nas comparações de expressão gênica realizadas nas 29 amostras entre os grupos
bócio, CPT e CFT foram detectadas diferenças estatisticamente significativas para quatro
genes (TG, SERPINA1, TFF3e LGALS3), tendência de expressão diferencial para um gene
(PDGFB) e ausência de expressão diferencial significativa para um gene (TPO) em todas as
comparações realizadas (Tabela 21).
Na análise do gene TG foi observada uma diferença estatisticamente significativa na
comparação do grupo bócio versus CPT (P = 0,0195). Nenhuma diferença significativa foi
encontrada nas comparações do grupo bócio versus CFT (P = 0,3114) e do grupo CPT versus
CFT (P = 0,1775). Para o gene TPO, nenhuma diferença significativa foi encontrada na
comparação do grupo bócio versus CPT (P = 0,9561), do grupo bócio versus CFT (P =
0,9572) e do grupo CPT versus CFT (P = 1,000). Na análise dos grupos para o gene PDGFB,
nenhuma diferença significativa foi obtida na comparação dos grupos bócio versus CFT (P =
0,5825), CPT versus CFT (P= 0,0780) e bócio versus CPT (P = 0,0557), porém para este
107
último, pode-se perceber uma grande aproximação ao valor de significância estabelecido pelo
teste (P ≤0,05) (Tabela 21).
Quando realizada a comparação com o gene SERPINA1, estatisticamente foram
encontrados valores significativos nas comparações do grupo bócio versus CPT (P= 0,0319) e
do grupo CPT e CFT (P = 0,0430). Nenhuma diferença significativa foi encontrada na
comparação do grupo bócio versus CFT (P = 0,5329). Pela análise estatística para o gene
TFF3, foi encontrado diferenças significativas na comparação do grupo bócio versus CFT(P
= 0,0495) e entre CPT versus CFT (P = 0,0430). Nenhuma diferença significativa foi
encontrada na comparação entre o grupo bócio e CPT (P = 0,4599). Na análise do gene
LGALS3foi observada uma diferença estatisticamente significativa na comparação do grupo
bócio versus CPT (P = 0,0116) e do grupo bócio versus CFT (P = 0,0374), porém nenhum
valor significativo foi observado na comparação entre o grupo CPT versus CFT (P = 0,4727)
(Tabela 21).
Tabela 21: Resultados referentes à análise estatística pelo método de Mann Whitney sobre os
valores de QR para os genes avaliados.
ANÁLISES
GENES
Bócio x CPT
Bócio x CFT
CPT x CFT
P = 0,0195- ↑ CPT
P = 0,3114
P = 0,1775
P = 0,9561
P = 0,9572
P = 1,000
PDGFB
P = 0,0557 - ↑ CPT
P = 0,5825
P = 0,0780
SERPINA1
P = 0,0319 - ↑ CPT
P = 0,5329
P = 0,0430 - ↑ CPT
P = 0,4599
P = 0,0495 - ↑ CFT
P = 0,0430 - ↑ CFT
P = 0,0116 - ↑ CPT
P = 0,0374 - ↑ CFT
P = 0,4727
TG
TPO
TFF3
LGALS3
CPT: (carcinoma papilífero de tireoide); CFT: (carcinoma folicular de tireoide);em azul: valores de P
significativos; em vermelho: valores de P com tendência a significância. Teste de Mann Whitney,
valores significativos: P≤0,05;↑: aumento de expressão.
Fonte: O autor.
Com base nos resultados obtidos, identificaram-se genes com potencial de
diferenciação entre as patologias benignas e malignas (bócio e carcinomas) e entre duas
patologias malignas (CPT e CFT). Os genes TG, SERPINA1 e LGALS3 diferenciaram bócio
de carcinomas papilífero; os genes TFF3 e LGALS3 diferenciaram bócio de carcinoma
108
folicular e os genes SERPINA1 e TFF3 diferenciaram carcinoma papilífero de carcinoma
folicular.
109
6
DISCUSSÃO
As amostras utilizadas neste projeto foram obtidas a partir de tecidos de tireoides pela
técnica de microdissecção e classificadas pela análise histológica como tecidos normais,
bócio, carcinoma papilífero (CPT) e carcinoma folicular (CFT). Os resultados obtidos neste
estudo permitiram demonstrar a importância da utilização da espectroscopia Raman na análise
dos diferentes tecidos de tireoide, além da validação dessa classificação por marcadores
moleculares específicos já descritos em literatura. Embora a correlação entre essas duas
análises seja indireta, a associação entre as mesmas é importante tanto para confirmar o
diagnóstico histopatológico quanto para auxiliar na consolidação dessas técnicas no
diagnóstico clínico das lesões de tireoide, em especial as lesões que apresentam análise
histopatológica com resultados controversos.
A técnica de espectroscopia Raman foi eficiente na discriminação de tecidos normais
de tireoide em relação aos tecidos acometidos por lesões benignas e malignas. Esta análise
permitiu observar alterações bioquímicas em importantes componentes relacionados à
presença do câncer, como uma maior quantidade de DNA e RNA, maior quantidade de
proteínas, assim como de alguns aminoácidos como prolina, triptofano e fenilalanina além de
bandas de lipídeos. Baseado no conhecimento de que as alterações bioquímicas precedem as
alterações morfológicas, foi verificado por meio da média espectral de cada grupo, diferenças
significativas na intensidade dos espectros das lesões de tireoide em relação ao tecido normal,
e uma semelhança nos picos característicos. Este fato permite afirmar que existem diferenças
bioquímicas que permitem diferenciar os tecidos patológicos (bócio, CPT e CFT) quando
comparados com o tecido normal.
Pela análise qualitativa da média espectral de cada grupo, as principais regiões
espectrais que sofreram alterações nas lesões de tireoide foram concordantes com as regiões
espectrais obtidas de outros estudos, tais como a região de amida I (≅1600 a 1700 cm-1)
(MOVASAGHI; REHMAN; REHMAN, 2007; RUCHITA; AGRAWAL, 2011) e amida III
(≅ 1200 a 1400 cm-1) (LIU et al., 2003). A detecção destas alterações é esperada nos
processos neoplásicos pelo fato de que nestas regiões estão presentes grandes quantidades de
moléculas componentes de proteínas devido à intensa proliferação celular.
Alguns estudos envolvendo espectroscopia Raman e neoplasias consideram as regiões
de amida I e amida III as mais importantes na diferenciação dos tecidos normais e tumorais
(HARRIS et al., 2010; HUANG et al., 2003). As alterações observadas nos modos
110
vibracionais das regiões de variação angular normal dos modos dos grupos-CH2 e -CH3 (≅
1300 a 1450 cm-1) e de DNA/RNA (≅ 700 a 850 cm-1) (JESS et al., 2007) podem ser
explicadas pela grande quantidade de material nuclear devido ao aumento de mitoses que
ocorrem em qualquer processo patológico, seja ele bócio ou tumor.
Dentro destas regiões, vários modos vibracionais com intensidades aumentadas foram
visualizados nas lesões de tireoide (bócio, CPT e CFT) quando comparadas ao tecido normal.
Na análise da região de amida I, os componentes que apresentaram aumento de intensidade
das bandas foram fenilalanina (1605 cm-1), tirosina (1617 cm-1), triptofano (1620 cm-1) e
proteínas/lipídeos (1664 cm-1). Na região de amida III, os componentes que apresentaram
modos vibracionais com aumento de intensidade foram fosfolipídeos e ácidos graxos (1271
cm-1), triptofano (1208 cm-1), amida III do colágeno (1247 cm-1), proteínas (1303 cm-1) e
alguns modos de DNA e RNA (1252, 1316, 1340 e 1373 cm-1). Para a região de variação
angular normal dos modos dos grupos -CH2 e -CH3 os componentes com aumento de
intensidade foram colágeno [δ(CH 2)], lipídeos (1303 cm-1) e fosfolipídeos [δ(CH3)] (1368 cm1
). A região de DNA e RNA apresentou picos com aumento de intensidade tais como o
aminoácido metionina [υ(C -S)] (701cm-1), nucleotídeos e DNA (719 cm-1), triptofano (757
cm-1), estiramento υ(O-P-O) de DNA/RNA (830 cm-1) e as bases nitrogenadas do DNA
adenina (729 cm-1), timina, citosina e uracila (746 e 781 cm-1).
Os aumentos de intensidade acima discriminados são justificados pelo aumento da
quantidade das proteínas e dos aminoácidos que ocorrem nas lesões de tireoide,
principalmente nos carcinomas. Resultados similares foram encontrados por Huang et al.
(2003) que em sua análise de comparação entre tecidos normais e tumorais de pulmão,
verificaram um aumento na intensidade das bandas dos aminoácidos triptofano e
fenilalaninanos tumores, além dos picos de 1322 e 1335 cm-1, característicos dos modos de
variação angular δ(HCH) dos gru pos -CH3 e-CH2 em tumores, que estão correlacionados às
modificações presentes nas estruturas das proteínas. Adicionalmente, outro fator que
provavelmente esteja relacionado com o aumento na intensidade dos picos relacionados a
proteínas é o aumento da tradução e consequentemente expressão proteica,devido à intensa
proliferação celular que ocorre no processo carcinogênico.
Embora a quantidade de lipídeos esteja diminuída nos carcinomas devido à ocorrência
de instabilidades em suas cadeias, neste estudo foi evidenciado uma maior intensidade dos
modos vibracionais com picos em 1664, 1368, 1303 e 1271 cm-1 referentes a esse componente
nos tecidos tumorais. Esse resultado pode ser justificado pelo fato da presença de lipídeos ser
fundamental para a produção hormonal. Gniadecka et al. (2004), utilizando a espectroscopia
111
Raman na análise de melanomas, verificaram que nos em tumores malignos houve um
aumento de intensidade nas bandas relacionadas a lipídeos com máximas c.a. 1300 cm-1e
atribuídos aos modos δ(HCH) twisting da cadeia alifática. No presente estudo também foram
observadas mudanças nos modos vibracionais relacionadas à presença de lipídeos (região de
1300 a 1320 cm-1), com aumento de intensidade desta região em todas as lesões estudadas,
principalmente para os carcinomas (CPT e CFT) em relação ao tecido normal. Estas
alterações também foram observadas na literatura em carcinomas de laringe (STONE et al.,
2000; LAU et al., 2003; LAU et al., 2005); nos tumores benignos e carcinomas do colo do
útero e em câncer de pele (KELLER et al., 2008), com resultados bem semelhantes aos
obtidos em nosso estudo.
As intensidades aumentadas dos modos vibracionais do DNA e RNA observadas
(1252, 1316, 1340 e 1373 cm-1) também constituem um importante fator na diferenciação
entre os tecidos normais e lesões de tireoide, pois é um reflexo do alto índice mitótico devido
ao aumento da proliferação celular descontrolada característica dos tecidos malignos.
Resultados similares foram descritos por Harris et al. (2009), que pela avaliação de células
normais e tumorais de tireoide demonstraram alterações nos modos vibracionais de 780 e 930
cm-1, atribuídos a mudanças na região de DNA e RNA. Chan et al. (2006), comparando
células provenientes de cultura de linfócitos normais e transformados por processos
neoplásicos, afirmaram que as principais diferenças encontradas entre as duas linhagens
foram nas regiões de proteínas, lipídeos e carboidratos, além de importantes modificações na
banda de DNA/RNA (600 a 800 cm-1). Adicionalmente, além da ocorrência do aumento da
intensidade dos picos, descritas anteriormente, nas lesões de tireoide (bócio, CPT e CFT)
quando comparadas com o tecido normal, outras alterações significativas foram observadas,
tais como a diminuição dos picos de 854 e 938 cm-1que correspondem a (picos relacionados a
proteína colágeno). A diminuição de intensidade dessas bandas também foram identificadas
por Kamemoto et al. (2010) nas células escamosas cervicais tumorais quando comparadas
com células normais. Estes autores atribuíram estes picos a proteína colágeno.
Similar aos nossos resultados, Utzinger et al. (2001) avaliando displasias de células
escamosas em carcinomas cervicais, Huang et al. (2003) e Harris et al. (2009), encontraram os
picos de 1445 cm-1, atribuído ao modo de variação angularδ(HCH) scissoring para lipídeos e
proteínas) e 1655 cm-1 :υ(C=O) do colágeno, aumentados em tecidos tumorais e afirmaram
que estes picos são marcadores para carcinomas. No presente estudo, o pico de 1448 cm-1
[δ(HCH)(CH2 , CH3)] também foi associado aos carcinomas (CPT e CFT), sendo o pico de
112
maior intensidade para estes tecidos, cujos valores foram obtidos pela média espectral de cada
grupo.
Os modos vibracionais atribuídos ao aminoácido fenilalanina (1003 cm-1) encontrado
com intensidade aumentada no bócio e no CFT, e a banda 1131 cm-1, com intensidade
aumentada somente no CFT em relação ao tecido normal e CPT, também auxiliaram na
discriminação entre os grupos de amostras. Malini et al. (2006) avaliou a eficiência da técnica
de espectroscopia Raman na discriminação de tecidos normais, inflamatórios, pré-malignos e
em amostras de tecidos orais. Estes autores encontraram uma banda de alta intensidade
correspondente a fenilalanina (1000 cm-1) nos tecidos malignos e a relacionaram com a
existência de uma maior quantidade de proteínas nesses tecidos. Resultados similares foram
obtidos por Pujary et al. (2011) que encontraram um aumento na intensidade do pico de
fenilalanina (1004 cm-1) em tecidos tumorais de laringofaringe, associando-os também ao
aumento de proteínas presentes nos carcinomas.
Uma importante ferramenta utilizada para a discriminação entre os tipos histológicos
analisados foi a aplicação da análise multivariada pela técnica de PCA, cujo objetivo foi
reduzir a quantidade de dados baseando-se nas variáveis presentes entre os mesmos. Após a
aplicação dessa análise, foi realizada a técnica de LDA, cujo objetivo foi realizar a
discriminação dos grupos baseando-se em suas similaridades. Esta técnica teve como
principal fundamento a redução da dimensão dos dados, minimizando a dispersão intraclasse
para mantê-los bem agrupados e maximizando a dispersão interclasse, pois desta forma os
agrupamentos conseguiram ser classificados. Adicionalmente, a análise do loading plot dos
espectros normalizados vetorialmente realizada após a obtenção dos primeiros valores
discriminatórios entre os tecidos a partir de todo o espectro (400 a 1800 cm-1) pela técnica de
PCA e LDA foi crucial para que as melhores regiões fossem selecionadas, garantindo assim a
maior discriminação entre o grupo de amostras analisados.
Com base nestas análises, os novos valores discriminatórios encontrados na
comparação entre todos os grupos utilizando a região de 780 a 1140 cm-1 e na comparação do
grupo normal versus bócio na região de 1180 a 1720 cm-1 foram superiores ao encontrado em
todo o intervalo espectral (400 a 1800 cm-1), porém foi inferior ao esperado. Este valor de
discriminação aquém do esperado pode ser atribuído a semelhança histológica existente entre
os grupos de amostras avaliados, principalmente quando relacionado o tecido normal versus
bócio. Para as outras comparações (normal versus CPT, normal versus CFT, bócio versus
CPT, bócio versus CFT e CPT versus CFT), os valores encontrados foram significativos, uma
vez que todas as regiões escolhidas, inclusive as utilizadas para a comparação entre todos os
113
grupos e normal versus bócio englobavam os principais componentes responsáveis pela
separação entre os tecidos, como aminoácidos, proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos. A
mesma região de 1180 a 1720 cm-1 foi importante para a separação do grupo normal versus
CFT, bócio versus CPT provavelmente pela presença do pico de fenilalanina (1003 cm-1),
sabidamente conhecido como um aminoácido precursor do bócio devido a produção do
composto benzilglicosinolato pertencente à família dos glicosinolatos (MEDEIROS-NETO,
2013) além da presença do pico de 1450 cm-1, considerado um pico característico de tecidos
malignos e atribuído a variação angular (H-C-H), associados às outras alterações (SHAFERPELTIER et al., 2002).
Como toda a região espectral (400 a 1800 cm-1) foi utilizada para a diferenciação entre
os grupos CPT versus CFT e bócio versus CFT, provavelmente a associação de todas as
alterações bioquímicas foram responsáveis pela discriminação. Porém, dentro de todo este
espectro, pode-se ressaltar que regiões que estiveram mais intensos para o grupo CPT foram
1300 a 1340 cm-1 (modos vibracionais relacionados a lipídeos) e a banda de 1505 a 1622 cm-1
(amida I), ambos atribuído a tumores malignos sendo que para o grupo CFT, os picos que
apresentaram aumento de intensidade foram de 1003, 1448 e 1664 cm-1, todos encontrados
com alta intensidade nos tecidos tumorais em outros estudos da literatura (UTZINGER et al.,
2001; HARRIS et al., 2009).
Baseado nos resultados de discriminação obtidos pelas análises de PCA e de LDA
sobre regiões específicas para cada grupo comparado foi observado que as novas regiões
escolhidas a partir do loading plot para os espectros normalizados pelo pico de 1450 cm-1 em
todo o intervalo espectral (400 a 1800 cm-1) não apresentaram grandes variações quando
comparadas com as regiões obtidas pela normalização vetorial.
Na comparação entre todos os tecidos (região de 1500 a 1700 cm-1) e na comparação
do grupo normal versus bócio (região de 1180 a 1430 cm-1) também não ocorreu uma boa
discriminação entre os grupos, provavelmente devido a alta similaridade entre os tecidos.
Embora estas regiões tenham envolvido picos que são classificados como importantes na
diferenciação entre os tecidos normais dos patológicos e apresentaram uma maior taxa de
classificação entre os grupos analisados, as mesmas não demonstraram a especificidade
esperada.
Na comparação normal versus CFT,a região de 600 a 930 cm-1 foi importante
provavelmente porque engloba uma grande quantidade de picos relacionados à DNA/RNA, o
que representa a maior concentração de material genético existente nos tecidos malignos.
Sabe-se que a quantidade aumentada do material genético na forma de modos vibracionais
114
atribuídos a DNA e RNA são características dos carcinomas devido ao crescimento celular
descontrolado dos tumores malignos (CHAN et al., 2006). Na comparação dos carcinomas
(CPT e CFT) em relação ao tecido normal foi observado uma diminuição de intensidade do
pico de 938 cm-1, atribuído ao colágeno (VIDYASAGAR et al., 2008; KAMEMOTO et al.,
2010) para os tecidos tumorais que juntamente com outras alterações bioquímicas dentro da
região de 940 a 1180 cm-1podem ter contribuído para a diferenciação entre estes grupos.
Na comparação do grupo bócio versus CFT, os mesmos picos atribuídos ao
aminoácido fenilalanina (1003 e 1032 cm-1) podem ter contribuído para a separação desses
grupos. Além desses modos vibracionais, os picos referentes aos componentes de proteínas,
lipídeos a ácidos nucleicos presentes na região de 1180 a 1430 cm-1também possibilitaram
essa discriminação. Segundo Malini et al. (2006), a principal região encontrada entre os
tecidos orais malignos e benignos foi a de 1200 a 1800 cm-1. Associado a esta região, a banda
associada a lipídeos (1300 a 1340 cm-1), também pode ter contribuído para a diferenciação
dos grupos tumorais, com aumento de intensidade no CFT em relação ao tecido de bócio. A
associação com os modos vibracionais atribuídos a lipídeos são importantes, pois o CFT pode
apresentar metástases a distância nos pacientes acometidos. Le, Huff e Cheng (2009), por
meio da quantidade de lipídeos presentes em células cancerígenas, afirmaram que o excesso
de lipídeos está associado com a agressividade do tumor, com alterações na membrana
plasmática das células tumorais e com a redução da inibição por contato intercelular.
Na comparação entre o grupo bócio versus CPT, a região utilizada de 1500 a 1700 cm1
contribuiu para a boa separação desses grupos, provavelmente por envolver a região de
amida I, considerada uma das principais regiões alteradas em casos de carcinomas. De acordo
com estes resultados, o estudo de Lau et al. (2003) identificou que uma das principais regiões
encontradas alteradas em tecidos malignos é a região de 1530 a 1580 cm-1, o que também foi
citado por Huang et al. (2003), que encontraram na banda de 1500 a 1700 cm-1, importantes
alterações nos tecidos malignos.
Na comparação entre os grupos CPT e CFT, não houve nenhuma modificação nos
resultados de discriminação nas regiões testadas após a análise do loading plot em todo o
intervalo espectral. Nesta análise, foi evidenciado que a região de 400 a 1800 cm-1
possibilitou com maior discriminação a separação para estes dois tipos de carcinomas. Assim
como para os espectros normalizados vetorialmente, acredita-se que esta região tenha
contribuído na discriminação dos tecidos devido à associação de todas as alterações presentes
nos modos vibracionais acima citadas.
115
A análise de cluster realizada baseada nos laudos histológicos para os dois tipos de
normalização apresentaram praticamente as mesmas variações. Quando comparadas as duas
normalizações,foram observadas alterações nas posições dos espectros, ressaltando que
dependendo do tipo de normalização aplicada, algumas amostras apresentaram uma maior
similaridade entre si. Além disso, é de extrema importância que se entenda a presença de
alguns espectros falso-positivos e falso-negativos na análise de cluster. Desta forma, pela
análise dos exames citológicos e anatomopatológicos dos tecidos, foi verificado que a
presença de outro tipo de lesão, mesmo que seja em pequenas quantidades ou proporções,
interferiu no resultado final de classificação pela análise multivariada, o que impediu que os
espectros fossem classificados em clusters separados. Estes resultados refletem a grande
heterogeneidade histológica presente nos tecidos biológicos, em especial nos carcinomas,
característica responsável pela grande quantidade de laudos incorretos ou indeterminados.
Segundo NCCN (2013), o diagnóstico dos tumores de tireoide é complexo e para
alguns tipos histológicos como CFT e carcinoma folicular de células de Hurthle o diagnóstico
só é realizado após a análise histológica pós tireoidectomia ou lobectomia. A histologia destes
tecidos muitas vezes pode ser confundida devido a falta de critérios celulares específicos para
algumas lesões como o carcinoma folicular quando comparado com adenomas
foliculares.Muitas vezes, o diagnóstico das patologias de tireoide se torna complexo devido a
sobreposição de características benignas e malignas em um mesmo tecido, causando uma
indeterminação no diagnóstico (LIU et al., 2003).
Pode-se concluir que embora os valores discriminatórios para os dois tipos de
normalização aplicada tenham sido semelhantes foi importante, pois se pode identificar que as
regiões escolhidas após a análise do loading plot para os espectros normalizados
vetorialmente (780 a 1140, 1180 a 1720, 940 a 1180, 1500 a 1700 e 400 a 1800 cm-1) e para
os normalizados pelo pico de 1450 cm-1 (1500 a 1700, 1180 a 1430, 940 a 1180, 600 a 930,
1180 a 1720, 400 a 1800 cm-1) foram as mais adequadas para a classificação dos tecidos.
Baseado no fato das normalizações aplicadas em nosso estudo serem diferentes esperava-se
discordância nos resultados obtidos, porém o que se identificou foi somente pequenas
mudanças na discriminação entre os tecidos estudados. Os aumentos nos valores de
discriminação ocorreram principalmente quando se aplicava às regiões escolhidas
previamente como as mais importantes por meio da normalização pelo pico de 1450 cm-1
sobre os espectros normalizados vetorialmente. Estes foram importantes e são justificados
pelo fato de que foram escolhidas regiões que englobassem a maior quantidade de
116
características discriminantes para cada tipo histológico, ou seja, foi considerado os principais
modos vibracionais relacionados às patologias.
Entretanto, quando foram analisadas as regiões que tiveram seus valores de
discriminação diminuídos pela troca de normalização, evidenciou-se que esta mudança
ocorria na aplicação das regiões consideradas excelentes para os espectros normalizados
vetorialmente sobre os espectros normalizados pelo pico de 1450 cm-1. Uma das possíveis
explicações é que o pico escolhido para a realização da normalização deve ser o que menos
sofre variação, tanto na intensidade quanto na largura entre todos os espectros. Neste estudo, o
pico selecionado para a realização dos dois tipos de normalização foi o de 1450 cm-1,
utilizado em estudos da literatura como normalizador de espectros (TEIXEIRA et al., 2009;
PUJARY et al., 2011). Em nosso trabalho este pico apresentou grande variação entre os
tecidos estudados, portanto ao realizar a normalização dos espectros por este pico, perderamse as características do mesmo para a discriminação entre os tecidos. Na maioria das
comparações sobre os espectros nas regiões que envolviam o pico de 1450 cm-1 houve uma
diminuição no valor discriminatório, sugerindo que nos tecidos onde ocorre alguma variação
de intensidade no pico sendo este o normalizador, as características discriminantes são
perdidas. É importante ressaltar que a variação existente nos tecidos avaliados em relação ao
pico de 1450 cm-1 é somente uma das possíveis explicações para a diminuição no valor
discriminante, pois tanto para os aumentos e diminuições de discriminação entre as regiões
aplicadas no estudo, o que mais influenciou foi o conjunto de alterações existentes dentro
daquela região, que na maioria das vezes envolveram modificação nos modos vibracionais
relacionados a proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos.
Baseados nos resultados encontrados, pudemos perceber a grande influência das
modificações existentes em relação aos modos vibracionais relacionados à DNA/RNA e
consequente expressão proteica. Desta forma, nossa análise da expressão gênica entre os
tecidos de tireoide demonstrou importantes resultados na busca de genes marcadores para as
lesões de tireoide, ressaltando que mutações existentes nos genes podem levar a produção de
diversos componentes alterados promovendo o surgimento do câncer.
Os genes alvos selecionados para a análise de expressão gênica pela qRT-PCR foram
TPO, TG, PDGFB, LGALS3, TFF3 e SERPINA1. Estes genes foram escolhidos por trabalhos
da literatura que os determinam com grande potencial de diagnóstico em diferentes lesões de
tireoide. A sequência dos iniciadores e a localização cromossômica para cada gene estão
representadas na Tabela 6.
117
Baseado nos resultados da análise de espectroscopia Raman foi encontrado, quando
comparados os diferentes grupos de amostras de tireoide,uma grande variação dos modos
vibracionais relacionados à DNA/RNA. Essas alterações detectadas nas bandas relacionadas
aos ácidos nucléicos provavelmente são o reflexo das alterações na expressão gênica e
proteica encontrada nos tecidos tumorais quando comparados aos tecidos normais. Neste
estudo, a análise da expressão gênica realizada nos diferentes grupos de amostras de tireoide
mostrou que os genes TG, SERPINA1, TFF3 e LGALS3 podem ser considerados como
marcadores moleculares de diagnóstico de carcinomas de tireoide,
Na análise de expressão gênica foram utilizadas 33 amostras da glândula tireoide
divididas em quatro grupos de acordo com o tipo histológico: quatro amostras de tecido
normal, 14 amostras de bócio, 11 amostras de CPT e quatro amostras de CFT. Os genes TG,
TPO, PDGFB, SERPINA1, TFF3 e LGALS3foram selecionados de artigos da literatura que os
determinaram como marcadores moleculares diagnósticos em lesões de tireoide após a análise
de expressão gênica (microarray e qRT-PCR). Os genes TPO e TG foram descritos como
participantes no desenvolvimento de bócio adenomatoso (NEUMANN et al., 1999), os genes
SERPINA1 e PDGFB foram detectados como marcadores de carcinomas papilíferos
(ALDRED et al., 2004; JARZAB et al., 2005; FOUKAKIS et al., 2007; BRULAND et al.,
2009; SASSA et al., 2011) e os genes LGALS3 e TFF3 foram descritos como marcadores de
carcinomas foliculares (ASAAD et al. 2006; FOUKAKIS et al., 2007; TAKANO;
YAMADA, 2009; KARGER et al., 2012).
A eficiência e especificidade dos iniciadores desenhados para cada gene foi avaliado
pela curva padrão e curva de dissociação, respectivamente. Os resultados obtidos neste estudo
mostraram que os iniciadores utilizados apresentaram um bom desempenho, com valores de
slope e de R2 dentro do esperado e ausência de amplificação de produtos inespecíficos,
garantindo assim uma grande sensibilidade e eficiência na reação de PCR.
Após a aquisição dos resultados pela amplificação das amostras pela técnica de qRTPCR, os mesmos foram analisados pelo método ∆∆Ct para a obtenção dos valores de QR e do
fold change na comparação entre os grupos de amostras. A análise estatística foi realizada
pelo teste de Mann Whitney não paramétrico, que eliminou a interferência dos grupos que
apresentaram uma quantidade reduzida de amostras bem como a heterogeneidade genética
existente nos tecidos tumorais. As análises comparativas realizadas entre os grupos relativas
aos seis genes avaliados mostraram diferenças estatisticamente significativas para os genes
TG, SERPINA1 e LGALS3 e tendência de expressão diferencial para o gene PDGFB quando
comparados os grupos bócio versus CPT; diferenças significativas para os genes TFF3 e
118
LGALS3 quando comparados os grupos bócio versus CFT; e diferenças significativas para os
genes SERPINA1 e TFF3 quando comparados os grupos CPT versus CFT.
O gene TG é um importante gene relatado na literatura como importante para o bom
funcionamento da glândula (NEUMANN et al., 1999; FOUKAKIS et al., 2007). Este gene
codifica a tireoglobulina, proteína homodímera produzida predominante pela glândula da
tireoide e que atua como um substrato para a síntese dos hormônios tiroxina (T4) e
triiodotironina (T3) bem como para a armazenagem de formas inativas do hormônio
tireoidiano e iodo. A tireoglobulina é secretada pelo retículo endoplasmático para seu local de
iodação e subsequente biossíntese da tiroxina no lúmen folicular. Mutações neste gene
causam disormonogênese da tireoide, manifestada como bócio e são associados com
hipotireoidismo congênito moderado a severo epolimorfismos neste gene também são
descritos e estão associados com a susceptibilidade para doenças autoimunes da tireoide
(DAIT), como a doença de Graves e a tireoidite de Hashimoto (TG, 2014).
Por ser uma proteína amplamente expressa em pacientes eutireoideos, o gene TG atua
de forma ativa na glândula tireoide. A tireoglobulina representa 70 a 80% do conteúdo
proteico da glândula tireoide, atuando diretamente na síntese hormonal (VAISMAN;
ROSENTHAL; CARVALHO, 2004). Segundo o estudo de Yano et al. (2004), onde
avaliaram o nível de expressão do gene TG sobre amostras normais, de CPT e sobre amostras
de sangue periférico de pacientes saudáveis, foi encontrado um aumento na expressão deste
gene em amostras de sangue periférico de pacientes saudáveis e em tecidos provenientes de
CPT. De acordo com o estudo de Lazar et al. (1999), em sua análise por qRT-PCR sobre 43
amostras de carcinomas diferenciados de tireoide e 24 amostras de tireoides normais,
afirmaram que a expressão deste gene em tecidos normais é normal.
Os resultados obtidos neste estudo encontraram expressão significativamente
aumentada para o gene TG nos casos de CPT quando comparados ao grupo bócio. Esta
diferença permitiu relacionar alterações na expressão deste gene com o desenvolvimento de
tumores malignos na tireoide. Resultados similares têm sido relatados na literatura quando
realizada a análise de expressão deste gene em casos de CPT. Yano et al. (2004) pela análise
de microarray encontraram o aumento significativo de expressão desse gene em CPT quando
comparados com tecidos normais de tireoide na análise de 4 amostras de tecidos normais e 7
de CPT. Baseado nos resultados de expressão aumentada em CPT, poderíamos classificar este
gene como um marcador específico para carcinomas papilífero de tireoide, porém devido a
presença de uma expressão aumentada do gene TG no sangue periférico de pacientes
saudáveis no estudo de Yano et al. (2004), Takano e Yamada (2009) e Bojunga et al. (2000)
119
este gene embora relacionado com CPT, não deve ser classificado como um marcador tumoral
para carcinomas de tireoide. Os resultados obtidos na literatura quando utilizado tecidos de
tireoide com CPT estão de acordo com os resultados do presente estudo, pois a expressão
desse gene estava significativamente aumentada no grupo de CPT quando comparado ao
bócio, e também se mostrou elevada embora não significativa, nos casos de CPT quando
comparados ao CFT. A efetividade na utilização do gene TG na diferenciação de lesões
malignas e benignas foi demonstrada no estudo de Karger et al. (2012), onde a associação
deste gene TG a outros (ADM3, HDG1 e LGALS3) foi realizada.
O gene TPO (thyroid peroxidase) é codificador de uma glicoproteína ligada a
membrana, que atua como uma enzima e desempenha um papel central na função e
metabolismo da glândula tireoide (HUANG et al., 2001). Estas proteínas atuam na iodação
dos resíduos de tirosina em tireoglobulina e na formação de fenoxi-ester entre os pares de
tirosinas iodadas para gerar os hormônios da tireoide, tiroxina (T4) e triiodotironina (T3),
além de representarem o alvo para anticorpos antimicrossomais nas doenças autoimunes da
tireoide. Mutações neste gene são associadas com desordens severas na hormonogênese da
tireoide, incluindo o hipotireoidismo congênito, bócio congênito e defeitos tipo IIA na
organificação dos hormônios da tireoide (TPO, 2014).
A presença do gene TPO e sua função em pacientes eutireoideos são de fundamental
importância para o processo de formação dos hormônios. Lazar et al. (1999), analisaram 67
tecidos provenientes da tireoide pela técnica de qRT-PCR verificaram que a expressão deste
gene em pacientes saudáveis foi normal. Comparando os resultados obtidos em adenomas e
relacionados ao tecido normal, foi evidenciado um aumento da expressão do gene TPO para
os adenomas frios, e na avaliação sobre carcinomas comparados com adenomas, houve uma
diminuição na expressão para carcinomas. No presente estudo, quando realizada as
comparações relacionadas a expressão deste gene entre os tecidos de lesões de tireoide, não
foram encontradas diferenças significativas. Uma possível explicação para esta ausência de
resultados significativos pode ser o número reduzido de amostras que constitui cada grupo.
Tallini et al. (1998), avaliando os níveis de expressão do TPO em 52 amostras de sangue
periferal de pacientes com carcinomas de tireoide, adenomas e hiperplasia nodular pela
técnica de qRT-PCR verificaram um aumento na expressão deste gene nos carcinomas.
Resultados similares foram obtidos por Yano et al. (2004), que em seu estudo em que avaliou
14 tecidos de tireoide pela técnica de microarray observaram a diminuição da expressão deste
genes nas amostras de tecido normal quando comparadas com CPT.
120
A escolha dos genes TG e TPO para a diferenciação das amostras do grupo bócio das
amostras de carcinomas (CPT e CFT) foi baseada pelo fato destes genes estarem diretamente
relacionados ao bom funcionamento da glândula tireoide (NEUMANN et al., 1999) e de que
estariam também ligados no desenvolvimento do bócio adenomatoso, uma vez que mutações
neste genes podem causar o surgimento do bócio adenomatoso (TG, 2014) seja este em
qualquer uma de suas formas clínicas. Embora Neumann et al. (1999), tenham detectado
mutações nos genes TPO, TG e NIS em bócios multinodulares quando comparados com o
tecido normal, nenhuma alteração na expressão destes genes foi visualizada quando realizada
a análise nesses mesmos tecidos. Estes autores ressaltam que estes genes estão relacionados
ao desenvolvimento do bócio, contudo não são determinantes para o seu desenvolvimento.
Karger et al. (2012), encontrou resultados positivos para a associação da expressão do gene
TG aos genes LGALS3, ADM3 e HDM1 na diferenciação de tumores malignos e benignos de
tireoide, porém estes genes não foram marcadores na diferenciação de nódulos benignos
versus tecido normal. De acordo com estes autores, no presente estudo poucos casos
apresentarem expressão aumentada do gene TG no grupo bócio quando comparados com o
tecido normal, contudo constatou-se um aumento significativo de expressão para o gene TG
nos casos de CPT quando comparados com o grupo bócio. Os resultados obtidos
corresponderam com os estudos da literatura que detectaram um aumento da expressão para
este gene nos carcinomas papilíferos.
Na análise de expressão do gene PDGFB foi observado uma porcentagem maior de
casos de CPT que apresentaram expressão aumentada ou normal e uma maior porcentagem de
casos de bócio com expressão reduzida em relação ao tecido normal. Nenhuma diferença
significativa foi verificada na comparação dos grupos bócio versus CFT, CPT versus CFT e
bócio versus CPT, sendo que esta última comparação houve uma tendência a significância,
com aumento de expressão gênica nas amostras de carcinoma. A proteína codificada pelo
gene PDGFB (platelet-derived growth factor beta polypeptide) é um membro da família do
fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e são indiretamente reguladas por
citocinas inflamatórias (CHOW et al., 2005). Os quatro membros desta família (A, B, C, D)
são fatores mitogênicos para células de origem mesenquimal,cujo produto genético pode
existir como um homodímero(PDGF-BB) ou como heterodímero, ligado ao fator alfa de
crescimento derivado de plaquetas (PDGF-AB) (PLATELET-DERIVED GROWTH
FACTOR BETA POLYPEPTIDE, 2014).
Embora não significativos, os resultados obtidos da análise do gene PDGFB
concordaram com estudos da literatura que mostraram que no CPT a sua expressão é elevada
121
em relação a outros tipos de lesões ou ao tecido normal, podendo assim ser considerado um
marcador importante para estes carcinomas. A ausência de significância observada no
presente estudo pode ser devido ao número amostral reduzido. Assim, um aumento do
número de casos poderá confirmá-lo como um potencial marcador de diagnóstico em CPT,
como previamente descrito em literatura (CHOW et al., 2005; WANG et al., 2008). Yano et
al. (2004) observaram altos níveis de expressão do gene PDGFB em CPT em relação ao a
tecidos normais, apresentando-se como um potencial marcador de diagnóstico para este tipo
de neoplasia. Os mesmos resultados foram obtidos por Bruland et al. (2009), que verificaram
um aumento na expressão deste gene em tecidos de tireoide acometidos por CPT, com a
presença ou não de infiltrado linfocitário, quando comparados com tecidos não acometidos
por tumor ressaltando a ligação da família PDGF com citocinas inflamatórias. Outros estudos
têm citado a existência de uma possível associação entre mutações BRAF, oncogene mais
comum nas alterações em CPT, e a família PDGF, onde foi verificado a ocorrência de um
aumento no número de plaquetas, com consequente aumento na expressão do gene PDGFB.
Estas alterações podem estar também estarem associadas ao processo de metastização que
facilmente ocorrem nos casos de CPT (WANG et al., 2008).
Assim como o gene PDGFB, o gene SERPINA1 (serpin peptidase inhibitor, clade A alpha-1 antiproteinase, antitrypsin, member 1) tem sido relatado por diversos autores como
um importante marcador de diagnóstico para CPT, apresentando um aumento de expressão
nestes tumores quando comparado a outros tecidos (JARZAB et al., 2005; VIERLINGER et
al., 2011). A proteína codificada por este gene é um inibidor de protease serina, cujos alvos
incluem elastase, plasmina, trombina, tripsina, quimiotripsina e ativador de plasminogênio,
atuando como uma glicoproteína de fase aguda (SERPINA1, 2014). A princípio, pensava-se
que esta proteína estava presente apenas no fígado, seu principal local de produção, com
expressão elevada somente nos tumores hepáticos. Contudo, atualmente sabe-se que esta
proteína é expressa em diversos outros órgãos e tipos tumorais, tais como o pâncreas, ovário e
bexiga (POBLETE et al, 1996). Neste estudo, foi observado uma porcentagem maior de casos
de CPT que apresentaram um aumento de expressão para este gene, expressão reduzida em
todos os casos de CFT e uma maior porcentagem de casos de bócio que apresentaram
diminuição de expressão em relação ao tecido normal. O potencial de ser um marcador
diagnóstico específico para CPT se confirmou neste estudo quando realizada a comparação
entre os grupos, com expressão significativamente elevada nestes carcinomas quando
comparados com os grupos de bócio e CFT. Como esperado, neste estudo não foi detectada a
122
expressão diferencial para o gene SERPINA1 quando realizada a comparação entre bócio
versus CFT.
Os resultados obtidos da análise do gene SERPINA1 estão de acordo com os
encontrados na literatura e confirmam a associação deste gene com CPT. Huang et al. (2001),
por meio da análise de expressão gênica pela técnica de microarray (plataforma Affymetrix)
contendo 12.000 genes humanos em oito amostras de CPT, observaram a expressão elevada
do gene SERPINA1 em todas as amostras analisadas. Estes autores descreveram que este gene
está envolvido nos processos de adesão celular e de matriz extracelular e que é um candidato
importante marcador de diagnóstico destas lesões. Jarzab et al. (2005) também indicou o
potencial diagnóstico do gene SERPINA1 em CPT quando analisou 50 amostras provenientes
de tecido normal e de CPT pela técnica de microarray e validação por qRT-PCR, e
detectaram um aumento de expressão para este gene em casos de CPT em relação ao tecido
normal. Vierlinger et al. (2011), também realizaram a análise de expressão do gene
SERPINA1 pela técnica de qRT-PCR em 82 amostras de tecido de tireoide, divididas entre 7
tipos histológicos: CAT (n = 3), AFT (n = 18), CFT (n = 13), CMT (n = 6), CPT (n = 19),
bócio nodular (n = 18) e normal (n = 5) e. Os resultados obtidos por estes autores mostraram,
um percentual de diferenciação de 99% para o CPT em relação a nódulos benignos e uma
acurácia de 93% quando comparado a outros tumores malignos. Assim, com base nos
resultados do presente estudo, os genes PDGFB e SERPINA1 foram marcadores diagnósticos
eficientes para a discriminação dos casos de CPT em relação aos outros grupos analisados
(bócio e CFT), pois apesar do gene PDGFB apresentar somente uma tendência a
significância, o mesmo apresentou aumento de expressão nos casos de CPT.
O gene TFF3 (trefoil factor 3 - intestinal), mapeado no cromossomo 21e expresso
principalmente nas células caliciformes dos intestinos e cólon, tem sido descrito como um
gene candidato a marcador diagnóstico para CFT (PATEL et al., 2011; KARGER et al.,
2012). Membros da família de proteínas trefoil são caracterizados por terem semelhanças
estruturais de trevo e um domínio de 40 aminoácidos, estando presentes em clusters. Estas são
proteínas secretoras presentes na mucosa gastrintestinal, onde suas funções ainda não são
muito bem definidas. Alguns estudos relatam que estas proteínas protegem a mucosa contra
os insultos, estabilizando a camada de muco, além de afetar a cicatrização do epitélio (TFF3,
2014). Expressões elevadas deste gene têm sido relatadas nas tireoides normais quando
comparadas aos carcinomas de tireoide.
Um fato importante é que se tem observado a ocorrência proporcional da diminuição
de expressão deste gene durante as etapas da progressão tumoral ou malignização da glândula
123
tireoide (TAKANO; YAMADA, 2009; CERUTTI, 2011). Os resultados obtidos neste estudo
em relação a análise do gene TFF3, foram discordantes com os trabalhos da literatura
(FOUKAKIS et al., 2007; TAKANO; YAMADA, 2009), onde diferentemente desses estudos,
foi encontrado um aumento de expressão significativa para este gene nos casos de CFT
quando comparados com as amostras de bócio e de CPT. Na comparação entre as lesões de
tireoide com os tecidos normais, 100% dos casos tanto de bócio quanto de CFT apresentaram
expressão aumentada. Karger et al. (2012), na avaliação de 111 aspirados de tireoide
distribuídos histologicamente entre bócio adenomatoso (n = 53), AFT (n = 40), CFT (n = 7),
CPT (n = 11) e aspirados classificados como normais retirados do tecido adjacente das lesões
por qRT-PCR encontrou uma importante diminuição de expressão deste gene em amostras de
tumores de tireoide quando comparados com amostras normais.
Além do gene TFF3, também foi avaliado o potencial diagnóstico do gene LGALS3
para CFT. O gene LGALS3 (lectin, galactoside-binding, soluble, 3) codifica um membro da
família galectina de proteínas de ligação a carboidratos, possui uma afinidade por betagalactosidases e localiza-se na matriz extracelular, no citoplasma e no núcleo. A proteína
codificada por este gene é caracterizada por uma extremidade N-terminal rica em prolina com
domínio de repetição in tanden e um único domínio C-terminal de reconhecimento de
carboidratos,podendo se auto associar por meio do domínio N-terminal,o que permite a
proteína ligar-se a ligantes multivalentes de sacarídeo. Esta proteína desempenha um papel em
diversas funções celulares, tais como a apoptose, imunidade inata, adesão e regulação celular,
inflamação, transformação maligna de nódulos e metastização (LGALS3, 2014).
Saez (2011) em seu estudo de revisão sobre os principais marcadores de diagnóstico e
prognóstico para lesões de tireoide, afirma que o gene LGALS3 primeiramente foi encontrado
como sendo específico para CPT, porém alguns anos depois foi encontrado por outros estudos
como sendo um marcador para casos de CFT (BARTOLAZZI, et al. 2001; MATOS et al.,
2005; LIU, et al., 2008). A análise comparativa realizada neste estudo entre cada grupo de
lesão de tireoide com o grupo de amostras normais mostrou que a maioria das amostras para
cada grupo de lesão analisada (bócio, CPT e CFT) apresentou expressão reduzida em relação
ao tecido normal. Na comparação entre os grupos de lesões, houve uma diminuição
significativa de expressão no grupo de CFT versus bócio para as amostras de bócio e aumento
de expressão nas amostras de CPT na comparação entre CPT versus bócio. A diminuição de
expressão também foi notada no grupo de CFT em relação ao CPT, porém não significativa.
O aumento de expressão para o grupo CPT está de acordo com outros estudos (POBLETE et
al., 1996; LAI et al., 1998) que encontraram um aumento de expressão para o gene LGALS3
124
em CPT. A alteração de expressão encontrada entre os carcinomas em relação ao bócio é
similar aos outros estudos que têm afirmado que este gene apresenta um aumento em sua
expressão em casos de lesões malignas na tireoide quando comparadas as lesões benignas
(KARGER, et al., 2012).
Resultados divergentes aos da literatura foram encontrados em nosso estudo para o
gene TFF3. Segundo Barden et al. (2003), Foukakis et al. (2007), Takano e Yamada (2009), é
comum se observar níveis diminuídos de expressão do gene TFF3 em casos de CFT,
constituindo uma importante relação deste gene para a diferenciação deste tipo tumoral em
relação a outros carcinomas ou lesões benignas. A expressão aumentada deste gene também é
observada tanto nos casos de lesões benignas quanto malignas da tireoide, tais como CPT,
AFT e CPTVF (carcinoma papilífero de tireoide variante folicular), dificultando assim a
aplicação clínica deste gene como marcador específico para CFT. Barden et al. (2003),
avaliando sete amostras de CFT e 12 amostras de AFT pela técnica semiquantitativa RT-PCR
evidenciaram um aumento na expressão do gene TFF3 em adenomas quando comparados as
amostras de CFT, ressaltando a presença deste gene em outros tipos histológicos. Embora a
literatura apresente bons resultados para os genes LGALS3 e TFF3 na diferenciação do CFT,
estudos ressaltam a importância da associação dos mesmos com outras alterações genéticas
presentes nos carcinomas, pois diferentes eventos, tais como mutações, translocações ou
fusões podem determinar a expressão destes genes (FOUKAKIS et al., 2007; PATEL et al.,
2009).
Portanto, os resultados obtidos por meio da técnica de espectroscopia Raman confocal
associada mesmo que indiretamente à análise de expressão gênica, tem a promessa de
aprimorar o diagnóstico das lesões e carcinomas de tireoide. A alta sensibilidade e
especificidade de ambas as técnicas permitem que possam ser utilizadas juntamente à
histologia, conhecida até os dias atuais ser a técnica diagnóstica padrão ouro. O fato da
espectroscopia Raman fornecer informações sobre as mudanças bioquímicas presentes nos
tecidos e a análise de expressão gênica descobrir genes que possam ser utilizados como
marcadores específicos de diagnóstico representam um grande avanço nos testes diagnósticos
utilizados atualmente nas lesões de tireoide, que são resumidas principalmente na técnica de
PAAF associada ao US e a histologia.
Embora os resultados tenham sido muito expressivos, é importante a realização de
estudos adicionais em um maior número de amostras e lesões pesquisadas com o objetivo de
melhorar a sensibilidade das técnicas e consequentemente aumentar a confiabilidade das
mesmas no diagnóstico das lesões de tireoide.
125
7
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos por meio da técnica de espectroscopia Raman confocal
apresentaram uma importante discriminação para as lesões de tireoide quando comparadas
com o tecido normal. Os valores discriminatórios obtidos comprovam a importância do
conhecimento das alterações bioquímicas presentes nos tecidos patológicos.
A análise de expressão gênica identificou diferenças significativas para os genes
LGALS3, SERPINA1, TFF3 e TG, demonstrando serem importantes para avaliação das lesões
de tireoide além de classificar o gene SERPINA1 como um importante marcador específico
para o diagnóstico de CPT.
Considerando que as alterações bioquímicas e moleculares antecedem as alterações
morfológicas, as técnicas de espectroscopia Raman confocal e análise de expressão gênica se
mostraram importantes ferramentas no auxílio diagnóstico das lesões de tireoide.
126
REFERENCIAS
AIN, K. B.; EGORIN, M. J.; DESIMONE, P. A. Treatment of anaplastic thyroid
carcinoma with paclitaxel: phase 2 trial using ninety-six-hour infusion - collaborative
Anaplastic Thyroid Cancer Health Intervention Trials (CATCHIT) group. Thyroid, v.10, n.7,
p.587-594, 2000.
AHMADIEH, H.; AZAR, S. T. Controversies in the management and follow-up of
differentiated thyroid cancer: beyond the guidelines. Journal of Thyroid Research, v.2012,
n.512401, 2012.
ALDRED, M. A. et al. Papillary and follicular thyroid carcinomas show distinctly different
microarray expression profiles and can be distinguished by a minimum of five genes. Journal
of Clinical Oncology, v.22, p.3531-3539, 2004.
ASAAD, N. Y. et al. Human Telomerase Reverse Transcriptase (hTERT) gene expression in
thyroid carcinoma: diagnostic and prognostic role. Journal of the Egyptian National
Cancer Institute, v.18, n.1, p.8-16, 2006.
BAIER, N. D. et al. Fine-needle aspiration biopsy of thyroid nodules: experience in a cohort
of 944 patients. American Journal of Roentgenology, v.193, n.4, p.1175-1179, 2009.
BALOCH, Z. W.; LIVOLSI, M. D. Diagnosis of follicular neoplasm: a grayzone in thyroid
fine-needle aspiration cytology. Diagnostic Cytopathology, v.26, p.41-44, 2002.
BALOCH, Z. W. et al. Interinstitutional review of thyroid fine-needle aspirations: impact on
clinical management of thyroid nodules. Diagnostic Cytopathology, v.25, p.231-234, 2001.
BAHN, R. S.; CASTRO, M. R. Approach to the patient with nontoxic multinodular goiter.
The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, v.96, n.5, p.1202-1212, 2011.
BARDEN, C. B. et al. Classification of follicular thyroid tumors by molecular signature:
results of gene profiling. Clinical Cancer Research, v.9, p.1792-1800, 2003.
BARTOLAZZI, A. et al. Application of an immunodiagnostic method for improving
preoperative diagnosis of nodular thyroid lesions. Lancet, v.357, n.9269, p.1644-1650, 2001.
BELGE, G. et al. Upregulation of HMGA2 in thyroid carcinomas: a novel molecular marker
to distinguish between benign and malignant follicular neoplasia. Genes, Chromosomes and
Cancer, v.47, n.1, p.56-63, 2008.
BELJEBBAR, A. et al. Ex vivo and in vivo diagnosis of C6 glioblastoma development by
Raman spectroscopy coupled to a microprobe. Analytical and Bioanalytical Chemistry,
v.398, n.1, p.477-487, 2010.
BELLISOLA, G.; SORIO, C. Infrared spectroscopy and microscopy in cancer research and
diagnosis. American Journal Cancer Reaserch, v.2, n.1, p.1-21, 2012.
127
BERGHOLT, M. S., et al. In vivo diagnosis of gastric cancer using Raman endoscopy and ant
colony optimization techniques. International Journal of Cancer, v.128, p.2673-2680,
2010.
BHARGAVA, R. Toward a practical Fourier transform infrared chemical imaging protocol
for cancer histopathology. Analytical and Bioanalytical Chemistry, v.389, n.1155, 2007.
BITAR, R. A. Estudo de tecido mamário humano por espectroscopia FT-Raman. 2004.
Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) - Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento,
Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, 2004.
BLANSFIELD, J. A.; SACK, M. J.; KUKORA, J. S. Recent experience with preoperative
fine-needle aspiration biopsy of thyroid nodules in a community hospital. Archives of
Surgery, v.137, p.818-821, 2002.
BOJUNGA, J. et al. Molecular detection of thyroglobulin mRNA transcripts in peripheral
blood of patients with thyroid disease by RT-PCR. British Journal of Cancer, v.82, n.10,
p.1650-1655, 2000.
BOMELI, S. R.; LEBEAU, S. O.; FERRIS, L. R. Evaluation of a thyroid nodule.
Otolaryngologic Clinics of North America, v.43, n.2, p.229-238, 2010.
BONGIOVANNI, M.; CIBAS, E. S.; FAQUIN, W. C. The role of thyroid fine needle
aspiration cytology and the Bethesda system for reporting thyroid cytopathology - minisymposium: thyroid pathology. Diagnostic Histopathology, v.17, n.3, 2010.
BRAUCHLE, E.; SCHENKE-LAYLAND, K. Raman spectroscopy in biomedicine – noninvasive in vitro analysis of cells and extracellular matrix components in tissues.
Biotechnology Journal, v.8, p.288-297, 2013.
BRIX, T. H. et al. Cigarette smoking and risk of clinically overt thyroid disease - A
population-based twin case-control study. Archives of Internal Medicine, v.160, n.5, p.661666, 2000.
BRULAND, O. et al. Inverse correlation between PDGFC expression and lymphocyte
infiltration in human papillary thyroid carcinomas. BMC Cancer, v.9, n.425, 2009, 15p.
BUESCO, A.; FARIAS, M. L. F. Nódulo e câncer da tireoide. In: CARNEIRO, A. J. V. et al.
Clínica médica: doenças da tireoide. São Paulo: Atheneu, 2003. p.103-117.
BUESCO, A.; GREGO FILHO, J. Propedêutica nas doenças da tireoide. In: CARNEIRO, A.
J. V. et al. Clínica médica: doenças da tireoide. São Paulo: Atheneu, 2003. p.1-23.
BUESCO, A.; VIOLANTE, A. H. D. Função tireoidiana, doença crônica e senescência. In:
CARNEIRO, A. J. V. et al. Clínica médica: doenças da tireoide. São Paulo: Atheneu, 2003.
p.25-32.
CAPUZZO, R. O que você precisa saber sobre a tireoide. Sociedade Brasileira de Cirurgia
de Cabeça e Pescoço, v.1, 2012. 26 p.
128
CARVALHO, G. A.; GRAF, H. Carcinoma indiferenciado de tireoide. Arquivos Brasileiros
de Endocrinologia e Metabologia, v.49, n.5, p.719-724, 2005.
CASTRO, M. R.; GHARIB, H. Thyroid fine-needle aspiration biopsy: progress, practice, and
pitfalls. Endocrine Practice, v.9, p.128-136, 2003.
CERUTTI, J. M. Employing genetic markers to improve diagnosis of thyroid tumor fine
needle biopsy. Current Genomics, v.12, n.8, p.589-596, 2011.
CERUTTI, J. M. et al. A preoperative diagnostic test that distinguishes benign from
malignant thyroid carcinoma based on gene expression. The Journal of Clinical
Investigation, v.113, n.8, p.1243-1242, 2004.
CHAN, J. W. et al. Micro-Raman spectroscopy detects individual neoplastic and normal
hematopoietic cells. Biophysical Journal, v.90, p.648–656, 2006.
CHOI, N. et al. Thyroid incidentaloma detected by time-resolved magnetic resonance
angiography at 3T: prevalence and clinical significance. Korean Journal of Radiology, n.13,
v.3, p.275-282, 2012.
CHOW, E. K. et al. TLR agonists regulate PDGF-B production and cell proliferation through
TGF-b/type I IFN crosstalk. The EMBO Journal, v.24, n.23, p.4071-4078, 2005.
COELI, C. M. et al. Incidência e mortalidade por câncer de tireoide no Brasil. Arquivos
Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, v.49, n.4, p.503-509, 2005.
COMANDAROBA, M. P. G. et al. Carcinoma papilífero da tireoide associado à tireoidite de
Hashimoto: uma série de casos. Revista Brasileira de Cancerologia, v.55, n.3, p.255-261,
2009.
COOPER, D. S. et al. Revised American Thyroid Association management guidelines for
patients with thyroid nodules and differentiated thyroid cancer. Thyroid, v.19, p.1167-1214,
2009.
CORRAL, J. et al. Thyroglobulin gene point mutation associated with non-endemic simple
goitre. Lancet, v.341, n.8843, p.462-464, 1993.
CRAMER, J. D. et al. Analysis of the rising incidence of thyroid cancer using the
surveillance, epidemiology and end results national cancer data registry. Journal of Surgery,
v.148, n.6, p.1147-1153, 2010.
DAVIES, L.; WELCH, H. G. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States,
1973-2002. The Journal of the American Medical Association, v.10, n.295, p.2164-2167,
2006.
DEAN, D. S.; GHARIB, H. Epidemiology of thyroid nodules. Best Practice and Research Clinical Endocrinology and Metabolism, v.22, n.6, p.901-911, 2008.
DESAILLOUD, R.; HOBER, D. Viruses and thyroiditis: an update. Virology Journal, v.6,
n.5, 2009.
129
EGUCHI, K. Apoptosis in autoimmune diseases. Annals of Internal Medicine, v.40, n.4,
p.275-284, 2001.
EPICURO. In: Citador. Disponível em: <http://www.citador.pt/frases/as-pessoas-felizeslembram-o-passado-com-gratidao-epicuro-11154>. Acesso em: 20 jul. 2014.
EXPERTSMINDS.COM. Bendings vibrations assignment help. 2013. Disponível em:
<http://www.expertsmind.com/topic/normal-modes-of-vibrations/bending-vibrations913546.aspx>. Acesso em: 03 maio 2013.
EZABELLA, M. C. L. et al. Carcinoma medularda tireóide. Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia e Metabologia, v.42, n.4, p.310-322, 1998.
FAGIN, J. A.; MITSIADES, N. Molecular pathology of thyroid cancer: diagnostic and
clinical implications: best practice and research. Clinical Endocrinology and Metabolism,
v.22, n.6, p.955-969, 2008.
FARWELL, A. P.; BRAVERMAN, L. E. Inflammatory thyroid disorders. Otolaryngologic
Clinics of North America, v.29, n.4, p.541-556, 1996.
FERRAZ, A. R. et al. Diagnóstico e tratamento do câncer da tireoide. [s.l.]: Sociedade
Brasileira de Cirurgia de Cabeça e Pescoço, Projeto Diretrizes; Associação Médica Brasileira;
Conselho Federal de Medicina, 2001.
FINN, S. P. et al. Expression microarray analysis of papillary thyroid carcinoma and benign
thyroid tissue: emphasis on the follicular variant and potential markers of malignancy.
Virchows Archive, v.450, p.249-260, 2007.
FINLEY, D. J. et al. Molecular profiling distinguishes papillary carcinoma from benign
thyroid nodules. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, v.89, p.3214-3223,
2004a.
FINLEY, D. J. et al. Discrimination of benign and malignant thyroid nodules by molecular
profiling. Annals of Surgery, v.240, p.425-436, 2004b.
FOUKAKIS, T. et al. A PCR-based expression signature ofmalignancy in follicular thyroid
tumors. Endocrine-Related Cancer, v.14, n.2, p.381-391, 2007.
FRANKHAUSER, B. D. Review of Labeled Images from A&P 202. 2010. Disponível em:
<http://biology.clc.uc.edu/fankhauser/Labs/Anatomy_&_Physiology/A&P202/Endocrine_Sys
tem/histology_jpgs/thyroid_400x_P2252255lbd.JPG>. Acesso em: 15 ago. 2013.
FREIRE, S. D. Tumores e nódulos tireoidianos. 2008. Disponível em: <
file:///G:/MESTRADO/TIREOIDE/ARTIGO%201/FREIRE%202008%20%20Tumores%20e%20N%C3%B3dulos%20Tireoidianos%20%20%20dos%20Sintomas%20
ao%20Diagn%C3%B3stico%20e%20Tratamento%20%20%20MedicinaNET.htm>. Acesso
em: 07 abr. 2013.
FRILLING, A.; LIU, C.; WEBER, F. Benign multinodular goiter. Scandinavian Journal of
Surgery, v.93, n.4, p.278-281, 2004.
130
GAITAN, E. et al. Antithyroid effects in vivo and in vitro of babassu and mandioca: a staple
food in goiter areas of Brazil. European Journal of Endocrinology, v.131, n.2, p.138-144,
1994.
GANDOLFI, P. P. et al. The incidence of thyroid carcinoma in multinodular goiter:
retrospective analysis. Acta bio-medica: Ateneo Parmense, v.75, n.2, p.114-117, 2004.
GAO, T. et al. RFG (ARA70, ELE1) Interacts with the human androgen receptor in a ligand:
dependent fashion, but functions only weakly as a coactivator in cotransfection assays.
Molecular Endocrinology, v.13, n.10, p.1645-1656, 1999.
GIORDANO, T. J. et al. Molecular classification of papillary thyroid carcinoma: distinct
BRAF, RAS, and RET/PTC mutation-specific gene expression profiles discovered by DNA
microarray analysis. Oncogene, v.24, n.44, p.6646-6656, 2005.
GIUFFRIDA, D.; GHARIB, H. Anaplastic thyroid carcinoma: current diagnosis and
treatment. Annals of Oncology, v.11, n.9, p.1083-1089, 2000.
GNIADECKA, M. et al. Melanoma diagnosis by Raman spectroscopy and neural networks:
structure alterations in proteins and lipids in intact cancer tissue. The Journal of
Investigative Dermatology, v.122, n.2, p.443-449, 2004.
GOLBERT, L. et al. Aumento da expressão do proto-oncogene ras no bócio multinodular:
possível envolvimento na patogênese. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e
Metabologia, v.47, n.6, p.721-727, 2003.
GOMES, E. M. S. et al. Frequency of thyroid carcinoma and thyroid autoimmunity in
firstdegree relatives of patients with papillary thyroid carcinoma: a single center experience.
Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, v.55, n.5, p.326-330, 2011.
GOUGH, J.; SCOTT-COOMBES, D.; PALAZZO, F. F. Thyroid incidentaloma: an evidencebased assessment of management strategy. World Journal of Surgery, v.32, n.7, p.12641268, 2008.
GRAF, H. Doença nodular de tireoide. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e
Metabologia, v.48, n.1, p.93-104, 2004.
GUERRERO, M. A.; CLARK, O. H. Controversies in the management of papillary thyroid
cancer revisite. ISRN Oncology, v.2011, 2011, 5p.
HARRIS, A. T. et al .Raman spectroscopy and advanced mathematical modeling in the
discrimination of human thyroid cell lines. Head and Neck Oncology, v.1, n.38, 2009.
HARRIS, A. T. et al. Raman spectroscopy in head and neck cancer. Head & Neck Oncology,
v.2, n.6, p.2-6, 2010.
HEDINGER, C. Histological typing of thyroid tumours. 2. ed. Berlin: Springer-Verlag
Berlin Heidelberg, 1998. 76 p.
131
HEGEDÜS, L. Thyroid ultrasound: endocrinology and metabolism. Clinics of North
America, v.30, n.2, p.339-360, 2001.
HEGEDÜS, L.; BONNEMA, S. J.; BENNEDBAEK, A. N. Management of simple nodular
goiter: current status and future perspectives. Endocrine Reviews, v.24, n.1, p.102-132, 2003.
HOGIU, S. W.; WEEKS, T.; HUSER, T. Chemical analysis in vivo and in vitro by Raman
spectroscopy: from single cells to humans. Current opinion in Biotechnology, v.20, n.1,
p.63-73, 2009.
HORIBA - JOBIN YVON TECHNOLOGY. What is Raman spectroscopy? Disponível em:
<http://www.horiba.com/fr/scientific/products/raman-spectroscopy/raman-academy/ramanfaqs/what-is-raman-spectroscopy/>. Acesso em: 03 set. 2013.
HORN-ROSS, P. L. et al. Papillary thyroid cancer incidence rates vary significantly by
birthplace in Asian American women. Cancer Causes and Control, v.22, n.3, p.479-485,
2011.
HTWE, T. T. Thyroid malignancy among goitrous thyroid lesions: a review of hospital-based
studies in Malaysia and Myanmar. Singapore Medical Journal, v.53, n.3, p.159-163, 2012.
HUANG, Y. et al. Gene expression in papillary thyroid carcinoma reveals highly consistent
profiles. Proceedings of the National Academy Science of the United States of America,
v.98, n.26, p.15044-15049, 2001.
HUANG, Z. et al. Near-infrared Raman spectroscopy for optical diagnosis of lung cancer.
International Journal of Cancer, v.107, p.1047-1052, 2003.
HUANG, Z. et al. In vitro imaging of thyroid tissues using two-photon excited fluorescence
and second harmonic generation. Photomedicine and Laser Surgery, v.28, n.1, p.129-133,
2010.
HUGHES, D. T.; DOHERTY, G. M. Central neck dissection for papillary thyroid cancer.
Cancer Control, v.18, n.2, p.83-88, 2011.
HUNT, J. L. Molecular mutations in thyroid carcinogenesis. American Journal of Clinical
Pathology, p.116-127, 2002.
IMAIZUMI, M., et al. Radiation dose-response relationships for thyroid nodules and
autoimmune thyroid diseases in Hiroshima and Nagasaki atomic bomb survivors 55-58 years
after radiation exposure. The Journal of the American Medical Association, v.295, n.9,
p.1011-1022, 2006.
INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER – INCA. Câncer da tireoide. 2011. Ministério da
Saúde. Disponível em: <http://www.inca.gov.br/conteudo_view.asp?id=2187> Acesso em: 29
jun. 2012.
INTENZO, C. M. et al. Scintigraphic features of autoimmune thyroiditis. Radiographics,
v.21, n.4, p.957-964, 2001.
132
ITO, Y et al.. Prevalence and biological behavior of variants of papillary thyroid carcinoma:
experience at a single institute. Pathology, v.40, n.6, p.617-622, 2008.
JACKSON, C. E. et al. The two-mutational-event theory in medullary thyroid cancer.
American Journal of Human Genetics, v.31, n.6, p.704-710, 1979.
JARLØV, E. A. et al. Inadequacy of the WHO classification of the thyroid gland.
Thyroidology, v.4, n.3, p.107-110, 1992.
JARZAB, B. et al. Gene expression profile of papillary thyroid cancer: sources of variability
and diagnostic implications. Cancer Research, v.65, n.4, p.1587-1597, 2005.
KARGER, S. et al. ADM3, TFF3 and LGALS3 are discriminative molecular markersin fineneedle aspiration biopsies of benign and malignantthyroid tumours. British Journal of
Cancer, v.106, n.3, p.562-568, 2012.
KAMEMOTO, L. E. et al. Near-infrared micro-Raman spectroscopy for in vitro detection of
cervical cancer. Applied Spectroscopy, v.64, n.3, p.255-261, 2010.
KEBEBEW, E. et al. Diagnostic and prognostic value of angiogenesis-modulating genes in
malignant thyroid neoplasms. Surgery, v.138, p.1102-1109, 2005a.
KEBEBEW, E. et al. ECM1 and TMPRSS4 are diagnostic markers of malignant thyroid
neoplasms and improve the accuracy of fine needle aspiration biopsy. Annals of Surgery,
v.242, p.353-361, 2005b.
KEBEBEW, E. et al. Diagnostic and extent of disease multigene assay for malignant thyroid
neoplasms. Cancer, v.106, p.2592-2597, 2006.
KEBEBEW, E. et al. Diagnostic and prognostic value of cell cycle regulatory genes in
malignant thyroid neoplasms. World Journal of Surgery, v.30, p.767-774, 2006.
KELLER, M. D. et al. Detecting temporal and spatial effects of epithelial cancers with Raman
spectroscopy. Disease markers, v.25, n.6, p.323-337, 2008.
KIHARA, M. et al. Evaluation of cytologically benign solitary thyroid nodules by
ultrasonography: a retrospective analysis of 1877 cases. Auris Nasus Larynx. 2012.
KIM, D. L.; SONG, K. H.; KIM, S. K. High prevalence of carcinoma in ultrasonographyguided fine needle aspiration cytology of thyroid nodules. Endocrine Journal, v.55, n.1,
p.135-142, 2008.
KNOBEL, M.; MEDEIROS-NETO, G. Moléstias associadas à carência crônica de iodo.
Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, v.48, n.1, p.53-61, 2004.
KNOBEL, M.; MEDEIROS-NETO, G. Relevance of iodine intake as a reputed predisposing
factor for thyroid cancer. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, v.51, n.5,
p.701-712, 2007.
133
KNUDSEN, N. et al. Goitre prevalence and thyroid abnormalities at ultrasonography: a
comparative epidemiological study in two regions with slightly different iodine status.
Clinical Endocrinology, v.53, n.4, p.479-485, 2000.
KOLJENOVIC, S. et al. Detection of meningioma in dura mater by Raman spectroscopy.
Analitical Chemistry, v.77, n.24, p.7958-7965, 2005.
KOTHAPALLI, R. et al. Microarray results: how accurate are they? BioMed Central
Bioinformatics, v.3, n.22, 2002.
KUDO, T. et al. Serum calcitonin levels with calcium loading tests before and after total
thyroidectomy in patients with thyroid diseases other than medullary thyroid carcinoma.
Endocrine Journal, v.58, n.3, p.217-221, 2011.
KUNG, A. W. C. et al. The effect of pregnancy on thyroid nodule formation. The Journal of
Clinical Endocrinology and Metabolism, v.87, n.3, p.1010-1014, 2002.
LACROIX, L. et al. Oncogenes and thyroid tumors. Bulletin du Cancer, v.92, n.1, p.37-43,
2005.
LADENSON, P. W. Optimal laboratory testing for diagnosis and monitoring of thyroid
nodules, goiter, and thyroid cancer. Clinical Chemistry, v.42, n.1, p.183-187, 1996.
LAI, M. L. et al. Alpha-1-antichymotrypsin immunoreactivity in papillary carcinoma of the
thyroid gland. Histopathology, v.33, n.4, p.332-336, 1998.
LAU, P. D. et al. Raman spectroscopy for optical diagnosis in normal and cancerous tissue of
the nasopharynx: preliminary findings. Lasers in Surgery and Medicine, v.32, p.210-214,
2003.
LAU, D. P. et al. Raman spectroscopy for optical diagnosis in the larynx: preliminary finding.
Lasers in Surgery and Medicine, v.37, n.3, p.192-200, 2005.
LAURBERG, P. et al. Environmental iodine intake affects the type of nonmalignant thyroid
disease. Thyroid, v.11, n.5, p.457-469, 2001.
LAYFIELD, L. J. et al. Thyroid aspiration cytology: current status. CA: Cancer Journal for
Clinicians, v.59, n.2, p.99-110, 2009.
LAZAR, V. et al. Expression of the Na1/I2Symporter gene in human thyroid tumors: a
comparison study with other thyroid-specific genes. The Journal of Clinical Endocrinology
and Metabolism, v.84, n.9, p.3228-2234, 1999.
LE, T. T.; HUFF, T.; CHENG, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of lipids
in cancer metastasis. BMC Cancer, v.9, n.42, 2009. 12 p.
LESLIE, D. G. et al. Identification of pediatric brain neoplasms using Raman spectroscopy.
Pediatric Neurosurgery, v.48, p.109-117, 2012.
134
LEVIN, I. W.; BHARGAVA R. Fourier transform infrared vibrational spectroscopic imaging:
integrating microscopy and molecular recognition. Annual Review of Physical Chemistry,
v.56, n.429, 2005.
LGALS3 - Lectin, galactoside-binding, soluble. 3. 10 fev. 2014. Disponível em:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3958>. Acesso em: 11 fev. 2014.
LIEBER, C. A. et al. In vivo nonmelanoma skin cancer diagnosis using Raman
microspectroscopy. Lasers in Surgery and Medicine, v.40, n.7, p.46-467, 2008.
LIN, J. D. Thyroid cancer in thyroid nodules diagnosed using ultrasonography and fine needle
aspiration cytology. Journal of Medical Ultrasound, v.18, n.3, p.91-104, 2010.
LIN, J. D.; HSUEH, C.; HUANG, B. Papillary thyroid carcinoma with different histological
patterns. Chang Gung Medical Journal, v.34, n.1, p.23-34, 2011.
LIU, K. Z., et al. Infrared spectroscopy diagnosis of thyroid tumors. Journal of Molecular
Structure, v.661-662, p.397-404, 2003.
LIU, Z. et al. Highly prevalent genetic alterations in receptor tyrosine kinases and
phosphatidylinositol 3-kinase/akt and mitogen-activated protein kinase pathways in anaplastic
and follicular thyroid cancers. Journal of Clinical Endocrinology and Metabology, v.93,
n.8, p.3106-3116, 2008.
LOOKFORDIAGNOSIS. Carcinoma medular de tireoide. 2009. Disponível em:
<http://escuela.med.puc.cl/paginas/cursos/tercero/anatomiapatologica/imagenes_ap/fotos937941/941.jpg>. Acesso em: 24 jun. 2013.
LOPES, P. C. et al. Discriminating adenocarcinoma from normal colonic mucosa through
deconvolution of Raman spectra. Journal of Biomedical Optics, v.16, 2011.
LYNG, F. M. et al. Vibrational spectroscopy for cervical cancer pathology, from biochemical
analysis to diagnosis tool. Experimental and Molecular Pathology, v.82, n.121, 2007.
MACIEL, L. M. Z.; MAGALHÃES, P. K. R. Tireoide e gravidez. Arquivos Brasileiros de
Endocrinologia e Metabologia, v.52, n.7, p.1084-1095, 2008.
MACIEL, R. M. B.; KIMURA, E. T.; CERUTTI, J. M. Patogênese dos tumores diferenciados
da tiróide (papilífero e folicular). Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia,
v.49, n.5, p.691-700, 2005.
MAGALHÃES, P. K. R. et al. Carcinoma medular de tireóide: da definição às bases
moleculares. Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, v.47, n.5, p.515-528,
2003.
MAIA, A. L. et al. Nódulos de tireoide e câncer diferenciado de tireoide: consenso brasileiro.
Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, v.51, n.5, p.867-893, 2007.
MALINI, R. et al. Discrimination of normal, inflammatory, premalignant and malignant oral
tissue: a Raman spectroscopy study. Biopolymers, v.81, n.3, p.179-193, 2006.
135
MAROTTA, V. et al. RET/PTC rearrangement in benign and malignant thyroid diseases: a
clinical standpoint. European Journal of Endocrinology, v.165, n.4, p.499-507, 2011.
MARQUSEE, E. et al. Usefulness of ultrasonography in the management of nodular thyroid
disease. Annals of Internal Medicine, v.133, n.9, p.696-700, 2000.
MARTINHO, H. S. et al. Role of cervicitis in the Raman-based optical diagnosis of cervical
intraepithelial neoplasia. Journal of Biomedical Optics, v.13, n.5, 2008.
MATHUR, A. et al. A prospective study evaluating the accuracy of using combined clinical
factors and candidate diagnostic markers to refine the accuracy of thyroid fine needle
aspiration biopsy. Surgery, v.148, n.6, p.1170-1177, 2010.
MATOS, P. S. et al. Usefulness of HBME-1, cytokeratin 19 and galectin-3 immunostaining in
the diagnosis of thyroid malignancy. Histopathology, v.47, n.4, p.391-401, 2005.
MATSUO, E. S. et al. Marcadores biológicos de tumores tiroidianos. Arquivos Brasileiros
de Endocrinologia e Metabologia, v.48, n.1, p.114-125, 2004.
MAZZANTI, C. et al. Using gene expression profiling to differentiate benign versus
malignant thyroid tumors. Cancer Research, v.64, p.2898-2903, 2004.
MAZZAFERRI, E. L. Managing thyroid microcarcinomas. Yonsei Medical Journal, v.53,
n.1, p.1-14, 2012.
MCCALL, A. et al. The incidence of thyroid carcinoma in solitary cold nodules and
in multinodular goiters. Surgery, v.100, n.6, p.1128-1132, 1986.
MEDEIROS-NETO, G. Multinodular goiter: thyroid manager. São Paulo: Department of
Medicine, University of Sao Paulo Medical School, 2013. Disponível em: <
http://www.thyroidmanager.org/chapter/multinodular-goiter/>. Acesso em: 28 jun. 2013.
MORRIS, L. G. T.; MYSSIOREK, D. Improved detection does not fully explain the rising
incidence of well-differentiated thyroid cancer: a population-based analysis. The American
Journal of Surgery, v.200, p.454-461, 2010.
MOVASAGHI, Z.; REHMAN, S.; REHMAN, I. U. Raman spectroscopy of biological
tissues. Applied Spectroscopy Reviews, v.42, p.493-541, 2007.
MOVASAGHI, Z.; REHMAN, S.; REHMAN, I. U. Fourier transform infrared (FTIR)
spectroscopy of biological tissues. Applied Spectroscopy Reviews, v.43, p.134-179, 2008.
NATIONAL COMPREHENSIVE CANCER NETWORK – NCCN. Guidelines thyroid
carcinoma. National Comprehensive Cancer Network, v.1, 2013. 98p.
NAUMANN, D. FT-infrared and FT-Raman spectroscopy in biomedical research. Applied
Spectroscopy Reviews, v.36, n.2-3, p.239-298, 2001.
NETTER, F. H. Atlas de anatomia humana. 2. ed. Porto Alegre: Artmed, 2001. 525p.
136
NEUMANN, S. et al. Linkage of familial euthyroid goiter to the multinodular goiter-1 locus
and exclusion of the candidate genes thyroglobulin, thyroperoxidase, and na1/i2symporter.The
Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, v.84, n.10, p.3750-3756, 1999.
NIEDZIELA, M. Pathogenesis, diagnosis and management of thyroid nodules in children.
Endocrine-Related Cancer, v.13, n.2, p.427-453, 2006.
NIKIFOROVA, M. N. et al. RAS point mutations and PAX8-PPARγ rearrangement in thyroid
tumors: evidence for distinct molecular pathways in thyroid follicular carcinoma. The
Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, v.88, n.5, p.2318-2326, 2003.
NUNES, L. O. Estudo do carcinoma basocelular ex vivo por espectroscopia FT-Raman.
2003. 82f. Dissertação (Mestrado em Engenharia Biomédica) - Instituto de Pesquisa e
Desenvolvimento, Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, 2003.
PASCHKE, R. et al. The TSH receptor and thyroid diseases. BailliOre's Clinical
Endocrinology and Metabolism, v.10, n.1, 1996.
PATEL, M. R. et al. Trefoil factor 3 immunohistochemical characterization of follicular
thyroid lesions from tissue microarray. Archives of Otolaryngology - Head and Neck
Surgery, v.135, n.6, p.590-596, 2009.
PATEL, M. R. et al. STT3A, C1orf24, TFF3: putative markers for characterization of
follicular thyroid neoplasms from fine-needle aspirates. The Laryngoscope, v.121, n.5,
p.983-989, 2011.
PAYNTER, O. E., et al. Goitrogens and thyroid follicular cell neoplasia: evidence for a
threshold process. Regulatory Toxicology Pharmacology, v.8, n.1, p.102-119, 1988.
PECCIN, S. et al.Nódulos de tireoide: valor da ultra-sonografia e da biópsia por punção
aspirativa no diagnóstico de câncer. Revista da Associação Médica Brasileira, v.49, n.2,
p.145-149, 2003.
PFEIFER, A. et al. Molecular differential diagnosis of follicular thyroid carcinoma and
adenoma based on gene expression profile by using formalin-fixed paraffin-embedded tissues.
BMC Medical Genomics, v.6, n.38, 2013. 10p.
PINEDA, P. et al. Detection of malignancy markers in thyroid nodules by reverse
transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR). Revista Médica do Chile, v.131, n.9,
p.965-972, 2003.
PINHEIRO, P. Nódulo de tireoide: como diferencia-lo do câncer. 2010. Disponível em:
<file:///G:/MESTRADO/TIREOIDE/ARTIGO%201/ARTIGOS%20USADOS%20NO%20P
ROJETO/PINHEIRO%202010%20-%20MD.SAUDE.htm>. Acesso em: 27 fev. 2013.
PLATELET-DERIVED GROWTH FACTOR BETA POLYPEPTIDE - PDGFB. 09 fev.
2014. Disponível em:<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5155> Acesso em: 10 fev. 2014.
137
POBLETE, M. T. et al. Alpha 1-antitrypsin expression in human thyroid papillary carcinoma.
The American Journal of Surgical Pathology, v.20, n.8, p.956-963, 1996.
POLLER, D. N.; GLAYSHER, S. BRAF V600 co-testing is technically feasible in
conventional thyroid fine needle aspiration (FNA) cytology smears and can reduce the need
for completion thyroidectomy. Cytopathology, 2013.
PONCIN, S. et al. Oxidative stress: a required condition for thyroid cell proliferation. The
American Journal of Pathology, v.176, n.3, p.1355-1363, 2010.
PONTIFÍCIA UNIVERSIDADE CATÓLICA - PUC RIO DE JANEIRO. Técnicas de
caracterização. 2011. Disponível em: <http://www2.dbd.pucrio.br/pergamum/tesesabertas/0721249_2011_cap_4.pdf>. Acesso em: 25 set. 2013.
POP, V. J. et al. Lowmaternalfreethyroxineconcentrations during early pregnancy are
associated with impaired psychomotor development in infancy. Clinical Endocrinology,
v.50, n.2, p.149-155, 1999.
PORTELLA, G. et al. ONYX-015, an E1B gene-defective adenovirus, induces cell death in
human anaplastic thyroid carcinoma cell lines. The Journal of Clinical Endocrinology and
Metabolism, v.87, n.6, p.2525-2531, 2002.
PRASAD, N. B. et al. Three-gene molecular diagnostic model for thyroid cancer. Thyroid,
v.22, n.3, p.275-284, 2012.
PUJARY, P. et al. Raman spectroscopic methods for classification of normal and malignant
hypopharyngeal tissues: an exploratory study. Pathology Research International, v.2011,
n.632493, 2011.
PUXEDDU, E.; FAGIN, J. A. Genetic markers in thyroid neoplasia. Endocrinology and
Metabolism Clinics of North America, v.30, n.2, p.493-513, 2001.
RAGO, T.; VITTI, P. Role of thyroid ultrasound in the diagnostic evaluation of thyroid
nodules. Best Practice & Research Clinical Endocrinology & Metabolism, v.22, n.6,
p.913-928, 2008.
RAVETTO, C.; COLOMBO, L.; DOTTORINI, M. E. Usefulness of fine-needle aspiration
in the diagnosis of thyroid carcinoma: a retrospective study in 37895 patients. Cancer,
v.90, p.357-363, 2000.
RENSHAW, A. A. Accuracy of thyroid fine-needle aspiration using receiver operator
characteristic curves. American Journal of Clinical Pathology, v.116, p.477-482, 2001.
REPPLINGER, D. et al. Is Hashimoto’s thyroiditis a risk factor for papillary thyroid cancer?
Journal of Surgical Research, v.150, n.1, p.49-52, 2007.
RIESCO-EIZAGUIRRE, G.; SANTISTEBAN, P. New insights in thyroid follicular cell
biology and its impact in thyroid cancer therapy. Endocrine-Related Cancer, v.14, n.4,
p.957-977, 2007.
138
RODRIGUES, A. A. N. et al. Carcinoma medular de tireoide. Revista de Ciências Médicas,
v.19, n.1-6, p.91-97, 2010.
RODRIGUES, H. G. C.; PONTES, A. B. N.; ADAN, L. F. F. Use of molecular markers in
samples obtained from preoperative aspiration of thyroid. Endocrine Journal, v.59, n.5,
p.417-424, 2012.
RON, E. et al. Thyroid cancer after exposure to external radiation: a pooled analysis of seven
studies. Radiation Research, v.141, n.3, p.259-277, 1995.
ROSEN, J. et al. A six-gene model for differentiating benign from malignant thyroid tumors
on the basis of gene expression. Surgery, v.138, n.6, p.1050-1056, 2005.
RUCHITA, S. D.; AGRAWAL, Y. K. Raman spectroscopy: recent advancements, techniques
and applications. Vibrational Spectroscopy, n.57, p.163-176, 2011.
RUZINEK, D.; SZPAK-ULCOK, S.; JARZAB, B. Gene expression profile of human thyroid
cancer in relation toits mutational status. Journal of Molecular Endocrinology, v.2, n.47,
p.R91-R103, 2011.
SACHMECHI, I. et al. Thyroid carcinoma in single cold nodules and in cold nodules of
multinodular goiters. Endocrine Practice, v.6, n.1, p.5-7, 2000.
SAEZ, J. M. G. Diagnostic and prognostic markers in differentiated thyroid cancer. Current
Genomics, v.12, n.8, p.597-608, 2011.
SAHA, A. et al. Raman spectroscopy: a real-time tool for identifying microcalcifications
during stereotactic breast core needle biopsies. Biomedical optical express, v.2, n.10,
p.2792-2803, 2011.
SAHU, R. K.; MORDECHAI, S. Fourier transform infrared spectroscopy in cancer detection.
Future Oncology, v.1, n.5, p.635-647, 2005.
SAPIO, M. R. et al. Detection of RET/PTC and BRAF mutations in preoperative diagnosis of
thyroid nodules within determinate cytological findings. Clinical Endocrinology, v.65, n.5,
p.678-683, 2007.
SARANAC, L. et al. Why is the thyroid so prone to autoimmune disease? Hormone
Research in Paediatric, v.75, n.3, p.157-165, 2011.
SASSA, M. et al. Aberrant promoter methylation in overexpression of CITED1 in papillary
thyroid cancer. Thyroid, v.21, n.5, p.511-517, 2011.
SCHNEIDER, A. B. et al. Radiation-induced tumors of the head and neck following
childhood irradiation. Prospective studies, Medicine, v.64, n.1, p.1-15, 1985.
SCHNEIDER, A. B. et al. Radiation-induced thyroid carcinoma: clinical course and results of
therapy in 296 patients. Annals of Internal Medicine, v.105, n.3, p.405-412, 1986.
139
SCHNEIDER, A. B. et al. Dose-response relationships for radiation-induced thyroid cancer
and thyroid nodules: evidence for the prolonged effects of radiation on the thyroid. The
Journal of Clinical Endocrinology and Metabology, v.77, n.2, p.362-369, 1993.
SERPINA1 - Serpin peptidase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member
1. 09 fev. 2014. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/5265>. Acesso em: 10
fev. 2014.
SHAFER-PELTIER, K. E. et al. Model-based biological Raman spectral imaging. Journal of
Cellular Biochemistry. Supplement, v.39, p.125-137, 2002.
SHAHA, A. R. Diagnosis and work-up of thyroid nodules. Head and Neck Surgery, v.14,
n.2, p.60-62, 2003.
SHARUNGBAM, D. G. et al. Identification of stable endogenous control genesfor
transcriptional profiling of photon, proton andcarbon-ion irradiated cells. Radiation
Oncology, v.7, n.70, 2012. 12p.
SINNOTT, B.; RON, E.; SCHNEIDER, A. B. Exposing the thyroid to radiation: a review of
its current extent, risks, and implications. Endocrine Reviews, v.31, n.5, p.56-773, 2010.
SIPOS, J. A.; MAZZAFERRI, E. L. Thyroid cancer epidemiology and prognostic variables.
Clinical Oncology, v.22, p.395-404, 2010.
SMIT, B. J. et al. Neurologicdevelopment of the newborn and youngchild in relation to
maternalthyroid function. Acta Paediatrica, v.89, n.3, p.291-295, 2000.
SOBRINHO-SIMÕES, M. et al. Follicular thyroid carcinoma. Modern Pathology, S10-S18,
2011.
SOBRINHO-SIMÕES, M. et al. Molecular pathology of well-differentiated thyroid
carcinomas. Virchows Archive, v. 447, n. 5, p. 787-793, 2005.
SPITZWEG, C; MORRIS, J. C. Genetics and phenomics of hypothyroidism and goiter due to
NIS mutations. Molecular and Cellular Endocrinology, n.322, n.1-2, p.56-63, 2010.
STONE, N. et al. Raman spectroscopy for early detection of laryngeal malignancy:
preliminary results. The Laryngoscope, v.110, n.10, p.1756-1763, 2000.
SUSTER, S. Thyroid tumors with a follicular growth pattern problems in differential
diagnosis. Archives of Pathology and Laboratory Medicine, v.130, n.7, p.984-988, 2006.
TACCALITI, A. et al. Anaplastic thyroid carcinoma. Frontiers in Endocrinology, v.3, n.84,
2012. 7p.
TAKANO, T; YAMADA, H. Trefoil factor 3 (TFF3): promising indicator for diagnosing
thyroid follicular carcinoma. Endocrine Journal, v. 56, n. 1, p. 9-16, 2009.
TAKANO, T.; YAMADA, H. Trefoil factor 3 (TFF3): promising indicator for diagnosing
thyroid follicular carcinoma. Endocrine Journal, v. 56, n. 1, p. 9-16, 2009.
140
TALLINI, G. et al. Detection of thyroglobulin, thyroid peroxidase and RET/PTC1 mRNA
transcripts in the peripheral blood of patients with thyroid diseases. Journal of Clinical
Oncology, v.16, n.3, p.1158-1166, 1998.
TAN, G. H.; GHARIB, H.; READING, C. C. Solitary thyroid nodule: comparison between
palpation and ultrasonography. Archives of Internal Medicine, v.155, n.22, p.2418-2423,
1995.
TAN, G. H.; GHARIB, H. Thyroid incidentalomas: management approaches to nonpalpable
nodules discovered incidentally on thyroid imaging. Annals of Internal Medicine, v.126,
n.3, p.226-231, 1997.
TAN, Y. Y. et al. Does routine consultation of thyroid fine needle aspiration cytology change
surgical management? Journal of the American College of Surgery, v.205, p.8-12, 2007.
TEE, Y. Y. et al. Fine-needle aspiration may miss a third of all malignancy in palpable
thyroid nodules: a comprehensive literature review. Annals of Surgery, v.246, n.5, p.714720, 2007.
TEIXEIRA, C. S. B. et al. Thyroid tissue analysis through Raman spectroscopy. Analyst,
v.134, p.2361-2370, 2009.
TFF3 - Trefoil factor 3 (intestinal). 09 fev. 2014. Disponível em:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7033>. Acesso em: 10 fev. 2014.
TG - Thyroglobulin. 10 fev. 2014. Disponível em: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7038>
Acesso em: 11 fev. 2014.
TOMEI, S. et al. c-KIT receptor expression is strictly associated with the biological behaviour
of thyroid nodules. Journal of Translational Medicine, v.10, n.7, p.2-9, 2012.
TOMER, Y. Genetic susceptibility to autoimmune thyroid disease: past, present, and future.
Thyroid, v.20, n.7, p.715-725, 2010.
TPO - Thyroid peroxidase. 06 fev. 2014. Disponível em:
<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/7173> Acesso em: 09 fev. 2014.
TREROTOLI, P. et al. Prevalence of thyroid nodules in an occupationally radiation exposed
group: a cross sectional study in an area with mild iodine deficiency. BMC Public Health,
v.5, n.73, 2005.
UNIVERSIDADE DE CAMPINAS – UNICAMP. Departamento de Anatomia Patológica.
2011. Disponível em: <http://www.fcm.unicamp.br>. Acesso em: 15 mar. 2013.
UTIGER, R. D. Effects of smoking on thyroid function. European Journal of
Endocrinology, v.138, n.4, p.368-369, 1998.
UTZINGER, U. et al. Near-infrared Raman spectroscopy for in vivo detection of cervical
precancers. Applied Spectroscopy, v.55, n.8, p.955-959, 2001.
141
VAISMAN, M.; REIS, F. A. A. Tireotoxicose. In: CARNEIRO, A. J. V. et al. Clínica
médica: doenças da tireoide. São Paulo: Atheneu, 2003. p.33-72.
VAISMAN, M.; ROSENTHAL, D.; CARVALHO, D. P. Enzimas envolvidas na
organificação tireoideana do iodo. Arquivos Brasileiros de Metabologia e Endocrinologia,
v.48, n.1, p.7-13, 2004.
VARTANIAN, J. G. Diagnóstico e tratamento do câncer de tireoide. Onco&. Disponível
em: <http://revistaonco.com.br/wp-content/uploads/2013/03/artigo-cabeca.pdf>. Acesso em:
24 out. 2013.
VIDYASAGAR, M. S. et al. Prediction of radiotherapy response in cervix cancer by Raman
spectroscopy: a pilot study. Biopolymers, v.89, n.6, p.530-537, 2008.
VIERLINGER, K. et al. Identification of SERPINA1 as single marker for papillary thyroid
carcinoma through microarray meta-analysis and quantification of its discriminatory power in
independent validation. BioMed Central Medical Genomics, v.4, n.30, p.1-9, 2011.
VITALE, G. et al. Current approaches and perspectives in the therapy of medullary thyroid
carcinoma. Cancer, v.1, n.91, p.1797-1808, 2001.
WANG, Y. et al. Association of the T1799A BRAF mutation with tumor extrathyroidal
invasion, higher peripheral platelet counts, and overexpression of platelet-derived growth
factor-B in papillary thyroid cancer. Endocrine-Related Cancer, v.15, n.1, p.183-190, 2008.
WARD, L. S. et al. Diretrizes clínicas na saúde complementar - câncer diferenciado da
tireoide: diagnóstico. [s.l.]: Associação Médica Brasileira, 2011. 12p.
WATT, T. et al. Quality of life in patients with benign thyroid disorders: a review. European
Journal of Endocrinology, v.154, n.4, p.501-510, 2006.
WEBER, F. et al. Genetic classification of benign and malignant thyroid follicular neoplasia
based on a three-gene combination. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism,
v.90, p.2512-2521, 2005.
WEI, R.; STEWART, E. A.; AMAOKU, W. M. Suitability of endogenous reference genes for
gene expression studies with human intraocularendothelial cells. BMC Research Notes, v.6,
n.46, 2013. 7p.
WIEST, P. W. et al. Thyroid palpation versus high-resolution thyroid ultrasonography in the
detection of nodules. Journal of Ultrasound in Medicine, v.17, n.8, p.487-496, 1998.
WIKIMEDIA COMMONS. Anaplastic thyroid carcinoma. 2009. Disponível em:
<http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Anaplastic_thyroid_carcinoma_low_mag.jpg>.
Acesso em: 20 ago. 2013.
WOJTAS, B. et al. Unsupervised analysis of follicular thyroid tumours transcriptome by
oligonucleotide microarray gene expression profiling. Endokrinology Polska, v.64, n.5,
p.328-334, 2013.
142
XING, M. et al. BRAF mutation predicts a poorer clinical prognosis for papillary thyroid
cancer. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism, v.90, n.12, p.6373-6379,
2005.
XING, M. Molecular pathogenesis and mechanisms of thyroid cancer. Nature Reviews.
Cancer, v.13, n.3, p.184-199, 2013.
YANG, H. L. et al. P21 Waf-1 (Cip-1) enhances apoptosis induced by manumycin and
paclitaxel in anaplastic thyroid cancer cells. The Journal of Clinical Endocrinology and
Metabolism, v.88, n.2, p.763-772, 2003.
YANO, Y. et al. Gene expression profiling identifies platelet-derived growth factor as a
diagnostic molecular marker for papillarythyroid carcinoma. Clinical Cancer Research,
v.10, n.6, p.2035-2043, 2004.
YEH, M. W.; DEMIRCAN, O.; ITUARTE, P. False-negative fine-needle aspiration cytology
results delay treatment and adversely affect outcome in patients with thyroid carcinoma.
Thyroid, v.14, p.207-215, 2004.
ZHANG, X. et al. Intraoperative detection of thyroid carcinoma by Fourier transform infrared
spectrometry. Journal of Surgical Research, v.1, n.7, 2010.
REFERENCIAS CONSULTADAS
BERTOLAZZI, A. et al. Application of an immunodiagnostic method for improving
preoperative diagnosis of nodular thyroid lesions. Lancet, v.357, n.9269, p.1644-1650, 2001.
ESZLINGER, M. et al. Perspectives and limitations of microarray-based gene expression
profiling of thyroid tumors. Endocrine Reviews, v.28, n.3, p.322-338, 2007.
INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER JOSÉ ALENCAR GOMES DA SILVA.
Coordenação Geral de Ações Estratégicas. Coordenação de Prevenção e Vigilância.
Estimativa 2014: incidência de câncer no Brasil. Rio de Janeiro: Inca, 2014. 22p.
NATIONAL CENTER FOR BIOTECHNOLOGY INFORMATION. Genes and expression.
Library Of Medicine/Pubmed, 2013.