TP2 – Desenho in silico de uma experiência de Southern

INSTITUTO SUPERIOR TÉCNICO
MESTRADO INTEGRADO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA
Relatório de Engenharia Genética
TP2 – Desenho in silico de uma experiência
de Southern Blotting, de uma experiência
de clonagem de um gene, e previsão da
função de uma sequência de DNA não
caracterizada
Ana Raquel Aguiar nº72727, Marta Ferreira nº72767, Nuno Matias nº73614
Professora Miguel Teixeira
Novembro 2013
1
Relatório TP2 – Engenharia Genética
2013/2014
Introdução
Neste trabalho experimental, pretendeu-se analisar as sequências de
nucleótidos e de aminoácidos de um determinado gene, através de algumas
ferramentas
bioinformáticas
essenciais
em
Engenharia
Genética,
disponibilizadas na Internet.
Para tal, realizaram-se três experiências, in silico, que permitiram
explorar os passos necessários de modo a:
I)
Conduzir uma experiência de Southern Blotting
II)
Superproduzir e purificar uma proteína
III)
Prever a função de um gene/proteína não caracterizado.
Com a finalidade de produzir uma sonda para a primeira experiência, criou-se
um mapa de restrição a partir da sequência de nucleótidos, que permitiu
seleccionar as enzimas de restrição. Para a ampliação por PCR criaram-se
primers adequados. Para superproduzir a proteína que o gene codifica, foi
necessário escolher um vector de clonagem adequado para introduzir o gene
numa bactéria que não o possuía. Para este processo também foram usados
métodos bioinformáticos para a selecção de enzimas de restrição e de primers.
Respectivamente à análise de sequências de nucleótidos do gene, inclui-se a
pesquisa de grelhas de leitura aberta (open reading frames – ORFs) que
permitiram identificar o gene desconhecido e a proteína codificada por este
com o recurso a ferramentas de BLAST na plataforma do NCBI. A partir da
análise de sequências de aminoácidos foi possível prever as propriedades
físico-químicas da proteína assim como a sua estrutura.
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
2013/2014
Resultãdos e Anãlise de Resultãdos
O gene estudado para os efeitos desta experiência foi o gene
ABY19312.1 que codifica para a enzima “farnesyl diphosphate synthase
1”(FDS1) do organismo Myzus persicae um afídio vulgarmente conhecido como
pulgão-verde-do-pessegueiro [1].
Desenho in silico de uma experiência de Southern blotting
A experiência laboratorial consiste na criação de uma sonda de DNA
contendo uma porção de um determinado gene. Essa sonda é modificada de
modo a ser detectável e, ao ser colocada em contacto com uma porção
genómica de origem desconhecida, liga-se com elevada especificidade apenas
àquela porção do gene, assinalando a sua presença no conteúdo genético
analisado com a sonda.
Na experiência computacional realizada, procurou-se definir as melhores
condições para a formação da sonda, nomeadamente os primers e as enzimas
de restrição a utilizar. Isto foi realizado para o gene codificante da FDS1, no
caso de se querer localizar este gene no DNA do organismo onde é expresso.
De forma a obter-se a sequência de nucleótidos do gene que codifica a
enzima em estudo, recorreu-se à base de dados do NCBI (National Center for
Biotechnology Information), tendo-se obtido o seguinte resultado em formato
FASTA contendo 1185 bp [2]:
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
2013/2014
>gb|EU334430.1|:248-1432 Myzus persicae farnesyl diphosphate synthase 1 (FPS1)
mRNA, complete cds
ATGAACAAAATGCTGACTTTTACGAGAGCCCTAAGTCGCCGGAGCGCGTTTTTGCTCTGTGACTCGGCTGTCGTTCGGAA
TAATAACTTTCGGGCTATGAGTACAGTTCGCGCACCGCCAGTCCCTCCGGTCATAACTGGTACAGCCGTCAGCAAGGACG
AGACCAGGGATTTCATGGCAGTGTTCCCAGATGTAGTCAGGGATCTGACGGACACCGGCCGTAACTTAGACGTGCCCGAT
GTTACCAAGTGGCTCGCAAAGCTGTTGCAATACAATGTGCCCGGTGGTAAGAAAAACCGAGGATTGGCTTTGGTACTGTC
ATACAAAATGTTATCCTCGCCTTCTGATCAGACTGATGAAAACCTTAAATTGTCTTACATACTGGGATGGTGTGTTGAAA
TTCTGCAAGCCTATCAATTAGTGTTAGATGACATAATGGATAACGCAATAACTAGACGAGGACGTCCATGTTGGTATCGG
CACAATGATATTGGTCTAATGGCAGTGAACGATGGTGTTCTCCTCGAACAGGCCATTTACCAGTTGATTAAAAAGTACTT
CAAGGATAAGCCTTACTACACACATATTTTGGAGCTGTTCTTTGACGTTACAATGAAAACTGCGATGGGTCAGTGTCTTG
ATATGTTAACCGCCAATAGCTTCAAGTCAAAAAAACTTGAAAAATATACCATGGAAAATTATACAGCTATTGTGAAATAT
AAGACTGCTTATTATTCTTTTTTTCTTCCAGTATGTCTTGCAATGCGCATGACAAACATCAATGACCCAGAAATCTTTCG
ACAAGCAAAGACTATACTGCTTGAAATGGGACACTTCTTTCAAGTTCAAGATGACTTTTTAGACTGTTATGGAGATCCAG
ACGTCATGGGAAAAATTGGCACAGACATAGAAGATGGTAAATGTTCATGGTTAGCTGTAGTGGCTTTGCAAAAAGTCAAT
TCTGAACAAAAGAAAATTATGGAGGACAACTATGGTATTGATGATCCAGCCAATGTTGCAATCATCAAAGATTTGTATGC
ACAGTTGAAATTAGCAGACACATTTCATCTCTACGAAGAAGAAAGTTATAAATTAATATGCACTCATATTCAACAGTTGT
CACGAGGTTTGTCACAAGACATGTTTTTCAAATTTTTGGAAAAGATTTACAAGAGAACACTCTAA
Fig.1 Sequência de nucleótidos do gene da FDS1
Computação do mapa de restrição do gene
A execução da técnica de Southern blotting implica a digestão da porção
genómica que se quer sondar, por parte de enzimas de restrição. Usando o
software NEBcutter V2.0 [3], foi possível, a partir da sequência de DNA do
gene, encontrar a maior grelha de leitura aberta – ORFs (open reading frames)
utilizando o código genético de E.Coli. Este software permitiu também a
selecção de enzimas de restrição cuja sequência de corte está presente ou
ausente no gene introduzido como input.
Tratando a sequência de DNA como linear e escolhendo enzimas de restrição
comercialmente disponíveis, obtém-se o mapa de restrição do gene em estudo
[4].
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
2013/2014
Fig.2 Mapa de restrição do gene da FDS1
Este diagrama mostra as enzimas que cortam o gene em sequências
específicas do mesmo. As enzimas que se devem escolher neste caso são as
que preferencialmente não têm sequências de corte localizadas no interior do
gene. Tais enzimas estão listadas na Tabela 1 [5]. Poderia ser utilizada uma
enzima que cortasse o gene numa zona exterior à zona sondada, mas para
escolher tal enzima tem de se ter em atenção os primers e verificar se estes
abrangem uma zona que é cortada pela enzima eleita.
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
2013/2014
Tabela.1 Lista de enzimas cujas sequências de corte localizam-se no exterior do gene
#
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
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29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
Enzyme
AarI
AbsI
Acc65I
AccI
AclI
AcuI
AfeI
AflII
AgeI
AhdI
AjuI
AleI
AlfI
AloI
AlwNI
ApaI
ApaLI
ApeKI
ArsI
AscI
AsiSI
AvaI
AvaII
AvrII
BamHI
BanI
BarI
BbsI
BbvCI
BbvI
BcgI
BciVI
BfuAI
BglI
BglII
BlpI
BmtI
BplI
BpmI
Bpu10I
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
BpuEI
BsaAI
BsaBI
BsaXI
BseYI
BsgI
BsiHKAI
BsiWI
BsmBI
BsmI
BsoBI
BspCNI
BspDI
BspEI
BspHI
BspMI
BspQI
BsrBI
BsrGI
BssHII
BstAPI
BstBI
BstEII
BstXI
BstZ17I
Bsu36I
ClaI
CspCI
DraI
DraIII
EarI
EciI
Eco53kI
EcoO109I
EcoP15I
EcoRI
EcoRV
FalI
FauI
Fnu4HI
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
120
FseI
HaeII
HgaI
HindIII
HphI
Hpy99I
KasI
KflI
KpnI
MauBI
MfeI
MluI
MmeI
MreI
MscI
MspA1I
NaeI
NarI
NdeI
NgoMIV
NheI
NlaIV
NotI
NruI
NsiI
PacI
PaeR7I
PasI
PcsI
PflFI
PflMI
PfoI
PluTI
PmeI
PmlI
PpuMI
PshAI
PspOMI
PspXI
PsrI
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
145
146
147
148
149
150
151
152
153
PstI
PvuI
PvuII
RsrII
SacI
SacII
SalI
SapI
Sau96I
SbfI
SexAI
SfaNI
SfiI
SfoI
SgrAI
SgrDI
SmaI
SmlI
SnaBI
SpeI
SphI
SspI
StuI
SwaI
TaqII
TauI
TfiI
TseI
TspMI
Tth111I
XbaI
XhoI
XmaI
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
2013/2014
Desenho de primers para PCR
Para a realização desta técnica é necessário a presença de uma elevada
quantidade de sonda, pelo que se deve recorrer à utilização da técnica de PCR,
conhecida pela sua utilidade na amplificação de zonas especificas de DNA.
Torna-se necessário definir a secção a ampliar, recorrendo por isso ao desenho
de dois primers; as sequências que ao ligarem-se à cadeia complementar ou à
cadeia codificadora permitem a acção da polimerase. Este desenho é feito
recorrendo ao auxílio do programa informático Primer3Plus [6].
O software utilizado no desenho de primers selecciona vários pares de primers
dos quais se selecciona 1 par, de acordo com os critérios enunciados abaixo. É
claro que essa selecção tem por base as características mais úteis à sua função
na técnica de PCR.
As características mais importantes na análise de um primer são:
• Ter um comprimento entre 17 a 28 bases. Um comprimento superior a 17 já
garante especificidade suficiente para que se ligue exclusivamente no local
seleccionado, enquanto que um comprimento superior a 28 bases torna-se
pouco eficiente, aumentando a probabilidade de se formarem estruturas
secundárias. É geralmente aceite que o comprimento ideal para a PCR é 18-22
bases. Este comprimento garante especificidade e facilidade de hibridação à
temperatura de melting (Tm).
• Possuir um conteúdo GC de 50% a 60%. As ligações G-C são mais estáveis,
pelo que promovem a ligação do primer à molécula de DNA. Quanto mais
elevado for o conteúdo GC, maior é a Tm, o que é conveniente pois impede
que os primers exijam uma temperatura muito baixa para a hibridação,
evitando o risco de renaturação do DNA. Também os terminais 3’ devem ser C,
G, CG ou GC de modo a aumentar a eficiência da acção da polimerase, não
podendo ter 3 ou mais nucleótidos de bases C e G seguidos, pois estas
sequências geram erros por ligação a outros locais do DNA com elevado
conteúdo GC.
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
2013/2014
• As temperaturas de melting deve estar entre os 55°C e os 80°C, evitando a
renaturação do DNA. É também necessário que a Tm esteja abaixo da
temperatura óptima do funcionamento da polimerase. Os primers para os
quais são obtidos melhores resultados possuem Tm pertencentes ao intervalo
52-58°C.
• Deve evitar-se a complementaridade entre as extremidades de modo a
prevenir a formação de dímeros e perturbar a actividade da polimerase;
• Devem evitar-se primers que tenham tendência para formar estruturas
secundárias.
Após a simulação, o par de primers seleccionado que cumpre os requisitos
enunciados em cima, está representado em seguida juntamente com as
respectivas localizações dentro do gene.
Fig.3 Primers obtidos e respectivas características
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
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Fig.4 Localização dos primers no gene
Super-produção e purificação de uma proteína
Com o objectivo de produzir a proteína pretendida, recorrendo a uma
bactéria neste caso a E.coli, a informação genética que permita a tradução tem
de ser contemplada no seu genoma, o que não se verifica. Para produzir esta
proteína recorrendo a esta bactéria é então necessário introduzir o gene no
interior da E.coli, através de um vector de clonagem.
Torna-se então necessário seleccionar um vector pequeno, de modo a
facilitar a introdução de DNA recombinante, como é o caso do PETBlueII.
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
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Selecção do vector de clonagem
Utilizou-se a base de dados do site addgene [7] para encontrar um
plasmídeo propício a servir de vector recombinante contendo o gene da FDS1.
Foram procurados plasmídeos com “HIS tag”, de origem bacteriana e com
resistência a, por exemplo, ampicilina.
Um dos plasmídeos com estas características é o PETBlueII, que por ser um
vector relativamente pequeno facilita a introdução de DNA recombinante [8].
Este plasmídeo está representado em seguida:
Tabela.2 Enzimas de restrição
XbaI
BgIII
NheI
EcoRV
XmaI
SmaI
SacI
BamHI
EcoRI
AscI
PstI
SaII
NcoI
AatII
KpnI
ClaI
BstBI
HindIII
NotI
EagI
PvuII
PmII
XhoI
AgeI
PacI
Fig.5 Vector PETBlueII
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Selecção das enzimas de restrição
Procedeu-se seguidamente à selecção das enzimas para abrir o vector
no local onde o gene seria clonado.
A escolha das enzimas de restrição deve ser feita de modo que estas cortem o
vector de clonagem na zona de corte de múltiplas enzimas (regiões azuis
escuras no vector PetblueII), mas que não abranjam o gene. De preferência
devem usar-se duas enzimas com segmentos de corte diferentes para evitar a
recircularização do vector antes da incorporação do gene.
Comparando a Tabela 1 (enzimas que não cortam o gene) com a lista das
enzimas com segmentos de corte situados na região múltipla de corte (Tabela
2) chega-se à conclusão que as todas as últimas enzimas podem ser utilizadas
para segmentar o plasmídeo à excepção das seguintes: NcoI, AatII, EagI.
Em seguida foi necessário escolher duas destas enzimas possíveis. A página da
internet clontech [9] disponibiliza informação sobre os meios de solução
tampão onde duas enzimas diferentes são compatíveis e têm eficiência
máxima. As enzimas escolhidas foram a BamHI e SmaI em meio de solução
tampão 0.5X T+BSA cuja composição pode ser consultada na respectiva fonte
bibliográfica.
Selecção dos primers
Seguidamente, desenharam-se os primers que devem ser sintetizados
tendo em conta que para a proteína ser expressa, todo o gene tem de estar
contido na região a amplificar, o que não se verificava quando se estavam a
desenhar primers para a amplificação de DNA para sondas. Os primers
receberam os nomes de forward (Fw) e reverse (Rv). O forward tem de ser
complementar do complementar, ou seja, tem de ser igual ao original e vai
hibridar com a cadeia complementar. Já o reverse tem de ser complementar
da cadeia que contem o gene. Quando apresentados, os primers devem
apresentar-se na forma 5’->3’.
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Fw: TCCCCCGGGATGAACAAAATGCTGACT
Rv: CGCGGATCCAGAGTGTTCTCTTGTAAA
O primer Fw foi construído a partir dos primeiros 18 nucleótidos da sequência
de
DNA
do
gene,
complementaridade
enquanto
dos
últimos
que
18
o
primer
nucleótidos
Rv
da
foi
construído
mesma
por
sequência,
representados a sublinhado. Se os primers fossem só constituídos por estes
segmentos o conteúdo GC era cerca de 33%, o que revela um valor longe do
de 55% requerido para bons primers. Este rácio era ainda menor se, em vez
de 18 nucleótidos se tivessem escolhido 20, acrescentando mais 2 nucleótidos
de adenina e timina, e por isso diminuindo ainda mais o conteúdo CG. Vê-se
portanto à partida a dificuldade acrescida de gerar bons primers já que a
sequência complementar de DNA é naturalmente muito rica em Adeninas e
Timinas e pobre em Guaninas e Citosinas.
Aos primers foi ainda acrescentada uma sequência de restrição que deve ter
em atenção a forma como o gene será transcrito e acrescentar aos primers as
sequências que permita ao gene ser inserido no sentido correcto em que a
leitura por parte de uma enzima proporcionará a transcrição e posterior
tradução de uma proteína funcional. De modo a compensar o baixo conteúdo
GC da sequência de 18 nucleótidos, é preferível adicionar sequências ricas em
guaninas e citosinas. As enzimas escolhidas anteriormente, SmaI e BamHI
satisfazem esta condição, tendo regiões de corte dadas a vermelho:
SmaI : TCCCCCGGGGGA
BamHI : CGCGGATCCGCG
Para além da zona de restrição podem ainda adicionar-se alguns nucleótidos
CG pois está a lidar-se com a actividade de endonucleases que verão a sua
eficiência aumentada caso a sua sequência de corte não esteja localizada numa
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2013/2014
extremidade. Após a ampliação do gene, este tem de ser digerido pelas
mesmas
enzimas
que
cortaram
o
vector,
de
modo
a
apresentarem
extremidades coesivas que facilmente se liguem ao vector, passando este a
estar clonado e a puder passar-se à sua inserção numa bactéria para a
produção da proteína.
Utilizou-se em seguida o software OligoAnalyzer [10] para averiguar a
qualidade dos primers e prever a temperatura de fusão dos mesmos, tendo-se
chegado às figuras seguintes.
Fig.6 Características do primer Fw
Fig.7 Características do primer Rv
Analisando estes resultados conclui-se que o comprimento dos dois primers
está dentro do intervalo estipulado (17-28 bases). Verifica-se que o conteúdo
GC e Tm (temperatura de fusão) são valores razoáveis embora não ideais visto
que o conteúdo GC ideal é perto de 55% e Tm entre 52-58ºC.
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Ferramentas básicas para prever a função de um gene/proteína
não caracterizado
De forma a obter-se a sequência de aminoácidos da proteína FDS1
recorreu-se novamente à base de dados do NCBI (National Center for
Biotechnology Information) [11], tendo-se obtido o seguinte resultado em
formato FASTA contendo 394 aminoacidos:
>gi|162538561|gb|ABY19312.1| farnesyl diphosphate synthase 1 [Myzus
persicae]
MNKMLTFTRALSRRSAFLLCDSAVVRNNNFRAMSTVRAPPVPPVITGTAVSKDETRDFMAVFPDVVRDLT
DTGRNLDVPDVTKWLAKLLQYNVPGGKKNRGLALVLSYKMLSSPSDQTDENLKLSYILGWCVEILQAYQL
VLDDIMDNAITRRGRPCWYRHNDIGLMAVNDGVLLEQAIYQLIKKYFKDKPYYTHILELFFDVTMKTAMG
QCLDMLTANSFKSKKLEKYTMENYTAIVKYKTAYYSFFLPVCLAMRMTNINDPEIFRQAKTILLEMGHFF
QVQDDFLDCYGDPDVMGKIGTDIEDGKCSWLAVVALQKVNSEQKKIMEDNYGIDDPANVAIIKDLYAQLK
LADTFHLYEEESYKLICTHIQQLSRGLSQDMFFKFLEKIYKRTL
Fig.8 Sequênica de aminoácidos da enzima FDS1
Procura por semelhança de nucleótidos
Quando se sequencia um gene, não se consegue caracterizar de
imediato qual(ais) a(s) proteína(s) produzida(s). É muitas vezes possível
encontrar dentro de uma sequência vários conjuntos de possíveis genes que
codifica para uma ou mais proteínas. Os possíveis genes são localizados por se
iniciarem com codões de iniciação (ATG) e terminarem com os codões de
terminação (TAA, TAG, TGA).
Inserindo a sequência de nucleótidos (Fig.1) na ferramenta Blast do NCBI e o
algoritmo blastn [12], obtiveram-se uma representação dos genes possíveis,
representados nas imagens seguintes.
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
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Fig.9 Representação gráfica dos resultados da procura por semelhança de nucleótidos
Fig.10 Representação descritiva dos resultados da procura por semelhança de
nucleótidos
Através da análise desta tabela conclui-se que o resultado 100% compatível
com a sequência de nucleótidos fornecida é precisamente o gene que codifica
para a enzima “farnesyl diphosphate synthase 1”(FDS1) do organismo Myzus
persicae. Caso, à partida, não soubéssemos o gene codificado por esta
sequência de nucleótidos, chegava-se a esta mesma conclusão.
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
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Procura por semelhança de proteínas
Pode comparar-se um o conjunto de nucleótidos que codifica para uma
proteína com outras sequências semelhantes, no entanto quando se pretende
determinar qual a função de determinada proteína torna-se mais preciso
comparar as sequências de aminoácidos. Usando a ferramenta Blast do NCBI e
o algoritmo blastp [13], obtiveram-se uma representação das proteínas
possíveis,
representados
nas
figuras
(apenas
23
dos
100
resultados)
seguintes:
Fig.11 Representação gráfica dos resultados da procura por semelhança de proteínas
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
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Fig.12 Representação descritiva dos resultados da procura por semelhança de proteínas
Utilizando o software Expasy e o algoritmo ProtParam [14], onde se
inseriu a sequência de aminoácidos, obtiveram-se as propriedades físicoquímicas associadas à proteína correspondente.
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
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Fig.13 Propriedades físico-químicas da enzima FDS1
Desta figura podemos estudar a composição relativa da proteína FSD1 em
termos de aminoácidos e dos pesos moleculares das proteínas. Caso
conseguíssemos obter os pesos moleculares das proteínas correspondentes dos
ORF’s
e
se
superproduzíssemos
essa
sequencia
de
DNA,
através
da
electroforese conseguiríamos concluir qual o ORF é que estaria a ser expresso.
Podemos também retirar outras propriedades físico-químicas da proteína,
entre elas a instabilidade. Verifica-se que a proteína FDS1 é instável.
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Análise da estrutura primária
É também importante quando se estuda a função de uma proteína ter a
noção do seu tempo de vida, da sua estrutura tridimensional; por exemplo as
proteínas transmembranares têm de se estruturar de modo a serem
hidrofóbicas. A ferramenta TMHMM permitiu aferir sobre a localização da
proteína dentro da célula [15].
Fig.14 Representação gráfica da probabilidade de localização da enzima FDS1 dentro da célula
Conclui-se que a proteína FSD1 é, sem margem para dúvidas, citosólica
(outside-fora da membrana celular), indicando que não está associada a
funções como por exemplo o transporte de substâncias através da membrana.
Uma proteína classificada como ‘outstide’ seria mais fácil de purificar e
compreender do que uma proteína membranar, que muito provavelmente teria
uma função dependente de outros sistemas enzimáticos. Outro factor
importante na funcionalidade das proteínas são as modificações pós-tradução
como a fosforilação e a metilação; caso estas não ocorram, torna-se impossível
a determinação da função da proteína.
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
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Conclusão
Através das ferramentas bioinformáticas foi possível aferir a sequência
de nucleótidos do gene estudado e descobrir que esse gene codifica para a
enzima FDS1 do organismo eucariota Myzus persicae.
Neste trabalho aprendeu-se a utilizar ferramentas bioinformáticas, que
permitiram o desenho do mapa de restrição do gene que codifica a FDS1, o
desenho de primers tendo em conta as características que estes devem
possuir, a identificação do gene e da proteína correspondente a uma sequência
de nucleótidos e aminoácidos e a caracterização da mesma em termos de
estrutura e propriedades.
Pode
então
constatar-se
o
quão
vasta
é
a
aplicação
da
simulação
computacional para a realização de certas experiências. Estes métodos
revelam
ser
muito
importantes
pois
facilitam
o
trabalho
de
muitos
investigadores, poupando tempo laboratorial e tornando os trabalhos menos
dispendiosos.
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Relatório TP2 – Engenharia Genética
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Referenciãs Bibliogrã ficãs
[1] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
[2] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/162538560?report=fasta
[3] http://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php
[4] http://tools.neb.com/NEBcutter2/cutshow.php?name=775ac6f9[5] http://tools.neb.com/NEBcutter2/listbycuts.php?name=775ac6f9-&numcuts=0
[6] http://biotools.umassmed.edu/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi
[7] http://www.addgene.org/vector-database/
[8] http://www.addgene.org/vector-database/2658/
[9]
http://www.clontech.com/takara/US/Support/Applications/Restriction_Enzymes/Buffer_Activity_
Chart
[10] http://eu.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
[11] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html
[12]
http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=bl
asthome
[13] http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
[14] http://web.expasy.org/protparam/
[15] www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0
Para recolha de informação:
http://www.premierbiosoft.com/tech_notes/PCR_Primer_Design.html
Protocolo:
Guia de trabalhos laboratoriais de Engenharia Genética (2013/2014) de Leonilde M. Moreira,
Cristina A. Viegas, Arsénio Fialho, Jorge H. Leitão e Isabel Sá Correia
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