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IX Encontro Nacional de Diagnóstico Veterinário
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157. Silva S.M.M.S., Souza F.A.L., Costa E.A., Sousa M.E.C. & Santos R.L. 2016. Caracterização molecular dos agentes causadores de rinite micótica em ovinos do Piauí. Pesquisa
Veterinária Brasileira 36(Supl.2):241-242. Setor de Patologia Animal, Universidade Federal
do Piauí, Centro de Ciências Agrárias, Av. Universitária s/n, Ininga, Teresina, PI 64049-550,
Brasil. E-mail: [email protected]
Projeto realizado com auxílio do CNPq a Silva S.M.M.S. (Proc. 478328/2009-5).
Introdução: No Brasil, as enfermidades micóticas que
acometem a cavidade nasal de ovinos podem causar prejuízos econômicos aos rebanhos de várias regiões, destacando-se no país a conidiobolomicose, causada por fungos do
gênero Conidiobolus spp., também conhecida como forma
nasofaringeana e que provoca dispneia, respiração ruidosa,
corrimento nasal serossanguinolento, assimetria craniofacial, exoftalmia e ceratite (Morris et al. 2001, Silva et al.
2007a, Portela et al. 2010); e a pitiose rinofacial, também
chamada de “nariz de touro”, que tem como agente etiológico o oomiceto Pythium insidiosum e causa corrimento
nasal serossanguinolento, aumento de volume das narinas,
vestíbulo nasal e lábio superior; mucosa nasal e palatos ulcerados e narinas parcialmente obstruídas (Riet-Correa et
al. 2008, Santurio et al. 2006). No Piauí estas enfermidades já vem a alguns anos acometendo os ovinos na maior
parte do Estado, afetando a cavidade nasal desses animais
e chamando atenção dos criadores, veterinários de campo
e pesquisadores. Ainda existem dúvidas quanto ao agente
etiológico dessas enfermidades, pois estas formas podem
aparecem em surtos isolados, porém podem apresentar-se
juntas, gerando confusão, já que possuem características
clínicas semelhantes (Portela et al. 2010, Vilela et al. 2010).
Alguns trabalhos tem sido realizados na tentativa de identiicar a etiologia das duas formas clínicas de rinite micótica
em ovinos, porém baseados apenas em critérios morfológicos e histoquímicos (Ubiali et al. 2013), ou caracterizando
uma das formas isoladamente (Vilela et al. 2010), havendo a
necessidade de um estudo aprofundado na área molecular,
já que atualmente dispomos dessa importante ferramenta
como meio de diagnóstico. Dessa forma, este trabalho tem
como objetivo caracterizar e identi icar por meio da Reação
em Cadeia da Polimerase (PCR) os agentes etiológicos das
duas formas clínicas de rinite micótica de ovinos do Piauí.
Material e Métodos: O estudo foi realizado no período de
2009 a 2012, com 6 ovinos que deram entrada no Setor de Patologia Animal da Universidade Federal do Piauí apresentando características clínicas das duas formas de rinite micótica (três animais
de cada). A caracterização molecular dos agentes etiológicos foi
realizada por meio da PCR e sequenciamento, a partir da extração
de DNA dos isolados dos fungos cultivados em ágar batata dextrose (BDA) obtidos das lesões de ambas formas. Para a forma nasofaringeana as hifas foram trituradas em nitrogênio líquido, tratadas com dodecil sulfato de sódio e proteinase K e o DNA extraído
com fenol-clorofórmio-álcool isoamilico. A subunidade do gene
18S do DNA ribossomal foi ampli icada utilizando os iniciadores
universais descritos por Gargas & De Priest (1996). Já para a forma rinofacial, o DNA dos cultivos foi extraído seguindo-se a técnica utilizada por De Hoog et al. (2003), e os iniciadores utilizados
foram desenhados a partir de sequências de Pythium insidiosum
depositadas no GenBank. Os produtos da PCR foram analisados
em um gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio. Os produtos ampli icados foram puri icados a partir do gel usando kit de
extração comercial, seguido pelo sequenciamento de ácidos nucléicos. As sequências obtidas foram analisadas e comparadas com
as disponíveis no GenBank usando BLAST (http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/BLAST) para procurar por prováveis identi icações das
espécies de fungo causadora das duas formas de rinite. A análise
ilogenética foi realizada utilizando o software MEGA5 (Kumar et
al. 2011), pelo método Neighbor-Joining.
Resultados: Após a PCR e os sequenciamentos dos seus
produtos, foi con irmado para a forma nasofaringeana a
presença do fungo Conidiobolus lamprauges, pertencente a
classe Zygomicetes e ordem Entomophtorales, sendo que
as sequências obtidas dos isolados avaliados possuem de
92 a 99% de identidade para o gene 18S rDNA de C. lamprauges (nºs GenBank AF296754 e AF113420), seguido
por C. osmodes (90% de identidade, GenBank AF368510),
C. thromboides (90% de identidade, GenBank AF052401)
e outros membros relacionados com Entomophtorales. As
três sequências de DNA de C. lamprauges isolados de ovinos do Piauí e as duas sequências isoladas do ambiente
disponíveis e agrupadas no banco de dados formaram um
forte táxon mono ilético. O táxon C. lamprauges está ligado
por um longo ramo à C. osmodes, C. thromboides, C. pumilus e C. rhysosporus, que, por sua vez, são próximos das demais sequências de Conidiobolus neste estudo. O restante
das sequências foram agrupadas em dois pequenos, bem
suportados e próximos grupos. Para a forma rinofacial, a
partir dos isolados estudados proveniente de três animais
com as características clínicas da enfermidade foi identi icado o fungo Pythium insidiosum, pertencente à classe
Oomycetes e ordem Phitiales, sendo que as sequências
possuem forte identidade (100%) para o gene 18S rRNA de
P. insidiosum isolados de estudos no Canadá (HQ643568),
Tailândia (GQ643568) e Brasil (EF666084), que na árvore
ilogenética formam um forte táxon mono ilético; seguidos
por outras cepas isoladas e sequenciadas de P. insidiosum
que variaram de 94 a 98% de identidade.
Discussão: Metodologias moleculares têm-se revelado
uma ferramenta valiosa na identi icação de isolados clínicos de uma variedade de agentes etiológicos diretamente de tecidos infectados ou a partir de cultivos destes (De
Paula et al. 2010, Vilela et al. 2010). Tem se observado que
em relatos de rinites micóticas em ovinos por C. coronatus
(Silva et al. 2007a), C. incongruus (Carrigan et al. 1992, Ketterer et al. 1992) e P. insidiosum (Tabosa et al. 2004, Riet-Correa et al. 2008, Santúrio et al. 2008) os sinais clínicos
são semelhantes sugerindo múltiplas etiologias, o que proporcionou o presente estudo e favoreceu a caracterização
desses agentes, como pode-se observar neste trabalho. O
uso da ferramenta de biologia molecular tem crescido anualmente, mesmo assim, estudos de caracterização molecular dos agentes envolvidos nas rinites micóticas de ovinos
são escassos e os que existem caracterizam apenas a forma
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nasofaringeana, con irmando-se como agente etiológico o
C. lamprauges (De Paula et al. 2010, Vilela et al. 2010, Silveira et al. 2013), assim como observado nos isolados dos
animais estudados. Este é o primeiro trabalho que isolou
e identi icou por meio de técnicas moleculares de sequenciamento o agente etiológico da forma rinofacial (“nariz de
touro”) no Brasil, sendo o P. insidiosum o responsável por
essa enfermidade. Além disso, a similaridade e aproximação ilogenética com isolados de outras partes do mundo
comprova a presença do mesmo nas rinites rinofacial de
ovinos. Todos os casos de rinite rinofacial no Brasil até
o momento sugerem e caracterizam este fungo apenas
morfologicamente (Santúrio et al. 2008, Riet-Correa et al.
2008). No Brasil o Conidiobolus spp. são considerados importantes patógenos causadores de zigomicose ovina (De
Paula et al. 2010), tendo sido relatado em nosso estado
(Silva et al. 2007b), Paraíba (Riet-Correa et al. 2008), Santa
Catarina (Furlan et al. 2010) e Mato Grosso (De Paula et al.
2010), porém na grande maioria este agente é caracterizado somente por meio de achados histopatológicos e microbiológicos.
Conclusão: O presente estudo caracterizou, pela primeira vez, através de sequenciamento genético e ilogenia,
as duas formas clínicas de rinite micótica que acometem
ovinos no Piauí, identi icando como causador da zigomicose rinofaringeal o C. lamprauges e como causador da pitiose
rinofacial o P. insidiosum, con irmando que estas enfermidades são provocadas por agentes etiológicos diferentes,
mas que podem ocorrer isoladas ou simultaneamente.
Referências: Carrigan M., Small A. & Perry G. 1992. Ovine nasal
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Nakazato L., Colodel E.M. & Pescador C.A. 2013. Pathology of nasal infection caused by Conidiobolus lamprauges and Pythium insidiosum in sheep.
J. Comp. Pathol. 149(2/3):137-145. - Vilela R., Silva S.M.S., Riet-Correa F.,
Dominguez E. & Mendoza L. 2010. Morphologic and phylogenetic characterization of Conidiobolus lamprauges recovered from infected sheep. J.
Clin. Microbiol. 48:427-432.
TERMOS DE INDEXAÇÃO: Conidiobolus lamprageus, Pythium insidiosum, doenças fúngicas, sequenciamento, PCR.
158. Souza F.A.L., Ribeiro D.P., Lopes M.G., Beserra E.E.A., Braga J.F.V., Bernardi J.C.M., Pires
L.V. & Silva S.M.M.S. 2016. Soroprevalência da diarreia viral bovina em rebanhos leiteiros da microrregião Litoral Piauiense. Pesquisa Veterinária Brasileira 36(Supl.2):242244. Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Rua Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos, Recife, PE 52171-900, Brasil.
E-mail: [email protected]
Introdução: O vírus da Diarreia Viral Bovina (BVDV)
é um dos principais patógenos responsáveis por perdas
econômicas signi icativas na indústria pecuária bovina de
corte e leite (Fino et al. 2012). É um vírus RNA, da família
Flaviviridae e gênero Pestivirus (Francki 1991) e tem distribuição mundial, sendo que no Brasil a disseminação na
população bovina foi comprovada por meio de isolamentos
e inquéritos epidemiológicos (Vidor et al. 1974, Castro et
al. 1993, Dias & Samara 2003, Quincozes et al. 2007, Brito et al. 2010, Chaves et al. 2012, Lucena & Tenório 2015).
Uma característica marcante do vírus é a grande diversidade antigênica e a existência de dois genótipos genética
e antigenicamente distintos: BVDV tipos 1 e 2 (Loneragan
et al. 2005). A infecção por BVDV é responsável por amPesq. Vet. Bras. 36(Supl.2), outubro 2016
pla variedade de manifestações clínicas, que variam de
infecções inaparentes ou subclínicas até doença aguda e,
às vezes, fatal (Fino et al. 2012), relacionadas com doença
reprodutiva, digestiva, respiratória, síndrome hemorrágica, doença das mucosas e imunodepressão (Dias & Samara 2003, Quincozes et al. 2007). O diagnóstico da doença
pode ser dado pelo exame clínico, achados de necropsia e
exames laboratoriais, como isolamento do vírus em cultivo
celular, identi icação de anticorpos por técnicas sorológicas
e pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) (Dias & Samara 2003, Pilz et al. 2005). Os estudos dessa enfermidade
no Nordeste são escassos, tendo relatos apenas na Bahia,
Pernambuco, Sergipe e Maranhão. No Piauí, informações
sobre a BVDV só foram relatadas até o momento, por Luce-