Rodrigo Cayô da Silva_Tese de Doutorado_Versão
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RODRIGO CAYÔ DA SILVA Dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp. isoladas no Brasil e na Espanha Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Doutor em Ciências. São Paulo 2012 RODRIGO CAYÔ DA SILVA Dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp. isoladas no Brasil e na Espanha Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo Escola Paulista de Medicina para obtenção do título de Doutor em Ciências. Orientadora: Profa. Dra. Ana Cristina Gales Disciplina de Infectologia - Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP. Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro fornecido pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). São Paulo 2012 ii DA SILVA, Rodrigo Cayô Dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp. isolados no Brasil e na Espanha. Rodrigo Cayô da Silva - São Paulo, 2012. xxvi, 239f. Tese (Doutorado) - Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia. Título em inglês: Dynamics of β-lactams resistance in clinical samples of Acinetobacter spp. isolated in Brazil and Spain. Key-words: Acinetobacter spp., β-lactâmicos, Brasil, Espanha, resistência aos antimicrobianos, biologia molecular, carbapenems. iii UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA Chefe do Departamento: Prof. Dr. Alvaro Nagib Atallah Coordenador do curso de Pós-graduação: Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz Chefe da Disciplina de Infectologia: Prof. Dr. Eduardo Alexandrino Servolo de Medeiros São Paulo 2012 iv RODRIGO CAYÔ DA SILVA Dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp. isoladas no Brasil e na Espanha BANCA EXAMINADORA: Presidente: Profa. Dra. Ana Cristina Gales Professora Adjunta e Diretora do Laboratório ALERTA da Disciplina de Infectologia do Departamento de Medicina da Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP. Titulares: Profa. Dra. Gertrudes Corção Professora Associada III do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Básicas da Saúde - ICBS e Vice-diretora do Instituto de Ciências Básicas da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS. Profa. Dra. Marina Baquerizo Martinez Professora Titular da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo USP e Diretora do Laboratório Clínico do Hospital Universitário da USP. Prof. Dr. Nilton Erbet Lincopan Huenuman Professor Doutor do Instituto de Ciências Biomédicas - ICB da Universidade de São Paulo USP. Prof. Dr. Alexandre Rodrigues Marra Médico Infectologista Pesquisador da Disciplina de Infectologia da Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP e Coordenador do Grupo de Suporte em Infecção do CTI-A do Hospital Israelita Albert Einstein - HIAE. Suplentes: Profa. Dra. Anna Sara Shafferman Levin Professora Associada do Departamento de Doenças Infecciosas e Parasitárias da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e Presidente da Comissão de Controle de Infecção Hospitalar do Hospital das Clínicas - HC-FMUSP. Prof. Dr. Afonso Luís Barth Professor Adjunto do Departamento de Análises da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Sul - UFRGS e Chefe do Serviço de Patologia Clínica do Hospital das Clínicas de Porto Alegre. v Embora ninguém possa voltar atrás e fazer um novo começo, qualquer um pode começar agora e fazer um novo fim. Francisco Cândido Xavier vi Dedico este trabalho aos meus amados pais, Evandro e Elizabeth, cujo amor incondicional me fizeram sentir especial e amado em todos os momentos da minha vida. Obrigado por terem me dado princípios e educação, e pelo incansável incentivo para que eu lutasse pelos meus sonhos. vii Agradeço as minhas queridas irmãs Cida, Cristina, Alessandra e Ana Paula (in memorian), pelo apoio e carinho constantes, e junto dos nossos pais me mostraram o verdadeiro significado da palavra família. viii Agradeço a DEUS, por dar sentido a minha vida, por ser a força em todos os momentos, e por estar sempre ao meu lado, mesmo quando não me lembro dele. ix AGRADECIMENTOS A minha orientadora Profa. Dra. Ana Cristina Gales pelo exemplo e determinação como profissional e microbiologista. Pelos ensinamentos constantes que permitiram a conclusão dessa tese. Pelo carinho e atenção que sempre teve comigo, por acreditar na minha capacidade e no meu trabalho, possibilitando a minha ida ao exterior para continuar os meus estudos. Por ter me confiado a supervisão do Laboratório ALERTA, permitindo o meu crescimento como microbiologista. Por ter me mostrado que é possível trabalhar com razão e sensibilidade. Muito obrigado por tudo. Sinto-me honrado por ter tido a sua orientação no meu doutorado. Ao Prof. Dr. Luis Mártinez Mártinez, meu tutor no estágio sanduíche, por ter me ensinado tanto, com muita atenção e paciência. Por ter me entregado um projeto tão pessoal, como foi o projeto das PBPs, e por ter confiado sempre no meu trabalho e na minha capacidade. Por ter feito eu me sentir parte do grupo durante os quase dois anos em que vivi na Espanha. Pelos valiosos conselhos que sempre levarei comigo ao longo da minha vida acadêmica. Fico muito feliz e honrado pela oportunidade de ter trabalhado com você. Além de tutor, sei que posso te chamar de amigo. Ao Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari por ter acreditado na minha capacidade, permitindo que começasse meu estagio no LEMC a muitos anos atrás. Por ter sido meu orientador no meu mestrado e por ter me incentivado a fazer meu doutorado sanduíche. Sei que sempre esteve torcendo pela minha vitória. Muito obrigado. Aos meus queridos amigos de Santander Jorge, Mapi, Javi, Pepe, Carmen e Liset por terem sido tão carinhosos e gentis comigo. Agradeço em especial a Jorge e a Mapi cujas palavras x dispensadas agora serão poucas para expressar toda a minha gratidão pelo tanto que me foi oferecido por vocês dois. Além de amigos, vocês dois são exemplos de que as dificuldades da vida são efêmeras quando se tem determinação e força de vontade. Fui tão feliz nos dois anos em que passei junto a vocês meus amigos, conheci lugares tão bonitos cujas lembranças desses momentos tão especiais estarão sempre comigo. Sei que não existe distancia, quando existe amizade verdadeira. Aos meus colegas do “Laboratorio de Investigación” do Hospital Universitário Marqués de Valdecilla - HUMV Belén Ruiz, Belén Campo, Fabián Unda, Alícia Marques, María Romo, Cristina Mirones, Elena Román, Patrícia Goicochea, Maria-Cruz Rodrigues e Alain Ocampo Sosa pela alegre e agradável companhia. A Maria-Cruz muito obrigado por todo o conhecimento transmitido que foram muito importantes no estudo das PBPs. Aprendi muito com você. A Belén Ruiz, cujo carisma e personalidade fizeram do nosso convívio tão alegre e descontraído. Ao querido grupo do “Cámara-café” pelos divertidos momentos que faziam nossas manhãs tão agradáveis. A todos os funcionários do “Servicio de Microbiología” do Hospital Universitário Marqués de Valdecilla - HUMV por terem me recebido tão bem, sempre com um sorriso no rosto para todas as minhas dúvidas. Em especial agradeço a todos os médicos e farmacêuticos microbiologistas responsáveis por cada seção do “Servicio de Microbiología”: Prof. Dr. Jesus Aguero Balbin, Dr. Jorge Calvo Montes, Dra. Maria Eliecer Cano Garcia, Dr. Carlos Fernandez Mazarrasa, Dra. Celia Garcia de la Fuente, Dra. Maria Asuncion Rodriguez Feijoo, Dra. Maria Pia Roiz Mesones, Dra. Ana Saez Lopez, Dr. Carlos Antonio Salas Venero, Dra. Maria Victoria San Juan Bilbao, Dra. Raquel Viar Diego, Dra. Maria Antonia Bernal Rubio, Dr. Ricardo Salesa Gutiérrez de Rozas e Dra. Begoña Perea; e também aos residentes: Carlos Ruiz de Alegria, xi Maitane Aranzamendi, Monica Gonzalo, Inmaculada Concepción Bernal, Omara Rivera e Laura Guzman. A todos os grupos de pesquisa na Espanha aos quais tive a oportunidade de trabalhar em conjunto para a conclusão de alguns dos trabalhos aqui apresentados: Prof. Dr. Jordí Vila do Hospital Clinic de Barcelona, Prof. Dr. Gérman Bou do Complejo Hospitalario Universitario A Coruña de La Coruña, Prof. Dr. Juan A. Ayala do Centro de Biología Molecular Severo Ochoa de Madrid, Prof. Dr. Álvaro Pascual e Prof. Dr. Felipe Fernández-Cuenca do Hospital Virgen Macarena de Sevilha e Dra. Lucrecia Yañez San Segundo e Dra. Maria Aranzazu Bermúdez Rodríguez do Servicio de Hematología do HUMV de Santander. Em especial agradeço a Paula Espinal e a María Merino. As minhas queridas amigas e colegas de laboratório Raquel Girardello e Cecilia Carvalhaes pelo apoio e incentivo diários. Muito obrigado pela força e companheirismo e principalmente pelos braços abertos com que me receberam na minha volta ao Brasil. A Raquel pela personalidade forte e decidida, sempre disposta a me ajudar nos meus experimentos e na supervisão do laboratório. A Cecilia pelo carinho e companheirismo e por ter sido pra mim o Brasil na Espanha. Aos meus queridos amigos Alinne Guimarães e André Doi pelos momentos tão alegres e descontraídos que passamos juntos e com quem sei que posso contar sempre. A Alinne por ser meu ombro amigo, sempre disposta a me escutar com um conselho de ânimo. Prezo muito a nossa amizade. Ao André pelo profissionalismo e pelos conselhos. Obrigado por serem meus amigos. xii As amigas Kelly Santiago e Fernanda Inoue pela amizade e pelos momentos diários compartilhados. Já faz tanto tempo que começamos juntos no LEMC, bons momentos e lembranças que certamente levaremos conosco. Obrigado pela força nos momentos de dificuldade. Quando se está longe da família os amigos se tornam uma segunda família. Aos pós-graduandos do Laboratório ALERTA Adriana Nicolletti, Adriana Pereira, Ana Carolina Ramos, Bruna Nonato, Danilo Xavier, Eloiza Campana, Eliete Frigatto, Fernanda Petrolini, Fernanda Rodrigues, Graziela Braun, Juliana Provasi, Lorena Fehlberg, Lucas Andrade, Lygia Schandert, Marina Visconde, Rafael Affini e Talita Barone pela agradável e divertida convivência, pelos conhecimentos divididos e as experiências compartilhadas. Obrigado por me aguentarem diariamente na supervisão do laboratório. Em especial agradeço as minhas co-orientandas Fernanda Petrolini, Fernanda Rodrigues, Juliana Provasi e Lygia Schandert, por me permitirem transmitir o pouco que sei e aprendi. Ao Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC, onde comecei e por quem tenho um enorme carinho e muitas boas lembranças. Em especial agradeço a Rosana Capecce pela ajuda, amizade e carinho constantes. Aos “meus” acinetos que foram meu objeto de estudo e cuja diversidade e complexidade taxonômica tornaram meus últimos quatro anos ocupados e felizes. xiii Sumário ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS .................................................................................. XVII ÍNDICE DE TABELAS................................................................................................................. XX ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................................ XXI RESUMO .................................................................................................................................. XXII ABSTRACT.............................................................................................................................. XXIV 1 - INTRODUÇÃO.......................................................................................................................... 1 2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................................... 5 2.1 - Agente Etiológico .............................................................................................................. 5 2.2 - Identificação das Espécies Pertencentes ao Gênero Acinetobacter ............................... 15 2.3 - Epidemiologia das Infecções por Acinetobacter spp. ...................................................... 21 2.4 - Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções por Acinetobacter spp. ............ 27 2.4.1 - Polimixinas ............................................................................................................... 27 2.4.2 - Tigeciclina ................................................................................................................ 29 2.4.3 - Ampicilina/Sulbactam ............................................................................................... 30 2.4.4 - Minociclina ............................................................................................................... 31 2.4.5 - Carbapenens ........................................................................................................... 32 2.5 - Mecanismos de Resistência aos β-Lactâmicos por Acinetobacter spp. .......................... 36 2.5.1 - Produção de β-Lactamases ..................................................................................... 38 2.5.2 - Impermeabilidade de Membrana Externa ................................................................ 50 2.5.3 - Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo ................................................................... 54 2.5.4 - Alteração das Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBPs) ....................................... 57 3 - APRESENTAÇÃO .................................................................................................................. 61 4 - ARTIGOS CIENTÍFICOS ........................................................................................................ 62 4.1 - Analysis of Genes Encoding for Penicillin-Binding Proteins in Clinical Isolates of Acinetobacter baumannii ......................................................................................................... 64 4.2 - OXA-207: a novel OXA-24 variant associated with carbapenem resistance in Acinetobacter pittii in Spain ..................................................................................................... 93 4.3 - Diversity of Emerging Acinetobacter Species in a Tertiary University Hospital in the North of Spain ................................................................................................................................. 119 xiv 4.4 - Bloodstream infection caused by Acinetobacter junii in a Patient with Acute Lymphoblastic Leukaemia after Allogenic Haematopoietic Cell Transplantation ................... 132 4.5 - Low Prevalence of blaOXA-143 in Private Hospitals in Brazil............................................. 143 4.6 - Temporal Dynamic of Carbapenemase-producing Acinetobacter spp. in a Brazilian Teaching Hospital Through an 18-Year Period: Earlier Dissemination of blaOXA-143 in Brazil. 148 4.7 - Detection of OXA-231, a new variant of blaOXA-143, in Acinetobacter baumannii from Brazil: a case report.......................................................................................................................... 162 5 - DISCUSSÃO......................................................................................................................... 170 6 - CONCLUSÕES..................................................................................................................... 193 7 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................................... 196 xv Índice de Abreviaturas e Siglas ABC - ATP-Binding Cassette ADC - Acinetobacter-Derived Cephalosporinases AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism AIM - Australian Imipenemase APACHE II - Acute Physiological and Chronic Health Evaluation II ARDRA - Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis ATCC - American Type Culture Collection C - Citosina CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior CDC - Centers for Disease Control and Prevention CIM - Concentração Inibitória Mínima CHDL - Carbapenem-Hydrolyzing Class D β-Lactamase CIP - Collection of l’Institut Pasteur CLSI - Clinical Laboratory Standards Institute CTX-M - Cefotaximase DBL - DBL numbering system DHP-1 - Deidropeptidase-1 DMT - Drug-Metabolite Transporter DNA - Ácido desoxirribonucleico EDTA - Ácido Etileno-Diamino-Tetracético ESAC - Extended-Spectrum AmpC βL - Extended Spectrum β-Lactamase ESβ EUA - Estados Unidos da América G - Guanina xvi GES - Guiana Extended Spectrum GIM - German Imipenemase HSP - Hospital São Paulo HUMV - Hospital Universitário Marqués de Valdecilla ICS - Infecção de Corrente Sanguínea IFIMAV - Instituto de Formación e Investigación Marqués de Valdecilla IJSEM - International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology IMI - Imipenem-hydrolysing β-Lactamase IMP - Imipenemase IS - Insertion Sequence KCTC - Korean Collection for Type Cultures KHM - Kyorin Hospital metalo-beta-lactamase KPC - Klebsiella pneumoniae Carbapenemase LEMC - Laboratório Especial de Microbiologia Clínica LPS - Lipopolissacarídeo LPSN - List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature MALDI-TOF MS - Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization - Time of Flight Mass Spectrometry MATE - Multidrug and Toxic Compound Extrusion Mβ βL - Metalo-β-Lactamase MDR - Multi-Drug Resistance MFS - Major Facilitator Superfamily MRSA - Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus NaCl - Cloreto de Sódio NMC-A - Nonmetallocarbapenamase of Class A xvii OMP - Outer Membrane Protein OXA - Oxacilinase PAβ βN - Phenyl-Arginine-β-Naphthylamide PBP - Penicillin-Binding Protein PCR - Polymerase Chain Reaction PDEE - Programa de Doutorado com Estágio no Exterior PER - Pseudomonas Extended Resistant PFGE - Pulsed Field Gel Electrophoresis PI - Ponto Isoelétrico qRT-PCR - Quantitative Real Time Polimerase Chain Reaction REIPI - Red Española de Investigación en Patología Infecciosa RND - Resistance-Nodulation-Division rRNA - RNA Ribossomal SBSV - Société de Bactériologie Systématique et Vétérinaire SCOPE - Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance SDS-PAGE - Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis SFC - Serratia fonticola carbapenemase SHV - Sulfhydryl-Variable β-Lactamase SIM - Seul Imipenemase SME - Serratia marcescens enzyme SMR - Small Multidrug Resistance SPM - São Paulo Metallo-β-Lactamase TEM - Temoniera β-Lactamase tRNA - RNA transportador UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo xviii UTI - Unidade de Terapia Intensiva VEB - Vietnamese Extended-Spectrum β-lactamase VIM - Verona Imipenemase xix Índice de Tabelas Tabela 1 - Nomenclatura atual, frequência, significância clínica e etimologia das 27 espécies de Acinetobacter spp. descritas e das 6 novas espécies propostas, mas ainda não validadas até o momento.................................................................................................................................................. 8 Tabela 2 - Genetic characterization of the 26 A. baumannii clinical isolates.......................................... 86 Tabela 3 - The penicillin-binding proteins (PBPs) of A. baumannii……………………………................. 87 Tabela 4 - Point mutations observed in the PBP genes in susceptible and resistant A. baumannii strains to carbapenems........................................................................................................................... 89 Tabela 5 - Point mutations observed in the PBP genes of the 10 A. baumannii genomes and the reference strain RUH-134........................................................................................................................ 91 Tabela 6 - MICs determined by broth microdilution for OXA-207-producing clinical isolate A. pittii HUMV-1588, recipient strain A. baylyi ADP1 with the plasmid alone, clone A. baylyi ADP1 harboring the plasmid pETRA with blaOXA-24, and clone A. baylyi ADP1 harboring the plasmid pETRA with blaOXA-207 are shown……………………………......................................................................................... 116 . Tabela 7 - Kinetic parameters of purified β-lactamases OXA-24 and OXA-207……….......................... 117 Tabela 8 - ARDRA profile, source of infection and CHDL content according to Acinetobacter species…………………………................................................................................................................. 128 Tabela 9 - Oligonucleotide primers used for amplification and sequencing of the carbapenemase coding genes ………………..………………………………........................................................................ 146 Tabela 10 - Frequency of carbapenemase-producing Acinetobacter spp. isolates in a Brazilian teaching hospital during an 18-year period............................................................................................. 148 xx Índice de Figuras Figura 01 - “Confusão” taxonômica que perdurou por mais de quatro décadas e atrasou o conhecimento da epidemiologia das espécies do gênero Acinetobacter .............................................. xxv Figura 02 - Martinus W. Beijerinck no seu laboratório em 12 de maio de 1921.................................... 05 Figura 03 - Comparação das estruturas química dos ácidos oliovânicos, tienamicina e dos carbapenens........................................................................................................................................... 34 Figura 04 - Estrutura da parede celular, mecanismos de resistências aos β-lactâmicos em Acinetobacter spp. e principais proteínas envolvidas........................................................................... 37 Figura 5 - Identification of the conserved motifs in the consensus sequences encoded by the HMM PBP genes of A. baumannii genomes used for the classification of PBPs, according to the work of Sauvage et al……………………………………………………………………………………………........... 92 Figura 6 - Alignment of the amino acid sequences of the OXA-24 and its variants (OXA-25, OXA-26, OXA-72, OXA-139, OXA-143, OXA-160, OXA-182 and OXA-207)....................................................... 118 . Figura 7 - Dendrogram of the 86 different Rep-PCR patterns obtained between the 603 A. calcoaceticus-baumannii complex isolates during the period of 2004 to 2008…................................... 127 Figura 8 - Distribution of the 86 Acinetobacter spp. isolates showing different Rep-PCR patterns according to ARDRA method……………………………………………………………………...…............. 130 Figura 9 - Distribution of the 603 Acinetobacter spp. isolates in the period of 2004 to 2008……….…. 131 xxi Resumo Durante mais de quatro décadas o gênero Acinetobacter sofreu com as constantes modificações na sua taxonomia o que atrasou o conhecimento da epidemiologia das espécies pertencentes a esse gênero. Atualmente o gênero Acinetobacter compreende 33 espécies descritas e mais 28 grupos genômicos aguardando uma posição taxonômica definitiva em relação a sua nomenclatura. Dentre essas espécies destacam-se o complexo A. calcoaceticus-baumannii devido a sua importância clínica, principalmente aquela que é um dos mais importantes patógenos da atualidade, A. baumannii. Devido a fenótipo de multirresistência apresentado pelos isolados de A. baumannii, os carbapenens são uma das poucas opções no limitado arsenal terapêutico para o tratamento de infecções causadas por esses micro-organismos. Entretanto, surtos causados por cepas de A. baumannii resistentes aos carbapenens tem se tornado um problema mundial. A erradicação das cepas de A. baumannii no ambiente hospitalar é difícil, pois uma vez que clones multirresistentes se estabelecem nesse nicho, eles se tornam endêmicos. Dentre os mecanismos de resistência aos carbapenens em A. baumannii, somente a produção de β-lactamases tem sido estudada com maior frequência. Embora se saiba que o principal grupo de carbapenemases produzidas por isolados de A. baumannii seja o grupo das oxacilinases, que hidrolisam fracamente os carbapenens, esse fato reforça a hipótese de que outros mecanismos poderiam estar contribuindo nesse fenótipo. Sendo assim, os artigos aqui apresentados buscaram avaliar a dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp. isoladas no Brasil e na Espanha. Artigo científico 1: Ainda é limitada as informações sobre o papel das proteínas ligadoras de penicilina (PBPs) na resistência aos βlactâmicos em Acinetobacter baumannii. Este estudo teve como objetivo determinar as sequências de nucleotídeos dos genes que codificam as PBPs em A. baumannii e analisar as variações alélicas nesses genes em isolados sensíveis ou resistentes aos β-lactâmicos. Sete genes de PBPs e um gene codificador de uma transglicosilase monofuncional (MGT) foram identificadas nos seis genomas de A. baumannii sequenciados, codificadores de (i) quatro proteínas de alto peso molecular (dois da classe A, PBP1a [ponA] e PBP1b [mrcB], e duas PBPs de classe B, PBP2 [pbpA/mrdA] e PBP3 [ftsI]), (ii) três PBPs de baixo peso molecular (sendo duas do Tipo-5, PBP5/6 [dacC] e PBP6b [dacD], e uma PBP do Tipo-7 (PBP7/8 [pbpG]), e (iii) uma enzima monofuncional (MtgA [mtgA]). Regiões de grandes variações foram observadas, embora a maior parte das alterações alélicas encontradas foram traduzidas em mutações silenciosas. As sequências de aminoácidos dos genes das PBPs nos genomas e nos isolados clínicos apresentaram ser altamente conservadas. As mutações encontradas nas sequencias de aminoácidos estavam mais associadas aos perfis clonais, do que diretamente relacionadas sensibilidade ou resistência aos β-lactâmicos. Artigo científico 2: Uma cepa de A. pittii resistente aos carbapenems carreando um nova variante do cluster OXA-24 foi isolada em Santander, localizada no norte da Espanha em 2008. O isolado também apresentava altos níveis de resistência à penicilina e aos monobactâmicos, e era sensível às cefalosporinas de amplo espectro. A análise da sequência de nucleotídeos confirmou a presença do gene blaOXA-207 codificador de uma nova carbapenemase, que apresenta uma mutação pontual Gly222Val em relação à OXA-24. Clonagem e análise da cinética enzimática mostrou que a OXA-207 apresenta uma redução na eficiência catalítica contra carbapenems, mas aumentou consideravelmente a especificidade para a oxacilina comparada com OXA-24, de acordo com os dados anteriores da função estrutural dessa. Artigo científico 3: Oitenta e seis isolados clínicos identificados pelo sistema MicroScan-WalkAway ® como complexo A. calcoaceticus-baumannii e coletados durante o período 2004-2008 em um hospital universitário e terciário, teve sua identificação confirmada por ARDRA. Apenas 44,2% dos isolados foram confirmados como sendo A. baumannii carreando 12 tipos diferentes de gene blaOXA-51-like. Foram também xxii identificados oito diferentes espécies não-baumannii, sendo A. pittii (41,8%) a espécie mais freqüente. Todos os isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens carreavam os genes blaOXA-24/40 ou blaOXA-51 associado a ISAba1. O gene blaOXA-58 foi encontrado em 19 dos 24 isolados de A. pittii pertencentes a um clone sensível aos carbapenems. Espécies emergentes de Acinetobacter foram identificadas em nosso hospital e sua incidência real pode ser subestimada pela identificação apenas por meio de sistemas automatizados. Artigo científico 4: Acinetobacter junii é um patógeno humano raro associado a bacteremia em recém-nascidos e pacientes de unidade de oncologia pediátrica. Apresentamos um caso de A. junii causando bacteremia em um paciente adulto transplantado com leucemia. A correta identificação de espécies de Acinetobacter pode esclarecer o real significado clínico das diferentes espécies deste gênero. Artigo científico 5: Uma alta prevalência de blaOXA-23 e uma baixa prevalência de blaOXA-143 foi encontrada entre os isolados de A. baumannii em hospitais privados brasileiros. A prevalência das CHDLs pode variar de acordo com o clone disseminado em um hospital ou em uma região geográfica específica e realçam a importância da aderência adequada às medidas de controle de infecção hospitalar. Assim, estudos de vigilância nacionais são necessários para analisar a prevalência real da CHDLs nos hospitais brasileiros. Artigo científico 6: O objetivo deste estudo foi avaliar a dinâmica temporal de carbapenemases em uma coleção de isolados de Acinetobacter spp coletados durante um período de 18 anos em um hospital brasileiro. Um total de 215 isolados apresentando altas taxas de resistência aos carbapenenens foi analisado no período de 1993 a 2010. A. baumannii foi responsável por 96,3% dos isolados. O gene blaOXA23 foi detectada em 36,7% (79/215) das amostras, seguido por blaOXA-143 (n=49, 22,7%), blaIMP-1 (n=24, 11,2%), blaIMP-10 (n=3, 1,4%) e blaOXA-72 (n=2, 0,9%). O primeiro isolado de A. baumannii carreando gene blaOXA-143 foi identificado em 1995, sete anos antes da introdução do clone de A. baumannii produtor de OXA-23 em 2002. Nós descrevemos pela primeira vez, a presença de IMP-1 em A. pittii e A. bereziniae, e a OXA-58 em A. genomic species "Close to 13TU". A OXA143 demonstrou ser uma enzima antiga em nosso hospital. A dinâmica da produção carbapenemase é complexa e varia drasticamente em função do tempo. Artigo científico 7: Este estudo relata a ocorrência da OXA-231, uma nova variante do cluster OXA-143, em uma cepa clínica de A. baumannii resistente aos carbapenens isolada em um hospital de terciário universitário localizado no Sul do Brasil. xxiii Abstract During four decades the genus Acinetobacter suffered with the constant changes in their taxonomy which delayed understanding of the epidemiology of the species belonging to that genus. Currently the genus Acinetobacter comprises 33 described species and 28 other genomic groups awaiting a definitive taxonomic position in relation to its nomenclature. Among these species highlights the A. calcoaceticus-baumannii complex due to its clinical importance, especially one that is one of the most important pathogens of nowadays, A. baumannii. Because of multidrug resistance phenotype displayed by isolates of A. baumannii, carbapenems are one of the few limited therapeutic options for the treatment of infections caused by these microorganisms. However, outbreaks caused by strains of A. baumannii resistant to carbapenems have become a global problem. The eradication of the A. baumannii strains from the hospital environment is difficult, because once multiresistant clones are established in this niche, they become endemic. Among the mechanisms of resistance to carbapenems in A. baumannii, only the production of β-lactamases has been studied most frequently. Although it is known that the main group of carbapenemases produced by A. baumannii isolates is the group of oxacilinases that weakly hydrolyze carbapenems, this fact reinforces the hypothesis that other mechanisms could be contributing in this phenotype. Thus, the articles presented here aimed to assess the dynamics of resistance to β-lactams in clinical samples of Acinetobacter spp. isolated in Brazil and Spain. Article 01: There is limited information on the role of penicillin-binding proteins (PBPs) in the resistance of Acinetobacter baumannii to β-lactams. This study aimed to determine the nucleotide sequences of the genes encoding for PBPs in A. baumannii and to analyze their allelic variations in isolates susceptible or resistant to β -lactams. Seven PBP genes and one monofunctional transglycosylase (MGT) gene were identified in the six genomes, encoding (i) four high molecular mass proteins (two of class A, PBP1a [ponA] and PBP1b [mrcB], and two of class B, PBP2 [pbpA/mrdA] and PBP3 [ftsI]), (ii) three low-molecular-mass proteins (two of Type5, PBP5/6 [dacC] and PBP6b [dacD], and one of Type-7 (PBP7/8 [pbpG]), and (iii) a monofunctional enzyme (MtgA [mtgA]). Hotspot mutation regions were observed, although most of the allelic changes found translated into silent mutations. The amino acid consensus sequences corresponding to the PBP genes in the genomes and the clinical isolates were highly conserved. The changes found in amino acid sequences were associated with concrete clonal patterns but were not directly related to susceptibility or resistance to β-lactams. Article 2: A carbapenem-resistant A. pittii strain carrying an OXA-24-like enzyme was isolated in Santander, Northern Spain in 2008. The isolate also exhibited high level resistance to penicillins and monobactams, and remained susceptible to expanded-spectrum cephalosporins. Sequence analysis confirmed the presence of the novel blaOXA-207 carbapenemase gene that presented a point Gly222Val substitution with respect to that of OXA-24. Cloning and kinetic analysis showed that OXA-207 presents a reduction in the catalytic efficiency against carbapenems and a noticeably increased in specificity for oxacillin compared with OXA-24, in agreement with the previous structural-function data of OXA-24. The mutation probably caused a misorientation of carbapenems to gain access to the active center of the OXA-enzyme. Article 3: Eighty six no repetitive clinical isolates identified by MicroScan-WalkAway® as A. calcoaceticus-baumannii complex collected during 2004-2008 period in a tertiary teaching hospital, had their identification confirmed by ARDRA. Only 44.2% of isolates was confirmed to be A. baumannii harboring 12 different blaOXA-51-like genes. Eight different non-baumannii species were also identified and A. pittii (41.8%) was the most frequent among them. All carbapenem-resistant A. baumannii isolates carried the blaOXA-24/40 or blaOXA-51-like-ISAba1 genes. The blaOXA-58 gene was found in 19 out of 24 isolates of a carbapenem-susceptible A. pittii clone. Emerging Acinetobacter species have been identified in our hospital and their actual incidence could be underestimated by using only xxiv automated identification systems. Article 4: Acinetobacter junii is a rare human pathogen associated with bacteraemia in neonates and paediatric oncology patients. We present a case of A. junii causing bacteraemia in an adult transplanted patient with leukaemia. The correct identification of Acinetobacter species can highlight the clinical significance of the different species of this genus. Article 5: A high prevalence of blaOXA-23 and a low prevalence of blaOXA-143 were found among A. baumannii isolates in private Brazilian hospitals. The prevalence of CHDLs may vary according to the disseminated clone in a specific hospital or region and emphasize the importance of appropriate adherence to infection control measures. Thus, wide national surveillance studies are necessary to analyze the real prevalence of CHDLs in Brazilian hospitals. Article 6: The aim of this study was to evaluate the temporal dynamic of carbapenemases in a collection of Acinetobacter spp. isolates collected during an 18 year-period in a Brazilian hospital. A 215 non-duplicate isolates showing high carbapenem resistance rates were analyzed from 1993 to 2010. A. baumannii was responsible for 96.3% of the isolates. The blaOXA-23 gene was detected in 36.7% (79/215) of the isolates, followed by blaOXA-143 (n=49, 22.7%), blaIMP-1 (n=24, 11.2%), blaIMP-10 (n=3, 1.4%) and blaOXA-72 (n=2, 0.9%). The first A. baumannii isolate carrying the blaOXA-143 gene was identified in 1995, seven years before the introduction of blaOXA-23 in 2002 and its widespread in the following 8 years of the study. We described for the first time the presence of IMP-1 in A. pittii and A. bereziniae, and OXA-58 in A. genomic species “Close to 13TU”. The OXA-143 is an ancient enzyme. The dynamic of carbapenemase production is complex and varied drastically according to time. Article 7: This study reports the occurrence of OXA-231, a novel variant of OXA-143, in an A. baumannii clinical isolate (Ac-141 strain) recovered from a tertiary teaching hospital located in Southern Brazil. xxv Figura 01 - “Confusão” taxonômica que perdurou por mais de quatro décadas e atrasou o conhecimento da epidemiologia das espécies do gênero Acinetobacter. Figura obtida do artigo de Ledermann (2007). xxvi Introdução 1 - Introdução Até o final da década de 80 pouco ou quase nada se sabia a respeito das espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter spp., e ainda não havia sido descrita aquela que viria a ser um dos mais importantes patógenos multirresistentes causadores de infecções nosocomiais da atualidade, A. baumannii (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996). Passados pouco mais de 30 anos, A. baumannii é um dos micro-organismos mais importantes, prevalentes e bem adaptados ao ambiente nosocomial (Higgins et al., 2010a). Isso se deve em parte, a sua incrível rapidez em adquirir ou desenvolver resistência aos antimicrobianos, aliada ao seu já amplo espectro de resistência intrínseca. Este fato é contrário à maioria das bactérias patogênicas tradicionais, que parecem necessitar de um tempo maior para adquirirem mecanismos de resistência efetivos em resposta à introdução de novas estratégias terapêuticas. Essa habilidade de adaptação verificada em A. baumannii talvez seja uma consequência da sua exposição evolucionária, por um longo período, na complexa e competitiva tarefa de manter-se no meio ambiente. Além disso, o uso indiscriminado de antimicrobianos nas últimas décadas pode também ter contribuído para o sucesso desse patógeno oportunista. Nas últimas décadas, surtos causados por isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens têm se tornado um problema mundial e infecções causadas por estes microorganismos estão associadas a uma maior morbi-mortalidade (Perez et al., 2007). Os últimos dados do programa SENTRY para a América Latina demonstram que a taxa de resistência aos carbapenens no Brasil aumentou de 12,6% entre 1997 a 1999 para 71,4% entre 2008 e 2010, um aumento de quase 60% em apenas uma década (Gales et al., 2012). Os dados gerais da América Latina também seguem essa mesma tendência, apresentando uma taxa de resistência aos carbapenens > 66% (Gales et al., 2012). 1 Introdução Quando se avalia as opções terapêuticas para o tratamento das infecções causadas por cepas de A. baumannii resistentes aos carbapenens, o panorama é estarrecedor (Neonakis et al., 2011). As polimixinas (B e E) geralmente constituem um dos únicos antimicrobianos clinicamente eficazes. Entretanto, os seus efeitos colaterais aliados aos escassos dados da sua farmacocinética e farmacodinâmica tem limitado o uso das polimixinas (Maragakis & Perl, 2008). A tigeciclina somente é aprovada para o uso em infecções de pele e partes moles, pneumonia comunitária e infecções intra-abdominais, restringindo o seu emprego terapêutico. Além disso, estudos clínicos tem demonstrado cautela quanto ao uso desse antimicrobiano para o tratamento de infecções causadas por A. baumannii, já que tem sido observado o surgimento de resistência durante o tratamento clínico (Fishbain & Peleg, 2010). Já o sulbactam, que no Brasil é comercializado na formulação ampicilina/sulbactam, é outra opção, mas com resultados discrepantes quanto a sua real eficácia terapêutica (Fishbain & Peleg, 2010; Neonakis et al., 2011). Embora a resistência aos carbapenens tenha aumentado a cada dia, e no Brasil os dados sejam alarmantes, variando drasticamente de acordo com a região geográfica, o uso desses antimicrobianos ainda é factível e importante, devido a sua boa tolerabilidade associado a efeitos adversos mínimos e pela sua excelente concentração na grande maioria dos tecidos (Nicolau, 2008). A produção de β-lactamases, principalmente as carbapenemases de classe D, é o mecanismo de resistência mais estudado em A. baumannii, talvez por ser o mais “fácil” de ser caracterizado, o que relegou os demais mecanismos a uma relativa obscuridade e esquecimento, principalmente no que concerne ao estudo das PBPs. Esse grupo de proteínas de membrana interna é alvo de todos os β-lactâmicos e um dos meios mais efetivos de aquisição de resistência bacteriana a estes antimicrobianos, principalmente em Gram positivos (Sauvage et al., 2008). Entretanto, assim como ocorre com outros bacilos Gram negativos de importância clínica, raros são os estudos que se dedicaram a estudar tais proteínas em A. baumannii. Talvez 2 Introdução o desinteresse em estudar esse grupo de proteínas esteja fundamentado na teoria de que o papel das PBPs na resistência aos β-lactâmicos em bacilos Gram negativos teria uma importância secundária frente aos demais mecanismos de resistência, uma vez que esses mecanismos atuariam em fases anteriores à ligação do β-lactâmico às PBPs. Apesar disso, os resultados obtidos indicam que a alteração ou modificação nas PBPs em A. baumannii pode estar relacionada à resistência aos carbapenens nesse micro-organismo (Gehrlein et al., 1991; Obara et al., 1991; Fernández-Cuenca et al., 2003; Russo et al., 2009; Cayô et al., 2011b; Yun et al., 2011). Ainda que a produção de carbapenemases de classe D seja o mecanismo mais prevalente em A. baumannii, essas enzimas hidrolisam fracamente os carbapenems e não apresentam atividade frente às cefalosporinas de amplo espectro (Poirel et al., 2010). Além disso, a grande maioria dos genes codificadores dessas β-lactamases necessita da presença de sequências de inserção, que trazem um promotor forte, para aumentar a expressão enzimática (Poirel et al., 2010). Tais observações somente aumentam a importância de outros mecanismos adjuvantes na elevação das concentrações inibitórias mínimas, não somente para os carbapenens, como também para os demais β-lactâmicos. Outro dado importante a ser enfatizado é que, de algum modo ao longo da sua escala evolutiva, A. baumannii desenvolveu, de maneira única, sequências de inserção em seu genoma de modo a reorganizar a expressão de diferentes genes conforme a sua necessidade e com menor custo energético (Vallenet et al., 2008). A presença de varias cópias nos genomas de A. baumannii sequenciados comprova a importância dessas sequências de inserção para sua adaptação e sobrevivência. A realidade de A. baumannii nos hospitais brasileiros e em diversas partes do mundo é alarmante e tende a agravar-se, uma vez que o desenvolvimento de novas opções terapêuticas não acompanha a rapidez e a evolução da resistência aos antimicrobianos expressa por esse micro-organismo. O conhecimento do papel das PBPs na resistência aos β-lactâmicos e como 3 Introdução funciona a interação entre esses compostos, poderia fornecer informações valiosas sobre possíveis novos alvos terapêuticos e minimizar o panorama preocupante verificado nos nossos isolados de A. baumannii. Sendo assim, os artigos aqui apresentados buscaram avaliar a dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp. isoladas no Brasil e na Espanha. Obviamente, a complexidade e abrangência da epidemiologia que envolve esses microorganismos não permitiu responder todas as perguntas propostas, e com certeza outras tantas surgiram a partir dos resultados obtidos. Mas com certeza fica a satisfação de ter contribuído, ainda que pouco, com a caracterização do fascinante gênero Acinetobacter. 4 Revisão Bibliográfica 2 - Revisão Bibliográfica 2.1 - Agente Etiológico Acinetobacter é uma palavra composta derivado das palavras gregas “ακινητο” ou “akineto” que significa não móvel e “bakter” de bactéria, e juntas significam bacilo não móvel (Howard et al., 2012). O gênero Acinetobacter tem uma longa e complicada história de mudanças quanto a sua taxonomia (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996; Towner, 2009). A história deste gênero bacteriano começou em 1911, na cidade holandesa de Delft, onde o microbiologista e botânico holandês Martinus Willem Beijerinck (16 de Março de 1851 a 1 de Janeiro de 1931) (Chung & Ferris, 1996), mostrado na Figura 1, isolou e descreveu em uma amostra de solo, usando meios Figura 02. Martinus W. Beijerinck no seu laboratório em 12 de maio de 1921. Foto obtida dos arquivos da Delft School of Microbiology. mínimos enriquecidos com acetato de cálcio (Beijerinck, 1911), o primeiro exemplar de um microorganismo que seria posteriormente chamado Acinetobacter (Towner, 2009; Howard et al., 2012). Desde então, os membros desse gênero foram classificados durante décadas com diferentes nomes, sendo alguns destes Mima polymorpha (De Bord, 1939), Bacterium anitratum (Schaub & Hauber, 1948), Moraxella lwoffii (Piéchaud et al., 1956) e Micrococcus calcoaceticus (Juni, 1978). A falta de um consenso e a confusão causada em decorrência disso resultou no atraso em se estabelecer a importância clínica e a epidemiologia desses micro-organismos (Towner, 2009). 5 Revisão Bibliográfica Originalmente descrito como Micrococcus calco-aceticus, o gênero Acinetobacter somente foi proposto depois de 43 anos por Brisou e Prevot em 1954, para diferenciá-lo dos organismos móveis dentro do gênero Achromobacter (Brisou & Prevot, 1954). Entretanto, essa denominação foi amplamente aceita somente em 1968, quando Baumann e colaboradores (1968) publicaram um estudo no qual avaliaram diferentes micro-organismos como Micrococcus calco-aceticus, Alcaligenes hemolysans, Mima polymorpha, Moraxella lwoffii, Herellea vaginicola e Bacterium anitratum (Baumann et al., 1968). Os autores concluíram que todos esses microorganismos pertenciam a um único gênero e não poderiam mais ser classificados como espécies diferentes com base apenas nas suas características fenotípicas (Baumann et al., 1968). Em 1971, o “Subcomitê de Taxonomia de Moraxella e Bactérias Relacionadas” oficialmente reconheceu o gênero Acinetobacter com base nos resultados do estudo de 1968 (Howard et al., 2012). Apesar disso, até 1986, apenas as espécies Acinetobacter calcoaceticus e Acinetobacter lwoffii haviam sido descritas como pertencentes a esse gênero (Bouvet & Grimont, 1986). Atualmente o gênero Acinetobacter é classificado no reino Bacteria, filo Proteobacteria, classe Gammaproteobacteria, ordem Pseudomonadales e família Moraxellaceae (Rossau et al., 1991; Vaneechoutte et al., 2011). Na mesma família ainda estão incluídos os gêneros Moraxella spp., Oligella spp. e Psychrobacter spp. (Rossau et al., 1991; Vaneechoutte et al., 2011). As espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter são cocobacilos Gram negativos, não fermentadores da glicose, estritamente aeróbicos, não fastidiosos, motilidade negativa, catalase positiva, oxidase negativa e com um conteúdo G + C no seu DNA variando de 39% a 47% (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996; Vaneechoutte et al., 2011; Howard et al., 2012). Pelo menos quatro espécies podem apresentar hemólise em ágar sangue: A. beijerinckii, A. gyllenbergii, A. junii (positivo para 11 a 89% dos isolados) e A. haemolyticus (Vaneechoutte et al., 2011). No teste de Gram, frequentemente esses micro-organismos podem apresentar dificuldade na etapa de descoloração, podendo, portanto, serem identificados erroneamente como Gram positivos e 6 Revisão Bibliográfica na maioria das vezes como cocos Gram lábeis (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996; Vaneechoutte et al., 2011; Howard et al., 2012). Até o momento, foram descritas 27 espécies reconhecidas e validadas e mais seis espécies propostas, mas ainda não reconhecidas pela comunidade internacional, como mostrado na Tabela 01. 7 Revisão Bibliográfica Tabela 1. Nomenclatura atual, frequência, significância clínica e etimologia das 27 espécies de Acinetobacter spp. descritas e das 6 novas espécies propostas, mas ainda não validadas até o momento.a Dados Clínicos Designação Atual Designação Prévia A. calcoaceticus A. genoespécie 1, Micrococcus calcoaceticus, Moraxella calcoacetica + 3 A. baumannii A. genoespécie 2, Bacterium anitratum ++++ A. pittii A. genoespécie 3, Herellea vaginicola +++ Cepa Referência Local de Isolamento Etimologia Referência ATCC 23055 solo, humanos O nome calcoaceticus se refere ao meio usado por Beijeirink em 1911 enriquecido com acetato de cálcio para o cultivo do primeiro isolado de Acinetobacter spp. Bouvet & Grimont, 1986 1 ATCC 19606 humanos, animais Homenagem a Paul e Linda Baumann, microbiologistas americanos Bouvet & Grimont, 1986 1 ATCC 19004 humanos, solo e vegetais Homenagem a Tyrone Pitt, médico microbiologista britânico Nemec et al., 2011 Nemec et al., 2011 Frequência Significância A. nosocomialis A. genoespécie 13TU, Acinetobacter anitratus +++ 1 RUH 2376 humanos O nome nosocomialis deriva do latim nosocomium que significa hospital/enfermaria e do sufixo -alis usado com sentido de pertencente ao hospital A. haemolyticus A. genoespécie 4, Achromobacter haemolyticus + 3 ATCC 17906 humanos O nome haemolyticus vem do latim haima que significa sangue e lutikos que significa capaz de dissolver Bouvet & Grimont, 1986 A. juniib A. genoespécie 5, Achromobacter citrocaligenes ++ 2 ATCC 17908 humanos, lodo Homenagem a Elliot Juni, microbiologista americano Bouvet & Grimont, 1986 8 Revisão Bibliográfica A. genoespécie 7, Achromobacter metalcaligenes + 3 ATCC 17909 humanos, animais Homenagem a John L. Johnson, médico americano Bouvet & Grimont, 1986 A. lwoffii A. genoespécie 8/8TU, Moraxella lwoffii ++ 2 ATCC 15309 humanos, animais Homenagem a André Michael Lwoff, microbiologista francês Bouvet & Grimont, 1986 A. bereziniae A. genoespécie 10, Achromobacter anitrata ++ 2 ATCC 17924 humanos, animais, esgoto Homenagem a Eugénie BergogneBérézin, médica microbiologista francesa Nemec et al., 2010 A. guillouiae A. genoespécie 11 A. johnsonii ++ 2 ATCC 11171 humanos, leite, água, Homenagem a Marie-Laure Joly-Guillou, solo, esgoto, lodo microbiologista francesa ativado Nemec et al., 2010 A. genoespécie 12 + 3 ATCC 43998 humanos, solo, algodão O nome radioresistens deriva do latim radius que significa raio e do latim resistens que significa resistente (resistente ao raio), se referindo à alta resistência aos raios gama verificada nesta espécie A. ursingiic NA + 3 LUH 3792 humanos Homenagem a Jan Ursing, bacteriologista e taxonomista sueco Nemec et al., 2001 A. schindleri NA + 3 LUH 5832 humanos Homenagem a Jiri Schindler, microbiologista e taxonomista checo Nemec et al., 2001 A. radioresistens Nishimura et al., 1988 9 Revisão Bibliográfica A. parvus A. baylyi NA NA + - 3 4 humanos, animais O nome parvus significa em latim pequeno, se referindo ao tamanho diminuto da colônia em meio de cultura comparado as demais espécies do gênero Acinetobacter spp. Nemec et al., 2003 CIP 107474 solo Homenagem a Ronald Bayly, microbiologista australiano que contribuiu com o conhecimento da fisiologia do gênero Acinetobacter spp. Carr et al., 2003 Homenagem a Jean Brisou, microbiologista francês que contribuiu com o conhecimento da taxonomia do gênero Acinetobacter spp. Anandlham et al., 2011 LUH 4616 A. brisouii NA - 4 DSM 18516 turfa (material vegetal decomposto em pântanos) A. rudis NA - 4 DSM 24031 leite, água O nome rudis em latim significa cru (isolado de produtos não processados) Vaz-Moreira et al., 2011 A. soli NA - 4 B1 Solo, humanos O nome soli que em latim significa solo Kim et al., 2009 A. indicus NA - 4 DSM 25388T Hexaclorociclohexano – HCH (lixão) O nome indicus se refere ao país de isolamento, Índia Mallotra et al., 2012 10 Revisão Bibliográfica A. antiviralisd A. bouvetii A. towneri A. tandoii A. tjernbergiae A. gerneri NA NA NA NA NA NA - - - - - - 4 4 4 4 4 4 KCTC 0699BP CIP 107468 CIP 107472 CIP 107469 CIP 107465 CIP 107464 planta do tabaco O nome antiviralis que deriva do grego anti que siginifica contra e do latim viralis que siginifca pertecente ao virus (antiviral) Lee et al., 2009 lodo Homenagem a Philippe Bouvet, microbiologista francês que contribuiu com o conhecimento da taxonomia do gênero Acinetobacter spp. Carr et al., 2003 lodo Homenagem a Kevin Towner, microbiologista britânico que contribuiu com o conhecimento da genética do gênero Acinetobacter spp. Carr et al., 2003 lodo Homenagem a Valter Tandoi, bacteriologista italiano que contribuiu com o conhecimento de Acinetobacter em lodo Carr et al., 2003 lodo Homenagem a Ingela Tjernberg, microbiologista e taxonomista sueca que contribuiu com o conhecimento da genética do gênero Acinetobacter spp. Carr et al., 2003 lodo Homenagem a Peter Gerner-Smidt, microbiologista dinamarquês que contribuiu com o conhecimento da taxonomia do gênero Acinetobacter spp. Carr et al., 2003 11 Revisão Bibliográfica A. beijerinckii NA + 3 LUH 4759 humanos, animais, solo e água Homenagem a Martinus Beijeirink, microbiologista holandês que descreveu o primeiro isolado Nemec et al., 2009 A. gyllenbergii NA + 3 RUH 422 humanos Homenagem a Helge G. Gyllenberg, bacteriologista e taxonomista finlandês Nemec et al., 2009 Vaneechoutte et al., 2008 A. venetianus NA - 4 ATCC 31011 água do mar O nome venetianus vem da palavra venetian que significa veneziano (uma das cepas foi isolada da lagoa de Veneza no Mar Adriático) A. marinusd NA - 4 DSM 16312T água do mar O nome marinus que em latim significa marinho (do oceano) Yoon et al., 2007 A. seohaensisd NA - 4 DSM 16313T água do mar O nome seohaensis deriva do nome Seohae, nome coreano do Mar Amarelo, onde foi isolada a espécie Yoon et al., 2007 A.oryzaed NA - 4 B23 arroz O nome oryzae que em latim siginifca arroz, onde foi isolada a primeira cepa Chaudhary et al., 2012 Kang et al., 2011 Lee & Lee, 2010 oleivoransd NA - 4 KCTC 23045 arroz O nome oleivorans deriva do latim oleum que significa óleo e do latim vorans que siginifica que devora (aquele que devora óleo/hidrocarboneto) A. kyonggiensisd NA - 4 JCM 17071 esgoto O nome kyonggiensis se refere a Kyonggi University A. 12 Revisão Bibliográfica a. Abreviações e símbolos: NA - não se aplica; (++++) muito frequente; (+++) frequente; (++) ocasionalmente; (+) raro; (-) nunca foi isolado em humanos; (1) principal espécie patogênica ao homem; (2) raros casos de doença comprovada; (3) isolado de humanos, significância desconhecida; (4) não são espécies patogênicas; ATCC - American Type Culture Collection, Rockville, Md, USA; CIP - Collection de l’Institut Pasteur, Institut Pasteur, Paris, França; LUH e RUH - Collection Leiden University Medical Center, Leiden, Holanda; KCTC - Korean Collection for Type Cultures, Daejeon, Coréia do Sul; DSM - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen; b. Recentemente foi demonstrado que Acinetobacter grimontii (Carr et al., 2003) na verdade se trata de Acinetobacter junii (Vaneechoutte et al., 2008). c. Acinetobacter septicus que inicialmente foi descrita como sendo uma nova espécie (Kilic et al., 2008), teve sua classificação contestada pelo principal grupo de taxonomia de Acinetobacter na atualidade (Nemec et al., 2008), que propuseram que estes isolados fossem considerados como sendo Acinetobacter ursingii; d. Novas espécies de Acinetobacter propostas, mas que ainda não foram validadas pela “List of new names and new combinations previously effectively, but not validly, published” publicada periodicamente pelo “International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology - IJSEM” (anteriormente chamado International Journal of Systematic Bacteriology) (http://ijs.sgmjournals.org/) e, consequentemente, não foram ainda incluídas na “List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature - LPSN” para o gênero Acinetobacter (http://www.bacterio.cict.fr/a/acinetobacter.html) do Professor Jean Paul Marie Euzéby da “Société de Bactériologie Systématique et Vétérinaire (SBSV)” - França (Euzéby, 1997). . 13 Revisão Bibliográfica Outros 28 grupos genômicos ou genoespécies, que assim são classificados por compreenderem diversas cepas em cada grupo, ainda aguardam uma posição taxonômica definitiva em relação a sua nomenclatura (Towner, 2009). Dentre esses, encontram-se as seguintes genoespécies mais conhecidas: A. genoespécie 6 - previamente Moraxella glucidolytica (Bouvet & Grimont, 1986), A. genoespécie 13BJ/14TU (Bouvet & Jeanjean, 1989; Tjernberg & Ursing, 1989), A. genoespécie 14BJ (Bouvet & Jeanjean, 1989), A. genoespécie 15BJ (Bouvet & Jeanjean, 1989), A. genoespécie 16 - previamente Alcaligenes haemolyticus (Bouvet & Jeanjean, 1989), A. genoespécie 17 (Bouvet & Jeanjean, 1989) e A. genoespécie 15TU (Tjernberg & Ursing, 1989). Recentemente, quatro genoespécies de importância clínica tiveram a sua nomeclatura definida e validada, sendo classificadas em A. pittii (A. genoespécie 3), A. nosocomialis (A. genoespécie 13TU), A. bereziniae (A. genoespécie 10) e A. guillouiae (A. genoespécie 11) (Nemec et al., 2010; Nemec et al., 2011), como mostrado na Tabela 01. Além disso, ainda existem pelo menos 21 cepas de Acinetobacter spp. que não foram incluídas em nenhuma espécie ou genoespécie descritas até o momento (Towner, 2009), tornando ainda mais diverso e complexo esse grupo de micro-organismos. Dentre as espécies do gênero Acinetobacter, A. calcoaceticus, A. baumannii, A. pittii e A. nosocomialis apresentam características fenotípicas muito similares, e por isso, foi proposto que tais espécies fossem referidas como um único grupo em 1991, o chamado “complexo A. calcoaceticus-baumannii” (Gerner-Smidt et al., 1991). Esta classificação foi defendida como forma de facilitar e simplificar a identificação desses micro-organismos, aliada à necessidade “questionável” de uma identificação mais criteriosa pelos laboratórios de rotina em microbiologia das diferentes espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter. Desde então, tais espécies tem sido referenciadas pelos laboratórios de rotina e por muitos estudos epidemiológicos publicados em todo o mundo pelo nome “genérico” (Lin et al., 1998; l-Tawfiq & Al-Tawfiq & Mohandhas, 2007; Park et al., 2012). A praticidade do uso do termo “complexo A. calcoaceticus-baumannii” é 14 Revisão Bibliográfica inegável, uma vez que a diferenciação precisa desses micro-organismos por provas bioquímicas (Bouvet & Grimont, 1986) é difícil e trabalhosa, o que a torna inviável na rotina laboratorial, o mesmo não se justifica nas publicações médicas-científicas. Sendo assim, cabe aos relatos de infecções causadas pelos membros do complexo A. calcoaceticus-baumannii, a responsabilidade em descrever e caracterizar as demais espécies do complexo (Towner, 2009), sempre que essas forem identificadas, já que as mesmas acabam sendo ofuscadas pela espécie mais importante e prevalente do grupo, A. baumannii. A partir dessas informações será possível uma melhor compreensão a respeito da epidemiologia desses micro-organismos como patógenos hospitalares. 2.2 - Identificação das Espécies Pertencentes ao Gênero Acinetobacter Devido à complexidade e heterogeneidade das espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter, nenhum esquema de identificação foi ainda proposto que incorpore tanto a praticidade e a confiabilidade exigida pela rotina laboratorial, como a abrangência que se espera para um grupo tão dinâmico (Dijkshoorn & Nemec, 2008). Sendo assim, a diferenciação das espécies dentro do gênero Acinetobacter acaba sendo frequentemente problemática (Nowak & Kur, 1996). Esse fator limitante é um sério obstáculo no conhecimento sobre a biologia, patogenicidade ou ecologia dessas espécies por parte dos microbiologistas e clínicos. Uma identificação incorreta pode ter, muitas vezes, consequências diretas no diagnóstico, tratamento e controle de infecções causadas por esses micro-organismos. Até o momento poucos métodos foram validados para uma identificação eficaz da maioria das espécies, genoespécies e demais cepas sem classificação pertencentes ao gênero Acinetobacter e, apesar dos avanços na identificação rápida de bactérias com base na sequência de DNA, a técnica de hibridização DNA-DNA ainda é considerada a técnica padrãoouro para avaliar taxonomicamente esses micro-organismos (Dijkshoorn & Nemec, 2008). Nessa 15 Revisão Bibliográfica metodologia, genomas inteiros são comparados, e a semelhança é estimada através da percentagem de ligação relativa ou pelas diferenças na estabilidade térmica dos híbridos. Embora a técnica de hibridização DNA-DNA tenha um grande valor na taxonomia bacteriana, por exemplo, a classificação taxonômica atual de Acinetobacter é baseada principalmente na similaridade DNA-DNA, esta técnica também apresenta desvantagens (Dijkshoorn & Nemec, 2008). Primeiramente, diferentes resultados podem ser obtidos (Grimont et al., 1980), quando se utiliza um dos cinco diferentes protocolos descritos para o gênero Acinetobacter (Bouvet & Grimont, 1986; Tjernberg & Ursing, 1989; Nemec et al., 2001; Carr et al., 2003; Nemec et al., 2003). Outra desvantagem é o fato da hibridização DNA-DNA ser muito laboriosa e exigir mão de obra altamente qualificada, sendo, portanto, realizada somente em um número restrito de laboratórios de taxonomia bacteriana (Dijkshoorn & Nemec, 2008). Idealmente, para se avaliar uma nova espécie de um determinado gênero, o DNA da mesma deve ser comparado aos DNAs de todas as espécies pertencente àquele gênero específico. Os representantes das novas espécies têm de ser hibridados reciprocamente aos pares. Devido as dificuldades da técnica de hibridização DNA-DNA, as novas linhagens somente foram testadas para essa metodologia após terem apresentado uma similaridade interespécie maior que 97% para o gene 16S rDNA (Stackebrandt & Goebel, 1994). Recentemente, essa regra foi alterada, mudando o ponto de corte para uma faixa de similaridade de 98,7% a 99% (Stackebrandt & Evers, 2002). Embora a hibridização DNA-DNA seja um método crucial para a classificação atual das espécies dentro do gênero Acinetobacter, devido à sua complexidade metodológica e do grande número de grupos de hibridização dentro do gênero, essa metodologia dificilmente pode ser considerada como uma opção para o delineamento de novas espécies adicionais, e muito menos como um método para identificação de espécies (Stackebrandt et al., 2002). 16 Revisão Bibliográfica Embora vários estudos tenham objetivado a criação de esquemas de identificação confiáveis baseados na homologia de DNA (Ibrahim et al., 1997; Rainey et al., 1994), nas características fenotípicas (Gerner-Smidt et al., 1991), no perfil de proteínas da membrana externa (Ino & Nishimura, 1989) e na comparação do envelope celular (Alexander et al., 1984), todos estes métodos produziram resultados inconsistentes. Inicialmente, Bouvet e Grimont (1986) propuseram um sistema de 25 provas bioquímicas para identificar as primeiras 12 genoespécies descritas. Posteriormente, esse sistema foi melhorado através da inclusão de novas genoespécies, todos previamente identificados e confirmados pela técnica de hibridização DNA-DNA (Gerner-Smidt et al., 1991). Infelizmente, mesmo este sistema não é capaz de separar as espécies estreitamente relacionadas do complexo A. calcoaceticus-baumannii (Gerner-Smidt et al., 1991). As características fenotípicas expressas pelas diferentes espécies de Acinetobacter spp. são influenciadas pelas condições nas quais elas são cultivadas (Gerner-Smidt et al., 1991). Isso se deve ao fato de que os membros desse gênero apresentam uma grande quantidade de genes dedicados às vias catabólicas conhecida como “arquipélago de diversidade catabólica” que leva à adaptação à maioria dos substratos (Barbe et al., 2004). Desse modo, o uso de auxanogramas, bateria de provas bioquímicas que tem como princípio a assimilação de fonte de carbono e nitrogênio, tem uma utilidade limitada na diferenciação das espécies de Acinetobacter spp. (La Scola et al., 2006). Embora, o padrão ouro para a identificação da grande maioria das espécies bacterianas tem sido o sequenciamento do gene codificador da porção 16S do rRNA, tal metodologia também não é confiável para a identificação de Acinetobacter spp., devido a baixa natureza polimórfica verificada nesse gene entre as genoespécies estreitamente relacionadas dentro do gênero Acinetobacter (Ibrahim et al., 1997; La Scola et al., 2006). Devido a isso, identificações errôneas podem ocorrer, como descrito por La Scola e colaboradores (2001) onde isolados de A. baumannii foram identificados como A. calcoaceticus usando o gene 16S rRNA (La Scola et al., 17 Revisão Bibliográfica 2006). Um teste alternativo ao sequenciamento do gene 16S rRNA, seria a amplificação do mesmo gene pela reação em cadeia da polimerase - PCR (~1.500 bp) seguida da restrição com cinco diferentes enzimas de restrição (CfoI, AluI, MboI, RsaI e MspI), sendo conhecido como “Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis” - ARDRA (Vaneechoutte et al., 1995). Este teste tem a vantagem de substituir o sequenciamento do gene 16S rRNA, apresentando os mesmos resultados e de maneira mais rápida. Embora os resultados sejam na maioria das vezes confiáveis, é recomendado a confirmação do resultado através do sequenciamento de outros genes (Yamamoto et al., 1999; Krawczyk et al., 2002; La Scola et al., 2006), principalmente quando espécies poucos frequentes são encontradas. Além disso, algumas das novas espécies descritas ainda não têm o seu perfil de ARDRA conhecido, dificultando a sua comparação. As dificuldades enfrentadas pelos microbiologistas na diferenciação e identificação das diferentes espécies do gênero Acinetobacter usando as metodologias convencionais tanto fenotípicas como moleculares, fizeram necessário a busca por novos genes candidatos à identificação. Dois alvos foram propostos apresetando resultados significativos, sendo estes o gene recA, codificador da recombinase A (Krawczyk et al., 2002), e o gene gyrB, codificador da subunidade β da DNA girase (Yamamoto et al., 1999). Apesar dos resultados animadores, esses dois alvos ainda carecem de um fator limitante quanto à descrição das sequências de nucleotídeos obtidas de cepas referências para as novas espécies de Acinetobacter descritas recentemente e depositadas no GenBank (La Scola et al., 2006). Vários estudos têm demonstrado o uso do gene rpoB, codificador da porção β da RNA polimerase, como sendo uma excelente ferramenta para a diferenciação e classificação taxonômica de espécies pertencentes a gêneros cuja identificação é impossível ou inviável pelos métodos convencionais (Drancourt & Raoult, 2002; Khamis et al., 2004). Sendo assim, La Scola e colaboradores (2006) investigaram a aplicabilidade desse gene para a identificação e diferenciação de 24 espécies e genoespécies diferentes de Acinetobacter. Os autores 18 Revisão Bibliográfica encontraram quatro regiões altamente variáveis, incluindo duas zonas polimórficas internas ao gene rpoB (zona 1, 350 bp e zona 2, 450 bp) e duas regiões intergênicas, cujos tamanhos variam na primeira região de 301 bp a 310 bp e na segunda região de 86 bp a 177 bp (La Scola et al., 2006). Tais regiões demonstraram ser um esquema factível e confiável para a identificação das espécies de Acinetobacter, sendo atualmente aceita e recomendada como prova confirmatória de espécie. Apesar disso, o pesadelo ainda continua para alguns raros isolados de A. baumannii e entre as espécies A. grimontii/A. junii e A. baylyi, como descrito pelos próprios autores (La Scola et al., 2006). Posteriormente, o mesmo grupo publicou um estudo validando a técnica, incluindo um maior número de isolados e espécies de Acinetobacter spp. (Gundi et al., 2009). Além dessas metodologias, outras também foram propostas com o intuito de facilitar a identificação das espécies de Acinetobacter spp., como por exemplo: análise do polimorfismo de comprimento de fragmentos - AFLP (Janssen et al., 1996; Nemec et al., 2001), ribotipagem (Gerner-Smidt et al., 1991), sequenciamento das regiões espaçadoras intergênicas da porção 16S-23S ribossomal (Chang et al., 2005), análise de restrição das regiões espaçadoras intergênicas da porção 16S-23S ribossomal (Dolzani et al., 1995), análise dos perfis das proteínas do envelope celular (Dijkshoorn et al., 1987; Dijkshoorn et al., 1990) e análise de anticorpos monoclonais para antígeno O (Pantophlet et al., 2002). Embora, muitas das metodologias anteriormente referenciadas apresentem resultados promissores, muitas delas não conseguem diferenciar as quatro espécies do complexo A. calcoaceticus-baumannii, exatamente as mais prevalentes no ambiente nosocomial, ou somente identificam as mesmas (Dijkshoorn et al., 1987; Dolzani et al., 1995; Chang et al., 2005), mas não as demais espécies/genoespécies do gênero. Além disso, as poucas metodologias que abrangem o maior número possível de espécies e genoespécies não são aplicáveis à rotina laboratorial, devido ao custo elevado (Gerner-Smidt et al., 1991; Yamamoto et al., 1999; Krawczyk et al., 2002; Chang et al., 2005; La 19 Revisão Bibliográfica Scola et al., 2006) e/ou por serem muito laboriosas (Dijkshoorn et al., 1987; Ino & Nishimura, 1989; Dijkshoorn et al., 1990; Dolzani et al., 1995; Vaneechoutte et al., 1995; Janssen et al., 1996; Nemec et al., 2001; Pantophlet et al., 2002). Na tentativa de solucionar esse impasse, estudos tem tentado aplicar, aquela que talvez seja a grande inovação na detecção de patógenos de importância clínica, a técnica de ionização e dessorção a laser assistida por matriz - tempo de voo (MALDI-TOF MS, do inglês “matrix assisted laser desorption/ionization - time of flight mass spectrometry”) na diferenciação das espécies do gênero Acinetobacter spp. (Espinal et al., 2011; Alvarez-Buylla et al., 2012; Kempf et al., 2012). A técnica de MALDI-TOF MS inova pela rapidez, acurácia e baixo custo na liberação dos resultados e por apresentar excelentes resultados mesmo para gêneros de difícil diferenciação na rotina laboratorial (Seng et al., 2009). Sendo assim, a técnica de MALDI-TOF MS mostrou-se uma excelente ferramenta para a detecção de A. baumannii (Kempf et al., 2012a) e na diferenciação das demais espécies do complexo A. calcoaceticus-baumannii, desde que seja incluída no banco de dados do aparelho os espectros proteicos de A. nosocomialis (Espinal et al., 2011). Entretanto, mesmo o MALDI-TOF MS não foi capaz de diferenciar as demais espécies do gênero (Alvarez-Buylla et al., 2012). Devido a todos os problemas aqui expostos referentes não somente a complexidade taxonômica dentre do gênero Acinetobacter, como também em escolher qual a melhor metodologia a ser usada para identificar as espécies pertencentes a esse gênero, proponho o esquema a seguir a ser usado pela rotina laboratorial de microbiologia: primeiramente seria a implementação da técnica de (i) MALDI-TOF MS (Espinal et al., 2011), uma vez que essa metodologia identifica as três espécies mais prevalentes; quando o MALDI-TOF MS liberasse resultados inconclusivos quanto a espécie, (ii) o sequenciamento do gene rpoB deveria ser utilizado (La Scola et al., 2006; Gundi et al., 2009). Na impossibilidade em sequenciar o gene rpoB, (iii) a técnica de ARDRA deveria ser utilizada (Vaneechoutte et al., 1995). 20 Revisão Bibliográfica 2.3 - Epidemiologia das Infecções por Acinetobacter spp. Em geral, bactérias Gram negativas não toleram a dessecação tão bem quando comparadas as bactérias Gram positivas e, a ocorrência daquelas na pele é normalmente confinado a áreas úmidas (Hanlon, 2005). Entretanto, relatos demonstraram que isolados de Acinetobacter spp. possuem capacidade de sobreviver durante longos períodos em superfícies abióticas e persistem como contaminantes da pele humana (Seifert et al. 1997; Wendt et al., 1997; Jawad et al., 1998). Inclusive, um estudo comprovou que A. calcoaceticus consegue sobreviver até 13 dias em superfícies secas, ao contrário de outras bactérias Gram negativas, que somente conseguiram permanecer viáveis por apenas três dias (Getchell-White et al., 1989). Devido a essa capacidade, as espécies do gênero Acinetobacter têm demonstrado ser uma das bactérias Gram negativas mais frequentemente envolvidas na contaminação das mãos dos profissionais de saúde (Guenthner et al., 1987). Sendo assim, não é surpresa que diferentes espécies de Acinetobacter spp. tenham sido encontradas na pele de pelo menos um quarto dos indivíduos saudáveis do sexo masculino (Forster & Daschner, 1998), em particular em regiões úmidas, tais como axilas, virilha e espaços interdígitos (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996). Entretanto, sua presença na orofaringe e no reto é rara (Forster & Daschner, 1998). Seifert e colaboradores (1997), em um interessante estudo realizado na Alemanha, mostraram que 75% dos pacientes hospitalizados e não infectados avaliados e 42,5% dos controles (pessoas saudáveis não internadas e profissionais de laboratório) estavam colonizadas por diferentes espécies de Acinetobacter spp., e as taxas de colonização aumentavam conforme o tempo de internação (Seifert et al., 1997). As espécies mais frequentes encontradas no estudo foram A. lwoffii (47%), A. johnsonii (21%), A. radioresistens (12%) e A. pittii (11%), sendo que as duas últimas espécies somente foram encontradas em pacientes hospitalizados. Já as espécies A. baumannii e A. nosocomialis somente foram isolados em 0,5% e 1% dos pacientes, respectivamente. Os autores concluíram 21 Revisão Bibliográfica que talvez a pele fosse o habitat natural de algumas espécies de Acinetobacter spp., principalmente A. lwoffii, A. johnsonii e A. pittii e, talvez, A. radioresistens. Esses resultados podem justificar o porquê da frequência com que essas espécies, em particular, foram encontradas causando infecções de corrente sanguínea (ICS) relacionadas a cateter (Seifert et al., 1994). Entretanto, Jawad e colaboradores (1998) mostraram que durante um surto causado por A. baumannii em uma unidade de terapia intensiva (UTI), esse patógeno foi isolado com uma alta frequência da pele e das fezes dos pacientes internados na mesma unidade (Jawad et al., 1998). As taxas de colonização de pacientes por Acinetobacter spp., em situações de surto, podem ser elevadas no trato respiratório (Mulin et al., 1997), na pele (Allen & Green, 1987), no trato urinário (Mulin et al., 1995) e no trato gastrointestinal (Timsit et al., 1993), dependendo das características específicas do surto (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996). Jawad e colaboradores também verificaram que tanto cepas não endêmicas como cepas endêmicas são capazes de sobreviver por longos períodos em superfícies secas, demonstrando uma característica inerente a esses micro-organismos (Jawad et al., 1998). Por outro lado, cepas endêmicas eram mais resistentes aos antimicrobianos que as cepas não endêmicas (Jawad et al., 1998). As espécies do gênero Acinetobacter são frequentemente consideradas ubíquas, uma vez que esses micro-organismos podem ser recuperados, usando meios de culturas enriquecidos, a partir de quase todas as amostras provenientes de solo ou de água (Peleg et al., 2008; Howard et al., 2012). Entretanto, esses achados contribuíram para que muitos equívocos sobre a espécie A. baumannii se perpetuassem na literatura médica-científica (Fournier & Richet, 2006). Entre os equívocos, Towner (2009) ressalta os três principais: (i) A. baumannii é um micro-organismo ubíquo ou altamente prevalente na natureza; (ii) pode ser facilmente recuperado a partir água, solo e animais; e (iii) faz parte da microbiota comensal da pele e da orofaringe de humanos. Enquanto estas declarações certamente se aplicam aos membros do gênero Acinetobacter quando considerado como um todo, para a espécie A. baumannii e seus 22 Revisão Bibliográfica parentes próximos (A. pittii e A. nosocomialis) isso não se aplica, já que não são organismos ubíquos (Towner, 2009). Embora A. baumannii possa ser isolado em pacientes hospitalizados e no ambiente hospitalar durante um período de surto (Jawad et al., 1998), esta espécie não apresenta um habitat natural conhecido fora do hospital (Peleg et al., 2008), sendo, inclusive, muito raramente isolada de solo, água ou de outras amostras ambientais (Towner, 2009). Na verdade, mesmo no ambiente nosocomial, durante períodos em que não estejam acontecendo surtos, raramente é isolado (Peleg et al., 2008; Towner, 2009). Apesar disso, cepas de Acinetobacter spp. causadoras de surtos têm a capacidade de sobreviver mais tempo no ambiente em comparação com cepas ATCCs, sendo demonstrado, inclusive, que as espécies do complexo A. calcoaceticus-baumannii tendem a ser mais resistentes à dessecação do que as espécies A. lwoffii, A. haemolyticus e A. junii (Jawad et al., 1996). Dentre as 33 espécies descritas para o gênero Acinetobacter (Tabela 01), pelo menos 16 dessas já foram descritas causando infecções em humanos (Bouvet & Grimont, 1986; Nishimura et al., 1988; Nemec et al., 2001; Nemec et al., 2003; Nemec et al., 2009; Nemec et al., 2010; Nemec et al., 2011). Dentre essas, aquelas pertencentes ao complexo A. calcoaceticusbaumannii são de longe as espécies mais frequentemente isoladas em infecções em humanos, sendo muitas vezes responsáveis por mais de 75% dos isolados de Acinetobacter spp. em amostras clínicas (Henwood et al., 2002), e as que apresentam as maiores taxas de resistência aos antimicrobianos (Bergogne-Bérézin & Towner, 1996; Forster & Daschner, 1998; Hanlon, 2005; Peleg et al., 2008; Towner, 2009; Howard et al., 2012). Das quatro espécies pertencentes ao complexo A. calcoaceticus-baumannii, A. calcoaceticus apresentam uma epidemiologia distinta das outras três espécies, sendo um microorganismo majoritariamente ambiental e muito raramente é o agente etiológico de infecções em humanos (Filka et al; 2000; Gopal et al., 2000; Hunt et al., 2000), ainda que cepas resistentes, eventualmente, possam causar infecções (Merino et al., 2010). Sendo assim, as espécies A. 23 Revisão Bibliográfica baumannii, A. pittii e A. nosocomialis são os principais patógenos causadores de infecções em humanos (Koh et al., 2012), ainda que a real prevalência das duas últimas espécies acabe sendo subestimada pelas dificuldades metodológicas em diferenciar essas espécies de A. baumannii, como discutido anteriormente no item 2.2. Embora A. baumannii seja a espécie mais prevalente e importante, os resultados obtidos a partir de estudos epidemiológicos que fizeram uma identificação correta das espécies pertencentes ao complexo A. calcoaceticus-baumannii demonstraram que, dependendo do hospital ou região geográfica, a frequência de isolamento de A. pittii e A. nosocomialis pode ser igual ou até mesmo superior à de A. baumannii (Molina et al., 2010; Lee et al., 2011; Lai et al., 2012), podendo essas duas espécies, inclusive serem capazes de causarem surtos (McDonald et al., 1999; De Vegas et al., 2006). Apesar disso, a grande maioria das informações sobre a epidemiologia das infecções causadas por Acinetobacter spp. está quase que exclusivamente vinculada a A. baumannii, e por isso será abordada com mais ênfase no texto a partir deste momento. A. baumannii é um dos mais importantes patógenos oportunistas causadores de infecções nosocomiais, e frequentemente está associado a surtos de difícil controle (BergogneBérézin & Towner, 1996), ocorrendo principalmente em UTIs (Young et al., 2007; MonterrubioVillar et al., 2009) e em unidades de queimados (Chim et al., 2007). Este micro-organismo está relacionado a uma variedade de complicações clínicas, tais como, pneumonia (Chan et al., 2007; Mai et al., 2007), sepse (Lee et al., 2007), infecções de pele (Ng et al., 2004) e meningite (Rodriguez et al., 2008), especialmente em pacientes imunocomprometidos ou com doença de base severa, geralmente levando a um aumento da morbidade e mortalidade (Urban et al., 2003). Além disso, tais infecções têm sido frequentemente associadas com a contaminação de equipamentos ou das mãos de profissionais de saúde (Chan et al., 2007). 24 Revisão Bibliográfica Alguns fatores têm contribuído para o sucesso e longevidade desse micro-organismo em causar surtos epidêmicos, sendo eles: (i) capacidade de A. baumannii em sobreviver em superfícies secas, relacionado à sua reduzida necessidade nutricional mínima para crescer (Wendt et al., 1997); (ii) habilidade em se manter viável em diferentes faixas de temperaturas e pH (Jawad et al., 1998); e (iii) propensão em adquirir genes de resistência aos antimicrobianos devido a sua permeabilidade para a troca de material genético (Higgins et al., 2010). Em um estudo publicado por Wendt e colaboradores (1997) ficou demonstrada que a capacidade das cepas de A. baumannii para sobreviver em superfícies secas varia muito e, surpreendentemente, esta característica está relacionada com a fonte a partir do qual a cepa foi isolada. Cepas isoladas a partir de fontes úmidas não sobrevivem tão bem como aquelas isoladas de fontes secas (Wendt et al., 1997). A persistência de isolados de A. baumannii frente a condições ambientais adversas é superior, inclusive, a outros dois grandes patógenos, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa (Musa et al., 1990). A erradicação de cepas de A. baumannii é extremamente difícil, principalmente quando estas se tornam endêmicas em uma unidade hospitalar, devido, em parte, ao fato de que as medidas habituais de controle de infecção hospitalar são muitas vezes insuficientes para deter a sua transmissão (Perez et al., 2008; Towner, 2009). Entretanto, medidas eficazes, concentradas no controle da contaminação ambiental podem ser bem sucedidas na erradicação de surtos (Wilks et al., 2006). As principais medidas incluem: (i) o uso de um sistema de aspiração traqueal fechado para todos os pacientes que receberam ventilação mecânica; (ii) descontaminação das mãos usando álcool gel; (iii) estratégias bem definidas para a limpeza dos equipamentos e do ambiente; e uma outra medida que tem sido utilizada, ainda que controversa, é (iv) o uso de polimixina B inalatória para pacientes com evidência de pneumonia, leve a moderada, associada à ventilação mecânica. A implementação do isolamento do paciente e/ou fechamento da unidade hospitalar por períodos de até quatro semanas, nos casos onde as medidas acima citadas não 25 Revisão Bibliográfica foram suficientes, podem auxiliar na contenção do surto (Denton et al., 2004; Pimentel et al., 2005). É sabido que no âmbito hospitalar, o papel das mãos dos profissionais de saúde como veículo de transmissão e disseminação de patógenos multirresistentes, principalmente A. baumannii (Chan et al., 2007), é essencial. Sendo assim, um estudo conduzido por Borer e colaboradores (2007) concluiu que a desinfecção diária de todo o corpo de pacientes ingressados na UTI com solução de gluconato de clorexidina a 4%, após culturas (inguinal e axilar) positivas de pele, reduziu significativamente a presença de A. baumannii desses pacientes. Infecções por A. baumannii tem sido associadas a climas quentes e úmidos (Berg et al. 1995; Anstey et al., 2002). Desde 1974, o “Centers for Disease Control and Prevention” - CDC observou taxas mais elevadas de infecções nosocomiais por A. baumannii no verão do que em outras estações do ano (Ramphal, 1979). McDonald e colaboradores (1999) avaliaram 3.447 infecções causadas por Acinetobacter em adultos e crianças internados em UTIs que foram relatados ao CDC entre 1987 a 1996. Os autores verificaram um aumento de 50% entre os meses de verão no hemisfério norte, de Julho a Outubro, do que nos demais meses do ano, e associou esse aumento às temperaturas mais quentes e úmidas nessa época do ano, o que teoricamente favoreceria o crescimento de Acinetobacter spp. em seus habitats naturais, tendo os aparelhos de ar condicionado apontados como os responsáveis pela epidemia (MacDonald et al., 1999). Entretanto, ao longo das duas últimas décadas, infecções por estes patógenos tem se tornado cada vez mais um problema em países de climas temperados (Munoz-Price & Weinstein, 2008). Como fatores de risco para colonização e infecção por A. baumannii temos: internação prévia em UTI, cirurgia recente, cateter venoso central, traqueostomia, ventilação mecânica, dieta parenteral, e terapia prévia com fluoroquinolonas, cefalosporinas de amplo espectro ou carbapenens (Villegas & Hartstein, 2003; Munoz-Price & Weinstein, 2008; Towner, 2009). 26 Revisão Bibliográfica Como forma de resumir a complexa epidemiologia de Acinetobacter spp., Towner (2009) dividiu apropriadamente o gênero Acinetobacter em três grandes populações, sendo estas: (i) isolados multirresistentes (MDR) que seriam encontrados principalmente em ambientes nosocomiais e durante situações de surto, sendo capazes de colonizar e infectar pacientes hospitalizados. Estes isolados compreenderiam principalmente A. baumannii, A. pittii e A. nosocomialis; (ii) isolados sensíveis à maioria dos antimicrobianos e que fariam parte da flora comensal normal da pele de humanos (estima-se que colonizem entre 25% a 70% dos indivíduos) e animais, podendo também ser encontrados como parte da flora de deterioração de muitos alimentos. Neste grupo entrariam as espécies A. johnsonii, A. lwoffii e A. radioresistens; e (iii) isolados ambientais sensíveis aos antimicrobianos que poderiam ser encontrados no solo ou em águas residuais, compreendendo principalmente as espécies A. calcoaceticus e A. johnsonii. Os habitats naturais das demais espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter (Tabela I) são ainda mal definidos, e necessitam ainda de estudos adicionais para melhor caracterização. 2.4 - Opções Terapêuticas para o Tratamento das Infecções por Acinetobacter spp. 2.4.1 - Polimixinas Dentre as limitadas opções terapêuticas para o tratamento das infecções causadas por isolados de Acinetobacter spp. MDR, as polimixinas são os antimicrobianos que apresentam os melhores resultados (Neonakis et al., 2011), com taxas de cura em torno de 75% a 87% (Kallel et al.,. 2007; Falagas et al.,. 2010a). Embora as polimixinas tenham sido descobertas no final da década de 40 (Stansly et al., 1947), apenas dois membros pertencentes a essa classe de antimicrobianos estão disponíveis na prática clínica atualmente, sendo estes, a polimixina B e a polimixina E, também conhecida como colistina (Velkov et al.,. 2010). Ambos os compostos são metabólitos peptídicos secundários produzidos pela bactéria de solo Paenibacillus polymyxa, compartilhando uma sequência comum primária e se diferenciando na posição 6, que é ocupada 27 Revisão Bibliográfica por uma D-Phe na polimixina B e uma D-Leu na colistina. As polimixinas são detergentes catiônicos que se ligam ao lipídio A do lipopolissacarídeo (LPS) bacteriano perturbando a membrana citoplasmática e, dessa forma, aumentando a permeabilidade da parede celular, com consequente vazamento do conteúdo citoplasmático e finalmente lise celular. As polimixinas foram abandonadas nas décadas de 1960 e 1970 devido a ocorrência frequente de nefrotoxicidade e neurotoxicidade (Wolinsky & Hines, 1962; Koch-Weser et al., 1970). Entretanto, com o surgimento de bacilos Gram negativos MDR e a falta de novas opções terapêuticas, fizeram com que as polimixinas voltassem ao cenário clínico nos últimos anos. Estudos recentes mostraram uma menor toxicidade, possivelmente devido ao uso de doses menores, novas formulações e um monitoramento minucioso do transcurso clínico dos pacientes que fazem uso desses antimicrobianos. Além disso, a neurotoxicidade associada ao tratamento com polimixinas se tornou incomum (Falagas & Kasiakou, 2006b). As polimixinas apresentam uma atividade bactericida contra isolados de A. baumannii, e as taxas de resistência tem se mantido relativamente baixa, variando, em média, de 1,7% a 3% (Gales et al., 2006; Souli et al., 2006; Gales et al., 2011). Apesar disso, Ko e colaboradores (2007) relataram uma taxa de 27,9% de resistência entre os 214 isolados de A. baumannii avaliados de dois hospitais sul-coreanos (Ko et al., 2007). Embora os mecanismos de resistência as polimixinas ainda não estejam bem esclarecidos (Falagas et al., 2010b), já se sabe que alterações na composição de LPS da parede celular bacteriana (Beceiro et al., 2011; Arroyo et al., 2011), expressão reduzida de proteínas de membrana externa (OMPs) específicas (Vila et al., 2007), redução do teor de lipídeos e redução na carga elétrica (Mg+2 e Ca+2) do envelope celular (Soon et al., 2011), são fatores importantes neste fenótipo. As polimixinas foram testadas extensivamente em combinação com carbapenens, quinolonas e aminoglicosídeos contra isolados de A. baumannii MDR, com resultados promissores (Pankuch et al., 2004; Yoon et al., 2004; Tan et al., 2007). Além disso, atenção 28 Revisão Bibliográfica especial deve ser tomada na realização dos testes de sensibilidade às polimixinas, uma vez que diferenças na composição de cátions dos meios de Mueller-Hinton disponíveis comercialmente interferem na concentração inibitória mínima - CIM obtida para esses antimicrobianos (Girardello et al., 2012), necessitando o ajustamento das concentrações dos cátions, quando necessário, segundo as recomendações do “Clinical Laboratory Standards Institute” - CLSI (CLSI, 2012). 2.4.2 - Tigeciclina A tigeciclina é o único membro da relativa nova classe de antimicrobianos, as glicilciclinas (Chopra, 2001). Esse antimicrobiano semi-sintético é uma modificação da molécula de minociclina e apresenta um amplo espectro de atividade, que inclui bactérias Gram positivas (incluindo estafilococos resistentes à meticilina - MRSA e enterococos resistentes à vancomicina - VRE) (Garrigós et al., 2011; Polidori et al., 2011), Gram negativas (incluindo enterobactérias produtoras de β-lactamases de espectro ampliado - ESβL) (Silva-Sanchez et al., 2011) e anaeróbios (Jump et al., 1996). A tigeciclina inibe a síntese proteica bacteriana através da ligação à subunidade ribossomal 30S (Bergeron et al., 1996) e apresenta uma atividade bacteriostática contra isolados de A. baumannii (Maragakis & Perl, 2008). Similarmente ao que ocorre com as polimixinas, a concentração dos cátions no meio Mueller-Hinton também podem interferir nos resultados obtidos nos testes de sensibilidade para tigeciclina (Cayô et al., 2010) levando a resultados discrepantes quando comparados as metodologias de disco difusão e Etest com a microdiluição em caldo (Fernández-Mazarrasa et al., 2009). Além disso, a tigeciclina pode sofrer degradação por um processo de oxidação, que causa a perda de sua potência (Bradford et al., 2005). Embora o uso de tigeciclina para o tratamento de infecções causadas por A. baumannii seja “off-label”, as CIMs relativamente baixas (CIM50 0,5-1 mg/L e CIM90 1-2 mg/L) obtidas em diferentes estudos tornaram o uso desse antimicrobiano atraente contra A. baumannii (Reinert et al., 2007; Garrison et al., 2009). Entretanto, apesar da boa atividade in vitro contra 29 Revisão Bibliográfica isolados de A. baumannii MDR, a eficácia clínica da tigeciclina continua a ser controversa (Karageorgopoulos et al., 2008; Gallagher & Rouse, 2009). Além disso, a resistência a tigeciclina em A. baumannii ocorre pela hiperexpressão de sistemas de efluxo, principalmente o sistema AdeABC, presente no cromossomo desse micro-organismo (Peleg et al., 2007). 2.4.3 - Ampicilina/Sulbactam Sulbactam é um inibidor de β-lactamase com uma estrutura semelhante aos βlactâmicos que possue atividade contra isolados de A. baumannii porque se liga à proteína ligadora de penicilina 2 (PBP2) (Zavascki et al., 2010). Estudos tem demonstrado que sulbactam, que no Brasil é comercializado juntamente com ampicilina, pode ser uma opção terapêutica para o tratamento de infecções causadas por A. baumannii MDR com resultados satisfatórios (Levin et al., 2003). Levin e colaboradores (2003) trataram 40 pacientes com infecções por A. baumannii MDR com ampicilina/sulbactam, sendo a maioria dos casos ICS e pneumonia, e observaram um taxa de cura de 67,5% (Levin et al., 2003). O mesmo grupo de pesquisa, em outro estudo, compararam retrospectivamente pacientes com infecções por Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenens que haviam feito terapia com polimixina B e ampicilina/sulbactam separadamente (Oliveira et al., 2008). Foi observado que ampicilina/sulbactam foi mais eficaz no tratamento de A. baumannii MDR do que a polimixina B. Inclusive o uso de polimixina B foi considerado no estudo como um fator independente de mortalidade, apresentando alto valor de “Acute Physiological and Chronic Health Evaluation II” - APACHE II (Oliveira et al., 2008). Devido aos resultados encorajadores, chegou-se se a conclusão de que para infecções causadas por isolados de A. baumannii sensíveis à ampicilina/sulbactam, dever-se-ia priorizar esse antimicrobiano como opção terapêutica (Neonakis et al., 2011). Além disso, foi demonstrado que o custo do tratamento com ampicilina/sulbactam é significativamente menor quando comparado com imipenem/cilastatina (1.500 dolares - imipenem-cilastatina vs 500 dolares - 30 Revisão Bibliográfica ampicilina/sulbactam, p=0.004) (Jellison et al., 2001). As desvantagens no uso do sulbactam seria o fato de que em muitos países, como o Brasil, somente existe a formulação 2:1 de ampicilina/sulbactam, respectivamente, e as altas taxas de resistência verificadas em algumas regiões geográficas, variando de 46,7% na Espanha (Fernández-Cuenca et al., 2004) a 70% em Tawain (Yang et al., 2010). 2.4.4 - Minociclina Introduzido no final da década de 60 (Redin, 1966), a minociclina, juntamente com a doxiciclina, sofreram modificações na estrutura inicial da tetraciclina, e representam a segunda geração desses antimicrobianos (Neonakis et al., 2011). Tais modificações permitiram a minociclina apresentar características únicas, como uma meia-vida longa, melhor absorção oral, e maior penetração tecidual (Nelson & Levy, 2011). Além disso, a minociclina mantém atividade contra bactérias resistentes à tetraciclina. Assim como as demais tetraciclinas, seu mecanismo de ação é a inibição da síntese proteica bacteriana, se ligando aos ribossomos e impedindo, dessa forma, a ligação do aminoacil-tRNA (Chopra et al., 1992). A minociclina apresenta atividade tanto contra bactérias Gram positivas como Gram negativas (Bishburg & Bishburg, 2009), e os mecanismos de resistência estão relacionados, na maioria das vezes, a dois grupos de genes (tet e otr) que codificam sistemas de efluxo e proteínas protetoras ribossomais (Chopra & Roberts, 2001). Tais grupos de genes podem conferir padrões distintos de resistência entre as tetraciclinas (Bishburg & Bishburg, 2009). O uso da minociclina caiu em desuso devido à introdução de agentes antimicrobianos mais potentes (Neonakis et al., 2011). Entretanto, devido a sua concentração sérica/tecidual ideal e sua notável penetração no sistema nervoso central, aliado ao aumento de infecções por A. baumannii MDR, esse antimicrobiano voltou a ganhar destaque (Bishburg & Bishburg, 2009; Neonakis et al., 2011). Os relatos na literatura, ainda que escassos, têm demonstrado resultados animadores para o tratamento de infecções de pele 31 Revisão Bibliográfica (Griffith et al., 2008) e pneumonia (Wood et al., 2003; Griffith et al., 2008) causadas por A. baumannii. 2.4.5 - Carbapenens Os β-lactâmicos apresentam uma excelente eficácia, segurança e tolerabilidade no tratamento de infecções bacterianas e, por isso, tem sido amplamente prescritos nos últimos 60 anos. Esses antimicrobianos são divididos em pelo menos cinco subclasses, sendo essas, penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, monobactâmicos e carbapenens. O mecanismo de ação de todos os β-lactâmicos consiste na ligação desses antimicrobianos com as PBPs, localizadas na membrana interna bacteriana, inibindo a síntese da parede celular, uma vez que as PBPs catalisam a síntese e a remodelação do peptídeoglicano, principal componente da parede celular (Sauvage et al., 2008; Llarrull et al., 2010). A inibição ocorre devido ao fato dos β-lactâmicos mimetizarem o dipeptídeo D-Ala-D-Ala, sendo reconhecidos pelas PBPs, e dessa forma atuarem como inibidores suicidas (Zapun et al., 2008). O sítio ativo serina das PBPs ataca o radical carbonila do anel β-lactâmico, resultando na abertura do anel e na formação de um complexo covalente enzima-acil. Uma vez ligado às PBPs, o β-lactâmico é hidrolisado muito lentamente, impedindo efetivamente que as PBPs realizem novas reações de síntese da parede celular bacteriana (Zapun et al., 2008). Dentre as subclasses dos β-lactâmicos, os carbapenens são aos antimicrobianos mais potentes e com o maior espectro de atividade antimicrobiana in vitro (Zhanel et al., 2007; Nicolau, 2008; Papp-Wallace et al., 2011). A história desses antimicrobianos começa no final da década de 60, quando o uso da penicilina na pratica clínica foi ameaçado pelo surgimento das βlactamases, e a busca por inibidores dessas enzimas se tornaram uma necessidade (PappWallace et al., 2011). Somente em 1976, os primeiros inibidores de β-lactamase foram descobertos, e foram chamados de ácidos olivânicos (Figura 2A). Esses compostos eram 32 Revisão Bibliográfica naturalmente produzidos pela bactéria Streptomyces clavuligerus, e apresentavam em suas estruturas o que mais tarde constituiria espinha dorsal da molécula dos carbapenens (Brown et al., 1976; Papp-Wallace et al., 2011). Entretanto, devido à instabilidade química e à pouca penetração na célula bacteriana, esses compostos foram esquecidos, sendo substituídos por dois outros inibidores mais potentes, o ácido clavulânico (isolado de S. clavuligerus) e a tienamicina (isolado de Streptomyces cattleya), sendo a tienamicina (Figura 2B) considerada o precursor dos carbapenens (Núñez et al., 2003; Papp-Wallace et al., 2011). A partir da molécula da tienamicina derivou-se o imipenem (Figura 2C), que em 1985 se tornou o primeiro carbapenem usado para o tratamento de infecções bacterianas (Miyadera et al., 1983; PappWallace et al., 2011). Posteriormente, outros carbapenens foram sendo desenvolvidos (Zhanel et al., 2007; Nicolau, 2008), sendo meropenem (Figura 2E), ertapenem (Figura 2F) e doripenem (Figura 2H) os mais importantes, pois constituem os compostos mais utilizados mundialmente. Os primeiros carbapenens, tais como imipenem e biapenem, eram frequentemente susceptíveis à degradação pela enzima dehidropeptidase-1 (DHP-1) localizada nos túbulos renais e sendo, portanto, necessária a coadministração com a cilastatina ou com o betamiprom, que são inibidores da DHP-1 (Zhanel et al., 2007). Os demais carbapenens desenvolvidos posteriormente (meropenem, ertapenem e doripenem) apresentam uma modificação na sua estrutura molecular, com a inserção de um radical 1β-Metil (Figura 2 - círculos em azul), que protege o grupo carbonil β-lactâmico reduzindo assim a hidrólise catalisada pela DHP-1. Dessa forma, os carbapenens posteriores ao imipenem e ao biapenem são administrados sem a associação com a cilastatina (Hammond, 2004; Papp-Wallace et al., 2011). 33 Revisão Bibliográfica A B C D E F H G Radical Trans-1-hidroxietil Radical 1β β -metil Substituição meta-ácido benzoico Anel β-lactâmico Figura 02 - Comparação das estruturas química dos ácidos oliovânicos, tienamicina e dos carbapenens. A - ácido oliovânico; B - tienamicina; C - imipenem, antigo MK-0787 (Horadam et al., 1980); D - panipenem, antigo RS-533 (Miyadera et al., 1983); E - meropenem, antigo SM7338 (Sentochnik et al., 1989); F - ertapenem, antigo MK-0826 (Goldstein et al., 2000);G biapenem, antigo L-627 (Ubukata et al., 1996); H - doripenem, antigo S-4661 (Iso et al., 1996). Estruturas químicas modificadas a partir da figura original obtidas de Papp-Wallace e colaboradores (2011). 34 Revisão Bibliográfica Imipenem, meropenem e doripenem apresentam meias-vidas in vivo de aproximadamente 1 hora, enquanto ertapenem tem uma meia-vida de aproximadamente 4 horas tornando-o adequado para uma única administração diária (Zhanel et al., 2007). Essa característica única do ertapenem está relacionada à inclusão de uma substituição meta de um radical de ácido benzoico (Figura 2F - círculo em lilás), que modificou as propriedades antibacterianas e farmacológicas do ertapenem, fazendo com esse composto se ligasse mais facilmente às proteínas do plasma humano (Hammond, 2004). Este aumento na ligação às proteínas do plasma permite à administração de uma dose única diária de 1 g de ertapenem comparado às três e quatro doses diárias usadas para o meropenem e imipenem, respectivamente (Cunha, 2002). Os carbapenens apresentam atividade contra muitas bactérias Gram positivas, Gram negativas e anaeróbios (Zhanel et al., 2007; Papp-Wallace et al., 2011). Geralmente, imipenem, panipenem e doripenem são potentes contra bactérias Gram positivas, enquanto meropenem, biapenem, ertapenem e doripenem são ligeiramente mais potentes contra bactérias Gram negativas (Papp-Wallace et al., 2011). Ertapenem é o carbapenem que apresenta o espectro mais limitado, já que não possui atividade frente a P. aeruginosa e A. baumannii (Cunha, 2002). Além disso, todos os carbapenens não apresentam atividade contra Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus resistentes a meticilina (MRSA) e Stenotrophomonas maltophilia (PappWallace et al., 2011; Nicolau, 2008). Diferente do ocorre com muitas das demais subclasses de β-lactâmicos, os carbapenens são estáveis frente à maioria das β-lactamases, incluindo as do tipo AmpC (item 2.5.1.2) e as ESβLs (item 2.5.1.3) (Papp-Wallace et al., 2011). As β-lactamases que contém um resíduo de serina no sítio ativo utilizam a reatividade química intrínseca dos β-lactâmicos para inativá-los. A enzima associa-se não covalentemente ao anel β-lactâmico, e então o radical hidroxila livre do resíduo de serina presente no sítio ativo da enzima ataca o anel β-lactâmico, formando uma 35 Revisão Bibliográfica ligação covalente acil-éster. A hidrólise do éster formado libera a enzima ativa e o β-lactâmico hidrolisado e inativado (Livermore, 1995). O radical trans-1-hidroxietil (Figura 2 - círculos em verde), presente nos carbapenens, retira a molécula de água do sítio ativo da β-lactamase, necessária para uma hidrólise enzimática eficiente, estabilizando a enzima acilada e inativa. Entretanto, a capacidade dos carbapenens de se manterem estáveis frente as β-lactamases não se estende às carbapenemases, entre elas as metalo-β-lactamases - MβLs (item 2.5.1.5) item e as carbapenemases de classe D (item 2.5.1.6) (Poirel et al., 2010; Cornaglia et al., 2011). Apesar disso, entre os carbapenens, o doripenem é o que apresenta melhor estabilidade frente às carbapenemases; sendo hidrolisado de 2 a 150 vezes mais lentamente que o imipenem (PappWallace et al., 2011). Embora os β-lactâmicos seja uma das classes mais importantes para o tratamento de infecções por bactérias Gram negativas, nenhuma nova subclasse foi descrita nos últimos 30 anos, e o desenvolvimento de novos representantes diminuiu drasticamente (Chambers, 2006; Poulakou & Giamarellou, 2008). Llarrull e colaboradores (2010) fizeram uma excelente e pessimista discussão sobre o futuro dos β-lactâmicos, na qual, inclusive tentam entender o descaso da indústria farmacêutica em relação a estes antimicrobianos: (i) a diminuição do interesse pela indústria farmacêutica em todos os aspectos relacionados ao desenvolvimento antibacteriano; (ii) a crença de que a interação estrutura-atividade para os β-lactâmicos chegou a um nível de complexidade que o esforço/custo já não se justifica, e que (iii) o uso indiscriminado dos β-lactâmicos durante décadas contribuiu para a seleção de diversos e efetivos mecanismos de resistência (Llarrull et al., 2010). 2.5 - Mecanismos de Resistência aos β-Lactâmicos por Acinetobacter spp. Os β-lactâmicos são os agentes antimicrobianos mais frequentemente utilizados na prática médica. A resistência a esses agentes limita drasticamente as opções terapêuticas e 36 Revisão Bibliográfica aumenta a morbidade e os custos com o paciente (Falagas et al., 2006a). A resistência bacteriana aos β-lactâmicos pode estar relacionada com qualquer uma das etapas envolvidas no mecanismo de ação desses antimicrobianos, sendo quatro os mecanismos descritos: (i) degradação enzimática do antimicrobiano pela produção de β-lactamases (Figura 04a); (ii) perda ou diminuição da expressão das proteínas de membrana externa (Figura 04b); (iii) hiperexpressão dos sistemas de efluxo (Figura 04c); e (iv) alteração da afinidade ou expressão das PBPs (Figura 04d) (Llarrull et al., 2010). 4b - Alteração de proteínas de Membrana Externas Localização: Membrana Externa Proteínas importantes: Omp25, OmpW, CarO, 33-36 kDa, OmpHMP, OprD-like Meio Externo Membrana Externa Espaço periplásmico 4c - Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo Localização: Membrana Externa Sistemas envolvidos: AdeABC, AdeDE, AdeFGH, Ade IJK 4d – Alteração do Sítio Alvo Localização: Membrana Interna Proteínas importantes: PBP1a,. PBP1b, PBP2, PBP3, PBP5/6, PBP6b, PBP7/8, MtgA Membrana Interna Citoplasma 4a - Produção de ß- lactamases Localização: Espaço periplásmico Enzimas importantes: OXA-23, OXA-24, OXA-51, 58, OXA-143, IMP-like, VIM-like, GIM-1, SIM-1, NDM-like, ADC Figura 04 - Estrutura da parede celular, mecanismos de resistências aos β-lactâmicos em Acinetobacter spp. e principais proteínas envolvidas. Figura modificada a partir da figura original obtida de Munoz & Weinstein (2008). 37 Revisão Bibliográfica Diferente das bactérias Gram positivas (Mainardi et al., 2008), nas quais a alteração das PBPs é o principal mecanismo de resistência aos β-lactâmicos (Wu et al., 1994; Ligozzi et al., 1996; Dowson et al., 1990), nos bacilos Gram negativos o mecanismo principal é a produção de β-lactamases. A degradação enzimática em bactérias Gram positivas ocorre mais raramente, com alguns relatos em isolados de Staphylococcus aureus (Livorsi et al., 2012) e Enterococcus spp. (Chow et al., 1993). A constituição da parede celular entre esses dois grupos de bactérias (Silhavy et al., 2010) tem um papel importante e essencial nessa diferença, elegendo a predominância de um mecanismo de resistência sobre os demais. As bactérias Gram negativas apresentam uma maior complexidade em sua parede celular (Silhavy et al., 2010) o que, consequentemente, influenciará na diversidade dos mecanismos de resistência observados nesses micro-organismos (Figura 04). 2.5.1 - Produção de β-Lactamases As β-lactamases são enzimas que catalisam a hidrólise do anel β-lactâmico, tornandoos inativos (item 2.4.5). Os genes que as codificam podem estar localizados tanto no cromossoma bacteriano como em plasmídeos (Bush et al., 1995). Algumas dessas enzimas utilizam íons de zinco como cofatores enzimáticos, enquanto a grande maioria opera via produção de ésteres de serina (Livermore, 1995). A quantidade de enzima produzida, a habilidade dessa enzima em hidrolisar o β-lactâmico e a velocidade com que o antimicrobiano penetra na célula são fatores que irão influenciar o grau da resistência. Essas enzimas são produzidas por inúmeras espécies bacterianas, tanto Gram positivas como Gram negativas, diferindo quanto as suas estruturas e localizações (Bush et al., 1995). Nas bactérias Gram positivas, as β-lactamases são secretadas no meio extracelular e, portanto são menos eficientes que as enzimas produzidas pelas bactérias Gram negativas, que se encontram estrategicamente 38 Revisão Bibliográfica no espaço periplásmico, onde podem alcançar altas concentrações agindo de modo mais eficaz sobre os β-lactâmicos, antes desses atingirem o seu sítio alvo, as PBPs (Livermore, 1993). A primeira β-lactamase foi identificada em Escherichia coli, antes mesmo do desenvolvimento da penicilina para uso na prática clínica (Abraham & Chain, 1988; Bradford, 2001). Isso é justificável, uma vez que muitas das classes de antimicrobianos utilizadas na prática clínica são compostos derivados de metabólitos secundários previamente isolados de micro-organismos ambientais (Barreiro et al., 2012). A penicilina, por exemplo, descoberta em 1928 pelo médico e bacteriologista escocês Sir Alexander Fleming, é um antimicrobiano natural isolado do fungo Penicillium chrysogenum (ou Penicillium notatum) causador do bolor do pão (Barreiro et al., 2012). A competição pela sobrevivência no meio ambiente é árdua e os microorganismos precisam produzir substâncias para se defenderem e conquistarem o seu próprio nicho ecológico (Fredrickson & Stephanopoulos, 1981). As β-lactamases são a principal causa de resistência aos β-lactâmicos em bacilos Gram negativos e tem sido objeto de extensas investigações microbiológicas, bioquímicas e genéticas (Bush et al., 1995). Embora, novos antimicrobianos resistentes à ação hidrolítica das βlactamases têm sido desenvolvidos, com o uso clínico de cada nova classe, novas β-lactamases surgem causando resistência a estes novos antimicrobianos. Presumidamente, a pressão seletiva do uso indiscriminado desses agentes no tratamento de infecções, tem selecionado novas variantes de β-lactamases (Bradford, 2001). Embora novas β-lactamases vem sendo descobertas a cada ano, a classificação proposta por Bush, Jacoby e Medeiros (1995) ainda é a mais utilizada e aceita, combinando aspectos estruturais e funcionais das β-lactamases. Posteriormente, os mesmos autores fizeram uma atualização da classificação, incluindo novas β-lactamases que não eram contempladas na classificação anterior e criaram novos subgrupos (Bush & Jacoby, 2010). Outra importante classificação é aquela descrita por Ambler (1980), na 39 Revisão Bibliográfica qual as β-lactamases foram agrupadas em quatro classes (A, B, C e D), levando em consideração as suas sequencias de aminoácidos. 2.5.1.2 - Produção de β -Lactamases de classe C - AmpC As β-lactamases do tipo AmpC pertencem ao grupo 1 de Bush (Bush et al., 1995) e a classe molecular C de Ambler (Ambler, 1980), sendo encontradas tanto no cromossomo bacteriano como em plasmídeos (Jacoby, 2009; Philippon et al., 2002). As enzimas cromossomais pertencentes a este grupo já foram descritas em uma variedade de microorganismos, principalmente nos membros do grupo CESP (Citrobacter freundii, Enterobacter spp., Serratia marcescens, Providencia stuartii, P. aeruginosa e Morganella morganii), nos quais essas β-lactamases são induzíveis (Bush et al., 1995; Jacoby, 2009), ou em micro-organismos como E. coli e A. baumannii, nos quais a indução não ocorre (Jacoby, 2009). Entre os membros do grupo CESP, existem três proteínas (AmpD, AmpG, e AmpR) que estão relacionadas ao mecanismo de indução e regulação das β-lactamases cromossomais do tipo AmpC, sendo necessário a presença de todos esses genes para a correta indução dessas β-lactamases (Kuga et al., 2000). A presença de alguns β-lactâmicos como a cefoxitina e o imipenem são fortes indutores, podendo aumentar de 100 a 600 vezes a expressão dessas βlactamases (Jones, 1998). A principal diferença entre indutores fortes e fracos é a afinidade com que os diferentes β-lactâmicos tem pela PBP4 e/ou PBP7, que funcionam como sinalizadores para o aumento da expressão do gene blaAmpC. O mecanismo de indução é extremamente complexo e quando os β-lactâmicos indutores são retirados, a produção pode voltar a níveis basais (Sanders et al., 1997). A maioria das β-lactamases do tipo AmpC hidrolisam ureidopenicilinas (piperacilina), cefamicinas (cefoxitina e cefotetan), e, a um nível inferior, as oximinocefalosporinas (ceftazidima, cefotaxima e ceftriaxona) e os monobactâmicos (aztreonam) (Jacoby, 2009; Philippon et al., 40 Revisão Bibliográfica 2002). As cefalosporinas zwiteriônicas (cefepima e cefpiroma), ou seja, moléculas que apresentam pólos positivos e negativos, e os carbapenens não são hidrolisados por essas βlactamases (Jacoby, 2009; Philippon et al., 2002). Entretanto, surgiram variantes das cefalosporinases do grupo 1 de Bush (CMY-10, CMY-19 e CMY-37) apresentando substituições de aminoácidos ou inserções/deleções em quatro regiões específicas que localizadas próximos ao sítio ativo da enzima, e devido a essas mutações passaram a hidrolisar as oximinocefalosporinas, cefepima e, em alguns casos, até imipenem (Rodríguez-Martínez et al., 2009). Sendo assim, Bush & Jacoby (2010), ao atualizarem a sua classificação das β-lactamases de 1995 (Bush et al., 1995), decidiram dividir o grupo 1 de Bush em dois subgrupos (1 e 1e). No subgrupo 1e foram incluídas as AmpCs que conferem sensibilidade reduzida para todas as cefalosporinas e foram genericamente chamadas de AmpCs de espectro ampliado (ESAC “Extended-Spectrum AmpC”) (Bush & Jacoby, 2010). Em 1990, foi descrito uma enzima localizada em um plasmídeo com 90% de similaridade com o gene ampC de E. cloacae, dando início a um novo grupo de enzimas pertencentes a classe C, conhecidas como AmpC plasmidiais (Papanicolaou et al., 1990). As AmpCs plasmidiais já foram descritas em todo o mundo, sendo encontradas principalmente em K. pneumoniae, K. oxytoca, Salmonella spp., Proteus mirabilis e E. coli. Essas enzimas apresentam o mesmo espectro de ação das AmpCs cromossomais, podendo ser induzíveis ou não (Philippon et al., 2002). Até o momento já foram descritas nove tipos de AmpCs plasmidiais: CFE-1, LAT-1, CMY (92 variantes), FOX (10 variantes), MOX (oito variantes), ACT (16 variantes), ACC (cinco variantes), MIR (cinco variantes) e DHA (oito variantes). Na literatura consta somente um relato de DHA-like em isolados de A. baumannii na China, com uma alta frequência (19,4%) (Yin et al., 2008) No caso de A. baumannii, a expressão da AmpC cromossômica, que é intrínseca da espécie, não é induzida pelo fato de que neste micro-organismo o gene ampR está ausente, 41 Revisão Bibliográfica sendo, portanto, expressa em níveis basais, e, dessa maneira não confere resistência às oximinocefalosporinas (Bou & Martínez-Beltrán, 2000). Entretanto, a resistência as oximinocefalosporinas em A. baumannii está geralmente relacionada com a hiperprodução de AmpC, quando a sequência de inserção (IS) ISAba1 está inserida a montante do gene, conferindo um promotor forte (Boo et al., 2009b; Lin et al., 2010). Além disso, foi proposto uma nomenclatura específica para as β-lactamases do tipo AmpC de A. baumannii, sendo sugerido o nome ADC derivado de “Acinetobacter-derived cephalosporinases”, já que essas enzimas apresentam um único ancestral comum e se distanciam substancialmente do outros genes ampC descritos em outros micro-organismos (Hujer et al., 2005). Entre as enzimas ADC, algumas já foram descritas como sendo ESAC, como as variantes ADC-33 (Rodríguez-Martínez et al., 2010) e ADC-56 (Tian et al., 2011), ambas conferindo resistências às cefalosporinas de quarta geração. βL 2.5.1.3 - Produção de β -Lactamases de Espectro Ampliado - ESβ As ESβLs pertencem ao grupo 2be de Bush (Bush et al., 1995) e a classe molecular A de Ambler (Ambler, 1980). É um grupo heterogêneo e apresentam uma serina no sítio ativo, representando o maior grupo de β-lactamases estudadas atualmente (Turner, 2005). Descritas inicialmente em K. pneumoniae e E. coli, as ESβLs se disseminaram para as demais espécies de enterobactérias, e, embora, sejam também encontradas em P. aeruginosa (Picão et al., 2009), raramente são descritas em A. baumannii. Os genes que codificam as ESβLs estão localizados em grandes plasmídeos que também podem codificar resistência aos aminoglicosídeos, tetraciclina, cloranfenicol, e trimetoprim/sulfametoxazol, o que pode explicar o fenótipo MDR verificado muitas vezes em bactérias produtoras dessas enzimas (Winokur et al., 2001; Turner, 2005). As ESβLs conferem resistência às penicilinas, às cefalosporinas de amplo espectro e ao aztreonam, mas não são ativas contra as cefamicinas e os carbapenens (Bradford, 42 Revisão Bibliográfica 2001; Turner, 2005). Além disso, a expansão do sítio ativo que permite a estas enzimas um aumento da atividade contra as cefalosporinas de amplo espectro resulta no aumento da sensibilidade aos inibidores de β-lactamases (Bradford, 2001; Turner, 2005). Entre as ESβLs, as enzimas do tipo TEM (202 variantes) e SHV (167 variantes) são derivadas das β-lactamases do tipo TEM-1, TEM-2 e SHV-1, que pertencem ao grupo 2b de Bush (Bush et al., 1995) e apresentam espectro de atividade limitado, não sendo capazes de hidrolisar oximinocefalosporinas. Estão incluídas entre as ESβLs também as enzimas do tipo CTX-M (133 variantes), que hidrolisam preferencialmente cefotaxima, e apresentam pouca similaridade (40%) com as enzimas do tipo TEM e SHV. A variante CTX-M-2 é a ESβL mais prevalente e disseminada no Brasil (de Oliveira Garcia et al., 2008; Picão et al., 2009). As ESβLs do tipo OXA hidrolisam muito bem a oxacilina ou cloxacilina, fato este que deu origem ao nome do grupo, e pertencem ao grupo 2de de Bush (Bush et al, 1995) e a classe molecular D de Ambler (Ambler, 1980). Essas enzimas não apresentam similaridade genética com as demais ESβLs e são mais frequentes em P. aeruginosa (Poirel et al., 2010). Essas enzimas serão abordadas com mais detalhe no item 2.5.1.6. Embora as ESβLs sejam muito prevalentes nas enterobactérias, raros são os relatos de A. baumannii carreando essas enzimas. Talvez isso se deva à dificuldade em se detectar essas enzimas em isolados de A. baumannii pelos laboratórios de rotina, já que foram comprovados resultados falsos positivos usando métodos fenotípicos (Beceiro et al., 2008). Até o momento, as ESβLs mais frequentemente descritas em Acinetobacter spp. são: PER-1 (Turquia - Vahaboglu et al., 2001; Bélgica - Naas et al., 2006; Romênia - Naas et al., 2007b; Bulgária - Strateva et al., 2008; Índia - Litake et al., 2009; Coréia do Sul - Bae et al., 2011), VEB-1 (Bélgica - Naas et al., 2006; França - Brasme et al., 2007; Hungria - Szábo et al., 2008; Argentina - Poirel et al., 2009), seguida da CTX-M-15 (Haiti - Potron et al., 2011; Índia - Shakil & Khan, 2010). Além disso, outras variantes também foram descritas em isolados de A. baumannii: SHV-5 (EUA - Naas et 43 Revisão Bibliográfica al., 2007a), CTX-M-2 (Japão - Nagano et al., 2004), CTX-M-43 (Bolívia - Celenza et al., 2006), TEM-92 (Itália - Edimiani et al., 2007), PER-2 (Argentina - Pasterán et al., 2006), PER-7(França Bonnin et al., 2011; Emirados Árabes - Opazo et al., 2012), GES-11 (França – Moubareck et al., 2009; Bélgica - Bogaerts et al., 2010) GES-12 (Bélgica - Bogaerts et al., 2010) e GES-14 (França - Bonnin et al., 2011). 2.5.1.4 - Produção de Carbapenemases de Classe A A produção de carbapenemases é o meio mais efetivo para a aquisição de resistência aos carbapenens em bacilos Gram negativos (Queenan & Bush, 2007). As serinocarbapenemases ou carbapenemases de classe A pertencem ao grupo 2f de Bush (Bush et al., 1995) e a classe molecular A de Ambler (Ambler, 1980). Fazem parte desse grupo as enzimas do tipo GES (22 variantes), KPC (11 variantes), SME (três variantes), IMI (duas variantes), NMCA e SFC-1 (Walther-Rasmussen & Høiby, 2007). Anteriormente, as enzimas do tipo GES foram classificadas como sendo pertencentes a grupo das ESβLs (grupo 2be de Bush), entretanto após a descrição de GES-2 em P. aeruginosa, que apresentava atividade contra imipenem, este grupo foi transferido para o grupo 2f (Queenan & Bush, 2007). Outra enzima que foi incluída neste grupo foi a SHV-38 (Poirel et al., 2003), que apresenta uma pequena atividade contra o imipenem, diferindo-se apenas por uma substituição de aminoácidos da SHV-1 (WaltherRasmussen & Høiby, 2007). Entre as carbapenemases de classe A, destacam-se as β-lactamases do tipo KPC devido a sua disseminação mundial, principalmente em isolados de K. pneumoniae, o que contribuiu drasticamente para o aumento das taxas de resistência aos carbapenens neste patógeno e nas demais enterobactérias (Cuzon et al., 2010). Em A. baumannii, a prevalência de carbapenemases de classe A é rara, quando comparado com as carbapenemases de classe B (item 2.5.5) e de classe D (item 2.5.6). Até o momento foram descritas as seguintes 44 Revisão Bibliográfica carbapenemases de classe A em A. baumannii: KPC-2, KPC-3, KPC-4 e KPC-10 (Porto Rico Robledo et al., 2010); GES-11 (França - Moubareck et al., 2009; Bélgica - Bogarerts et al., 2010) e GES-12 e GES-14 (Bélgica - Bogarerts et al., 2010; França - Bonnin et al., 2011). 2.5.1.5 - Produção de Carbapenemases de Classe B - Mβ βL As MβLs são enzimas que inicialmente pertenciam ao grupo 3 de Bush (Bush et al., 1995) e a classe molecular B de Ambler (Ambler, 1980). Após a atualização da classificação funcional (Bush & Jacoby, 2010), esta passou a incluir três subgrupos (3a, 3b e 3c), equivalentes as três subclasses moleculares (B1, B2 e B3), respectivamente. Os subgrupos 3a, 3b e 3c se diferem não só pelo seu alto grau de diversidade de sequência de aminoácidos, mas também nos seus sítios ativos. As MβLs das subclasses B1 e B3 contêm dois íons de zinco no sítio ativo, enquanto os membros da subclasse B2 contém apenas um íon de zinco (Bush & Jacoby, 2010; Cornaglia et al., 2011). Um valor ≥ 30% de diferença na sequência de aminoácidos é usado como ponto de corte para a classificação de uma enzima como uma nova MβLs (Cornaglia et al., 2007). Estão incluídas no subgrupo 3a (B1) as principais MβLs, sendo essas: IMP (38 variantes), VIM (34 variantes), NDM (sete variantes), SPM-1, GIM-1, SIM-1, AIM-1 e KHM-1 (Queenan & Bush, 2007; Cornaglia et al., 2011), sendo encontradas principalmente em isolados de P. aeruginosa e A. baumannii (Bush & Jacoby, 2010; Cornaglia et al., 2011). A maioria dessas MβLs aquiridas são codificadas por cassetes gênicos localizados em elementos genéticos móveis (integrons de classe 1), podendo estar inseridos tanto no cromossomo como no plasmídeo bacteriano (Walsh et al., 2005). O subgrupo 3b (B2) contém um pequeno grupo de MβLs que hidrolisam preferencialmente os carbapenens do que as penicilinas e as cefalosporinas (Walsh et al., 2005; Bush & Jacoby, 2010). Neste subgrupo está incluída a MβL cromossômica CphA de Aeromonas spp.. O grupo 3c (B3) incluí a MβL L1 que é intrínseca de Stenotrophomonas maltophilia (Walsh et al., 2005; Bush & Jacoby, 2010). 45 Revisão Bibliográfica As MβLs hidrolisam todos os β-lactâmicos comercialmente disponíveis, a exceção do aztreonam (Walsh et al., 2005). Essas enzimas caracterizam-se por geralmente: (i) necessitarem de dois íons divalentes, usualmente zinco, como co-fator para a atividade catalítica; (ii) por terem a estrutura tridimensional semelhantes; e (iii) por apresentarem resíduos conservados, os quais são responsáveis pela interação da enzima com cátions divalentes (Bush & Jacoby, 2010; Cornaglia et al., 2011). Além disso, essas enzimas são inibidas pelo ácido etilenodiaminoacético (EDTA) ou por compostos derivados do ácido tiolático (ácido mercaptopropiônico), não sofrendo ação dos inibidores das serino-β-lactamases, como o ácido clavulânico (Walsh et al., 2005; Bush & Jacoby, 2010; Cornaglia et al., 2011). Em um excelente estudo de revisão, Cornaglia e colaboradores (2011) relataram todas as MβLs descritas em A. baumannii até o momento: IMP-1 (Japão), IMP-2 (Itália), IMP-4 (China), IMP-5 (Portugal), IMP-8 (China), IMP-10 (Japão), VIM-1 (Grécia), VIM-2 (Coréia do Sul), VIM-3 (Tawain), VIM-4 (Grécia), VIM-11 (Tawain), SIM-1 (Coreia do Sul), NDM-1 (Índia) e NDM-2 (Emirados Árabes) (Cornaglia et al., 2011; Ghazawi et al., 2012). Além disso, diferentes MβLs foram descritas em outras espécies de Acinetobacter spp.: IMP-1 em A. ursingii (Japão - Endo et al., 2012), VIM-2 e SIM-1 em A. bereziniae (Coreia do Sul - Lee et al., 2010), IMP-4 em A. junii (Austrália - Peleg et al., 2006), NDM-1 em A. lwoffii (China - Fu et al., 2012) e NDM-1 em A. pittii (China - Fu et al., 2012). 2.5.1.6 - Produção de Carbapenemases de Classe D (CHDLs) As β-Lactamases de classe D (Ambler, 1980), ou oxacilinases, apresentam características tão diversas, que fazem dessas enzimas um grupo extremamente heterogêneo e complexo (Poirel et al., 2010). Devido a isso, as oxacilinases são classificadas em três subgrupos diferentes de Bush (Bush & Jacoby, 2010), sendo eles: (i) 2d - oxacilinases de espectro restrito, presente em enterobactérias, e capaz de hidrolisar fortemente a 46 Revisão Bibliográfica oxacilina/cloxacilina; (ii) 2de - oxacilinases do tipo ESβL (item 2.5.1.3), encontradas principalmente em P. aeruginosa (integrons de classe 1), hidrolisam bem, ainda que de maneira diferencial, as oximinocefalosporinas e cefepima; (iii) 2df - conhecidas como “CarbapenemHydrolyzing Class D β-Lactamase” (CHDLs), quase que exclusivamente restritas a A. baumannii, não hidrolisam as oximinocefalosporinas e cefepima, e hidrolisam fracamente os carbapenens (inferior às MβLs) (Bush & Jacoby, 2010; Poirel et al., 2010). Embora anteriormente as oxacilinases fossem definidas pela sua capacidade em hidrolisar oxacilina/cloxacilina mais rapidamente que as benzilpenicilinas, com o surgimento de variantes apresentando essa capacidade reduzida, atualmente se utiliza a hidrólise das aminopenicilinas e das carboxipenicilinas como característica primordial desse grupo de β-Lactamases (Poirel et al., 2010). As oxacilinases juntamente com as enzimas das classes A e C são serino-β-Lactamases (Poirel et al., 2010). Todas as oxacilinases apresentam três motivos conservados no seu sítioativo serina, sendo estes: STFK (posições 70 a 73), F/YGN (posições 144 a 146) e KTG (posições 216 a 218). As posições assinaladas anteriormente para os motivos conservados estão de acordo com o “DBL numbering system”, como descrito por Poirel e colaboradores (2010). O segundo motivo conservado é específico das oxacilinases, enquanto os outros dois são comuns também às classes A e C de Ambler (Walther-Rasmussen & Høiby, 2007). As oxacilinases usualmente não são inibidas pelos inibidores de serino-β-Lactamases (ácido clavulânico, tazobactam e sulbactam), mas geralmente são totalmente inibidas por cloreto de sódio (NaCl) a uma concentração de 100 mM (Poirel et al., 2010). Atualmente já foram descritas 250 variantes de oxacilinases, sendo a maioria CHDLs (http://www.lahey.org/Studies/). Embora Walther-Rasmussen e Høiby (2007) tenham dividido as CHDL em oito diferentes clusters, neste item somente serão discutidos os clusters descritos em A. baumannii. Sendo assim, até o momento, já foram descritos seis clusters diferentes de CHDLs 47 Revisão Bibliográfica neste micro-organismo, sendo estes: OXA-23, OXA-24, OXA-51, OXA-58, OXA-143 e OXA-182 (Brown & Amyes, 2006; Walther-Rasmussen & Høiby, 2007; Higgins et al., 2009; Kim et al., 2010; Poirel et al., 2010). A primeira CHDL descrita em A. baumannii, foi a OXA-23 em 1985 no Reino Unido (Panton et al., 1993), e na época foi chamada de ARI-1. Esta enzima apresenta uma identidade de sequência de aminoácidos de 56% com a OXA-51 (Poirel & Nordmann, 2006). O cluster OXA-23 apresenta sete variantes conhecidas, sendo estas a OXA-23, OXA-27, OXA-49, OXA-73, OXA-134 e OXA-146 (análise Laboratório ALERTA-UNIFESP). Assim como a maioria das CHDLs em A. baumannii, a OXA-23 hidrolisa fracamente os carbapenens, sendo necessário a presença de uma IS, geralmente a ISAba1 (ou ISAba4), a montante do gene, para conferir o aumento da expressão do gene que a codifica (Poirel & Nordmann, 2006). A OXA-23 tem sido descrita em diferentes países, demonstrando ser provavelmente a CHDL de A. baumannii mais prevalente no mundo (Queenan & Bush, 2007; Poirel et al., 2010), inclusive no Brasil (Carvalho et al., 2009;. Martins et al., 2009). Recentemente, Poirel e colaboradores (2008) encontraram OXA-23 em isolados de A. radioresistens, considerada uma espécie comensal e presente na pele de pacientes internados. Os autores concluíram que A. radioresistens constituiu o reservatório do gene que codifica a OXA-23, o qual foi transferido para A. baumannii (Poirel et al., 2008). Entre as CHDLs de A. baumannii, somente a OXA-23 foi descrita em uma enterobactéria, sendo um isolado de P. mirabilis (Bonnet et al., 2002). A segunda CHDL a ser descrita em A. baumannii foi a OXA-24 (idêntica à OXA-40) em 1997 na Espanha (Bou et al., 2000), e apresenta uma identidade de sequência de aminoácidos de 63% com a OXA-51 (Peleg et al., 2008). Atualmente o cluster OXA-24 engloba cinco variantes conhecidas, sendo elas: OXA-25, OXA-26, OXA-72, OXA-139 e OXA-160 (análise Laboratório ALERTA-UNIFESP). A variante OXA-24/40 é endêmica em Portugal e na Espanha e tem sido descrita nos Estados Unidos, enquanto a variante OXA-72 tem sido descrita em diferentes países do mundo (Poirel et al., 2010). Dentre todas as CHDLs, o cluster OXA-24 é o 48 Revisão Bibliográfica único, juntamente com a OXA-143 e a OXA-182, em que os genes codificadores dessas enzimas não estão relacionados a IS, o que sugere que essas enzimas sejam as mais potentes CHDLs em A. baumannii. O processo de mobilização dessas enzimas ocorre por um processo de recombinação homóloga (Poirel et al., 2010). Além disso, a OXA-24/40 também foi descrita em isolados de P. aeruginosa na Espanha (Sevillano et al., 2009). O terceiro cluster a ser descrito foi OXA-51, em 1994, na Argentina (Brown et al., 2005). Atualmente, existe mais de 65 variantes descritas (análise Laboratório ALERTA-UNIFESP), e durante muito tempo o cluster OXA-51 foi considerado como sendo codificado por um gene cromossomal e intrínseco de A. baumannii (Queenan & Bush, 2007; Walther-Rasmussen & Høiby, 2007), sendo dessa maneira utilizado para confirmação indireta da identificação da espécie. Entretanto, foi descrito recentemente na região de Tawain a presença desses genes tanto no cromossoma, como no plasmídeo em isolados de A. baumannii (Chen et al., 2010). Mais tarde esses plasmídeos foram encontrados em isolados clínicos de A. nosocomialis (Lee et al., 2012). Portanto, a presença do gene blaOXA-51-like não é presuntivo da identificação da espécie de A. baumannii. Além disso, assim como ocorre com os genes blaOXA-23-like e blaADC-like, os genes codificadores das CHDLs do cluster OXA-51 também estão associados com a ISAba1 para aumentar a sua expressão e dessa forma levar ao fenótipo de resistência aos carbapenens (Poirel & Nordmann, 2006; Queenan & Bush, 2007; Walther-Rasmussen & Høiby, 2007). O quarto cluster a ser descrito foi a OXA-58 em 2003 na França (Poirel et al., 2005) e apresenta uma identidade de sequência de 59% com a OXA-51 (Peleg et al., 2008). Já foram descritas duas variantes, sendo elas: OXA-96, OXA-97 e OXA-164 (análise Laboratório ALERTA-UNIFESP). Estudos avaliando o contexto genético da OXA-58, verificaram que o gene blaOXA-58-like pode estar associado a diferentes IS, como ISAba1, ISAba2, ISAba3 e IS18 (Poirel & Nordmann, 2006), todas relacionadas ao aumento da expressão do gene que codifica a OXA-58. Por último, recentemente, foram propostos dois novos clusters de CHDLs em A. baumannii, 49 Revisão Bibliográfica sendo estes os clusters OXA-143 (Higgins et al., 2009) e OXA-182 (Kim et al., 2010). O cluster OXA-143 foi descrito em um isolado brasileiro, em 2009, e o cluster OXA-182 descrito na Coréia do Sul, em 2010 (Higgins et al., 2009; Kim et al., 2010). Ambos os clusters apresentam alta identidade de sequência de aminoácidos (> 80%) com o cluster OXA-24 (Peleg et al., 2008; Poirel et al., 2010). Assim como ocorre com o cluster OXA-24, a OXA-143 e a OXA-182 não estão relacionadas à IS para aumentar a sua expressão. Dentre os clusters de CHDLs descritos em outras espécies, apenas merece destaque a CHDL plasmidial OXA-48 (Poirel et al., 2004), devido a repercussão que vem tomando nos últimos dois anos, associado a sua disseminação para diferentes espécies de enterobactérias em mais de 23 países da Europa e regiões vizinhas (Poirel et al., 2012). A produção de diferentes classes de cabapenemases, bem como os demais mecanismos de resistência aos βlactâmicos, em isolados clínicos de Acinetobacter spp. no Brasil, serão abordados detalhadamente na discussão. 2.5.2 - Impermeabilidade de Membrana Externa Bactérias Gram negativas apresentam uma parede celular complexa, composta por uma membrana externa, que é uma estrutura membranosa presente externamente à membrana citoplasmática e a camada de peptídeoglicano entre as duas membranas. A principal função da membrana externa é atuar como uma barreira permeável que elimina os compostos tóxicos à célula que existem no meio externo (Vila et al., 2007). O fato dessa membrana excluir compostos lipofílicos e grandes (> 600 daltons), muitos antimicrobianos tem pouca atividade contra bactérias Gram negativas, embora eles sejam ativos contra bactérias Gram positivas. Muito deste fluxo através da membrana ocorre por meio de canais formados por proteínas (Nikaido, 1994). 50 Revisão Bibliográfica Para muitos antimicrobianos, um grupo de proteínas de membrana externa (OMPs), conhecidas como porinas, capazes de formar canais constituídos de água no seu interior, é o principal meio de transporte através da membrana bacteriana (Nitzan et al., 2002). As porinas se diferem das demais OMPs por serem triméricas e, portanto, formam poros na membrana externa, enquanto as demais OMPs são monoméricas e não formam poros (Nikaido, 1994). As porinas são geralmente divididas em duas classes: porinas não específicas, que permitem a difusão de moléculas hidrofílicas abaixo de um certo tamanho, e porinas específicas, as quais facilitam a difusão de substratos específicos (Nikaido, 1994). O tamanho, a carga e a hidrofobicidade dos β-lactâmicos interferem na sua capacidade em atravessar os canais de uma porina. Sendo assim, moléculas de alto peso molecular e moléculas carregadas negativamente apresentam dificuldade em atravessar as porinas da célula bacteriana. Por outro lado, moléculas pequenas, zwiteriônicas ou com características hidrofílicas, como a cefepima e o imipenem, atravessam rapidamente pelas porinas (Nikaido, 1994). As porinas podem aumentar ou diminuir as taxas de penetração dos β-lactâmicos na célula bacteriana (Nitzan et al., 2002) e diferenças na permeabilidade da membrana externa variam de acordo com cada micro-organismo (Nikaido, 1994). Embora a produção de β-lactamases seja um tema bem caracterizado, os demais mecanismos relacionados a resistência aos β-lactâmicos ficaram relegados a quase total obscuridade. Uma das limitações do conhecimento a respeito da resistência aos carbapenens em Acinetobacter spp. é a falta de informação a respeito das porinas, e das propriedades de permeabilidade de sua membrana incluindo uma melhor caracterização das suas OMPs (Vila et al., 2007). Até agora, apenas poucas OMPs foram relatadas e suas funções ainda permanecem na maioria das vezes desconhecidas (Poirel & Nordmann, 2006; Vila et al., 2007). Acredita-se que o tamanho pequeno e o limitado número de porinas em Acinetobacter spp. seja o responsável pela resistência intrínseca aos antimicrobianos observada neste micro-organismo 51 Revisão Bibliográfica (Vila et al., 2007). Esse conceito que se tinha sobre a permeabilidade de A. baumannii foi em parte confirmado por um interessante estudo publicado recentemente (Sugawara & Nikaido, 2012). Nesse estudo, foi observado que a permeabilidade da membrama externa de A. baumannii para cefalotina e cefaloridina era 100 vezes menor do que a permeabilidade observada para a E. coli K12, demonstrando que naturalmente A. baumannii apresenta uma baixa permeabilidade de membrana externa (Sugawara & Nikaido, 2012). Além disso, foi observado que embora a OmpA, também conhecida como OmpHMP (36,5 kDa), apresente uma capacidade mínima de formar poros, quando o gene ompA foi deletado, houve uma diminuição de 2-3 vezes na permeabilidade para cefalotina e cefaloridina (Sugawara & Nikaido, 2012). Os autores concluem que a baixa permeabilidade dessa porina aliada à hiperexpressão de βlactamases intrínsecas, como as CHDLs do cluster OXA-51 e as cefalosporinases do tipo ADC/AmpC, e de sistemas de efluxo poderiam ser essenciais para os altos níveis de resistência intríseca observada para muitos antimicrobianos em isolados clínicos de A. baumannii (Sugawara & Nikaido, 2012). Embora ainda sejam poucos os estudos que avaliaram o papel das porinas na resistência aos carbapenens em A. baumannii, os dados obtidos mostram que essas proteínas desempenham um papel importante na resistência aos carbapenens (Limansky et al., 2002; Dupont et al., 2005; Mussi et al., 2005; Tomas et al., 2005). Sendo assim, Limansky e colaboradores (2002) demonstraram que a resistência a imipenem em um isolado de Acinetobacter spp. não produtor de carbapenemase, estava associada à perda de uma proteína de 29 kDa, designada CarO. Resultado semelhante foi observado por um estudo conduzido por Mussi e colaboradores (2005), no qual foi demonstrado que a resistência a imipenem e a meropenem em A. baumannii também estava associado a perda dessa porina, pela inativação do gene carO por uma IS. Recentemente, outros dois estudos, comparando a proteômica de isolados sensíveis e resistentes de A. baumannii, observeram alterações estruturais na CarO, 52 Revisão Bibliográfica principalmente nas estruturas primárias e quartenárias dessa porina (Siroy et al., 2006; Vashist et al., 2010). Foi também observado que as isoformas alteradas não transportavam eficientemente os carbapenens como a porina “selvagem” (Vashist et al., 2010). Dessa forma, isolados de A. baumannii resistentes, provavelmente, alterariam a CarO de modo a diminuir a entrada de carbapenem na célula bacteriana. Da mesma forma, outras duas porinas foram descritas relacionadas à resistência aos carbapenens em A. baumannii: uma proteína chamada 33-36 kDa (Tomas et al., 2005), com um tamanho estimado de 31 kDa, e outra de 43 kDa, que demonstra homologia peptídica com a OprD (D2) de P. aeruginosa (Dupont et al., 2005). Como nenhum sítio de ligação ao imipenem pode ser detectado na CarO, acredita-se que esta porina seja um canal inespecífico de entrada para os carbapenens (Siroy et al., 2005), enquanto a proteína de 43 kDa (OprD-like) seria o canal específico para estes antimicrobianos (Vila et al., 2007). Outra porina descrita em A. baumannii é a OmpW (21 kDa), que demonstra uma alta homologia com a OmpW de E. coli e P. aeruginosa. Embora sua função em A. baumannii ainda não esteja bem esclarecida, Vila e colaboradores (2007) observaram uma diminuição in vitro da expressão dessa porina em mutantes de A. baumannii resistentes à colistina (Vila et al., 2007). Entretanto, Tiwari e colaboradores (2012) avaliando a proteômica de isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens, observaram uma diminuição da expressão de OmpW, comparada com a cepa ATCC 19606 de A. baumannii sensível aos carbapenens. Embora, em um estudo similar, Siroy e colaboradores (2005) não tenham observado alteração na expressão da OmpW, eles relataram a presença de pelo menos quatro isoformas diferentes dessa OMP no gel de dodecil-sulfato de sódio em poliacrilamida - SDS-PAGE (Siroy et al., 2006). Vashist e colaboradores (2010) também observaram a presença de isoformas de OmpW e, em decorrência desse achado, os autores inferiram que era possível que a OmpW, sendo uma 53 Revisão Bibliográfica porina pequena, fosse importante para realizar a função de transporte na ausência ou alteração das porinas principais em isolados resistentes de A. baumannii (Vashist et al., 2010). 2.5.3 - Hiperexpressão de Sistemas de Efluxo Sistemas de efluxo são transportadores expressos em qualquer célula viva, protegendoa dos efeitos tóxicos de substâncias químicas orgânicas (Vila et al., 2007). Em bactérias, os genes codificadores desses sistemas estão majoriatariamente localizados no cromossomo ou em plasmídeos (Coyne et al., 2011), como é o caso do sistema de efluxo QepA que extrui especificamente fluoroquinolonas (Yamane et al., 2007). Os sistemas de efluxo podem ser específicos para um determinado substrato ou podem transportar uma gama de compostos estruturalmente diferentes, incluindo antimicrobianos de diferentes classes, como macrolídeos, aminoglicosídeos, quinolonas, cloranfenicol, tetraciclinas, trimetoprim e recentemente a tigeciclina (Piddock, 2006; Coyne et al., 2011). Dessa forma, o fenótipo MDR está frequentemente associado à hiperexpressão desses sistemas, já que reduzem o acúmulo de muitos antimicrobianos no interior da bactéria, ao mesmo tempo (Piddock, 2006; Vila et al., 2007; Coyne et al., 2011). Embora esses sistemas possam conferir diminuição da sensibilidade a muitos antimicrobianos, nem sempre essa diminuição resulta em resistência (Piddock, 2006). Cinco superfamílias de sistemas de efluxo estão associadas a resistências aos antimicrobianos em bactérias (Piddock, 2006; Coyne et al., 2011), sendo elas: transportadores do tipo ABC (ATP-Binding Cassette), superfamília MFS (Major Facilitator Superfamily), família MATE (Multidrug and Toxic Compound Extrusion), família SMR (Small Multidrug Resistance) e família RND (Resistance Nodulation Division). Uma sexta família é considerada por Poole (2002), sendo esta a superfamília DMT (Drug-Metabolite Transporter). Dentre essas famílias, a família RND engloba os mais importantes sistemas de efluxo em bactérias Gram negativas (Coyne et al., 2011), e é composta por três proteínas: (i) uma proteína transportadora, 54 Revisão Bibliográfica responsável pela ejeção (bomba), localizada na membrana interna (citoplasmática); (ii) uma proteína acessória ou de fusão localizada no espaço periplasmático; e (iii) uma OMP localizada na membrana da bactéria (Piddock, 2006; Coyne et al., 2011). O formato tripartido presente na família RND confere a ela a capacidade de ejetar o maior número possível de substratos diferentes, ao contrário dos sistemas de efluxo formados por somente uma única proteína, que, ejetam um número pequeno de compostos (Coyne et al., 2011). A família RND faz uso de prótons como força motriz, um gradiente eletroquímico no qual o movimento de íons de hidrogênio impulsiona o transporte do substrato (Piddock, 2006). Diversos sistemas de efluxo foram descritos em A. baumannii, a partir da análise dos cromossomas sequenciados (Coyne et al., 2011). Entretanto, até o momento, somente três sistemas do tipo RND (AdeABC, AdeIJK e AdeFGH), dois sistemas do tipo MFS (CraA e AmvA) e um sistema cada dos tipos MATE (AdeM) e SMR (AdeS) demonstraram estar envolvidos na ejeção de antimicrobianos (Vila et al., 2007; Coyne et al., 2011). O sistema AdeABC, é talvez o mais importante e conhecido. Ele é formado por três proteínas: AdeA que forma a proteína de fusão, AdeB que forma o componente trans-membrana e AdeC que forma a proteína de membrana externa. Este sistema é regulado por dois componentes o AdeR (repressor) e AdeS (sensor quinase), codificados por genes que estão no operon adeRS, localizado a motante do operon adeABC, e são transcritos em direção oposta (Marchand et al., 2004; Coyne et al., 2011). Mutações pontuais nestes componentes estão associadas à hiperexpressão desse sistema levando ao fenótipo de multirresistência em A. baumannii (Marchand et al., 2004). A inativação do gene adeB em isolados de A. baumannii que hiperexpressavam o sistema AdeABC, demonstrou que os principais substratos desse sistema são os aminglicosídeos, as fluoroquinolonas, as tetraciclinas, a tigeciclina, os macrolideos, o cloranfenicol, o trimetoprim e o brometo de etídio (Magnet et al., 2001; Marchand et al., 2004; Higgins et al., 2004). A real contribuição do sistema AdeABC na resistência aos carbapenens 55 Revisão Bibliográfica ainda não está esclarecida, uma vez que estudos utilizando inibidores de sistemas de efluxo, como a “phenyl-arginine-b-naphthylamide” (PAβN), mostraram resultados contraditórios (Pournaras et al., 2006; Peleg et al., 2007). Os resultados obtidos até o momento sugerem que esse sistema esteja relacionado à resistência a meropenem, mas não para imipenem em isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 que tiveram o gene adeB deletado (Wong et al., 2009). Provavelmente, somente a hiperexpressão do sistema AdeABC não seja suficiente para causar altos níveis de resistências aos carbapenens, necessitando da associação de outros mecanismos (Coyne et al., 2011). O sistema AdeIJK está relacionado com a resistência intrínseca à ticarcilina, às cefalosporinas, ao aztreonam, às fluoroquinolonas, às tetraciclinas, às lincosamidas, à rifampicina, ao cloranfenicol, ao trimetoprim, à novobiocina e ao ácido fusídico (Damier-Piolle et al., 2008). Entretanto, os aminoglicosídeos não são substratos para esse sistema (Coyne et al., 2010a). Embora o sistemas AdeABC e AdeIJK ejetem a tigeciclina, a associação desses dois sistema aumenta drasticamente a extrusão da mesma (Damier-Piolle et al., 2008; Coyne et al., 2011). Diferente do que ocorre com o sistema AdeABC, não foi encontrado nenhum gene regulatório do sistema AdeIJK (Damier-Piolle et al., 2008). O terceiro sistema da família RND em A. baumannii, AdeFGH, apresenta o AdeL como regulador da sua expressão. Os dados a respeito desse sistema demonstram que ele está associado com altos níveis de resistência às fluoroquinolonas, ao cloranfenicol, ao trimetoprim e à clindamicina e à diminuição da sensibilidade às tetraciclinas, à tigeciclina e ao sulfametoxazol (Coyne et al., 2010b). Entretanto, os aminoglicosídeos e os β-lactâmicos não são substratos para esse sistema (Coyne et al., 2010b). Além disso, o sistema AdeFGH não está presente em todos os isolados de A. baumannii (Coyne et al., 2011). Pelo menos dois sistemas de efluxo foram identificados em espécies de Acinetobacter spp., sendo outras que não A. baumannii (Coyne et al., 2011). O sistema AdeXYZ apresenta 56 Revisão Bibliográfica 97% de identidade com o sistema AdeIJK de A. baumannii e está presente em 90% dos isolados de A. pittii (Chu et al., 2006). Esse sistema está relacionado à resistência aos β-lactâmicos, à ciprofloxacina, à tetraciclina, à rifampicina e ao cloranfenicol. Já foi também encontrado em um isolado de A. nosocomialis e em um isolado de A. genoespécie 17 (Chu et al., 2006). O sistema AdeDE é encontrado em 70% dos isolados de A. pittii e também foi encontrado em A. nosocomialis e A. genoespécie 17 (Chu et al., 2006). Esse sistema apresenta 40% de identidade com o sistema AdeAB e ejetam aminoglicosídeos, carbapanens, ceftazidima, fluoroquinolonas, eritromicina, tetraciclina, rifampicina e cloranfenicol (Chau et al., 2006). Não foi encontrado um gene de porina no operon adeDE, demonstrando que o sistema deve recrutar outra proteína para fomar os sistema tripartido (Chau et al., 2006). 2.5.4 - Alteração das Proteínas Ligadoras de Penicilinas (PBPs) PBPs são uma família de enzimas que compartilham uma origem evolutiva comum. Essas enzimas catalisam a síntese de peptídeoglicano, o principal componente da parede celular bacteriana, e também estão associados com a morfogênese celular e com o complexo de divisão celular (Sauvage et al., 2008). As PBPs têm sido classificadas em dois grupos, as PBPs de alto peso molecular (HMM-PBP) e as PBPs de baixo peso molecular (LMM-PBP). Essa classificação baseia-se no peso molecular aparente no gel de SDS-PAGE, nas sequências de aminoácidos e nas funções celulares e enzimáticas das PBPs (Goffin & Ghuysen, 1998; Ghosh et al., 2008; Sauvage et al., 2008). De acordo com a estrutura do domínio N-terminal (Sauvage et al., 2008), as HMM-PBPS podem ser divididas em classe A (funcionalmente envolvidas nas reações de transpeptidação e transglicosilação) (Bertsche et al., 2005; Born et al., 2006) ou em classe B (funcionalmente envolvidas nas reações de transpeptidação, elongação ou divisão celular) (Den Blaauwen et al., 2003; Piette et al., 2004). Os LMM-PBPs ou de classe C, são DDcarboxipeptidades e/ou endopeptidases envolvidas na separação celular durante o processo de 57 Revisão Bibliográfica divisão, na maturação do peptideoglicano ou na reciclagem da parede celular bacteriana (Ghosh et al., 2008). As transglicosilases monofuncionais (MGTs) é um grupo de enzimas presentes em algumas bactérias, com um único domínio glicosiltransferase semelhante às PBPs de classe A, cuja função é ainda desconhecida (Spratt et al., 1996; Sauvage et al., 2008). As PBPs são o sítio alvo dos β-lactâmicos e estão relacionadas a síntese do peptídeoglicano, principal componente da parede celular bacteriana. A afinidade dos βlactâmicos a estas proteínas é bem variada e mutações podem alterar a sua estrutura levando a uma baixa afinidade de ligação aos β-lactâmicos ou a produção de PBPs suplementares que também podem apresentar baixa afinidade. A mudança na conformação das PBPs leva a resistência aos β-lactâmicos (Zapun et al., 2008). A inibição das PBPs produz um desequilíbrio no metabolismo da parede celular bacteriana, resultando na inibição do crescimento ou lise. O que acontece entre a inibição das PBPs e o resultado biológico decorrente ainda permanece mal compreendido (Zapun et al., 2008). Recentemente, um estudo conduzido por Moya e colaboradores (2009), mostrou pela primeira vez que o papel das PBPs na resistência aos carbapenens em Gram negativos poderia ser muito mais complexo e fascinante do que se poderia imaginar. Nesse estudo os autores observaram que a PBP4, em P. aeruginosa, funciona como uma “armadilha” para os βlactâmicos. Uma vez se ligado a essa PBP, é desencadeado uma complexa e eficiente reposta conduzida pela hiperprodução de AmpC e ativação do sistema de dois componentes CreBC (Moya et al., 2009). O mesmo grupo de pesquisa publicou um outro estudo no qual observaram que a hiperprodução de AmpC e a ativação do sistema de dois componentes CreBC pela inativação da PBP4 ocorre de maneira diferencial em uma coleção não relacionadas clonalmente de P. aeruginosa (Zamorano et al., 2010). Esses dois estudos representam um marco na maneira como se consideravam o papel das PBPs na resistência aos carbapenens em bacilos Gram negativos. 58 Revisão Bibliográfica De todos os estudos descritos enfocando as bases bioquímicas e genéticas da resistência aos carbapenens em isolados de A. baumannii, raríssimos são aqueles que se dedicaram a estudar o papel dos genes codificadores das proteínas ligadoras de penicilinas (PBPs) nesse fenótipo em A. baumannii (Gehrlein et al., 1991; Obara et al., 1991; FernándezCuenca et al., 2007; Russo et al., 2009; Yun et al., 2011). Estudos publicados da década de 90 avaliando o perfil das PBPs de A. baumannii através do gel de SDS-PAGE, encontraram PBPs com baixa afinidade para os carbapenens (Gehrlein et al., 1991; Obara & Nakae, 1991; Urban et al., 1995). Gehrlein e colaboradores (1991) observaram sete PBPs em um isolado clínico de A. baumannii com aparentes tamanhos moleculares no gel de SDS-PAGE de 94, 84, 65, 61, 48, 40 e 24 kDa. No estudo de Gehrlein e colaboradores (1991) foi observado que, na presença de imipenem, ocorre uma complexa reorganização das PBPs que leva a resistência aos carbapenens in vitro. Já Fernández-Cuenca e colaboradores (2003), usando géis de SDS-PAGE a 12% marcado com ampicilina e 125I, avaliaram isolados clínicos sensíveis e resistentes aos carbapenens. Os isolados resistentes mostraram expressão reduzida de uma PBP de 73,2 kDa, chamada PBP2, associada com a produção de CHDLs e, em alguns isolados, com a perda de um porina de 22,5 kDa. Em outro estudo, foi relatado um isolado clínico de A. baumannii resistente a imipenem mostrando PBPs com baixa afinidade para os inibidores de β-lactamase, principalmente o ácido clavulânico (Urban et al., 1995). O mesmo estudo também mostrou que o sulbactam se liga melhor às PBPs do que tazobactam, mesmo nos isolados resistentes a imipenem, o que pode explicar a satisfatória atividade deste composto frente a isolados de A. baumannii multirresistentes (Piette et al., 2004; Michalopoulos & Falagas, 2010). Obara & Nakae (1991) avaliaram 12 isolados de A. calcoaceticus sensíveis a imipenem, detectando seis PBPs no gel de SDS-PAGE com tamanhos de 94, 92, 86, 74, 59 e 42 kDa. Mutantes selecionados in vitro e que apresentavam resistência à cefoxitina, à cefoperazona ou à ceftazidima, mostraram expressão reduzida de porinas, bem como alterações na expressão das 59 Revisão Bibliográfica PBPs (Obara & Nakae, 1991). Em um estudo recente, Yun e colobaradores (2011) avaliaram a regulação proteômica de um isolado de A. baumannii resistente a imipenem sob condições de estresse causadas por diferentes antimicrobianos. Na presença de imipenem, eles observaram um aumento dos níveis de transcrição dos genes codificadores de PBPs ponA (PBP1a), ftsI (PBP3) e dacC (PBP5/6), dos sistemas de efluxo AdeABC e AdeJIK, e da β-lactamases cromossomal AmpC. Entretanto, foi observada a repressão dos genes codificadores das proteínas de membrana externa OmpHMP (OmpA-like) e OmpW. Esses dois estudos (Obara & Nakae, 1991; Yun et al., 2011) demonstram uma associação complexa e multifatorial na resistência aos carbapenens em A. baumannii. 60 Apresentação 3 - Apresentação Nesta tese de doutorado serão apresentados sete artigos, sendo quatro destes recentemente publicados no Antimicrobial Agents and Chemotherapy (AAC), Journal of Antimicrobial Chemotherapy (JAC) e Journal of Medical Microbiology (JMM), e os outros três em fase de submissão. Quatro desses artigos foram realizados durante meu estágio de doutorado Sanduíche, com bolsa do Programa de Doutorado com Estágio no Exterior (PDEE) da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), no período de fevereiro de 2009 a janeiro de 2010, e com bolsa de estudos finaciada pelo “Instituto de Formación e Investigación Marqués de Valdecilla - IFIMAV” no período de fevereiro a outubro de 2010. O estágio foi realizado no “Laboratório de Investigación” do “Servício de Microbiología” do “Hospital Universitário Marqués de Valdecilla - HUMV”, sob supervisão do Professor Dr. Luis Martínez Martínez. O HUMV está localizado na cidade de Santander, capital da “Comunidad Autonoma de Cantabria”, norte da Espanha, sendo um dos mais importantes centros hospitalares e de pesquisa médica desse país. 61 Artigos Científicos 4 - Artigos Científicos 4.1 - Artigo Científico 1: Analysis of genes encoding penicillin-binding proteins in clinical isolates of Acinetobacter baumannii. Publicado em Dezembro de 2011 no periódico “Antimicrobial Agents and Chemotherapy (AAC)”, volume 55, número 12, páginas 5907-5913. Os resultados parciais desse estudo também foram apresentados na forma oral na seção de resistência em Acinetobacter spp. no “8th International Symposium on the Biology of Acinetobacter”, realizado no período de 1 a 3 de setembro de 2010 na cidade de Roma, Itália. 4.2 - Artigo Científico 2: OXA-207: a novel OXA-24 variant associated with carbapenem resistance in Acinetobacter pittii in Spain. Os resultados parciais desse estudo foram apresentados na forma oral e pôster na no “XIV Congreso de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica - SEIMC”, realizado no período de 19 a 22 de maio de 2010 na cidade de Barcelona, Espanha. O presente artigo será submetido ao periódico “Antimicrobial Agents and Chemotherapy (AAC)”. 4.3 - Artigo Científico 3: Diversity of Emerging Acinetobacter Species in a Tertiary University Hospital in the North of Spain. Os resultados parciais desse estudo foram apresentados na forma de pôster na no “European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases - ECCMID”, realizado no período de 7 a 10 de maio de 2011 na cidade de Milão, Itália. O presente artigo será submetido ao periódico “Journal of Antimicrobial Chemotherapy (JAC)”. 4.4 - Artigo Científico 4: Bloodstream infection caused by Acinetobacter junii in a Patient with Acute Lymphoblastic Leukaemia after Allogenic Haematopoietic Cell Transplantation. Publicado em Março de 2011 no periódico “Journal of Medical Microbiology (JMM)”, volume 60, número 3, páginas 375-377. 62 Artigos Científicos 4.5 - Artigo Científico 5: Low prevalence of blaOXA-143 in private hospitals in Brazil. Publicado em Setembro de 2011 no periódico “Antimicrobial Agents and Chemotherapy (AAC)”, volume 55, número 9, páginas 4494-4495. 4.6 - Artigo Científico 6: Temporal Dynamic of Carbapenemase-producing Acinetobacter baumannii (Acb) in a Brazilian Teaching Hospital Through an 18-Year Period: Earlier Dissemination of blaOXA-143 in Brazil. Os resultados parciais desse estudo foram apresentados na forma de pôster na no “51th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy - ICAAC”, realizado no período de 17 a 20 de setembro de 2011 em Chicago, Estados Unidos. O presente artigo será submetido ao periódico Antimicrobial Agents and Chemotherapy (AAC). 4.7 - Artigo Científico 7: Detection of OXA-231, a new variant of blaOXA-143, in Acinetobacter baumannii from Brazil: a case report. Aceito para publicação em Junho de 2012 no periódico “Jornal of Antimicrobial Chemotherapy (JAC)”. Os resultados parciais desse estudo também foram apresentados na forma oral no “26º Congresso Brasileiro de Microbiologia CBM”, realizado no período de 2 a 6 de outubro de 2011 na cidade de Foz do Iguaçu, Brasil. 63 Artigos Científicos - Espanha Analysis of Genes Encoding for Penicillin-Binding Proteins in Clinical Isolates of Acinetobacter baumannii Rodrigo Cayô1*, María-Cruz Rodríguez1§, Paula Espinal2, Felipe Fernández-Cuenca3, Alain A. Ocampo-Sosa1, Álvaro Pascual3, Juan A. Ayala4, Jordi Vila2 and Luis Martínez-Martínez1,5. Short running title: Analysis of Penicillin-Binding Proteins in A. baumannii. 1Service of Microbiology, University Hospital Marqués de Valdecilla - IFIMAV, Santander, Spain; 2Service of Microbiology, Hospital Clinic, School of Medicine, University of Barcelona, Barcelona, Spain; 3Service of Microbiology, University Hospital Virgen Macarena, Seville, Spain; 4Centro de Biología Molecular Severo Ochoa - CSIC-UAM, Campus de Cantoblanco, Madrid, Spain. 5Department §Current of Molecular Biology, School of Medicine, University of Cantabria, Santander, Spain. address: Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria, Santander, Spain. *Corresponding author. Current Address: Laboratorio Especial de Microbiologia Clínica - LEMC/ALERTA, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, Rua Leandro Dupret, 188, Vila Clementino, 04025-010, São Paulo - SP, Brazil. Tel.: +55 11 50812965. Fax.: +55 11 50812965. E-mail: [email protected]. 64 Artigos Científicos - Espanha ABSTRACT There is limited information on the role of penicillin-binding proteins (PBPs) in the resistance of Acinetobacter baumannii to β-lactams. This study presents an analysis of the allelic variations of PBP genes in A. baumannii isolates. Twenty six A. baumannii clinical isolates (susceptible or resistant to carbapenems) from three teaching hospitals in Spain were included. Antimicrobial susceptibility profile, clonal pattern and genomic species identification were also evaluated. Based on the six complete genomes of A. baumannii, the PBP genes were identified and primers were designed for each gene. The nucleotide sequences of the genes identified that encode PBPs and the corresponding amino acid sequences were compared with those of the ATCC 17978. Seven PBP genes and one monofunctional transglycosylase (MGT) gene were identified in the six genomes, encoding (i) four high molecular mass proteins (two of class A, PBP1a [ponA] and PBP1b [mrcB], and two of class B, PBP2 [pbpA/mrdA] and PBP3 [ftsI]), (ii) three lowmolecular-mass proteins (two of Type-5, PBP5/6 [dacC] and PBP6b [dacD], and one of Type-7 (PBP7/8 [pbpG]), and (iii) a monofunctional enzyme (MtgA [mtgA]). Hotspot mutation regions were observed, although most of the allelic changes found translated into silent mutations. The amino acid consensus sequences corresponding to the PBP genes in the genomes and the clinical isolates were highly conserved. The changes found in amino acid sequences were associated with concrete clonal patterns but were not directly related to susceptibility or resistance to β-lactams. An insertion sequence disrupting the gene encoding the PBP6b was identified in an endemic carbapenem-resistant clone in one of the participant hospitals. 65 Artigos Científicos - Espanha INTRODUCTION Acinetobacter baumannii is an opportunistic nosocomial pathogen responsible for a variety of serious infections, especially in intensive care units (ICU) (23,27). Its ability to survive on dry surfaces (6,21,41) and to acquire antimicrobial resistance, as well as being suited for genetic exchange have contributed to the success and longevity of this microorganism to cause epidemic spread outbreaks (19). Carbapenems are currently one of the few options for treatment of infections caused by multi-drug resistant A. baumannii (15). However, since the early 1990s, the frequence of outbreaks caused by carbapenem-resistant A. baumannii isolates has increased worldwide (5,16), becoming a significant public health concern (40). The mechanisms underlying resistance to carbapenems in A. baumannii include: (I) the production of beta-lactamases, particularly acquired carbapenem-hydrolyzing class D βlactamases (CHDLs) (7,31), metallo-β-lactamases (30) and in rare cases, class A carbapenemases (32); (II) outer membrane impermeability, associated with the loss or decreased expression of porins (25) and, probably, (III) the overproduction of efflux pumps (20). However, there is limited information on the role of penicillin-binding proteins (PBPs) on this phenotype in A. baumannii (12,13,26). PBPs are a family of enzymes that share a common evolutionary origin. These enzymes catalyze the synthesis of peptidoglycan, the primary component of the bacterial cell wall, and are also associated with cell morphogenesis and cell division complex (33). PBPs have been classified into two groups, the high-molecular-mass (HMM) and low-molecular-mass (LMM) PBPs, according to their apparent molecular weights on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) gels, their amino acid sequences, and their enzymatic and cellular functions (4,14,17,33). The HMM PBPs can be divided in class A (transpeptidase/glycosyltransferase activities) (2,3) or class B (transpeptidase activity, elongase activity or divisome) (10,29), depending on the structure of their N-terminal domain (33). The 66 Artigos Científicos - Espanha LMM PBPs or class C PBPs, are DD-carboxypeptidades and/or endopeptidases involved in cell separation, peptidoglycan maturation or recycling (14). The monofunctional enzymes (MGTs) is a group of enzymes present in some bacteria, with a single glycosyltransferase domain similar to those of class A PBPs, and their function is still unknown (35). This study aimed to determine the nucleotide sequences of the genes encoding for PBPs in A. baumannii and to analyze their allelic variations in isolates susceptible or resistant to β-lactams. (This work was presented in part as an oral presentation at the 8th International Symposium on the Biology of Acinetobacter in Rome, 2010). 67 Artigos Científicos - Espanha MATERIALS AND METHODS Bacterial isolates. A total of 26 nonduplicate A. baumannii clinical isolates, presenting different carbapenem susceptibility profiles were collected in three teaching hospitals in Spain: the University Hospital Marqués de Valdecilla, Santander (n = 12), the Hospital Clínic, Barcelona (n = 12), and the University Hospital Virgen Macarena, Seville (n = 2) (Table 1). The two isolates from the third hospital have been described previously (12). These isolates were representative of the most prevalent clones in each institution. Presumptive identification of the isolates as A. baumannii was carried out by amplifying the complete open reading frame of blaOXA-51-like gene, which is considered chromosomally intrinsic to A. baumannii (31), using primers pairs OXA-69A and OXA69B as described previously (18). Both primers were also used to detect the presence of ISAba1 upstream of the blaOXA-51-like gene (18). Amplified rRNA gene restriction analysis (ARDRA), using the CfoI, AluI, MboI, RsaI, and MspI enzymes, was carried out as described previously (39), to confirm the genomic species identification of A. baumannii. The reference strain A. baumannii RUH-134 (11) was included as control for both genomic identification and PCR amplification of PBP genes. Testing of susceptibility to antimicrobial drugs. Tigecycline and colistin MICs were determined at the three participating centers by broth microdilution according to Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) guidelines (8). The MICs of imipenem, meropenem, cefepime, ceftazidime, ceftriaxone, cefotaxime, aztreonam, amikacin, gentamicin, minocycline and ciprofloxacin were also determined by microdilution for the isolates from the Hospital Clínic and University Hospital Virgen Macarena, but for the isolates from the University Hospital Marqués de Valdecilla, the MICs of these drugs were determined with Etest strips according to the manufacturer’s (AB bioMérieux, Solna, Sweden) recommendations. The 68 Artigos Científicos - Espanha results for tigecycline were interpreted according to the U.S. Food and Drug Administration (FDA) breakpoints for Enterobacteriaceae (for susceptibility, ≤ 2 µg/mL; for intermediacy, 4 µg/mL, for resistance, ≥ 8 µg/mL), and the results for the other antimicrobial agents tested were interpreted according to the CLSI breakpoints (9). Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Escherichia coli ATCC 25922 were used as quality control strains. Molecular typing by PFGE. The clonal relationships of the A. baumannii isolates were determined by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) using the ApaI restriction enzyme (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN), as described elsewhere (34). The restriction fragments were separated on 1% (wt/vol) agarose gels in 0.5% Tris-borate-EDTA (TBE) buffer in a CHEF-DR (contour-clamped homogeneous electric field–dynamically regulated) III Mapper electrophoresis system (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) for 19 h at 14°C using a pulse ramping rate changing from 5 to 20 s at 6 V/cm. DNA fingerprints were interpreted as recommended by Tenover et al. (37). The reference strains A. baumannii RUH-875 and RUH-134 (11), representatives of major international clones I and II, respectively, were also used as comparators. Identification of PBP genes. The genes encoding PBPs were identified on the basis of the six complete genomes of A. baumannii that had been deposited in GenBank by the time this study was started. The following organisms were considered: A. baumannii strains AB0057 (accession no. NC_011586), ATCC 17978 (accession no. NC_009085), SDF (accession no. NC_010400), AYE (accession no. NC_010410), ACICU (accession no. NC_010611), and AB307-0294 (accession no. NC_011595). Consensus sequences were obtained for each PBP gene identified, and a series of primers for PCR amplification and sequencing was designed, as listed in Table S1 in the supplemental 69 Artigos Científicos - Espanha material. The A. baumannii genomes deposited in GenBank after the beginning of this study were also considered for comparison and analysis of the PBP genes. These genomes include those of A. baumannii strains AB056 (accession no. NZ_ADGZ01000571), AB058 (accession no. NZ_ADHA01000108), AB059 (accession no. NZ_ADHB01000264), AB900 (accession no. NZ_ABXK01000007), and ATCC 19606 (accession no. NZ_ACQB00000000). Analysis of the PBP genes in A. baumannii clinical isolates. Genomic DNA from clinical isolates was extracted with InstaGeneTM Matrix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), according to manufacturer’s recommendations. PBP genes were amplified by PCR using the following conditions: 95ºC for 5 min, followed by 35 cycles of 95ºC for 30 s, 55ºC for 30 s and 72ºC for 1 to 3 min, according to the amplicon size, followed by 72ºC for 7 min. PCR products were analyzed on a 1 % (w/v) agarose gels stained with ethidium bromide. PCR products were purified by using a High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Bidirectional DNA sequencing was performed by Macrogen Inc. (Seoul, South Korea). Each PBP gene was named and classified based on the homologies obtained with others PBP sequences from different microorganisms, deposited in the GenBank, as well as on the recognition of the conserved motifs. All PBP sequences were compared with those of A. baumannii ATCC 17978 (1). Analysis of the PBP genes in A. baumannii clinical isolates. Genomic DNA from clinical isolates was extracted with InstaGene Matrix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) according to the manufacturer’s recommendations. PBP genes were amplified by PCR under the following conditions: 95°C for 5 min, followed by 35 cycles of 95°C for 30 s, 55°C for 30 s, and 72°C for 1 to 3 min, according to the amplicon size, and finally 72°C for 7 min. PCR products were analyzed on 1% (wt/vol) agarose gels stained with ethidium bromide. PCR 70 Artigos Científicos - Espanha products were purified by using a High Pure PCR product purification kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Bidirectional DNA sequencing was performed by Macrogen Inc. (Seoul, South Korea). Each PBP gene was named and classified on the basis of homology with other PBP sequences from different microorganisms deposited in GenBank, as well as by the recognition of conserved motifs. All PBP sequences were compared with those of A. baumannii ATCC 17978 (1). Nucleotide sequence accession numbers. The nucleotide sequences of the PBP genes of the A. baumannii clinical isolates in this study have been deposited in the GenBank nucleotide sequence database and were assigned the following accession numbers, according to each PBP/MTG gene and strain: for ponA, JF746077 to JF746102; for mrcB, JF746103 to JF746128; for pbpA, JF745973 to JF745998; for ftsI, JF745999 to JF746024; for dacC, JF746025 to JF746050; for dacD, JF746051 to JF746074; for pbpG, JF746129 to JF746154; and for mtgA, JF745947 to JF745972. 71 Artigos Científicos - Espanha RESULTS PBP genes in A. baumannii. Seven PBP genes and one MTG gene were identified in the six A. baumannii genomes analyzed in this study (Table 2). Four HMM PBPs were found: PBP1a (encoded by ponA), PBP1b (mrcB), PBP2 (pbpA or mrdA), and PBP3 (ftsI). According to their N-terminal domains, they were assigned to class A (PBP1a and PBP1b) or class B (PBP2 and PBP3). Sequence alignment revealed the five conserved motifs [EDXXFXXHXG, GXSTXX(M/Q)QXXK, RKXXE, KXXIXXYXN, and RXXXXL (where X is any amino acid)] of the glycosyltransferase N-terminal domain in both HMM class A PBPs (Fig. 1A). In the C-terminal penicillin-binding (PB) domain, with transpeptidase activity, the residue following motif 3 [K(T/S)GT] was a threonine in class A PBPs (KTGTT for PBP1a and KSGTT for PBP1b) and an alanine in class B PBPs (KTGTA), as expected (Fig. 1B). The HMM class A PBPs, PBP1a and PBP1b, are the major transglycosylases-transpeptidases in A. baumannii and are probably involved in the elongation of non-cross-linked glycan chains of peptidoglycan. The presence of an aspartic acid residue at the third position of motif 2 (SXD) in the active site of PBP2 (pbpA) and the presence of an asparagine residue at the same position in PBP3 confirmed the classification of these PBPs into subclasses B2 and B3, respectively (Fig. 1C). Both PBP2 and PBP3 are monofunctional transpeptidases. PBP2 is a member of subclass B2, a group of proteins involved in cell elongation. PBP3, as a member of subclass B3, is probably associated with cell division. The fstI gene was localized in the A. baumannii genomes in an operon with the mraW, mraY, ftsL, murE, and murF genes, which are associated with the divisome. MtgA (encoded by mtgA) is a monofunctional transglycosylase with a glycosyltransferase domain similar to those of PBP1a and PBP1b. Three LMM PBPs have been found in A. baumannii: PBP5/6 (encoded by dacC), PBP6b (dacD), and PBP7/8 (pbpG). These LMM PBPs are associated with cell separation and the maturation or 72 Artigos Científicos - Espanha recycling of peptidoglycan. Analysis of the genes encoding PBP5 and PBP6 in A. baumannii genomes showed that they are identical at the nucleotide and amino acid levels. Thus, this PBP is referred to as PBP5/6 (dacC). This PBP and PBP6b (dacD) were classified as class C type 5 PBPs, and both are presumably D-Ala-D-Ala-carboxypeptidases. PBP7/8 (pbpG) is a class C type 7 PBP with putative endopeptidase activity. No class C type 4 PBP genes seem to be present in A. baumannii. Hot spot mutations in PBP genes and β-lactam resistance. The 26 clinical isolates were identified as A. baumannii by ARDRA, and all isolates carried a blaOXA-51 allele (Table 1). PFGE profile analysis revealed that the 26 isolates were categorized into 11 different clones. All A. baumannii isolates were susceptible to colistin and tigecycline, with MICs ranging from 0.25 to 1 µg/ml and 0.5 to 1 µg/ml, respectively. Minocycline also showed good coverage against the A. baumannii isolates tested (73.1% susceptibility; MIC at which 50% of isolates were inhibited [MIC50], 2 µg/ml). High resistance rates were observed for expandedspectrum cephalosporins (MIC50, 32 µg/ml), cefepime (MIC50, ≥ 32 µg/ml), and aztreonam (MIC50, >16 µg/ml). The MICs of imipenem and meropenem ranged from 0.25 to >32 µg/ml, and for 53% of the isolates, the MICs of both these antimicrobial agents were >32 µg/ml. The majority of the isolates were resistant to ciprofloxacin (MIC50, >2 µg/ml) and aminoglycosides (MIC50s, >8 µg/ml for gentamicin and >16 µg/ml for amikacin). All the A. baumannii isolates resistant to carbapenems (n = 14) carried the plasmid-borne carbapenemase gene blaOXA-24 or the insertion sequence ISAba1 upstream of the chromosomal blaOXA-51-like gene and/or AmpC (data not shown). Analysis of the nucleotide sequences of the seven PBP genes and one MGT gene in the A. baumannii clinical isolates revealed specific hot spot mutation regions in all genes. However, most of the allelic variations observed were silent mutations (data not shown). The main changes in the different PBP genes relative to the sequences of strain ATCC 17978 are shown in Table 3. 73 Artigos Científicos - Espanha Although a few mutations were found in the amino acid sequences of the PBPs, none of these mutations could be related to β-lactam resistance. The observed changes in the amino acid sequence were associated with specific clonal patterns, and in general, the same mutations were observed in organisms from the different hospitals as well as in the 10 genomes already sequenced (Table 4). Interestingly, comparison of the amino acid consensus sequence corresponding to each PBP gene in the A. baumannii genomes deposited in GenBank with the corresponding amino acid consensus sequence of the 26 A. baumannii clinical isolates showed that these genes were highly conserved (identity, 99.6% to 100.0%). In two isolates (HUMV-1319 and HUMV-5118) of an endemic carbapenem-resistant clone (MIC, >32 µg/ml) from one of the participating centers, PCR amplification of the carboxypeptidase PBP6b gene showed a fragment of 2,410 bp instead of the expected 1,320 bp. Sequencing of this amplicon indicated the presence of an insertion sequence (IS) disrupting the PBP6b gene. This IS was identical to an IS30 family transposase found in the genome of A. baumannii strain ACICU and was similar to ISAba125, differing only in His222Tyr codons in the transposase gene. Two imperfect inverted repeats (IR-L [AAACTTGAAGTCGACA] and IR-R [TGTCGCACCTCA TGTTT]) bordering the transposase gene were also identified. The IS was not found in the carO gene in these two isolates (data not shown). 74 Artigos Científicos - Espanha DISCUSSION PBPs are involved in the metabolism of peptidoglycan, an essential component of the bacterial cell wall (33). β-Lactams mimic the D-Ala-D-Ala dipeptide and act as suicide inhibitors binding covalently to the PBPs (45). Inhibition of PBPs causes instability in the cell wall, resulting in growth inhibition or lysis (42). In this study, seven PBP genes and one MGT gene were found in the genomes of several A. baumannii strains, encoding PBP1a, PBP1b, PBP2, PBP3, PBP5/6, PBP6b, PBP7/8, and MtgA. The amino acid sequences of these PBPs in the A. baumannii clinical isolates were compared with those in strain ATCC 17978. This strain was isolated in the early 1950s (1), prior to the development of the majority of the antimicrobial agents used in clinical practice. This comparison showed that PBP genes are highly conserved in all A. baumannii strains analyzed. The few point mutations observed could not be associated with carbapenem resistance, since they were found in both susceptible and resistant strains. Some point mutations were observed in specific isolates, especially in the genome of strain SDF (Table 4), a multisusceptible A. baumannii strain. It is most probable that these variations are associated with clonal patterns. PBPs with low affinity for β-lactams had been described for Acinetobacter spp. (13, 26, 38). Gehrlein et al. (13) described seven PBPs in an A. baumannii clinical strain with apparent molecular sizes of 94, 84, 65, 61, 48, 40, and 24 kDa, based on phenotypic assays; the first six could be identified as PBP1a (94.74 kDa), PBP1b (88.26 kDa), PBP2 (74.42 kDa), PBP3 (67.66 kDa), PBP5/6 (48.84 kDa), and PBP6 (41.78 kDa), respectively, but the last PBP did not correlate with PBP7/8 (36.86 kDa). They also observed that imipenem could select in vitro for a resistant A. baumannii mutant showing a complex reorganization of PBPs. Because no alterations in outer membrane proteins (OMPs) or in β-lactamase production were detected in the imipenemresistant mutant, the authors associated the alterations in PBP profiles with the observed 75 Artigos Científicos - Espanha imipenem resistance. In another study, Obara and Nakae (26) evaluated 12 imipenemsusceptible strains of Acinetobacter calcoaceticus and detected six PBP bands of 94 (PBPla), 92 (PBPlb), 86 (PBPlc), 74 (PBP2), 59 (PBP3), and 42 (PBP4) kDa. In vitro-selected mutants resistant to cefoxitin, cefoperazone, or ceftazidime showed reduced expression of porins, as well as alterations in PBP expression and/or affinity for β-lactams. In another study, an imipenemresistant nosocomial strain of A. baumannii showing PBPs with low affinity for β-lactamase inhibitors, especially clavulanic acid, was reported (38). This study also showed that sulbactam bound to PBPs better than tazobactam, even in imipenem-resistant strains, which may explain the satisfactory in vitro activity of sulbactam against some multidrug-resistant A. baumannii isolates (22, 28). Fernández-Cuenca et al. (12) used 12% SDS-PAGE gels marked with 125I-labeled ampicillin to evaluate the PBP profiles of two groups of A. baumannii isolates with imipenem and meropenem MICs of 0.25 to 2 µg/ml and 4 to 32 µg/ml, respectively. Isolates HUS-31 and HUS-457, included in the present study, are representative of these two groups, respectively. Isolates with carbapenem MICs of ≥4 µg/ml showed reduced expression of a 73.2-kDa PBP named PBP2 (which may correspond to the PBP2 identified in this study [74.42 kDa]), associated with the production of several β-lactamases, including oxacillinases (which has been confirmed in the present study), and, in some isolates, with the loss of a 22.5-kDa porin. We have not observed any mutations in PBP2 (or any other PBP) of strain HUS-457, suggesting that regulatory mechanisms could be involved in the reported decreased expression of the 73.2-kDa protein in this isolate. An IS has been found to disrupt the dacD gene (encoding PBP6b) in two isolates of a carbapenem-resistant endemic clone. This IS is similar to ISAba125, which was previously reported to disrupt the carO gene (25), coding for a porin associated with resistance to carbapenems in A. baumannii. Although E. coli mutants lacking one or all of the LMM PBPs failed 76 Artigos Científicos - Espanha to substantially affect cell division or elongation (14), Moya et al. (24) have reported that in P. aeruginosa, inactivation of the dacB gene (encoding the nonessential PBP4, but absent in A. baumannii) is associated with a complex high-level β-lactam resistance, triggering ampC overproduction and the specific activation of the CreBC two-component regulator, which also activates the expression of β-lactamase in an Aeromonas PBP4-like mutant (36). Zamorano et al. (44) also showed that dacB inactivation produced significantly higher MICs of antipseudomonal penicillins and cephalosporins than ampD inactivation. We may speculate that the importance of inactivation of the PBP6 gene in carbapenem resistance might be marginal. It was observed in only 2 of the 14 carbapenem resistant isolates we studied (both of which belonged to the same clone), in which resistance can be explained by the production of OXA-24. In fact, other OXA-24producing isolates are also resistant to carbapenems (Table 1), even though they do not have an inactivated PBP6 gene. Unfortunately, attempts to silence the dacD gene in the carbapenem susceptible A. baumannii strain ATCC 19606 (to verify the actual role of PBP6b in β-lactam resistance) were unsuccessful until now. Additional studies on this topic are warranted. Recently, Yun et al. (43) evaluated proteome regulation in an imipenem-resistant A. baumannii strain under antibiotic stress conditions. They observed that the levels of RND family transporters (AdeABC and AdeJIK), the PBP genes ponA (PBP1a), ftsI (PBP3), and dacC (PBP5/6), and, noticeably, AmpC β-lactamase were increased in the presence of imipenem. In contrast, repression of the OMPs OmpA and OmpW was observed under the same conditions. These results suggest that together such mechanisms contribute to imipenem resistance in A. baumannii. 77 Artigos Científicos - Espanha ACKNOWLEDGMENTS This work was partially supported by Instituto de Salud Carlos III, Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI, RD06/0008) and FIS (PI080209). We are grateful to the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), which gave a PDEE grant to R.C. (protocol 4149/08-4). L. Dijkshoorn is thanked for providing A. baumannii strains RUH-134 and RUH-875. We acknowledge the funding of MICINN (BFU2009-09200) to J.A.A. TRANSPARENCY DECLARATIONS We have no conflicts of interest to report. 78 Artigos Científicos - Espanha REFERENCES 1. Baumann, P. 1968. Isolation of Acinetobacter from soil and water. J. Bacteriol. 96:39-42. 2. Bertsche, U., E. Breukink, T. Kast, and W. Vollmer. 2005. 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Rev. 32:361-385. 84 Artigos Científicos - Espanha Table 1 - Genetic characterization of the 26 A. baumannii clinical isolates. µg/ml) of:b MIC (µ PFGE Strain Hospitala/City Oxacilinases types clone IPM MEM FEP CAZ CRO CTX ATM AMK GEN MIN CIP TGC CST HUMV-823 HUMV/Santander A >32 >32 >32 >32 >32 >32 >16 >16 >8 8 >2 1 0.5 OXA-51-like+ISAba1 HUMV-1175 HUMV/Santander A1 >32 >32 >32 >32 >32 >32 >16 >16 >8 8 >2 1 0.5 OXA-51-like+ISAba1 HUMV-3743 HUMV/Santander A2 >32 >32 >32 >32 >32 >32 >16 >16 >8 8 >2 1 0.5 OXA-51-like+ISAba1 HUMV-1102 HUMV/Santander B 2 2 8 16 >32 >32 16 ≤8 ≤4 4 >2 1 1 OXA-51-like HUMV-2790 HUMV/Santander B 1 1 8 >32 >32 >32 >16 ≤8 ≤4 4 >2 1 1 OXA-51-like HUMV-1319 HUMV/Santander C >32 >32 >32 16 >32 >32 >16 >16 >8 2 >2 1 0.5 OXA-51-like, OXA-24 HUMV-5118 HUMV/Santander C >32 >32 >32 >32 >32 >32 >16 >16 >8 1 >2 1 0.5 OXA-51-like, OXA-24 HUMV-2471 HUMV/Santander D >32 >32 8 ≤8 4 4 8 >16 >8 2 >2 0.25 0.25 OXA-51-like, OXA-24 HUMV-4066 HUMV/Santander D >32 >32 >32 ≤8 32 32 >16 >16 >8 2 >2 0.25 0.5 OXA-51-like, OXA-24 HUMV-6457 HUMV/Santander D >32 >32 >32 16 8 8 16 ≤8 ≤4 2 >2 0.25 0.5 OXA-51-like, OXA-24 HUMV-2120 HUMV/Santander E 0.25 0.25 4 ≤8 8 8 16 ≤8 ≤4 1 ≤0.125 0.5 0.5 OXA-51-like HUMV-4674 HUMV/Santander F 0.5 0.5 8 ≤8 8 8 16 ≤8 ≤4 0.5 1 2 0.5 OXA-51-like HC-360 HC/Barcelona G 1 2 32 32 >32 >32 >16 >16 >8 2 >2 1 0.25 OXA-51-like HC-3581 HC/Barcelona G 1 2 32 32 >32 >32 >16 >16 >8 2 >2 1 0.25 OXA-51-like 85 Artigos Científicos - Espanha HC-4249 HC/Barcelona G >32 >32 >32 32 >32 >32 >16 16 >8 <0.5 >2 0.5 0.5 HC-4275 HC/Barcelona G >32 >32 >32 32 >32 >32 >16 >16 >8 1 >2 1 0.125 OXA-51-like+ISAba1, OXA-24 HC-60 HC/Barcelona H 1 4 32 ≤8 16 16 >16 16 >8 <0.5 1 1 0.125 OXA-51-like HC-3343 HC/Barcelona H 1 4 32 ≤8 16 16 >16 16 >8 <0.5 1 1 0.125 OXA-51-like HC-4256 HC/Barcelona H >32 >32 16 ≤8 32 32 >16 ≤8 >8 <0.5 1 0.5 0.25 OXA-51-like, OXA-24 HC-3202 HC/Barcelona H >32 >32 32 32 >32 >32 >16 >16 >8 2 >2 1 0.25 OXA-51-like, OXA-24 HC-771 HC/Barcelona I 1 4 16 >32 >32 >32 >16 16 >8 8 >2 0.5 0.25 OXA-51-like HC-769 HC/Barcelona I 1 8 16 >32 >32 >32 >16 >16 >8 8 >2 1 0.25 OXA-51-like HC-181 HC/Barcelona I >32 >32 16 >32 >32 >32 >16 >16 >8 8 >2 0.5 0.25 OXA-51-like+ISAba1 HC-1959 HC/Barcelona I >32 >32 >32 >32 >32 >32 >16 >16 8 8 >2 0.5 0.25 OXA-51-like+ISAba1 HUS-31 HUVM/Seville J 0.25 0.5 32 16 >32 >32 >16 >16 >8 2 >2 2 0.25 OXA-51-like HUS-457 HUVM/Seville K 4 4 4 16 32 32 >16 16 >8 <0.5 >2 0.5 0.125 OXA-51-like OXA-51-like, OXA-24 a. HUMV - Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, HC - Hospital Clinic, HUVM - Hospital Universitario Virgen Macarena. b. IPM, imipenem; MEM, meropenem; FEP, cefepime; CAZ, ceftazidime; CRO, ceftriaxone; CTX, cefotaxime; ATM, aztreonam; AMK, amikacin; GEN, gentamicin; MIN, minocycline; CIP, ciprofloxacin; TGC, tigecycline; CST, colistin. 86 Artigos Científicos - Espanha Table 2 - The penicillin-binding proteins (PBPs) of A. baumannii. % Identity with: PBP (gene) PBPs classificationa Molecular function Possible physiological functionb Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli PBP1a (ponA) HMM Class A (subclass A1) Transglycosylase and transpeptidase Peptidoglycan synthesis 43 36 PBP1b (mrcB) HMM Class A (subclass A2) Transglycosylase and transpeptidase Peptidoglycan synthesis 42 32 Monofunctional enzymes (MGTs) Monofunctional transglycosylase Unknown 34 32 PBP2 (mrdA/pbpA) HMM Class B (Subclass B2) Transpeptidase Cell elongation 45 39 PBP3 (ftsI) HMM Class B (Subclass B3) Transpeptidase Septum formation (Cell division) 39 39 PBP5/6 (dacC) LMM Class C (Type-5) D-ala-D-ala-carboxypeptidase Unknown 48 40 PBP6b (dacD) LMM Class C (Type-5) D-ala-D-ala-carboxypeptidase Unknown PBP7/8 (pbpG) LMM Class C (Type-7) Endopeptidase Unknown MtgA (mtgA) 31 38 34 a. HMM, High molecular mass; LMM, Low molecular mass. 87 Artigos Científicos - Espanha b. Enzymatic activities and functions predicted by sequence homology analysis. c. Amino acid sequence homology for the PBP and MGT proteins from the genomes of the P. aeruginosa PA7 strain (accession no. NC_009656), E. coli O157:H7 strain EDL933 (accession no. NC_002655.2) and A. baumannii SDF strain (accession no. NC_010400). Analysis was performed using the CLUSTAL W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). 88 Artigos Científicos - Espanha Table 3 - Point mutations observed in the PBP genes in susceptible and resistant A. baumannii strains to carbapenems. Point Mutation(s)c(clonal pattern[s]) origina Strains and susceptibilityb HUMV (Imipenem-susceptible) HUMV (Imipenem-resistant) HC (Imipenem-susceptible) HC (Imipenem-resistant) HUVM (Imipenem-susceptible) PBP1a PBP1b PBP2 PBP3 PBP5/6 PBP6b PBP7/8 MtgA ponA mrdA pbpA fstl dacC dacD pbpG mtgA 0d N329S (B), T374V (B, E), N296D (B, E), N307S (B, E) P28S (B), T188P (B) T45S (B, F), A84T (B) F18L (B, E, F) , T49P (B, E, F), I54V (E, F), N179S (B, E, F) N329S (A, C, D), T374V (A), N296D (A), N307S (A) P28S (A), A277T (D), V350I (D), S429N (D) T45S (A, C, D), A84T (A) F18L (A, C, D), T49P (A, C, D), Q100E (C), N179S (A, C, D) N329S (I) P28S (I), T188P (G) T39I (I), T45S (G, H, I), A84T (I) F18L (G, H, I), T49P (G, I), Q100E (G), N179S (G, H, I) L147I (B), T636A (E) P112S (B) P665A (E) A244T (C), S382N (C), T636A (C, D) P112S (A), P764S (C) V509I (C), G V (C) E110Q (D) 523 P112S (I), P764S (G) G V (G), V509I (G) 523 H370Y (I) T38A (H), L147I (I), A244T (G), S382N (G), T636A (G) L147I (I), A244T (G, H), S382N (G, H), T636A (G, H) A244T (J), S382N (J), T636A (J) P112S (I), P764S (G, H) P764S (J) V509I (G) G523V (G), H370Y (I) V509I (J), G523V (J) E110Q (K) N329S (I) 0 T39I (I), P28S (I), T45S (G, H, I), T188P (G, H) A84T (I) A277T (K), V350I (K), S429N (K) T45S (J, K) F18L (G, H, I), T49P (G, I), Q100E (G, H), N179S (G, H, I) F18L (J, K), T49P (J, K), Q100E (J), N179S (J, K) a. HUMV - Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, HC - Hospital Clinic, HUVM - Hospital Universitario Virgen Macarena. 89 Artigos Científicos - Espanha b. Imipenem-susceptible (MIC ≤ 4 µg/mL) and Imipenem-resistant (MIC ≥ 16 µg/mL). c. Amino acid substitution(s) relative to the genome of A. baumannii strain ATCC 17978. d. No mutations relative to the genome of A. baumannii strain ATCC 17978 were observed. 90 Artigos Científicos - Espanha Table 4 - Point mutations observed in the PBP genes of the 10 A. baumannii genomes and the reference strain RUH-134. Strain Point Mutations PBP3 PBP5/6 fstl dacC PBP1a ponA PBP1b mrdA PBP2 pbpA RUH-134 L147I 0a 0 0 ACICU L147I P112S 0 SDF A224T, T636A S274A, R590H, Q601E, R712H, Q765E AYE T38A, A244T AB0057 AB307-0294 AB900 AB056 AB058 AB059 ATCC 19606 PBP6b dacD PBP7/8 pbpG MtgA mtgA N329S P28S A84T F18L, T49P A346V, H370Y 0 P28S, K229Q T45S, A84T 0 0 S5 N S418N T45S, R218H N513H P665A 0 0 0 T45S T38A, A244T N513H P665A 0 0 0 T45S T38A, A244T, A613T N513H P665A 0 N329S 0 T45S T636A 0 E110Q 0 0 A277T, V350I, S429N T45S 0 P665A 0 0 0 T45S 0 P665A V565L 0 0 T45S 0 P665A 0 0 0 T45S 0 0 0 0 Q143K T45S T38A, A244T, T776A T38A, A244T, T776A T38A, A244T, T776A V623I F18L, T49P, N179S V8M, F18M, T49P, Q100E, N179S F18L, T49P, Q100E, N179S F18L, T49P, Q100E, N179S F18L, T49P, Q100E, N179S F18L, T49P, N179S F18L, T49P, Q100E, N179S F18L, T49P, Q100E, N179S F18L, T49P, Q100E, N179S F18L, T49P, N179S a. No mutations relative to the A. baumannii ATCC 17978 genome were observed. 91 Artigos Científicos - Espanha A Motif 1 Motif 2 Motif 3 Motif 4 Motif 5 B C Figure 1. Identification of the conserved motifs in the consensus sequences encoded by the HMM PBP genes of A. baumannii genomes used for the classification of PBPs, according to the work of Sauvage et al. (33). (A) Localization of the five characteristic conserved motifs of the Nterminal domain (boxed) in both HMM class A PBPs, PBP1a and PBP1b. (B) Arrows indicates differences in the motif 3 of the C-terminal domain (underlined) between the HMM class A and class B PBPs. (C) Arrows indicate the motif 2 residues in third position of the active site of the HMM of class B PBPs, used to divide these PBPs in subclasses B2 and B3. The first two residues of the active site are underlined. 92 Artigos Científicos - Espanha OXA-207: a novel OXA-24 variant associated with carbapenem resistance in Acinetobacter pittii in Spain Rodrigo Cayô1§*, María Merino2§, Belén Ruiz del Castillo1, María Eliecer Cano1, Jorge Calvo1, Germán Bou2 and Luis Martínez-Martínez1,3. §Both authors have equally contributed to this work. Short running title: blaOXA-207 in A. pittii. 1Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Marqués de Valdecilla - IFIMAV, Santander, Spain; 2Laboratorio de Microbiología, Complejo Hospitalario Universitario A Coruña (CHUAC) - INIBIC, La Coruña, Spain; 3Departmento de Biología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de Cantabria, Santander, Spain. *Corresponding author. Current Address: Laboratorio Especial de Microbiologia Clínica - LEMC/ALERTA, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, Rua Leandro Dupret, 188, Vila Clementino, 04025-010, São Paulo - SP, Brazil. Tel.: +55 11 50812965. Fax.: +55 11 50812965. E-mail: [email protected]. 93 Artigos Científicos - Espanha ABSTRACT A carbapenem-resistant A. pittii strain carrying an OXA-24-like enzyme was isolated in Santander, Northern Spain in 2008. The isolate also exhibited high level resistance to penicillins and monobactams, and remained susceptible to expanded-spectrum cephalosporins. Sequence analysis confirmed the presence of the novel blaOXA-207 carbapenemase gene that presented a point Gly222Val substitution with respect to that of OXA-24. This residue was located adjacent to Met-223, which defines a tunnel-like entrance to the active site of OXA-24. Analysis of the genetic context of blaOXA-207 showed the presence of the site-specific XerC/XerD-like recombination binding sites flanking the oxacillinase gene which was identical to the corresponding structures flanking the blaOXA-24 gene in A. baumannii strains isolated in the same institution. Cloning and kinetic analysis showed that OXA-207 presents a reduction in the catalytic efficiency against carbapenems and a noticeably increased in specificity for oxacillin compared with OXA-24, in agreement with the previous structural-function data of OXA-24. In summary, a novel OXA-type enzyme has been isolated from a carbapenem resistant A. pittii clinical isolate, which showed reduced catalytic efficiency against the carbapenems due to a Gly222Val amino acid replacement. This mutation probably caused a misorientation of carbapenems to gain access to the active center of the OXA-enzyme. Key words: oxacillinase, CHDL, active site, kinetic analysis, XerC/XerD-like. 94 Artigos Científicos - Espanha INTRODUCTION Acinetobacter pittii (formerly Acinetobacter genomic species 3) is a member of the Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex that includes three other species: A. baumannii, A. calcoaceticus and Acinetobacter nosocomialis (formerly Acinetobacter genomic species 13TU).1 The use of molecular methods2,3 for correct identification of the Acinetobacter species has shown that A. pittii (and A. nosocomialis) is commonly isolated from clinical specimens and may be associated with hospital outbreaks.4-6 A. pittii seems to be ecologically diverse as it was found in food, soil, and in healthy and clinically ill individuals, being able to produce serious infections.7-9 A. pittii usually remains susceptible to the majority of antimicrobial agents used in the clinical practice.10 However, carbapenem-resistant A. pittii isolates harboring oxacillinase genes have been reported.11,12 Oxacillinases are a group of β-lactamases with heterogeneous structural and biochemical properties.13 The carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamases (CHDLs) are mainly found in A. baumannii and are included in four clusters: the intrinsic chromosomally OXA-51-like and the acquired OXA-23-like, OXA-24-like and OXA-58-like. The corresponding genes can be either chromosome or plasmid encoded.13,14 The OXA-24 cluster comprises of six described variants: OXA-24 (identical to OXA-40), OXA-25, OXA-26, OXA-72, OXA-139 (accession number AM991978) and OXA-160. 12,15-18 The amino acid sequences of OXA-143 and OXA-182 enzymes present a high identity with OXA-24, and should be included as members of the cluster OXA-24, instead of the new clusters proposed.8,19 Whereas the blaOXA-23 and blaOXA-58 genes are commonly surrounded by insertion sequences (IS) that enhance their expression, the genes belonging to the OXA-24 cluster are not associated with these structures.13,20 In the latter case it seems that XerC/XerD recombination sites are key structures associated with its spreading, although this event has not been clearly demonstrated.8,21 Overall, it is clear that these enzymes are by themselves able to cause resistance to carbapenems.13,14,22 Eventually, the acquired-CHDLs can 95 Artigos Científicos - Espanha be transferred from A. baumannii to other non-baumannii species, compromising the therapeutic options to treat the infections caused by these pathogens.23,24 The aim of this study was to characterize a novel OXA-24 variant (OXA-207) in a carbapenemresistant A. pittii isolate from Spain. 96 Artigos Científicos - Espanha Materials and Methods Bacterial strains. A. pittii HUMV-1588 is a carbapenems-resistant clinical strain isolated in April 2008 from a bronchial aspirate of a patient admitted to the Medical Intensive Care Unit in the Hospital Marqués de Valdecilla, a tertiary teaching hospital located in Santander, Northern Spain. The isolate was firstly identified as Acinetobacter baumannii/A. haemolyticus by the automated system MicroScan Walk-Away (Siemens Healthcare Diagnostic Inc., West Sacramento, CA). A. baylyi ADP1 was used as a host of the different recombinant plasmids. E. coli BL21 was used for carbapenemase gene expression. Bacteria were grown at 37 ºC in Luria-Bertani medium, supplemented with the appropriate antibiotics. Identification of Acinetobacter species. Species identification of HUMV-1588 strain was performed by two methodologies: (I) amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) method, using the enzymes CfoI, AluI, MboI, RsaI and MspI;3 and (II) sequencing analysis of partial regions of RNA polymerase β subunit (rpoB) gene [zone 1 (350 bp, between positions 2,900 and 3,250) and zone 2 (450 bp, between positions 3,250 and 3,700)], as previously published.2,25 Antimicrobial susceptibility testing. MICs of ampicillin, ampicillin/sulbactam, amoxycillin/clavulanate, piperacillin/tazobactam, cefoxitin, ceftazidime, cefotaxime, cefepime, aztreonam, imipenem, meropenem, amikacin, gentamicin, tobramycin, tetracycline, minocycline, doxycycline, levofloxacin, ciprofloxacin, chloramphenicol, tigecycline, colistin and trimethoprim-sulfamethoxazole were determined by Etest strips, according to manufacturer’s (bio-Mérieux, Marcy l’Étoile, France) recommendations. Results for tigecycline were interpreted according to the US Food and Drug Administration (FDA) 97 Artigos Científicos - Espanha breakpoints for Enterobacteriaceae (susceptible, ≤2 mg/ml; intermediate, 4 mg/ml; resistant, >8 mg/ml), and for the other antimicrobial agents tested the Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) breakpoints were considered.26 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 and Escherichia coli ATCC 25922 were used as quality control strains. PCR assays for molecular characterization of β-lactamase genes associated with carbapenem resistance. Genomic DNA from A. pittii HUMV-1588 was extracted with InstaGeneTM Matrix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA), according to manufacturer’s recommendations. As screening, multiplex-PCR assays were performed to investigate the presence of CHDLs (blaOXA-23-like, blaOXA24-like, blaOXA-51-like, blaOXA-58-like) and metallo-β-lactamase (blaIMP-like, blaVIM-like, blaSPM-1, blaGIM-1 and blaSIM-1) encoding genes as previously reported.27,28 207.A:5’AYTTCGBATAAYSSCCATTATGTTAAATTAAAAGA’3 Primers and Pre-OXAPre-OXA- 207.B:5’ATTTCGYATAASGYGTATTATGTTAATTTTAGAAA’3 amplifying the entire blaOXA-24-like genes and surrounding regions (amplicon size of 967 bp), including its flanking region composed of XerC/XerD-like recombination sites, were designed according to previously reported sequences.17,21 PCR conditions were as follows: 95º C for 5 min, followed by 35 cycles of 95 ºC for 30 s, 45 ºC for 30 s and 72 ºC for 2 min, followed by 72 ºC for 7 min. PCR products were analyzed on a 1% (w/v) agarose gel stained with ethidium bromide. PCR products were purified by using a High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany). Bidirectional DNA sequencing was performed by Macrogen Inc. (Seoul, South Korea). Cloning and characterization of the new OXA-207. The blaOXA-24 and the blaOXA-207 were amplified in parallel by PCR with the primers OXA24/207Fow-XbaI 5´-CCCTCTAGAATGAAAAAATTTATACTTCC-3´and OXA24/207-Rev-NcoI 5´- 98 Artigos Científicos - Espanha CCCCCATGGTTAAATGATTCCAAGATTTTC-3´. The purified amplicons were cloned between XbaI and NcoI restriction sites in pET-RA plasmid harboring a rifampicin resistance gene [GenBank: HM219006]. The constructions were used to transform A. baylyii ADP1 cells by electroporation (25 µF, 200 Ω, 2.5 kV), with a Gene Pulser II (BioRad, Richmond, CA). Transformants were selected on LB plates supplemented with 50 mg/L of ampicillin and 50 mg/L of rifampicin. All constructions were confirmed by sequencing both strands, by standard procedures. MICs for ampicillin, imipenem and meropenem were determined by broth microdilution for the A. pittii HUMV-1588 and A. baylyii ADP1 strains, as well as for the A. baylyii ADP1 transformants, according to the CLSI guidelines.26,29 Antibiotic and other chemicals. Ampicillin and oxacillin were obtained from Sigma (St Louis, MO, USA). Imipenem was from Merck (Whitehouse Station, NJ), and meropenem from AstraZeneca (London, United Kingdom). Nitrocefin was obtained from Oxoid (Basingstoke, Hants, UK). The antibiotic molar extinction coefficients in the spectrophotometric assays were 1050, 258, 9000, 6500 M-1 cm-1, respectively. The wavelengths used for measurements were 235 nm for ampicillin, 260 nm for oxacillin, 300 nm for imipenem and meropenem and 495 nm for nitrocefin. Purification of the carbapenemase. To purify OXA-207, the corresponding gene was cloned into the pGEX-6P-1 vector with BamHI and EcoRI restriction sites to produce translational fusions with the glutathione S-transferase (GST) gene. The primers used for amplification of the gene lacking the signal peptide are OXA24/207-pepBamHI 5´-AAGGATCCTCTATTAAAACTAAATCTGAAG-3´ and OXA24/207RevEcoRI 5´-AAAGAATTCTTAAATGATTCCAAGATTTTC-3´. The OXA-207 and the OXA-24 were purified to homogeneity with the GST gene fusion system (Amersham Pharmacia Biotech, 99 Artigos Científicos - Espanha Europe GmbH), in accordance with the manufacturer’s instructions. The mature purified protein, lacking the GST fusion protein, appeared on SDS-PAGE gels as a band of 30.99 kDa (≥ 95% purity) (data not shown). The concentrations of the purified proteins were determined by a protein assay (Bio-Rad, Richmond, CA). Determination of kinetic parameters. The proteins OXA-207 and OXA-24 were subjected to further biochemical studies with ampicillin, oxacillin, imipenem and meropenem. Biochemical studies (Kcat/Km ratio) were carried out at 25º C in a Nicolet Evolution 300 spectrophotometer (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA) and the data obtained were analyzed with Vision Pro software (Thermo Electron Corporation). Km values were calculated as Ki values in competitive assays with nitrocefin as the substrate. The Kcat values were obtained under zero-order conditions ([S] > Km). The tests were repeated three times in PBS with 20 mg/L BSA. Nucleotide sequence accession numbers. The complete nucleotide sequences of blaOXA-207 and partial sequence of rpoB gene from A. pittii HUMV-1588 strain were deposited in the GenBank nucleotide database under accession numbers JQ838185 and JQ838184, respectively. 100 Artigos Científicos - Espanha RESULTS Molecular taxonomic identification and antimicrobial susceptibility. The carbapenem-resistant HUMV-1588 isolate was identified as A. pittii by ARDRA, showing a profile 21313. Sequencing analysis of both zones of rpoB gene, confirmed this result. HUMV1588 A. pittii was resistant to amoxicillin (MIC, > 256 mg/L), ampicillin (MIC, > 256 mg/L), cefoxitin (MIC, > 256 mg/L), chloramphenicol (MIC, > 256 mg/L), ciprofloxacin (MIC, 16 mg/L), imipenem (MIC, 32 mg/L), meropenem (MIC, 32 mg/L), aztreonam (MIC, >256 mg/L) and piperacillin-tazobactam (MIC, > 256/4 mg/L); intermediate to cefepime (MIC, 16 mg/L); and susceptible to ampicillin-sulbactam (MIC, 8/16 mg/L), ceftazidime (MIC, 2 mg/L), cefotaxime (MIC, 4 mg/L), gentamicin (MIC, 0.5 mg/L), tobramycin (MIC, 0.06 mg/L), amikacin (MIC, 2 mg/L), levofloxacin (MIC, 2 mg/L), tetracycline (MIC, 2 mg/L), doxycycline (MIC, 0.25 mg/L), minocycline (0.125 mg/L), tigecycline (0.125 mg/L), colistin (MIC, 0.25 mg/L) and trimethoprimsulfamethoxazole (MIC, 0.06 mg/L). Identification of the blaOXA-207 gene. A. pittii HUMV-1588 lacks a chromosomal-encoded blaOXA-51-like gene and any of the investigated metallo-β-lactamase-encoding genes. However, this isolate carried a CHDL blaOXA-24-like gene. Sequencing of a 967-bp amplicon showed the presence of an open reading frame of 828-bp which encoded a product predicted to have 99.0% amino acid identity with OXA-24 β-lactamase. The HUMV-1588 harbored a new variant of the CHDL OXA-24 cluster, designated OXA-207. This new enzyme had a G→T mutation at nucleotide 665, causing a unique Gly222Val change. A comparison of the predicted amino acid sequences of OXA-207 with those of the OXA-24 variants, as well as with the two related enzymes, OXA-143 and OXA-182, is shown in Figure 1. The OXA-24 cluster comprises of seven different variants that present a high identity (99.0%) between them, diverging from the OXA-24 from one [OXA-26 (Ser257Thr), OXA-72 (Gly224Asp), 101 Artigos Científicos - Espanha OXA-139 (Asn87Ile), OXA-160 (Pro257Ser) and OXA-207 (Gly222Val)] to two [OXA-25 (Lys202Glu and Ser268Leu)] amino acids. These CHDLs differ from OXA-182 and OXA-143 enzymes in 30 (89.0% of identity) to 34 (87% of identity) amino acids, respectively, with the latter two oxacillinases differing between them in 19 amino acids (93.0% of identity). The three conserved motifs (STKF, FGN and KSG) responsible for the formation of the active site of the oxacillinase group are identical between the OXA-24-like, OXA-143 and OXA-182 enzymes. The Gly222Val substitution present in OXA-207 is near to the third conserved motif KSG of this βlactamase and adjacent to Met-223, which has been defined as a key residue in defining the tunnel-like entrance of carbapenems to the active site of the enzyme. The partial sequences of the genetic context of blaOXA-207 gene revealed, as previously described in this group of genes, the presence of the site-specific recombination XerC-XerD-like binding sites flanking the oxacillinase gene. Antibiotic susceptibility testing. The MICs (mg/L) of ampicillin, imipenem and meropenem for A. pittii HUMV-1588 clinical isolate, the A. baylyi ADP1 clones harboring the pET-RA plasmid harboring the blaOXA-207 and blaOXA-24WT and the recipient strain A. baylyi ADP1 with the plasmid alone are listed in Table 1. The MICs of imipenem and meropenem for A. baylyi ADP1 expressing the blaOXA-207 gene were increased by 7-fold, similar to those obtained by the A. baylyi ADP1 expressing the blaOXA-24WT and A. pittii HUMV-1588. Although the MICs of ampicillin are increased by 7-fold and 8-fold in the recipient clones harboring the blaOXA-207 and blaOXA-24WT, respectively, the results obtained for the A. pittii HUMV-1588 were 3-fold higher. 102 Artigos Científicos - Espanha Biochemical studies. Ampicillin, oxacillin, imipenem and meropenem were selected for kinetic studies and the kinetic parameters obtained for OXA-24 and OXA-207 are shown in Table 2. Kinetic parameters (Table 2) corroborate MICs values. The Kcat/Km values for ampicillin for OXA-24 and OXA-207 are similar, differing for an increase in the Km for OXA-207. However, the OXA-207 shows high rates of hydrolysis for oxacillin (low Km) comparing with the OXA-24 (high Km). The Kcat/Km for OXA-207 was 8,934.7 compared with 48,626 for OXA-24. Although both enzymes showed high affinity for imipenem and meropenem (low Km), OXA-24 hydrolyzes carbapenems better than OXA-207, since OXA-24 show higher Kcat values than OXA-207. The catalytic efficiencies (Kcat/Km) of OXA24 for meropenem and imipenem were 2 and 3 times higher, respectively, than those of OXA-207 (Table 2). 103 Artigos Científicos - Espanha Discussion The difficulties in identification of more than 34 species and genomic species of Acinetobacter described until now, explain the limited clinical information about these microorganisms.1 The use of molecular methods for a correct identification of Acinetobacter non-baumannii species has contributed to the understanding of the epidemiology and the real impact of these species as a cause of human infections.10,12,19,24,30-32 Recently, molecular epidemiology studies have shown that the frequency of A. pittii or A. nosocomialis may be even greater than A. baumannii.10 To date OXA-24 β-lactamase was reported in Europe,33-38 Asia-Pacific24 and USA.39-41 Most OXA-24 variants have been described in specific strains isolated in Spain (OXA-25 and OXA207), Belgium (OXA-26), Italy (OXA-139) and USA (OXA-160).15,18 OXA-72 was first described in an A. pittii isolate from China in 2007,12 and has subsequently been reported in Europe23,31,42-46 and Taiwan.43 Two other CHDL enzymes related to the OXA-24 cluster have been described in Brazil (OXA-143) and in South Korea (OXA-182).19 Recent studies have shown that OXA-143 is the second most important CHDL found in Brazilian A. baumannii isolates and OXA-182 is an emerging CHDL in South Korea.19,48,49 D’Andrea and colleagues revealed that the blaOXA-24 gene was flanked by conserved inverted repeats homologous to XerC/XerD binding sites that are associated with DNA mobilization in Acinetobacter plasmids.21 In another study, Merino and colleagues reported an A. calcoaceticus clinical isolate carrying the blaOXA-24 during a multidrug-resistant A. baumannii clonal outbreak in a hospital in Spain.50 Both plasmids harboring the blaOXA-24 gene from the A. calcoaceticus and A. baumannii strains demonstrated the presence of XerC/XerD recombination binding sites.50 The same structures were also found flanking the blaOXA-72 and blaOXA-160.51 Our results corroborate these findings, demonstrating that OXA-207 is also flanked by XerC/XerD-like recombination binding sites. Although no information about the genetic context of OXA-25, OXA-26, OXA-139 or 104 Artigos Científicos - Espanha OXA-182 is available, it would be possible that all these CHDLs are mobilized by a similar mechanism. More recently, Rumbo and colleagues demonstrated that clinical isolates of A. baumannii may release outer membrane vesicles as a mechanism of horizontal plasmid harboring the blaOXA-24 gene transfer to A. baumannii ATCC 17978, increasing the possibilities of CHDL gene transfer between Acinetobacter spp. clinical isolates.51 The capacity of dissemination of the OXA-24, was exemplified in a study conducted by Sevillano and colleagues that reported the presence of blaOXA-24 gene in P. aeruginosa carried by a plasmid also found in A. baumannii from a hospital in northern Spain.52 Other studies described transmission of genes coding for CHDL and metallo-βlactamase from A. baumannii to other Acinetobacter species in different regions.12,23,24,31,37 In A. pittii, the CHDLs described until now were OXA-58 in Germany and OXA-72 in China.11,12 Although OXA-24 is the most disseminated CHDL in A. baumannii clinical isolates in Spain,16,17 this is the first report of an OXA-24 variant in a non-baumannii species in the same country. The presence of the same XerC/XerD structure flanking the novel OXA-207 found in A. pittii HUMV1588, as well as in the OXA-24-producing A. baumannii clones identified in our hospital during the last 5 years (data not shown, manuscript in preparation), emphasize a possible gene transfer from A. baumannii to A. pittii. The A. pittii HUMV-1588 was resistant to penicillins, monobactams and carbapenems, but remained susceptible to expanded-spectrum cephalosporins. OXA-207, as observed for the other CHDLs, did not significantly hydrolyze expanded-spectrum cephalosporins.8,13,22 The unique Gly222Val mutation was near the KSG conserved motif of the active site of the OXA207 and adjacent to the key residue Met-223, which is very important from a structural point of view for the biochemical properties of OXA-24. An analysis of the crystal structure of OXA-24 showed that the specificity to carbapenems in this CHDL is determined by a hydrophobic barrier that is established through the specific arrangement of a pair of amino acid residues Tyr-112 and 105 Artigos Científicos - Espanha Met-223 side chains, which define a tunnel across the active site of this β-lactamase.22 The orientation of both residues delimits the access to the catalytic binding-site, positioning appropriately the carbapenem for an optimal recognition.22 The presence of this “tunnel” on the OXA-24 enzyme alters drastically the conformation of the distal pyrrolidine/sulfonamide group of the carbapenems, that will interfere in the capacity to hydrolyze these antimicrobial agents better than the others oxacillinases.53 Based on the analysis of two mutants (Tyr112Ala and Met223Ala), it was possible to conclude that the residue Tyr-112 are important to confer high MICs of imipenem and meropenem, instead of the residue Met-223. Interesting the Met-223 residue is exactly next to the Gly222Val mutation observed in the novel OXA-207 variant. The results for the OXA-207 (Gly222Val) were similar to those obtained by the Met223Ala previously. A reduction in the catalytic efficiency against the carbapenems and a noticeably increased in specificity for oxacillin were observed by both mutations [Gly222Val (OXA-207) and Met223Ala]. This data can justify the strong hydrolysis (high Kcat/Km ratio) of oxacillin observed by OXA-207 β-lactamase compared with the OXA-24 WT. However, the Kcat/Km ratio for imipenem and meropenem observed by the OXA-207 were not lower than those described by the previous study by the in vitro double mutant OXA-24 (Tyr112Ala + Met223Ala). Maybe the alterations in the tunnel-like entrance caused by the Gly222Val (OXA-207) were not sufficient to avoid the recognition of carbapenem molecule by the active site of the β-lactamase. Although OXA-207 hydrolyzed weakly the carbapenems, this β-lactamase significantly contributes to resistance to imipenem and meropenem in the A. pittii HUMV-1588 clinical isolate. In conclusion, we have identified for the first time a carbapenem-resistant A. pittii clinical isolate harboring the novel OXA-207 enzyme (an OXA-24 variant) in Spain. Our findings suggest that the unique mutation present in the OXA-207 changed its catalytic activity against the β-lactams. The emergence of the OXA-207 carbapenemase in an A. pittii clinical isolate is a concern, since the 106 Artigos Científicos - Espanha possibility of its dissemination will drastically change the treatment of infections caused by this pathogen. 107 Artigos Científicos - Espanha ACKNOWLEDGMENTS AND FUNDING This work was partially supported by Instituto de Salud Carlos III, Spanish Network for Research in Infectious Diseases (REIPI, RD06/0008) and Fondo de Investigación Sanitaria (PI080209 and PS09/00687). We are grateful to the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), which gave a PDEE grant to R.C. (protocol 4149/08-4). We gratefully acknowledge the assistance of Sophia Mooney in the preparation of the manuscript. TRANSPARENCY DECLARATIONS We have no conflicts of interest to report. 108 Artigos Científicos - Espanha REFERENCES 1. Nemec A, Krizova L, Maixnerova M et al. Genotypic and phenotypic characterization of the Acinetobacter calcoaceticus-Acinetobacter baumannii complex with the proposal of Acinetobacter pittii sp. nov. (formerly Acinetobacter genomic species 3) and Acinetobacter nosocomialis sp. nov. (formerly Acinetobacter genomic species 13TU). Res Microbiol 2011; 162:393-404. 2. La Scola B, Gundi VA, Khamis A, Raoult D. Sequencing of the rpoB gene and flanking spacers for molecular identification of Acinetobacter species. J Clin Microbiol 2006; 44:827-32. 3. Vaneechoutte M, Dijkshoorn L, Tjernberg I et al. 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Antimicrobial A. pittii A. baylyi + A. baylyi + Agents (blaOXA-207) pETRA+blaOXA-24 pETRA+blaOXA-207 Ampicillin 4096 1024 512 4 Imipenem 32 32 16 0.125 Meropenem 32 32 16 0.125 A. baylyi 116 Artigos Científicos - Espanha Table 2. Kinetic parameters of purified β-lactamases OXA-24 and OXA-207a. OXA-24 Antimicrobial Agent OXA-207 Kcat (s-1) Km (µM) Kcat/Km (mM1s-1)c 2,882.8 337.5 (±6.7) 150.9 (±15.4) 2,236.6 403.4 (±127.8) 48.6 383.3 (±28.5) 42.9 (±8.3) 8,934.7 1.96 (±0.41) 0.60 (±0.10) 3,266.7 0.41 (±0.01) 0.37 (±0.07) 1,108.1 0.165 (±0.004) 0.017 (±0.001) 9,705.9 0.043 (±0.002) 0.008 (±0.001) 5,375.0 Kcat (s-1) Km (µM) Kcat/Km (mM-1s-1)c Ampicillin 258.3 (±29.1) 89.6 (±38.0) Oxacillin 19.6 (±0.8) Imipenem Meropenem aData are the means (±SD) of three independent experiments. 117 Artigos Científicos - Espanha Figure 1. Alignment of the amino acid sequences of the OXA-24 and its variants (OXA-25, OXA26, OXA-72, OXA-139, OXA-143, OXA-160, OXA-182 and OXA-207). Analysis was performed using the CLUSTAL W multiple sequence alignment program. All sequences were obtained according with the accession numbers provided by β-Lactamase Classification and Amino Acid Sequences website (http://www.lahey.org/Studies/). Conserved motifs are boxed. Points represent conserved amino acids. Arrow indicates the Gly222Val substitution in the predicted amino acid sequence of 207. 118 Artigos Científicos - Espanha Diversity of Emerging Acinetobacter Species in a Tertiary University Hospital in the North of Spain Rodrigo Cayô1*, Maria Eliecer Cano1, Jorge Calvo1 and Luis Martínez-Martínez1,2. Short running title: Emerging Acinetobacter Species among Clinical Isolates. 1Service of Microbiology, University Hospital Marqués de Valdecilla - IFIMAV, Santander, Spain; 2Department of Molecular Biology, School of Medicine, University of Cantabria, Santander, Spain. *Corresponding author. Current Address: Laboratorio Especial de Microbiologia Clínica - LEMC/ALERTA, Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP, Rua Leandro Dupret, 188, Vila Clementino, 04025-010, São Paulo - SP, Brazil. Tel.: +55 11 50812965. Fax.: +55 11 50812965. E-mail: [email protected]. 119 Artigos Científicos - Espanha ABSTRACT Eighty six no repetitive clinical isolates, representative of each Rep-PCR pattern, identified by MicroScan-WalkAway® as A. calcoaceticus-baumannii complex collected during 2004-2008 period in a tertiary teaching hospital, had their identification confirmed by ARDRA. Only 44.2% of isolates was confirmed to be A. baumannii harboring 12 different blaOXA-51-like genes. Eight different non-baumannii species were also identified and A. pittii (41.8%) was the most frequent among them. All carbapenem-resistant A. baumannii isolates carried the blaOXA-24/40 or blaOXA-51like-ISAba1 genes. The blaOXA-58 gene was found in 19 out of 24 isolates of a carbapenemsusceptible A. pittii clone. Emerging Acinetobacter species have been identified in our hospital and their actual incidence could be underestimated by using only automated identification systems. 120 Artigos Científicos - Espanha Acinetobacter species have emerged as important opportunistic pathogens responsible for a variety of severe nosocomial infections, especially the four closely related and phenotipically similar species included in the Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex.1-4 Although, A. baumannii is the most prevalent and resistant species of this group, the real incidence of the other members can be underestimated, because the identification at the species level using phenotypic methods is complex and problematic,2 and automated systems have shown unsatisfactory results to discriminate these microorganisms.3 In this way, a great variety of molecular methods have been proposed to attempt to correctly identify the Acinetobacter species.4-6 However, many of these methodologies are not applicable in the clinical microbiology routine. This study was designed to evaluate the diversity of Acinetobacter species and to characterize the production of carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase (CHDLs) among these isolates during a 5-year period in a tertiary university hospital in northern Spain. This work was presented in part as a poster presentation at the 21th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases - ECCMID in Milan, 2011. During the period of 2004 to 2008, a total of 603 clinical isolates identified previously as A. calcoaceticus-baumannii complex by MicroScan-WalkAway® (Siemens Healthcare Diagnostic Inc., West Sacramento, CA) in a tertiary teaching hospital, with 900-beds, localized in the north of Spain, were selected. The clonal relationships of the A. calcoaceticus-baumannii complex isolates were determined by Rep-PCR using the primers pairs REP-1 (5´- IIIGCGCCGICATCAGGC-3´) and REP-2 (5´-ACGTCTTATCAGGCCTAC-3´), as described previously7 and the amplified fragments were separated on a 1.5% (w/v) agarose gel for 240 min. Rep-PCR gels were analyzed by BioNumerics program version 5.0 (Applied Maths, Kortrijk, Belgium). In all images, the definition of bands was performed automatically by the program and then checked individually by visual comparison. The similarity coefficient used was the Dice coefficient. 8 The dendrogram was constructed using the algorithm UPGMA phylogenetic analysis 121 Artigos Científicos - Espanha (unweighted Pair-Groups Method using arithmetic Averages).9 The values used for optimization and tolerance for all of the isolates were 1.0 and 2.0%, respectively. The Rep-PCR results showed 98 different patterns (Figure 1). However, a single representative isolate of 12/98 RepPCR patterns were not viable or contaminated. For this reason, one isolate of each remainder patterns (n=86) was chosen for the further analysis. The detection of CHDL-encoding genes was performed by multiplex PCR, as previously published10 and confirmed by sequencing. The presence of the blaOXA-51-like gene was considered as predictor for A. baumannii. To confirm the identification at species level for all clinical isolates was carried out by amplified rRNA gene restriction analysis (ARDRA), as previously described.6 Surprisingly, only 38/86 (44.2%) of the isolates were positive for blaOXA-51-like gene and, as expected, these isolates were identified as A. baumannii, showing three different ARDRA profiles (Table 1). Among the 38 A. baumannii clones, a total of 12 blaOXA-51-like genes were found: blaOXA64, blaOXA-65, blaOXA-66, blaOXA-67, blaOXA-68, blaOXA-69, blaOXA-70, blaOXA-71, blaOXA-94, blaOXA-98, blaOXA- 106 and blaOXA-117. These results are in accordance with a previous study conducted by Héritier et al. who also showed that the blaOXA-51-like are, in generally, closely related with the clonal pattern of the A. baumannii isolate.11 A great diversity of Acinetobacter species has been founded among the blaOXA-51-like-negative isolates. Interestingly, 41.8% (n=36) of the isolates were identified as A. pittii (ARDRA profile 21213), being the second most frequently Acinetobacter spp. in our hospital (Table 1). Epidemiological studies have done a correct identification of the isolates belonging to the A. calcoaceticus-baumannii complex. These findings shows that, although A. baumannii is the most prevalent and important specie, the frequency of isolation of A. pittii and A. nosocomialis may be equal or even superior to A. baumannii,12-14 depending of the hospital or geographic region. These two species can even be capable of causing outbreaks.15-16 All carbapenem resistant A. baumannii isolates harbored the blaOXA-24/40 or the blaOXA-51-likeISAba1. In opposite, the carbapenem-susceptible isolates did not show the ISAbA1 upstream to 122 Artigos Científicos - Espanha blaOXA-51-like gene. Previously studies have shown that the OXA-24/40 is the most important and disseminated CHDL in Spain,17 indeed this enzyme are endemic to the Iberian Peninsula.18 Interestingly, the blaOXA-58 gene was found in 19 out of 24 isolates of a carbapenem-susceptible A. pittii clone in the present study. Marti et al. reported the presence of OXA-58-ISAba3 isolated from an A. pittii isolate showing high resistance levels to imipenem (MIC > 32 mg/mL) in Spain.19 However, the authors explain that production of OXA-58 alone is not sufficient to cause elevated MICs for imipenem, which requires the contribution of other resistance mechanisms, such as porins loss and active efflux.19 In another study, it was reported the presence of OXA-23 and OXA-58 A. radioresistens and A. bereziniae carbapenem-susceptible isolates, respectively.19 Evaluating the genetic background of the OXA-58, the authors found the same results obtained by Marti et al. in A. pittii and explain that ISAba1, ISAba2 and IS18 works as better promoters than ISAba3, which could explain the susceptibility to carbapenems observed in A. bereziniae isolate19 and, probably, in A. pittii isolates of our study. The authors conclude, remembering that Acinetobacter spp. isolates susceptible to carbapenems, but producers CHDLs, act as reservoirs of resistance genes, since they could not be identified by routine methods, which generally assess samples resistant. Other seven different species were also identified. A common ARDRA profile 42123 for A. bereziniae and A. guillouiae was obtained for three isolates (Table 1), and an additional restriction enzyme BsmaI was necessary to further differentiate both species. A restriction pattern 1 was observed for BsmaI enzyme, identifying the isolates as A. bereziniae. A restriction enzyme BfaI was also used to discriminate the ARDRA profile 14122 observed for two isolates and an ARDRA restriction pattern 1+2 was obtained, identifying both isolates as A. genomic species 13BJ. Two rarely species, A. phenon 3 (ARDRA profile 14143) and A. phenon 5 (ARDRA profile 25113), were identified, more associated to respiratory tract infection. The other three species were 123 Artigos Científicos - Espanha identified as A. genomic species 16, A. calcoaceticus and A. nosocomialis. None of these species were found carrying any CHDL gene. In summary, the prevalence of A. pittii is higher in our institution, been the second most frequent specie. Emerging Acinetobacter species have been identified in our hospital and their actual incidence could be underestimated by using only automated identification systems. 124 Artigos Científicos - Espanha REFERENCES 1. Higgins, P. G., C. Dammhayn, M. Hackel, and H. Seifert. 2010. Global spread of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii. J Antimicrob Chemother. 65:233-238. 2. Ribera, A., F. Fernández-Cuenca, A. Beceiro, G. Bou, L. Martínez-Martínez, A. Pascual, J. M. Cisneros, J. Rodríguez-Baño, J. Pachón, J. Vila, and the Spanish Group for Nosocomial Infection (GEIH). 2004. 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Detection of blaOXA-58 and blaOXA-23-like genes in carbapenemsusceptible Acinetobacter clinical isolates: should we be concerned? 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Abreviations: BSI - bloodstream infections, LRTI - lower respiratory tract infections, SSTI - skin and soft tissue infections, UTI - urinary tract infections. b. ARDRA profiles according with restriction enzymes CfoI, AluI, MboI, RsaI, MspI. To differentiate among isolates with the same ARDRA profile, a further restriction analysis was made with enzymes BfaI and BsmI. 129 Artigos Científicos - Espanha A. nosocomialis 1% A. genomic Acinetobacter phenon species 13BJ A. genomic 5 2% species 16 2% Acinetobacter 1% A. bereziniae phenon 3 4% 3% A. calcoaceticus 1% A. baumannii 44% A. pittii 42% Figure 2 - Distribution of the 86 Acinetobacter spp. isolates showing different Rep-PCR patterns according to ARDRA method. 130 Artigos Científicos - Espanha Acinetobacter phenon 5 n= 2 Acinetobacter phenon 3 n=2 A. calcoaceticus n=1 A. nosocomialis n=1 Acinetobacter genomic species 13BJ A. n=2 bereziniae n=9 Acinetobacter genomic species 16 n=1 A. pittii n=70 A. baumannii n=515 Figure 3 - Distribution of the 603 Acinetobacter spp. isolates in the period of 2004 to 2008. 131 Artigos Científicos - Espanha Bloodstream infection caused by Acinetobacter junii in a Patient with Acute Lymphoblastic Leukaemia after Allogenic Haematopoietic Cell Transplantation Rodrigo Cayô1*, Lucrecia Yañez San Segundo2,3, Inmaculada Concepción Pérez del Molino Bernal1, Celia García de la Fuente1, Maria Aranzazu Bermúdez Rodríguez2,3, Jorge Calvo1 and Luis Martínez-Martínez1,4. Short running title: Acinetobacter junii in a Haematopoietic Cell Transplanted Patient. 1Service of Microbiology, University Hospital Marqués de Valdecilla - HUMV, Avda. de Valdecilla, s/n, 39008, Santander, Spain; 2Service of Haematology, University Hospital Marqués de Valdecilla - HUMV, Avda. de Valdecilla, s/n, 39008, Santander, Spain; 3Medicine and Psychiatry Department, School of Medicine, University of Cantabria, Avda. Herrera Oria, s/n, 39011, Santander, Spain. 4Molecular Biology Department, School of Medicine, University of Cantabria, Avda. Herrera Oria, s/n, 39011, Santander, Spain. *Corresponding author. Current Address: Servicio de Microbiología, Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, Avda. de Valdecilla, s/n, Pabellón 20, Planta 2, 39008. Tel.: +34 942 202580. Fax.: +34 942 203462. E-mail: [email protected]. 132 Artigos Científicos - Espanha ABSTRACT Acinetobacter junii is a rare human pathogen associated with bacteraemia in neonates and paediatric oncology patients. We present a case of A. junii causing bacteraemia in an adult transplanted patient with leukaemia. The correct identification of Acinetobacter species can highlight the clinical significance of the different species of this genus. 133 Artigos Científicos - Espanha INTRODUCTION Acinetobacter junii (genomic species 5) is a rare human pathogen, being particularly associated with outbreaks of septicaemia in neonates and paediatric oncology patients (Bernards et al., 1997; de Beufort et al., 1999; Kappstein et al., 2000). Rare cases of meningitis (Chang et al., 2000), peritonitis (Borràs et al., 2007), ocular infection (Prashanth et al., 2000), and septicaemia in adult oncology patient (Linde et al., 2002) caused by A. junii have also been described. Although Acinetobacter baumannii is the most important and prevalent species involved in nosocomial infections (Bergogne-Berezin & Towner, 1996), the real incidence and the roles of the other members of genus Acinetobacter as human pathogens can be masked, since reliable phenotypical identification is time consuming and labor intensive (Gerner-Smidt et al., 1991). The precise identification of Acinetobacter species requires the application of molecular methods (Vaneechoutte et al., 1995; La Scola et al., 2006). Unfortunately, the latter approach is not generally applicable in clinical microbiology practice, which makes the delineation of Acinetobacter species often problematic and difficult. In this way, we present the first case of bacteraemia caused by A. junii in a patient with acute leukaemia treated with allogenic haematopoietic cell transplantation (HCT). 134 Artigos Científicos - Espanha CASE REPORT A 43-year-old female diagnosed of acute lymphoblastic leukaemia type B in 2004, finished her chemotherapy treatment in June 2006. In February 2009, the patient presented a late relapse with bone marrow and central nervous system involvement. After achieving a second complete remission, the patient was treated with an HCT from a mismatched unrelated donor. In the first month after the HCT, the patient developed acute cutaneous graft-versus-host disease grade 2 (GVHD), resolved after treatment with prednisone (1 mg/kg/day). The patient was discharged with a good status performance. On day +36 after HCT, the patient was readmitted because of fever without neutropenia. Empirical therapy, initially with piperacillin/tazobactam (4/0.5 g/8h iv) and oral levofloxacin (500 mg/24h) and later with meropenem (1 g/8h), teicoplanin (10 mg/Kg/24h) and oral posaconazole (200 mg/8h) was unsuccessful. Treatment with intravenous cotrimoxazole (TMP 20 mg/Kg/24h and SMX 100 mg/kg/24h divided in four doses) was added because of a suspected toxoplasmosis that was not confirmed by investigating of Toxoplasma DNA in blood by PCR. The patient developed pancytopenia, laboratory signs of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP) and clinical features of GVHD progression. Prednisone was increased to 2 mg/Kg/day and finally fever disappeared. On day +63 after HCT, the patient presented a new episode of fever (39.5ºC). In this moment, the patient presented 2.700/mm3 leucocytes with 40% of neutrophils, haemoglobin 7.8 g/dL and platelets count of 3.000/mm3 and she was receiving piperacillin/tazobactam (4/0.5 g/8h iv). Three sets of blood cultures were drawn in a 30 minutes period. In the first two blood cultures, the isolates appeared as Gram-negative, strictly aerobic, non-fermenting, non-motile, catalasepositive, oxidase-negative coccobacillus, with the times to detection of 24.6 h and 25.3 h (BACTEC 9240 Blood Culture System, Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks, Md.). No growth was observed in the third set of blood culture. 135 Artigos Científicos - Espanha The isolate was identified as Acinetobacter lwoffii by MicroScan Walk-Away® (Siemens Healthcare Diagnostic Inc., West Sacramento, CA), with 98.7% of presumptive identification. To confirm the species identification, Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis - ARDRA (Vaneechoutte et al., 1995), was performed using firstly the enzymes CfoI, AluI, MboI, RsaI, MspI. An ARDRA profile 12123 compatible with both A. junii (genomic species 5) and unnamed genomic species 17 was obtained. To differentiate between these two options, a further restriction analysis was made with the enzyme BfaI. A restriction pattern 3 was obtained, confirming the isolate identification as A. junii. Antibiotic susceptibility was determined by Etest strips (AB Biodisk, Solna, Sweden), according to the manufacturer’s recommendations. According to CLSI breakpoints (CLSI, 2010), the isolate was susceptible to piperacillintazobactam (MIC, ≤ 0.015 µg/ml), imipenem (MIC, 0.125 µg/ml), meropenem (MIC, 0.125 µg/ml), trimethoprim-sulfamethoxazole (MIC, 0.25 µg/ml), minocycline (0.25 µg/ml), ampicillinsulbactam (0.50 µg/ml), cefepime (MIC, 1 µg/ml), doxycycline (MIC, 1 µg/ml), gentamicin (MIC, 1 µg/ml), amikacin (MIC, 2 µg/ml), ceftazidime (MIC, 2 µg/ml), tetracycline (4 µg/ml) and levofloxacin (MIC, 2 µg/ml), and resistant to ciprofloxacin (MIC, 4 µg/ml). In addition, the following antimicrobial agents (for which breakpoints from the CLSI are not available) were also tested: cephalothin (MIC, 1 µg/ml), tigecycline (MIC, 1 µg/ml), amoxicillin-clavulanate (2 µg/ml), aztreonam (MIC, 4 µg/ml), chloramphenicol (MIC, 4 µg/ml), cefoxitin (MIC, 8 µg/ml), ampicillin (MIC, 128 µg/ml). No subsequent A. junii strain was isolated from the patient. After the susceptibility testing results were obtained, therapy with piperacillin/tazobactam (4/0.5 g/8h iv) was maintained. The central venous catheter, without any signs of local infection, was removed two days after obtaining the blood cultures. No further complications due to A. junii infection were observed in the course of 8 days of treatment with piperacillin/tazobactam. A resolution of the signs and symptoms was observed, especially after the catheter removal, and clearance of infection was confirmed by the subsequent blood cultures realized in the next two 136 Artigos Científicos - Espanha weeks. The patient died one month later because of an unfavorable evolution of GVHD, associated with TTP and cytomegalovirus infection 137 Artigos Científicos - Espanha DISCUSSION Although the immediate source of the infection could not be identified in this case, as the removed central catheter was not sent for microbiological culture, the significant improvement observed in the clinical course of the infection after catheter withdrawal, probably indicates that this device was associated with the episode of bacteraemia, which could justify the isolation of this pathogen, even with appropriate antibiotic therapy. Seifert and colleagues (Seifert et al., 1997) showed that human skin appears to be a natural habitat of some Acinetobacter species, especially A. lwoffii, A. johnsonii and A. genoespecies 3. The others species founded, including A. junii, were described as colonizers only in hospitalized patients. They observed that these species have also been recovered from blood cultures of patients with catheter-related bacteraemia. Interesting, A. baumannii and A. genoespecies 13TU were rarely founded on human skin. A few reports of nosocomial outbreaks caused by A. junii have been described (de Beufort et al., 1999; Kappstein et al., 2000). Kappstein et al. (2000) reported an outbreak of bacteraemia in paediatric oncology patients in whom aerators may act as reservoir for this pathogen. They also described that the water system was contaminated with A. junii and recommended that for highrisk areas, aerators should be avoided. In another study, de Beaufort et al. (1999) described six cases of sepsis in a neonatal unit, and concluded that intravenous fat emulsion was implicated as a possible source of the infection. However, community-acquired infections associated with A. junii have also been reported (Chang et al., 2000; Prashanth et al., 2000, Borràs et al., 2007), showing the potential of this opportunistic pathogen to cause infection in humans. A previous study evaluating the clinical characteristics of patients with A. junii infections, reported that this pathogen affected mainly patients who have had prior antimicrobial therapy, invasive procedures, or malignancy (Hung et al., 2009). The study also showed that infections caused by this pathogen were primarily bacteraemia and the isolates remained susceptible to the majority of 138 Artigos Científicos - Espanha the antimicrobial agents tested. These high rates of bacteraemia observed, are probably associated with the fact that, in general, the group of patients susceptible to acquired infection by A. junii show serious underlying diseases and therefore need invasive procedures, which act as reservoirs and a port of entry for the infection, as previously described. Higgins and colleagues (Higgins et al., 2001) have tested rare non-fermenting Gram-negative bacteria, including A. junii isolates, against different antibiotics and biocides, and concluded that despite being susceptible to certain antimicrobial agents in vitro, some isolates were still able to cause bacteraemia after antibiotic therapy. Our case is in accordance with this observation, as the patient was treated as empirical therapy with piperacillin/tazobactam, and subsequently developed a bloodstream infection caused by an organism susceptible to this antimicrobial agent. However, it should be considered that at the moment of the episode of bacteraemia, the patient was receiving corticosteroid therapy. Although A. junii is capable of causing serious infections, they are generally, non-fatal because the microorganism is commonly susceptible to antimicrobial agents (Bernards et al., 1997). However, Peleg et al. (2006) have identified a carbapenem-resistant A. junii blood culture isolate producing OXA-58 and IMP-4. In another study, Marquè et al. (2005) described the spread of the plasmid-mediated OXA-58 in Acinetobacter spp. clinical isolates from southern Europe, including an A. junii isolate carrying a 150-kb plasmid harbouring OXA-23 and OXA-58. The acquisition of resistant genes, typically associated with A. baumannii, by A. junii clinical isolates is a concern, since the therapeutic options to treat these infections become limited. A retrospective study described by van de Broek et al. (2009) demonstrated in a university hospital, under endemic conditions, the importance of others species of Acinetobacter non-baumannii as a cause of nosocomial infection. The frequency of Acinetobacter genomic species 3 was the same obtained by A. baumannii. Surprising, A. lwoffii represent 11% of the 359 strains evaluated in the study. 139 Artigos Científicos - Espanha Between the 20 different species identified, A. ursingii, A. johnsonii and A. junii were also frequent, presenting, 13, 13 and 12 isolates, respectively. Although the therapy is guided primarily by the susceptibility pattern of the isolate and not by the species identification, special attention should be given to the correct identification of Acinetobacter non-baumannii species that will contribute to a better understanding of the epidemiology and the real clinical impact of these species as a cause of infections in humans. The majority of the reports describing infections caused by A. junii, used as confirmatory identification test a molecular method, especially the sequence of the 16S rRNA gene (Seifert et al., 1997; Linde et al., 2002; Borràs et al., 2007; Hung et al., 2009), showing the importance of molecular methods in the correct identification of the species included in the genus Acinetobacter. 140 Artigos Científicos - Espanha REFERENCES Bergogne-Bérézin, E. & Towner, K. J. (1996). Acinetobacter spp. as nosocomial pathogens: microbiological, clinical, and epidemiological features. Clin Microbiol Rev 9, 148-165. Bernards, A. T., de Beaufort, A. J., Dijkshoorn, L. & van Boven, C. P. (1997). Outbreak of septicaemia in neonates caused by Acinetobacter junii investigated by amplified ribosomal DNA restriction analysis (ARDRA) and four methods. J Hosp Infect 35, 129-140. Borràs, M., Moreno, S., Garcia, M., Martín, M. L., Manonelle, A. & Fernández, E. (2007). Acinetobacter junii causes refractory peritonitis in a patient on automated peritoneal dialysis. Perit Dial Int 27, 101-102. Chang, W. N., Lu, C. H., Huang, C. R. & Chuang ,Y. C. (2000). Community-acquired Acinetobacter meningitis in adults. Infection 28, 395-397. CLSI. (2010). Performance Standards for antimicrobial susceptibility testing - Twentieth edition. Informational Supplement M100-S20. Wayne, PA: Clinical Laboratory Standard Institute, de Beaufort, A. J., Bernards, A. T., Dijkshoorn, L. & van Boven, C. P. (1999). Acinetobacter junii causes life-threatening sepsis in preterm infants. Acta Paediatr 88, 772-775. Gerner-Smidt, P., Tjernberg, I. & Ursing, J. (1991). Reliability of phenotypic tests for identification of Acinetobacter species. J Clin Microbiol 29, 277-282. Higgins, C. S., Murtough, S. M., Williamson, E., Hiom, S. J., Payne, D. J., Russell, A. D. & Walsh, T. R. (2001). Resistance to antibiotics and biocides among non-fermenting Gramnegative bacteria. 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Regional Occurrence of Plasmid-Mediated Carbapenem-Hydrolyzing Oxacilinase OXA-58 in Acinetobacter spp. in Europe. J Clin Microbiol 43, 4885-4888. Peleg, A. Y., Franklin, C., Walters, L. J., Bell, J. M. & Spelman, D. W. (2006). OXA-58 and IMP-4 Carbepenem-hidrolyzing β-lactamases in an Acinetobacter junii blood culture isolate from Australia. Antimicrob Agents Chemoter 50, 399-400. Prashanth, K., Ranga, M. P., Rao, V. A. & Kanungo, R. (2000). Corneal perforation due to Acinetobacter junii: a case report. Diagn Microbiol Infect Dis 37, 215-217. Seifert, H., Dijkshoorn, L., Gerner-Smidt, P., Pelzer, N., Tjernberg, I. & Vaneechoutte, M. (1997). Distribution of Acinetobacter Species on Human Skin: comparison of phenotypic and genotypic identification methods. J Clin Microbiol 35, 2819-2825. van de Broek, P. J., van der Reijden, T. J. K., van Strijen, E., Helmig-Schurter, A. V., Bernards, A. T. & Dijkshoorn, L. (2009). 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Among them, 91 (11.3%) were A. baumannii isolates that were recovered mainly from the respiratory tract (70.3%) and bloodstream (24.2%). Susceptibility testing was performed by CLSI broth microdilution (3). The detection of metallo-β-lactamase (MβL) and carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase (CHDL)-encoding genes was performed by multiplex PCR (5,7,9) and confirmed by sequencing. The presence of the insertion sequence ISAba1 upstream of the CHDL-encoding genes was also investigated. Genetic relatedness among CHDL-producing A. baumannii isolates, including the first OXA-23-producing A. baumannii clone isolated in Brazil (4), was evaluated by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE). A total of 83/91 (91.2%) isolates were resistant to carbapenems. We also observed low rates of susceptibility to amikacin (18.7%), ceftazidime (12.1%), cefepime (8.8%), piperacillin- tazobactam (3.3%), and ciprofloxacin (3.3%). In contrast, most A. baumannii isolates were susceptible to polymyxin B (MIC90, 1 µg/ml; 97.8% of the isolates were susceptible). MβL-encoding genes were not identified in our study, as was also reported by Antonio et al. (1). However, we identified the blaOXA-23 gene in carbapenem-resistant isolates more frequently than in the former study (83.5% versus 41.7%). The blaOXA-23 gene was found in all carbapenemresistant isolates from the cities of Belo Horizonte, Blumenau, Curitiba, and São Luís, followed by 143 Artigos Científicos - Brasil Rio de Janeiro (93.7%), Porto Alegre (80.0%), and São Paulo (69.0%). These results are in accordance with previous local reports (2, 4, 6) that emphasize that this gene is widespread in our country. The ISAba1 element was positioned upstream of blaOXA-23 in all isolates, whereas no insertion sequence was observed upstream of blaOXA-51. Although A. baumannii carrying blaOXA-58 and blaOXA-72 had recently been described in Brazil (1, 9), no isolates carrying these variants were found in our study. Nine distinct PFGE clones were identified among the 76 OXA-23-producing A. baumannii isolates. The predominance of a single clone (clone A [36.8% of the isolates]) was observed in isolates collected from six distinct Brazilian cities. This clone exhibited a PFGE profile similar to that of the first Brazilian clone producer of OXA-23 (4). A. baumannii belonging to clones B (17.1%) and D (9.2%) were also identified in isolates collected from distinct cities, while other genotypes were identified in specific locations. While Antonio et al. (1). reported a high prevalence of the blaOXA-143 gene (58.3%), we found that only 7 of 83 (8.4%) A. baumannii isolates carried this gene. These isolates were collected from a few hospitals located in the cities of São Paulo (n = 6) and Rio de Janeiro (n = 1). In both studies, the majority of OXA-143-producing A. baumannii isolates were recovered from cities located in São Paulo State. However, while Antonio et al. observed that 70% (21/30) of the isolates from this region carried the blaOXA-143 gene, in the present study, we identified this resistance determinant in only 20.7% (6/29) of isolates collected from São Paulo. Moreover, we have observed the predominance of a single PFGE clone among the seven OXA-143-producing A. baumannii isolates, which contrasts with results obtained by Antonio et al., in which 7 distinct enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence (ERIC) PCR clones harbored the blaOXA-143 gene. Nevertheless, in their study, the high prevalence of OXA-143-producing isolates could also be partially justified by the intrahospital spread of a single clone, which corresponded to 57.1% of all OXA-143-producing isolates (1). The high prevalence of blaOXA-23 found in our 144 Artigos Científicos - Brasil study may also be justified by intra- and interhospital spread of endemic clones. The results of these two studies show that the prevalence of CHDLs may vary according to the disseminated clone in a specific hospital or region and emphasize the importance of appropriate adherence to infection control measures. Thus, wide national surveillance studies are necessary to analyze the real prevalence of CHDLs in Brazilian hospitals. REFERENCES 1. Antonio, C.S., P.R. Neves, M. Medeiros, E.M. Mamizuka, M.R.E. de Araújo and N. Lincopan. 2011. High Prevalence of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii carrying the blaOXA-143 gene in Brazilian Hospitals. Antimicrob. Agents Chemother. 55:1322-1323. 2. Carvalho, K.R., A.P. Carvalho-Assef , G. Peirano, L.C. Santos, M.J. Pereira, and M.D. Asensi. 2009. Dissemination of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii genotypes carrying blaOXA-23 collected from hospitals in Rio de Janeiro, Brazil. Int. J. Antimicrob. Agents. 34:25-28. 3. Clinical and Laboratory Standards Institute. 2009. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically: Approved Standard - Eighth Edition M07-A8. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA, USA. 4. Dalla-Costa, L.M., J. M. Coelho, H.A.P.H.M. Souza, M.E.S. Castro, C.J.N. Stier, K.L. Bragagnolo, A. Rea-Neto, S.R. Penteado-Filho, D.M. Livermore and Neil Woodford. 2003. Outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the OXA-23 enzyme in Curitiba, Brazil. J. Clin. Microbiol. 41:3403-3406. 5. Higgins, P.G., L. Poirel, M. Lehmann, P. Nordmann, and H. Seifert. 2009. OXA-143, a novel carbapenem-hydrolyzing class D beta-lactamase in Acinetobacter baumannii. Antimicrob. Agents. Chemother. 53:5035-5038. 145 Artigos Científicos - Brasil 6. Martins, A.F., R. Kuchenbecker, T. Sukiennik, R. Boff, K.C. Reiter, L. Lutz, A.B. Machado, and A.L. Barth. 2009. Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the OXA-23 enzyme: dissemination in Southern Brazil. Infection. 37:474-476. 7. Mendes, R.E., K.A. Kiyota, J. Monteiro, M. Castanheira, S.S. Andrade, A.C. Gales, A.C.C. Pignatari and S. Tufik. 2007. Rapid detection and identification of metallo-betalactamase-encoding genes by multiplex real-time PCR assay and melt curve analysis. J. Clin. Microbiol. 45: 544-547. 8. Woodford, N., M.J. Ellington, J.M. Coelho, J.F. Turton, M.E. Ward, S. Brown, S.G. Amyes and D.M. Livermore. 2006. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp. Int. J. Antimicrob. Agents. 27: 351-353. 9. Werneck, J.S., R.C. Picão, C.G. Carvalhaes, J.P. Cardoso and A.C. Gales. 2011. OXA-72-producing Acinetobacter baumannii in Brazil: a case report. J. Antimicrob. Chemother. 66: 452-454. Jéssica S. Werneck* Renata C. Picão Raquel Girardello Rodrigo Cayô Vitor Marguti Laboratório ALERTA, Division of Infectious Diseases, Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, São Paulo, Brazil. Líbera Dalla-Costa Hospital de Clínicas, Universidade Federal do Paraná, Curitiba, Brazil. 146 Artigos Científicos - Brasil Ana C. Gales Laboratório ALERTA, Division of Infectious Diseases, Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, São Paulo, Brazil. *Phone/Fax: 55 (11) 55764748 E-mail: [email protected] 147 Artigos Científicos - Brasil Temporal Dynamic of Carbapenemase-producing Acinetobacter spp. in a Brazilian Teaching Hospital Through an 18-Year Period: Earlier Dissemination of blaOXA-143 in Brazil. Rodrigo Cayô1, Cecília Godoy Carvalhaes1, Raquel Girardello1, Adryella de Paula Ferreira Luz1, André Mario Doi1, Antonia Maria de Oliveira Machado2, Antonio Carlos Campos Pignatari1, Ana C. Gales1. Short running title: Temporal Dynamic of Carbapenemase-producing Acinetobacter spp. in Brazil. 1Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC & Laboratório ALERTA, Discipline of Infectology, Department of Medicine, Federal University of São Paulo - UNIFESP, São Paulo, Brazil. 2Laboratório Central, Hospital São Paulo - HSP, Federal University of São Paulo - UNIFESP, São Paulo, Brazil. *Corresponding author. Current Address: Laboratório Especial de Microbiologia Clínica - LEMC, Rua Leandro Dupret, 188, Vila Clementino, São Paulo - SP, Brazil. Tel/Fax.: +55 11 50812965. E-mail: [email protected]. 148 Artigos Científicos - Brasil ABSTRACT The carbapenem resistance rates in Brazilian Acinetobacter baumannii isolates is extremely higher, and are associated with the production of two major carbapenemases, OXA-23 and OXA143. The aim of this study was to evaluate the temporal dynamic of carbapenemases in a collection of Acinetobacter spp. isolates collected during an 18 year-period in a Brazilian hospital. A 215 non-duplicate isolates showing high carbapenem resistance rates were analyzed from 1993 to 2010. A. baumannii was responsible for 96.3% of the isolates. The blaOXA-23 gene was detected in 36.7% (79/215) of the isolates, followed by blaOXA-143 (n=49, 22.7%), blaIMP-1 (n=24, 11.2%), blaIMP-10 (n=3, 1.4%) and blaOXA-72 (n=2, 0.9%). The first A. baumannii isolate carrying the blaOXA-143 gene was identified in 1995, seven years before the introduction of blaOXA-23 in 2002 and its widespread in the following 8 years of the study. We described for the first time the presence of IMP-1 in A. pittii and A. bereziniae, and OXA-58 in A. genomic species “Close to 13TU”. The OXA-143 is an ancient enzyme. The dynamic of carbapenemase production is complex and varied drastically according to time . 149 Artigos Científicos - Brasil Acinetobacter baumannii is a multidrug-resistant opportunistic pathogen associated with a variety of nosocomial infections and responsible for outbreaks worldwide (1). Its ability to acquire antimicrobial resistance and to survive under different environmental and nutritional conditions makes this pathogen extremely successful (2). Carbapenems are considered to be the most active antimicrobial agents against A. baumannii (3). However, carbapenem resistance is rising and it is mainly associated with the acquired carbapenem-hydrolyzing class D-lactamases (CHDLs) in A. baumannii (4). In Brazil, the carbapenem resistance rates range from 56% to 73% among A. baumannii isolates (5,6) and vary considerably according to the geographic region. Because of the elevated carbapenems resistance rates, polymyxins have been widely used as the last therapeutic options to treat the A. baumannii (7). The mechanisms of carbapenem resistance found in these isolates are mostly related to the production of CHDL OXA-23, indeed the most prevalent and disseminated carbapenemase around the country (8,9), production of metallo-β-lactamase (MβLs) IMP-1 (10) and, very sporadicall, other CHDLs like OXA-72 and OXA-58 (11,12,13). Although OXA-143 has been recently described in a Brazilian isolates collected in 2004 (14), studies have shown that the prevalence of this enzyme is higher in public hospitals from the Brazilian southeast region (11,15). The aim of this study was to evaluate the temporal dynamic of carbapenemases in a collection of Acinetobacter spp. clinical isolates collected during an 18 year-period in a tertiary teaching hospital located in São Paulo, Brazil. This work was presented in part as a poster presentation at the 51th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy - ICAAC in Chicago, 2011. A total of 215 non-duplicate Acinetobacter spp. clinical isolates showing high carbapenem resistance rates were studied. These isolates were collected from different body sites of patients hospitalized at a 600-bed hospital located in São Paulo city from January of 1993 to December of 2010. In general, it was included one isolate per month. Phenotypic identification of the isolates was performed by MicroScan-WalkAway® automated system (Siemens Healthcare Diagnostic 150 Artigos Científicos - Brasil Inc., West Sacramento, CA) or Phoenix® automated microbiology system (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD). Presumptive identification of the isolates as A. baumannii was done by amplifying the complete open reading frame of blaOXA-51-like gene, which is considered chromosomally intrinsic to this species (4), using primers pairs OXA-69A and OXA-69B (Table 1). Both primers were also used to detect the presence of ISAba1 upstream of the OXA-51 variants (16). Identification was confirmed at species level by sequencing analysis of partial regions of RNA polymerase β subunit (rpoB) gene using primers pairs Ac969F (5’- TAYCGYAAAGAYTTGAAAGAAG-3’) and Ac1598R (5’-CGBGCRTGCATYTTGTCRT-3’), as previously published (17). The clonal relationship of the 215 Acinetobacter spp. isolates was determined by Rep-PCR using the primer pairs REP-1 (5´-IIIGCGCCGICATCAGGC-3´) and REP-2 (5´ACGTCTTATCAGGCCTAC-3´), as described previously (18). The amplified fragments were separated on a 1.5% (w/v) agarose gels for 240 min. For identification of carbapenemase encoding genes and insertion sequence ISAba1, the specific primers as shown in Table 1 were used. Nucleotide sequencing to confirm the enzyme gene types was performed using ABI Prism 3500 Series (Applied Biosystems, Warrington, UK). Among the 215 carbapenem-resistant Acinetobacter spp. isolates recovered during the 18-year period of study, A. baumannii was the most frequent species (96.3%) identified in this collection. Other three species, Acinetobacter genomic species “Close to 13TU” (n=2) and A. pittii (formerly A. genomic species 3; n=1), included in the A. calcoaceticus-baumannii complex, and A. bereziniae (formerly A. genomic species 10; n=1) were also identified. Although all A. baumannii isolates carried the chromosomally encoded blaOXA-51-like gene, none of other three non-baumannii species harbored this CHDL, including the closest related species, A. pittii and A. genomic species “Close to 13TU”. For a long time, the gene encoding CHDL OXA-51-like was considered exclusive to the A. baumannii chromosome (4) and, because of this, its detection has been widely used as an indirect method for A. baumannii identification (19). However, a report describing the 151 Artigos Científicos - Brasil occurrence of plasmids carrying the genetic structure ISAba1-blaOXA-51-like, firstly disseminated among A. baumannii isolates in Taiwan (20) and, later, detected in Acinetobacter nosocomialis (formerly Acinetobacter genomic species 13TU) and Acinetobacter genomic species “Close to 13TU”isolates (21,22), indicated that detection of blaOXA-51 like could not be used for identification purposes. As expected, the OXA-23 was the most prevalent carbapenemase founded in 36.7% of A. baumannii isolates (Table 2), followed by OXA-143 (22.7%) and IMP-1 (11.2%). Our results are in contrast to those reported recently in 2000-bed teaching hospital in São Paulo city (23). In this study, Mostachio and colleagues described a high prevalence of OXA-143 (76%) compared with 18% of OXA-23. In the same study, the authors reported only five isolates carrying the MβL IMP1 (23). Another study evaluating different Brazilian hospitals also reported a high prevalence of OXA-143 (58.3%), but showed a prevalence of OXA-23 (41.7%) superior to that reported by Mostachio and colleagues (11,23). In our study, the OXA-23-producing A. baumannii isolates were grouped under 19 different Rep-PCR patterns in accordance with a previous study that reported the polyclonal character of A. baumannii OXA-23-producers from distinct Brazilian geographic regions (15). Only two A. baumannii isolates, were found harboring the blaOXA-72. This results also agrees with previously studies that also showed a rare prevalence of this CHDL in our country (11,13). Interesting, blaOXA-143 seems to be more ancient CHDL encoding gene. It was initially found in an A. baumannii isolated in the year 1995 (Table 2), almost eight years before the introduction of OXA-23-producing A. baumannii clones in the same institution, and fourteen years before its first description in 2004 (14). However, the isolates carrying the blaOXA-23 seems to be more adapted to the nosocomial environment, since a faster widespread dissemination of this CHDL in our institution was observed in the next nine years after its introduction in 2002. The blaOXA-143 was found concomitantly in an IMP-1-producing- and in six OXA-23-producing-A. baumannii isolates. Two major clones of OXA-143-producing A. baumannii were observed in two 152 Artigos Científicos - Brasil distinct periods, between 1995 and 1998 (n=10 isolates) and 2004 and 2010 (n=29 isolates), respectively. Almost 70% of the OXA-143-producing isolated in the period of study belonged to both clones. Previous studies showed that IMP-1 was the most frequent A. baumannii carbapenemase found in our institution, located in a class 1 integron called In86 (24), which was also described in Klebsiella pneumoniae isolates in São Paulo (25). In this study, we found two isolates of A. pittii and A. bereziniae carrying the blaIMP-1 gene in 2001 and 2007, respectively, suggesting the high ability of In86 mobilization. In August 2000, three clonal A. baumannii isolates carrying the MβL IMP-10 were detected. These isolates probably were involved in a small hospital outbreak. To our knowledge this is the first report of IMP-10-producing A. baumannii in Brasil. The most ancient carbapenemase encoding gene found in our study was blaOXA-58. Although OXA-58 has been previously reported in Brazilian A. baumannii isolates (11), in the present study blaOXA-58 was found to be carried by two A. genomic species “Close to 13TU” belonging to the same clone, isolated in 1993 and 1997, respectively. The blaOXA-58 was first described in a French A. baumannii isolated, in 2003. (26) It has also been reported in other Acinetobacter species, especially in A. pittii isolated from Spain (27). To the best of our knowledge, both OXA-58 isolates reported in the present study are probably the most ancient reported isolates carrying this CHDL encoding gene worldwide. We also observed an earlier dissemination of the blaOXA-143 gene in A. baumannii. This study shows how dynamic and complex was the carbapenemase production among Acinetobacter spp. overtime in our setting. In addition, it pints out for the necessity of further studies to understand the evolution of this carbapenemase encoding genes among Acinetobacter spp. . 153 Artigos Científicos - Brasil REFERENCES 1. Peleg, A. Y., H. Seifert, D. L. Paterson. 2008. Acinetobacter baumannii: emergence of a successful pathogen. Clin. Microbiol. Rev. 21:538-582. 2. Towner, K. J. 2009. Acinetobacter: an old friend, but a new enemy. J. Hosp. 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Β-lactamases Class A β-lactamase KPC-like GES-like Primer Nucleotide Sequence (5'-3') Usage Reference TCGCTAAACTCGAACAGG TTACTGCCCGTTGACGCCCAATCC TCACGCACTATTACTGGC TATTTGTCCGTGCTCAGG Amplification Amplification Amplification Amplification 28 28 29 29 IMP.F IMP.R Intl.F qac.R VIM.F VIM.R SPM-1.F SPM-1.R GIM-1.F GIM-1.R SIM-1.F SIM-1.R NDM-1.F NDM-1.R CCAAACYACTASGTTATC GAATAGRRTGGCTTAAYTCTC GCCTGTTCGGTTCGTAAGCT CGGATGTTGCGATTACTTCG AATGCGCAGCACCAGGATAG GTTTGGTCGCATATCGCAAC CCTTTTCCGCGACCTTGATC CTAAATCGAGAGCCCTGCTTG CGGAACGACCATTTGAATGG TCAATTAGCTCTTGGGCTGAC TGGCCTGTTCCCATGTGAG GTACAAGGGATTCGGCATCG CTGGGTCGAGGTCAGGATAG GGCGTTAGATTGGCTTACACC Amplification/sequencing Amplification/sequencing Sequencing Sequencing Amplification Amplification Amplification Amplification Amplification Amplification Amplification Amplification Amplification/sequencing Amplification/sequencing 30 30 31 31 30 30 30 30 30 30 30 30 This study This study OXA-23.F OXA-23.R ISAba1.F OXA-24.F ATTTCTGACCGCATTTCCAT GATCGGATTGGAGAACCAGA GTCAGTTGCACTTGGTCG AGTTGAGCGAAAAGGGGATT Amplification Amplification Amplification Amplification 32 32 KPC F KPC.R GES. F GES. R Class B β-lactamase IMP-like VIM-like SPM-1 GIM-1 SIM-1 NDM-1 Class D β-lactamase OXA-23-like OXA-24-like 32 159 Artigos Científicos - Brasil OXA-51-like OXA-58-like OXA-143 OXA-48 OXA-24.R Pre-OXA-24.F Pre-OXA-24.R OXA-51.F OXA-51.R OXA-69.F OXA-69.R OXA-58.F OXA-58.R OXA-58-1TOT OXA-58-2TOT Pre-OXA-143.F Pre-OXA-143.R OXA-48.F OXA-48.R GGTTAGTTGGCCCCCTTAAA AYTTCGBATAAYSSCCATTATGTTAAATTAAAAGA ATTTCGYATAASGYGTATTATGTTAATTTTAGAAA TGGATTGCACTTCATCTTGG TAATGCTTTGATCGGCCTTG CTAATAATTGATCTACTCAAG CCAGTGGATGGATGGATAGATTATC CCCCTCTGCGCTCTACATAC AAGTATTGGGGCTTGTGCTG ATGAAATTATTAAAAATATTG TTATAAATAATGAAAAACACC TTGGAAAATTATATAATCCC AGTTAACTTTCAATAATTG TTGGTGGCATCGATTATCGG GAGCACTTCTTTTGTGATGGC Amplification Sequencing Sequencing Amplification Amplification Sequencing Sequencing Amplification Amplification Sequencing Sequencing Amplification/sequencing Amplification/sequencing Amplification Amplification 32 This study This study 32 32 16 16 32 32 27 27 14 14 33 33 160 Artigos Científicos - Brasil Table 2 - Frequency of carbapenemase-producing Acinetobacter spp. isolates in a Brazilian teaching hospital during an 18-year period. Species (rpoB) Year of isolationa Nº of isolates (%)b blaOXA-51 A. baumannii 1994-2002, 2004-2005 43 (20%) blaOXA-51 + blaOXA-23 A. baumannii 2002-2003, 2005-2010 79 (36.7%) blaOXA-51 + blaOXA-143 A. baumannii 1995-1998, 2004-2010 49 (22.7%) blaOXA-51 + blaOXA-72 A. baumannii 2008, 2009 2 (0.9%) blaOXA-51+ blaOXA-23 + blaOXA-143 A. baumannii 2007-2010 6 (2.8%) blaOXA-51 + blaIMP-1 A. baumannii 1996, 1999-2001, 2003-2006, 2010 24 (11.2%) blaOXA-51 + blaIMP-1 + blaOXA-143 A. baumannii 1997 1 (0.5) blaOXA-51 + blaIMP-10 A. baumannii 2000 3 (1.4%) blaIMP-1 A. pittii 2001 1 (0.5%) blaIMP-1 A. bereziniae 2007 1 (0.5%) Carbapenemase encoding genes content A. genomic species 1993, 1997 “Close to 13TU” a. Years in bold represent when the first isolate carrying the respective carbapenemase encoding gene firstly detected. blaOXA-58 2 (0.9%) b. Four isolates could not be identified by the sequencing analysis of the rpoB gene and were not included in the table. 161 Artigos Científicos - Brasil Detection of OXA-231, a new variant of blaOXA-143, in Acinetobacter baumannii from Brazil: a case report Bárbara Gionco1*, Jacinta S. Pelayo1, Emerson J. Venancio2, Rodrigo Cayô3, Ana C. Gales3, Floristher E. Carrara-Marroni4. 1Department 2Department of Microbiology, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brazil. of Science Pathological, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brazil. 3Laboratório ALERTA, Division of Infectious Diseases, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, São Paulo, Brazil. 4Department of Pathology, Clinical and Toxicological Analysis, Hospital Universitário de Londrina, Universidade Estadual de Londrina, Londrina, Paraná, Brazil. Keywords: carbapenems, oxa-type beta-lactamase, polymyxin B, drug resistance *Corresponding author. Current Address: Universidade Estadual de Londrina. Rodovia Celso Garcia Cid, Pr 445, Km 380. CEP 86051-980, Londrina, Paraná, Brasil. Tel: +55 43 33715726; email: [email protected] 162 Artigos Científicos - Brasil Sir, In Brazil, the resistance rates to carbapenem range from 25% to 45% among A. baumannii isolates.1 The mechanisms of carbapenem resistance among these isolates are mainly associated with the production of two major carbapenem-hydrolysing class D carbapenemases (CHDL), OXA-23 and OXA-143.2,3 To date, OXA-143 is the single representative of this recently reported subgroup of CHDL. In contrast to the OXA-23 subgroup, which is widely disseminated in the Brazilian territory, OXA-143 has been only detected in A. baumannii isolated from hospitals located in São Paulo and Rio de Janeiro states so far.2-5 Analysis of the genetic environment of blaOXA-143 revealed that it was bracketed by two copies of the same replicase gene. It suggests that a homologous recombination process probably took part in the blaOXA-143 acquisition.4 This study reports the occurrence of OXA-231, a novel variant of OXA-143, in an A. baumannii clinical isolate (Ac-141 strain) recovered from a tertiary teaching hospital located in Southern Brazil. In October 2007, a 72-year-old woman was admitted at the emergency room of the Hospital Universitário de Londrina (HU), a teaching hospital located in the city of Londrina, state of Paraná, Brazil. The patient presented history of diabetes, hypertension and had previously been submitted to a transtibial amputation due an infected diabetic foot, at the HU, 25 days ago. On the day of admission, the patient presented fever, dyspnea and was diagnosed with pneumonia. Empirical therapy with cefepime [2 g, intravenously (iv), twice daily] and vancomycin [1.5 g, iv, once a day] was started. Five days after hospitalization, the patient got febrile and showed signals and symptoms of urinary tract infection. An ESBL-producing Klebsiella pneumoniae susceptible only to imipenem and amikacin was isolated from urine. Therapy with imipenem [500 mg, iv, four times a day] was initiated. Six days after imipenem administration, the patient remained febrile and developed signals of sepsis. A carbapenem-resistant A. baumannii isolate (Ac-141 strain) was recovered from the urine culture and antimicrobial therapy was replaced by polymyxin B [500.000 UI, iv, three-times a day] that was continued for ten days. The patient 163 Artigos Científicos - Brasil showed clinical improvement and was discharged after 15 days of hospitalization. The next urinary cultures were negative indicating that microbiological cure as achieved. The Ac-141 strain was initially identified as Acinetobacter calcoaceticus-baumannii complex by MicroScan-WalkAway automated system (Siemens Healthcare Diagnostic). The sequencing analysis of partial regions of RNA polymerase β subunit (rpoB) gene [zone 1 (350 bp, between positions 2,900 and 3,250) and zone 2 (450 bp, between positions 3,250 and 3,700)], as previously published,6 confirmed the identification at species level of the Ac-141 strain as A. baumannii. The partial sequence of rpoB gene obtained was deposited in the GenBank under accession number JQ676953. The minimal inhibitory concentrations (MIC) for ceftazidime, imipenem, meropenem, ampicillin-sulbactam and polymyxin B were confirmed by agar dilution method, according to the recommendations of the Clinical and Laboratory Institute (CLSI).7 According to susceptibility tests results, the Ac-141 strain was resistant to ampicillin/sulbactam (MIC, >128/64 mg/L), ceftazidime (MIC, >128 mg/L), cefepime (MIC, >16 mg/L), imipenem (MIC, 64 mg/L), meropenem (MIC, 64 mg/L), trimethoprim/sulfamethoxazole (MIC, >2/38 mg/L), amikacin (MIC, >4 mg/L), ciprofloxacin (MIC, >4 mg/L), levofloxacin (MIC, >4 mg/L), gentamicin (MIC, >8 mg/L) but susceptible only to polymyxin B (MIC, 1 mg/L). Ac-141 strain also showed low tigecycline MIC (1 mg/L). PCR targeting genes encoding CHDLs, metallo-β-lactamases (MβL) and KPC, were carried out as previously described.4,8,9 The PCR results showed that the Ac-141 strain carried the blaOXA-51 and blaOXA-143 genes. A subsequent PCR targeting both blaOXA-51 and the insertion sequence ISAba1 yielded a positive result. The ISAba1 upstream the blaOXA-51 is associated with the overproduction of this CHDL and contributed to increase the MICs of carbapenems against A. baumannii, which may result in high level of carbapenem resistance when other mechanisms are also present. DNA sequencing of the entire sequence of the blaOXA-143-like gene, using the pair primers previously published,4 identified a single mutation at nucleotide 671 that led to a unique 164 Artigos Científicos - Brasil amino acid substitution of a Aspartic acid for Alanine at position 230, according to the DBL numbering system.4 This new OXA-143 variant was named OXA-231 and its nucleotide sequence has been deposited in the GeneBank under the accession number JQ676953. Interesting, the Asp230Ala mutation was near the KSG (positions 216 to 218) conserved motif of the active site of the OXA-231 and adjacent to the key residue Methionine, which is very important from a structural point of view for the biochemical properties of OXA-24/40, a close related CHDL (88% of identity with OXA-143).4,10 A study conducted by Santillana et al. showed that a in vitro mutation in this residue caused a reduction in the catalytic efficiency of the OXA24/40 against the carbapenens and a noticeably increased in specificity for oxacillin.10 Thus, the effect of the substitution Asp230Ala can be unpredictable in structure of the OXA-231. Plasmid extract of the Ac-141 strain was obtained by the Kieser method11 followed by electrophoresis and subsequent Southern blot and hybridization with a blaOXA-231-specific probe using the Dig DNA Labelling and Detection kit (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany). The results showed that the blaOXA-231 gene was located on a plasmid of ~140 kb. Although it could not be possible to sequence all genetic environment of blaOXA-231 gene, the partial flanking sequences obtained until now (data not show) is similar to that described for blaOXA-143 gene.4 In our hospital, 75% of the A. baumannii isolates are resistant to carbapenems. The production of OXA-23 has been the main mechanism of carbapenem resistance found in these isolates. For instance, from August 2006 to August 2011, blaOXA-23 was detected in 68% of A. baumannii isolates that belonged to multiple clones (unpublished data). To our knowledge, this is the first description of OXA-143 cluster in an A. baumannii strain isolated in our hospital and in southern Brazil, and coincidently it is a novel variant of this cluster. Curiously, no additional OXA-143 or OXA-231 have been detected among the carbapenem-resistant A. baumannii isolates (n=125) during the 5-year period of study in our hospital. 165 Artigos Científicos - Brasil The detection of OXA-231 in Brazil is a cause of great concern and shows the potential of these new CHDL spread to other Brazilian regions. Although, only a single case involving OXA-231 was reported, continuous surveillance studies are of paramount importance to prevent its further dissemination. Lastly, we would like to emphasize the clinical and microbiological efficacy of polymyxin B in eradicating the infection caused by AC-141 strain. The clinical success probably was achieved because the urinary tract was the source of infection. Unfortunately, a distinct outcome could have observed if the respiratory tract was infected. In this manner, novel therapeutic agents are extremely necessary for treatment of multi-drug resistant Gram-negative bacilli. 166 Artigos Científicos - Brasil 1 Funding 2 Not to declare. 3 4 Transparency declarations 5 A. C. G. has received research funding and/or consultation fees from Janssen-Cilag, 6 Wyeth/Pfizer, Novartis and Sanofi-Aventis. Other authors have nothing to declare. 167 Artigos Científicos References 1. Rossi F. The challenges of antimicrobial resistance in Brazil. Clin Infect Dis 2011; 52:1138-43. 2. Werneck JS, Picão RC, Girardello R et al. Low prevalence of blaOXA-143 in private hospitals in Brazil. Antimicrob Agents Chemother 2011; 55:4494-5. 3. Dalla-Costa LM, Coelho JM, Souza HA et al. Outbreak of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii producing the OXA-23 enzyme in Curitiba, Brazil. J Clin Microbiol 2003; 41:3403-6. 4. Higgins PG, Poirel L, Lehmann M et al. OXA-143, a novel carbapenem hydrolyzing class D β -lactamase in Acinetobacter baumannii. Antimicrob Agents Chemother 2009; 53:5035-8. 5. Carvalho KR, Carvalho-Assef AP, Peirano G et al. Dissemination of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii genotypes carrying blaOXA-23 collected from hospitals in Rio de Janeiro, Brazil. Int J Antimicrob Agents 2009; 34:25-8. 6. La Scola B, Gundi VA, Khamis A, Raoult D. Sequencing of the rpoB gene and flanking spacers for molecular identification of Acinetobacter species. J Clin Microbiol 2006; 44:827-32. 7. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically-Eighth Edition: Approved Standard M07-A8. CLSI, Wayne, PA, USA, 2009. 8. Woodford N, Ellington MJ, Coelho JM et al. Multiplex PCR for genes encoding prevalent OXA carbapenemases in Acinetobacter spp. Int J Antimicrob Agents 2006; 27:351-3. 9. Ellington MJ, Kistler J, Livermore DM et al. Multiplex PCR for rapid detection of genes encoding acquired metallo-beta-lactamases. 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As infecções mais frequentes foram as do trato respiratório (41%), do sítio cirúrgico (14,8%), do trato urinário (12,7%), de pele e partes moles (11,5%) e de corrente sanguínea (9,6%) (Asensio et al., 2008). Os mesmos autores relataram que 34,5% dos isolados de A. baumannii na Espanha eram resistentes aos carbapenens, estas taxas eram ainda superiores (43,8%) em pacientes internados em UTI (Asensio et al., 2008). Talvez o dado mais impressionante no estudo espanhol, seja a taxa de infecções consideradas comunitárias (14%), ainda que os próprios autores tenham inferido que esse valor poderia ter sido superestimado, uma vez que o critério amplamente utilizado para classificação de uma infecção como comunitária (até 48 horas após a internação) pode ser falho (Asensio et al., 2008). Ainda assim, as taxas de resistência aos carbapenens na Espanha são inferiores àquelas observadas no Brasil, onde os dados do Programa SENTRY descrito por Gales e colaboradores (2012) relataram a preocupante taxa de 73% de resistência entre as 355 amostras de Acinetobacter spp. isoladas no período de 2008 a 2010 (Gales et al., 2012). Já no estudo Brazilian SCOPE (“Surveillance and Control of Pathogens of Epidemiological Importance”), conduzido por Marra e colaboradores (2011), onde foram avaliados somente isolados de corrente sanguínea adquiridas no ambiente hospitalar em 16 hospitais brasileiros, mostraram taxas de resistência inferiores, em torno de 56%, porém ainda superiores aos dados espanhóis 170 Discussão (Marra et al., 2011). A diferença observada no perfil de sensibilidade aos carbapenens entre os isolados de Acinetobacter spp. do programa SENTRY e do projeto Brazillian SCOPE é esperada, já que o SENTRY inclui também isolados do trato respiratório, onde geralmente as taxas de resistência aos carbapenens em bacilos Gram negativos não-fermentadores são sabidamente maiores (Friedland et al., 2003; Asensio et al., 2008). Embora as causas para tal acontecimento ainda sejam desconhecidas, acredita-se que um maior inoculo e um maior uso de procedimentos invasivos, principalmente em pacientes internados em UTIs, aliado a uma maior propensão para seleção de isolados resistentes observados nesse sítio de infecção, justifique, em parte, essa característica fenotípica entre os isolados de Acinetobacter spp. recuperados desse sítio corpóreo ou do trato respiratório (Asensio et al., 2008). Os dados do SENTRY na América Latina ainda apontam Acinetobacter spp. como o sexto patógeno mais frequente em ICS (7,2%), o terceiro em infecções do trato respiratório baixo (17,7%) e o sexto em infecções de pele e partes moles (9,9%) (Gales et al., 2012). Além disso, Acinetobacter spp. foi o quarto patógeno Gram negativo mais frequente nos centros médicos avaliados pelo programa na América Latina (n=845, 14,8%), ficando atrás somente de E. coli, P. aeruginosa e K. pneumoniae (Gales et al., 2012). De maneira similar, os resultados obtidos pelo projeto Brazilian SCOPE demonstrou que Acinetobacter spp. é o quarto agente infeccioso causador de ICS no Brasil (12,5%), sendo o segundo patógeno mais frequentemente isolado de ICS em pacientes internados em UTI (Marra et al., 2011). No mesmo estudo, foram também observadas altas taxas de mortalidade associada a ICS por Acinetobacter spp. em pacientes internados em UTI (65,2%), principalmente quando comparada as demais unidades hospitalares (39,6%). Essa maior predileção dos isolados de Acinetobacter spp. por pacientes de UTI também foi observada pelo estudo de Asensio e colaboradores (2008) na Espanha, onde, inclusive, os isolados apresentaram as maiores taxas de resistência aos carbapenens comparada às demais 171 Discussão unidades hospitalares, principalmente nas amostras isoladas de ICS (63,3%) e do trato respiratório (48%). O estudo Espanhol observou também que as taxas de resistência aos carbapenens variaram consideravelmente entre as “comunidades autónomas” (Asensio et al., 2008), o equivalente a estados no Brasil. Dentre as “comunidades autónomas” que apresentaram as maiores taxas de resistência (> 40%), encontra-se a “Comunidad de Cantabria”, localizada no norte do país, e onde se localiza o HUMV, onde parte da presente tese foi desenvolvida. Dados recentes da União Européia, também demonstram diferenças drásticas no perfil de sensibilidade aos carbapenens entre os isolados de A. baumannii nos diferentes países que compõe o bloco (Kempf & Rolain, 2012). O estudo observou, de um modo geral, um aumento das taxas de resistência a esses antimicrobianos entre os países do sul quando comparado aos países do norte europeu, variando de 4% (Suécia), 8% (Alemanha) e 10-20% (França) a 55%, 60% e 85% na Inglaterra, Itália e Grécia, respectivamente (Kempf & Rolain, 2012). Nesse estudo, a Espanha apresentou 45% de resistência aos carbapenens. No Brasil, um estudo avaliando a epidemiologia molecular de 206 isolados de A. baumannii causadores de ICS do projeto Brazilian SCOPE, observou diferenças quanto ao perfil de sensibilidade aos carbapenens nas diferentes regiões geográficas brasileiras (dados não publicados*). As regiões nordeste e centro-oeste apresentaram as maiores taxas de resistência (> 69%), seguida pelas regiões sudestes (> 60%) e nordeste (50%). A região sul apresentou as menores taxas de resistência, com apenas 29% dos isolados resistentes (dados não publicados*). Algumas considerações precisam ser feitas ao se comparar as taxas de resistência aos carbapenens entre Brasil e Espanha. Primeiramente o Brasil apresenta uma área territorial de proporções continentais, quase 17 vezes o território da Espanha, com uma população estimada em 192 milhões de habitantes frente aos 46 milhões de espanhóis. As dimensões observadas em nosso país dificultam a implementação de políticas de vigilância efetivas de modo que 172 * Dissertação de Mestrado - Adryella de Paula Ferreira Luz (Disciplina de Infectologia - UNIFESP), 2010. Discussão possamos ter dados realmente representativos do perfil de resistência aos antimicrobianos em todos os estados da federação. As dificuldades encontradas não esbarram apenas na questão geográfica, mas principalmente na imensa desigualdade socioeconômica que assolam o nosso país, permitindo que as melhores condições de assistência à saúde fiquem quase que exclusivas nas regiões mais ricas e desenvolvidas (sul e sudeste). Obviamente, aliado a isso contamos com deficiências no sistema público de saúde. Enquanto que na Espanha, todos os hospitais estão interligados por uma única e eficiente rede de vigilância de resistência antimicrobiana, a REIPI (“Red Española de Investigación en Patología Infecciosa”), coordenado pelo ministério da saúde daquele país, e apresente um sistema público abrangente e de boa qualidade, ainda que muito caro, permite uma melhor padronização e igualdade na implementação de medidas de controle de infecções hospitalares e um controle rígido do uso de antimicrobianos, o que contribui para as menores taxas de resistência. Apesar disso, as taxas de resistência observadas na Espanha, assim com nos demais países mediterrâneos, como Itália e Grécia, são extremamente superiores aos observados nos países nórdicos (Kempf & Rolain, 2012). Rossi (2011) faz uma reflexão muito oportuna a respeito do uso de antimicrobianos, quando descreve os desafios da resistência bacteriana no Brasil. Nesse estudo, a autora evidencia o uso indiscriminado de antimicrobianos como um fator crítico na seleção da resistência em nosso país, lembrando que até pouco tempo a população tinha livre acesso aos antimicrobianos, levando a prática muito comum de automedicação. Além disso, reforça a ideia de que outros fatores como o uso de dosagem inadequada, má aderência no tratamento e o uso inapropriado de agentes antimicrobianos também podem desempenhar um papel igualmente importante. Se as taxas de resistências aos carbapenens entre isolados de Acinetobacter spp. do Brasil e da Espanha são tão diferentes (Asensio et al., 2008; Marra et al., 2011; Gales et al., 2012), variando inclusive dentro de cada país (Asensio et al., 2008; Luz, 2011), os mecanismos 173 Discussão de resistência prevalentes nesses isolados são ainda mais diversos. Duas CHDLs resumem os principais mecanismos de resistência nos dois países, a OXA-24/40 na Espanha (Bou et al., 2000) e a OXA-23 no Brasil (Dalla-Costa et al., 2003). Partindo dessas duas CHDLs darei início a dinâmica da resistência aos β-lactâmicos em isolados de Acinetobacter spp. no Brasil e na Espanha, que objetivou a presente tese e a partir de agora servirá de elo que unirá todos os sete artigos aqui apresentados. Dentre os mecanismos de resistência aos carbapenens descritos em isolados clínicos de A. baumannii, a produção de β-lactamases, particularmente as CHDLs, é o mais importante e bem estudado (Poirel et al., 2010). A impermeabilidade de membrana externa associada com a perda ou diminuição da expressão das porinas CarO (29 kDa) (Mussi et al., 2005), 33-36 kDa (Tomás et al., 2005) e a OprD-like (43 kDa) (Dupont et al., 2005) é outro mecanismo descrito em A. baumannii associado a resistência aos carbapenens. Acredita-se que o tamanho pequeno e o número de porinas em A. baumannii seja o responsável pela resistência intrínseca aos antimicrobianos observada neste patógeno (Vila et al., 2007). Embora vários sistemas de efluxo tenham sido descritos em A. baumannii, o sistema AdeABC é o mais importante e estudado (Chu et al., 2006; Huang et al., 2008), a relação da hiperexpressão desses sistemas na resistência aos β-lactâmicos ainda é pouco compreendida (Marchand et al., 2004; Hu et al., 2007). Assim como ocorre com outros bacilos Gram negativos, raros foram os estudos que estudaram o papel das PBPs na resistência aos β-lactâmicos, principalmente aos carbapenens, em A. baumannii (Gehrlein et al., 1991; Obara et al., 1991; Fernández-Cuenca et al., 2003; Russo et al., 2009; Yun et al., 2011). Ainda assim, a maioria desses estudos foi realizada com cepas mutantes laboratoriais sem nenhum mecanismo de resistência adicional e expostas a diferentes β-lactâmicos. Embora os resultados mostrassem uma reorganização das PBPs frente à pressão seletiva com os β-lactâmicos, esses estudos não representam a realidade, uma vez que isolados clínicos de A. baumannii tendem a ser multirresistentes, apresentando 174 Discussão conjuntamente diferentes mecanismos de resistência, principalmente produção de β-lactamases e alteração de porinas, o que diminuiria drasticamente a pressão seletiva desses antimicrobianos in vivo sobre as PBPs. Sendo assim, ainda que in vitro os β-lactâmicos exerçam uma pressão seletiva sobre as PBPs, in vivo isso se repetiria, mesmo com tantos mecanismos de resistência atuando em etapas anteriores à ligação desses antimicrobianos às PBPs? Dessa maneira, decidimos por estudar os diferentes genes de PBPs em isolados clínicos de A. baumannii de três grandes centros hospitalares na Espanha, durante meu estágio de doutorado sanduíche no HUMV. Neste estudo descrevemos e classificamos os genes codificadores de PBPs em A. baumannii, e avaliamos o papel das mutações encontradas nesses genes na resistência aos βlactâmicos em isolados clínicos da Espanha (artigo científico 1). A partir da análise dos genomas sequenciados de A. baumannii foram encontrados sete PBPs (PPB1a, PBP1b, PBP2, PBP3, PBP5/6, PBP6b e PBP7/8) e uma MGT (MtgA) (Cayô et al., 2011a). Dessa maneira, A. baumannii apresenta quatro HMM-PBPs, sendo duas transpeptidases/transglicosilases de classe A, PBP1a e PBP1b, responsáveis pela síntese da parede celular, e duas transpeptidases de classe B, PBP2 (subclasse B2) e PBP3 (subclasse B3) (Cayô et al., 2011a). As PBPs da subclasse B2 tem função de elongação da parede celular e as PBPs da subclasse B3 está relacionada a divisão celular (Den Blaauwen et al., 2003; Piette et al., 2004; Sauvage et al., 2008). Foram também encontradas três LMM-PBPs, sendo essas as D-Ala-D-Alacarboxipeptidases PBP5/6 e PBP6b, e a endopeptidase PBP7/8. Por último, foi também encontrado uma transglicosilase monofuncional chamada MtgA (Cayô et al., 2011a). No mesmo estudo, 26 isolados clínicos de A. baumannii sensíveis e resistentes aos carbapenens, tiveram os sete genes codificadores das PBPs, além da MGT, sequenciados. Quando comparadas as mutações das PBPs dos isolados clínicos com os 11 genomas de A. baumannii previamente sequenciados, foi constatado que os genes das PBPs são altamente 175 Discussão conservados, mesmo quando comparado ao genoma da ATCC 17978, cepa isolada no início da década de 50, anterior ao desenvolvimento e uso da maioria dos β-lactâmicos na prática clínica (Baumann, 1968). A maioria das mutações encontradas na sequencia de nucleotídeos foi silenciosa e geralmente ocorria sempre nas mesmas regiões, indicando a presença de “hotspot mutations” nos genes codificadores das PBPs. As poucas mutações pontuais encontradas na sequência de aminoácidos não puderam ser associadas com a resistência aos β-lactâmicos, uma vez que as mesmas foram encontradas tanto em cepas sensíveis como nas resistentes (Cayô et al., 2011a). Ao que tudo indica, essas mutações estão mais associadas ao perfil clonal das cepas de A. baumannii do que diretamente com a resistência aos antimicrobianos (Cayô et al., 2011a). Nós também relatamos em dois isolados resistentes aos carbapenens e que pertenciam ao clone mais disseminado nos últimos cinco anos no HUMV, a inativação do gene dacD, codificador da PBP6b, devido à presença de uma IS (Cayô et al., 2011a), semelhante à ISAba125, que havia sido previamente reportada como presente no gene que codificava a porina CarO (Mussi et al., 2005). Embora não tenha sido avaliado nesse estudo o impacto da inativação da PBP6b em A. baumannii, Ghosh e colaboradores (2008) avaliaram mutantes de E. coli apresentando a deleção de uma ou de todas as LMM-PBPs, e demonstraram que tais deleções não afetaram substancialmente a divisão ou o alongamento da célula bacteriana. Apesar disso, um estudo conduzido por Russo e colaboradores (2009) demonstrou in vitro, usando diferentes modelos de infecção, que a PBP7/8 contribui para a sobrevivência de A. baumannii frente a atividade bactericida mediada pelo sistema complemento. Naquele estudo, um mutante de A. baumannii apresentando uma inserção de um transposon no gene pbpG que codifica a PBP7/8 foi morto pelas células do sistema imune em modelos in vitro de ascites e também apresentava uma diminuição da sua sobrevida nos modelos animais de infecção de pele e partes moles e de pneumonia, quando comparado com os mesmos modelos infectados com a cepa do tipo 176 Discussão selvagem. Os autores também observaram por microscopia eletrônica de transmissão que os isolados que não expressavam a PBP7/8 apresentavam uma forma cocobacilar aberrante, demonstrando um provável papel crítico na modulação da morfologia celular em A. baumannii. Baseado nos seis trabalhos que enfocaram o estudo das PBPs em A. baumannii publicados até o momento (Gehrlein et al., 1991; Obara et al., 1991; Fernández-Cuenca et al., 2007; Russo et al., 2009; Cayô et al., 2011b, Yun et al., 2011), incluindo o presente trabalho, é possível inferir que: (i) a indução com β-lactâmicos leva a uma reorganização das PBPs, e a resistência in vitro a esses antimicrobianos; (ii) a relativa atividade do sulbactam frente a isolados multirresistentes de A. baumannii pode ser explicada, em parte, pela sua maior afinidade pelas PBPs desse micro-organismos comparado aos demais inibidores; (iii) provavelmente eventos pós-transcricionais ou de expressão gênica tenham maior impacto e importância na alteração das PBPs do que propriamente mutações nos genes codificadores das PBPs; (iv) o papel das PBPs pode transcender a resistência aos β-lactâmicos, demonstrando ser um possível fator de virulência e evasão do sistema imunológico e (v) a resistência aos carbapenens pode ser multifatorial e complexa, envolvendo tanto a indução da expressão de βlactamases, sistemas de efluxo e PBPs e a diminuição da expressão de proteínas de membrana externa. Ainda que a produção de CHDLs seja o mecanismo mais prevalente em A. baumannii, essas enzimas hidrolisam fracamente os carbapenens e não apresentam atividade frente às cefalosporinas de amplo espectro (Poirel et al., 2010). Além disso, a grande maioria dos genes codificadores das CHDLs necessitam da presença de IS, conferindo um promotor forte, para aumentar a sua expressão (Poirel et al., 2010). Tais observações somente aumentam a importância de outros mecanismos adjuvantes na elevação das CIMs, não somente para os carbapenens, como também para os demais β-lactâmicos. Outro dado importante a ser enfatizado é que, de algum modo, ao longo da sua escala evolutiva, A. baumannii desenvolveu, 177 Discussão uma maneira única de manter diferentes “cópias” de IS em seu genoma de modo a mobilizá-la quando necessário, reorganizando, dessa maneira, a expressão de diferentes genes conforme a sua necessidade e com menor custo energético (Vallenet et al., 2008). A presença de varias cópias ao longo dos genomas de A. baumannii sequenciados comprova a importância dessas IS para sua sobrevivência. A associação de tais estruturas com as PBPs ainda carece ser elucidado, conforme relatado no gene dacD (PBP6b) nos isolados espanhóis (Cayô et al., 2011a). Para o estudo das PBPs, inicialmente selecionamos aleatoriamente 16 isolados sensíveis ou resistentes aos carbapenens, e que fossem representativos dos clones majoritários e minoritários mais importantes da coleção de aproximadamente 603 amostras do complexo A. calcoaceticus-baumannii do HUMV, coletadas entre os anos de 2004 a 2008. Essas amostram haviam sido previamente identificadas pelo sistema automatizado MicroScan Walk-Away® (Siemens Healthcare Diagnostics, West Sacramento, CA) e caracterizadas quanto ao perfil clonal por Rep-PCR. Os oligonucleotídeos para os genes das PBPs foram desenhados baseados nos genomas de A. baumannii conhecidos na época. As cepas de referência RUH134 e RUH875 de A. baumannii foram utilizadas para padronização das reações de PCR. Entretanto, no momento de testar os oligonucletídeos para os 16 isolados clínicos selecionados, cinco desses não apresentavam amplificação para alguns dos genes de PBPs de A. baumannii. A partir dessa observação, inferimos que talvez esses isolados pudessem não ser A. baumannii, mas uma das outras três espécies que compõe o complexo A. calcoaceticus-baumannii. Sendo assim, duas metodologias para a confirmação da identificação das espécies do gênero Acinetobacter foram padronizadas, sendo essas o ARDRA (Vaneechoutte et al., 1995) e, posteriormente, o sequenciamento do gene rpoB (La Scola et al., 2006; Gundi et al., 2009). Inicialmente os cinco isolados de Acinetobacter spp. foram negativos para o gene blaOXA51-like, que na época ainda era utilizado para a identificação presuntiva de A. baumannii (Chen et 178 Discussão al., 2010; Lee et al., 2012). Dessa forma, já sabíamos que tais isolados não pertenciam à espécie A. baumannii, justificando o motivo da não amplificação para alguns dos genes de PBPs estudados. Os cinco isolados foram então identificados por ARDRA como sendo A. pittii (quatro isolados) e A. haemolyticus (um isolado). A identificação foi posteriormente confirmada pelo sequenciamento do gene rpoB. Ao repicar esses isolados em ágar sangue observamos a presença de hemólise para o isolado identificado como sendo A. haemolyticus, que embora essa característica não seja exclusiva dessa espécie, serve de exclusão de uma cepa com sendo A. calcoaceticus-baumannii, uma vez que as quatro espécies que compõe o complexo não são hemolíticas. Como um dos isolados de A. pittii (HUMV-1588) era positivo para o gene blaOXA-24/40like, decidimos então sequenciar, uma vez que ainda não havia sido descrito na Espanha outra espécie de Acinetobacter spp. que não A. baumannii carreando a CHDL OXA-24/40. Surpreendentemente, o resultado do sequenciamento demonstrou que o isolado de A. pittii carreava uma nova variante do cluster OXA-24/40, sendo nomeada OXA-207, o que acabou dando origem ao artigo seguinte (artigo científico 02). Diferente do que ocorre no Brasil, onde há um predomínio da OXA-23, fato este que será melhor abordado na segunda parte desta discussão, na Espanha a principal carbapenemase é a OXA-24/40 (Acosta et al., 2011). Inicialmente descrita em um surto ocorrido 1997 no Hospital Ramón y Cajal em Madrid (Bou et al., 2000), essa CHDL é endêmica na península Ibérica (Lopez-Otsoa et al., 2003; Grosso et al., 2011b), sendo também descrita nos Estados Unidos (Lolans et al., 2006; Tian et al., 2011). O sucesso da OXA-24/40 nessa região geográfica se deve, principalmente, pela disseminação de um clone epidêmico MDR que tem sido descrito em Portugal desde 1995 (Da Silva et al., 2004). Apenas casos esporádicos foram relatados na França e Itália (Héritier et al., 2003; D'Andrea et al., 2009), já que as CHDLs mais prevalentes nesses dois países são a OXA-23 e a OXA-58, o mesmo ocorrendo com os demais países da 179 Discussão União Europeia (Kempf & Rolain, 2012), com exceção da Croácia, que apresenta a OXA-72 (Goic-Barisic et al., 2011). Até o momento foram descritas seis variantes, sendo essas: OXA-25, OXA-26, OXA-72, OXA-139, OXA-160 e OXA-207 (Afzal-Shah et al., 2001; Wang et al., 2007; Tian et al., 2011). Somente a OXA-72 tem sido descrita em diferentes partes do mundo (Poirel et al., 2010), diferente das demais variantes que são restritas a determinados locais (Tian et al., 2011), ou a um único relato (Afzal-Shah et al., 2001). Dois novos clusters apresentando uma alta identidade de sequência com a OXA-24/40 foram propostos, sendo esses a OXA-143 no Brasil e a OXA182 na Coréia do Sul (Higgins et al., 2009; Kim et al., 2010), podendo, inclusive, ser consideradas, por alguns autores, como variantes do cluster OXA24/40. Talvez a maior diferença entre essas três enzimas, seja o contexto genético. Nenhumas dessas enzimas foi relacionada à IS (Poirel et al., 2010), como ocorre com as demais CHDLs de A. baumannii, o que demonstra que essas enzimas sejam as mais potentes de todas as CHDLs. Foi descrito que as enzimas do cluster OXA-24/40 se mobilizam por um sistema de recombinação XerC/XerD que facilita a sua disseminação por diferentes espécies de Acinetobacter (Merino et al., 2010) e que, a princípio não seria o mesmo modo de mobilização da OXA-143 e da OXA-182 (Higgins et al., 2009; Kim et al., 2010). A capacidade de mobilização dos genes codificadores das variantes do cluster OXA24/40, justifica o fato de já terem sido descritos relatos de A. junii (Fernández-Cuenca et al., 2012) e A. pittii (Montealegre et al., 2012) carreando a OXA-72, como também A. calcoaceticus (Merino et al., 2010) e A. haemolyticus (Grosso et al., 2011b) carreando a OXA-24/40. Além disso, Sevillano e colaboradores (2009) descreveram a produção de OXA24/40 em um isolado de P. aeruginosa no norte da Espanha e que carreava o mesmo plasmídeo verificado nos isolados de A. baumannii, mostrando a capacidade de transmissão horizontal desse determinante de resistência (Sevillano et al., 2011). 180 Discussão Assim como em toda a Espanha, a OXA-24/40 é a CHDL mais prevalente em isolados de A. baumannii do HUMV. Sendo assim, a transmissão dessa CHDL de A. baumannii para A. pittii era algo factível. Tanto o gene blaOXA-24/40, presente nos clones de A. baumannii encontrados no HUMV, como o gene blaOXA-207, isolado de A. pittii, apresentavam o mesmo contexto genético, demonstrando a passagem do gene de resistência de uma espécie para a outra. Entretanto, o gene blaOXA-207 encontrado em A. pittii apresentava uma mutação que alterou o sítio catalítico da enzima aumentando a sua afinidade por oxacilina e diminuindo, por outro lado, sua afinidade pelos carbapenens. Ainda assim, os estudos de cinética demonstraram que o efeito dessa mutação não foi o mesmo observado in vitro por Santillana e colaboradores (2007). Dessa forma, a produção de OXA-207 possui um importante papel na resistência aos carbapenens na cepa HUMV-1588. Dentre as variantes do cluster OXA-24/40, a OXA-207 é a primeira que realmente apresenta alteração na sua capacidade hidrolítica. A questão ainda desconhecida é por que e em que condições o gene da OXA-24/40 sofreu a mutação, tornando-se uma nova variante. Higgins e colaboradores (2010b) comprovaram in vivo a reversão da OXA-164, nova variante do cluster OXA-58, novamente em uma OXA-58 após tratamento com meropenem combinado com amicacina, ciprofloxacina e cotrimoxazol. Entre os 16 isolados identificados pelo MicroScan Walk-Away® como complexo A. calcoaceticus-baumannii e selecionados para o estudo das PBPs, quatro foram identificados como sendo A. pittii. A partir dessa constatação surgiu a ideia de avaliar a real prevalência das demais espécies pertencentes ao complexo A. calcoaceticus-baumannii no HUMV nos últimos cinco anos (artigo científico 03). Os resultados obtidos mostraram uma grande diversidade de espécies pertencentes ao gênero Acinetobacter spp. causando infecções em humanos. Talvez o dado mais importante seja a alta prevalência de A. pittii no HUMV, sendo responsável por 41,8% (36/86) dos padrões de Rep-PCR avaliados no estudo. A prevalência de A. pittii foi similar a de A. baumannii (44,8%; 38/86), quando avaliado somente os padrões de Rep-PCR. Outro 181 Discussão resultado interessante foi a presença de OXA-58 em um clone de A. pittii sensível aos carbapenenens no HUMV. Martí e colaboradores (2008b) relatam, pela primeira vez, a presença de OXA-58 em um isolado de A. pittii apresentando altos níveis de resistência a imipenem (CIM > 32 µg/mL) na Catalunha. Os autores comparam o contexto genético desse isolado ao de uma cepa de A. baumannii também produtora de OXA-58 e isolada no mesmo hospital. Eles verificaram que o gene blaOXA-58 estava localizado em plasmídeos diferentes em ambos isolados, porém flanqueado por duas copias da ISAba3. Os autores concluem que a produção isolada de OXA-58 não é suficiente para causar as CIMs elevadas para imipenem, sendo necessária a contribuição de outros mecanismos de resistência, como a perda de porinas e efluxo ativo. Embora o mesmo grupo de pesquisa também tenha relatado a presença de OXA-58 em um isolado de A. phenon 6/ct13TU (Martí et al., 2008a), não foi verificada a presença dessa CHDL nos isolados identificados como A. phenon 6 em nosso estudo. Boo e Crowley (2009) relataram a presença de OXA-23 e OXA-58 em isolados sensíveis de A. radioresistens e A. bereziniae, respectivamente. Avaliando o contexto genético da OXA-58, os autores encontraram os mesmos resultados obtidos por Martí e colaboradores (2008b) em A. pittii e explicam que a ISAba1, ISAba2 e IS18 funcionariam como melhores promotores do que a ISAba3, o que justificaria a sensibilidade verificada no isolado de A. bereziniae (Boo & Crowley, 2009) e, provavelmente, no isolados de A. pittii sensíveis do HUMV. Os autores finalizam, lembrando que isolados de Acinetobacter spp. sensíveis aos carbapenens, porém produtores de CHDLs, funcionariam como reservatórios de genes de resistência, já que poderiam não ser identificados pelos métodos rotineiros que, geralmente, avaliam amostras resistentes (Boo & Crowley, 2009). Embora a análise por padrão de Rep-PCR permita inferir que A. pittii seja tão frequente como A. baumannii como agente causador de infecção no HUMV, quando se extrapola os dados para os demais de isolados por padrão de Rep-PCR, A. baumannii é o mais prevalente, sendo responsável por 85% dos isolados (515/603). Tal resultado já era esperado, uma vez que A. 182 Discussão baumannii se dissemina clonalmente no ambiente hospitalar, causando surtos de grandes proporções, além de geralmente apresentar um fenótipo MDR, o que favorece a sua permanência como microbiota da pele de pacientes, permitindo a transmissão cruzada entre pacientes ou, mais frequentemente, de profissional de saúde para paciente. Resultado oposto foi observado para a maioria dos isolados de A. pittii e das outras sete espécies/genoespécies também identificadas no estudo, já que foram geralmente multissensíveis, o que impede, muitas vezes, que tais micro-organismos sejam capazes de causar surtos. Como já era de se esperar, a maioria dos isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens no HUMV eram produtores de OXA-24/40. Nos demais clones resistentes e não produtores de OXA-24/40 foi observada a presença de OXA-51 associado a ISAba1. Uma alta variabilidade quanto as CHDLs cromossômicas pertencentes ao cluster OXA-51 foi verificada entre os isolados de A. baumannii. Pelo menos 12 tipos diferentes de OXA-51 foram identificados, além de outras nove novas variantes aguardando nomeclatura específica. Turton e colaboradores (2010) analisando a incidência das espécies de Acinetobacter spp. no Reino Unido, relata A. baumannii como sendo a espécie mais prevalente, com 78% dos isolados analisados, seguido por A. lwoffii/A. genoespécie 9 (8%), A. ursingii (4%). A. pittii, a segunda espécie mais frequente em nosso estudo, foi reponsável por somente 1,7% dos isolados juntamente com A. johnsonii no estudo britânico, o qual ainda relata diferenças nos perfis de sensibilidade aos antimicrobianos entre as espécies, sendo A. lwoffii e A. schindleri espécies multissensíveis e A. pittii, A. nosocomialis, A. bereziniae e A. gyllenbergii resistentes a, pelo menos, oito antimicrobianos diferentes. Em outro estudo de van den Broek e colaboradores (2009) realizado na Holanda, que avaliou prospectivamente as espécies de Acinetobacter spp. durante oito anos, foi observada uma menor prevalência de A. baumannii (27%), quando comparados a estudos similares (Turton et al., 2010). Entretanto, A. pittii foi tão prevalente quanto A. baumannii, com 26% dos isolados, seguido por A. lwoffii (11%), A. ursingii (4%), A. 183 Discussão johnsonii e A. junii (3%). Esses autores relataram também que 37% dos isolados de A. baumannii foram multissensíveis aos antimicrobianos. Com a padronização das metodologias de ARDRA e o sequenciamento do gene rpoB, comecei a auxiliar na identificação das espécies dos isolados clínicos provenientes da rotina laboratorial. Em uma dessas identificações, tivemos um caso de um paciente com um quadro de leucemia linfoblástica aguda com histórico recente de transplante de medula óssea, não aparentado (artigo científico 04). O paciente apresentou um pico febril, sendo isolado da hemocultura um coco-bacilo Gram negativo não fermentador identificado inicialmente como A. lwoffii. A identificação realizada pelo ARDRA confirmou a identificação desse isolado como pertencente à espécie A. junii. Consta na literatura diversos relatos descrevendo uma predileção desse micro-organismo por pacientes oncológicos e neonatos (Bernards et al., 1997). Geralmente as cepas são sensíveis à maioria dos antimicrobianos utilizados na clínica e por isso o transcurso clínico é quase sempre favorável. Ainda que a terapia seja guiada, principalmente, pelo antibiograma apresentado pelo isolado, do que pela identificação da espécie, atenção especial deve ser dada para uma correta identificação das diferentes espécies de Acinetobacter não-baumannii. Dessa maneira, as informações obtidas permitirão uma melhor compreensão da epidemiologia e a importância dessas espécies como patógenos humanos. No Brasil, três trabalhos foram os pioneiros na caracterização molecular dos mecanismos de resistência aos carbapenens em isolados de Acinetobacter spp., os quais relataram pela primeira vez a produção de OXA-23 e IMP-1 no Brasil (Costa et al., 2000; DallaCosta et al., 2003; Gales et al., 2003). O estudo de Costa e colaboradores (2000) foi primeiro estudo em se avaliar os mecanismos de resistência aos carbapenens em isolados sensíveis e resistentes pertecentes ao um surto ocorrido no Hospital das Clínicas de São Paulo. Neste estudo os autores observaram a alteração de uma porina de 31-36 kDa em um isolados resistente a imipenem. Além disso, eles detectaram uma β-lactamase com PI de 7,4 em todos os 184 Discussão isolados, provavelmente a OXA-51, descrita somente cinco anos depois (Brown et al., 2005), e mais duas β-lactamases, somente nos isolados resistentes, com PIs de 5,9 e 6,7, correspondentes a TEM-1 e a OXA-23. Dalla-costa e colaboradores (2003) descreveram um surto em dois hospitais em Curitiba causado por oito cepas de A. baumannii resistentes aos carbapenens isoladas em 1999. Todas as cepas apresentavam o mesmo padrão de PFGE e carreavam uma CHDL, ainda desconhecida em nosso país, a OXA-23, após 14 anos desde a sua descrição na Escócia em 1985. O surto causado por essas cepas estavam associados a uma alta mortalidade (62,5%), mesmo dois dos cinco pacientes terem sido tratados com polimixina B. Esse estudo chamou a atenção da comunidade científica nacional para aquela que, posteriormente, seria a carbapenemase mais frequente no Brasil. No mesmo ano, Gales e colaboradores (2003) descreveram pela primeira vez no Brasil uma cepa de A. baumannii produtora da MβL IMP-like isolada em 2000 no Hospital São Paulo. Embora nesse isolado não tivesse sido avaliada a produção de CHDLs, os resultados do gel de ponto isoelétrico (PI) apontaram somente a presença de duas enzimas com PIs de 5,4 e 8,6, que correspondem, provavelmente, a TEM-1 e IMP-like, respectivamente (Gales et al., 2003). Em 2005, um estudo do Programa SENTRY avaliando a disseminação e a diversidade de MβL na América Latina, relatou a presença de IMP-1 em sete isolados de Acinetobacter spp. no Hospital São Paulo, não sendo encontrado nos demais centros médicos brasileiros participantes (Sader et al., 2005). Além disso, o estudo também relata um isolado de P. fluorescens também produtor de IMP-1, demonstrando a capacidade de disseminação desse determinante de resistência, mesmo entre espécies diferentes. No ano seguinte, Tognim e colaboradores (2006) relatam que a MβL, descrita em 2003, se tratava da variante IMP-1 e que esta estava disseminada nos isolados de Acinetobacter spp. do Hospital São Paulo. Os autores também descrevem a presença de dois ribogrupos distintos principais, 52-1 e 60-7, sendo o primeiro ribogrupo encontrado entre 1994-1998, composto principalmente por isolados não 185 Discussão produtores de MβL, e o segundo ripogrupo encontrado entre 1999-2001 e composto por isolados produtores de IMP-1. Como ambos os ribogrupos apresentavam uma alta similaridade (85%), os autores concluíram que o segundo ribogrupo (60-7) seria um subclone do ribogrupo 52-1, tendo adquirido o gene da IMP-1. A partir dos resultados obtidos pelos três estudos é possível inferir que as carbapenemases presentes nos isolados de A. baumannii em Curitiba e em São Paulo não eram as mesmas até o ano 2001. Um ano após o estudo de Tognim e colaboradores (2006), um novo estudo do programa SENTRY, estudando sete cepas de Acinetobacter spp. e uma cepa de P. putida produtoras de IMP-1 isoladas entre 2001-2002 no Hospital São Paulo, descreveu o contexto genético dessa MβL (Mendes et al., 2007). Dessa forma, ficou definido que o gene blaIMP-1 estava inserido em um integron de classe 1 chamado In86, e que este estava localizado tanto no cromossoma como em plasmídeos nas cepas de Acinetobacter spp., sendo a maioria não relacionadas clonalmente. O In86 apresentava mais dois genes cassetes, além do gene blaIMP-1, sendo ambos, aac(6’)-31 e o aadA1, codificadores de enzimas modificadoras de aminoglicosídeos (Mendes et al., 2007). Até o momento, o gene blaIMP-1 somente foi descrito no estado de São Paulo, demonstrando ser um problema restrito, principalmente, nos hospitais na região metropolitana da capital. Além disso, a mobilização e disseminação do gene blaIMP-1 é exclusivamente relacionada ao In86, já que esse mesmo integron foi também descrito em cepas de enterobactérias produtoras de IMP-1 em diferentes hospitais da cidade de São Paulo (Lincopan et al., 2005; Lincopan et al., 2006; Penteado et al., 2009). Após seis anos desde o primeiro relato de OXA-23 no Brasil, dois estudos avaliando cepas de A. baumannii isoladas entre 2006 e 2007, relatam a disseminação dessa CHDL no Rio de Janeiro (Carvalho et al., 2009) e em Porto Alegre (Martins et al., 2009). Esses dois estudos foram importantes, pois foram os primeiros a demonstrar que a OXA-23 era a carbapenemase mais frequente e disseminada em isolados de A. baumannii no Brasil, que a IMP-1 era um 186 Discussão problema restrito ao estado de São Paulo e que diferente do que foi observado em Curitiba, esses isolados não apresentavam o mesmo perfil clonal (Dalla-Costa et al., 2003; Carvalho et al., 2009; Martins et al., 2009). Em 2010, um estudo avaliando a evolução temporal de isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens em Curitiba, demonstrou que o clone produtor de OXA-23, inicialmente descrito em 1999, persistiu até 2004 sendo, então, substituído por outros dois clones prevalentes (Schimith Bier et al., 2010), corroborando com os resultados obtidos no Rio de Janeiro e em Porto Alegre (Carvalho et al., 2009; Martins et al., 2009). O estudo também relatou uma alta taxa de mortalidade (45,2%) verificada nas infecções causada pelos isolados produtores de OXA-23 e que tais infecções eram principalmente pneumonias relacionada à ventilação mecânica. Resultados similares foram obtidos por Carneiro e colaboradores (2010) em um estudo realizado na cidade de Londrina, onde foram verificadas um alta prevalência de pneumonias relacionadas à ventilação mecânica por isolados de A. baumannii produtores de OXA-23 com altas taxas de mortalidade (52,9%). Furtado e colaboradores (2011) também encontraram altas taxas de mortalidade (61,9%), sendo superiores aquelas apresentadas pelos dois estudos anteriores. Uma característica comum a esses três estudos é o fenótipo MDR apresentados pelos diferentes clones brasileiros de A. baumannii produtores de OXA-23, sendo geralmente sensíveis somente à tigeciclina e à polimixina B (Carneiro et al., 2010; Schimith Bier et al., 2010; Furtado et al., 2011). Uma característica importante verificada nesses isolados foi que mesmo nos casos em que a terapia foi considerada adequada (geralmente polimixina B), a taxa de mortalidade permaneceu elevada (Schimith Bier et al., 2010; Furtado et al., 2011). Ferreira e colaboradores (2011) relataram a presença de OXA-23 em isolados de A. baumannii recuperados de águas residuais de três hospitais localizados em Porto Alegre, demonstrando o papel do esgoto hospitalar na perpetuação de patógenos e genes de resistência aos antimicrobianos no meio ambiente, que poderiam funcionar como possíveis reservatórios 187 Discussão naturais (Ferreira et al., 2011). Já Martins e colaboradores (2011) relatam um interessante caso de infecção grave após transplante de pulmão, cujo doador estava colonizado com A. baumannii produtor de OXA-23. O receptor foi a óbito 60 dias pós-transplante e tal episodio reforça o diagnóstico precoce de colonização por A. baumannii em doadores de órgãos, o que poderá implicar na aceitação ou rejeição do órgão e no ajuste da terapia profilática. Recentemente, um estudo realizado no Rio de Janeiro, mostrou que 70% dos isolados produtores de OXA-23 naquela cidade estão relacionados a uma das três linhagens de A. baumannii MDR mais prevalentes em todo o mundo, o EU-II (Grosso et al., 2011a). Durante muitos anos a resistência aos carbapenens em isolados de A. baumannii no Brasil ficou vinculada exclusivamente a produção de IMP-1 e, principalmente, da OXA-23, como mostrado nos estudos anteriores. Entretanto, esse cenário se modificou por completo com a descrição em 2009, por um grupo alemão, de uma nova CHDL encontrada em um isolado brasileiro, a então desconhecida OXA-143 (Higgins et al., 2009). Em 2011, três importantes trabalhos mostraram que a dinâmica da resistência aos carbapenens no Brasil era muito mais diversa do que imaginávamos (Antonio et al., 2011; Figueiredo et al., 2011; Werneck et al., 2011a). Em maio daquele ano, Figueiredo e colaboradores (2011) descreveram no Rio de Janeiro o primeiro relato no Brasil da produção de OXA-58 em uma cepa de A. baumannii isolada em 2005. Logo em seguida Werneck e colaboradores (2011a) publicam o primeiro caso brasileiro da produção de OXA-72 em A. baumannii isolado, em 2007, na cidade de São Paulo. Finalmente, quase que concomitantemente, Antonio e colaboradores (2011) nos revelam que a então desconhecida OXA-143 era altamente prevalente nos isolados de A. baumannii no estado de São Paulo em detrimento à OXA-23. Nesse estudo também foram encontrados dois isolados de A. baumannii produtores de OXA-72 e um único isolado produtor de OXA-58, e mais surpreendentemente três isolados carreando ao mesmo tempo a OXA-23 e a OXA-143. 188 Discussão Baseado no estudo de Antonio e colaboradores (2011), publicamos uma carta resposta (artigo científico 5) enfatizando que a alta prevalência verificada no estudo anterior era uma realidade dos hospitais públicos de São Paulo, o mesmo não sendo verificado nos hospitais privados da mesma cidade (Werneck et al., 2011b). Além disso, verificamos que a OXA-143, embora presente na região sudeste, não foi encontrada nos isolados de A. baumannii das demais regiões do país, sendo a OXA-23 a mais prevalente e disseminada CHDL no Brasil (Werneck et al., 2011b). Embora diferentes perfis clonais tenham sido observados entre os isolados produtores de OXA-23, o clone mais frequente encontrado no Brasil ainda continuava sendo o primeiro clone descrito em 2003 (Dalla-Costa et al., 2003). Dados do projeto SCOPE (dados não publicados*), avaliando 16 hospitais públicos e privados brasileiros, confirmou os resultados anteriores, demonstrando que a OXA-143 realmente está restrita a região sudeste. Além disso, um estudo de Clemente e colaboradores (2011), relata que a OXA-143 é prevalente em Belo Horizonte, e ainda que aquele seria o primeiro surto causado por isolados de A. baumannii produtores de OXA-143, apresentando altas taxas de mortalidade semelhantes aquelas causadas por infecções por produtores de OXA-23. Com o advento da OXA-143, novas dúvidas começaram a surgir a respeito de quando essa CHDL teria entrado no Hospital São Paulo, já que os dados locais mostravam uma prevalência maior do que esperado (dados não publicados*). Além disso, o conhecimento que tínhamos sobre a epidemiologia molecular da resistência aos carbapenens no Hospital São Paulo era a prevalência de IMP-1 na década de 90 (Gales et al., 2003; Sader et al., 2005; Tognim et al., 2006; Mendes et al., 2007) e a inserção da OXA-23 na década seguinte, com a entrada do clone oriundo de Curitiba (Gales et al., 2008). Sendo assim, idealizamos um estudo com o objetivo de avaliar a dinâmica temporal da produção de carbapenemases em cepas de Acinetobacter spp. resistentes aos carbapenens durante os últimos 18 anos no Hospital São Paulo (artigo científico 6). A diversidade de carbapenemases e de clones encontrados e o 189 * Dissertação de Mestrado - Adryella de Paula Ferreira Luz (Disciplina de Infectologia - UNIFESP), 2010. Discussão modo como eles se distribuíram ao longo dos 18 anos do estudo, impressiona pelo incrível dinamismo. Embora, a maioria dos isolados resistentes aos carbapenens (96,7%) tenha sido identificada como sendo A. baumannii, outras espécies de Acinetobacter spp. também foram observadas, entre elas, A. pittii, A. nosocomialis e A. bereziniae. A MβL IMP-1 foi detectada em dois períodos distintos, entre 1995 e 1998 e entre 2004 a 2010. Até 2002, essa MβL foi a carbapenemase mais importante nos isolados de A. baumannii no Hospital São Paulo, como mostrado em estudos anteriores (Gales et al., 2003; Sader et al., 2005; Tognim et al., 2006; Mendes et al., 2007). A grande capacidade de mobilização do gene blaIMP-1 entre diferentes espécies já foi extensivamente descrita na literatura (Lincopan et al., 2005; Lincopan et al., 2006; Penteado et al., 2009). Em nosso estudo foram encontrados isolados de A. pittii e A. bereziniae produtores de IMP-1. A transmissão de genes de resistência de A. baumannii para as demais espécies do gênero compromete drasticamente as opções terapêuticas das infecções causadas por esses micro-organismos, uma vez que geralmente eles apresentariam, naturalmente, sensibilidade à maioria dos antimicrobianos. Além da IMP-1, foi detectada, pela primeira vez no Brasil, a produção de IMP-10 em A. baumannii. Todas as três cepas produtores dessa MβL foram isoladas em agosto de 2000, apresentando dois padrões de Rep-PCR. Possivelmente, uma disseminação desses genes tenha ocorrido durante esse período no hospital. Ao que tudo indica, a OXA-23 foi introduzida no Hospital São Paulo em 2002, oriundo do clone de Curitiba (Dalla-Costa et al., 2003) e manteve-se presente no hospital nos oito anos seguintes do estudo. O dado mais surpreendente foi que a OXA-143 foi isolada pela primeira vez no Hospital São Paulo em 1995, oito anos antes da inserção da OXA-23 nesse hospital e 14 anos antes da sua primeira descrição em 2009 (Higgins et al., 2009). As CHDLs OXA-23 e OXA143 foram identificadas concomitantemente em seis isolados de A. baumannii (2,8%), como descrito previamente (Antonio et al., 2011), a maioria entre os anos 2008 e 2009. A produção de 190 Discussão OXA-143 e IMP-1 em uma mesma cepa de A. baumannii foi observada em 1997. Dois isolados de A. baumannii, coletados em 2008 e 2009, carreavam a OXA-72. Apesar disso, sabe-se que essa CHDL é anterior a esse período, já que Werneck e colaboradores (2011a) já haviam descrito a presença dessa CHDL no Hospital São Paulo em um isolado de 2007. A OXA-58 foi a primeira CHDL encontrada no Hospital São Paulo em 1993 e um segundo isolado apresentando o mesmo padrão de Rep-PCR foi isolado quatro anos depois. A detecção de tal enzima não seria nada original, já que a produção dessa CHDL já havia sido descrita previamente em isolados brasileiros de A. baumannii (Antonio et al., 2011; de Figueiredo et al., 2011), se não fosse pelo fato de que ambos os isolados serem A. “Close to 13TU”. O primeiro relato de OXA-58 ocorreu em 2003 (Poirel et al., 2005), quase 10 anos após o primeiro isolado encontrado no Hospital São Paulo. Como esperado, a CHDL mais prevalente foi a OXA23, sendo detectada em 39,5% (n=85) dos isolados, seguido pela OXA-143 (n = 57, 26,5%), IMP-1 (n = 27, 12,5%), IMP-10 (n=3, 1,4%), OXA-72 (n = 2, 0,9%) e OXA-58 (n = 2, 0,9%). Obviamente, a frequência dessas carbapenemases está associada à disseminação de clones resistentes e as taxas de resitência poderiam ser menores caso houvesse uma maior aderência às políticas de controle de infecção hospitalar. Até 2011, nenhum isolado de A. baumannii produtor de OXA-143 havia sido descrito fora da região sudeste, nem mesmo nos estados fronteiriços (Dalla-Costa et al., 2003; Schimith Bier et al., 2010). Entretanto, analisando cepas de A. baumannii resistentes aos carbapenens isolados nos últimos seis anos no Hospital Universitário de Londrina, encontramos um único isolado que produzia uma enzima que apresentava uma mutação pontual (Asp230Ala) próximo ao motivo conservado KSG da OXA-143 (artigo científico 7), sendo posteriormente chamada OXA-231 (Gionco et al., 2012), sendo a primeira variante do cluster OXA-143. Posteriormente, nenhum outro isolado foi encontrado carreando essa nova variante de OXA-143 no HU de Londrina, ou em outro Hopital no estado do Paraná. 191 Discussão Ao final dessa tese reflito sobre a busca em entender a dinâmica da resistência aos βlactâmicos em amostras clínicas de Acinetobacter spp. isoladas no Brasil e na Espanha. Acredito que a diversidade e a complexidade com que encontramos, descobrimos apenas a ponta do icebergue, pois são tantas as perguntas ainda a serem respondidas. Talvez a dinâmica não é para ser entendida, mas para ser estudada continuamente, pois contínua é a capacidade do gênero Acinetobacter em adaptar-se as condições adversas e competitivas que ditam o meio ambiente e o ambiente nosocomial, o que a torna fascinante. Martinus W. Beijerinck disse uma vez que “Felizes são aqueles que agora começam”, talvez se referindo aos grandes passos dados por pesquisadores como ele, permitindo que as gerações futuras, como a minha, pudessem trilhar seus próprios caminhos. 192 Conclusões 6 - Conclusões As mutações observadas nos sete genes de PBPs em isolados clínicos espanhóis estão mais relacionadas ao perfil clonal da cepa do que com a resistência aos β-lactâmicos em A. baumannii; Uma nova variante de CHDL pertencente ao cluster OXA-24/40 (OXA-207) foi descrita em um isolado de A. pittii resistente aos carbapenens no norte da Espanha. A mutação apresentada no gene blaOXA-207 alterou o sítio catalítico da β-lactamase, aumentando sua afinidade por oxacilina e diminuindo sua atividade de carbapenemase; Embora A. baumannii seja a espécie pertecente ao gênero Acinetobacter mais prevalente e resistente encontrado nos últimos cinco anos no HUMV, A. pittii foi identificado como a segunda espécie mais frequente como patógeno humano; Todos os isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens no HUMV carreavam os genes blaOXA-24/40 ou blaOXA-51-like-ISAba1, demonstrando serem as duas CHDLs codificadas por esses genes os meios mais efetivos de aquisição de resistência aos βlactâmicos nesses micro-organismos; Diferentes espécies de Acinetobacter spp., foram encontradas causando infecções nos últimos cinco anos no HUMV, sendo erroneamente identificadas como sendo pertencentes ao complexo A. calcoaceticus-baumannii pelo sistema automatizado MicroScan-WalkAway®; 193 Conclusões Um isolado de A. junii foi identificado causando ICS em um paciente transplantado de medula óssea com leucemia linfoblástica aguda, enfatizando a predileção desse microorganismo por esse tipo de paciente; A CHDL OXA-143 somente foi encontrada em hospitais do estado de São Paulo e raramente no Rio de Janeiro, demonstrando ainda ser um problema isolado, principalmente em hospitais públicos da região Sudeste; A OXA-143 demonstrou ser uma CHDL mais antiga do que se esperava, sendo identificada em isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens no HSP oito anos antes do que os isolados de A. baumannii produtores de OXA-23. Entretanto a disseminação dos isolados apresentando o gene blaOXA-143 ocorre de maneira mais lenta do que aqueles que apresentam o gene blaOXA-23, tendo esses maior sucesso ecológico; O gene blaOXA-23 entrou no HSP provavelmente somente a partir de 2002, com a inserção do clone identificado inicialmente em Curitiba, sendo a CHDL mais prevalente no HSP desde então. Além disso, mostrou-se altamente prevalente e disseminada entre os isolados de A. baumannii resistentes aos carbapenens nas diferentes regiões geográficas brasileiras; Assim como verificado no HUMV, o gene blaOXA-58 foi encontrado em isolados de Acinetobacter não-baumannii (A. genomic species “Close to 13TU”), sendo a CHDL mais antiga encontrada no HSP, 194 Conclusões Pela primeira vez no Brasil foi identificado a carbapenemase IMP-10 em isolados de A. baumannii, em um pequeno surto ocorrido em agosto de 2000 no HSP; A IMP-1 ainda é uma importante carbapenemase em isolados de A. baumannii no HSP, sendo restrita aos hospitais da cidade de São Paulo. Além disso, esse carbapenemase apresenta uma alta capacidade de se disseminar sendo encontrada em outras espécies de Acinetobacter não-baumannii; A primeira variante de OXA-143 (OXA-231) foi descrita na cidade Londrina em um isolado de A. baumannii, demonstrando a emergência desse cluster de CHDL nas demais regiões geográficas brasileiras; 195 Referências Bibliográficas 7 - Referências Bibliográficas Abraham EP e Chain E. 1988. An enzyme from bacteria able to destroy penicillin. 1940. Reviews of Infectious Diseases. 10(4): 677-678. Acosta J, Merino M, Viedma E, Poza M, Sanz F, Otero JR, Chaves F, Bou G. 2011. Multidrugresistant Acinetobacter baumannii Harboring OXA-24 carbapenemase, Spain. Emerging infectious diseases. 17:1064-1067. Afzal-Shah M, Woodford N, Livermore DM. 2001. Characterization of OXA-25, OXA-26, and OXA-27, molecular class D beta-lactamases associated with carbapenem resistance in clinical isolates of Acinetobacter baumannii. 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