EFEITOS DO TRATAMENTO CRÔNICO COM ROSIGLITAZONA NA

EFEITOS DO TRATAMENTO CRÔNICO COM
ROSIGLITAZONA NA BIOSSÍNTESE DA
TESTOSTERONA EM RATOS
Luana Maria Mariz Gomes da Silva1, Aline Ferreira da Silva Mariano2, Cleiton Diniz Barros3, Maria do Carmo Alves
de Lima4, Suely Lins Galdino5, Ivan da Rocha Pitta6, Maria Inês Wanderley7, Janaína de Albuquerque Couto8

Introdução
A rosiglitazona corresponde a uma
tiazolidina-2,4-diona
(glitazona),
utilizada
na
terapêutica como um hipoglicemiante oral no
tratamento da diabetes mellitus tipo 2, visto que
apresenta efeitos sob a sensibilização da insulina.
Contudo, este tratamento tem provocado redução no
nível de testosterona, comprometendo a funções deste
hormônio [1,2]. Tendo em vista a ampla aplicação
terapêutica deste fármaco, é de fundamental
importância avaliar quais as conseqüências da sua
utilização, evitando possíveis efeitos indesejáveis [3].
A rosiglitazona, assim como as demais tiazolidinonas,
ao ocasionar a deficiência de andrógenos, pode inverter
estes efeitos e promover a produção e ação dos
adipócitos, com efeitos colaterais clínicos adversos [4].
A eficácia da rosiglitazona como agente
hipoglicemiante deve-se ao seu mecanismo de ação
como um agente agonista do receptor gama
proliferador ativado do peroxissomo (PPAR-γ) [5].
Estes receptores nucleares são ligantes ativadores de
fatores transcricionais que regulam diversas atividades
biológicas desde a diferenciação e o desenvolvimento
celular até o metabolismo dos lipídeos e a homeostase
[6]. Ebora esteja comprovada a ação das tiazolidinonas
sobre a biossíntese da testosterona, há uma escassa
informação a respeito desta interferência na
esteroidogênese testicular, o que justifica a pesquisa
destes mecanismos, sendo estes mais seguros e providos
de menos efeitos colaterais. Diante do exposto, o presente
trabalho tem como objetivo avaliar a deficiência
androgênica em modelos animais normais. Para isso
avaliamos o efeito do tratamento crônico com a
rosiglitazona sobre os níveis plasmáticos de testosterona
(modelo in vivo) e sobre a produção testicular desse
hormônio (modelo ex-vivo), utilizando ratos machos
adultos normais.
Material e métodos
A. Modelo in vivo
Para a realização do ensaio in vivo, utilizamos
ratos Wistar (Rattus norvegicus) adultos, machos, pesando
entre 250-300g. Os ratos foram previamente divididos em
grupos de 06 animais, mantidos em gaiolas apropriadas, em
sala climatizada, havendo 10 dias de adaptação antes do
início dos experimentos. O grupo teste utilizou a
rosiglitazona e o grupo controle utilizou o veículo. Os
grupos foram tratados por um período de 15 dias, por via
oral. Após o tratamento, os animais foram eutasianados, e
em seguida, foi feita a coleta de sangue, o qual foi
centrifugado para obtenção do plasma e estocado à – 20ºC
para posterior análise por radioimunoensaio (RIE) usando
kit comercial.
________________
1. Aluna de graduação do Curso de Farmácia, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof. Moraes do Rego, s/n, Cidade Universitária, Recife,
PE, CEP 50770-901. E-mail: [email protected]
2. Aluna de Graduação do Curso de licenciatura em Ciências Biológicas, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Rua Manoel de Medeiros
s/n, Dois Irmãos, Recife, PE, CEP 52171-900.
Segundo Autor é Professor Adjunto do Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Av. Bento
Gonçalves, 9500, prédio 43423, sala 209, Porto Alegre, RS, CEP 91501-970.
3. Aluno do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof.
Moraes do Rego, s/n, Cidade Universitária, Recife, PE, CEP 50770-901.
4. Professora Adjunta do Departamento de Ciências Farmacêuticas, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof.
Moraes do Rego, s/n, Cidade Universitária, Recife, PE, CEP 50770-901.
5. Professora Associada do Departamento de Antibióticos, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof. Moraes do
Rego, s/n, Cidade Universitária, Recife, PE, CEP 50770-901.
6. Professor Associado do Departamento de Antibióticos, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Av. Prof. Moraes do
Rego, s/n, Cidade Universitária, Recife, PE, CEP 50770-901.
7. Professora Associada do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Pernambuco, Av.
Prof. Moraes do Rego, s/n, Cidade Universitária, Recife, PE, CEP 50770-901.
8. Professora Assistente do Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Área de Bioquímica e Biofísica, Universidade Federal Rural de
Pernambuco, Rua Dom Manoel de Medeiros s/n. Dois Irmãos. Recife – PE. CEP 52171-900
Apoio financeiro: UFPE, UFRPE e CNPq.
B. Modelo in vivo e ex vivo
Os animais utilizados no ensaio in vivo, após serem
eutasianados, tiveram os testículos e a vesícula seminal
removidos. Dois tratados com a rosiglitazona e dois
apenas com o veículo tiveram seus testículos
cuidadosamente descapsulados e incubados em uma
solução
enzimática
(2mL/testículo)
contendo
colagenase (0,5mg/mL), inibidor de tripsina
(0,2mg/mL) e leupeptina (5µg/mL), todos dissolvidos
em tampão fosfato-salina (PBS) (136,9 mM NaCl, 2,68
mM KCl, 8,1 mM Na2HPO4.7H2O, 1,47 mM KH2PO4)
contendo albumina sérica bovina (BSA) (1mg/mL). O
pH foi ajustado para 7,4 e a incubação teve duração de
20-30 minutos em um banho-maria a 34ºC, sob
agitação de 100 ciclos/minuto até ocorrer a dispersão
dos túbulos em uma massa homogênea. Em seguida, o
tecido disperso foi imediatamente diluído à 50mL com
PBS/BSA para diminuir o efeito da enzima, os túbulos
seminíferos sedimentados durante 2 minutos e o
sobrenadante foi filtrado através de malha de nylon
(80µm). O filtrado foi centrifugado em tubos plásticos
de 50mL a 150xg, 21ºC, durante 15 minutos. O
sobrenadante foi descartado e as células sedimentadas
foram ressuspendidas em M199/BSA contendo
NaHCO3 (2,2 mg/mL) e BSA (1mg/mL), com o auxílio
de uma pipeta plástica. Essa suspensão (5 mL) foi
colocada cuidadosamente sobre o gradiente de Percoll
(0 a 90%), realizando-se, em seguida, a centrifugação a
1.300xg durante 30 min a 21oC. A fração das células de
Leydig (interface 43-68%) foi aspirada com seringa de
plástico de 10 mL e lavada duas vezes em M199/BSA
com M199. Em seguida, as células foram contadas
utilizando uma câmara de Neubauer. O número de
células a serem incubadas foi determinado previamente
em 0,35 x 106células/0,5mL de meio de incubação. Em
seguida, as células foram incubadas a 34ºC numa
atmosfera de 95% de O2 e 5% de CO2 durante 3 horas
em banho maria com agitação de 60 ciclos por minuto,
com meio de cultura M199, com a rosiglitazona e o
controle (1, 5, 10 e 100 µM) em condições basais e
estimuladas com gonadotrofia coriônica humana
(hCG)(1 mUI/mL). Após o término da incubação as
células foram precipitadas por centrifugação (150xg
por 15 min) a 4ºC, o sobrenadante coletado e
armazenado a 20ºC para posterior dosagem de
testosterona por RIE [7]. Em seguida, as células foram
incubadas por 3 horas com os diferentes estímulos
(hCG, dbcAPM) e precursores (22-hidroxi-colesterol e
pregnenolona).
testosterona estimulada no meio de incubação, a qual nos
forneceu os resultados expressos na tabela 1. O tratamento
com a rosiglitazona não alterou os níveis plasmáticos de
testosterona. Os resultados do modelo ex-vivo foram
expressos como ∆% do estimulado menos o basal e
mostraram que a rosiglitazona inibe em 51,6 ± 1,7 % e 45,8
± 0,9 % a produção de testosterona estimulada pela hCG e
dbcAMP, respectivamente e em 59,8 ± 5,1 % induzida
pelo 22(R)-hidroxi-colesterol, mas não afeta a secreção
induzida pela pregnenolona. De acordo com os resultados,o
tratamento crônico com a rosiglitazona inibe a produção de
testosterona pelas células de Leydig. Sugerimos que esta
inibição se dê por inibição da função da enzima P450 scc,
visto que a produção de testosterona induzida pelo 22(R)hidroxicolesterol, que acessa diretamente a mitocôndria e é
substrato para a P450 scc (enzima passo limitante no
processo de esteroidogênese) foi reduzida em 59,8 ± 5,1 %
pelo tratamento com a rosiglitazona, enquanto que a
produção de testosterona induzida pela pregnenolona, que é
o produto da reação catalisada pela P450 scc, não foi
afetada pelo tratamento com a rosiglitasona.
Agradecimentos
Agradecemos a Universidade Federal de Pernambuco, a
Universidade Federal Rural de Pernambuco e ao Conselho
Nacional
de
Desenvolvimento
Científico
e
Tecnológico/CNPq.
Referências
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
Resultados e Discussão
Por meio do modelo in vivo obtivemos as células de
Leydig dos dois grupos de animais (controle e
rosiglitazona). Conforme descrito na metodologia do
modelo ex vivo, realizamos a leitura da dosagem de
[7]
INAN M., BASARAN U, DIKMEN D., KANTER M., YALCIN O.,
AYDOGDU N., TURAN, N. 2007 Rosiglitazone, an agonist of
peroxisome proliferator-activated receptor-gamma, prevents
contralateral testicular ischaemia-reperfusion injury in prepubertal
rats. Clin Exper Pharmacol Physiol, 34:457-461.
MOURÃO, R.H., SILVA, T.G., SOARES, A.L.M., VIEIRA, E.S.,
SANTOS, J.N., LIMA, M.C.A., LIMA, V.L.M., GALDINO, S.L.,
BARBE, J., PITTA, I.R. 2005 Synthesis and biological activity of
novel acridinylene and benzylidene thiazolidediones, European
Journal of Medicinal Chemistry, 40:1129-1133.
VIERHAPPER, P., NOWOOTNY, P., WALDAUSL. 2003 Reduced
production rates of testosterone and diidrotestosterone in healtly
men treated with rosiglitazone, Elsevier Science, 34:230-232.
CARRUTHERS, M.; TRINICK, T.R.; JANKOWSKA, E. ;
TRAISH, A.M. 2008 Are the adverse effects of glitazones linked to
induced testosterone deficiency?, Cardiovascular Diabetology,
07:1-6.
LENHARD, J.M. 2001 PPARγ/RXR as a molecular target for
diabetes, Receptors Channels, 07:249-258.
HOUSEKNECHT, K.L., COLE, B.M., STEELE, P.J. 2001
Peroxissome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) and its
ligands: a review, Domestic animal endocrinology, 22: 1-23.
WANDERLEY, M. I. & NEGRO-VILAR, A. 1996 Pretreatment
with phorbolester and LHRH agonist reduces testosterone
production and protein kinase C activity in rat Leydig cells
challenged with PDBu and LHRH. Braz J Med Biol Res, 29:15571565.
Tabela 1. Efeitos do tratamento crônico por vo com Rosiglitazona (5mg/Kg) durante 15 dias, sobre a secreção de
testosterona induzida pelo hCG, dbcAMP, 22-OH-colesterol e pregnenolona. As células ( 0,35 x 106/ 0,5 mL) foram
incubadas durante 3 horas. % estimulado pelo basal: diferença percentual (%) da produção de testosterona estimulada
menos o basal do respectivo grupo. Os resultados representam a média  EPM de determinações em triplicata. * p 
0,01) em relação ao respectivo controle (ANOVA).
Adições
hCG (1 mIU/mL)
Dibutiril cAMPb (1mM)
22-hidroxi-colesterol (10M)
Pregnenolona (1M)
% da testosterona
Controle
Rosiglitazona
2415120,7
1246,742,1
2296,755,6
1052,722,4
7702,3330,4
4605,3393,3
344591,1
3549200,2