Docentes: Carla Coutinho, Nuno Mira

Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica
Engenharia Genética
TP5: Tipagem molecular de isolados clínicos do
complexo Burkholderia cepacia
Docentes: Carla Coutinho, Nuno Mira
Dezembro de 2014
75559, Ana Palma
75720, Diogo Cardoso
75726, Bernardo Noronha
Índice
1.
Resultados ............................................................................................................................. 2
2.
Discussão ............................................................................................................................... 4
3.
Referências ............................................................................................................................ 8
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1. Resultados
No trabalho laboratorial 5 analisou-se os perfis de ribotipagem do complexo de
isolados de B. cepacia apresentados em seguida (figura 1). Nos poços 2 a 12 encontram-se
estes perfis e no poço 1 o marcador de pesos moleculares.
N
Fig. 1 – Ribotipos do complexo de isolados de B. cepacia após digestão do DNA genómico com EcoRI e hibridação
com com sonda universal (“acetylaminoflourene-labeled 16S e 34S rRNA de E. coli [1]) nos poços 2 a 12. Marcador
de pesos moleculares no poço 1.
Durante a actividade laboratorial construiu-se a matriz binária apresentada
em seguida (figura 2). As colunas correspondem aos poços 2 a 12 da figura 1. A cada perfil
foi atribuido o número 1 quando apresenta uma banda e 0 quando esta está ausente
Fig. 2 - Matriz binária produzida no TP5. 23 linhas e 11 colunas, representando os poços 2 a 12 da fig. 1
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De seguida utilizou-se o software NTSYS-pc para que se construísse um dendograma
com base na matriz binária anteriormente elaborada.
Fig. 3 - Dendograma obtido com o software utilizado no TP5
O coeficiente de correlação cofenética obtido foi 0.93290.
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2. Discussão
A ribotipagem é um método laboratorial que permite comparar espécies
filogeneticamente e identificar estirpes de bactérias da mesma espécie através da
comparação ao nível das sequências 16S e 23S de DNA ribossómico. O procedimento
adoptado neste método é semelhante ao da hibridação de Southern, começando pela
restrição do DNA genómico com uma endonuclease (no caso deste laboratório, utilizou-se
EcoRI). Seguindo-se os processos habituais na técnica mencionada, utilizan-se como sonda
DNA ribossómico 16S e 23S de E.Coli, que, devido ao elevado nível de conservação durante
o processo evolutivo destas sequências, se pode considerar como uma “sonda universal” [3]
para esta técnica.
A análise e comparação das bandas de hibridação dos diferentes poços- normalmente
recorrendo a métodos computacionais- permite inferir conclusões quanto à relação
filogenética dos organismos ou distinguir estirpes da mesma espécie.
O objectivo da actividade laboratorial foi então o de observar a relação filogenética
entre as várias estirpes do complexo B. cepacia de um conjunto de isolados clínicos. O
complexo B. cepacia é um grupo de espécies de bactérias que surgem como patogénicos
oportunistas de alguma relevância, particularmente a pacientes que sofrem de fribrose
quística
[3].
Pode portante ser relevante a distrinção dos isolados em termos da estirpe
presente em cada amostra, uma vez que estirpes diferentes têm patogeneidades
diferentes. Pode também ser importante saber qual a estirpe presente em cada amostra
para que se possa identficar a fonte de contaminação.
Recorreu-se assim à técnica de ribotipagem, tendo sido construído um dendograma a
partir dos perfis de ribotipagem de B. cepacia previamente obtidos.
O software utilizado transformou a matriz binária introduzida (figura 1) numa matriz
de similaridade triangular usando o coeficiente de similaridade Dice, SD
[1].
A posterior
construção do dendograma a partir desta matriz foi feita pelo método UPGMA
(Unweighted-Pair Group Method using Arithmetic means), que forma grupos
emparelhando sucessivamente padrões de ribotipagem similares de acordo com a
distância entre bandas
[1].
O coeficiente de correlação cofenética obtido (0.93290) foi
bastante próximo de 1, o que significa que o modelo criado é adequado para reproduzir os
nossos dados iniciais (a matriz binária). Um coeficiente maior que 0.7 é considerado
razoável e igual a 1 é considerado ideal, pelo que o obtido laboratorialmente representa
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efectivamente um bom nível de correlação entre a realidade e o dendograma produzido,
desde que a matriz binária represente fielmente os perfis de ribotipagem.
Por análise dos perfis de ribotipagem (figura 1), podemos prever a proximidade
filogenética das estirpes presentes em cada amostra - quanto maior o número de bandas
de peso molecular correspondente, maior a sua proximidade. Observa-se que os ribotipos
dos poços 3, 5 e 6 aparentam ser iguais (as bandas obtidas por digestão cromossómica e
posterior hibridação com a sonda universal são iguais, ou pelo menos aparentam sê-lo)..
Também os ribotipos dos poços 10 e 11 parecem coincidir, assim os dos poços 4 e 8
também aparenta ser idêntico. Já os poços 7, 9 e 12 aparentam conter ribótipos únicos
relativamente ao resto dos poços.
É importante referir que para concluir se as amostras em cada poço são ou não
idênticas, se deu apenas importância ao peso molecular de cada banda (ou seja, a distância
percorrida no gel) e não à largura de cada banda, que é referente à quantidade de amostra.
Observando agora o dendograma obtido (figura 3) pode-se concluir quanto à
proximidade filogenética das estirpes presentes nas amostras recolhidas. As estirpes
representadas em ramos do dendograma que têm origem num ponto com maior
coeficiente de Dice SD (representado no eixo das abcissas) são mais próximas
filogeneticamente do que as que derivam de ramos com origem num ponto com menor S D,
uma vez que o coeficiente de Dice é uma estatística usada para comparar a similaridade
entre duas amostras [2].
Por observação do dendograma, pode-se confirmar que, entre as amostras recolhidas,
há estirpes extremamente semelhantes, tais como as dos poços 3, 5 e 6, e há estirpes um
pouco mais afastadas filogeneticamente, sendo as menos semelhantes a do poço 2 e 10 ou
a de 2 e 11. Pode-se então confirmar que, muito provavelmente, as amostras dos poços 2 e
8 pertencem à mesma estirpe de B. cepacia, as amostras dos poços 3, 5 e 6 pertencem a
outra estirpe de B. cepacia e as amostras dos poços 10 e 11 a outra estirpe ainda. As
amostras dos poços 7, 9 e 12, com base no dendograma, apresentam ribotipos únicos
neste conjunto de amostras. Todos estes resultados vão de acordo com a previsão feita ao
observar os perfis de ribotipagem.
Analisou-se o artigo de onde foram recolhidos os ribotipos utilizados
[1]
por forma
a comparar o dendograma obtido neste trabalho laboratorial e o obtido pelos autores do
artigo aquando do seu estudo. A figura com os resultados do artigo apresenta-se na página
seguinte, figura 4.
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Fig. 4 - Dendograma mostrando os resultados obtidos pelos autores do artigo para as estirpes de B. cepacia e isolados em
estudo. A vermelho estão indicados os poços em que se encontrava o respectivo isolado. Os isolados denominam-se por
IST4XX. No poço 12 encontra-se a estirpe ATCC25416, e a, b e d referem-se a estirpes epidémicas altamente transmissíveis.
Estes últimos funcionaram como estirpes de referência.
Verifica-se, por análise da figura 4, que as previsões acima efectuadas relativamente à
relação filogenética entre estirpes do complexo de B. cepacia foram bastante acertadas – a
relação entre estirpes e os respectivos valores do coeficiente de Dice é praticamente igual
na figura 4 (obtida pelos autores do estudo) e na figura 3 (obtida no trabalho prático).
Observam-se algumas disparidades, por exemplo ao nível da relação entre a estirpe do
poço 12 e a dos poços 3, 5 e 6. O coeficiente de Dice deste nó na figura 4 é de cerca de 0.3
(estirpes muito diferentes, provavelmente até espécies diferentes) enquanto que na figura
3 é aproximadamente 0.8, um valor largamente superior que indica uma proximidade
genética muito mais elevada. Outra diferença, por exemplo, é ao nível da relação entre a
estirpe do poço 12 e a dos poços 10 e 11.
Erros deste género podem ser explicados pela ambiguidade aquando da elaboração da
matriz binária – por vezes torna-se difícil distinguir as bandas, sendo discutível se se
observa uma, duas ou mais bandas, o que pode portanto levar a diferentes interpretações
da figura 1, resultando em matrizes binárias diferentes e, portanto, em dendogramas
também diferentes.
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Desta forma, conclui-se que uma desvantagem da ribotipagem é a sua suscetibilidade
a erros, uma vez que a construção da matriz é feita observando as bandas dos perfis de
ribotipagem, onde pode haver um engano na leitura, ou a separação de bandas não estar
completamente evidente. Deste modo, é normal que neste laboratório diversos grupos
obtenham resultados ligeiramente diferentes. No entanto, considerou-se, por comparação
com o artigo de referência, que o dendograma obtido representa bastante fielmente a
realidade, ou seja, o grau de semelhança entre as estirpes do complexo B. cepacia.
Pode-se ainda ressalvar que este método de identificação de estirpes dentro da
mesma espécie é muito útil no que toca à identificação de estirpes virulentas em isolados
clínicos, por comparanção com a estirpe de referência adequada, sendo utilizado em
grande escala para o efeito.
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3. Referências
[1]
Richau, J. A., J. H. Leitão, M. Correia, L. Lito, M. J. salgado, C. Barreto, P Cescutti e I.
Sá-Correia. 2000. Molecular typing and exopolysaccharide biosynthesis of Burkholderia
cepacia isolates from a portuguese cystic fibrosis center. J. Clin. Microbiol. 38:1651-1655
[2]
www.ccdc.cam.ac.uk/SupportandResources/Support/Pages/SupportSolution.aspx?supp
ortsolutionid=228
[3]
Guia de laboratório TP5 – “MOLECULAR TYPING OF Burkholderia cepacia COMPLEX
CLINICAL ISOLATES”
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