Tese - FELIPE_DE_PAULA_NOGUEIRA_CRUZ (1,70
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOSSISTEMAS FELIPE DE PAULA NOGUEIRA CRUZ Variabilidade genética no gene da glicoproteína B (gB) do Citomegalovírus Humano (HCMV) em amostras de sangue de pacientes submetidos a transplante renal SANTO ANDRÉ 2012 UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E HUMANAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOSSISTEMAS FELIPE DE PAULA NOGUEIRA CRUZ Variabilidade genética no gene da glicoproteína B (gB) do Citomegalovírus Humano (HCMV) em amostras de sangue de pacientes submetidos a transplante renal Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de PósGraduação em Biossistemas da Universidade Federal do ABC como parte dos requisitos para a obtenção do título de mestre em Biossistemas. Departamento: Centro de Ciências Naturais e Humanas Área de concentração: Biologia Molecular/Virologia Orientador: Profª. Drª. Maria Cristina Carlan da Silva SANTO ANDRÉ 2012 Este exemplar foi revisado e alterado em relação à versão original, de acordo com as observações levantadas pela banca no dia da defesa, sob responsabilidade única do autor e com a anuência de seu orientador. Santo André, ____de _______________ de 20___. Assinatura do autor: _____________________________________ Assinatura do orientador: _________________________________ Dedicatória Aos meus pais Antonio e Gilda. Agradecimentos Várias pessoas contribuíram para que este trabalho chegasse a bom termo. Nada na vida conquistamos sozinhos. Sempre precisamos de outras pessoas para alcançar os nossos objetivos. Muitas vezes um simples gesto pode mudar a nossa vida e contribuir para o nosso sucesso. A todas elas registro minha gratidão. À minha orientadora, professora Dra. Maria Cristina Carlan da Silva, pela orientação, pela amizade, pela paciência e por ter confiado em meu trabalho. Ao professor Dr. Antonio Sergio Kimus Braz pela amizade, pelos esclarecimentos dados os quais muito contribuíram para a elaboração deste trabalho. A todos os amigos do Instituto Pasteur, Rafael de Novaes Oliveira (grande amigo) por tudo que fez por mim, Pedro Carnielli Jr, Helena Batista, William Fahl e Juliana Castilho pelo apoio, pela amizade e pelos ensinamentos. Ao professor Dr. Maurício Lacerda Nogueira e professor Leonardo Guizilini Plazas Ruiz pela colaboração a qual muito contribuíram. Aos meus pais, Antonio e Gilda pelo amor, pelo incentivo, pela contribuição e pelo apoio para que hoje fosse possível a realização desse objetivo. Muito Obrigado!!!! A Deus e aos Irmãos do Plano Espiritual que estão sempre presentes em minha vida e no meu coração. Sumário Resumo ........................................................................................................................................VIII Abstract ..........................................................................................................................................IX Índice de Abreviaturas e Símbolos...................................................................................................X Índice de Figuras ..........................................................................................................................XII Índice de Tabelas .........................................................................................................................XIII 1. Revisão Bibliográfica..............................................................................................17 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 1.1. O Citomegalovírus Humano .......................................................................................18 1.2. Estrutura e Composição da Partícula Viral..................................................................19 1.3. Organização Genômica do HCMV..............................................................................19 1.4. Replicação e Latência do HCMV ...............................................................................21 1.5. Epidemiologia .............................................................................................................23 1.6. Patogenia......................................................................................................................24 1.7. Mecanismos de Transmissão......................................................................................25 1.7.1. Infecção Congênita........................................................................................26 1.7.2. Infecção Perinatal ..........................................................................................27 1.7.3. Infecção em Pacientes Transplantados...........................................................28 1.8. Glicoproteínas do HCMV............................................................................................28 1.8.1. Glicoproteína B - gpUL55..............................................................................29 1.8.2. Variabilidade genética da gB em pacientes transplantados............................32 Objetivos........................................................................................................................35 2.1. Objetivos Específicos..................................................................................................35 Materiais e Métodos.................................................................................................36 3.1. Amostra viral de referência.........................................................................................36 3.2. População e amostras do estudo .................................................................................36 3.3. Extração e Purificação de DNA...................................................................................36 3.4. Semi-nested-PCR.........................................................................................................37 3.5. Purificação dos produtos de PCR................................................................................39 3.6. Reação de Sequenciamento de DNA...........................................................................39 3.7. Edição das sequências de DNA...................................................................................39 3.8. Determinação dos genótipos da gB e análise genealógica..........................................40 Resultados.....................................................................................................................43 4.1. Semi-Nested-PCR para amplificação do gene codificador da gB ..............................43 4.2. Reação de Sequenciamento de DNA...........................................................................45 4.3. Determinação dos genótipos da gB e análise genealógica..........................................45 Discussão......................................................................................................................52 Conclusões....................................................................................................................55 Referências Bibliográficas....................................................................................56 Anexos............................................................................................................................63 VIII Resumo Um dos componentes mais importantes do Human Cytomegalovirus (HCMV) é a glicoproteína B (gB), uma proteína altamente conservada essencial para a replicação do vírion. Contudo, em certas regiões do ORF UL55, como a região do sítio de clivagem da protease, existem pontos de variação genética, o que resulta em diferentes genótipos da gB. Estudos demonstram que a infecção por diferentes genótipos da glicoproteína B, pode estar relacionada à virulência e patogênese do vírus, sendo portanto, um importante fator de ocorrência de doença. O HCMV é um dos principais agentes patogênicos em indivíduos imunocomprometidos, sendo uma das principais causas de mortalidade, devido à infecção primária ou reativação viral. Sendo assim, a importância do diagnóstico precoce da infecção ativa e da identificação dos genótipos da glicoproteína gB em pacientes transplantados é de extrema importância. Pretendeu-se com esta dissertação de mestrado a análise de amostras de sangue periférico de pacientes transplantados renais quanto à presença do HCMV e determinação dos genótipos da glicoproteína B predominantes, onde o HCMV foi encontrado em 93% dos pacientes, onde o genótipo gB2 (77%) foi o mais frequente, seguido pelo genótipo gB3 (15%) e genótipo gB1 (8%). IX Abstract One of the most important components of Human Cytomegalovirus (HCMV) is a glycoprotein B (gB), a highly conserved protein essential for replication of the virion. However, in certain regions of the UL55 ORF as the region of the protease cleavage site, there are points of genetic variation, which results in different genotypes of gB. Studies show that infection with different genotypes of glycoprotein B may be related to pathogenesis and virulence of the virus, and therefore an important factor in the occurrence of disease. The HCMV is a major pathogen in immunocompromised individuals, and is a major cause of mortality due to primary infection or viral reactivation. Thus, the importance of early diagnosis of active infection and the identification of genotypes glycoprotein gB in transplant patients is extremely important. The intention with this dissertation analysis of peripheral blood samples of kidney transplant patients for the presence of HCMV and determination of the genotypes of glycoprotein B predominate, where HCMV was found in 93% of patients where the genotype gB2 (77 %) was the most frequent, followed by genotype gB3 (15%) and genotype gB1 (8%). X Lista de Abreviaturas e Símbolos M Micromole l Microlitro nm Nanômetro aa Aminoácido AIDS Síndrome da Imunodeficiência Adquirida DNA Ácido desoxirribonucléico RNA Ácido ribonucléico dNTP Desoxirribonucleotídeo trifosfatado DTT Dithiothreitol EGFR Receptor do fator de crescimento epidérmico HCMV Human Cytomegalovirus HSV Herpes simplex virus HHV-5 Human Herpes virus-5 HSPG Heparan sulfato GCMV Gorilla Cytomegalovirus gB Glicoproteína B gH Glicoproteína H gN Glicoproteína N gL Glicoproteína L gO Glicoproteína O gM Glicoproteína M gCI Complexo glicoprotéico I gCII Complexo glicoprotéico II gCIII Complexo glicoprotéico III GTR Tempo geral reversível IE Immediate early Kb Kilobase XI Kpb Kilo pares de base kDa Kilodalton MCP Proteína maior do capsídeo mCP Proteína menor do capsídeo MCMV Murine Cytomegalovírus MHC Complexo de Histocompatibilidade Principal MgCl2 Cloreto de Magnésio Pb Par de bases PCR Reação em cadeia pela polimerase PDGFRA Receptor de fator de crescimento derivado de plaquetas RFLP Polimorfismo de fragmento de restrição UI Unidade Internacional UL Unique long US Unique short XII Índice De Figuras Figura 1. Estrutura geral do HCMV..............................................................................................18 Figura 2. Esquema simplificado do genoma do HCMV. Este é organizado em duas regiões de sequências únicas, única longa (UL) e única curta (EUA), ladeado por dois conjuntos de repetições invertidas (TRL/IRL) e (IRS/TRS)................................................................................18 Figura 3. Mapa do genoma do HCMV. As setas verdes representam os ORFs prováveis para codificar uma proteína, setas vermelhas designam os ORFs improváveis para codificar um polipeptídeo, e as setas azuis indicam ORFs não reconhecidos que apresentam um elevado potencial para codificar proteínas. A caixa de cinza marca a sequência adicional encontrado na linhagem Toledo, localizando-o em relação ao genoma da linhagem AD169.............................................................................................................................................20 Figura 4. Ciclo de replicação do HCMV. A partícula viral liga-se à célula, promovendo a fusão do envelope viral com a membrana plasmática ocasionando a liberação do nucleocapsídeo no citoplasma. O nucleocapsídeo migra para o núcleo, liberando o DNA viral levando a transcrição dos genes virais. No núcleo, nucleocapsídeos são montados e migram para o citoplasma aonde adquirem o envelope final e saem da célula por exocitose ............................................................21 Figura 5. Representação da glicoproteína B em analogia a estrutura do HSV por Pötzsch, et al, 2011.................................................................................................................................................29 Figura 6. Mapa dos códons da glicoproteína B mostrando as regiões de variação ao nível de peptídeo...........................................................................................................................................31 Figura 7. Quadro do alinhamento de sequências de DNA do HCMV para cada genótipo da gB. As regiões destacadas indicam os sítios de restrição para as enzimas HinfI e RsaI. Adaptado de Wu et al., 2010................................................................................................................................40 Figura 8. Eletroforese em gel de agarose a 1% dos amplicons obtidos na reação de semi-nestedPCR para detecção da gB em amostras de sangue de pacientes transplantados: Padrão de peso molecular (1), CMVHB-3032 (2), CMVHB-3069 (3), controle negativo adicionado na fase de Nested(4), controle positivo da fase de isolamento de DNA (5) e controle negativo da também da fase de isolamento do DNA(6)........................................................................................................43 Figura 9. Eletroforese em gel de agarose a 1% dos amplicons obtidos na reação de semi-nestedPCR para detecção do gene GAPDH em amostras de sangue de pacientes transplantados: (1) CMVHB-2980, (2) CMVHB-3004, (3) CMVHB-3026, (4) CMVHB-4314, (5) controle negativo adicionado na fase de Nested, (6) Padrão de peso molecular ........................................................44 Figura 10. Alinhamento representativo das sequências da gB de pacientes transplantados. As regiões destacadas indicam os sítios de restrição para as enzimas HinfI e RsaI presentes na região variável da gB (Wu et al., 2010).....................................................................................................47 Figura 11. Árvore filogenética enraizada construída pelo método de máxima verossimilhança utilizando as amostras, genótipos e linhagens. Essa árvore mostra a formação de cinco grupos, onde o grupo gB2 apresenta a maior concentração das amostras dos pacientes seguidos de gB3 e gB 1. A raiz da árvore foi feita utilizando a sequência do Citomegalovírus de gorila (GCMV número de acesso FJ538490.2). Os números próximos de cada nó representam o suporte de ramo alRT.................................................................................................................................................50 XIII Figura 12. Árvore filogenética enraizada construída pelo método de máxima verossimilhança utilizando as sequências dos genótipos da gB e linhagens do HCMV. A raiz da árvore foi feita utilizando a sequência do Gorilla Cytomegalovírus (GCMV número de acesso FJ538490.2). Os números próximos de cada nó representam o suporte de ramo alRT, mostrando claramente os grupos formados para cada genótipo da gB....................................................................................52 XIV Índice de Tabelas Tabela 1. Primers utilizados para amplificação da região variável da gB por semi-nestedPCR.................................................................................................................................................36 Tabela 2. Sequências de linhagens do HCMV e genótipos da gB com os números de acesso do GenBank utilizadas para gerar a sequência consenso do gene UL55, e para a análise genealógica .........................................................................................................................................................39 Tabela 3. Amostras positivas pela técnica de semi-nested-PCR que foram sequenciadas e resultado do BLASTn para confirmação do resultado.................................................................45 XV “Não basta ensinar ao homem uma especialidade, porque se tornará assim uma máquina utilizável e não uma personalidade. É necessário que adquira um sentimento, um senso prático daquilo que vale a pena ser empreendido, daquilo que é belo, do que é moralmente correto...” (Albert Einstein) XVI Revisão Bibliográfica 1. Revisão Bibliográfica 1.1. O Citomegalovírus Humano O Human Cytomegalovirus (HCMV) também conhecido como Herpesvírus humano-5 (HHV-5), pertence à família Herpesviridae, subfamília Betaherpesvirinae, o qual é um agente infeccioso relativamente frequente no mundo. Em países desenvolvidos, o número de indivíduos infectados pelo HCMV varia de 40 a 60%, enquanto que em países em desenvolvimento a sua prevalência pode chegar até 90% (Pass, 2001). A partícula viral de aproximadamente 200nm de diâmetro (Roizman et al., 1981; Jacobson & Mills, 1988; Mockarsi et al., 2006) possui como material genético um DNA de dupla fita, revestido por uma capsídeo protéico de simetria icosaédrica, que por sua vez, é envolto por uma camada de protéica denominada tegumento e por um envelope glicoprotéico. Assim como os demais membros da família Herpesviridae, o HCMV fica em estado de latência por toda a vida dos indivíduos infectados e este estado é caracterizado pela presença do DNA viral e ausência de replicação viral em células infectadas tais como monócitos, (Stainer, et al., 1989). A reativação do vírus pode ocorrer em decorrência de imunossupressão causada por câncer, imunodeficiência e estresse (Jarvis & Nelson, 2002). 17 Revisão Bibliográfica 1.2. Estrutura e Composição da Partícula Viral A partícula viral do HCMV, típica dos outros membros da família Herpesviridae (Gibson, 1996), é formada por um DNA de dupla fita linear de aproximadamente 230 Kbp, revestido por um capsídeo icosaédrico, composto por 162 capsômeros, que por sua vez é envolto por uma camada de proteínas e RNA virais, denominada tegumento, e pelo envelope glicoprotéico (Figura 1). Estima-se que a partícula viral seja composta de aproximadamente 59 proteínas estruturais virais e várias proteínas celulares (Varnum et al., 2004), além do DNA e RNA virais (Bresnahan & Shenk, 2000; Greijer et al., 2000). Proteínas do envelope Tegumento externo Tegumento interno Capsídeo Vertex de entrada Figura 1. Estrutura geral do HCMV. Fonte: viralzone.expasy.org 18 Revisão Bibliográfica 1.3. Organização genômica do HCMV O genoma do HCMV, composto de um DNA linear de dupla fita de aproximadamente 230 Kbp, é formado por duas regiões únicas: a região única longa (UL, do inglês unique long) e uma região única curta (US, do inglês unique short) (Mocarski et al., 2007). Estas regiões são flanqueadas por sequências terminais repetidas e invertidas longas e curtas (TRL, do inglês terminal repeat long e TRS, terminal repeat short) e por sequências internas repetidas e invertidas (IRL, do inglês internal repeat long e IRS, internal repeat short (Figura 2) (Mocarski et al., 2007). Figura 2. Esquema simplificado do genoma do HCMV. O genoma é organizado em duas regiões de sequências únicas, única longa (UL) e única curta (US), que são flanqueadas por dois conjuntos de repetições invertidas e repetidas (TRL / IRL) e (IRS / TRS). Fonte: www.nist.gov/mml/biochemical/genetics/cmv_structure.cfm. Existem relatos que demonstraram que o genoma viral possui 192 ORFs (open reading frames) capazes de codificar proteínas (Figura 3) (Murphy et al., 2003), dentre estes, somente cerca de 45 codificam proteínas com função no ciclo replicativo viral (Dunn et al, 2003). 19 Revisão Bibliográfica Figura 3. Mapa do genoma da linhagem AD169 do HCMV. As setas verdes representam os ORFs prováveis para codificar proteínas, setas vermelhas designam os ORFs improváveis para codificar proteínas, e as setas azuis indicam ORFs não reconhecidos que apresentam um elevado potencial para codificar proteínas. A caixa em cinza marca a sequência adicional encontrado na linhagem Toledo, localizando-a em relação ao genoma da linhagem AD169. Fonte: www.nist.gov/mml/biochemical/genetics/cmv_structure.cfm 20 Revisão Bibliográfica 1.4. Replicação e Latência do HCMV O ciclo de replicação do HCMV é caracterizado por ser lento, durando cerca de 72 horas desde a entrada do vírus na célula até a liberação de novas partículas virais. O passo inicial de entrada HCMV na célula hospedeira começa com a ligação de baixa afinidade entre o vírus e proteoglicano de heparan sulfato (HSPG) presente na superfície celular (Mocarski et al., 2007). Após a ligação com o HSPG, ocorre outra ligação específica entre o vírus e receptores específicos tais como o fator de crescimento epidérmico (EGFR) e integrinas celulares (Mocarski et al., 2007), levando a fusão do envelope viral com a membrana plasmática e resultando na liberação do capsídeo e tegumento para o citoplasma da célula. Em seguida, o capsídeo é transportado em direção ao núcleo onde o DNA viral é introduzido através dos poros da nucleares. Uma vez dentro do núcleo, o DNA viral é transcrito pela RNA polimerase II do hospedeiro (Mocarski et al., 2007). A síntese de proteínas virais dividida em três fases; expressão dos genes precoces imediatos (imediate early - IE), expressão do genes precoces (early) e expressão de genes tardios (late). A expressão dos genes precoces imediatos ocorre dentro de 1 a 4 horas após a infecção. As proteínas produzidas nesta fase possuem uma série de funções incluindo transativação da expressão dos genes precoces e tardios. Os genes precoces codificam proteínas essenciais para a replicação do DNA viral tais como a DNA polimerase viral e o fator de processabilidade da polimerase. Além disso, algumas proteínas estruturais, tais como os componentes do tegumento também são sintetizados no início do período precoce (Mocarski et al., 2007). A fase tardia ocorre entre 36 a 48 horas de infecção após a replicação do DNA, e a maioria das proteínas estruturais são sintetizadas neste período. Após a produção das proteínas estruturais, o nucleocapsídeo é montado no núcleo sendo subsequentemente 21 Revisão Bibliográfica transportado para o citoplasma. Durante sua passagem para o citoplasma o nucleocapsídeo brota na membrana perinuclear interna adquirindo um envelope primário e transtitório, que é perdido após fusão fusão do mesmo com a membrana perinuclear externa. No citoplasma, o nucleocapsídeo brota em membrana derivadas da face trans do complexo de Golgi, adquirindo o envelope final sendo posteriormente liberado da célula por exocitose (Figura 4) (Seo & Britt, 2007). Figura 4. Ciclo de replicação do HCMV. A partícula viral liga-se à célula, promovendo a fusão do envelope viral com a membrana plasmática ocasionando a liberação do nucleocapsídeo no citoplasma. O nucleocapsídeo migra para o núcleo, liberando o DNA viral levando a transcrição dos genes virais. No núcleo, nucleocapsídeos são montados e migram para o citoplasma aonde adquirem o envelope final e saem da célula por exocitose (Huang & Johnson, 2000). 22 Revisão Bibliográfica A persistência do genoma viral em uma forma não produtiva ocorre em sítios anatômicos específicos por meses ou vários anos. Isto ocorre devido à capacidade do vírus de escapar do sistema imunológico ao induzir um estado de latência, ao utilizar alguns tecidos para replicação e ao expressar genes virais que interferem com a resposta imune. O escape do sistema imunológico, principalmente de células CD8+ é mediado por importantes mecanismos, que atuam bloqueando a expressão de moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) de classe I. A escolha de células epiteliais das glândulas salivares para replicação viral ocorre devido à expressão de um número insuficiente de moléculas de MHC classe I nestas células, necessárias para iniciar o reconhecimento pelas células CD8+ (Morcarski, 2002; Mocarski et al., 2007). 1.5. Epidemiologia Estudos epidemiológicos demonstraram que a infecção pelo HCMV ocorre praticamente em todas as regiões do mundo. Em países desenvolvidos, cerca de 1,0% dos recém-nascidos, e aproximadamente 60% da população adulta são infectados pelo HCMV. Enquanto em populações de nível sócio-econômico mais baixo, a prevalência é significantemente maior, variando entre 80 a 100%. A prevalência de anticorpos contra o HCMV (anti-HCMV) eleva-se com a idade, atingindo níveis máximos após os 25 anos (Pannuti, 1984; Pass, 2009). No Brasil, os dados epidemiológicos disponíveis são restritos a algumas áreas urbanas, tais como o estado de São Paulo. Estudos usando soros coletados de pessoas saudáveis de diferentes grupos de idade em São Paulo e testados para anticorpos antiHCMV mostraram que em crianças de 0-4 anos de idade a soroprevalência era de 60%, com um lento aumento após os 15 anos de idade e 80% de positividade no grupo de idade entre 51 a 60 anos (Almeida et al., 2001). 23 Revisão Bibliográfica Existe uma nítida relação entre a prevalência de anticorpos em uma determinada população adulta e seu nível sócio-econômico. Assim, em populações de alto nível sócio-econômico, a prevalência tem variado, nos diversos países estudados, de 40 a 60%, enquanto em populações de nível sócio-econômico mais baixo, a prevalência é maior, variando de 80 a 100% (Pass, 2009). A infecção congênita pelo HCMV destaca-se pela alta frequência com que é observada, sendo o vírus considerado atualmente, a causa mais comum de infecção congênita em humanos. Estudos realizados na população de São Paulo demonstram altas taxas de infecção congênita em populações de nível sócio-econômico baixo e médio. Um estudo realizado em Ribeirão Preto demonstrou que 2,6% dos recémnascidos apresentavam infecção congênita por HCMV (Yamamoto, et al., 1999). 1.6. Patogenia Em indivíduos imunocompetentes a infecção é geralmente assintomática, devido a um equilíbrio estabelecido entre o sistema imune do indivíduo infectado e a replicação viral. No entanto, em indivíduos nos quais o sistema imune não está completamente desenvolvido ou naqueles imunocomprometidos, o vírus pode causar diversas manifestações clínicas como, mononucleose-símile, febre persistente, mialgia, dor de cabeça, linfadenopatia cervical, pneumonia, hepatites, distúrbios gastrointestinais, retinites, anemia hemolítica, trombocitopenia, distúrbios do sistema nervoso central e periférico e lesões cutâneas (Landolfo et al., 2003). Em pacientes transplantados o HCMV é um dos principais agentes responsáveis por morte devido à imunossupressão dos mesmos (Pass, 2009). A principal fonte de infecção por HCMV, em transplantados são os órgãos dos doadores soropositivos (80- 24 Revisão Bibliográfica 90% dos casos), nos remanescentes 10-20%, a infecção resulta da reativação do vírus presente em estado latente nos pacientes. Sendo o estado sorológico do doador e do receptor e a natureza da imunossupressão administrada após o transplante os fatores de risco mais importantes e determinantes no desenvolvimento da doença por HCMV (Sia & Patel, 2000). No Brasil, a soroprevalência do HCMV na população adulta chega a 90% (Aquino & Figueiredo, 2001). A incidência de infecção por HCMV durante o período pós-transplante pode variar de 20 a 60% (Aquino & Figueiredo, 2001; Diemant et al., 2010). Em indivíduos com Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), apesar da Terapia Antiretroviral Altamente Ativa contra o HIV (HAART), o HCMV continua a ser um grave problema uma vez que alguns pacientes não respondem ou não têm acesso ao tratamento (Gilbert & Boivin, 2005). 1.7. Mecanismos de Transmissão O HCMV já foi encontrado em saliva, urina, sangue, secreções respiratórias, secreção do cervix uterino, esperma, colostro e leite materno, medula óssea, rins e outros órgãos. Desse modo muitas são as possíveis fontes para disseminação do vírus, podendo a infecção primária ocorrer no período pré-natal (infecção congênita), perinatal ou pósnatal, tanto por vias naturais como iatrogênicas. Uma vez estabelecida uma infecção primária em indivíduos imunocompetentes, o vírus pode permanecer em estado persistente, com baixos níveis de replicação, devido à ação do sistema imune, ou entrar em estado de latência, caracterizado pela presença do DNA em monócitos e ausência de replicação viral. O DNA latente pode reativar em determinadas circunstâncias, especialmente quando houver diminuição da imunidade do hospedeiro resultando 25 Revisão Bibliográfica formação de partículas virais que podem ser transmitidas para novos hospedeiros (Mocarski et al., 2007). 1.7.1. Infecção congênita A infecção congênita por HCMV pode resultar tanto da infecção primária materna (taxa de transmissão vertical de 40% a 50%) como da reativação do vírus latente (taxa de transmissão vertical de 0,5 a 2%). Estes dados indicam que os anticorpos maternos desempenham papel protetor para o feto, evitando doenças clinicamente manifestas. A viremia materna parece ser o fator mais importante para a propagação da infecção para o feto, porém, ainda não está esclarecido se o vírus atravessa a barreira placentária no interior de leucócitos ou livre no plasma. Outra maneira de disseminação seria a infecção dos tecidos placentários e células amnióticas pelo vírus que, após entrar em contato com as células da mucosa oral ou gástrica do feto, por meio da deglutição do líquido amniótico, iniciaria a replicação na orofaringe, alcançando a circulação fetal e propagando-se para outros órgãos, como o rim. As células epiteliais dos túbulos renais parecem ser sítio importante de replicação do HCMV, nas crianças infectadas. A excreção viral, na urina, pode persistir durante anos nessas crianças. Também são desconhecidos os mecanismos pelos quais a mãe transmite a infecção para o feto durante a infecção recorrente. Supõe-se que possa ocorrer reativação viral em sítios localizados, como o endométrio, o miométrio e o canal cervical, com conseqüente propagação para o feto, mesmo na presença de imunidade prévia (Alford et al., 1990). A idade gestacional parece ter pouca influência na frequência da infecção fetal por HCMV, mas, observa-se acometimento mais grave quando a infecção ocorre na primeira metade da gestação (Alford et al., 1990, Mocarski et al., 2007). 26 Revisão Bibliográfica 1.7.2. Infecção perinatal O HCMV também pode infectar o recém-nascido durante o trabalho de parto ou nas primeiras semanas de vida. A infecção perinatal pelo HCMV resulta da contaminação do recém-nascido com secreção cervical ou leite materno contendo o vírus. Ela também pode resultar da transmissão iatrogênica através de transfusão sangüínea, principalmente em prematuros politransfundidos (Pannuti, 1985). A infecção perinatal pode ser resultado de infecção primária materna, mas, frequentemente, é causada por infecção recorrente, resultante da reativação viral. Cerca de 25 a 35% das mães infectadas excretam o vírus pelo leite materno e 40 a 60% das crianças amamentadas por mais de um mês poderão adquirir a infecção (Stagno et al., 1983). O HCMV é isolado do leite materno, mais freqüentemente, após um mês do parto (Almeida et al., 2001). A vasta maioria das infecções perinatais são assintomáticas, podendo, no entanto, estar associadas a quadros de pneumonia intersticial de gravidade variável e hepatoesplenomegalia, atipia linfocitária, exantema, anemia e linfoadenopatia (Kumar et al., 1984). A gravidade da infecção perinatal, que ocorre nos recém-nascidos prematuros submetidos a transfusões sangüíneas de doadores infectados por HCMV, é proporcional à quantidade de sangue transfundido. Esta infecção perinatal pós-transfusional, que possui período de incubação de trinta a cento e cinqüenta dias, pode evoluir com piora rápida do estado clínico, síndrome séptica, pneumonite ou exacerbação de quadros clínicos citados anteriormente, particularmente em bebês prematuros com peso menor que 1.500 gramas e em bebês de mães soronegativas para HCMV, recomendando-se que estes recebam sangue depletado de leucócitos (Almeida et al., 2001). 27 Revisão Bibliográfica 1.7.3. Infecção em pacientes transplantados A gravidade da infecção e as manifestações clínicas são bastante variáveis e dependem do tipo de transplante, condições clínicas do doador, presença ou não de reações de histocompatibilidade, e regime de imunossupressão utilizada. Nos acometidos a doença se apresenta com sinais de síndrome de mononucleose, sendo que o achado principal é febre de duração variável. Em ordem de frequência podem ser observados: hepatomegalia, esplenomegalia, mialgia e/ou artralgia, elevações dos marcadores hepáticos e linfocitose. Linfócitos atípicos são menos evidentes nos pacientes e, devido à imunossupressão a leucopenia ocorre mais frequentemente que leucocitose, juntamente com anemia e trombocitopenia. Após a síndrome da mononucleose, a pneumonia por HCMV é a mais frequente manifestação em pacientes imunodeprimidos, principalmente em transplantados de medula óssea (Zheng et al., 2001). Além das manifestações próprias da doença viral, o HCMV parece ser um imunossupressor, e a infecção por este agente é considerada um fator de risco independente para o desenvolvimento de superinfecções por outros patógenos oportunistas. (Maya & Azulay, 2000). 1.8. Glicoproteínas do HCMV As glicoproteínas do envelope do HCMV exercem importantes funções no ciclo de replicação do HCMV, incluindo a adesão, penetração, disseminação entre células e formação de novas partículas virais. Estas glicoproteínas são adquiridas durante brotamento do nucleocapsídeo e tegumento em membranas celulares derivadas da face trans do complexo de Golgi (Britt & Mach 1996; Rasmussen et al., 1997). 28 Revisão Bibliográfica O envelope do HCMV possui nove glicoproteínas, incluindo a glicoproteína B (gB/UL55), glicoproteína M (gM/UL100), glicoproteína H (gH/UL75), glicoproteína L (gL/UL115), glicoproteína O (gO/UL74), glicoproteína N (gN/UL73), gP48 (UL4), gpTRL10 e UL33 (Varnum et al., 2004). A gH, codificada pelo ORF UL75, constituída de 742 a 743 aminoácidos, tem sido indicada como alvo de anticorpos neutralizantes e, assim como a gB, é importante no ciclo de replicação viral (Spaete, 1994). A gL, produto do ORF UL115 de 278 aminoácidos, é considerada um facilitador da expressão de gH, através do complexo formado pela sua junção mediada por pontes dissulfeto (Spaete, 1994). A gO foi recentemente descrita como codificada pelo gene UL74 (Huber, 1998). É composta de 188 a 195 aminoácidos e forma, juntamente com a gH e a gL, o complexo gCIII (Huber, 1999; Li, 1997), Estas estão organizadas em três complexos glicoprotéicos de alto peso molecular, chamados gCI (formado por gB), gCII (por gM/gN) e gCIII (formado por gO/gH/gL). Estes complexos podem estar unidos por pontes dissulfeto, ou podem ser compostos de dímeros ou multímeros de glicoproteínas derivadas da clivagem de um precursor simples e ainda podem ser formados por diferentes glicoproteínas (Varnum et al., 2004). 1.8.1. Glicoproteína B – gpUL55 Um dos mais importantes componentes do HCMV é a gB, uma proteína de 905 a 907 aminoácidos, dependendo da linhagem viral, codificada pelo ORF UL55, e presente no envelope viral (Figura 5). 29 Revisão Bibliográfica Figura 5. Arquitetura dos domínios da glicoproteína B do HCMV. As regiões coloridas representam os domínios individuais em analogia à estrutura da gB do Herpes Simplex Virus (HSV). Pötzsch, et al, 2011. Diversos estudos demonstram que a gB está envolvida com vários processos como a ligação entre o vírus e a célula, fusão do envelope viral com a membrana plasmática, e orientação de novas partículas virais para aquisição do envelope final da partícula (Varnum et al., 2004, Britt & Mach 1996, Lopper e Compton 2004). Como mencionado, a gB utiliza como receptores as moléculas de HSPG para a fixação e a penetração de HCMV, e outros receptores específicos do hospedeiro tais como integrina beta 1 (ITGB1) e receptor do fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGFRA) (Mocarski et al., 2007). 30 Revisão Bibliográfica A gB é uma proteína altamente imunogênica e considerada o principal alvo de anticorpos neutralizantes, e da resposta imunológica humoral e celular (Rasmussen et al., 1997; Britt & Mach, 1996, Shepp et al., 1996). Estudos demonstram que anticorpos monoclonais anti-gB neutralizam o vírus impedindo a ligação das partículas virais com os receptores da superfície celular (Fries , 1994, Navarro et al., 1997; Dunn et al., 2003; Yun et al., 2003). Durante o transporte pelo complexo de Golgi, a gB é clivada realizada por uma furina do hospedeiro, gerando duas subunidades gp55 e gp116 que são ligadas por pontes dissulfeto ( Lopper & Compton, 2002; Chou, 1992; Brown & Abernathy, 1998). A furina foi a primeira pro-proteína convertase a ser identificada, está localizada principalmente na face trans do complexo de Golgi e é capaz de clivar precursores de uma grande variedade de proteínas, incluindo fatores de crescimento, sistema complemento, receptores, exotoxinas bacterianas e glicoproteínas do envelope (Brown & Abernathy, 1998). O gene UL55 possui regiões variáveis localizadas gene na região N-terminal, Cterminal (Meyer-König et al., 1998) e no sítio de clivagem de protease, região localizada entre os aminoácidos 460 e 461 (Figura 6) (Chou, 1992, Vogelberg et al., 1996). Baseado nas variações no sítio de clivagem da protease, foram caracterizados cinco genótipos da gB (gB1, gB2, gB3, gB4, gB5) (Chou & Dennison, 1991; Chou, 1990; Chou, 1992; Shepp et al.,1998). 31 Revisão Bibliográfica Figura 6. Mapa dos códons da glicoproteína B mostrando as regiões de variação ao nível de peptídeo. As variações que ocorrem geralmente em mais de uma linnhagem estão indicadas pelas linhas maiores. Variações que ocorrem em uma única linhagem (linhas mais curtas). Os círculos fechados indicam sítios de glicosilação potenciais (Asn-X-Ser ou Asn-X-Thr). A seta indica o sítio de clivagem (gp55 região do códon 461) (Adaptado de Chou, 1992). 1.8.2. Variabilidade genética da gB em pacientes transplantados Muitos estudos relatam a correlação dos genótipos da gB com o quadro clínico, carga viral em pacientes infectados, e sua prevalência em diferentes grupos de pacientes imunocomprometidos estudados. Torok-Storb et al.,1997, descrevem em seu estudo com indivíduos transplantados de medula óssea, a correlação dos tipos gB3 e gB4 com morte por mielossupressão. Em outro estudo com pacientes transplantados, o subtipo gB1 foi encontrado mais comumente em pessoas que sobreviveram à infecção pelo HCMV, com melhor prognóstico (Fries et al., 1994, Patel & Paya, 1997). Estudos em pacientes que realizaram transplante renal e outros receptores de órgãos sólidos relatam que o genótipo gB1 é o mais frequente (Manuel et al., 2009). Além disso, trabalhos demonstram que a coinfecção com múltiplos genótipos gB em pacientes imunocomprometidos está associada com maior carga viral, maior prevalência de doença por HCMV, e maior grau de rejeição do órgão, além disso, muitos genótipos são frequentemente concomitantes à infecção com outras herpesviroses (Coaquette et al.,2004). Estes resultados evidenciam a hipótese de que a variabilidade genética em gB 32 Revisão Bibliográfica influencia na virulência do HCMV, devido ao fato de que a patogenicidade está frequentemente ligada ao tropismo celular (Pang et al., 2008, Manuel et al., 2009). No Brasil, estudos como o de Aquino & Figueiredo, 2001 abordaram as relações entre a infecção por HCMV com dados clínicos de pacientes submetidos a transplante de rim no período pós-transplante através das técnicas de antigenemia e nested-PCR para o detecção da gB em amostras de sangue periférico e urina. Neste estudo, os pacientes que apresentaram sintomas da infecção pelo HCMV mostraram maior risco de morte em relação aos pacientes assintomáticos. Yamamoto et al., 2007 compararam a distribuição dos genótipos da gB em mães e crianças infectadas congenitamente com um grupo não infectado para estudar a variação genética das linhagens do HCMV e transmissão materno-fetal. A infecção por múltiplos genótipos foi observada no período pós-parto mães infectadas pelo vírus HIV. Os genótipos da gB não se correlacionaram com a transmissão intra-uterina do HCMV. A distribuição dos genótipos encontrada refletiu a frequência de linhagens selvagens circulantes da região. Correia-Silva et al., 2010 determinaram uma prevalência do genótipo 2 da gB em pacientes submetidos ao transplante alogênico de células tronco hematopoiéticas e também a correlação entre genótipos da gB e níveis de citocinas. Este estudo demonstrou que a diminuição dos níveis de IL-1 e aumento de IL-10 no sangue parecem estar associados com menor sobrevida dos pacientes e que genótipos do HCMV podem estar associados com os diferentes níveis de citocinas presentes em amostras de saliva e sangue. Finalmente, um estudo de Diemant et al., 2010 em receptores pediátricos de transplante de rim e medula óssea demonstrou a prevalência dos genótipos gB1 e gB2, Pacientes em que se detectou o genótipo gB1 apresentaram sintomas como febre, vômito, 33 Revisão Bibliográfica diarréia, característicos de provável doença por HCMV durante uma infecção ativa. Pacientes que apresentaram o genótipo gB2 também apresentaram os mesmos sintomas mai potencializados. Por outro lado, os pacientes que apresentaram mistura de linhagens (gB1/gB4, gB1/gB2 e gB2/gB3) se mostraram assintomáticos. 34 Materiais e Métodos 2. Objetivos Pretendeu-se com esta dissertação de mestrado fornecer dados epidemiológicos com relação à infecção por HCMV e variabilidade genética da gB em pacientes que foram submetidos a transplante renal. 2.1. Objetivos específicos - Investigar a presença do HCMV em pacientes submetidos a transplante renal; - Determinar a prevalência dos diferentes genótipos da gB na população de pacientes transplantados analisada; 35 Materiais e Métodos 3. Materiais e Métodos 3.1. Amostra viral de referência O DNA da linhagem clínica fix do HCMV, clonado como um Cromossomo Bacteriano Artificial (HCMV FIX-BAC), gentilmente doado por Thomas Shenk (Universidade de Princeton), foi utilizado como controle positivo na etapa de extração do DNA total e nas reações de semi-nested PCR. 3.2. População e amostras do estudo O presente estudo compreende um grupo de 72 pacientes que realizaram transplante renal pelo Hospital da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto (FAMERP). As amostras de sangue periférico dos pacientes foram coletadas em tubos contendo EDTA e gentilmente enviadas para a UFABC pelos Professores Dr. Maurício Lacerda Nogueira e Leonardo Guizilini Plazas Ruiz. 3.3. Extração e Purificação de DNA O DNA total do sangue periférico dos pacientes foi extraído utilizando-se o kit Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega™) seguindo as instruções do fabricante. O protocolo utilizado foi feito da seguinte maneira: 300l do sangue foram homogeneizados por inversão com 900l de solução de lise de células, incubados à temperatura ambiente por 10min e centrifugação por 20s a 16000xg*. 36 Materiais e Métodos Adicionou-se 300l de solução de lise de núcleo e 100l de solução de precipitação de proteínas e misturou-se vigorosamente por 20s e centrifugação por 3min a 16000xg*. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo contendo 300l de isopropanol. A solução foi homogeneizada e centrifugada por 1min a 16000xg*. O sobrenadante foi descartado e adicionou-se 300l de etanol a 70% e a solução foi centrifugada por 1min a 16000xg*. Novamente o sobrenadante foi descartado e o DNA ressuspendido em 100l de solução de reidratação. Para controle positivo da extração, o DNA viral HCMV (FIX-BAC) foi adicionado a uma amostra de sangue, negativa para o HCMV, antes da extração do DNA total. Como controle negativo o mesmo protocolo foi realizado somente com água. 3.4. Semi-nested-PCR Em uma primeira etapa uma reação de PCR foi realizada conforme protocolo descrito por Zheng, et al., 2001. Brevemente, foi preparada uma mistura contendo 5µl do DNA, tampão 1X (200mM Tris-HCl pH 8.4, 500mM KCl), 2 mM de MgCl2 (50mM), 0,25 µM dos primers gB-1up e gB-low (Tabela 1), 0,2 µM da mistura de dNTP (250mM de cada dNTP), 1U de Taq DNA polimerase (Invitrogen, USA) e água para completar 50µl. Os ciclos da reação utilizados foram de 94 ºC/15 minutos, seguido de cinco ciclos de 94 ºC 30 segundos, 60°C /30 segundos e 72ºC/45 segundos e após trinta ciclos de 94 ºC/30 segundos, 55,2°C/30 segundos e 72ºC/45 segundos e finalmente, extensão final de 72ºC/10 minutos. Na segunda etapa de amplificação (Nested) 5µl do amplicon da reação de PCR foi adicionado a uma mistura contendo tampão 1X (200mM Tris-HCl pH 8.4, 500mM 37 Materiais e Métodos KCl), 2 mM de MgCl2 (50mM), 0,25 µM dos primers gB-1up e gB-2low, que produzem um fragmento de 316pb (Tabela1), 0,2 µM da mistura de dNTP (250mM de cada dNTP), 1U de Taq DNA polimerase (Invitrogen, USA) e água para completar 50µl. Novamente, a mistura foi submetida aos mesmos 35 ciclos térmicos realizados na etapa de PCR descrita anteriormente. A presença de DNA celular nas amostras foi confirmada pela amplificação do gene GAPDH humano (Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase) utilizando-se o conjunto de primers descrito na tabela 1 e o mesmo protocolo descrito para a reação de PCR para o ORF UL55. O produto da amplificação submetido à eletroforese em gel de agarose 1%, em tampão Tris-Acetato EDTA. Para visualização o DNA foi corado com brometo de etídeo e visualizado em transiluminador UV Carestream 212 Pro. Tabela 1. Primers utilizados no estudo Primers Sequência 5'-3' Tamanho Posição no Amplicon genoma Referência (pb) gB-1up TGT TCT GGC AAG GYA TCA AG gB-low TCA CAA GAC ATC ACC CAT GAA AC gB-2 low GTT GTT GTA RAT GGC YGA GAG GAPDH foward ACC CAC TCC TCC ACC TTT GAC GAPDH reverse CTG TTG CTG TAG CCA AAT TCG T 352 83024 Zheng, et al., 2001 83353 Zheng, et al., 2001 316 83319 Zheng, et al., 2001 203 1066 Murphy, E. 2008 1269 Murphy, E. 2008 38 Materiais e Métodos 3.5. Purificação dos produtos de PCR A purificação dos produtos obtidos da amplificação por PCR foi realizada utilizando-se o kit Ilustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification kit (GE Healthcare Bio-sciences), seguindo as instruções do fabricante. 3.6. Reação de sequenciamento de DNA A reação de sequenciamento de DNA consistiu em 4 L de BigDye 3.1 (Applied Byosystems), 3,2 pmoles de cada primer senso e antisenso referente ao gene em reações independentes, entre 30 a 60 ng do DNA em estudo e água DNase RNAse free para uma reação final de 10L, levando-se ao termociclador Mastercycler Gradient (Eppendorf ) para 35 ciclos de 96 ºC/10 segundos, 50 ºC/5 segundos e 60ºC/4 minutos, com rampa de 1ºC/segundo entre cada temperatura. A purificação da reação de sequenciamento foi realizada por Sephadex™ G(GE healthcare Bio-sciences)em placas especificas para PCR com 96 orifícios. Após a purificação, as sequências foram obtidas a partir do sequenciador automático ABI-3130 (Applied Biosystems™). 3.7. Edição das sequências de DNA Para cada nucleotídeo mostrado nos eletroferogramas, foram atribuídos scores através do software Phred (http://asparagin.cenargen.embrapa.br/phph/), sendo 39 Materiais e Métodos utilizadas as posições que apresentaram nucleotídeos com índice Phred maior que 20, isto é, uma taxa de erro equivalente a menos uma base para 100 sequenciadas. Os nucleotídeos com índice Phred igual ou menor a 20 foram conferidos manualmente com o programa Chromas v. 2.23 (© 1998-2002 Technelysiumm Pty LTD), para a busca por erros de interpretação e discrepâncias entre cada uma das fitas sequenciadas. A sequência final de cada amostra foi obtida com o aplicativo CAPcontig com o programa Bioedit v. 5.0.9 (Hall, 1999), sendo a mesma submetida a BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) para confirmação do sequenciamento. 3.8. Determinação dos genótipos da gB e análise genealógica Para a construção das árvores filogenéticas, as sequências de DNA obtidas foram alinhadas pelo método do alinhamento múltiplo Muscle (Edgar, 2011) utilizando-se o programa Seaview 4 (Gouy, Guindon & Gascuel, 2010), conferindo-se manualmente os alinhamentos para cada conjunto de sequências alinhadas. Para a reconstrução filogenética das amostras de HCMV, foi utilizado o método de máxima verossimilhança com o software PhyML (Anisimova & Gascuel, 2006) com modelo evolutivo GTR (General Time Reversible) através da inteface gráfica Seaview 4 com suporte de ramos aLRT (Guindon & Gascuel, 2003). Foram utilizadas 26 sequências de genomas completos do HCMV de diferentes linhagens presentes no GenBank (Tabela 2) como grupos externos para o enraizamento das árvores. Os genótipos da gB foram determinados através da comparação das sequências obtidas com as sequências publicadas por Wu et al., 2010 (Figura 7). 40 Materiais e Métodos Tabela 2. Linhagens do HCMV e sequências parciais da gB com seus respectivos números de acesso do GenBank, utilizadas para gerar a árvore filogenética do ORF UL55 (gB). Amostra strain AD169 complete genome Número de Acesso X17403.1 Referência Chee, et al., 1990 strain AF1 complete genome GU179291.1 Dargan, et al., 2010 strain JHC complete genome HQ380895.1 Jung, et al., 2011 Gorilla gorilla cytomegalovirus FJ538490 Leendertz et al., 2009 strain Toledo complete genome GU937742.1 Davison, et al., 2003 strain Merlin complete genome AY446894.2 Davison, et al., 2003 strain JHC complete genome HQ380895.1 Jung, et al., 2011 strain JP complete genome GQ221975.1 Cunningham, et al., 2010 strain U8 complete genome GU179288.1 Dargan, et al., 2010 strain U11 complete genome GU179290.1 Dargan, et al., 2010 strain HAN13 complete genome GQ221973.1 Cunningham, et al., 2010 strain HAN20 complete genome GQ396663.1 Cunningham, et al., 2010 strain HAN38 complete genome GQ396662.1 Cunningham, et al., 2010 strain VR1814 complete genome GU179289.1 Dargan, et al., 2010 strain 3157 complete genome GQ221974.1 Davison, et al., 2003 strain 3301 complete genome GQ466044.1 Cunningham, et al., 2010 gB1 glycoprotein B GU365817.1 Murthy, et al., 2011 gB1* glycoprotein B GU365818.1 Murthy, et al., 2011 gB1** glycoprotein B GU365819.1 Murthy, et al., 2011 gB2 glycoprotein B GU365820.1 Murthy, et al., 2011 gB2* glycoprotein B GU365821.1 Murthy, et al., 2011 gB3 glycoprotein B GU365822.1 Murthy, et al., 2011 gB3* glycoprotein B GU365823.1 Murthy, et al., 2011 gB4 glycoprotein B GU365824.1 Murthy, et al., 2011 gB5 glycoprotein B GU365825.1 Murthy, et al., 2011 41 Materiais e Métodos Figura 7: Quadro do alinhamento de sequências de DNA do HCMV para cada genótipo da gB. As regiões destacadas indicam os sítios de restrição para as enzimas HinfI e RsaI presentes na região variável da gB. Adaptado de Wu et al., 2010. 42 Resultados 4. Resultados 4.1. Semi-nested-PCR para amplificação do gene codificador da glicoproteína B (UL55) Foram testadas 72 amostras de sangue periférico de pacientes submetidos a transplante renal para a presença do HCMV, pela técnica de semi-nested-PCR utilizando-se primers para a região variável da glicoproteína gB e 26 (36,1%) mostraramse positivas. A figura 8 demonstra resultados da amplificação do fragmento de 316pb correspondente a região variável da gB em amostras positivas representativas de dois pacientes, controle positivo (HCMV FIX-BAC) e controle negativo (água). Em todas as 72 amostras testadas, o gene GAPDH foi amplificado confirmando a presença de DNA celular nas mesmas. A figura 9 mostra amplificação da região de 203 pb do GAPDH em quatro amostras de pacientes e um controle negativo da fase de isolamento do DNA, no qual não houve amplificação. 43 Resultados 1 2 3 4 5 6 PM 3032 3069 H2O FixBac H2O 316 pb Figura 8. Eletroforese em gel de agarose a 1% dos amplicons obtidos na reação de semi-nested-PCR para detecção da gB em amostras de sangue de pacientes transplantados: Padrão de peso molecular (1), CMVHB-3032 (2), CMVHB-3069 (3), controle negativo adicionado na fase de Nested (4), controle positivo da fase de isolamento de DNA (5) e controle negativo da também da fase de isolamento do DNA(6). 1 2 3 4 5 6 2982 3004 3026 4314 H2O PM 203 pb Figura 9. Eletroforese em gel de agarose a 1% dos amplicons obtidos na reação de Semi-Nested-PCR para detecção do gene GAPDH em amostras de sangue de pacientes transplantados: (1) CMVHB-2980, (2) CMVHB-3004, (3) CMVHB-3026, (4) CMVHB-4314, (5) controle negativo adicionado na fase de Nested, (6) Padrão de peso molecular. 44 Resultados 4.2. Reação de sequenciamento de DNA Das 26 amostras positivas por semi-nested-PCR para o ORF UL55 sequenciadas, todas resultaram em sequências com índice Phred maior que 20 e contigs viáveis após a aferição com o aplicativo CAPcontig e edição manual pelo aplicativo Chromas. Para cada uma das sequências obtidas, a análise de BLASTn confirmou as identidades máximas entre as amostras estudadas. A região analisada do gene corresponde à posição nucleotídeo 488 ao nucleotídeo 679 do gene UL55 (em relação à linhagem AD169 número de acesso X17403.1), referentes à região do sítio de clivagem da protease. 4.3. Determinação dos genótipos da gB e análise genealógica A determinação dos genótipos da gB foi realizada utilizando-se como base de referência sequências publicadas por Wu et al., 2010 (Fig.7). Nestas sequências estão destacados os sítios de restrição para as enzimas HinfI e RsaI e variações dentro dos mesmos nos diferentes genótipos. 45 Resultados HinfI – GAATC RsaI - GTAC Figura 10. Alinhamento representativo das sequências da gB de pacientes transplantados. As regiões destacadas indicam os sítios de restrição para as enzimas HinfI e RsaI presentes na região variável da gB (Wu et al., 2010). Também para determinação dos genótipos da gB foram geradas árvores filogenéticas com base na região do gene UL55 analisada. Para construção das árvores foram utilizadas sequências de diferentes linhagens do HCMV, extraídas do GenBank, utilizando método de máxima verossimilhança com o software PhyML com modelo evolutivo GTR (General Time Reversible) através do Seaview 4. A tabela 3 mostra todas as amostras positivas para HCMV e seus respectivos genótipos para a glicoproteína gB. 46 Resultados Tabela 3. Amostras dos pacientes positivas pela técnica de semi-nested-PCR com os resultados da análise do BLASTn e os genótipos da gB. Amostras Positivas para Citomeglovírus Humano Número Amostra Resultado do BLASTn Genótipo 1 CMVHB-2982 Linhagem Toledo gB3 2 CMVHB-2984 Linhagem U11 gB2 3 CMVHB-3032 Linhagem JP gB2 4 CMVHB-3069 Linhagem U11 gB2 5 CMVHB-3072 Linhagem U11 gB2 6 CMVHB-4312 Linhagem AF1 gB1 7 CMVHB-4327 Linhagem U11 gB2 8 CMVHB-4328 Linhagem U11 gB2 9 CMVHB-4329 Linhagem U11 gB2 10 CMVHB-4330 Linhagem U11 gB2 11 CMVHB-4333 Linhagem U11 gB2 12 CMVHB-5146 Linhagem U11 gB2 13 CMVHB-5157 Linhagem U11 gB2 14 CMVHB-5192 Linhagem U11 gB2 15 CMVHB-5212 Linhagem VR1814 gB3 16 CMVHB-5237 Linhagem VR1814 gB3 17 CMVHB-5350 Linhagem U11 gB2 18 CMVHB-5353 Linhagem U11 gB2 19 CMVHB-5365 Linhagem U11 gB2 20 CMVHB-5377 Linhagem U11 gB2 21 CMVHB-5398 Linhagem U11 gB2 22 CMV-HB 6261 Linhagem U11 gB2 23 CMV-HB 6338 Linhagem U11 gB2 24 CMV-HB 6347 Linhagem U11 gB1 25 CMV-HB 6390 Linhagem U11 gB2 26 Amostra5 Linhagem VR1814 gB3 Para construção da árvore, demonstrada na figura 11, foi analisado o segmento gênico correspondente à região entre o nucleotídeo 1330 a 1513. A raiz desta árvore foi realizada utilizando-se uma sequência de Citomegalovírus de gorila (GCMV), retirada do GenBank (número de acesso FJ538490.2). Esta árvore nos mostra cinco agrupamentos nos quais foi realizada análise da região mencionada pelas linhagens do HCMV (genoma completo, sequências parciais da glicoproteína B e sequências obtidas 47 Resultados das amostras dos pacientes. A grande maioria das amostras dos pacientes se concentrou no grupo do genótipo gB2, seguido pelo grupo gB3 e gB1. 48 Resultados Figura 11. Árvore filogenética enraizada construída pelo método de máxima verossimilhança utilizando as amostras, genótipos e linhagens. Essa árvore mostra a formação de cinco grupos, onde o grupo gB2 apresenta a maior concentração das amostras dos pacientes seguidos de gB3 e gB 1. O outgroup da árvore foi feito utilizando a sequência do Citomegalovírus de gorila (GCMV número de acesso FJ538490.2). Os números próximos de cada nó representam o suporte de ramo aLRT. 49 Resultados Na árvore da figura 12 foi utilizado o segmento completo dos genótipos da gB, alinhados com as sequências das linhagens do HCMV e como esperado, foram formados todos os grupos correspondentes a cada genótipo da gB. 50 Resultados Figura 12. Árvore filogenética enraizada construída pelo método de máxima verossimilhança utilizando as sequências dos genótipos da gB e linhagens do HCMV. O outgroup da árvore foi feito utilizando a sequência do Citomegalovírus de gorila (GCMV número de acesso FJ538490.2). Os números próximos de cada nó representam o suporte de ramo aLRT, mostrando claramente os grupos formados para cada genótipo da gB. 51 Discussão 5. Discussão O HCMV está entre os maiores problemas da saúde pública mundial, sendo o causador de inúmeras infecções em pacientes imunodeprimidos. Com o desenvolvimento de imunossupressores mais potentes, passaram a ocorrer relatos de infecções virais com maior severidade e maior taxa de recorrência (Smak Gregoor et al., 2003). A alta incidência do vírus na população, aliada à sua característica oportunista e habilidade de se disseminar para vários órgãos explicam sua frequente ocorrência na população transplantada (Costa, 1999). Nesse grupo de pacientes, a infecção primária pode ter origem em fontes diversificadas, incluindo o próprio enxerto, ou secundária, quando o indivíduo tem infecção latente, sendo que as infecções primárias geralmente são mais graves (Maya & Azulay, 2000). Muitos estudos relataram a correlação dos genótipos da gB do envelope viral com o quadro clínico e carga viral dos pacientes infectados. A gB é um dos componentes mais importantes do HCMV. Esta proteína altamente conservada essencial para a replicação do vírion possui, em certas regiões, como por exemplo, a região do sítio de clivagem da protease pontos de variação genética, o que resulta em diferentes genótipos da gB, fator este, que pode influenciar diretamente na patogênese e virulência do HCMV (Coaquette et al., 2004). Acredita-se que algumas linhagens têm preferência em infectar determinados órgãos ou tipos celulares, ou que são mais virulentas ou mais imunossupressoras que outras, ou ainda, possuem uma maior probabilidade de contribuir para a rejeição de órgão (Binder et al., 1999; Diemant et al., 2010). Em nosso estudo o HCMV foi detectado em 26 das 72 amostras de pacientes submetidos a transplante renal (36,1%) pela técnica de semi-nested PCR. A discrepância dos dados da literatura em relação aos resultados de nosso estudo, no qual foi utilizada a 52 Discussão técnica de semi-nested PCR, e em somente 28 amostras o vírus detectado, pode ser devido a diferenças na sensibilidade das técnicas ou aos diferentes conjuntos de primers utilizados. Além disso, a dificuldade da detecção do HCMV em todas as amostras testadas neste trabalho também pode ser devido a variabilidade no ORF UL55 presente na região de anelamento dos primers usados em semi-nested PCR, embora os oligonucleotídeos utilizados sejam específicos para regiões mais conservadas do ORF UL55. Novak et al., 2011 relatou que a infecção por múltiplos genótipos pode influenciar a geração de novas variantes pela recombinação genética, dificultando assim, a detecção do HCMV por métodos moleculares. Em um estudo realizado por Zheng et al., 2002, o HCMV foi detectado pela técnica de semi-nested-PCR em 18% dos pacientes submetidos a transplante de fígado estudados. Neste estudo foram abordadas as variações genéticas da gB e prevalência dos genótipos por sequenciamento genético, sendo o genótipo gB1 predominante, seguido do genótipo gB2. Diemant et al., 2010, também observaram predominância do genótipo gB1, sendo que o gB2 também apresentou uma frequência considerável em pacientes transplantados renais. Neste estudo os pacientes com o genótipo gB1 apresentaram sintomas como febre, vômito e diarréia característicos de uma doença pelo HCMV. Já pacientes com genótipo gB2 também demonstraram os mesmos sintomas, porém mais graves e com recorrência da infecção. Por outro lado, os pacientes que apresentaram mistura de linhagens (gB1/gB4, gB1/gB2 e gB2/gB3) permaneceram assintomáticos. No presente estudo foi encontrada uma prevalência do genótipo gB2 em amostras de pacientes submetidos a transplante renal no hospital da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, seguido pelos genótipos gB3 e gB1. Os genótipos 53 Discussão gB4 e gB5 não foram encontrados neste estudo. Os resultados apresentados corroboram os estudos de Vogelberg et al., 1996 e Carraro & Granato, 2003 . Como mencionado alguns estudos anteriores em pacientes submetidos a transplante renal observaram a prevalência do genótipo gB1 (Diemant et al., 2010; Madi et al., 2011). As diferenças genotípicas encontradas nos diferentes estudos podem ser devido à variação na distribuição geográfica dos genótipos ou também pela diversidade de linhagens virais (Wada et al., 1997). A propriedade da gB em promover a entrada e disseminação viral nas células hospedeiras, provavelmente pode ser diferente entre os genótipos em sua habilidade de regular e interagir com moléculas de adesão podendo caracterizar a prevalência de genótipos específicos em determinados grupos de pacientes (Meyer-König et al., 1998; Diemant et al., 2010; Madi et al., 2011). 54 Conclusões 6. Conclusões A partir dos resultados deste estudo pode-se obter as seguintes conclusões: 1. O HCMV foi detectado pela técnica de semi-nested-PCR em 36,1% da população analisada; 2. Nos pacientes estudados houve uma prevalência do genótipo gB2 (78%) seguido pelo genótipo gB3 (18%) e genótipo gB1 (4%). 3. Não foram encontrados os genótipos gB4 e gB5. 55 Referências Bibliográficas 7. Referências Bibliográficas ALFORD, C.A.; BRITT, W.J. - Cytomegalovirus. In: Fields Virology, 2ª ed., New York, Raven Press, p. 1981-2010, 1990. ALMEIDA, H.C.; BITTENCOURT, H.; GOMEZ, R.S. Saliva as a source of HCMV DNA in allogeneic stem cell transplantation patients. Oral Diseases v.16, p.210–216, Mar, 2010. ALMEIDA, L.N.B.; AZEVEDO, R.S.; AMAKU, M.; MASSAD, E. Cytomegalovirus seroepidemiology in an urban community of São Paulo, Brazil. Rev Saúde Pública; 35(2): 124-129, 2001. ANISIMOVA, M. & GASCUEL O. Approximate Likelihood-Ratio Test for Branches: A Fast, Accurate, and Powerful Alternative. Systematic Biology, 55(4), 539-552, 2006. BINDER, T.; SIEGERT, W.; KRUSE, A.; OETTLE, H.; WILBORN, F.; PENG, R.; TIMM, H.; NEUHAUS, P.; SCHMIDT, C.A. Identification of Human Cytomegalovirus Variants by Analysis of Single Strand Conformation Polymorphism and DNA Sequencing of the Envelope Glycoprotein B Gene Region-Distribution Frequency in Liver Transplant Recipients. Journal of Virological Methods, 78(1-2): 153-162, 1999. BRESNAHAN, W.A.; SHENK, T. - A Subset of Viral Transcripts Packaged Within Human Cytomegalovirus Particles. Science, 288: 2373-2376, 2000. BRITT, W. J.; MACH, M. – Human Cytomegalovirus Glycoproteins. Intervirology, 39: 401-412, 1996. CARRARO, E. & GRANATO, C.F. Single human cytomegalovirus gB genotype shed in multiple sites at the time of diagnosis in renal transplant recipients. J Med Virol. Jun;70(2):240-3, 2003. CHEE,M.S.; BANKIER,A.T.; BECK,S.; BOHNI,R.; BROWN,C.M.; CERNY,R.;HORSNELL,T.; HUTCHISON III,C.A.; KOUZARIDES,T.; MARTIGNETTI,J.A.;PREDDIE,E.;SATCHWELL,S.C.;TOMLINSON,P.;WESTON,K .M.; BARRELL,B.G. Analysis of the protein-coding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD169.Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154, 125-169, 1990. CHOU, S. – Differentiation of Cytomegalovirus Strains by Restriction Analysis of DNA Sequences Amplified from Clinical Specimens. Journal of Infectious Diseases, 162: 738-742, 1990. CHOU, S. – Cytomegalovirus Infection. Current Opinion in Infectious Diseases, 5: 427-432, 1992. CHOU, S.; DENNISON, K.M. – Analysis of Interstrain Variation in Cytomegalovirus Glycoprotein B Sequences Encoding Neutralization-Related Epitopes. Journal of Infectious Diseases, 163: 1229-1234, 1991. 56 Referências Bibliográficas CHOU S. - Antiviral Drug Resistance in Human Cytomegalovirus.Transplant Infectious Disease, 1(2): 105-114, 1999. COAQUETTE A.; BOURGEOIS A.; DIRAND C.; VARIN A.; CHEN W; HERBEIN G. Mixed Cytomegalovirus Glycoprotein B Genotypes in Immunocompromised Patients. Clinical Infectious Diseases, 39: 155-161, 2004. CORREIA-SILVA, J.F.; BRUNA-ROMERO, O.; RESENDE, R.G.; MIRANDA, L.P.M.; OLIVEIRA, F.E.; COSTA, F.O.; XAVIER, S.G.; FIGUEIREDO-NEVES, S.P.; CUNNINGHAM C.; GATHERER D.; HILFRICH B.; BALUCHOVA K.; DARGAN D.J.; THOMSON M.; GRIFFITHS P.D.; WILKINSON G.W.; SCHULZ T.F.; DAVISON,A.J. Sequences of complete human cytomegalovirus genomes from infected cell cultures and clinical specimens J. Gen. Virol. 91 (PT 3), 605-615, 2010. DARGAN, D.J.; DOUGLAS, E.; CUNNINGHAM, C.; JAMIESON, F.; STANTON, R.J.; BALUCHOVA, K.; MCSHARRY, B.P.; TOMASEC, P.; EMERY, V.C.; PERCIVALLE, E.;SARASINI, A.; GERNA, G.; WILKINSON, G.W.; DAVISON, A.J. Sequential mutations associated with adaptation of human cytomegalovirus to growth in cell culture J. Gen. Virol. 91 (PT 6), 1535-1546, 2010. DAVISON,A.J.; AKTER,P.; CUNNINGHAM,C.; DOLAN,A.; ADDISON,C.; DARGAN,D.J.; HASSAN-WALKER,A.F.; EMERY,V.C.; GRIFFITHS,P.D.; WILKINSON,G.W. Homology between the human cytomegalovirus RL11 gene family and human adenovirus E3 genes J. Gen. Virol. 84 (PT 3), 657-663, 2003. DOLAN, A.; CUNNINGHAM, C.; HECTOR, R.D.; HASSAN-WALKER, A.F.; LEE,L.; ADDISON, C.; DARGAN, D.J.; MCGEOCH, D.J.; GATHERER, D.; EMERY, V.C.; GRIFFITHS, P.D.; SINZGER, C.; MCSHARRY, B.P.; WILKINSON, G.W.; DAVISON, A.J. Genetic content of wild-type human cytomegalovirus J. Gen. Virol. 85 (PT 5), 1301-1312, 2004. DUNN, W.; CHOU, C.; LI, H.; HAI, R.; PATTERSON, D.; STOLC, V.; ZHU, H.; LIU, F. Functional profiling of a human cytomegalovirus genome. Proc Natl Acad Sci U S A. 25;100(24):14223-8, 2003. EDGAR, R.C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32:1792–1797, 2004. ESSA, S.; PACSA, A.; RAGHUPATHY, R.; SAID, T.; NAMPOORY, M.R.; JOHNY, K.V.; AL-NAKIB, W. Low levels of Th1-type cytokines and increased levels of Th2type cytokines in kidney transplant recipients with active cytomegalovirus infection. Transplant Proc. v.41, n.5, p.1643-1647, 2009. FIORAVANTE, M.T. Diagnóstico e monitorização da infecção por Citomegalovirus em transplantados renais por meio da técnica de “Nested”- PCR e antigenemia. Dissertação de Mestrado, DCM/FCM/Unicamp, 2001. 57 Referências Bibliográficas FRIES, B.C.; CHOU, S.; BOECKH, M.; TOROK-STORB, B. – Frequency Distribuition of Cytomegalovirus Envelope Glycoprotein Genotypes in Bone Marrow Transplant Recipients. Journal of Infectious Diseases, 169: 769-774, 1994. GOUY M., GUINDON S. & GASCUEL O. SeaView version 4: a multiplatform graphical user interface for sequence alignment and phylogenetic tree building. Molecular Biology and Evolution 27(2):221-224, 2010. GIBSON W. Structure and formation of the cytomegalovirus virion. Curr Top Microbiol Immunol.;325:187-204, 2008. GILBERT, C.; BOIVIN, G. – Mini review: Human Cytomegalovirus Resistance to Antiviral Drugs. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 49(3): 873-883, 2005. GREIJER, A.E.; DEKKERS, C.A.; MIDDELDORP, J.M.; Human cytomegalovirus virions differentially incorporate viral and host cell RNA during the assembly process. J Virol. 9078-82, 2000. GUINDON, S. & GASCUEL, O. A simple, fast, and accurate algorithm to estimate large phylogenies by maximum likelihood. Syst Biol. 52:696–704, 2003. HALL, T. A. Bioedit: a user-friendly biological sequence aligment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symposium Series, v.41, p.95-98, 1999. HELDWEIN, E.E.; LOU, H.; BENDER, F.C.; COHEN, G.H.; EISENBERG, R.J.; HARRISON, S.C. Crystal structure of glycoprotein B from herpes simplex virus 1. Science 313: 217–220, 2006. HUANG, E; JOHNSON, R.A. - Human Cytomegalovirus - no Longer just a DNA Virus. Nature Medicine, 6: 863-864, 2000. JACOBSON, M.A & MILLS, J.; Cytomegalovirus infection. Clin Chest Med, 9: 443448, 1988. JARVIS, M.A.; NELSON, J.A.; Human cytomegalovirus persistence and latency in endothelial cells and macrophages. Curr. Opin. Microbiol 5: 403-7, 2002. JUNG,G.S.; KIM,Y.Y.; KIM,J.I.; JI,G.Y.; JEON,J.S.; YOON,H.W.; LEE,G.C.; AHN,J.H.; LEE,K.M.; LEE,C.H. Full genome sequencing and analysis of human cytomegalovirus strain JHC isolated from a Korean patient. Virus Res. 156 (1-2), 113120, 2011. LANDOLFO, S.; GARIGLIO, M.; GRIBAUDO, G.; LEMBO, D. The Human cytomegalovirus Pharmacol Ther. Jun;98(3):269-97, 2003. LEENDERTZ, F.H.; DECKERS, M.; SCHEMPP, W.; LANKESTER, F.; BOESCH, C.; MUGISHA, L.; DOLAN, A.; GATHERER, D.; MCGEOCH, D.J.; EHLERS, B. Novel cytomegaloviruses in free-ranging and captive great apes: phylogenetic evidence for bidirectional horizontal transmission J. Gen. Virol. 90 (PT 10), 2386-2394, 2009. 58 Referências Bibliográficas LOPPER, M. & COMPTON, T. Coiled-coil domains in glycoproteins B and H are involved in human cytomegalovirus membrane fusion..Journal of Virology 78, 83338341, 2004. MADI, N.; AL-NAKIB, W.; PACSA, A.; SAEED, T. Cytomegalovirus genotypes gB1 and gH1 are the most predominant genotypes among renal transplant recipients in Kuwait. Transplant Proc.43(5):1634-7, Jun, 2011 MANUEL, O.; ASBERG, A.; PANG, X.; ROLLAG, H.; EMERY, V.C.; PREIKSAITIS, J.K.; KUMAR, D.; PESCOVITZ, M.D.; BIGNAMINI, A.A.; HARTMANN, A.; JARDINE, A.G.; HUMAR, A. Impact of genetic polymorphisms in cytomegalovirus glycoprotein B on outcomes in solidorgan transplant recipients with cytomegalovirus disease. Clin Infect Dis. v.49, n.8, p.1160-6, Oct, 2009. MEYER-KÖNIG, U.; VOGELBERG, C.; BONGARTS, DELBRÜCK, R.; WOLFF-VORBECK, G.; KIRSTE, G.; HUFERT, F.T.; von LAER, D. – Glycoprotein B Genotype Tropism In Vivo of Human Cytomegalovirus Infection. Journal 55: 75-81, 1998. A.; KAMPA, D.; HABERLAND, M.; Correlates with Cell of Medical Virology, MEYER-KÖNIG, U.; HABERLAND, M.; von LAER, D.; HALLER, O.; HUFERT, F.T. – Intragenic Variability of Human Cytomegalovirus Glycoprotein B in Clinical Strains. Journal of Infection Diseases, 177: 1162-1169, 1998(2). MIR, S.; ERDOGÃN, H.; KABASAKAL, C.; HOSCOSKUN, C. Pediatric renal transplantation: Single center experience. Pediatric transplantation. 9: 56-61, 2005 MORCARSKI, E.S. JR. Immunomodulation by cytomegaloviruses: manipulative strategies beyond evasion. Trends Microbiol. v.10, n.7, p.332-339, Jul, 2002. MOCARSKI, E. S.; SHENK, T.; PASS, R. F;. Cytomegaloviruses. Knipe D., Howely P.M.,Griffin D. E., Lamb R. A., Martin M. A., Roizman B., Straus S.E., 5th edition. Lippincott- Williams and Wilkins publishers, Philadelphia. 2701-2072, 2007. MURPHY, E.; YU, D.; GRIMWOOD, J.; SCHMUTZ, J.; DICKSON, M.; JARVIS, M.A.; HAHN, G.; NELSON, J.A.; MYERS, R.M.; SHENK, T.E. Coding potential of laboratory and clinical strains of human cytomegalovirus. ProcNatlAcadSci USA 100:14976-81, 2003. MURTHY, S.; HAYWARD, G.S.; WHEELAN, S.; FORMAN, M.S.; AHN, J.H.; PASS, R.F.; ARAV-BOGER,R. Detection of a single identical cytomegalovirus (CMV) strain in recently seroconverted young women. PLoS ONE 6 (1), E15949, 2011. NAVARRO, D.; LENNETTE, E.; TUGIZOV, S.; PEREIRA, L. – Humoral Immune Response to Functional Regions of Human Cytomegalovirus Glycoprotei B. Journal of Medical Virology, 52: 451-459, 1997. PANG, X.; HUMAR, A.; PREIKSAITIS, J.K. Concurrent genotyping and quantitation of cytomegalovirus gB genotypes in solid-organ-transplant recipients by use of a realtime PCR assay. J Clin Microbiol. v.46, n.12, p.4004-10, Dec, 2008. 59 Referências Bibliográficas PANNUTTI,C.S. Infecção por CMV. Revisão e Ensaios. Pediat (S.Paulo), 6: 144-153, 1985. PATEL R & PAYA C. Infections in Solid-Organ Transplant Recipients. Clin Microbiol 10 (1): 86-124, 1997. PASS, R.F.; ZHANG, C.; EVANS, A.; SIMPSON, T.; ANDREWS, W.; HUANG, M.L.; COREY, L.; HILL, J.; DAVIS, E.; FLANIGAN, C.; CLOUD, G. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine 360, 1191-1199, 2009. PÖTZSCH, S.; SPINDLER, N.; WIEGERS, AK.; FISCH, T.; RÜCKER, P.; STICHT, H.; GRIEB, N.; BAROTI, T.; WEISEL, F.; STAMMINGER, T.; MARTIN-PARRAS, L.; MACH, M.; WINKLER, T.H. B cell repertoire analysis identifies new antigenic domains on glycoprotein B of human cytomegalovirus which are target of neutralizing antibodies. PLoS Pathog. 7(8): e1002172, Aug, 2011. RASMUSSEN, L. – Immune Response to Human Cytomegalovirus Infectious. Current Topics in Microbiology and Immunology, 154: 221-254, 1990. RASMUSSEN, L.; MORRIS, S.; ZIPETO, D.; FESSEL, J.; WOLITZ, R.; DOWLING, A.; MERIGAN, T.C. – Quantitation of Human Cytomegalovirus DNA from Peripheral Blood Cells of Human Immunodeficiency Virus-Infected Patients Could Predict Cytomegalovirus Retinitis. Journal of Infection Diseases, 171: 177-182, 1995. RASMUSSEN, L.; HONG, C.; ZIPETO, D.; MORRIS, S.; SHERMAN, D.; CHOU, S.; MINER, R.; DREW, W.L.; WOLITZ, R.; DOWLING, A.; WARFORD, A.; MERIGAN, T.C. – Cytomegalovirus gB Genotype Distribution Differs in Human Immunodeficiency Virus-Infected Patients and Immunocompromised Allograft Recipients. Journal of Infectious Diseases, 175: 179-184, 1997. RENTENAAR, R.J.; GAMADIA, L.E.; VAN DERHOEK, N.; VAN DIEPEN, F.N.; BOOM, R.; WEEL, J.F. Development of virus-specificCD4(+) T cells during primary cytomegalovirus infection. J Clin Invest 105(4):541-8, 2000. SEO, J.Y. & BRITT, W.J. Cytoplasmic Envelopment of Human Cytomegalovirus Requires the Postlocalization Function of Tegument Protein pp28 within the Assembly Compartment. J. Virol. 81, 6536-6547, 2007. SHEPP, D.H.; MATCH, M.E.; ASHRAF, A.B.; LIPSON, S.M.; MILLAN, C.; PERGOLIZZI, R.G. – Cytomegalovirus Glycoprotein B Groups Associated with Retinitis in AIDS. Journal of Infectious Diseases, 174: 184-187, 1996. SHEPP, D.H.; MATCH, M.E.; LIPSON, S.M.; PERGOLIZZI, R.G. – A Fifth Human Cytomegalovirus Glycoprotein B Genotype. Research in Virology, 149: 109-114, 1998. SIA, I.G. & PATEL, R. New strategies for prevention and therapy of cytomegalovirus infection and disease in solid-organ transplant recipients.Clinical Microbiology Reviews 13, 83-121, 2000. 60 Referências Bibliográficas STAGNO, S.; REYNOLDS, D.W.; PASS, R.F.; ALFORD, C.A. Breast milk and the risk of cytomegalovirus infection. The New England journal of medicine 302, 10731076, 1983. SULSTON, J.E. & WILSON,R. Toward a complete human genome sequence. Genome Res. 8 (11), 1097-1108,1998. TOROK-STORB, B.; BOECKH, M.; HOY, C.; LEISENRING, W.; MYERSON, D.; GOOLEY, T. – Association of Specific Cytomegalovirus Genotypes with Death from Myelosuppression after Marrow Transplantation. Blood, 90(5): 2097-2102, 1997. VARNUM S.M., STREBLOW D.N., MONROE M.E., SMITH P., AUBERRY K.J., PASA-TOLIC L., WANG D., CAMP D.G., RODLAND K., WILEY S., BRITT W., SHENK T., SMITH R.D., NELSON J.A. Identification of proteins in human cytomegalovirus (HCMV) particles: the HCMV proteome. J Virol 78:10960-66, 2004. VOGELBERG, C.; MEYER-KÖNIG, U.; HUFERT, F.T.; KIRSTE, G.; von LAER, D. Human Cytomegalovirus Glycoprotein B Genotypes in Renal Transplant Recipients. Journal of Medical Virology, 50: 31-34, 1996. YAMAMOTO, A.Y.; MUSSI-PINHATA, M.M.; DE DEUS WAGATSUMA, V.M.; MARIN, L.J.; DUARTE, G.; FIGUEIREDO, L.T. Human cytomegalovirus glycoprotein B genotypes in Brazilian mothers and their congenitally infected infants. J Med Virol.79(8):1164-8, 2007. YUN, Z.; LEWENSOHN-FUCHS, I.; LJUNGMAN, P.; RINGHOLM, L.; JONSSON, J.; ALBERT, J. – A Real-time Taq Man PCR for Routine Quantitation of Cytomegalovirus DNA in Crude Leukocyte Lysates from Stem Cell Transplant Patients. Journal of Virological Methods, 110: 73-79, 2003. ZEEVI, A.; SPICHTY, K.; BANAS, R.; MOREL, P.; IACONO, A.; DAUBER. J. Two types of CMV-specific memory responses in lung transplant recipients. Transplant Proc 31(1-2):173-4, 1999. ZHENG SS, ZHOU L, QIAN J, CAI T, FAN J, MA WH. Cytomegalovirus glycoprotein B sequence variation in Chinese liver transplant recipients. Hepatobiliary Pancreat Dis Int. 2001 Feb;1(1):26-9. 61 Referências Bibliográficas 62 Anexos Anexos Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – CEP/FAMERP Av. Brigadeiro Faria Lima, 5416 – Vila São Pedro – Fone/fax: 17 –32015813 São José do Rio Preto – SP TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU RESPONSÁVEL LEGAL Nome:.............................................................................................................................................. Documento de Identidade:............................................... Sexo:..................................................... Endereço:........................................................................................................................................ Bairro:............................................................ Cidade:..................................................................... CEP:.......................................... Telefone: DDD( ).................................................................. Responsável Legal:.......................................................................................................................... Natureza (grau de parentesco, tutor, curador etc.):....................................................................... Documento de Identidade:............................................... Sexo:..................................................... Endereço:........................................................................................................................................ Bairro:............................................................ Cidade:..................................................................... CEP:.......................................... Telefone: DDD( ).................................................................. DADOS SOBRE A PESQUISA Título do Protocolo de Pesquisa: Variabilidade genética no gene da glicoproteína B (gB) do Citomegalovírus Humano (HCMV) em amostras de sangue de pacientes submetidos a transplante renal Pesquisador responsável: Profª Dra Maria Cristina Carlan da Silva Cargo/Função: Professora Adjunta Inscrição Conselho Regional nº: Avaliação do risco da Pesquisa: Risco mínimo ..... Risco baixo ..... Risco médio ..... Risco maior ..... Duração da Pesquisa: 2 anos. 64 Anexos Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto – CEP/FAMERP Av. Brigadeiro Faria Lima, 5416 – Vila São Pedro – Fone/fax: 17 –32015813 São José do Rio Preto – SP DECLARAÇÃO Declaro para os devidos fins que: Tenho ciência dos termos da Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde e que cumprirei os mesmos; Que tornarei público os resultados do projeto de pesquisa (nome do projeto________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ________________________________________sejam eles favoráveis ou não; Que há infra-estrutura necessária para o desenvolvimento do referido projeto. São José do Rio Preto, de de 2012. ________________________ Responsável pelo projeto ________________________ Nome e Setor ________________________ Nome e Setor __________________________ Orientador __________________________ Nome e Setor ____________________________ Nome e Setor 65 Anexos Protocolo de Isolamento de DNA Lise das células 1. Para 300 l de amostra, pipetar 900 l de solução de lise de células. Misturar por inversão. 2. Incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. 3. Centrifugar: 13.000 – 16.000 x g por 20 segundos. 4. Descartar o sobrenadante e dar vortex no pellet. Lise do núcleo e precipitação de proteínas 5. Pipetar 300 l de solução de lise do núcleo ao pellet e misturar por inversão. 6. Adicionar 100 l de solução de precipitação de proteínas e dar vortex por 20 segundos. 7. Centrifugar: 13.000 – 16.000 x g por 3 minutos. Precipitação e reidratação do DNA 8. Transferir o sobrenadante para um novo tubo contendo 300 l de isopropanol. 9. Centrifugar: 13.000 – 16.000 x g por 1 minuto. 10. Descartar o sobrenadante e adicionar 300 l de etanol 70%. 11. Centrifugar: 13.000 – 16.000 x g por 3 minutos. 12. Aspirar o etanol e deixar secar por 15 minutos. 13. Adicionar 100 l de solução de reidratação e deixar por 1 hora a 65°C ou overnight a 4°C. 66 Anexos Protocolos das reações de semi-nested-PCR Reação de PCR - Glicoproteína B Data da reação: Reagente 10x PCR Buffer dNTPs 1,25 mM Volume/amostra Número de amostras l 11 5 55 8 88 Primer gB-1up 1,25 13,75 Primer gB-low 1,25 13,75 MgCl2 1,5 16,5 DMSO 1 11 Taq DNA-polimerase 0,5 5,5 Água ultra-pura 28,5 313,5 Total de MIX 47 517 DNA 3 Adicionar 3 l de DNA Programa: HCMVtouch Tamanho do fragmento esperado: 352 pb Reação de Nested-PCR - Glicoproteína B Data da reação: Reagente Volume/amostra Número de amostras l 12 10x PCR Buffer 5 60 dNTPs 1,25 mM 8 96 Primer gB-1up 1,25 15 Primer gB-2low 1,25 15 MgCl2 1,5 18 DMSO 1 12 Taq DNA-polimerase 0,5 6 Água ultra-pura 30,5 366 Total de MIX 49 588 DNA 1 Adicionar 1 l de DNA Programa: HCMV Tamanho do fragmento esperado: 316 pb 67 Anexos Protocolos dos ciclos de reações de semi-nested-PCR Ciclos: Programa HCM Vtouch Temperatura Tempo Número de Ciclos 94 °C 5 minutos 94 °C 30 segundos 59 °C 30 segundos 72 °C 45 segundos 94 °C 30 segundos 55,2 °C 30 segundos 72 °C 45 segundos 72 °C 10 minutos 5X 30X Extensão Final Ciclos: Programa HCM V Temperatura Tempo Número de Ciclos 94 °C 15 minutos 95 °C 30 segundos 55,2 °C 30 segundos 72 °C 45 segundos 40X Protocolos das reações de sequenciamento de DNA M ix pGEM 1 Reação Reagentes Reação BigDye 4 l BigDye 4 l Primer 0,8 mM 4 l Primer 3,2 mM 1 l pGEM 200 ng/ml 1 l DNA 5 l H2O 1 l H2O Total 10 l Total 10 l 68 Anexos Protocolo do ciclo da reação de sequenciamento de DNA Ciclos: Programa SEQ Temperatura Tempo 96 °C 10 segundos 50°C 5 segundos 60°C 4 minutos 10°C conservação N° de Ciclos 35 ciclos 69
