Dissertação de Mariana Moraes Piccolomini

INSTITUTO BIOLÓGICO
PÓS-GRADUAÇÃO
Alterações na Morfologia e na Viabilidade no Desenvolvimento de
Embriões Bovinos Fecundados in vitro com Sêmen Exposto
Experimentalmente à Escherichia coli Produtora da Toxina Shiga
Stx2 (STEC)
MARIANA MORAES PICCOLOMINI
Dissertação apresentada ao Instituto
Biológico, da Agência Paulista de
Tecnologia dos Agronegócios, para
obtenção do título de Mestre em
Sanidade,
Segurança
Alimentar
e
Ambiental no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade Animal,
Segurança Alimentar e Ambeintal
Orientadora: Profª. Drª. Magali D’Angelo
São Paulo
2010
DADOS DE CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)
Núcleo de Informação e Documentação - Biblioteca
Instituto Biológico
Secretaria da Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo
Piccolomini, Mariana Moraes
Alterações na morfologia e na viabilidade no desenvolvimento de embriões bovinos fecundados in vitro com
sêmen exposto experimentalmente à Escherichia coli produtora da toxina shiga stx2 (STEC) / Mariana
Moraes Piccolomini -- São Paulo, 2010.
Dissertação (Mestrado). Instituto Biológico (São Paulo). Programa de Pós-Graduação.
Área de concentração: Sanidade Animal.
Linha de pesquisa: Reprodução Animal.
Orientador: Magali D´Angelo
Versão do título para o inglês: Changes in morphology and viability on the development of bovine embryos in
vitro fertilized with experimentally contaminated semen to Escherichia coli shiga toxin-producing stx2 (stec).
1. Sêmen bovino 2. Embrião bovino 3. Escherichia coli . 4. Toxina shiga stx2 5. Fecundação in vitro 6.
Sanidade animal...I. D’Angelo, Magali II. Instituto Biológico (São Paulo). Programa de Pós-Graduação III.
Título
IB/Bibl. /2010/006
“Dedico este trabalho as pessoas que são a base da minha vida.
Aos meus pais Eduardo e Sueli
e a minha irmã Julia”
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais Eduardo Piccolomini e Sueli Vitória Moraes Piccolomini, fonte
inspiradora e grande exemplo de vida, por todo amor, apoio, carinho e compreensão.
À minha irmã Julia Moraes Piccolomini, pelo apoio, risadas e por me ajudar com as
apresentações.
Ao meu namorado Rodrigo de Melo Del Posso, pela paciência, força, carinho, por me
ajudar, por ouvir e sempre me apoiar. Amo você.
À minha orientadora Doutora Magali D’Angelo, pesquisadora do Laboratório de
Biologia Celular do Instituto Biológico de São Paulo, pela orientação desde a graduação,
ensinamentos e por acreditar em mim.
À minha grande amiga e mestre Ana Carolina Goes, por dividir comigo esse
momento, por estar sempre presente, pelas intermináveis conversas, por me ouvir e me
entender, pelas risadas e por ser minha “co-orientadora”. Sucesso pra você, amiga.
Ao meu grande amigo e mestre Leandro Lima Rossignolo Venditti, por sempre me
ajudar, mesmo que de longe, com simples correções de textos à “botijão de nitrogênio
líquido com peças quebradas”. Pelas conversas, brigas e risadas. Saudades.
À equipe do Laboratório de Biologia Celular, Danielle, Eduardo e Mayra pela
convivência, paciência e enorme contribuição nas idas ao abatedouro, na seleção de oócitos
e ajuda com os experimentos e análise dados estatísticos.
Às pesquisadoras do Laboratório de Bacteriologia Geral do Instituto Biológico de São
Paulo, Ms. Alessandra Figueiredo de Castro Nassar e Ms. Simone Miyashiro, pela
ajuda direta no experimento, por cederem a bactéria utilizada e por sempre estarem
dispostas a ajudar.
À pesquisadora do Laboratório de Viroses de Bovídeos do Instituto Biológico de São
Paulo, Doutora Edviges Maristela Pituco, por me ajudar quando precisei de material para a
realização do trabalho.
À pesquisadora do Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto Biológico de
São Paulo, Ms. Márcia Catroxo, pela microscopia eletrônica realizada nesse trabalho.
Às Doutoras Eliana Scarcelli Pinheiro, Margareth Elide Genovez e Cláudia Del
Fava do Instituto Biológico de São Paulo e ao Doutor Pietro Sampaio Baruselli da
Universidade de São Paulo que aceitaram gentilmente meu convite para participar da banca
de mestrado, esclarecendo e ensinando durante a qualificação, e quando precisei. Obrigada
pelo carinho e amizade. É uma honra para mim dividir esse momento com vocês.
À todos os docentes da Pós Graduação do Instituto Biológico de São Paulo, cada um
me ensinou um pouquinho do que está aqui.
Aos amigos da pós-graduação, pelas conversas e risadas de todas quartas-feiras. Ao
Luis Correzola pela amizade, alegria e conselhos. Ao Emerson, Diogo e Ricardo pelas
viagens à Campinas com direito a muitos “retornos”.
Ao abatedouro Mantiqueira e seus funcionários, por ceder e ajudar na colheita dos
ovários utilizados nesse trabalho.
À Central Bela Vista/Genética Bovina por ceder gentilmente o sêmen utilizado no
experimento.
Às Empresas In Vitro Brasil e Vitrocell/Embriolife, cujos suportes viabilizaram a
execução deste trabalho.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes) pela
bolsa de mestrado.
À todos que, de forma direta ou indireta, contribuíram para o êxito dessa jornada...
Muito Obrigada
“Quando não conseguir correr através dos anos, trote. Quando não conseguir trotar,
caminhe. Quando não conseguir caminhar, use uma bengala.
Mas nunca se detenha”
Madre Teresa de Calcutá
RESUMO
PICCOLOMINI, M.M. ALTERAÇÕES NA MORFOLOGIA E NA VIABILIDADE NO
DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES BOVINOS FECUNDADOS IN VITRO COM SÊMEN
EXPOSTO EXPERIMENTALMENTE À ESCHERICHIA COLI PRODUTORA DA TOXINA
SHIGA STX2 (STEC). São Paulo. 2010. Dissertação (Mestrado em Sanidade Animal,
Segurança Alimentar e Ambiental) – Instituto Biológico.
Embora cada vez mais utilizadas, as técnicas de reprodução assistida ainda necessitam de
pesquisas que avaliem os riscos sanitários de oócitos, embriões e espermatozóides, uma
vez que as mortalidades embrionária e fetal têm um grande impacto na rentabilidade de
qualquer sistema de produção animal. O objetivo desse trabalho foi avaliar por meio de
microscopia óptica e eletrônica de transmissão, as alterações na morfologia e na viabilidade
do
desenvolvimento
de
embriões
bovinos
fecundados
com
sêmen
exposto
experimentalmente a Escherichia coli produtora da Toxina Shiga stx2. Para tanto, oócitos
foram aspirados de ovários de vacas abatidas e os que apresentaram zona pelúcida intacta
foram selecionados e maturados. Após 20 horas, os oócitos foram divididos em grupo
controle (n=418), fecundado com o sêmen controle e contaminado (n=415), fecundado com
sêmen exposto a 200 UFC de E. coli produtora da toxina shiga stx2. Cada amostra de
sêmen foi tratada pela técnica de gradiente descontínuo de Percoll®, sendo que a
concentração espermática foi ajustada em aproximadamente 100 mil espermatozóides para
cada oócito. Após o período de fecundação, os embriões foram avaliados quanto a sua
morfologia e viabilidade, através da microscopia óptica. A análise estatística foi feita pelo
método do χ2 (qui-quadrado) com correção de Yates. Na avaliação morfológica, os oócitos
fecundados com o sêmen contaminado apresentaram retração citoplasmática, falhas na
divisão, assimetria de blastômeros, ooplasma granuloso, com coloração castanho escura,
formação de vacúolos, degeneração e rompimento da zona pelúcida. Através do corte semifino foram observadas células granulosas e vacuolizadas, apresentando estruturas
semelhantes à E. coli, que foram confirmadas através da microscopia eletrônica de
transmissão. Essas alterações não foram observadas no grupo controle. A taxa de clivagem
foi 70,3% e 52,8%, respectivamente, para embriões controle e contaminado, apresentando
diferença significativa (p=0,0001). Após o 7º dia de desenvolvimento embrionário, foi
observado 44,7% de mórulas no grupo controle, e no grupo contaminado apenas 22,4%,
apresentando diferença significativa (p=0,0001). A presença da E. coli produtora da toxina
shiga stx2 interfere na taxa de clivagem dos embriões e também inviabiliza e/ou provoca
queda no desenvolvimento embrionário ao estádio de mórula, além de causar alterações
morfológicas durante esse desenvolvimento. A boa higienização do prepúcio do touro e dos
materiais utilizados durante a coleta, com descontaminantes adequados, são de extrema
importância, assim como o uso de antibióticos eficientes durante a diluição do sêmen, para
que este se apresente livre de qualquer contaminação, já que o procedimento utilizado
durante a FIV (Percoll®), para reduzir ou eliminar a E. coli produtora de toxina shiga, não se
mostrou eficaz.
Palavras chave: Fecundação in vitro. Sêmen bovino. Escherichia coli produtora da toxina
shiga stx2.
ABSTRACT
PICCOLOMINI,
DEVELOPMENT
M.M.
OF
CHANGES
BOVINE
IN
MORPHOLOGY
EMBRYOS
IN
AND
VITRO
VIABILITY
ON
FERTILIZED
THE
WITH
EXPERIMENTALLY CONTAMINATED SEMEN TO ESCHERICHIA COLI SHIGA TOXINPRODUCING STX2 (STEC). São Paulo. 2010. Master thesis (Animal Health, Food Safety
and Environmental) – Instituto Biológico.
Although increasingly used, assisted reproduction techniques still need researchs to assess
the health risks of oocytes, embryos and sperm, as the embryonic and fetal mortality have a
major impact on the profitability of any livestock production system. The aim of this study was
to evaluate by optical and electron on microscopy, changes in morphology and viability of the
development of bovine embryos, fertilized with semen experimentally contaminated with
Escherichia coli producing the Shiga toxin stx2. To this end, oocytes were aspirated from
ovaries of slaughtered cows and ones with the intact zona pellucida were selected and
matured. After 20 hours, the oocytes were divided into control group (n = 418), fertilized with
semen control and group infected (n = 415), fertilized with sperm exposed to 200 UFC E. coli
shiga toxin-producing stx2. Each semen was treated by the technique of discontinuous
Percoll® gradient, and the sperm concentration was adjusted to approximately 100 thousand
sperm for each oocyte. After the period of fertilization, the embryos were evaluated for their
viability and morphology by light microscopy. Statistical analysis was performed using the χ2
(Chi-square test) with Yates correction. In the morphological evaluation, the oocytes fertilized
with contaminated semen showed cytoplasmic shrinkage, blastomere division failures,
asymmetry of blastomeres, granular ooplasm with dark brown color, formation of vacuoles,
degeneration and disruption of the zona pellucida. The thin sections of the same group
showed granular cells and vacuolated, with structures similar to E. coli, that have been
confirmed by transmission electron microscopy. These changes were not observed in the
control group. Cleavage rate was 70.3% and 52.8%, respectively, for control and infected
embryos, showing significant difference (p = 0.0001). After the 7th day of embryonic
development, where it was observed 44.7% of morula in the control group and 22.4% in the
group infected, statistically significantly different (p = 0.0001). The presence of E. coli shiga
toxin-producing stx2 interfere with cleavage rate of embryos and also impossible and / or
causes a reduction in embryo development to the morula stage and cause morphological
changes during the development. Good hygiene of the prepuce of the bull and materials
used during the collection, with appropriate disinfectants, are extremely important, and the
use of antibiotics effective for the dilution of semen, to ensure the back of contamination,
since the procedure used during IVF (percoll®), to reduce or eliminate STEC, was not
effective.
Keywords: In vitro fertilization. Bovine semen. Escherichia coli shiga toxin-producing stx2.
LISTA DE TABELA
Tabela 1
Desenvolvimento embrionário dos embriões do grupo controle e
contaminado........................................................................................22
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Embriões do grupo controle após 18 horas da fecundação, antes da
retirada da camada de células do cumulus (aumento de
100x)....................................................................................................19
Figura 2
Embriões do grupo contaminado após 18 horas da fecundação , antes
da retirada da camada de células do cumulus (aumento de
100x)....................................................................................................19
Figura 3
Embriões denudados do grupo controle após 18 horas da fecundação
(aumento de 100x)..............................................................................20
Figura 4
Embriões denudados do grupo contaminado após 18 horas da
fecundação (aumento de 100x) ..........................................................20
Figura 5
Mórulas do grupo controle após o 7º dia de desenvolvimento (aumento
de 100x) .............................................................................................20
Figura 6
Embrião do grupo controle após o 7º dia de desenvolvimento
(aumento de 100x) .............................................................................20
Figura 7
Mórula do grupo controle após o 7º dia de desenvolvimento (aumento
de 100x) .............................................................................................21
Figura 8
Embriões do grupo contaminado, com assimetria de blastômeros e
falha na divisão, após o 7º dia de desenvolvimento (aumento de
100x) ..................................................................................................21
Figura 9
Embriões do grupo contaminado, com assimetria de blastômeros,
falha na divisão, ooplasma granuloso e formação de vacúolos, após o
7º dia de desenvolvimento (aumento de 100x) ..................................21
Figura 10
Embriões do grupo contaminado, com assimetria de blastômeros,
falha na divisão, ooplasma granuloso, formação de vacúolos, retração
citoplasmática, degeneração e rompimento da zona pelúcida, após o
7º dia de desenvolvimento (aumento de 100x) ..................................21
Figura 11
Embriões do grupo contaminado, com degeneração, rompimento de
zona pelúcida e falha na divisão, após o 7º dia de desenvolvimento
(aumento de 100x) .............................................................................21
Figura 12
Embrião do grupo contaminado após o 7º dia de desenvolvimento
(aumento de 100x) .............................................................................22
Figura 13
Embriões do grupo contaminado após o 7º dia de desenvolvimento
(aumento de 100x) .............................................................................22
Figura 14
Embrião do grupo contaminado após o 4º dia de desenvolvimento em
microscopia óptica de corte semi-fino (aumento de 100x). A: zona
pelúcida. Estruturas semelhantes a E.coli estão representadas pela
seta.....................................................................................................23
Figura 15
Outro corte do mesmo embrião do grupo contaminado após o 4º dia
de desenvolvimento em microscopia óptica de corte semi-fino
(aumento de 100x). A: zona pelúcida. Estruturas semelhantes a E.coli
estão representadas pela seta............................................................23
Figura 16
Embrião do grupo contaminado após o 4º dia de desenvolvimento em
microscopia eletrônica de transmissão (aumento de 3840x). A: zona
pelúcida, B: ooplasma, C: vacúolos do ooplasma. Dentro do círculo se
estruturas semelhantes a bactéria......................................................24
Figura 17
Embrião do grupo contaminado após o 4º dia de desenvolvimento em
microscopia eletrônica de transmissão (aumento de 10000x). A: zona
pelúcida, C: vacúolos do ooplasma. Dentro do círculo se encontram
estrutururas semelhantes a bactéria...................................................25
Figura 18
Embrião do grupo contaminado após o 4º dia de desenvolvimento em
microscopia eletrônica de transmissão (aumento de 10000x). A: zona
pelúcida. As setas indicam estruturas semelhantes a bactéria...........25
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
µL
microlitro
µm
micrometro
A/E
attaching and effacing
BoHV-1
herpesvírus bovino tipo 1
BLEV
vírus da leucose enzoótica bovina
BSA
albumina sérica bovina
BTV
vírus da língua azul
BVDV
vírus da diarréia viral bovina
ºC
graus Celsius
CO2
gás Carbônico
CSS
Semen Certified Services
DTA
doença de transmissão alimentar
E. coli
Escherichia coli
EHEC
Escherichia coli entero-hemorrágica
FIV
fecundação in vitro
FMDV
febre aftosa
G
grama
HeLa
células de papiloma vírus humano
HIV
vírus da imunodeficiência humana
ICSI
injeção intracitoplasmática de espermatozóide
L
litro
MAPA
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
mg
micrograma
mL
mililitro
mm
milímetro
mM
milimolar
nM
nanometro
MIV
maturação in vitro
OPU
Ovum Pick-up
PBS
solução salina fosfatada
PCR
reação da polimerase em cadeia
pH
potencial hidrogênico
PIV
produção in vitro
RPM
rotações por minuto
SHU
síndrome hemolítica urêmica
SOF
meio fluido sintético de tuba uterina
SP
São Paulo
STEC
Escherichia coli produtora da toxina shiga
TE
transferência de embriões
UFC
unidade formadora de colônia
Vero
células de rim de macaco verde africano
Obs: Visto terem seu uso consagrado na literatura técnica algumas abreviaturas e siglas
seguem as iniciais de sua grafia no idioma inglês.
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 1
2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................................
3
2.1 Produção in vitro de embriões ..................................................................................
3
2.2 Risco de transmissão de doenças pela produção in vitro .........................................
4
2.3 Risco de transmissão de doenças por sêmen contaminado ....................................
5
2.4 Contaminação do sêmen bovino pela Escherichia coli e suas características .........
8
2.5 Aspectos gerais da Escherichia coli produtora da toxina shiga STX2 (STEC) .........
9
2.6 Hipótese ....................................................................................................................
12
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................
13
3.1 Bactéria e condições de crescimento .......................................................................
13
3.2 Colheita dos ovários .................................................................................................
13
3.3 Aspiração folicular .....................................................................................................
14
3.4 Seleção dos oócitos ..................................................................................................
14
3.5 Maturação e manutenção dos oócitos in vitro ..........................................................
14
3.6 Preparo da placa de fecundação ..............................................................................
15
3.7 Contaminação do sêmen in vitro ..............................................................................
15
3.8 Preparo do sêmen ....................................................................................................
15
3.9 Fecundação ..............................................................................................................
16
3.10 Avaliação da morfologia e viabilidade dos embriões bovinos após fecundação
com sêmen contaminado por Escherichia coli produtora da toxina shiga STX2 (STEC)..
16
3.11 Análise estatística ...................................................................................................
17
3.12 Avaliação da morfologia pela microscopia óptica de corte semi-fino e eletrônica de
transmissão............................................................................................ ......................
17
4. RESULTADOS ............................................................................................................
19
4.1 Avaliação morfológica do desenvolvimento de embriões de PIV com sêmen
exposto experimentalmente pela STEC por microscopia óptica .....................................
4.2
Avaliação
da
viabilidade
experimentalmente pela STEC
de
embriões
de
PIV
com
sêmen
19
exposto
......................................................................................
22
4.3 Avaliação morfológica pela microscopia óptica de corte semi-fino ........................... 23
4.4 Avaliação morfológica pela microscopia eletrônica de transmissão...........................
24
5. DISCUSSÃO ................................................................................................................ 26
6. CONCLUSÃO ............................................................................................................
30
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...........................................................................
31
1.
INTRODUÇÃO
No contexto atual de evolução da produtividade na pecuária nacional, associado às
inovações científicas e tecnológicas, várias biotecnologias ligadas à reprodução animal vêm
sendo desenvolvidas e aprimoradas com o intuito de aumentar a eficiência reprodutiva,
maximizando a produção de animais geneticamente superiores, visando o aproveitamento
desse material genético para obtenção do maior número de descendentes, em um curto
período de tempo. Na bovinocultura brasileira, essas tecnologias vêm sendo amplamente
utilizadas e adaptadas ao nosso sistema de produção e, ao longo da sua evolução, têm
revelado bons índices reprodutivos, confirmando ser um processo economicamente viável,
bastante divulgado e empregado na pecuária moderna (RENESTO, 2004).
Embora cada vez mais utilizadas, as técnicas de reprodução assistida como a
produção in vitro (PIV) e a transferência de embriões (TE), ainda necessitam de pesquisas
que avaliem os riscos sanitários das doadoras assim como dos oócitos e embriões
(MAGAJEVSKI; GIRIO; MEIRELLES, 2007). O aprimoramento contínuo de métodos de
controle sanitário do rebanho e das biotécnicas ligadas à reprodução é importante e
necessário, uma vez que a mortalidade embrionária e fetal tem significativo impacto na
rentabilidade de qualquer sistema de produção animal.
A contaminação do sêmen pode afetar diretamente o espermatozóide devido à
competição pelos nutrientes naturais do sêmen, bem como infectar a fêmea, resultando em
baixas taxas de concepção. Muitos microrganismos podem se localizar na cavidade
prepucial do touro e a contaminação do sêmen pode ocorrer na hora da colheita por meio da
microbiota da pele e do solo, já que esses microrganismos estão presentes nesses dois
locais (COSTA; PRADO, 2008).
D’Angelo et al. (2006b), após relatarem contaminação de embriões de PIV por
amostras de sêmen contaminadas com Acinetobacter spp (5000 unidades formadoras de
colônia
–
UFC/mL),
Enterobacter
aerogenes
(5000
UFC/mL),
Escherichia
coli
(5000UFC/mL), Streptococcus spp (incontáveis/mL) e Alcaligenes faecalis (incontáveis/mL)
concluíram que a amostra de sêmen deve ser isenta de contaminantes, pois a condição in
vitro promove ambiente favorável para o seu crescimento.
A presença de bactérias no sêmen torna o procedimento da PIV inviável quando a
concentração de microrganismos é alta. Quando a concentração é baixa, sua presença não
é facilmente detectada, uma vez que pode não afetar a fecundação e o desenvolvimento
dos embriões, portanto, retarda a aplicação de medidas de controle e podendo facilitar a
disseminação do agente (BIELANSKY; JORDAN, 1996; STRINGFELLOW; GIVENS, 2000a).
A Escherichia coli (E. coli) produtora de toxina Shiga (STEC) é encontrada no
intestino de animais sadios, sendo o gado bovino principal reservatório, e também no meio
ambiente, onde os animais são mantidos (FENG, 2000). Possui resistência às condições
desfavoráveis do meio, podendo sobreviver por mais de dez meses no meio ambiente
(VARMA et al., 2003).
O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) tem discutido a
obrigatoriedade da realização de espermocultura de cada partida de sêmen industrializado,
em função das frequentes falhas na PIV, devido às contaminações dos oócitos com
bactérias ubiquitárias e oportunistas da microbiota prepucial (CARVALHO et al., 2007).
Dessa forma, torna-se relevante a avaliação da infectividade e o efeito em embriões
produzidos com sêmen contaminado com Escherichia coli produtora da toxina Shiga, para
poder subsidiar a proposta de que o sêmen deve ser isento de qualquer microrganismo,
patogênico ou não. Alguns desses microrganismos podem não acarretar doenças para
fêmea receptora ou causar disseminação para o rebanho, mas podem comprometer a
técnica de reprodução, causando também, prejuízos ao produtor.
Esse trabalho tem como objetivo avaliar por meio de microscopia óptica e eletrônica
de transmissão as alterações na morfologia e na viabilidade do desenvolvimento de
embriões bovinos, fecundados com sêmen exposto experimentalmente à Escherichia coli
produtora da Toxina Shiga stx2 (STEC).
2.
REVISÃO DA LITERATURA
2.1
Produção in vitro de embriões
Atualmente, o Brasil possui o maior rebanho bovino comercial do mundo, com cerca
de 200 milhões de animais (IBGE, 2008) e se apresenta em posição de destaque na
produção mundial de embriões, particularmente pela expansão do uso da produção in vitro
(PIV) em bovinos (GRAZIANO, 2005). Nos próximos anos, o cenário nacional da PIV de
embriões deve continuar a crescer (VARAGO; MENDONÇA; LAGARES, 2008).
A reprodução animal é programada para propiciar retorno econômico ao proprietário
rural e disseminar rapidamente animais de genética superior. Várias técnicas têm sido
implementadas e implantadas para aumentar a produtividade individual e, paralelamente, o
desempenho do conjunto de animais em fase de reprodução. Técnicas como Inseminação
Artificial (IA), Transferência de Embriões (TE) e a PIV são exemplos da tecnologia
desenvolvida para melhorar a produtividade dos rebanhos (CARDOSO; VASCONCELLOS ,
2004).
Em essência, o principal efeito das tecnologias da reprodução é aumentar a
eficiência reprodutiva. Quando a tecnologia da reprodução é utilizada nos rebanhos de elite
de uma raça, a taxa de melhoramento genético aumenta. Essa tem sido considerada a
principal vantagem genética oferecida pelas tecnologias reprodutivas (LIMA, 2006).
Durante os anos de 2004 à 2007, o Brasil foi responsável por mais de 85% (245.257)
da produção total mundial de embriões bovinos pela PIV. O avanço da PIV no país criou
uma polarização no mercado mundial de embriões bovinos, com a América do Sul (Brasil)
dominando a produção in vitro e com a América do Norte (EUA e Canadá) dominando a
produção in vivo com 52,2% (302.486). Em 2008, mesmo com a crise mundial, houve
crescimento, ainda que pequeno, tanto na TE quanto na PIV (VIANA, 2009).
A PIV tem sido extensivamente utilizada em pesquisa e também para fins comerciais,
uma vez que maximiza o potencial genético da fêmea (KRUIP; BEVERS; KEMP. 2000). É
uma biotécnica utilizada, alternativamente, para aumentar a velocidade de produção de
animais geneticamente superiores e impedir o descarte precoce de fêmeas geneticamente
privilegiadas, mas portadoras de alterações adquiridas as quais impossibilite que a
reprodução ocorra de forma natural ou até mesmo pela transferência de embriões
(GONÇALVES et al., 2002).
No início da década de 90, com a introdução da Ovum Pick-up, seguida pela
produção in vitro de embriões (OPU-PIV), a expectativa da produtividade das fêmeas
aumentou. A aplicação da OPU-PIV é de grande importância para a multiplicação rápida de
animais. Nibart et al. (1995) demonstraram que pode-se obter até 18 gestações em três
meses utilizando aspiração folicular, enquanto que com a TE clássica, no mesmo período,
seria possível obter apenas cinco gestações (RENESTO, 2004).
Entretanto, as taxas de blastocistos bovinos oriundos de oócitos maturados e
fecundados in vitro ainda são baixas, aproximandamente 30% dos oócitos selecionados
morfologicamente antes de serem submetidos a maturação in vitro (MIV) resultam em
embriões viáveis, havendo oscilações desses resultados, variando entre 5 e 60%
(GONÇALVES et al., 2002). Além dos baixos índices de blastocistos, a PIV de embriões
ainda apresenta outras limitações: qualidade biológica dos embriões, dificuldades na sua
criopreservação e de oócitos, menor viabilidade dos oócitos obtidos de bezerras em relação
aos de vacas e novilhas, e o custo, que é superior ao embrião produzido pela TE, na maioria
das raças (PEIXER et al., 1995). Por isso, após um período de intenso crescimento (20022006), a PIV no Brasil, apresentou uma tendência de estabilização (VIANA, 2009).
Em geral, os mamíferos apresentam altas taxas de falha na prenhez, em torno dos
15% (SCHIEVE et al., 2003), sendo que a maior perda ocorre no início do desenvolvimento.
As razões para tal fato não são totalmente esclarecidas. Apesar do sucesso do
desenvolvimento do embrião depender de contribuições genéticas e epigenéticas, tanto do
sexo masculino como do feminino, o sexo masculino é subestimado em afetar
negativamente a qualidade e o desenvolvimento do embrião (DURANTHON; RENARD,
2001).
2.2
Risco de transmissão de doenças pela produção in vitro
Do ponto de vista epidemiológico, as novas tecnologias representam um desafio para
o controle da transmissão de doenças, pois produzem novos ambientes e manipulação
excessiva do material, possibilitando uma maior chance de contaminação e disseminação
de patógenos (STRINGFELLOW; GIVENS; WALDROP, 2004).
Em 2005, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) sofreu um
corte de 63% na verba destinada para medidas de defesa sanitária (GRAZIANO, 2005).
Essas medidas visando a biossegurança são implantadas com a finalidade de se evitar que
o agente etiológico infecte o animal suscetível, impedindo a disseminação do agente ao
combater os vetores e eliminar as condições predisponentes (GONÇALVES, 1990).
As fontes mais comuns de contaminação na PIV são o ambiente onde o material é
manipulado, os gametas, tanto femininos quanto masculinos, o líquido folicular, o plasma
seminal, células somáticas e materiais de origem animal utilizados no preparo dos meios de
cultura (STRINGFELLOW; GIVENS, 2000b).
Na produção de embriões, os estudos da interação entre patógenos e
oócitos/embriões tornam-se essenciais, uma vez que essas diferenças estão ligadas à sua
capacidade de resistir à aderência e penetração por agentes infecciosos, podendo causar
alterações morfofisiológicas como bloqueio da clivagem, aumento do espaço periplásmico e
até ruptura da zona pelúcida (D’ANGELO et al., 2005; D’ANGELO et al., 2006a).
A utilização da microscopia eletrônica, assim como métodos de biologia molecular,
têm permitido elucidações sobre a interação entre patógenos e gametas/embriões, assim
como sua detecção nos produtos utilizados na PIV, gerando subsídios para avaliação e
melhora nos métodos de descontaminação, garantindo a biossegurança na produção
animal.
A contaminação da PIV em elevada escala é prejudicial, assim como a infecção por
agentes citopatogênicos, porém ambas são autolimitantes, uma vez que são facilmente
detectadas. Nesses casos, pode ocorrer falha na fecundação, ou degeneração embrionária,
o que anularia o risco de transmissão da doença, pois os embriões seriam descartados
(BIELANSKI, 1997). Por outro lado, a contaminação com baixa concentração de patógenos
ou com microrganismos não citopatogênicos é potencialmente mais preocupante, pois sua
presença não seria facilmente detectada, uma vez que pode não afetar a fecundação e
desenvolvimento dos embriões, e portanto, retardar a ação de controle de contaminação e
facilitando a disseminação do agente (BIELANSKI; JORDAN, 1996; STRINGFELLOW;
GIVENS, 2000a).
2.3
Risco de transmissão de doenças por sêmen contaminado
As possibilidades da contaminação do sêmen por agentes patogênicos e a sua
disseminação através do mesmo converteram-se em uma das principais preocupações para
criadores e autoridades sanitárias dos países onde se empregam tecnologias da reprodução
(AFSHAR; EAGLESOME, 1990). A tudo isso se deve, também, acrescentar o risco do uso
do sêmen infectado nos processos de transferência de embriões (BIELANSKI; DUBUC,
1994). A presença de microrganismos no sêmen acabam implicando não só na infecção
exclusiva da fêmea receptora ou do coletivo da exploração pecuária, mas também na
possível introdução de doenças exóticas no país importador (SILVA, 2003).
Microrganismos podem estar presentes no sêmen de um animal infectado, ou podem
contaminar o sêmen durante a colheita, processamento ou armazenamento. No primeiro
caso, os espermatozóides podem ser infectados por um agente patogênico nos testículos,
ou durante seu trânsito pelo epidídimo, canal deferente e uretra. Além disso, alguns
microrganismos também poderiam contaminar o espermatozóide, quando associados a
células do sangue, quando há inflamação ou trauma das glândulas acessórias (próstata e
vesícula seminal), ou também quando estão em alta concentração na urina ou na cavidade
prepucial. Microrganismos ambientais também podem contribuir para a contaminação do
sêmen (SCHIEWE, 1998). Frequentemente, sêmen ejaculado não está livre da microbiota
bacteriana. As bactérias do prepúcio de um animal saudável incluem numerosas espécies
que podem contaminar o sêmen, algumas dessas bactérias podem se comportar como
infecções oportunistas e ser um risco potencial (BIELANSKI, 2007).
Na prática, cada ejaculado é diluído durante o processamento para a produção de
várias doses para inseminação. Dependendo do grau de diluição do sêmen, este
procedimento diminui a concentração de contaminantes, em certa medida, podendo
minimizar o risco de transmissão da doença. O sêmen contaminado tem um grande
potencial para a re-introdução de uma doença. Esse potencial ainda é maior porque a
maioria dos microrganismos sobrevive à baixas temperaturas e ao congelamento
(ELAZHARY et al., 1980).
Para admissão dos reprodutores nas centrais de inseminação artificial para colheita
de sêmen, é realizada quarentena, durante a qual são realizados exames clínicos e provas
diagnósticas para as principais doenças infecciosas que afetam o desempenho reprodutivo brucelose, campilobacteriose, tricomonose bovina, tuberculose, leptospirose, herpesvírus
bovino 1 (BoHV-1), vírus da diarréia viral bovina (BVDV), vírus da leucose enzoótica bovina
(BLEV) e febre aftosa (FMDV). Uma vez admitido, o touro é monitorado (sorodiagnóstico)
semestralmente para BoHV-1, BVDV, BLEV e FMDV. Realiza-se também o controle de
todas as partidas de sêmen para o BoHV-1 (OKUDA, et al., 2003). Segundo o Código
Sanitário para Animais Terrestres (OIE, 2008), nas centrais os animais devem ser mantidos
sempre limpos e escovados, principalmente antes da coleta. No caso de sujeira evidente, o
orifício prepucial e as regiões circunvizinhas devem ser cuidadosamente limpos com sabão
ou detergente, seguido de enxágue e secagem. Também é recomendado, para cada mL de
sêmen congelado, uma mistura de antibióticos com atividade bactericida no mínimo
equivalente ás seguintes misturas: gentamicina (250ug), tilosina (50ug), lincomicinaespectinomicina (150/300ug) ou penicilina (500 IU), estreptomicina (500ug), lincomicinaespectinomicina (150/300ug).
Uma série de patógenos virais e bacterianos têm sido identificados em associação
com sêmen (HARE, 1985). Alguns desses podem aderir à superfície dos espermatozóides,
outros podem se associar com o plasma seminal ou com células do sangue presentes no
sêmen. Provavelmente, apenas alguns, como o vírus da imunodeficiência humana (HIV),
vírus da imunodeficiência felina, vírus da língua azul (BTV), BVDV e BoHV-I, têm a
capacidade de penetrar no acrossoma do espermatozóide. Brackett et al. (1971) foram os
primeiros a demonstrar que as células do sêmen poderiam servir de portadores de genes
virais e introduzi-los no oócito durante o processo de fecundação. A presença de bactérias
geralmente leva a taxas de fecundações reduzidas, seguidas por degeneração e morte dos
embriões (LE et al., 1997) ou podem afetar o desenvolvimento embrionário, através da
produção de toxinas ou por competição pelo mesmo substrato, como os meios de cultura
(BIELANSKI, 1997).
Ao longo dos anos, diversas técnicas de lavagem do sêmen, como o gradiente
descontínuo de Percoll® e Swin-up, foram desenvolvidas e, como ocorrem com os embriões,
essas lavagens se tornaram o procedimento mais importante para o controle e eliminação
de microrganismos. O principal objetivo da lavagem é separar a fração de espermatozóides
altamente móveis a partir do plasma seminal para otimizar a probabilidade de fecundação.
Observou-se que esses procedimentos de lavagem, além de separar os espermatozóides
imóveis e detritos, também reduziam contaminantes microbianos associados ao sêmen.
Quando a lavagem é realizada com antibióticos, ela pode reduzir ainda mais a carga de
microrganismos bacterianos ou até eliminá-los (COTTELL et al., 1997).
Alguns estudos mostraram que a penicilina, estreptomicina e polimixina foram
eficazes para controlar o crescimento de bactérias no sêmen diluído, sem causar nenhum
efeito adverso sobre a viabilidade do esperma. Numerosos antibióticos foram testados para
determinar se eram espermicidas quando adicionados aos diluidores de sêmen de touro.
Epicillina, flurofamide, aureomicina e terramicina e, em particular os agentes antifúngicos
anfotericina
espermicidas
B,
nistatina,
micostatina,
(EAGLESOME;
GARCIA;
rosaramicina
STEWART,
e
clindamicina
1992).
Alguns
mostraram-se
protocolos
são
recomendados pela Semen Certified Services (CSS) para o processamento comercial de
sêmen na América do Norte. Em contraste, com base em novos estudos, não houve
qualquer benefício antimicrobiano de adicionar a combinação de gentamicina, tilosinalincomicina-espectinomicina ao sêmen (GUERIN; THIBIER, 1993). Stringfellow et al. (1997)
descreveram um caso de utilização acidental do sêmen criopreservado contaminado com
Pseudomonas maltophilia por fecundação in vitro (FIV) de oócitos bovinos. Apesar do
tratamento do sêmen por gradiente de Percoll® e da adição de antibióticos nos meios
utilizados, a bactéria persistiu no sistema de FIV e causou a degeneração dos embriões.
Foram relatados outros casos onde a lavagem do sêmen por swim-up não conseguiu
eliminar agentes bacterianos, como o Mycoplasma pulmonis (FRASER; TAYLORROBINSON, 1977), Mycoplasma bovis e Mycoplasma bovigenitalium (LO; BLANCHARD,
1996).
A utilização de antibióticos nos meios pode aumentar a probabilidade de gerar cepas
resistentes, sendo cada vez mais comum em sistemas de PIV com sêmen de touros
contaminados (LIVERSEDGE et al., 1996).
Diversos procedimentos antimicrobianos estão atualmente disponíveis para a
desinfecção de sêmen e embriões, e outros ainda estão em desenvolvimento. Infelizmente,
nenhum deles cumpre a exigência de um descontaminante universal. Há necessidade de
métodos simples, novos e mais eficientes de controle de contaminantes, tanto bacterianos,
como virais, particularmente em sêmen para a PIV (BIELANSKI; SAPP; LUTZEWALLACE,
1998).
2.4
Contaminação do sêmen bovino pela Escherichia coli e suas características
O couro, o trato gastrintestinal e o trato respiratório são os reservatórios naturais dos
microrganismos nos bovinos (GRAU, 1979). Em razão da grande aproximação durante o
regime intensivo, os animais estão mais susceptíveis a acumular grandes quantidades de
material fecal e, consequentemente, maior número de organismos fecais, em comparação
com animais submetidos ao regime extensivo (VAN DONKERSGOED et al.,1997).
Entretanto, bovinos em pastagens podem estar em contato com ambientes contendo fezes,
efluentes de esgoto, alimentos e água contaminados (GENIGEORGIS, 1987), resíduos de
animais selvagens e domésticos e, além disso, pessoas podem carrear excretas de animais
de um lugar para outro, por meio de botas e roupas (LINTON; HINTON, 1987).
A cavidade prepucial dos touros parece ser o principal ponto para a contaminação do
sêmen por microrganismos, quando a colheita de sêmen é efetuada com vagina artificial.
Entretanto, foi demonstrado que em alguns animais a uretra também é altamente
colonizada, sugerindo que os procedimentos instituídos para reduzir o número de
organismos no prepúcio, podem não ser totalmente efetivos para eliminar a contaminação
do sêmen (DOIG, 1981).
A Escherichia coli (E. coli) é um bacilo gram-negativo, anaeróbio facultativo e
habitante normal do trato-intestinal em animais de sangue quente, responsável por
metabolizar uma considerável quantidade de vitaminas e exercer o importante papel de
reprimir a multiplicação de bactérias prejudiciais à saúde. Contudo, a E. coli compreende, na
verdade, um grande grupo de microrganismos, que se subdividem em mais de 160 sorotipos
diferentes. Alguns desses grupos, chamados de E. coli enteropatogênicas são capazes de
provocar infecções intestinais, algumas de certa gravidade (HOMERO, 2006).
A E. coli compreende grande número de grupos e tipos sorológicos, verificados por
meio de anti soros preparados contra as três variedades de antígenos que ocorrem na
espécie, ou seja, os antígenos somáticos (O), capsulares (K) e flagelares (H). São
conhecidos atualmente 174 antígenos O, 100 antígenos K e 157 antígenos H. Nem todas as
amostras de E. coli provenientes do intestino, ou de qualquer outro local do organismo,
apresentam os três tipos de antígenos ao mesmo tempo (TRABULSI et al., 2002). A
combinação específica entre antígenos O e H é que define o sorotipo (NATARO; KAPER,
1998).
Vários autores têm demonstrado que enterobactérias, como a E. coli, afetam de
forma significativa a qualidade espermática, principalmente no que se refere à motilidade
(aderência e aglutinação) (DIEMER; WEIDNER; MICHELMANN, 1996). Isso pode ocorrer
pela ação de toxinas (SONE; OHMURA; BAMBA, 1982), alteração do pH, competição pelo
mesmo substrato (RIDEOUT; BURNS; SIMPSON, 1982) ou pela ação direta, levando a
defeitos estruturais na peça intermediária, membrana plasmática e acrossoma da célula
espermática (DIEMER et al., 1996). Segundo Woelders (1991), o acrossoma é parte
fundamental nos processos de fecundação, e qualquer alteração presente pode inibir a
capacidade fecundante do espermatozóide. Danos estruturais de espermatozóides
induzidos por E. coli foram descobertos pelo uso de diferentes técnicas de microscopia
eletrônica (DIEMER et al., 2000).
É cada vez mais frequente a presença de amostras da bactéria E. coli
patogênica nos rebanhos bovinos brasileiros. A água que os animais bebem e o solo dessas
regiões apresentam alta incidência deste patógeno emergente, que vem adquirindo
resistência através de sucessivas mutações genéticas (HOMERO, 2006).
2.5
Aspectos Gerais da Escherichia coli produtora da toxina shiga (STEC)
Escherichia coli O157:H7 é um sorotipo pertencente ao grupo EHEC (E. coli enterohemorrágicas). Todas as EHEC produzem fatores citotóxicos em células Vero (rim de
macaco verde africano), os quais foram descritos inicialmente como Verotoxinas e,
atualmente, Shigatoxinas, em função da similaridade com a toxina produzida pela Shigella
dysenteriae tipo 1 (DOYLE, 1995). Por esse motivo, foi denominada E. coli produtora de
toxina Shiga (STEC). Emergente nas últimas décadas, esse microrganismo é um importante
patógeno causador de doença de transmissão alimentar (DTA) e um amplo espectro de
doenças no ser humano, variando de diarréia branda a complicações graves como a
síndrome hemolítica urêmica (SHU) (NATARO; KAPER, 1998).
Escherichia coli produtora de toxina Shiga (STEC) é reconhecida como um
importante grupo de patógenos emergentes que se tornaram um grande desafio à saúde
pública, pois possuem alto grau de infectividade para os seres humanos. Mesmo em baixo
número no alimento ingerido (10 UFC) são capazes de provocar infecção (WHO, 1998).
As STEC utilizam diferentes estratégias para provocar infecção e podem apresentar
uma variedade de fatores de virulência, consequência da versatilidade de seu genoma que é
conferida principalmente por duas configurações genéticas: plasmídeos de virulência e ilhas
de patogenicidade localizados no cromossomo, além da presença de bacteriófagos. O
principal fator de virulência nas STEC, a toxina Shiga, é codificada por um bacteriófago que
se insere no cromossomo (PATON; PATON, 1998). O sorotipo O157:H7 é o mais
frequentemente envolvido em surtos, entretanto, mais de 400 sorotipos de STEC,
denominados de STEC não O157, foram descritos em humanos (SHEN et al., 2005). No
Brasil, a pesquisa do sorotipo O157:H7 nos Laboratórios Nacionais de Saúde Pública foi
implantada em 2001 e a pesquisa de STEC não O157 ainda está restrito a poucos
laboratórios (FARAH, 2005).
As STEC se diferenciam de outras E. coli pela produção de toxinas shiga. Existem
dois tipos principais de toxina shiga produzidos por STEC denominados stx1 e stx2. Essas
toxinas são relacionadas geneticamente e apresentam atividades biológicas similares, mas
são distintas antigenicamente. (STROCKBINE et al., 1986). A presença desses genes em
bacteriófagos propicia não somente a capacidade de disseminação entre diferentes cepas,
mas também possibilita a presença das duas toxinas em uma mesma bactéria (FÜRST et
al., 2000). Há evidências de que determinados antibióticos estimulam o aumento da
produção de toxinas tornando-as mais disponíveis para absorção, o que pode levar a um
agravamento do quadro clínico (TARR et al., 2005).
A produção de toxina leva a inibição da síntese de proteínas, causando a morte das
células endoteliais renais, células epiteliais intestinais, células Vero ou HeLa (células do
papiloma vírus humano), e outras células que possuam o receptor específico (Gb3)
(MAINIL; DAUBE, 2005).
Embora dados substanciais tenham sido acumulados sobre a patogenicidade das
STEC nos últimos anos, poucas informações estão disponíveis sobre os mecanismos de
adesão utilizados por esses organismos. A compreensão deste mecanismo de interação
patógeno-hospedeiro pode ajudar a estabelecer os efeitos que a adesão desencadeia sobre
as células (KAPER; NATARO; MOBLEY, 2004).
As STEC exploram componentes da membrana e do citoesqueleto da célula
hospedeira para colonizar a mucosa intestinal. O gene eae codifica uma proteína externa de
membrana, denominada Intimina. Esta proteína é um fator de virulência mediador no ataque
ao enterócito, produzindo lesão intestinal do tipo attaching and effacing (A/E), caracterizada
pela destruição localizada das microvilosidades do intestino, forte adesão da bactéria e
reorganização do citoesqueleto da célula hospedeira (SHAW et al., 2004).
As linhagens O157: H7 e outras não-O157 são encontradas no intestino de animais
sadios, sendo o principal reservatório o gado bovino, e também no meio ambiente onde os
animais são mantidos (TÓTH et al., 2009). Nos bovinos, aparentemente os receptores
específicos (Gb3) estão presentes apenas no cérebro e no rim e a falta desses receptores
no intestino explicaria a ausência da doença intestinal nesses animais (PRUIMBOOMBREES et al., 2000).
Linhagens distintas dos bovinos, composição da dieta, tamanho do rebanho, idade
dos animais, condições de stress, podem ser alguns dos fatores que contribuem para a
obtenção de prevalências variáveis de STEC nestes reservatórios (COBBOLD et al., 2004).
A capacidade das STEC de sobreviver por mais de dez meses no meio ambiente
constitui outro risco de contaminação (VARMA et al., 2003). Durante pelo menos seis meses
pode ser encontrada em sedimentos em água parada, podendo ser um importante nicho
ambiental (TÓTH et al., 2009). A manipulação desses patógenos pelos profissionais nos
laboratórios também tem sido relatada como uma outra via de contaminação (SPINA et al.,
2005).
No mundo inteiro foram relatadas taxas variáveis de prevalência de cepas de STEC
em bovinos (ARMSTRONG; HOLLINGSWORTH; MORRIS JR, 1995).
No Brasil, os estudos sobre STEC ainda são incipientes (IRINO et al., 2005). Cepas
produtoras de toxina shiga foram isoladas de rebanho bovino aparentemente saudável
(SILVA, 2002), com alta prevalência e aparentemente há predomínio de STEC não O157
(PIGATTO, 2003).
Foram encontradas frequências de STEC de 37% no Paraná e de 71% no Rio de
Janeiro. As do Rio de Janeiro foram isoladas de amostras de fezes de bovinos sadios, onde
a prevalência em bovinos leiteiros foi maior que a de bovinos de corte, 82% e 53%
respectivamente. Entre as estirpes positivas prevaleceu as sequências stx1/stx2 em bovinos
leiteiros (69%) e a sequência stx1 foi a mais frequente em bovinos de corte (TRISTÃO et al.,
2007). Cerqueira et al. (1999) identificaram estirpes de STEC em 65% dos animais
analisados no Estado do Rio de Janeiro e 28% no Estado do Rio Grande do Sul. Também já
foram encontradas no Estado de São Paulo (IRINO et al., 2005) e no Sul do Brasil , onde foi
relatada frequência de 49% no Rio Grande do Sul e de 59% no Paraná (FARAH, 2007).
Foi comprovada a presença de STEC em amostras de fezes de bovinos de leite, em
amostras de água ambiental, de água de consumo humano e em amostras de leite cru, em
propriedades rurais da bacia leiteira de Pelotas-RS. A prevalência foi de 49% dos animais
testados, pertencentes a 95% das propriedades estudadas. Características da propriedade,
tais como tamanho (pequenas propriedades), número de animais (pequeno número de
animais) e confinamento de vacas em cocheiras à noite, foram relacionadas à maior
prevalência de animais infectados com STEC (SANDRINI et al., 2007).
2.6
Hipótese
O presente estudo avaliou a hipótese de que a presença da bactéria Escherichia coli
produtora da toxina stx2 no sêmen interfere na fecundação, possivelmente por sua interação
com o espermatozóide e, consequentemente, o mesmo atuar como vetor para a
transmissão do patógeno em todas as etapas da FIV, inviabilizando ou diminuindo as taxas
de clivagem dos embriões e do desenvolvimento embrionário.
3.
MATERIAL E MÉTODOS
O líquido folicular foi analisado quanto a presença de E. coli e somente o que estava
sem contaminação foi utilizado. As palhetas de sêmen utilizadas continham a partida de um
único touro e apresentavam, para cada 1 mL de diluidor, 0,32 mg de penicilina, 0,66 mg de
estreptomicina e 1 mg de amicacina. Foram cedidas pela Central Bela Vista/Genética
Bovina, também testados e livre de contaminação por E. coli. As amostras foram cultivadas
em meio ágar sangue de carneiro a 5%, por 48 horas à temperatura de 37ºC, em estufa. Os
testes foram realizados pelo Laboratório de Bacteriologia Geral, do Centro de Sanidade
Animal do Instituto Biológico de São Paulo.
3.1
Bactéria e condições de crescimento
Foi utilizada, para contaminação do sêmen, a bactéria Escherichia coli produtora da
toxina shiga (STEC), isolada de bovinos em abatedouros do Estado de São Paulo (SP),
através de swab retal e da carcaça, logo após o abate. Foi identificada por meio da reação
em cadeia pela polimerase (PCR), apresentando o gene responsável pela produção da
toxina stx2 (MIYASHIRO et al., 2009).
A bactéria foi cultivada em meio ágar sangue de carneiro a 5% em estufa à
temperatura de 37ºC por 24 horas, sua suspensão foi preparada no momento da inoculação,
em solução salina estéril, na concentração de 200 unidades formadoras de colônia (UFC).
Foram feitas diluições na base 10, na escala de MaCfarland. A amostra foi gentilmente
cedida pelo Laboratório de Bacteriologia Geral, do Centro de Sanidade Animal do Instituto
Biológico de São Paulo.
3.2
Colheita de ovários
Os ovários foram colhidos no abatedouro Mantiqueira, localizado em São José dos
Campos, na região do Vale do Paraíba. Foram removidos, aproximadamente, 20 minutos
após a morte do animal, no momento da evisceração e depositados em frascos isotérmicos
contendo solução salina fosfatada (PBS) com 1% de antibiótico - penicilina/estreptomicina
(Vitrocell/Embriolife®) previamente aquecida (38°C). Os ovários foram recebidos no
laboratório, após o período de 3 horas e foram lavados (2x) em PBS e mantidos nessa
mesma solução em frascos a temperatura de 38ºC, até a aspiração folicular.
O procedimento acima foi aprovado pela comissão de ética na experimentação
animal – CETEA-IB, protocolo 40/08 (Anexo 1).
3.3
Aspiração folicular
Os folículos foram aspirados com seringa de 10 mL e agulha calibre 18G, contendo
0,5mL de solução de lavagem (In Vitro®). O material aspirado foi colocado em um tubo para
centrifuga de 15mL estéril e mantido na estufa à temperatura de 38ºC, 5% de CO2 e 90% de
umidade por 20 minutos, para decantação.
3.4
Seleção dos oócitos
Após a decantação, o pellet formado foi recolhido e colocado em uma placa de Petri
com solução de lavagem (In Vitro®). Os oócitos foram selecionados com o auxílio de um
estereomicroscópio (40X) (OLEMAN®) em fluxo lâminar. A placa de Petri permaneceu
apoiada em uma placa aquecedora à 38°C, para evitar grandes variações de temperatura.
Foram selecionados apenas oócitos com zona pelúcida intacta, ooplasma uniforme e
envolto por, no mínimo, duas camadas de células do cumulus. Os oócitos selecionados
foram maturados em gotas de meio de maturação (MIV – In Vitro®).
3.5
Maturação e manutenção dos oócitos in vitro
A placa de maturação foi preparada antes da aspiração folicular e foi mantida na
estufa à temperatura de 38ºC, 5% de CO2 e 90% de umidade. Em uma Na placa de Petri
com 35mm de diâmetro, foram feitas quatro gotas de 100µL de MIV, cobertas com óleo
mineral filtrado. Após a lavagem e seleção, os oócitos foram transferidos para as gotas e
permaneceram no meio por 20 horas, na estufa à temperatura de 38ºC, 5% de CO2 e 90%
de umidade. Em cada gota foram colocados no máximo 20 oócitos.
3.6
Preparo da placa de fecundação
A placa de fecundação foi preparada após o período de maturação oocitária, antes
do preparo do sêmen. Foram feitas quatro gotas com 100µL de meio FIV (meio de
fecundação) acrescido de 4,4µL de heparina e 1,1µL de P.H.E. (In Vitro®), cobertas por óleo
mineral filtrado em uma placa de Petri com 35mm de diâmetro. A placa foi mantida na estufa
à temperatura de 38ºC, 5% de CO2 e 90% de umidade. Os oócitos maturados foram
transferidos para essa nova placa. Em cada ensaio eram preparadas pelo menos duas
placas, uma para receber o sêmen controle e a outra o contaminado.
3.7
Contaminação do sêmen in vitro
Após o período de maturação oocitária, foram descongeladas duas palhetas de
sêmen (0,5 mL) em banho-maria à 37ºC por 30 segundos. Cada palheta de sêmen foi
transferida para um microtubo, um com o sêmen controle e outro com o contaminado, que
foi exposto a 200 UFC de E. coli.
3.8
Preparo do sêmen
O sêmen de cada microtubo foi processado pela técnica de gradiente descontínuo de
®
Percoll . Foram preparados dois tubos para centrífuga de 15 mL estéril, um para receber o
sêmen controle e outro o sêmen contaminado, com camadas de 0,5mL de Percoll® 90% e
0,5mL de Percoll® 45% (In Vitro®). O sêmen de cada microtubo foi depositado sobre as
camadas de Percoll® e os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 1000 rotações por
minuto (RPM). Após a centrifugação, o pellet formado em cada tubo foi transferido para dois
tubos de centrifuga - um controle e um contaminado, com 1mL de meio FIV, acrescido de
heparina e P.H.E. Os tubos foram centrifugados novamente por 10 minutos a 1000 RPM. Do
novo pellet formado, 30µL de cada tudo foi transferido para microtubos (A) com 30µL meio
FIV, acrescido de heparina e P.H.E. Desses 60µL, 5µL foi transferido para um microtubo (B)
com 50µl de meio FIV para verificar a motilidade dos espermatozóides e outros 5µL para um
microtubo (C) com 250µL de água destilada para verificar a concentração, utilizando a
câmara de Neubauer. Os microtubos A permaneceram na estufa por 30 minutos à
temperatura de 38ºC, 5% de CO2 e 90% de umidade. A concentração espermática foi
ajustada, em aproximadamente 100 mil espermatozóides para cada oócito, antes de ser
colocado na placa de fecundação.
Concentração x Motilidade x Volume do microtubo A = Resultado – Volume do microtubo A
1000
O resultado final é a quantidade de meio que foi adicionado no microtubo A para
diluição da concentração.
Todo cuidado foi tomado para que não ocorresse contaminação do material controle
pelo contaminado.
3.9
Fecundação
Foram transferidos 5µL do conteúdo de cada microtubo A para cada gota das
respectivas placas de fecundação, já com os oócitos.
3.10
Avaliação da morfologia e viabilidade dos embriões bovinos após fecundação
com sêmen contaminado por Escherichia coli produtora da toxina shiga stx2
(STEC)
Após 18 horas da fecundação, os embriões dos grupos controle e contaminado
foram observados por microscopia óptica, com objetivo de avaliar a interação e possíveis
alterações morfológicas no embrião. Antes da retirada das células do cumulus, foi feita uma
observação em um microscópio Olimpus (Tokyo, Japan) com aumento de 100X para avaliar
as possíveis diferenças. Depois, foram preparadas mais duas placas (35mm de diâmetro)
com 4 gotas de 100µL meio SOF (In Vitro®), cobertas por óleo mineral filtrado, para
manutenção dos oócitos após a retirada do cumulus.
A placa foi mantida na estufa à
temperatura de 38ºC, 5% de CO2 e 90% de umidade até o 7º dia de desenvolvimento
(houve troca de meio de cultura no 5º dia). Foram feitas observações para análise
morfológica e da viabilidade durante o desenvolvimento. O denudamento dos embriões foi
feito com o auxilio de vórtex.
A análise da viabilidade foi realizada por meio da avaliação da taxa de clivagem e do
desenvolvimento embrionário até o 7º dia de desenvolvimento, na presença ou ausência do
patógeno. Para essa análise foi utilizado o microscópio Olimpus (Tokyo, Japan - 100X).
3.11
Análise estatística
Para a análise estatística da taxa de clivagem e desenvolvimento dos embriões foi
utilizado o teste do χ2 (qui-quadrado) com correção de Yates, sendo o nível de significância
de 5% (p<0,05).
3.12
Avaliação da morfologia pela microscopia óptica de corte semi fino e eletrônica
de transmissão
No quarto dia de desenvolvimento embrionário, foram separados alguns embriões de
estádios diferentes, de ambos os grupos, para observação da morfologia por corte semi-fino
e microscopia eletrônica.
Os embriões foram lavados em solução PBS e colocados em um microtubo com
100µl de glutaraldeído 2,5%. Os microtubos permaneceram durante 15 minutos a
temperatura de 4ºC e depois os embriões foram novamente lavados em PBS. Cada embrião
foi embebido individualmente em agarose 2%, cortado em bloco de aproximadamente
2mm³, e preparados para serem cortados com o seguinte protocolo:
Três lavagens de 15 minutos em tampão PBS seguida por pós-fixação em tetróxido
de ósmio 1% em PBS durante 1 hora e três lavagens de 15 minutos em água destilada.
Imersão de 1 hora em uranila a 0,5 em água destilada e novamente três lavagens de 15
minutos em água. Em seguida, para desidratação, 15 minutos de lavagem em acetona 50%,
depois 15 minutos em acetona 70%, mais 15 minutos em acetona 90% e finalmente dois
banhos de 10 minutos seguidos por um último de 15 minutos em acetona 100%. Os
embriões foram colocados na resina Spurr e após 72 horas foram cortados com
ultramicrótomo em corte semi-fino (2µm). Essas secções semi-finas foram coradas com azul
de toluidina a 2% em solução de borato de sódio 1% em água destilada e analisadas quanto
à morfologia no microscópio ótico invertido com aumento de 1000x.
Para análise ultra-estrutural os blocos foram seccionados e os cortes ultra-finos
recolhidos em telas de níquel. As telas foram lavadas em BSA com tween 20 em PBS, pH
7,0, incubadas em cloreto de amônio 5mM (bloqueando e evitando a ligação específica de
anticorpos em grupamento aldeídico livre presente nas células fixadas) e lavadas em BSA
com tween 20 em PBS, pH 7,0. A seguir as telas foram incubadas com anticorpo primário
1:80 em PBS/BSA 1 % por 4 horas, lavadas em BSA com tween 20 em PBS, pH 7,0,
incubadas com anticorpo secundário (proteína A-ouro) 1:10 em PBS/BSA 1 %, lavadas em
PBS, pH 7,0 e fixadas com glutaraldeído 2,5% em água. Após lavagem em água as telas
foram contrastadas com acetato de uranila e citrato de chumbo. No início e final do
processamento as telas foram tratadas com metaperiodato de sódio (solução saturada)
(KNUTTON, 1995; PADRÓN, 1998). As telas foram examinadas em microscópio eletrônico
de transmissão Philips EM208.
4.
RESULTADOS
Para a análise morfológica e da viabilidade dos embriões, foram identificados e
selecionados, em estereomicroscópio, 833 oócitos com zona pelúcida intacta, ooplasma
uniforme e envolto por, no mínimo, duas camadas de células do cumulus, sendo 418 oócitos
fecundados com sêmen controle e 415 oócitos fertilizados com sêmen exposto a E. coli
produtora da toxina stx2.
4.1
Avaliação morfológica do desenvolvimento de embriões de PIV com sêmen
exposto experimentalmente pela STEC por microscopia óptica
Na avaliação morfológica, após o período de fecundação (18 horas), não foram
observadas diferenças significantes entre os embriões do grupo controle e contaminado
antes da retirada das células cumulus.
Nos dois grupos foram observados possíveis zigotos com uma camada de células do
cumulus compacta, sendo difícil a visualização do ooplasma e da zona pelúcida, como é
possível ver nas figuras 1 e 2.
Figura 1: Embriões do grupo controle após 18 horas da
Figura 2: Embriões do grupo contaminado após 18 horas da
fecundação, antes da retirada da camada de células do
fecundação, antes da retirada da camada de células do
cumulus (aumento de 100x).
cumulus (aumento de 100x).
Com o denudamento dos embriões, pode ser observada, no grupo contaminado
(figura 4), retração do ooplasma de alguns embriões.
Figura 3: Embriões denudados do grupo controle após 18
Figura 4: Embriões denudados do grupo contaminado após
horas da fecundação (aumento de 100x).
18 horas da fecundação (aumento de 100x).
Após o 4º e 7º dia de desenvolvimento, as alterações morfológicas foram mais
visíveis no grupo contaminado, que apresentou retração citoplasmática, falhas na divisão,
assimetria de blastômeros, ooplasma granuloso, com coloração castanho escura, formação
de vacúolos, degeneração e rompimento da zona pelúcida (Figuras 8 à 13).
Figura 5: Mórulas do grupo controle após o 7º dia de
Figura 6: Embrião do grupo controle após o 7º dia de
desenvolvimento (aumento de 100x).
desenvolvimento (aumento de 100x).
Figura 7: Mórula do grupo controle após o 7º dia de desenvolvimento (aumento de 100x).
Figura 8: Embriões do grupo contaminado, com assimetria
Figura 9: Embriões do grupo contaminado, com assimetria
de blastômeros e falha na divisão, após o 7º dia de
de blastômeros, falha na divisão, ooplasma granuloso e
desenvolvimento (aumento de 100x).
formação de vacúolos, após o 7º dia de desenvolvimento
(aumento de 100x).
Figura
10:
Embriões
do
grupo
contaminado,
com
Figura
11:
Embriões
do
grupo
contaminado,
com
assimetria de blastômeros, falha na divisão, ooplasma
degeneração, rompimento de zona pelúcida e falha na
granuloso, formação de vacúolos, retração citoplasmática,
divisão, após o 7º dia de desenvolvimento (aumento de
degeneração e rompimento da zona pelúcida, após o 7º
100x).
dia de desenvolvimento (aumento de 100x).
Figura 12: Embrião do grupo contaminado após o 7º dia de
Figura 13: Embriões do grupo contaminado após o 7º dia de
desenvolvimento (aumento de 100x).
desenvolvimento (aumento de 100x).
4.2
Avaliação
da
viabilidade
de
embriões
de
PIV
com
sêmen
exposto
experimentalmente pela STEC
A avaliação da viabilidade foi verificada por alterações na taxa de clivagem e no
desenvolvimento dos embriões. Após o período de fecundação a taxa de clivagem dos
embriões do grupo controle foi de 70,3% (294/418) e a encontrada para o grupo
contaminado foi de 52,8% (219/415).
De acordo com o teste do χ2, verificou-se o valor p<0,05 (p = 0,0001), havendo
diferença significativa na taxa de clivagem.
Após o 7º dia de desenvolvimento embrionário foi observado 44,7% (187/418) de
mórulas no grupo controle, e no grupo contaminado apenas 22,4% (93/415). De acordo com
o teste do χ2, verificou-se o valor p<0,05 (p = 0,0001),
significativa entre os dois grupos.
também havendo diferença
Tabela 1: Desenvolvimento embrionário dos embriões do grupo controle e contaminado. São
Paulo, SP, 2009.
Taxa de clivagem
Controle
Contaminado
Valor de P
70,3% (294/418)
52,8% (219/415)
0,0001
44,7% (187/418)
22,4% (93/415)
0,0001
dos embriões
Mórulas
4.3
Avaliação morfológica pela microscopia óptica de corte semi-fino
Na avaliação morfológica, após o 4º dia de desenvolvimento, através da microscopia
óptica de corte semi-fino, foram observadas células granulosas e vacuolizadas,
apresentando estruturas semelhantes à E. coli, representadas pela seta nas figuras 14 e 15.
A
Figura 14: Embrião do grupo contaminado após o 4º dia de
desenvolvimento em microscopia óptica de corte semi-fino (aumento de
100x). A: zona pelúcida. Estruturas semelhantes a E. coli estão
representadas pela seta.
A
Figura 15: Outro corte do mesmo embrião do grupo contaminado após
o 4º dia de desenvolvimento em microscopia óptica de corte semi-fino
(aumento de 100x). A: zona pelúcida. Estruturas semelhantes a E. coli
estão representadas pela seta.
4.4
Avaliação morfológica pela microscopia eletrônica de transmissão
A avaliação ultra-estrutural pelo microscópio eletrônico de transmissão também
mostrou que o grupo contaminado com E. coli apresentava alta formação de vacúolos e
granulação no ooplasma, além de confirmar que estruturas semelhantes a E. coli estavam
realmente presentes do embrião.
A
A
B
C
5200 NM
Figura 16: Embrião do grupo contaminado após o 4º dia de desenvolvimento em microscopia eletrônica de
transmissão (aumento de 3840x). A: zona pelúcida, B: ooplasma, C: vacúolos do ooplasma. Dentro do
círculo se encontram estruturas semelhantes a bactéria.
A
C
2000 NM
Figura 17: Embrião do grupo contaminado após o 4º dia de desenvolvimento em microscopia eletrônica de
transmissão (aumento de 10000x). A: zona pelúcida, C: vacúolos do ooplasma. Dentro do círculo se
encontram estruturas semelhantes a bactéria.
A
B
600 NM
Figura 18: Embrião do grupo contaminado após o 4º dia de desenvolvimento em microscopia eletrônica de
transmissão (aumento de 10000x). A: zona pelúcida. As setas indicam estruturas semelhantes a bactéria.
5.
DISCUSSÃO
A cada nova tecnologia que surge na área de reprodução animal ocorre uma
mudança ambiental capaz de influenciar o potencial epidemiológico de sua produção e,
portanto, a qualidade da manipulação dos materiais é que determinará a presença de
animais doentes ou saudáveis na nova população gerada (STRINGFELLOW; GIVENS;
WALDROP, 2004). O resultado final do processo dependerá do estabelecimento de
controles adequados, assim como da qualidade técnica e ética dos profissionais envolvidos.
É de especial importância que a quantidade de patógenos associados com um único
embrião possa ser determinada, para que seja conhecido o risco de transmissão de uma
doença, pois essa constitui a dose infectante em caso de transferência desse embrião
(GALUPPO, 2005).
Qualquer processo de produção, por mais simples que seja, segue uma conduta
determinada. Os procedimentos para a PIV de embriões já estão relativamente definidos. Os
meios de cultivo e os métodos empregados são bastante similares, com algumas variáveis
entre os laboratórios. Entretanto, os percentuais de produção de embriões, a qualidade dos
mesmos e a capacidade de produzir gestações variam entre equipes e até mesmo entre
indivíduos dentro de cada laboratório (VARAGO; MENDONÇA; LAGARES, 2008).
Como pode ser observada, em nossos resultados, a taxa de clivagem alcançada
para o grupo controle (70,3%) foi equivalente às taxas encontradas em uma PIV comercial.
Foram relatadas, em alguns estudos, taxas de 52% (SALIBA; ALVIM, 2005), 61,5%
(PFEIFER et al., 2005), 67,2% (JASMIN et al., 2005), 70,33% (IGUMA et al., 2005) e 82,1%
(MARTINS JUNIOR et al., 2004). A taxa de clivagem observada no grupo contaminado
(52,8%) foi baixa, comparada com esses estudos, mas se torna aceitável, uma vez que os
oócitos foram coletados de ovários provenientes de abatedouros, sem as devidas
informações de cada animal, como a raça, idade, manejo nutricional, estado sanitário, e
sazonalidade (ARMSTRONG; EVANS, 1983).
Por meio da análise estatística foi observada diferença significativa entre os grupos.
Isso implica que, possivelmente, a presença da bactéria no sêmen interferiu na fecundação.
Bielanski (1997), ao contrário dos resultados apresentados, não observou diferença
significativa na taxa de clivagem entre embriões fecundados com sêmen controle (60%) e
embriões fecundados com sêmen exposto experimentalmente ao Campylobacter fetus
subsp venerealis (10g organismos/mL) (52%).
Piccolomini et al. (2008) infectaram experimentalmente embriões murinos com E. coli
produtora da toxina shiga stx1, antes da primeira divisão embrionária. Foi verificada taxa de
clivagem de 53,8% para o grupo controle e 39,7% para o grupo contaminado, também não
apresentando significância nos resultados.
De acordo com Diemer et al. (1996) e Auroux et al. (1991), a E. coli apresenta um
efeito direto sobre a motilidade progressiva da célula espermática, no entanto, esse efeito é
dependente da concentração bacteriana. Del Porto et al. (1975) observaram que a
concentração de 106 UFC por mL de sêmen causava uma queda significativa na motilidade
espermática. Contraditoriamente, Edmondson et al. (1948) não encontraram qualquer
correlação entre o número de bactérias presentes no sêmen bovino e o período de tempo
que este apresentava células móveis. No entanto, observaram que fatores de virulência
bacteriana, como capacidade hemolítica, estavam relacionados a diminuição da motilidade
espermática.
Após o 7º dia de desenvolvimento embrionário foi observado 44,7% de mórulas no
grupo controle e no grupo contaminado apenas 22,4%, havendo diferença significativa entre
os dois grupos. A presença da bactéria pode ter influenciado esse resultado, pela ação
direta sobre o espermatozóide e/ou embrião, ou indireta, pela ação de sua toxina ou por
competir pelo mesmo substrato do embrião. Bielanski (1997) não observou diferença
significativa em embriões que se desenvolveram até a fase de blastocisto (31% grupo
contaminado e 41% grupo controle) com o sêmen exposto experimentalmente ao
Campylobacter fetus subsp venerealis (10g organismos/mL).
Através da análise morfológica dos embriões, muitas diferenças foram observadas
após o 4º dia de desenvolvimento, como retração citoplasmática, falhas na divisão,
assimetria de blastômeros, ooplasma granuloso, com coloração castanho escura, formação
de vacúolos, degeneração e rompimento da zona pelúcida no grupo contaminado.
Alterações semelhantes em embriões murinos expostos experimentalmente a E. coli
produtora da toxina shiga stx1 foram observadas por Piccolomini et al. (2008), porém
nenhum embrião apresentou rompimento da zona pelúcida.
Na análise dos embriões, através da microscopia óptica de corte semi-fino e
eletrônica de transmissão, foram observadas células granulosas e vacuolizadas,
apresentando estruturas semelhantes à E. coli inseridas no ooplasma. Esses resultados
indicam que o espermatozóide atua como vetor para a transmissão desse patógeno.
Stringfellow et al. (1997) descreveram um caso de uso acidental de sêmen
contaminado criopreservado com Pseudomonas maltophilia na PIV de bovinos. Apesar do
tratamento do sêmen por gradiente de Percoll® e adição de antibióticos nos meios utilizados
para PIV, a bactéria persistiu no sistema e causou degeneração dos embriões.
Amostras de sêmen de touros persistentemente infectadas com BVDV foram
submetidos a técnicas de seleção de espermatozóides normalmente utilizados antes da PIV
(Swim up e gradiente de Percoll®) para determinar se essas técnicas selecionariam
espermatozóides livres de BVDV. Utilizando a técnica de imunoperoxidase, foi verificado que
todos os testes foram positivos para o BVDV, demonstrando que os métodos físicos
comumente utilizados para preparação do sêmen não removem completamente os vírus.
Esse sêmen foi utilizado para a PIV e as taxas de clivagem e de desenvolvimento para o
estágio de blastocisto do grupo experimental foram inferiores aos do grupo controle.
(BIELANSKI; JORDAN, 1996)
D’angelo et al. (2006b) relataram contaminação de embriões de PIV por amostras de
sêmen contaminadas com Acinetobacter spp (5.000 UFC/mL), Enterobacter aerogenes
(5.000 UFC/mL), Escherichia coli (5.000 UFC/mL), Streptococcus spp (incontáveis/mL) e
Alcaligenes faecalis (incontáveis/mL). A presença dessas bactérias no sêmen tornou o
procedimento da FIV inviável.
Devido ao grande desenvolvimento tecnológico ocorrido nesses últimos anos em
relação às técnicas empregadas na produção in vitro de embriões bovinos, do ponto de vista
epidemiológico, deve-se ressaltar que, a cada fase de desenvolvimento criam-se novos
desafios em relação ao controle de doenças. Conforme as tecnologias vão se tornando
mais complexas, como no caso da injeção intracitoplasmática de espermatozóide (ICSI) e da
clonagem, criam-se novas oportunidades para a introdução de patógenos no sistema
(STRINGFELLOW; GIVENS; WALDROP, 2004). Portanto, a introdução de agentes
infecciosos e oportunistas através da PIV é óbvia e, consequentemente, pesquisas sobre os
riscos de transmissão de doenças por embriões são de extrema importância, assim como
pesquisas que visam o melhoramento das técnicas de PIV para aumentar cada vez mais as
taxas de blastocistos e de sucesso na transferência de embriões.
Para a biotécnica de PIV, devem ser revistas as normas de coleta, processamento e
armazenamento de sêmen, para garantir que o mesmo seja isento de microrganismos. As
Boas Práticas na coleta e no laboratório durante o processamento e armazenamento são
fundamentais, uma vez que o muco prepucial possui uma microbiota normal muito rica, além
de microrganismos oportunistas, sendo um risco potencial para contaminação do sêmen. É
importante ressaltar que os meios de cultivo utilizados durante a FIV são ricos em nutrientes
e tornam-se propícios ao desenvolvimento de contaminantes.
A boa higienização do prepúcio do touro e dos materiais utilizados durante a coleta,
com descontaminantes adequados, são de extrema importância, assim como o uso de
antibióticos eficientes durante a diluição do sêmen, já que o procedimento utilizado durante
a FIV (Percoll®), para reduzir ou eliminar a STEC, não se mostrou eficaz.
6.
CONCLUSÃO
A hipótese inicial foi aceita e com base nos resultados apresentados, pode-se
concluir que a presença da Escherichia coli produtora da toxina shiga stx2 no sêmen
interfere na taxa de clivagem dos embriões e também inviabiliza e/ou provoca queda no
desenvolvimento embrionário ao estádio de mórula, além de causar alterações morfológicas
durante esse desenvolvimento.
7.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AFSHAR, A.; EAGLESOME, M. D. Viruses associated with bovine semen. Veterinary
Bulletin, v. 60, p. 689-697, 1990.
ARMSTRONG, D. T.; EVANS, G. M. Factors influencing success of embryo transfer in sheep
and goats. Theriogenology, v. 19, n. 1, p. 31-42, 1983.
ARMSTRONG, G. L., HOLLINGSWORTH, J., MORRIS JR., J. G. Emerging foodborne
pathogens: Escherichia coli O157:H7 as a model of entry of a new pathogen into the food
supply of the developed world. Epidemiologic reviews, v. 18, p. 29–49. 1995.
AUROUX, M. R.; JACQUES, L.; MATHIEU, D. Is the sperm bacterial ratio a determining
factor in impairment of sperm motility: in vitro study in man with Escherichia coli.
International Journal of Andrology, v. 14, n. 4, p. 264-270, 1991.
BIELANSKI, A. A review on disease transmission studies in relationship to production of
embryos by in vitro fertilization and to related new reproductive technologies.
Biotechnologies Advances, v. 15, n. 3-4, p. 633-656,1997.
BIELANSKI, A.; DUBUC, C. In vitro fertilization and culture of ovafrom heifers infected with
bovine herpesvirus- 1 (BHV-1). Theriogenology, v. 41, p. 1211-1217, 1994.
BIELANSKI, A.; JORDAN, L. Washing or washing and trypsin treatment is ineffective for
removal of noncytopathic bovine viral diarrhea virus from bovine oocytes or embryos after
experimental viral contamination of an in vitro fertilization system. Theriogenology, v. 46, p.
1467-1476, 1996.
BIELANSKI, A. A review on disease transmission studies in relationship to production of
embryos by in vitro fertilization and to related new reproductive technologies.
Biotechnologies Advances, v. 15, n. 3-4, p. 633-656,1997.
BIELANSKI, A.; SAPP, T.; LUTZEWALLACE, C. Association of bovine embryos produced by
in vitro fertilization with a noncytopathic strain of bovine viral diarrhea virus type II.
Theriogenology, v. 49, p. 1231–8, 1998.
BIELANSKI, A. Disinfection procedures for controlling microorganisms in the semen and
embryos of humans and farm animals. Theriogenology, v. 68, p. 1–22, 2007.
BRACKETT, B. G.; BARANSKA, W.; SAWICKI, W.; KOPROWSKI, H. Uptake of
heterologous genome by mammalian spermatozoa and its transfer to ova through
fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences. USA. v. 2, p. 353-357,
1971.
CARDOSO, M. V.; VASCONCELLOS, S. A. Importância das micoplasmoses na fertilidade
de touros. Arquivos do Instituto Biológico, v. 71, n. 2, p. 257-265, 2004.
CARVALHO, A. F.; SARAGÓ, A.; TELLES, F. M.; AZEVEDO, S. S.; BATISTA, C. S. A.;
CAMPOS, F. R.; SCARCELLI, E.; GENOVEZ, M. E. Nova proposta de análise bacteriológica
quantitativa aplicada a sêmen industrializado de touros para emprego em centrais de
inseminação artificial. Biológico, v. 69, n. 2, p. 113-198, 2007.
CERQUEIRA, A. M. F.; GUTH, B. E. C.; JOAQUIM, R. M.; ANDRADE, J. R. C. High
occurrence of Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) in healthy cattle in Rio de
Janeiro State, Brazil. Veterinary Microbiology, v. 70, p. 111-121, 1999.
COBBOLD, R. N.; RICE, D. H.; SZYMANSKY, M.; CALL, D. R.; HANCOCK, D. D.
Comparison of Shiga-toxigenic Escherichia coli prevalences among dairy, feedlot, and cowcalf herds in Washington State. Applied and Environmental Microbiology, USA. v. 70, p.
4375 - 4378, 2004.
COSTA, J. P.; PRADO, F. R. A. Avaliação bacteriológica do sêmen coletado de forma in
natura de touros Nelore. Veterinária e Zootecnia, v. 15, n. 2, supl.1, p. 125, 2008.
COTTELL, E.; LENNON, B.; MCMORROW, J.; BARRYKINSELLA, C.; HARRISON, R. F.
Processing of semen in an antibiotic-rich culture medium to minimize microbial presence
during in vitro fertilization. Fertility and Sterility, v. 67, p. 98–103, 1997.
D'ANGELO, M.; GALUPPO, A. G.; PIATTI, R. M.; MELO, G. M.; ZERIO, N. M. C.; SOUZA,
R. J. Avaliação de sensibilidade de zigotos murinos ao herpesvírus bovino-1: um modelo
experimental para estudos de interação embrião-vírus. Arquivos do Instituto Biológico,
v. 72, n. 2, p. 141-145, 2005.
D'ANGELO, M.; GALUPPO, A. G.; MELO, G. M.; ZERIO, N. M. C.; PITUCO, E. M.;
OKUDA, L. H. Estudo morfológico de embriões bovinos fertilizados in vitro expostos
experimentalmente à Neospora caninum. Arquivos do Instituto Biológico, v. 73, n. 2, p.
211-214, 2006a.
D'ANGELO, M.; GALUPPO, A. G.; MELO, G. M.; PAVÃO, D. L. ROJAS, N.; SOUZA, R. J.;
ATHAYDE, C.; PINHEIRO, E. S. Acceptable microorganismos concentration in a sêmen
sample for in vitro embryo production. Brazilian Journal of Microbiology, v. 37 n. 4,
2006b.
DEL PORTO, G. B.; DERRICK JR, F. C.; BANNISTER, E. R. Bacterial effect on sperm
motility. Urology, v. 5, n. 5, p. 638-639, 1975.
DIEMER, T.; WEIDNER, W.; MICHELMANN, H. W. Influence of Escherichia coli on motility
parameters of human spermatozoa in vitro. International Journal of Andrology, v. 19, n. 5,
p. 271-277, 1996.
DIEMER, T.; HUWE, P.; MICHELMANN, H. W.; MAYER, F.; SCHIEFER, H. G.; WEIDNER,
W. Escherichia coli-induced alterations of human spermatozoa. An electron microscopy
analysis. International Journal of Andrology, v. 23, p. 178–186, 2000.
DOIG, P. A. Bovine genital mycoplasmosis. Canadian Veterinary Journa, v. 22, p. 339-343,
1981.
DOYLE, M. P. Escherichia coli O157:H7. In: DOYLE, M. P. et al. Foodborne Pathogenic
Bacteria. ASM Press, 1995. p. 171-191.
DURANTHON, V.; RENARD, J. P. The developmental competence of mammalian oocytes: a
convenient but biologically fuzzy concept. Theriogenology, v. 55, p. 1277–89, 2001;
EAGLESOME, M. D.; GARCIA, M. M.; STEWART, R. B. Microbial agents associated with
bovine genital tract infections and semen. Part II. Haemophilus sommus, Mycoplasma spp
and Ureaplasma spp, Chlamydia; Pathogens and semen contaminants; Treatment of bull
semen with antimicrobial agents. Veterinary Bulletin, v. 62, p. 887–910, 1992.
EDMONDSON, J. E., TALLMAN, K. L., HERMAN, H. A. Study of the types of bacterial in
bovine semen and their effect upon motility. Journal of Dairy Science, v. 31, p. 681, 1948.
ELAZHARY, M.; LAMOTHE, P.; SILIM, A.; ROY, R. S. Bovine herpesvirus-1 in the sperm of
a bull from a herd with fertility problems. Canadian Veterinary Journal, v. 21, p. 336–9,
1980.
FARAH, S. M. S. S. Características fenotípicas e genotípicas de estirpes de
Escherichia coli produtora de toxina shiga (STEC) isoladas de bovinos no estado do
Paraná. [Dissertação (Mestrado). Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas,
Universidade Federal do Paraná]. 2007.
FENG, P. Escherichia coli Serotype O157:H7 Novel vehicles of infection and emergence of
phenotypic variants. Emerging Infectious Diseases, v. 6, p. 530-533, 2000.
FRASER, L.; TAYLOR-ROBINSON, D. The effect of Mycoplasma pulmonis on fertilization
and preimplantation development in vitro of mouse eggs. Fertility and Sterility, v. 28, p.
488–98, 1977.
FÜRST, S.; SCHEEF, J.; BIELASZEWSKA, M. RÜSSMAN, H.; SCHMIDT, H.; KARCH, H.
Identification and Characterization of Escherichia coli strains O157 and non-O157
serogroups containing three distinct Shiga toxin genes. Journal of Medical Microbiology,
v. 49, p. 383-386, 2000.
GALUPPO, A. G. Avaliação da sensibilidade de zigotos murinos à Brucella abortus
para o estabelecimento de um modelo experimental em estudos de interações
embriões-patógenos. [Dissertação (Mestrado). Faculdade de Medicina Veterinária e
Zootecnia, Universidade de São Paulo, p. 74]. 2005.
GENIGEORGIS, C. The risk of transmission of zoonotic and human diseases by meat and
meat products. In: SMULDERS, F. J. M. (Ed.). Elimination of pathogenic organisms from
meat and poultry. Amsterdam: Elsevier Science Publishers B.V, p. 111-147, 1987.
GONÇALVES, E. I. (Ed.) Manual de Defesa Sanitária Animal. Jaboticabal: FUNEP, 1990,
p. 133.
GONÇALVES, P. B. D.; VISINTIN, J. A.; OLIVEIRA, M. A. L.; MONTAGNER, M. M.; COSTA,
L. F. S. Produção in vitro de embriões. In: GONÇALVES, P. B. D.; FIGUEIREDO, J. R.;
FERITAS, V. J. F. (Ed.). Biotécnicas aplicadas à reprodução animal. São Paulo: Varela,
2002, p. 195-196.
GRAU, F. Fresh meats: bacterial association. Arch Lebensmittelhygiene, v. 30, p. 81,
1979.
GRAZIANO, F. Olho no boi. O Estado de São Paulo, São Paulo, 10 mai. 2005. Espaço
Aberto, v. 126, n. 40747, p. A2, 2005.
GUERIN, B.; THIBIER, M. Value of adding antibiotics to frozen bovine semen: the example
of mycoplasmas and campylobacters. Contraception, fertilité, sexualité, v. 21, p. 753–9,
1993.
HARE, W.C.D. Diseases transmissible by semen and embryo transfer technigues. OIE
Technical Bulletin, v. 4, p.1–117, 1985.
HOMERO, V. Presença de E. coli patogênica em rebanhos é risco mundial de saúde
pública. Boletim da FAPERJ. Rio de Janeiro, 05 out. 2006. Disponível em:
<http://www.faperj.br/boletim_interna.phtml?obj_id=3170>. Acesso em: 18 out 2006.
IBGE. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística. São Paulo. 26 nov. 2008.
IGUMA, L. T.; PIVATO, I.; CAMARA, J. U.; DAMATO, J.; PEREIRA, D. C.; CORREA, G. A.;
MACHADO, G. M.; FRANCO, M. M.; BORGES, J. R. J.; RUMPF, R. Efeitos da
administração de FSH em novilhas doadoras de ovócitos para a transferência nuclear
usando fibroblastos de vaca crioula Junqueira – resultados preliminares. Acta Scientiae
Veterinariae, v. 173, p. 35-54, 2005.
IRINO, K.; KATO, M. A. M. F.; VAZ, T. M. I.; RAMOS, I. I.; SOUZA, M. A. C.; CRUZ, A. S.;
GOMES, T. A. T.; VIEIRA, M. A. M.; GUTH, B. E. C. Serotypes and virulence markers of
Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) isolated from dairy cattle in São Paulo State,
Brazil. Veterinary Microbiology, v. 105, p. 29-36, 2005.
JASMIN.; POLISSENI, J.; TORRES-JUNIOR, J. R. S.; SÁ, W. F.; CAMARGO, L. S. A.;
FERREIRA, A. M.; FOLHADELLA, I. M.; VIANNA, J. H. M.; RAMOS, A. A. Desenvolvimento
in vitro de embriões derivados de oócitos bovinos maturados em meio sem controle da
atmosfera gasosa. Acta Scientiae Veterinariae, v. 33, p. 376, 2005.
KAPER, J. B.; NATARO, J. P.; MOBLEY, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature
Reviews Microbiology. v. 2, p. 123-140. 2004.
KNUTTON, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods Enzymology, v. 253,
p. 145 – 158, 1995.
KRUIP, T. A. M.; BEVERS, M. M.; KEMP, B. Environment of oocyte and embryo determines
health of IVP offspring. Theriogenology, v. 53, p. 611-618, 2000.
LE, K. W.; KIM, I. H.; SON, D. S.; LEE,H. J.; LEE, D. W.; SEO, G. H.; CHOI, S. H.; YANG, B.
C.; KIM, K. N.; JUNG, S. C. Identification of bacteria derived from frozen bovine semen that
resulted in contamination during in vitro fertilization. Theriogenology, v. 47, p. 375, 1997.
LIMA, V. H. Como e quando a sexagem de embriões faz a diferença. O Embrião:
Sociedade Brasileira de Tecnologia de Embriões, Jaboticabal, Editorial, n. 26, p. 4, 2006.
LINTON, A. H.; HINTON, M. H. Prevention of microbial contamination of red meat in the ante
mortem phase: epidemiological aspects. In: SMULDERS, F. J. M. (Ed.). Elimination of
pathogenic organisms from meat and poultry. Amsterdam: Elsevier Science Publishers
B.V. 1987, p. 9-25.
LIVERSEDGE, N. H.; JENKINS, J. M.; KEAY, S. D.; MCLAUGHLIN, E. A.; SUFYAN, H.;
MAILE, L. A. Antibiotic treatment based on seminal cultures from asymptomatic male
partners in in-vitro fertilization is unnecessary and may be detrimental. Human
Reproduction, v. 11, p. 1227–31, 1996.
LO, S. C.; BLANCHARD, A. Mycoplasmas and in vitro infections of cell cultures with HIV. In:
TULLY, G.; RAZIN, S. (Ed). Molecular and diagnostic procedures in mycoplasmology.
Academy Press, v, 2, 1996, p. 399–403.
MAGAJEVSKI, F. S.; GIRIO, R. S. J.; MEIRELLES, R. B. Pesquisa de leptospira em fetos de
vacas abatidas no estado de São Paulo, Brasil. Arquivos do Instituto Biológico, v. 74, n.
2, p. 67-72, 2007.
MAINIL, J. G.; DAUBE, G. Verotoxigenic Escherichia coli from animals, humans and foods:
who’s who? Journal of Applied Microbiology, v. 98, p. 1332-1344, 2005.
MARTINS JUNIOR, A.; CALEGARI, R. S.; FREITAS, C. P; ZANON, J. E. O.; PASCHOAL, D.
M. Desenvolvimento potencial de embriões bovinos após fertilização de ovócitos in vitro com
catalase e GnRH. Acta Scientiae Veterinariae, v. 32, p. 92, 2004.
MIYASHIRO, S.; CARVALHO, A.F.; NASSAR, A.F.C.; BALDASSI, L. Caracterização
molecular e fenotípica de estirpes de Escherichia coli produtoras de shiga-toxina (STEC)
não-O157 de amostras isoladas de fezes e carcaças bovinas. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE MICROBIOLOGIA, 25, 2009, Porto de Galinhas, Anais... Porto de
Galinhas: SBM, 2009.
NATARO, J. P.; KAPER, J. B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clinical Microbiology
Reviews, v. 11, n. 1, p. 142, 1998.
NIBART, M.; SILVA PEIXER, M.; THUARD, J .M.; DURANT, M.; GUYADER-JOLY, C.;
PONCHON, S.; MARQUANT-LE GUIENNE, B.; HUMBLOT, P. Embryo production by OPU
and IVF in dairy cattle. In: RÉUNION A.E.T.E., XI, 1995, Hannover, Proceedings…
Hannover, p. 216, 1995.
OKUDA, L. H.; JEREZ, J. A.; PITUCO, E. M.; STEFANO, E.; RODRIGUES, L. A. Estomatite
vesicular: monitoramento em touros doadores de sêmen de uma central de inseminação
artificial. Arquivos do Instituto Biológico, v. 70, n. 1, p. 11-15, 2003.
OIE. World organization for animal health. Terrestrial Animal Health Code. 13 Ed. Paris:
OIE. Disponivel em: <http://www.oie.int> Acesso em: 17 mai 2008.
PADRÓN, T. S. Técnicas de imunocitoquímica. In: Técnicas básicas de Microscopia
Eletrônica aplicadas às Ciências Biológicas. Rio de Janeiro, 1998.
PATON, J. C.; PATON, A. W. Pathogenesis and diagnosis of Shiga toxin-producing
Escherichia coli infections. Clinical Microbiology Reviews, v. 11, p. 450-479, 1998.
PEIXER, M. A. S.; SOUZA, R. V.; RUMPF, R.; DE BEM, A. R.; NETO, M. A. P. Nascimento
dos primeiros produtos de FIV da raça Nelore no cenargem. Zootecnia, v. 32, p. 49, 1995.
PFEIFER, L. F.; SCHNEIDER, A.; CASTILHO, E. M.; LUZ, E. M.; ATHAIDE, P. F.;
DIONELLO, N. J. L.; PIVATO, I.; RIMPF, R.; CORREA, M. N. Efeito da progesterona
exógena em vacas doadoras de ovócitos sobre o desenvolvimento folicular e a produção in
vitro de embriões. Acta Scientiae Veterinariae, v. 33, p. 184, 2005.
PICCOLOMINI, M. M.; GOES, A. C.; MIYASHIRO, S.; PAVÃO, D. L.; D’ANGELO. M.
Desenvolvimento de embriões murinos in vitro infectados experimentalmente pela
Escherichia coli produtora da toxina shiga stx1. Biológico, v. 70, n. 2, p. 107-216, 2008.
PIGATTO, C. P. Isolamento e freqüência de Escherichia coli produtora de toxina Shiga
(STEC) em cultura fecal de bovinos no estado do Paraná. [Dissertação (Mestre). Setor
de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Paraná. Curitiba]. 2003.
PRUIMBOOM-BREES, I. M.; MORGAN, T. W.; ACKERMANN, M. R.; SAMUEL, J. E.;
CORNICK, N. A.; MOON, H. W. Cattle lack vascular receptors for Escherichia coli O157:H7
Shiga toxins. PNAS, v. 97, p. 10325-10329, 2000.
RENESTO, A. Associação das biotécnicas: aspiração folicular guiada por ultrasonografia e superovulação na produção in vitro e in vivo de embriões bovinos.
[Dissertação (Mestre). Setor de Ciências Agrárias. Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias – UNESP. Jabuticabal]. 2004.
RIDEOUT, M. I.; BURNS, S. J.; SIMPSON, R. B. Influence of bacterial pruducts on the
motility of stallion spermatozoa. Journal of Reproduction and Fertility, supl. 32. p. 35-40,
1982.
SALIBA, W. P.; ALVIN, M. T. T. Problemas relacionados a produção comercial de embriões
bovinos. Acta Scientie Veterinariae, v. 33, supl. 1, p. 162-166, 2005.
SANDRINI, C. N. M; PEREIRA, M. A; BROD, C. A; CARVALHAL, J. B; ALEIXO, J. A. G.
Escherichia coli verotoxigênica: isolamento e prevalência em 60 propriedades de bovinos de
leite da região de Pelotas, RS, Brasil. Ciência Rural, v, 37, n. 1, 2007.
SCHIEWE, M. General hygiene and quality control practices in a embryo production
laboratory. In: STRINGFELLOW, D. A.; SEIDEL, M. (Ed). Manual of the International
Embryo Transfer Society, Illinois:IETS, 1998, p. 93–103.
SCHIEVE, L. A.; TAYHAM, L.; PETERSON, H. B.; TONER, J.; JENG, G. Spontaneous
abortion among pregnancies conceived using assisted reproductive technology in the United
States. Obstetric Gynecologic, 2003.
SHAW, D. J.; JENKINS, C.; PEARCE, M. C.; CHEASTY, T.; GUNN, G. J.; DOUGAN, G.;
SMITH, H. R.; WOOLHOUSE, M. E. J.; FRANKEL, G. Shedding patterns of verocytotoxinproducing Escherichia coli strains in a cohort of calves and their dams on a Scottish beef
farm. Applied and Environmental Microbiology, p. 7456-7465, 2004.
SHEN, S., MASCARENHAS, M., MORGAN, R., RAHN, K., KARMALI, M. A. Identification of
four fimbria-encoding genomic islands that are highly specific for verocytotoxin-producing
Escherichia coli serotype o157 strains. Journal of Clinical Microbiology, v. 43, p. 38403850, 2005.
SILVA, L. R. Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 em bovinos abatidos em matadouro
frigorífico de Curitiba-Paraná. [Dissertação (Mestre). Departamento de Medicina
Veterinária. Universidade Federal do Paraná. Curitiba]. 2002.
SILVA, N. Detecção de patógenos no sêmen. Detecção de agentes patogênicos em
sêmen
bovino
destinado
a
inseminação
artificial.
Disponível
em:
<http://biotecnologia.uol.com.br/edicoes/ed06.asp>. Acesso em: 14 mai 2003.
SONE, M.; OHMURA, K.; BAMBA, K. Effects of various antibiotics on the control of bacterial
in boar semen. Veterinary Record, n. 111, p. 11-14, 1982.
SPINA, N.; ZANSKY, S.; DUMAS, N.; KONDRAKI, S. Four laboratory-associated cases
of infection with Escherichia coli O157:H7. Journal of Clinical Microbiology. v. 43, p.
2938- 2939, 2005.
STRINGFELLOW, J. S.; HATHCOCK, T. L.; RIDDEL, K. P.; STRINGFELLOW, D. A.; GALIK,
P. K.; RIDDEL JR, M. G.; CARSON, R. L. Introduction of Stenotrophomas maltophilia
through semen used for in vitro production of bovine embryos Theriogenology, v.47, p. 382,
1997.
STRINGFELLOW, D. A.; GIVENS, M. D. Epidemiologic concerns relative to in vivo and in
vitro production of livestock embryos. Animal Reproduction Science, v. 60-61, p. 629-642,
2000a.
STRINGFELLOW, D. A.; GIVENS, M. D. Infectious agents in bovine embryo production:
hazards and solutions. Theriogenology, v. 53, p. 85-94, 2000b.
STRINGFELLOW, D. A.; GIVENS, M. D.; WALDROP, J. G. Biosecurity issues associated
with current and emerging embryo technologies. Reproduction, Fertility and Development,
v. 16, p. 93-102 , 2004.
STROCKBINE, N. A.; MARQUES, L. R. M.; NEWLAND, J. M.; SMITH, H. W.; HOLMES, R.
K.; O’BRIEN, A. D. Two toxin-converting phages from Escherichia coli O157:H7
strain 933 encode antigenically distinct toxins with similar biologic activities. Infection and
Immunity, v. 170, p. 1116-1122, 1986.
TARR, P. I.; GORDON, C. A.; CHANDLER, W. L. Shiga-toxin-producing Escherichia coli and
haemolytic uremic syndrome. Lancet, v. 365, p. 1073–1086, 2005.
TÓTH, I.; SCHMIDT, H.; KARDOS, G.; LANCZ, Z.; CREUZBURG, K.; DAMJANOVA,
PÁSZTI, I. J.; BEUTIN, L.; NAGY, B. Virulence genes and molecular typing of different
groups of Escherichia coli O157 strains in cattle. Applied and Environmental
Microbiology, 2009.
TRABULSI, L. R.; ALTERTHUM, F.; GOMPERTZ, O. F.; CANDEIAS, J. A. N. (Ed).
Microbiologia. 3 ed. São Paulo: Atheneu, 2002.
TRISTÃO, L. C. S.; GONZALEZ, A. G. M.; COUTINHO, C. A. S. et al. Virulence markers and
genetic relationships of Shiga toxin-producing Escherichia coli strains from serogroup O111
isolated from cattle. Veterinary Microbiology, v. 119, p. 358-365, 2007.
VAN DONKERSGOED, J.; JERICHO, K. W. F.; GROGAN, H.; THORLAKSON, B.
Preslaughter hide status of cattle and the microbiology of carcasses. Journal of Food
Protection, v. 60, p. 1502-1508, 1997.
VARAGO, F. C.; MENDONÇA, L. F.; LAGARES, M. A. Produção in vitro de embriões
bovinos: estado da arte e perspectiva de uma técnica em constante evolução. Revista
Brasileira de Reprodução Animal, v. 32, n. 2, p. 100-109, 2008. Disponível em:
<http://www.cbra.org.br.> Acesso em: 10 jul 2009.
VARMA, J. K.; GREENE, K. D.; RELLER, M. E; DE LONG, S. M.; TROTTIER, J.; NOVICKI,
S. F.; DI ORIO, M.; KOCK, E. M.; BANNERMAN, T. M.; YORK, S. T.; LAMBERT-FAIR, M.;
WELLS, J. G.; MEAD, P. S. Outbreak of Escherichia coli O157 infection following exposure
to a contaminated building. Jama, v. 290, p. 2790-2712, 2003.
VIANA, J. H. M.; Mudanças e tendências no mercado de embriões bovinos no Brasil. O
Embrião. Sociedade Brasileira de Tecnologia de embriões. Ano X, n.42, jul/agosto. 2009.
WHO, World Health Organization. Zoonotic non-O157 Shiga toxin-producing Escherichia coli
(STEC). Scientific Working Group Meeting. Geneva, Switzerland, 1998.
WOELDERS, H. Overview of in methods for evaluation of semen quality. Reproduction in
Domestic Animals, Suppl. 1, p. 145-164, 1991.