Detecção do citomegalovírus humano em doadores de sangue

DETECÇÃO DO CITOMEGALOVÍRUS HUMANO EM DOADORES DE SANGUE ATRAVÉS DE
PCR EM TEMPO REAL
Detection of human cytomegalovirus in blood donors by real-time PCR
Renato Lopes Fernandes de Medeiros1, José Alexandre Rodrigues de
Lemos2, Maria de Fátima Lima de Assis3, Iracina Maura de Jesus4, Elisabeth
Conceição de Oliveira Santos5
RESUMO
O citomegalovírus humano (HCMV) é um agente infeccioso da família Herpesviridae.
Neste trabalho, pesquisou-se HCMV através da PCR em Tempo Real, em 115
amostras de DNA extraído de leucócitos de indivíduos voluntários para doação de
sangue no Centro de Hemoterapia do Pará. A presença do DNA viral foi evidenciada
em 57% dos indivíduos estudados, sendo que 2/3 deles eram do sexo masculino, não
tendo sido observada nenhuma relação significante entre faixa etária, gênero e presença
do DNA viral. Os resultados através da PCR em Tempo Real nos permitem sugerir
que os bancos de sangue introduzam a identificação do HCMV na escolha das
amostras de sangue com leucócito que serão utilizadas em pacientes imunodeprimidos
e mulheres em início de gestação, pelo fato do HCMV ser um vírus teratogênico.
PALAVRAS-CHAVE
Citomegalovírus, doadores de sangue, Reação em Cadeia da Polimerase
ABSTRACT
The human cytomegalovirus (HCMV) is an infectious agent of the Herpesviridae
family. In this work, we used Real-Time PCR to identify HCMV in 115 samples
of extracted DNA of leukocytes from voluntary blood donors at in the Centro de
Hemoterapia do Pará. The presence of viral DNA was evidenced in 57% of the
studied individuals, 2/3 of them were male, not having been observed any significant
association between age, gender and the presence of viral DNA. The results through
Real-Time PCR suggests that the blood banks should introduce the identification
of HCMV in samples of blood with leukocyte that will be used in
immunocompromised patients and women in beginning of pregnancy, because
HCMV is a teratogenic agent.
KEY WORDS
Cytomegalovirus, blood donors, Polymerase Chain Reaction
1
Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Consultor da UNESCO/IEC/SVS/MS.
End.: Rua Antonio Barreto, 377, Bloco B, apto. 101 – Belém – PA – CEP: 66055-050 – E-mail:
[email protected]
2
Doutor em Biologia Genética. Professor Adjunto do Departamento de Genética da Universidade Federal do Pará.
3
Citogeneticista. Pesquisadora do Instituto Evandro Chagas.
4
Especialista em Vigilância em Saúde Ambiental. Pesquisadora do Instituto Evandro Chagas/SVS/MS.
5
Virologista. Diretora do Instituto Evandro Chagas.
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1. INTRODUÇÃO
O Citomegalovírus Humano (HCMV), um dos principais agentes infecciosos
que afetam seres humanos, é membro da família Herpesviridae, subfamília Betaherpesvirinae, e, de acordo com o Comitê Internacional de Taxonomia Viral, é
conhecido como Herpesvírus humano 5 – HHV 5 (Mocarski Junior, 1995).
Durante o período de infecção, o HCMV, como outros vírus, é liberado
através de diversos exudatos, como: urina, fezes, sangue, sêmen, excreção cervical,
saliva, leite materno e lágrima (Kapranos et al., 2003).
A infecção primária é freqüentemente assintomática, sendo as populações de
maior risco pacientes imunocomprometidos (imunodeficiência congênita ou
adquirida, transplantados e pacientes dependentes de drogas imunossupressoras),
pacientes com câncer e recém-nascidos (Mocarski Junior, 1995).
A relação entre o HCMV e as transfusões sangüíneas começou a ser considerada
desde 1966, quando Kaarianen et al. (apud Sandler & Glumet, 1982) evidenciaram,
por isolamento do vírus em linhagens celulares, a presença do HCMV em pacientes
pós-transfusionais com infecção subclínica (Sandler & Glumet, 1982).
A potencialidade de uma transmissão do HCMV está associada à quantidade
de monócitos presentes na corrente sangüínea (Slobedman & Mocarski, 1999).
Em indivíduos transfusionados imunocompetentes e sem história clínica, a infecção
pós-transfusional por HCMV geralmente resulta em uma soroconversão
assintomática, podendo apresentar sintomas semelhantes ao da síndrome da
mononucleose; porém, em indivíduos imunodeprimidos a infecção torna-se
mórbida chegando mesmo a ser fatal (Sandler & Glumet, 1982). Os indivíduos
que não apresentam problemas de imunossupressão, quando infectados pelo
HCMV, se desenvolverem alguma sintomatologia, esta geralmente apresenta-se
de forma leve, não sendo registrada na maioria das vezes. O que torna o HCMV
um dos mais graves agentes infecciosos é a infecção em gestantes, principalmente
nos três primeiros meses de gestação. O HCMV faz parte do complexo TORCH
(toxoplamose, vírus da rubéola, o citomegalovírus humano e o herpesvírus)
responsável por teratogenia congêntia (Pannuti, 1996).
Diversos estudos estimam que o risco de infecção pós-transfusional em
pacientes soronegativos varia de 2,7% a 10,5% por unidade de sangue. Para
indivíduos que receberam múltiplas transfusões, esta taxa aumenta para 20% a
60% (Bico et al., 1989).
A prevalência do HCMV em doadores de sangue é superior a 80%
(Kothari et al., 2002) e, por admitir-se que o HCMV está associado aos
leucócitos, tem sido recomendado em transfusões o uso de sangue completamente destituído de leucócitos, para evitar infecções pós-transfusionais
(Mocarski Junior, 1995).
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Nos Estados Unidos, uma universidade implantou, como forma de evitar
a transmissão do HCMV em transfusões, uma triagem de doadores selecionando apenas os indivíduos negativos para HCMV. Como conseqüência,
a taxa de prevalência em doadores foi reduzida de 12,5% para 1,8%
(Yeager et al., 1981).
Embora o teste ELISA seja mais utilizado no diagnóstico do HCMV (GrangeotKeros & Cointe, 2001; Takeda et al., 2001; Zang et al., 2003), com o advento da
Biologia Molecular, tornou-se possível identificar o agente viral presente no material em estudo. O método quantitativo da Reação em Cadeia da Polimerase
(PCR) em Tempo Real, baseado no uso de uma sonda fluorescente, permite
correlacionar a intensidade de sinal fluorescente com a quantidade de genoma
viral amplificado (Satou et al., 2001; Maclkay et al., 2002), o que nos assegura uma
triagem mais eficaz entre os doadores assintomáticos. O uso da técnica de PCR
em Tempo Real tem sido aplicado também no monitoramento de pacientes
imunodeprimidos pós-transplante (Griscelli et al., 2001; Sanches et al., 2001;
Tanaka et al., 2002).
Entendendo-se a transfusão sangüínea como uma das formas de transmissão
do HCMV, é de importância estudos detalhados em doadores de sangue e, assim,
demonstrar o perfil dos indivíduos doadores de sangue atendidos no Centro de
Hemoterapia do Pará (HEMOPA) com relação à infecção pelo HCMV. Para esse
estudo, foi utilizado como método diagnóstico o PCR em Tempo Real.
2. MATERIAL E MÉTODOS
Esta investigação foi submetida ao Comitê de Ética em Pesquisa envolvendo
seres humanos do Núcleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do
Pará, tendo o parecer de aprovação o número de protocolo 040/2004 – CEP/NMT.
O estudo compreendeu um total de 115 amostras de DNA extraídos de
leucócitos de indivíduos voluntários para doação de sangue no Centro de
Hemoterapia do Pará (HEMOPA), provenientes do município de Belém (Pará),
no período de agosto de 2003 a janeiro de 2004.
A metodologia utilizada para a extração do DNA é baseada no princípio de
eluição de sílica-gel (Amenshan ®), de acordo com o fabricante.
Para a detecção do HCMV por PCR em Tempo Real, foram confeccionados
iniciadores e sonda através de um programa da Applied Biosystems® denominado de
Assay-By-Design. O Master Mix – TaqMan Universal PCR Master Mix contém
nucleotídeos, Tampão e TaqDNAPolimerase. Para cada reação, foi utilizado 15µL
do Master Mix, 10,5µL de água destilada, 1,5µL do Mix de iniciadores e sonda
(Assay-By-Design, 3µL de DNA genômico do paciente, resultando em uma mistura
com volume final de 30µL.
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As reações foram incubadas no termociclador em Tempo Real ABI 7000
(Applied Biosystems®), obedecendo à seguinte seqüência de ciclos, temperatura e
tempo: 1 ciclo a 50°C por 5 minutos; 55 ciclos a 95°C por 15 segundos e 55
ciclos a 60° por 1 minuto.
A região gênica do HCMV estabelecida para ser estudada foi a DNApol
(DNA Polimerase) com 300 pares de base. Essa seqüência foi submetida ao procedimento Assays-by-Design com a finalidade de ser escolhido o melhor ponto para
amplificação. A região amplificada compreendeu 80 pares de base e o ponto
escolhido para a ligação da sonda foi o 76.
Foi analisada a associação dos resultado do ensaios moleculares com o gênero
e idade, utilizando-se o teste χ2 a um nível de significância α = 0,05, com auxílio
do software estatístico Bioestat 3.0 (Ayres et al., 2003).
3. RESULTADO
Foram analisados leucócitos de 80 homens e 35 mulheres com idades entre 18
a 74 anos. Dos 115 indivíduos analisados, 65 eram portadores de DNA viral (57%)
e, nos 50 restantes (43%), não foi detectado DNA do HCMV (Tabela 1). Dentre as
mulheres, o percentual de indivíduos HCMV+ (62,9%) foi um pouco superior que
dentre os homens (53,8%), sem, no entanto, observar-se diferença estatisticamente
significante (p = 0,3647). Pôde-se observar que as prevalências de HCMV+ são
semelhantes entre as diferentes faixas etárias, com destaque para a faixa etária de 46
a 54 anos, que apresentou valor um pouco superior ao encontrado nas demais.
Entretanto, esta diferença não foi estatisticamente significante (p= 0,8427).
Tabela 1
Diagnóstico para HCMV por PCR em Tempo Real no total de doadores de sangue,
segundo sexo e faixa etária.
χ2 = 0,822, p = 0,3647; **χ2 para tendência = 0,039, p= 0,8427.
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Observou-se na Tabela 2 que há uma tendência estatisticamente significante
dos casos positivos masculinos serem mais jovens em comparação com as mulheres
(p = 0,033), uma vez que 39,5% tinham entre 18 e 27 anos, decrescendo à
medida que a idade avança, enquanto apenas 13,6% das mulheres HCMV+
tinham entre 18 e 27 anos, aumentando para as faixas etárias seguintes.
Tabela 2
Faixa etária e gênero dos indivíduos positivos para o HCMV.
χ2 para tendência, p= 0,033.
4. DISCUSSÃO
Os dados obtidos em nossas análises reforçam a premissa de que o HCMV pode
estar hospedeiro em um organismo humano sem qualquer sintoma-tologia detectável.
Como estudamos uma amostra de leucócitos provenientes de indivíduos
voluntários para doação de sangue, cadastrados em um Centro de Hemoterapia,
nosso estudo torna-se de alta relevância, uma vez que esse material será utilizado
em terapias transfusionais. Sendo a maioria dos receptores de sangue
imunocompetentes, a partícula viral do HCMV, provavelmente, não acarretará
problemas para esses indivíduos. No entanto, sugerimos que, a exemplo do que
foi descrito por Yearger et al. (1981), de alguma forma os bancos de sangue
introduzam a identificação do HCMV como critério de escolha das amostras de
sangue com leucócitos que serão utilizadas em pacientes imunodeprimidos e
mulheres em início de gravidez, já que o HCMV faz parte do complexo TORCH,
grupo de agentes etiológicos considerados teratogênicos.
O fato de em um total de 115 amostras termos observado 57% positivas e
43% negativas nos leva a concluir que a freqüência do HCMV em população
assintomática é relativamente alta, apesar de se observar uma prevalência ainda
maior (aproximadamente 80%) em outros estudos, principalmente em regiões
subdesenvolvidas (Kothari et al., 2002). Sabe-se que as técnicas moleculares, como
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a PCR em Tempo Real, apresentam uma sensibilidade e especificidade maior que
a técnica ELISA, utilizada na maioria dos trabalhos da literatura. Desta forma,
esta seria uma possível hipótese que explicaria a diferença, fazendo com que a
prevalência, embora se apresentasse relativamente alta, é ainda menor do que as
vistas em outras investigações laboratoriais (Grangeot-Keros & Cointe, 2001;
Takeda et al., 2001; Kothari et al, 2002; Zang et al., 2003).
A diferença de infecção pelo HCMV entre os gêneros não foi estatisticamente
significante, correspondendo aos resultados obtidos por Bico et al. (1989), em um
estudo sobre a prevalência de anticorpos contra o HCMV em doadores de
sangue, realizado em Montevidéu, Uruguai. Os autores constataram que a
diferença no grau de susceptibilidade entre os homens e as mulheres doadores
não foi relevante. As porcentagens de soropositividade foram bastante semelhantes,
com 59% para os homens e 58% para as mulheres, o que significa que não houve
distinção nas freqüências de infecção entre homens e mulheres.
A técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) em Tempo Real confirmou
a presença do genoma viral na amostra estudada. No caso da infecção pelo
HCMV, uma das células alvo é o monócito (Slobedman & Mocarski, 1999), que
por ser totalmente diferenciada e presente na corrente sangüínea, tem uma vida
média temporária. Portanto, é de se esperar a relação entre a presença de partícula
viral em monócitos e o estado de infecção aguda. Nossos resultados mostraram
que esta relação pode não ser exata, em vista de todos os doadores testados serem
assintomáticos, o que comprova a latência temporária do vírus.
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Nosso trabalho nos levou a concluir que a freqüência do HCMV em população
assintomática é relativamente alta, mesmo utilizando métodos de análise laboratorial
(método molecular), diferente dos utilizados rotineiramente em investigações
deste espectro de pesquisa. Observou-se a presença do genoma viral em mais da
metade dos indivíduos estudados. Notou-se uma maior tendência dos casos
masculinos serem mais jovens em comparação com as mulheres. Os indivíduos
mais jovens mostraram-se mais susceptíveis à infecção pelo HCMV, o que pode
corresponder à maior exposição às vias de contágios. Em virtude dos indivíduos
estudados serem todos assintomáticos, nossos dados nos levam a supor que os
monócitos são células-alvo que podem manter o vírus HCMV em latência.
Desta maneira, após as análises, sugerimos que os bancos de sangue introduzam
a identificação do genoma do HCMV como parte da seleção de amostras sangüíneas
com presença de leucócitos que serão utilizadas em pacientes imunodeprimidos
e mulheres em início de gestação, em vista do HCMV ser um vírus responsável
por teratogênese.
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