Using image analysis and processing for morphological

Using image analysis and processing for
morphological characterization of bovine
spermatozoa
Rebecca Espı́rito Santo da Cruz
Faculdade de Medicina Veterinária
Universidade Federal de Uberlândia
Uberlândia, MG, Brasil
[email protected]
Marcelo Emı́lio Beletti
Instituto de Ciências Biomédicas
Universidade Federal de Uberlândia
Uberlândia, MG, Brasil
[email protected]
Resumo—The semen analysis is the main method of
diagnosis in male fertility used in veterinary medicine.
However, due to the subjectivity intrinsic of an visual
analysis, it has being proposed to use computer image
analysis for the evaluation of sperm morphology. Thus,
the present study aims to characterize the morphology
of bull sperm head by using image processing and
analysis techniques. For morphological analysis it was
performed the preparation of smears, the capture and
segmentation of the images, and the automatic evaluation of various characteristics obtained from the head
of the sperm. In order to validate the efficiency of the
automatic segmentation, an index of similarity from the
comparison with manual segmentation was obtained.
From this ratio it was found that 85% of the heads
automatically detected had good quality segmentation.
The results show that the method can be used by
researchers in male fertility studies.
I. Introdução
Em termos mundiais, a pecuária bovina brasileira
destaca-se pelo seu efetivo e inesgotável potencial de crescimento. Esse crescimento demonstra a consolidação da
atividade, cada vez mais fortalecida pela maior disponibilidade de sêmen [1]. O aumento do número do rebanho
está diretamente ligado à melhoria das taxas reprodutivas
dos animais, que por sua vez depende diretamente da
fertilidade. Nenhum teste isolado é capaz de predizer a
fertilidade de uma amostra de sêmen, mas o exame de
várias caracterı́sticas fı́sicas e morfológicas pode predizer
uma maior fertilidade [2].
Várias técnicas têm sido empregadas para medir estes
fatores, entre elas encontra-se o espermograma. O espermograma consiste na avaliação fı́sica e morfológica do
sêmen, assumindo grande importância como diagnóstico,
sendo que o médico veterinário é frequentemente requisitado para a avaliação do animal quanto à sua habilidade
em produzir espermatozoides viáveis [3], seja em centrais
de inseminação ou em propriedades que utilizam a monta
natural para provar a aptidão do macho. É o principal
método de diagnóstico de fertilidade do macho utilizado na
rotina veterinária para a avaliação de várias caracterı́sticas
Bruno Augusto Nassif Travençolo
Faculdade de Computação
Universidade Federal de Uberlândia
Uberlândia, MG, Brasil
[email protected]
espermáticas, dentre elas a motilidade e a morfologia dos
espermatozoides [4], [5].
Frequentemente, a morfologia e a motilidade dos espermatozoides são estimadas de forma subjetiva, por meio da
avaliação visual das células espermáticas sob microscopia
óptica convencional, representando a principal análise laboratorial utilizada pelas centrais de coleta e congelamento
de sêmen [6]. Essa avaliação subjetiva, amplamente utilizada em laboratórios de andrologia, depende da habilidade
e percepção do técnico [7]. Por isso, com o objetivo de
reduzir a subjetividade, tendenciosidade, possı́veis falhas
e aumentar a reprodutibilidade entre diferentes examinadores, vem sendo proposto o uso de análise de imagem por
computador para a avaliação da motilidade e morfologia
dos espermatozoides [6], [7], [8], [9].
A análise de caracterı́sticas estáticas do espermatozoide
referentes à sua morfologia e a análise do movimento
espermático por meio da computação é uma análise mais
rápida e objetiva para avaliação do macho da espécie
bovina. A análise de imagens por computador oferece uma
maior precisão e confiabilidade nos resultados, pois reduz
a subjetividade, e consequentemente falhas que possam
surgir durante a avaliação, inerentes do processo feito
por análise visual, além de fornecer novas metodologias e
técnicas para a avaliação da fertilidade contribuindo desta
forma com melhoria da reprodução animal [10], [11], [2].
No entanto os sistemas computacionais já disponı́veis
apresentam algumas desvantagens que tornam seu uso
limitado como o elevado custo do equipamento, a necessidade de validação, o controle de qualidade e a padronização das avaliações realizadas [11].
Com o presente trabalho objetivou-se a caracterização morfológica da cabeça de espermatozoides de touros
por meio de técnicas computacionais de processamento
e análise de imagem. Foi realizada uma verificação da
viabilidade de se usar essa metodologia, por meio da
avaliação da precisão do algoritmo de segmentação. Essa
avaliação foi feita comparando-se os resultados da segmentação automática com a segmentação manual. Após a
segmentação, diversas medidas que permitem caracterizar
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270
morfologicamente as cabeças foram realizadas.
II. Materiais e Métodos
A análise da morfologia da cabeça de espermatozoides
bovinos é composta de três principais etapas: (i) Preparação das amostras e captura das imagens; (ii) Segmentação
automática das imagens; e (iii) Avaliação automática das
caracterı́sticas morfológicas das cabeças.
A. Preparação das amostras e captura das imagens dos
espermatozoides
Foram utilizadas 25 amostras de sêmen de touro fornecidas pelo Laboratório de Histologia da Universidade
Federal de Uberlândia. As amostras estavam armazenadas
em solução de citrato formalado, sendo 2,9% de citrato e
10% de formol até o momento do processamento. O sêmen
foi utilizado para captura das imagens para avaliação
da morfologia espermática. Para análise morfológica dos
espermatozoides foram realizados esfregaços das doses de
sêmen sendo que essas amostras já estavam fixadas pelo
citrato formalado. Após secagem ao ar, os esfregaços foram
hidrolisados por 25 min., em ácido clorı́drico 4N, lavados
em água destilada e secos à temperatura ambiente. Então,
foi colocada uma gota de azul toluidina a 0,025% em
tampão Mcllvaine (citrato de sódio-fosfato) pH 4 e coberto
com lamı́nula [9].
Após confecção dos esfregaços, fez-se a leitura por microscopia óptica utilizando a objetiva de imersão (100X).
Por meio de uma câmera conectada a um computador
acoplado ao microscópio, as imagens digitais das cabeças
espermáticas foram capturadas (Fig. 1).
Nessa imagem, os pixels ou pontos em preto representam
regiões que não pertencem aos espermatozoides, enquanto
que esses são marcados pelos pixels em branco. O processo de segmentação é fundamental para que as medidas
automáticas, descritas na próxima seção, possam ser calculadas. O método adotado para segmentação foi a limiarização, com limiar escolhido automaticamente baseando-se
na análise dos picos da segunda derivada do histograma
da imagem [13].
Figura 2. Resultado da segmentação automática das cabeças de
espermatozoides de touro contidas na Fig. 1.
Para verificar se o processo automático de segmentação
foi realizado corretamente, as cabeças dos espermatozoides
de touro também foram segmentadas manualmente. Em
seguida, foram comparados os dois métodos (Fig. 3). A
imagem obtida pela segmentação automática (Fig. 3a) e
pela segmentação manual (Fig. 3b) foram sobrepostas.
O resultado dessa sobreposição gerou uma nova imagem
com duas diferentes regiões (não considerando o fundo)
(Fig. 3c): R1, que contém pixels que pertencem à cabeça
do espermatozoide tanto na imagem segmentada automaticamente quanto na manual (pixels em branco na Fig. 3c);
e R2, que contém os pixels da cabeça do espermatozoide
somente na imagem obtida pela segmentação automática
ou somente pela segmentação manual (pixels em cinza
na Fig. 3c). Com isso, foi possı́vel calcular um ı́ndice de
similaridade entre a imagem original e a segmentada por
meio da seguinte equação:
Figura 1. Imagens das cabeças espermáticas de touro obtidas após
captura pela câmera acoplada ao microscópio óptico em aumento de
1000X.
B. Segmentação automática das imagens
Posteriormente as imagens obtidas foram processadas
realizando a segmentação [12], que neste caso significa
identificar a cabeça dos espermatozoides na imagem. Essa
identificação consiste em gerar uma nova imagem (Fig. 2).
S=
P (R1)
P (R1) + P (R2)
(1)
onde S é o ı́ndice de similaridade e P (R1) e P (R2)
indicam a quantidade de pixels que pertencem à região R1
e R2, respectivamente. Dessa forma, quando o resultado
da segmentação automática for exatamente igual ao da
manual, o valor de S será 1. Não havendo nenhuma
intersecção, o valor de S será 0.
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Figura 3. Segmentação das cabeças de espermatozoides de touro.
(a) Resultado da segmentação automática. (b) Resultado da segmentação manual. (c) Sobreposição dos resultados para realização
do cálculo do ı́ndice de similaridade S (Eq. 1).
C. Avaliação automática das caracterı́sticas morfológicas
das cabeças
Neste trabalho foram extraı́das medidas morfológicas
importantes das cabeças dos espermatozóides. As medidas
foram calculadas após o processo de segmentação. Foram
avaliadas área, perı́metro, elongação, simetria, textura,
entropia, largura e comprimento [14], [9], [5], [15], [16]. A
partir desses valores é possı́vel realizar análises que podem
ajudar na determinação da existência ou não de anomalias
na cabeça dos espermatozoides.
III. Resultados e Discussão
A. Avaliação do ı́ndice de similaridade
Analisando os resultados, verificamos empiricamente
que uma boa segmentação foi obtida para cabeças com
ı́ndice de similaridade S maior que 0, 80. A Fig. 4 mostra
alguns exemplos de cabeças com diferentes ı́ndices de
similaridade. Para valores acima de 0, 8 a detecção funcionou bem – pode-se notar que as imagens segmentadas
manualmente e as automáticas são bem semelhantes. No
entanto, para valores menores que 0, 8 pode-se observar
cabeças que possuem algum tipo de patologia ou então
estavam sobrepostas a outras cabeças, ou apresentavam
algum artefato de técnica que de alguma forma interferiu
em sua morfologia, prejudicando desta forma a segmentação. Ou ainda algum artefato presente na lâmina que
foi considerado como sendo uma cabeça e acabou sendo
segmentado.
No total, 1228 cabeças foram consideradas, sendo que
953 (85%) obtiveram grau de similaridade maior que 0, 8
(Fig. 5). Com isso, podemos considerar que o algoritmo de
segmentação automática funciona muito bem. As cabeças
com similaridade menor que 0, 8 – o que indica que não
foram corretamente segmentadas – poderiam ser descartadas por meio da análise de outras medidas (como, por
exemplo, simetria ou área).
Figura 4.
Exemplos de imagens com diferentes ı́ndices de similaridade. As images são apresentadas aos pares, onde a imagens à
esquerda mostram o resultado da segmentação automática (mas com
os pixels com intensidades da imagens originais) e as imagens à direita
mostram a segmentação manual.
B. Análise da Morfologia da Cabeça
Como o ı́ndice de similaridade mostrou que o algortimo
de segmentação pode ser usado para detecção automática
das cabeças de espermatozóides nas imagens, o próximo
passo é obter medidas referentes a essas cabeças, de
forma a caracterizar morfologicamente o espermatozoide.
Foram calculadas, para cada cabeça, as seguintes medidas:
Figura 5. Grau de similaridade de todas as cabeças espermáticas
analisadas.
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272
Tabela I
Média e desvio padrão das 25 amostras analisadas, para cabeças com simetria maior que 0.9.
Amostra
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Média
Desvio
Área (µm)
(µm)
40,4
35,1
34,9
36
39,2
35,5
34,4
36,2
37,8
40,9
37
36,1
34,1
36,3
36,7
40,6
35,2
40,4
37,6
36
41
42,9
41,7
36
40
37,68
2,54
Perı́metro
(µm)
27,1
24,9
24,1
24,7
25,9
24,3
24,4
25
25,3
26,3
25,1
24,7
23,9
25
24,6
25,9
24,4
25,7
25,4
24,7
26,3
26,8
26,2
24,2
25,8
25,21
0,86
Elongação
Simetria
Textura
Entropia
4,7
4,8
4,03
4,12
3,62
4,13
4,69
4,99
4,29
4,12
4,35
4,58
4,33
4,53
3,55
3,73
4,42
3,7
4,24
4,56
3,98
3,95
4,06
3,69
4,2
4,21
0,38
0,94
0,95
0,94
0,95
0,94
0,95
0,95
0,95
0,96
0,95
0,95
0,95
0,95
0,95
0,95
0,94
0,95
0,95
0,94
0,96
0,95
0,96
0,96
0,96
0,96
0,95
0,01
3,93
2,77
2,55
1,74
4,6
2,47
2,36
3,69
5,42
3,28
3,47
2,46
3,53
2,9
4,71
5,22
2,91
6,81
2,22
3,38
4,31
3,76
5,38
6,41
2,84
3,72
1,31
3,86
3,34
3,3
2,78
4,1
3,24
3,14
3,72
4,21
3,6
3,67
3,24
3,71
3,39
4,06
4,25
3,37
4,52
3
3,56
3,86
3,8
4,17
4,58
3,37
3,67
0,46
Figura 6.
Exemplo de cabeças com patologias ou artefatos de
técnica. Em muitos casos essas imagens podem ser eliminadas da
análise morfológica por meio de uma consulta ao valor de simetria.
Para imagens mostradas nesta figura, todas cabeças apresentam
simetria abaixo de 90%.
área (µ2 m), perı́metro (µm), elongação, simetria, textura,
entropia, comprimento (µm) e largura (µm). O cálculo
dessas medidas serve também não só para caracterizar
o espermatozoide, mas também como uma etapa de pósprocessamento, pois é possı́vel remover das análises cabeças com medidas discrepantes da média. No caso, a medida
escolhida foi a simetria. A Tab. I apresenta o resultado das
medidas para as 25 amostras. Foram selecionadas somente
as cabeças com simetria acima de 90%, porque são as com
maior chance de apresentarem morfologia normal.
Como pode ser visto na Fig. 6, cabeças com simetria
abaixo de 90% possuem algum tipo de patologia, sobreposição com outras cabeças, ou presença de artefato de
técnica que de alguma forma interferem na morfologia
espermática, prejudicando dessa forma a segmentação.
Os valores obtidos para as medidas apresentadas na
Tab. I foram semelhantes aos valores encontrados na
Compri–
mento (µm)
10,5
9,7
9,2
9,4
9,6
9,4
9,6
9,8
9,6
10
9,5
9,5
9,1
9,6
9,1
9,6
9,3
9,5
9,8
9,5
9,7
10
10
9,1
9,9
9,6
0,32
Largura
(µm)
4,9
4,5
4,7
4,7
5,1
4,7
4,5
4,5
4,9
5
4,6
4,6
4,5
4,6
4,9
5,1
4,6
5,2
4,8
4,6
5,1
5,2
5,1
4,8
5
4,8
0,23
literatura, demonstrando que a análise automática pode
ser utilizada para análise da morfologia da cabeça. Vale
notar que pode haver uma variação nas medidas devido à
raça [15], espermatozoide normal ou defeituoso [17] e fatores extrı́nsecos como, por exemplo, má nutrição, traumas
e variação da temperatura ambiental, que afetam direta
ou indiretamente a espermatogênese. E essas variações são
esperadas entre indivı́duos mesmos que estes apresentem
fertilidade comprovada [18].
Além disso, os métodos de fixação celular, calibração das
imagens digitais, equipamentos e métodos de mensuração
podem alterar a conformação ou os valores absolutos das
medidas [18]. Alguns estudos relatam a possibilidade de
existir uma relação entre a forma da cabeça do espermatozoide e a fertilidade de touros. Animais de maior fertilidade
produziriam espermatozoides com cabeças alongadas e
afiladas em comparação a touros de menor fertilidade [19].
IV. Conclusão
Neste trabalho foi feita a caracterização morfológica das
cabeças espermáticas de touros por meio da utilização
de técnicas computacionais de processamento e análise de
imagem. Com a utilização da análise de imagem computacional foi possı́vel identificar diversas caracterı́sticas da
cabeça dos espermatozoides, como área, perı́metro, elongação, comprimento, largura, simetria, textura e entropia.
A análise da segmentação automática foi comparada com
a segmentação manual, na qual foi possı́vel avaliar a
qualidade do método automático. Verificou-se que 85% das
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273
cabeças detectadas automaticamente apresentam uma boa
qualidade de segmentação.
As rotinas atuais já estão sendo utilizadas em vários
projetos de pesquisa relacionados ao estudo da fertilidade
bovina. Como trabalhos futuros pretende-se avaliar em detalhe a importância de cada medida usada (ou combinação
de medidas) para definir novos parâmetros de fertilidade
espermática.
[17] P. d. A. B. Miranda, C. E. dos Santos Fernandes, S. da Silva Moraes, A. R. de Oliveira, S. d. C. P. Lopes, and T. B. Amaral,
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Rev. Bras. Reprod. Anim, vol. 35, no. 2, pp. 160–170, 2011.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao CNPq, CAPES, FAPEMIG e
PROPP-UFU pelo suporte financeiro.
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