versão final - Instituto Biológico

Detecção do Lettuce mosaic virus em sementes de alface (Lactuca sativa L.)
Amanda Roberta da Silva
Dissertação apresentada ao Instituto
Biológico,
da
Agência
Paulista
de
Tecnologia
dos
Agronegócios,
para
obtenção do título de Mestre em Sanidade,
Segurança Alimentar e Ambiental no
Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade Vegetal,
Segurança Alimentar e Meio Ambiente.
Orientador (a): Addolorata Colariccio
São Paulo
2010
SECRETARIA DE AGRICULTURA E ABASTECIMENTO
AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS
INSTITUTO BIOLÓGICO
Pós-Graduação
Av. Cons. Rodrigues Alves 1252
CEP 04014-002 - São Paulo – SP
[email protected]
FOLHA DE APROVAÇÃO
Nome do candidato
Título: Detecção do Lettuce mosaic virus em sementes de alface (Lactuca sativa L.)
Orientador(a): Addolorata Colariccio
Dissertação
apresentada
ao
Instituto
Biológico da Agência Paulista de Tecnologia
dos Agronegócios para obtenção do título de
Mestre em Sanidade, Segurança Alimentar e
Ambiental no Agronegócio.
Área de Concentração: Sanidade Vegetal,
Segurança Alimentar e Meio Ambiente.
Aprovada em:
Banca Examinadora
Assinatura:
Prof. (a) Dr.(a):
Instituição:
Assinatura:
Prof. (a) Dr.(a):
Instituição:
Assinatura:
Prof. (a) Dr.(a):
Instituição:
i
Dedico aos meus pais, Antonio Roberto e Maria Prisca, ao meu Noivo Jean
Cesar e aos meus irmãos Ariana e Arthur.
OBRIGADA, DE CORAÇÃO, PELA CONFIANÇA E INCENTIVO .
ii
AGRADECIMENTOS
Meu mais profundo agradecimento e reconhecimento a todas as pessoas que,
direta ou indiretamente, possibilitaram a execução deste trabalho.
Ao
Instituto
Biológico,
pela
oportunidade
oferecida
para
o
meu
aperfeiçoamento e aprimoramento profissional.
A Dra. Addolorata Colariccio, pela amizade, confiança e orientação durante
esses anos.
Ao Dr. Alexandre e ao Dr. Joaquim, pelo apoio, sugestões em diferentes
etapas do desenvolvimento deste trabalho e pela valiosa colaboração.
Aos
demais
professores
do
Curso
de
Pós-Graduação,
pelos
inúmeros
ensinamentos transmitidos.
Ao amigo Ricardo Lombardi, grande amigo, sincero e solícito, a quem
agradeço pela força e estímulo oferecidos no decorrer do curso.
Aos funcionários do Instituto Biológico, pela ajuda na condução dos ensaios de
campo.
À coordenação e aos colegas do laboratório de fisiopatologia e fitovirologia,
pela colaboração nos trabalhos de laboratório.
Aos Colegas do Curso de Pós-Graduação, pelo companheirismo e amizade
demonstrada.
Enfim, a todos que, de alguma maneira, contribuíram para o êxito deste
trabalho.
O meu mais sincero,
Muito Obrigada!!!!
iii
RESUMO
SILVA, A.R. Detecção do Lettuce mosaic virus em sementes de alface (Lactuca sativa L.).
Dissertação (mestrado em sanidade vegetal, segurança alimentar e o meio ambiente)Instituto Biológico. São Paulo, 2010.
O trabalho teve como objetivo a detecção e identificação do LMV em sementes de alface de
variedades comerciais e de linhagens experimentais do banco de germoplasma do
IAC/apta, visando à comparação dos métodos de diagnóstico biológicos e sorológicos para
avaliar a presença do LMV nessas sementes. Os extratos das sementes foram inoculados
em plantas de Chenopodium amaranticolor e utilizados no teste de PTA-ELISA, para avaliar
se as sementes estavam ou não infectadas pelo LMV. Nos lotes de sementes das
variedades comerciais não foi possível detectar a presença do vírus. Entretanto, entre as
linhagens experimentais a C13 manifestou sintomas de anéis cloróticos e mosaico sistêmico
na planta indicadora. Para caracterizar o LMV, folhas de C. amaranticolor inoculadas com a
linhagem experimental C13 e dois isolados do LMV pertencentes á Coleção de Fitovírus Karl
Silberschmidt empregados como controle foram submetidas a RT-PCR e digestão
enzimática com a enzima ECO-RI. A digestão enzimática possibilitou a identificação do
subgrupo LMV-Common nas três amostras avaliadas, resultado que está em concordância
com os dados da literatura. A taxa de transmissão pela semente do subgrupo LMV-Most é
bastante elevada, chegando a 16,5% em cultivares de alface onde os genes de resistência
estão ausentes, e a 1,9% em genótipos contendo os alelos mo11 e mo12, enquanto que o
subgrupo LMV-Common não infecta genótipos contendo os alelos de resistência recessivos.
Os resultados foram negativos, para todas as amostras avaliadas em PTA-ELISA, o que
pode indicar que a analise realizada diretamente, a partir de sementes influi nos resultados,
uma vez que a concentração do LMV nas sementes é baixa. Nas amostras avaliadas com
resultado positivo para o LMV-Common é possível que a linhagem experimental C13, o
isolado CoFiKS 18/1998 (alface Verônica) e o isolado CoFiKS 20/1998 (alface americana),
não possuam o gene Mo2 ou que a resistência por ele conferida tenha sido contornada.
PALAVRAS CHAVE: ALFACE, Lettuce mosaic virus, SUBGRUPO, TRANSMISSÃO,
SEMENTES, DETECÇÂO.
iv
ABSTRACT
SILVA, A.R. Detection of Lettuce mosaic virus in lettuce seeds (Lactuca sativa L.).
Dissertação (mestrado em sanidade vegetal, segurança alimentar e o meio ambiente)Instituto Biológico. São Paulo, 2010.
The work aimed at the detection and identification of LMV in lettuce seeds of commercial
varieties and experimental lines of the germplasm bank of IAC / apta in order to compare
methods of biological and serological diagnosis to assess the presence of LMV in these
seeds. The extracts of the seeds were inoculated in Chenopodium amaranticolor and used in
PTA-ELISA test, to assess whether the seeds were either not infected by LMV. In seed lots
of commercial varieties has not been possible to detect the presence of the virus. However,
among the experimental lines C13 showed symptoms of systemic mosaic and clorotic rings
in the control plant. To characterize the LMV, leaves of C. amaranticolor inoculated with the
experimental strain C13 and two LMV isolates belonging to the Collection the of phytovirus
Karl Silberschmidt used as control were subjected to RT-PCR and enzymatic digestion with
the enzyme Eco-RI. Enzymatic digestion allowed the identification of subgroup LMVCommon in all three samples, a result that is consistent with the literature data. The
transmission rate for the seed subgroup of LMV-Most is quite high, reaching 16.5% in lettuce
cultivars where resistance genes are missing, and 1.9% in genotypes containing the alleles
and mo11 mo12, whereas the LMV-Common subgroup does not infect genotypes containing
the recessive resistance alleles. The results were negative for all samples in PTA-ELISA,
which may indicate that the analysis performed directly from seed influences the results,
since the concentration of LMV in seeds is low. In the samples with positive result for the
LMV-Common is possible that the experimental strain C13, the isolated CoFiKS 18/1998
(lettuce Veronica) and isolated CoFiKS 20/1998 (lettuce Americana), do not possess the
gene, or Mo2 that resistance by he has been given circumvented.
KEYWORDS: Lettuce mosaic virus, SEED, TRANSMISSION, LETTUCE, SUBGROUP,
DETECTION.
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Genealogia da série Brasil do IAC/apta.................................................................17
Figura 2: Genealogia do cultivar 'Regina'..............................................................................18
Figura 3: C. amaranticolor inoculado com a linhagem C13, sintomas localizados de anéis
cloróticos e mosaico...............................................................................................................23
Figura 4: C. amaranticolor inoculado com o isolado LMV CoFiKS 18/1998, com sintoma de
mosaico sistêmico..................................................................................................................23
Figura 5: C. amaranticolor inoculado com o isolado LMV CoFiKS 20/1998, com sintomas de
mosaico sistêmico..................................................................................................................24
Figura 6: Perfil eletroforético dos produtos da RT-PCR. Observou-se a presença de bandas
de aproximadamente 280pb nas colunas 1 (linhagem C13), 2 (isolado CoFiKS 20/1998) e 3
(isolado CoFiKS18/1998). Na coluna 4 (controle negativo) não se observou a presença de
bandas....................................................................................................................................26
vi
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Variedades comerciais e linhagens utilizadas no trabalho...................................16
Tabela 2: Isolados do Lettuce mosaic virus utilizados no trabalho.......................................16
Tabela 3: Oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos vírus nas análises de RTPCR........................................................................................................................................21
viii
SUMÁRIO
RESUMO ................................................................................................................................iii
ABSTRACT ............................................................................................................................iv
LISTA DE FIGURAS ...............................................................................................................v
LISTA DE TABELAS ..............................................................................................................vi
1. INTRODUÇÃO.......................................................................................................1
2. OBJETIVOS...........................................................................................................4
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...........................................................................4
3. REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................5
3.1 A cultura da alface.........................................................................................5
3.2 Principais vírus que afetam a cultura da alface..........................................6
3.3 A família Potyviridae......................................................................................7
3.4 O vírus do mosaico da alface Lettuce mosaic virus (LMV)........................8
3.5 Transmissão de vírus de plantas pela semente........................................10
3.6 Principais
medidas
empregadas
para
a
comercialização
de
sementes......................................................................................................12
4. MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................15
4.1 Local de realização dos experimentos......................................................15
4.2 Material vegetal............................................................................................15
4.3 Obtenção da planta indicadora de C. amaranticolor para o teste
biológico.......................................................................................................18
4.4 Detecção do LMV em sementes por teste biológico................................18
4.5 Detecção do LMV em sementes por PTA-ELISA......................................19
4.6 Testes moleculares......................................................................................20
4.6.1. Extração do RNA total.......................................................................20
4.6.2. Reação de transcriptase reversa seguida de reação em cadeia de
polimerase (RT-PCR)............................................................................20
4.6.3. Digestão dos produtos da RT-PCR.................................................21
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................................22
5.1 Transmissão mecânica e avaliação dos sintomas..................................22
5.2 Teste sorológico.........................................................................................24
5.3 Testes moleculares.....................................................................................25
6. CONCLUSÃO......................................................................................................29
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................30
1
1. INTRODUÇÃO
A alface é uma das hortaliças de maior importância econômica no mundo
(DINANT & LOT, 1992). Na América do Sul, o Brasil se destaca como o maior produtor
desta hortaliça, sendo o estado de São Paulo o maior produtor nacional, com uma produção
de 21587 toneladas em 2007 (AGRIANUAL, 2007). Seu cultivo abrange 6570,20 hectares
com uma produção de 4.097.697 engradados, com capacidade para 9 dúzias (IEA, 2007).
No Brasil foram comercializadas, no ano de 2007, 17 toneladas de sementes nuas e 34
toneladas de sementes peletizadas (ABCSEM, 2007).
Por se tratar de uma cultura que exige um processo produtivo intensivo, pela
acirrada concorrência comercial e pela perecibilidade do produto, o que impõe aos
produtores, rígidas exigências quanto à produção e comercialização, principalmente quanto
há necessidade de se manter a quantidade, a qualidade e a regularidade de oferta do
produto. A ocorrência de fitoviroses, em várias regiões produtoras tem sido apontada como
a principal responsável por frustrações de safra, prejuízos financeiros, infidelidade da
clientela e desabastecimento (BORGES, 2006).
Dependendo das condições ambientais e dos cuidados dispensados à cultura, as
fitoviroses podem ser responsáveis por grandes perdas de produção (RESENDE &
CUPERTINO, 1995).
A alface pode ser infectada por diversos vírus, o mais importante é o Lettuce
mosaic virus (LMV), pertencente à família Potyviridae, gênero Potyvirus, com ocorrência
generalizada em todas as regiões produtoras de alface do Brasil (ZERBINI, 1995).
O LMV apresenta uma ampla gama de hospedeiros, infectando 121 espécies
vegetais pertencentes a 60 gêneros e 17 famílias botânicas (DINANT & LOT, 1992). A
maioria das espécies hospedeiras desse vírus encontra-se na família Asteraceae, a qual
pertence à alface e chicória além de algumas centenas de espécies de plantas invasoras
que podem ser reservatórios naturais, como o Erigeron bonariensis (CHAVES et al., 2007).
O LMV é transmitido por pelo menos 25 espécies de afídeos de forma não
persistente, ou seja, durante a picada de prova e também pelas sementes de plantas de
alface infectadas (ZERBINI & MACIEL-ZAMBOLIM, 1999).
O primeiro relato de transmissão do LMV pela semente foi feito por NEWBALL
(1923), que verificou uma diferença na taxa de transmissão que variou tanto entre cultivares
e como dentro dos mesmos, indicando uma possibilidade de uma seleção de genótipos de
alface com baixa ou nenhuma transmissão do vírus via semente.
No Brasil e em muitos países europeus o LMV tem sido controlado por meio do
uso de cultivares resistentes. Já nos Estados Unidos, o controle é feito pelo uso de
sementes indexadas, associado ao manejo de plantas daninhas e períodos de vazio
sanitário (ZERBINI et al., 1995). Em regiões primárias de plantio, onde ainda não há
2
ocorrência do vírus, a utilização de sementes sadias pode retardar o estabelecimento da
doença (ZERBINI et al., 1995).
Para o manejo do LMV, observa-se a necessidade da procura de novos genes
que confiram resistência múltipla ou específica, uma vez que existem isolados de LMV, que
apresentam características biológicas e moleculares divergentes. A classificação de isolados
de LMV em patótipos foi proposta com base na capacidade dos isolados em infectar
cultivares contendo diferentes genes de resistência (PINK et al., 1992a). Isolados
pertencentes ao patótipo I infectam apenas cultivares que não possuem os genes de
resistência. Isolados pertencentes ao patótipo II (incluindo a estirpe típica) são capazes de
infectar cultivares que possuem o gene Mo2, mas não aqueles com os alelos mo11 e mo12.
Isolados pertencentes ao patótipo III superam a resistência conferida pelo gene Mo2 e pelo
alelo mo11. Porém, há relatos na Europa, Oriente Médio e Brasil de isolados que causam
sintomas de mosaico em plantas com os genes Mo2 e pelos alelos mo11 e mo12
classificados no patótipo IV, (REVERS et al., 1997; KRAUSE-SAKATE et al., 2002).
Considerando a identificação desses isolados de LMV que não são capazes de
contornar a resistência dos alelos mo11 e mo12 e de isolados que contornam a resistência
dos mesmos e, que podem ser transmitidos pelas sementes e por afídeos em cultivares
portadoras destes genes, foi proposta uma nova classificação para os isolados de LMV, em
dois subgrupos: LMV-Common e LMV-Most, respectivamente (KRAUSE-SAKATE et al.,
2004).
Em estudos comparativos do comportamento das cultivares de alface, plantadas
no Brasil, frente a isolados pertencentes ao patótipo II e patótipo IV atualmente classificados
respectivamente, no subgrupo LMV-Common e LMV-Most, foi relatada a habilidade do
patótipo IV atual LMV-Most, em contornar os genes que conferem resistência, infectando
sementes de genótipos suscetíveis e tolerantes (JADÃO et al., 2002). Além disso, os
mesmos autores verificaram que a taxa de transmissão pela semente desse subgrupo é
bastante elevada, chegando a 16,5% em cultivares de alface onde os genes de resistência
estão ausentes, e a 1,9% em genótipos contendo os alelos mo11 e mo12 (JADÃO et al.,
2002).
Novas perspectivas se abriram para o estudo da epidemiologia do LMV, desde
que isolados provenientes de alface apresentando recombinação entre os subgrupos LMVMost e LMV-Common foram descritos em condições naturais no Brasil (KRAUSE-SAKATE
et al., 2004).
O que torna importante os estudos para avaliar a presença do LMV em sementes
de alface, bem como da diferença da taxa de transmissão pelas sementes dos diferentes
3
isolados do vírus, tanto em variedades comerciais, quanto nas linhagens de alface
desenvolvidas visando à incorporação de genes de resistência.
4
2. OBJETIVOS
Avaliar a transmissão do LMV pelas sementes das variedades comerciais de
alface, enviadas ao Instituto Biológico pelo Ministério da Agricultura e das linhagens
pertencentes ao banco de germoplasma do Programa de Melhoramento de Alface do
IAC/APTA, obtidas em campo aberto na região de Monte Alegre do Sul.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Detectar a presença do LMV nas sementes de diferentes variedades comerciais e
linhagens de alface utilizando testes biológicos de transmissão mecânica para
planta indicadora;
2. Detectar a presença do LMV nas sementes das diferentes variedades comerciais
e linhagens de alface por intermédio da técnica de PTA-ELISA com antissoro
policlonal;
3. Identificar o subgrupo do LMV, do isolado estudado, utilizando biologia molecular.
5
3. REVISÃO DE LITERATURA
3.1 A cultura da Alface
A alface pertence à classe Magnoliopsida, ordem Asterales, família Asteraceae,
subfamília Cichorioideae, tribo Lactuceae, gênero Lactuca (WIKISPECIES, 2006). Originária
da região do mediterrâneo, a alface já era utilizada como planta medicinal há 4500 a.C.
Como hortaliça está registrada a sua utilização desde 2500 a.C. A planta foi trazida para o
Brasil pelos portugueses. As espécies silvestres trazidas na época ainda podem ser
encontradas em regiões de clima temperado, no sul da Europa e na Ásia Ocidental (GOTO;
TIVELLI, 1998).
Esta hortaliça apresenta um caule diminuto, não ramificado, ao qual se prendem
as folhas, relativamente grandes, lisas ou crespas, fechando-se ou não na forma de uma
“cabeça” (FILGUEIRA, 1982). As raízes são do tipo pivotante, com finas ramificações,
explorando apenas os primeiros 25 cm de solo (LIMA, 1986). É considerada uma cultura de
raízes densas e relativamente pouco profundas.
FILGUEIRA (1982) cita que a alface é, entre as hortaliças folhosas, a de maior
consumo e importância econômica, no Brasil. Entre os grupos mais consumidos no país, os
de folhas crespas vêm crescendo consideravelmente nos últimos anos, correspondendo a
46,43% do volume comercializado de 27.423 toneladas, no ano de 2006, pela CEAGESP
(AGRIANUAL, 2008).
Seu cultivo abrange 6570,20 hectares com uma produção de 4.097.697
engradados, com capacidade para 9 dúzias (IEA, 2007). No Brasil foram comercializadas,
no ano de 2007, 17 toneladas de sementes nuas e 34 toneladas de sementes peletizadas
(ABCSEM, 2007).
Por ser uma cultura originária de clima ameno, a alface não se desenvolve bem
em condições de altas temperaturas (CÁSSERES, 1980). Dias longos associados a
temperaturas elevadas aceleram o processo de pendoamento, o qual também depende da
cultivar (NAGAI & LISBÃO, 1980; MALUF, 1994). A tendência ao pendoamento mais rápido
ou lento caracteriza as cultivares como de inverno ou de verão. As cultivares de inverno,
quando cultivadas nessa época, normalmente formam cabeça ou roseta de folhas. Porém,
quando cultivadas no verão, emitem pendão floral precocemente, tornando-se impróprias
para o consumo, devido ao acúmulo de látex em suas folhas. Já as cultivares de verão
formam cabeça ou roseta de folhas normais, quando cultivadas tanto no inverno quanto no
verão (MALUF, 1994).
A cultura da alface é afetada por diversas doenças que causam prejuízos aos
produtores, dentre estas muitas são causadas por vírus.
6
3.2 Principais vírus que afetam a cultura da alface
A alface (Lactuca sativa L.) está entre as hortaliças de maior importância
econômica no Brasil.
As viroses, atualmente, podem ser consideradas como o maior problema
fitossanitário da cultura da alface e, dependendo das condições ambientais e dos tratos
culturais dispensados, podem ser responsáveis por perdas de até 100% (RESENDE E
CUPERTINO, 1995).
No Brasil, desde a década de 1940, foram relatados diferentes vírus infectando a
cultura da alface, que causaram quebra de produção. Tais ocorrências foram primeiramente
descritas nos arredores da capital de São Paulo, em áreas intensamente cultivadas. As
viroses descritas, até então eram transmitidas principalmente por sementes e afídeos
(KRAMER et al., 1945).
KITAJIMA (1986, 1993) compilou os vírus e enfermidades de plantas registradas
no Brasil a partir de 1911. Os vírus que ocorrem em alface, tendo por base este
levantamento, são: “Lettuce mottle sequivirus” – (LeMoV), “Lettuce mosaic potyvirus” –
(LMV), “Bidens mottle potyvirus” – (BiMoV), “Bidens mosaic potyvirus” – (BiMV), “Cucumber
mosaic cucumovirus” – (CMV), “Lettuce necrotic yellow cytorhabdovirus” – (LNYV) e o
“Tomato spotted wilt tospovírus” - (TSWV).
No Brasil, o vírus que causa maior dano econômico à cultura de alface e que
justifica a adoção de medidas de controle é o LMV (ZERBINI, 1995), sendo que se a
semente utilizada para plantio estiver infectada e as condições climáticas forem favoráveis à
presença de afídeos, as perdas podem chegar a 100% (ZERBINI, 1995). Assim, o controle
desta fitovirose reside principalmente na utilização de sementes isentas de vírus e utilização
de variedades tolerantes, com a ressalva de já existirem isolados capazes de causar
sintomas em alfaces tolerantes (JADÃO, 2001). No Estado de São Paulo a ocorrência do
Tomato chlorotic spot virus – TCSV (Tospovirus) também é um vírus limitante para a cultura
da alface (COLARICCIO et al., 2002).
7
3.3 A família Potyviridae
A família Potyviridae constitui, do ponto de vista econômico, o maior e mais
importante grupo de vírus de plantas cultivadas, com cerca de 16% das espécies de vírus de
plantas descritas até o momento (FAUQUET, et al.,2005). A família é dividida em seis
gêneros (Potyvirus, Bymovirus, Rymovirus, Ipomovirus, Macluravirus e Tritimovirus), de
acordo com a transmissão por vetor, sendo que a classificação em espécies é feita pela
organização do genoma (FAUQUET, et al., 2005). Os Potyviridae são encontrados em todo
o mundo e podem infectar mais de 2000 espécies de plantas. Todos os membros da família
induzem a formação de corpos de inclusões cilíndricas no citoplasma de células infectadas,
também denominadas “cata-ventos”, sendo esta uma característica que foi utilizada no
passado para classificar os potyvírus em quatro grupos de acordo com o tipo de inclusão
induzida (EDWARDSON et. al, 1984). Membros dessa família são facilmente transmitidos
mecanicamente de plantas infectadas para plantas sadias, pela inoculação do extrato
vegetal infectado ou por preparações virais purificadas (BERGER et al.,2005).
O gênero Potyvírus é o mais numeroso, com mais de 100 espécies descritas
(FAUQUET, et al.,2005). Em conjunto, essas espécies infectam uma ampla gama de
hospedeiros em diferentes regiões climáticas, causando grandes danos econômicos em
várias culturas. As espécies pertencentes a este gênero são transmitidas por afídeos de
modo não persistente (BOCK e CONTI, 1974; DIPIERO et al., 2006; FAUQUET et al.,2005).
As partículas virais são alongadas, flexuosas, medindo aproximadamente 690-760 nm de
comprimento por 11-16 nm de diâmetro. O material genético é composto por uma ou duas
moléculas de RNA de fita simples, sentido positivo. O RNA viral é envolto por
aproximadamente de 2.200 cópias de uma proteína capsidial com peso molecular de cerca.
34 kDa (SHUKLA et al., 1994).
A proteína capsidial dos potyvírus apresenta uma região amino-terminal altamente
variável em tamanho e seqüência, uma região central altamente conservada contendo de
215 a 227 aminoácidos, e uma região carboxi-terminal com 18-20 aminoácidos. As regiões
amino e carboxi-terminal estão voltadas para o exterior da partícula viral, e são responsáveis
pelas propriedades antigênicas da proteína e, consequentemente, da partícula viral
(SHUKLA et al.,1994). O RNA dos potyvírus é covalentemente ligado a uma proteína de
origem viral (genome-linked viral protein, VPg) em uma extremidade 5’ (RIECHMAN et
al.,1989) e apresenta uma cauda poliadenilada, de origem viral, em sua extremidade 3’
(ALLISON et al., 1986). O RNA genômico apresenta uma única fase aberta para leitura open
reading frame (ORF) localizada entre duas regiões não codificadoras denominadas 5’NTR e
3’NTR.
8
A tradução da ORF origina potencialmente uma poliproteína com peso molecular de
aproximadamente 350kDa (ALLISON et al., 1986), que é processada por meio da atividade
proteolítica de três proteases (P1, HC-Pro e NIa) contidas na própria seqüência, dando
origem a 8-10 produtos finais (CARRINGTON et al., 1990). As proteases P1 e HC-Pro
catalisam unicamente suas próprias clivagens cis, e também seis clivagens adicionais em
trans (DAROS & CARRIGTON, 1997). Uma característica das proteínas sintetizadas pelos
potyvírus é o seu caráter multifuncional. Cada proteína é geralmente responsável por várias
funções durante o ciclo de infecção (URCUQUI-INCHIMA et al.,2001).
3.4 O vírus do mosaico da alface Lettuce mosaic virus (LMV)
O LMV considerado o agente causal do mosaico de maior importância na cultura
de alface (PAVAN & KUROZAWA, 1997), encontra-se disseminado por todo o mundo
(DINANT & LOT, 1992). Os sintomas são o mosaico e deformação foliar, com conseqüente
redução do crescimento e queda na produtividade. Os sintomas apresentam variações
relacionadas a cultivar, o subgrupo do vírus e aos fatores ambientais, como temperatura, luz
e nutrição que podem influenciar a expressão dos sintomas (FRENCH & HEBERT, 1980).
O genoma de todo Potyvírus é composto de um único RNA de fita simples,
sentido positivo, com aproximadamente 10.000 nucleotídeos, apresentando uma proteína
(VPg) ligada covalentemente ao terminal 5’ e uma cadeia poliadenilada no terminal 3’
(REVERS et al., 1997).
A gama de hospedeiros é bastante ampla, infectando 121 espécies vegetais
pertencentes a 60 gêneros e 17 famílias botânicas (DINANT & LOT, 1992). A maioria das
espécies hospedeiras encontra-se na família Asteraceae, a qual pertence à alface (DINANT
& LOT, 1992). Além da alface, infecta outras culturas, entre elas, chicória espinafre, grão de
bico, ervilha, girassol (DINANT & LOT, 1992) e plantas da vegetação espontânea
pertencentes principalmente à família Asteraceae, como o Erigeron bonarienses (CHAVES
et al., 2002), Gazania spp. (ZERBINI et al., 1997) e Zinnia elegans (VEDOVELLO et al.,
1999).
O LMV pode ser transmitido por afídeos, por sementes de plantas infectadas e por
extrato vegetal. Diversas espécies de afídeos são capazes de transmitir o LMV, entre elas:
Myzus persicae, Aphis gossypii, Macrosiphum solanifolli e Uroleucon sonchi (COSTA,
1998). No entanto, a espécie que apresenta maior eficiência na transmissão é M. persicae
(EDWARDSON e CHRISTIE, 1991).
A transmissão do LMV por sementes representa na maioria das vezes a principal
fonte de inóculo primário na cultura (FILGUEIRA, 2000). A porcentagem de transmissão do
vírus pelas sementes de alface pode variar de acordo com o subgrupo do LMV e da cultivar
empregada (DINANT & LOT, 1992; JADÃO et al., 2002).
9
O subgrupo LMV-Common e LMV-Most apresentam grande variabilidade
biológica, na severidade dos sintomas, na transmissão pelas sementes e na capacidade em
quebrar os genes de resistência descritos em cultivares de L. sativa (JADÃO et al., 2002).
No Brasil e em muitos países da Europa o LMV tem sido controlado por meio do
uso de cultivares resistentes, as quais perfazem a grande maioria das cultivares plantadas.
Até o final da década de 1960, dois genes de resistência haviam sido identificados: o gene
recessivo g, encontrado na cultivar ‘Gallega de Invierno’ (BANNEROT et al., 1969), e o gene
recessivo mo, encontrado em um acesso selvagem de Lactuca proveniente do Egito
(RYDER,1970). Posteriormente, foi demonstrado que os genes g e mo constituem, na
verdade, dois alelos do mesmo gene (PINK et al., 1992a; PINK et al., 1992b). O gene g
passou a ser denominado mo11, e o gene mo passou a ser denominado mo12 (LE GALL,
2003). Estes genes foram incorporados a cultivares comerciais de alface no inicio dos anos
70, de forma que a grande maioria das cultivares plantadas atualmente no Brasil e na
Europa possuem o gene mo11, enquanto nos Estados Unidos possuem o gene mo12
(DINANT & LOT, 1992). Além dos dois alelos recessivos, algumas cultivares de alface
possuem o gene dominante Mo2, originalmente presente em Lactuca virosa (PINK et al.,
1992a).
Alguns isolados do LMV, na Europa, Oriente Médio e Brasil são capazes de
infectar cultivares contendo os alelos mo11 e mo12 (DINANT & LOT, 1992; PINK et al.,
1992a;PINK et al., 1992b; STANGARLIN et al., 2000). A classificação de isolados de LMV
em patótipos foi proposta com base na capacidade dos isolados em infectar cultivares
contendo diferentes genes de resistência (PINK et al., 1992a). Isolados pertencentes ao
patótipo I infectam apenas cultivares que não possuem os genes de resistência. Isolados
pertencentes ao patótipo II (incluindo a estirpe típica) são capazes de infectar cultivares que
possuem o gene Mo2, mas não aqueles com os alelos mo11 e mo12. Isolados pertencentes
ao patótipo III superam a resistência conferida pelo gene Mo2 e pelo alelo mo11. Isolados
pertencentes ao patótipo IV são capazes de suplantar a resistência proporcionada pelo gene
Mo2 e pelos alelos mo11 e mo12. A maioria dos isolados de LMV se enquadram no patótipo
II. Porém, os novos isolados recentemente relatados na Europa, Oriente Médio e Brasil
enquadram-se no patótipo IV, causando sintomas de mosaico em plantas contendo os
genes mo11 e mo12 (REVERS et al., 1997; KRAUSE-SAKATE et al., 2002 ).
Considerando a identificação de isolados de LMV em alface que não são
capazes de contornar a resistência dos genes mo11 e mo12 e de isolados que contornam a
resistência dos mesmos e, que podem ser transmitidos pelas sementes e por afídeos em
cultivares portadoras destes genes, foi proposta uma nova classificação para os isolados de
LMV, em dois subgrupos: LMV-Common e LMV-Most, respectivamente (KRAUSE-SAKATE
et al., 2002). Estes isolados encontram-se disseminados em diversos países da Europa e
10
América do Sul, incluindo o Brasil, e por serem capazes de transmissão via semente mesmo
em cultivares portadoras de genes de resistência, constituem um sério entrave à produção
de alface, uma vez que não foram identificadas fontes naturais de resistência aos isolados
da estirpe Most (KRAUSE-SAKATE et al., 2002).
Isolados do LMV-Most e LMV-Common podem ser detectados diferencialmente
por RT-PCR com oligonucleotídeos específicos (PEYPELUT et al., 2004).
3.5 Transmissão de vírus de plantas pela semente
Cerca de 20% dos vírus de plantas são transmitidos durante sucessivas
gerações por meio das sementes (MATTHEWS, 1991; MINK, 1993). No entanto pouco se
sabe sobre os mecanismos envolvidos. Na grande maioria dos casos, a semente oferece
uma efetiva barreira contra a passagem dos vírus, mesmo no caso daqueles que são
altamente infectivos. A despeito desta proteção, um apreciável número de vírus passa de
uma geração para a seguinte através da semente (BENNETT, 1969; SHEPHERD, 1972).
O processo de transmissão do vírus pela semente é um evento importante, pois é
uma das maneiras de introdução do vírus tanto em regiões onde não ocorria antes, como
também nas regiões onde já ocorre. É, muitas vezes, a única ou a principal alternativa
responsável pelas fontes de vírus que surgem nas plantações e a partir das quais ocorre a
disseminação dentro da área plantada (GASPAR, 1980).
Apesar dos fatores que levam à transmissão de um vírus de planta através da
semente não serem bem conhecidos. Muitas teorias têm sido propostas para explicar esse
fenômeno, sendo aquelas relacionadas com a distribuição do vírus nos tecidos infectados e
principalmente naqueles associados com a formação dos gametas e da semente são as que
recebem maior apoio, embora não haja evidência conclusiva a respeito (DUGGAR, 1930;
CALDWELL, 1934; BENNETT, 1940).
A maioria dos vírus transmitidos por semente é encontrado nos vários tecidos
que constituem a semente. Mas ao que tudo indica o fator crítico para a transmissão à
progênie é sua habilidade em invadir e sobreviver no embrião em algum estádio de sua
formação. Testes de polinização cruzada têm mostrado que a transmissão de vírus pelo
embrião pode ocorrer quando a planta-mãe sadia é polinizada com pólen oriundo de planta
infectada (NELSON e DOWN, 1933; MEDINA e GROGAN, 1961; LISTER e MURANT, 1967;
YANG e HAMILTON, 1974). Estes dados sugerem que a invasão do embrião provavelmente
ocorre por meio de uma das três maneiras seguintes: a) introdução do vírus no saco
embrionário pelo pólen; b)invasão do saco embrionário por vírus provenientes da planta
mãe; c)invasão direta do embrião.
É opinião da maioria dos pesquisadores que, a invasão do saco embrionário pelo
vírus que infecta a planta mãe é a que com maior freqüência leva à sua presença no
11
embrião (BENNET, 1969; YANG & HAMILTON, 1974; CARROLL & MAYHEW, 1976 a e b).
BENNET (1969) e SHEPHERD (1972) relataram a presença de vírus no pólen e no óvulo de
plantas infectadas com certa freqüência, com valores geralmente maiores para o óvulo.
Em estudos realizados por CARROLL (1981) com o Barley stripe mosaic virus –
BSMV (Hordeivirus) em cevada comprovou-se que o processo de transmissão do BSMV é
influenciado pela interação entre a temperatura, a estirpe do vírus e o estádio de
desenvolvimento da planta na infecção. No entanto, em secções ultrafinas de anteras e
grãos de pólen, observadas ao microscópio eletrônico de transmissão verificou-se que o
vírus invade primeiramente o meristema floral da hospedeira e subseqüentemente as
células-mães dos grãos de pólen e as células espermáticas. As evidências apresentadas
pelo autor do trabalho sustentam a hipótese de BENNETT (1969) de que a transmissão pela
semente pode depender da capacidade do vírus de infectar primeiramente o meristema
floral e subseqüentemente invadir os gametófitos, tanto masculino quanto feminino, estes
resultados sugerem que a transmissão pela semente pode ocorrer de forma direta ou
indireta (CARROLL, 1981).
A transmissão direta se dá pela invasão do embrião após a fertilização, enquanto
a indireta é mediada pela infecção de gametas antes da fertilização. Em alguns casos, como
o do BSMV em cevada, ambos os processos podem ocorrer simultaneamente (MAULE &
WANG, 1996). Para que a invasão direta do embrião imaturo ocorra, as partículas virais
precisam atravessar o limite entre os tecidos maternos e da progênie (embrião).
Somente após os primeiros estudos de transmissão pela semente no
patossistema Pea seed-borne mosaic virus – PSbMV (Potyvirus) em ervilha foi possível
propor um modelo que explicasse esse processo. O PSbMV é um dos muitos potyvírus que
são transmitidos pela semente de leguminosas que são de grande importância econômica
(RAGBIR & MAURY, 1987). Um estudo de transmissão do PSbMV realizado utilizando duas
cultivares de ervilha, comprovou que o vírus foi encontrado em tecidos florais antes da sua
fertilização (WANG & MAULE, 1992). Todavia, não foram encontradas partículas virais nos
grãos de pólen, nem nos óvulos. Foi sugerido que a transmissão do PSbMV pela semente,
pode ocorrer apenas durante o desenvolvimento do embrião por uma “janela” que pode
sofrer influências ambientais. A invasão do embrião pelo PSbMV é evidenciada pela
presença de um tecido conectivo transiente denominado suspensor, que é uma estrutura
que está relacionada ao suporte nutricional do embrião em desenvolvimento. O suspensor
surge entre os tecidos da planta-mãe e do óvulo após a fertilização, a sua degeneração
"fecharia a janela" para a transmissão do vírus pela semente. De acordo com esse modelo,
não ocorre infecção viral dos tecidos que formarão o embrião antes da fertilização (WANG &
MAULE, 1992).
12
Entretanto,
outros
autores,
trabalhando
com
patossistemas
distintos,
encontraram resultados diferentes. SCHIPPERS (1963) detectou alta taxa de infecção (80%)
de óvulos de Phaseolus vulgaris L. cv. Beka, pelo Bean common mosaic virus - BCMV
(Potyvirus) antes da fertilização. Porém, a taxa de transmissão do vírus pela semente foi de
apenas 15%. O mecanismo de transmissão do Tobacco ringspot virus - TRSV (Nepovírus)
pela semente de soja foi estudado em óvulos coletados um dia antes do florescimento.
Foram encontradas partículas virais no embrião, demonstrando um processo indireto de
transmissão via óvulo antes da polinização. Os autores realizaram experimentos de
polinização cruzada, os quais sugeriram que a infecção dos megagametófitos é o principal
fator envolvido na transmissão pela semente (YANG & HAMILTON, 1974).
No entanto, poucos trabalhos foram realizados visando elucidar o mecanismo de
transmissão do LMV pela semente de alface. Por meio de cruzamentos entre plantas sadias
e infectadas utilizando plantas com esterilidade masculina, foi evidenciada a capacidade de
transmissão via óvulo, alcançando taxas de transmissão superiores a 5%, enquanto a taxa
de transmissão via pólen foi inferior a 0,5% (RYDER, 1964). A localização do LMV em
embriões imaturos de alface em secções ultrafinas foi investigada por meio de
imunomarcação (HUNTER & BOWYER, 1994). Os autores encontraram partículas virais em
todos os tecidos do óvulo, exceto no saco embrionário. Contudo, não é sabido se as
partículas de LMV presentes nos tecidos não-embrionários necessariamente tornam a
semente infectada. Os autores sugerem que a combinação isolado/cultivar utilizada pode
não ter sido adequada para a infecção do tecido embrionário (ROBERTS et al, 2003).
3.6 Principais medidas empregadas para a comercialização de sementes
A primeira lei fitossanitária relativa à quarentena de plantas foi promulgada na
França, em 1881 (STAKMANN & HARRAR, 1957). O primeiro acordo internacional sobre
fitossanidade foi firmado na Europa, com a finalidade de prevenir a introdução do inseto
Phylloxera vitifoliae (Hemíptera: Phylloxeridae) em videira. No Brasil, o início das atividades
dos serviços oficiais fitossanitários se deu com o surgimento do que hoje é o Departamento
de Defesa e Inspeção Vegetal (DDIV) da Secretaria Nacional de Defesa Agropecuária
(SNAD), órgão do Ministério da Agricultura, do Abastecimento e da Reforma Agrária
(MAARA). Naquela ocasião, as campanhas fitossanitárias nacionais foram às primeiras
manifestações de preocupação com esses problemas no país (ALVES, 1980).
Atualmente, além das atividades de defesa vegetal a cargo do MAARA, que
detém jurisprudência sobre todo material vegetal transitando no país, há instituições de
pesquisa que, por delegação do próprio Ministério, realizam introdução e intercâmbio de
germoplasma vegetal, e que conseqüentemente são encarregadas da quarentena desse
material, como o Instituto Biológico (IB), Coopersucar, a comissão executiva do plano da
13
lavoura cacaueira (CEPLAC), a coordenadoria da assistência técnica integral (CATI)
(MARINHO, et al, 1991), assim como o centro nacional de pesquisa de recursos genéticos e
biotecnologia (CENARGEN) da empresa brasileira de pesquisa agropecuária (EMBRAPA).
A quarentena vegetal visa prevenir a entrada de organismos nocivos em áreas
indenes. É apoiada por leis nacionais e fundamentada em princípios biológicos. O Cenargen
executa a quarentena de germoplasma vegetal introduzido no Brasil destinado aos
programas de melhoramento genético do SNPA (KIMATI, 1978).
A agricultura brasileira tem se beneficiado da introdução de acessos de
germoplasma de diversas espécies vegetais, permitindo ao país obter variedades adaptadas
às nossas condições edafoclimáticas e resistentes a pragas. No entanto, o movimento de
germoplasma vegetal inevitavelmente envolve riscos de introdução de pragas em áreas
livres das mesmas. Importações inadvertidas de material vegetal têm causado sérios
prejuízos à agricultura brasileira. A quarentena de material vegetal evita a introdução e a
disseminação de pragas agrícolas, sendo a maneira mais eficiente de proteger a agricultura
e o ambiente do ingresso de pragas quarentenárias (BATISTA et al., 2002).
As medidas quarentenárias aplicadas aos produtos vegetais podem ser de
exclusão ou erradicação. Em caso de exclusão, os riscos de entrada dos agentes
patogênicos são minimizados pelo controle da sua ausência no material vegetal antes da
importação. Ao contrário, a erradicação autoriza a aplicação de tratamentos térmicos,
químicos, biológicos ou de limpeza através da cultura de tecido, quando a espécie vegetal
foi introduzida no país importador (MARINHO et al., 2003).
Por definição, uma praga quarentenária é um organismo de risco econômico
potencial para a área posta em perigo e onde ainda não está presente ou, se está não se
encontra amplamente distribuída e esta oficialmente controlada. Considera-se praga
quarentenária A1 aquela que não está presente no país ou na região. Praga quarentenária
A2 é aquela que apresenta distribuição limitada em uma área e esta oficialmente controlada.
Entende-se como área um país, parte de um país ou todas ou partes de vários países
oficialmente definidos (MARINHO et al., 2003).
Para decidir quais espécies são de importância quarentenária, para o país ou
região, várias informações devem ser consideradas. É necessário avaliar o potencial das
espécies exóticas introduzidas no país em questão. Esse processo é o componente
preliminar da Análise de Risco de Pragas (APR) (MARQUES et al, 1995).
Considerando a grande variabilidade genética que é própria das introduções de
germoplasmas, os cuidados fitossanitários nestes casos devem ser enfatizados, pois essa
variabilidade pode potencializar o risco da introdução de organismos nocivos, pela
possibilidade de sempre haver disponível um hospedeiro suscetível. Ao mesmo tempo, é
indesejável que esses organismos impeçam a expressão das características do
14
germoplasma ou mesmo inviabilizam sua utilização nos programas de melhoramento
(MARQUES et al, 1995).
A maioria do material vegetal é introduzido sob a forma de sementes. Portanto,
existe uma grande necessidade em saber quais são as pragas que podem ser transmitidas
por essas sementes. Por razões ainda não esclarecidas, apenas cerca de 1/3 dos vírus
vegetais conhecidos são transmitidos dessa forma (BATISTA et al., 2002).
Para agilizar os procedimentos quarentenários de um laboratório de virologia, é
fundamental saber quais os vírus que podem ser transmitidos pelas sementes que estão
sendo introduzidas. Outras informações como distribuição geográfica, sintomas no
hospedeiro natural e plantas indicadoras de vírus e viróides são complementos importantes
para auxiliar o diagnóstico dos mesmos (BATISTA et al., 2002).
Dentre as sementes das principais culturas importadas pelo Brasil estão as de
alface, cuja sanidade no cultivo, depende da qualidade fitossanitária dessas sementes, uma
vez que o vírus que mais se dissemina na cultura da alface e que causa os maiores danos é
o LMV. Assim, este trabalho tem por objetivo avaliar a presença do LMV em sementes das
principais variedades comerciais e linhagens de alface, bem como propor uma amostragem
do número de sementes, que possibilite a detecção segura do vírus nas sementes.
15
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Local de realização dos experimentos
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Fitovirologia e Fisiopatologia
(LFF) e na casa de vegetação (LFF) do Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade
Vegetal (CPDSV), do Instituto Biológico, São Paulo.
4.2 Material vegetal
Foram utilizadas sementes de 17 variedades comerciais de alface, enviadas ao
Instituto Biológico pelo Ministério da Agricultura e 10 linhagens pertencentes ao banco de
germoplasma do Programa de Melhoramento de Alface do IAC/APTA, obtidas em campo
aberto na região de Monte Alegre do Sul, durante o ano de 2006 (Tabela 1). Como controle
positivo foram empregados dois isolados de LMV da Coleção de Fitovírus Karl Silberschmidt
(CoFiKS) do LFF , o isolado de alface Verônica de Embu-Guaçú (CoFiKS 18/1998) e o
isolado de alface Americana de Biritiba-Mirim (CoFiKS 20/1998), mantidos em tecido foliar
desidratado à -20°C (Tabela 2).
As sementes foram mantidas acondicionadas em sacos de papel laminados e
mantidas a 5ºC. A seleção das variedades deveu-se as características agronômicas e a
aceitação do mercado; já a seleção das linhagens considerando-se as suas características
agronômicas e por apresentarem sintomas de mosaico brando em ensaios realizados em
campo experimental do IAC-APTA de Monte Alegre do Sul. As linhagens utilizadas foram
provenientes do cruzamento entre o cultivar 'Regina' e o PI 342517 (‘Ancora’) cuja
genealogia está representada na Figura 1. O genitor ‘Regina’ possui o gene recessivo mo11
(anteriormente denominado g), incorporado pelo uso do cultivar Brasil 48 em sua genealogia
(Figura 2) (CHUNG, 2005).
16
Tabela 1: Variedades comerciais e Linhagens utilizadas no trabalho.
VARIEDADES COMERCIAIS DE ALFACE
Alface Crespa Gentilina (Itália/MAPA)
Alface
Romana
Bionda
Orotolani
(Itália/MAPA)
Alface
Romana
Branca
de
Paris Alface Banchu Red Fire (Japão/MAPA)
(Itália/MAPA)
Alface Little Green (EUA/MAPA)
Alface Kahuna (EUA/MAPA)
Alface OGR (Japão/MAPA)
Alface Kagraner (Itália/MAPA)
Alface Kaiser (Japão/MAPA)
Alface Mimosa Catalogna (Itália/MAPA)
Alface 28060 (Itália/MAPA)
Alface 27030 (Itália/MAPA)
Alface 367 (Itália/MAPA)
Alface 27010 (Itália/MAPA)
Alface 3620 (Itália/MAPA)
Alface 28531 (Itália/MAPA)
Alface 28140 (Itália/MAPA)
LINHAGENS DE ALFACE
Linhagem C07 (Monte Alegre/BAG/APTA) Linhagem C88 (Monte Alegre/BAG/APTA)
Linhagem C13 (Monte Alegre/BAG/APTA) Linhagem C44 (Monte Alegre/BAG/APTA)
Linhagem C20 (Monte Alegre/BAG/APTA) Linhagem C48 (Monte Alegre/BAG/APTA)
Linhagem C40 (Monte Alegre/BAG/APTA) Linhagem C52 (Monte Alegre/BAG/APTA)
Linhagem C42 (Monte Alegre/BAG/APTA) Linhagem C71 (Monte Alegre/BAG/APTA)
Tabela 2: Isolados do Lettuce mosaic virus utilizados no trabalho.
ISOLADOS DO Lettuce moisac virus
Isolado CoFiKS18/1998
Isolado CoFiKS 20/1998
17
Figura 1: Genealogia da série Brasil do IAC/apta
18
Figura 2: Genealogia do cultivar ‘Regina’
4.3 Obtenção da planta indicadora (Chenopodium amaranticolor) para o teste
biológico
A sementeira para obtenção da plantas indicadora (Chenopodium amaranticolor)
foi feita em caixa plástica, utilizando terra vegetal com semeadura a lanço coberta com terra
vegetal peneirada e mantida em observação até atingirem o estádio de quatro folhas
verdadeiras. Então, as plântulas foram transplantadas para vasos com volume de 150 ml,
contendo terra vegetal e foram mantidas em casa de vegetação pertencentes ao LFF.
4.5 Detecção do LMV em sementes por teste biológico
Os inóculos empregados nos testes de transmissão mecânica foram preparados
pela trituração em nitrogênio liquido das sementes das variedades comerciais e das
linhagens de alface em almofariz, adicionando-se PBS pH 7,4 (tampão fosfato de sódio e
potássio em salina) contendo sulfito de sódio 0,01 M. Utilizou-se 1g de sementes para cada
10 ml de tampão. Os inóculos foram preparados a baixas temperaturas, pela manutenção
dos almofarizes a -20 0C. As folhas foram polvilhadas com abrasivo (caborundum 600 mesh)
antes de serem friccionadas com o pistilo embebido no extrato bruto.
Para avaliação biológica das sementes foram inoculadas 5 plantas de C.
amaranticolor para cada variedade comercial e cada linhagem de alface, sendo que 5
19
plantas de C. amaranticolor foram utilizadas como controle negativo. As plantas foram
mantidas em casa de vegetação e a manifestação dos sintomas foi avaliada semanalmente
por 30 dias.
4.6 Detecção do LMV em sementes por PTA-ELISA
Para a detecção do LMV nas amostras de alface, utilizou-se a técnica sorológica
PTA-ELISA “Plate Traped Antigen” – “Enzyme Linked Immunosorbent Assay” (CLARK &
ADAMS, 1977).
Foram utilizados 1g de sementes de cada variedade comercial e de cada linhagem
de alface, cada amostra foi triturada em nitrogênio liquido e tampão carbonato (0,015M de
Na2CO3, 0,035M NaHCO3, pH 9,6) na razão de 1:10 (p/v), sendo aplicados 100µL do extrato
de cada amostra em placa de ELISA. Foi utilizada uma triplicata por amostra. As placas
foram incubadas por 2h a 37ºC, e lavadas com PBS-Tween (0,0015M KH2PO4, 0,14M NaCl,
0,004M Na2HPO4, 0,003M KCl, pH 7,4.acrescido de 0,5mL Tween 20%). Após a lavagem,
foram aplicados, nos poços, 100µL de antissoro policlonal contra o LMV, diluído na
proporção de 1:1000 (v/v) em Tampão Fosfato 0,05M pH7,4 acrescido de 0,5% de Tween®
20 e 2% polivinilpirrolidona (PBS-TPo). A placa foi novamente incubada a 37ºC por 2h,
sendo lavada e acrescentando-se a seguir 100µl do conjugado (“anti-rabbit IgG Alkaline
Phosphatase” Sigma), anti-imunoglobulina de coelho conjugada à enzima Fosfatase Alcalina
diluída a 1/3000 (v/v) em PBS-TPo incubando-se por 2 h a 37 °C. Após a lavagem foram
adicionados, nos poços 100µl do substrato da enzima p-nitofenil fosfato (“Phosphatase
Substrate” Sigma), diluída em Tampão Substrato (9,7%mL de dietalonamina; 0,02g de
cloreto de magnésio; 0,02g de azida sódica em 100mL de água destilada, pH 9,8) na
proporção de em 1mg/ml. O controle negativo foi de plântulas de alface sadias provenientes
de sementes certificadas germinadas em câmara de crescimento (BOD). Os controles
positivos foram os isolados CoFiKS 18/1998 e CoFiKS 20/1998. A leitura de absorbância à
405nm em leitor de ELISA “Multiskan Microplate Reader Bio-Rad Modelo 3550 UV” (BioRad) foi realizada 30 minutos após a adição do substrato. Os resultados foram obtidos
dividindo-se o valor médio da absorbância da leitura de cada amostra infectada (I), pelo
valor médio obtido da leitura da amostra controle sadia (S). Os valores de I/S iguais ou
superiores a três foram considerados positivos.
20
4.6 Testes moleculares
4.6.1
Extração do RNA Total
A extração do RNA total foi realizada utilizando o reagente Trizol®, seguindo
indicações do fabricante (INVITROGEN). 100µg de tecido foliar coletados de plantas de C.
amaranticolor apresentando sintomas de mosaico foram trituradas em nitrogênio liquido e
transferidos para microtubos de 1,5mL. Foi adicionado as amostras 1mL de reagente Trizol®
e as amostras foram homogeneizadas. Após, procedeu-se uma centrifugação a 12,000 x g
por 10 minutos a 4ºC e incubação das amostras por 5 minutos em banho de gelo. Foi
adicionado a solução 200µL de clorofórmio e as amostras foram agitadas vigorosamente por
15 segundos e incubadas em banho de gelo por 5 minutos. As amostras foram
centrifugadas a 12,000 x g por 15 minutos a 4ºC e o sobrenadante foi transferido para novos
tubos, sendo adicionados 500µL de álcool isopropílico. As amostras foram incubadas
novamente por 10 minutos em banho de gelo e posteriormente centrifugadas a 12,000 x g
por 10 minutos a 4ºC. O precipitado resultante foi lavado com etanol 75%. A mistura foi
agitada vigorosamente e centrifugada a 7,000 x g por 5 minutos a 4ºC. O precipitado foi
seco em temperatura ambiente e depois suspendido em água destilada deionizada estéril.
As amostras foram conservadas a -20ºC. Como controle negativo, foi realizada extração de
RNA de uma planta de C. amaranticolor sadia.
4.6.2
Reação de transcriptase reversa seguida de reação em cadeia de
polimerase (RT-PCR)
As extrações de RNA Total foram submetidas a RT-PCR utilizando par de
oligonucleotídeos iniciadores (primers) específicos para o LMV (Tabela 3). Este par de
primers foi desenhado para amplificar em reação do PCR um fragmento correspondente à
região 3’ codificadora da proteína NIb e a região 5’ codificadora da proteína capsidial do
LMV.
A reação de transcrição reversa foi realizada utilizando 4,0 µL de RNA total, 0,5
µL de oligo dT e 5,5 µL de água destilada deionizada estéril. A mistura foi submetida a 70 °C
por 5 minutos para desnaturação do RNA e, imediatamente, colocada em banho de gelo,
para evitar a renaturação do mesmo. Adicionou-se a mistura 5 µL de tampão 5X da
transcriptase reversa (PROMEGA), 0,5 µL de mistura de dNTPs (2,5mM cada), 1,0 µL de
transcriptase reversa (M-MLV-PROMEGA) e 8,5 µL de água destilada deionizada estéril. A
mistura foi submetida a 42 °C por 1 h para obtenção do DNA complementar (cDNA).
A reação de PCR foi feita utilizando o kit GoTaq® Flexi DNA Polymerase
(PROMEGA). Foi utilizado 5 µL do cDNA , 10 µL do tampão 5X GoTaq® Flexi Buffer, 1,0 µL
de mistura de dNTPs (2,5mM cada), 1,0 µL de cada primer (1,0 µM), 4,0 µL de MgCl2 (2,0
mM) e água destilada deionizada para um volume final de 50 µL.
21
Os produtos da PCR foram visualizados por meio de eletroforese em gel de
agarose (1,5%) contendo brometo de etídio (1,5 µg/mL).
Tabela 3: Oligonucleotídeos utilizados para amplificação dos vírus nas análises de RT-PCR.
Nome dos
Posição no
Sequência
Tamanho do
iniciadores
genoma do
produto de
(primers)
LMV
amplificação
09171m
9171
5’GCGTTGATGTCGTCATCYTT 3’
08894p
8894
5’CCGTACATAGCIGARTGTGCT 3’
278 pb
*Fonte: KRAUSE-SAKATE et al.,2002.
4.6.3
Digestão dos produtos da RT-PCR
Os produtos da RT-PCR foram purificados utilizando o QIAquick® PCR
Purification Kit, de acordo com as indicações do fabricante (QIAGEN). O DNA purificado foi
digerido com a enzima Eco RI na seguinte proporção: 17,6 µL de DNA purificado, 2 µL do
tampão React®3 e 0,4 µL de enzima Eco RI. A reação foi incubada por 2 h a 37 °C e
visualizada em gel de agarose 2% contendo brometo de etídio (1 µg/mL) (AUSUBEL et al.,
1999).
22
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Transmissão mecânica e avaliação de sintomas
As plantas de C. amaranticolor foram avaliadas para a visualização de sintomas,
até 30 dias após a inoculação com o extrato das sementes das variedades comerciais e das
linhagens de alface. Dentre as variedades comerciais avaliadas nenhuma delas induziu
sintomas nas plantas de C. amaranticolor, e nas linhagens avaliadas, apenas a linhagem
C13 foi positiva induzindo sintomas de anéis cloróticos locais e mosaico sistêmico em
plantas de C.amaranticolor (Figura 3). Os isolados LMV CoFiKS 18/1998 e CoFiKS 20/1998,
empregados como controle positivo manifestaram sintomas de mosaico sistêmico (Figuras 4
e 5).
Quando se pretende fazer uma avaliação de perdas, provocadas por um
determinado vírus na planta hospedeira cultivada, não se pode deixar de considerar a
variabilidade biológica e molecular do vírus. Um mesmo vírus pode ter subgrupos que
induzem sintomas com diferentes severidades e que são capazes de infectar certas
variedades ou espécies (PINK et al., 1992).
Apesar dos vírus poderem causar uma série de diferentes sintomas na planta
hospedeira suscetível, os sintomas observados externamente nessa planta são os que
servem como indícios da presença da doença no campo. Alguns dos sintomas morfológicos
ou externos provocados por vírus são bastante característicos, de modo que podem permitir
a sua diagnose imediata. No entanto, nem todos os vírus induzem sintomas característicos
que permitem a sua diagnose pela inspeção visual das plantas (FIGUEIRA, 2000).
Algumas espécies de hospedeiras têm sido utilizadas como indicadoras para a
presença de LMV, por apresentarem sintomas característicos de lesão local e sistêmica,
como as espécies C. quinoa e C. amaranticolor, sintomas sistêmicos como Nicotiana
benthamiana e sintoma local como Gomphrena globosa (ZERBINI et al., 1995).
A manifestação dos sintomas do LMV pode ser alterada de acordo com os
fatores ambientais, como temperatura e luminosidade (RYDER, 1979). Em temperaturas
elevadas, o número de plantas sem sintomas é maior (RYDER, 1979). Entretanto, apesar da
avaliação biológica ser simples, é uma técnica demorada e nem sempre apresenta absoluta
precisão nos resultados (FIGUEIRA, 2000).
23
Figura 1: C. amaranticolor inoculado com a linhagem C13, sintomas localizados
de anéis cloróticos e mosaico.
Figura 2: C. amaranticolor inoculado com o isolado LMV CoFiKS 18/1998, com
sintoma de mosaico sistêmico.
24
Figura 3: C. amaranticolor inoculado com o isolado LMV CoFiKS 20/1998, com
sintomas de mosaico sistêmico.
5.2 Teste Sorológico
O resultado da leitura dos testes de PTA-ELISA foi negativo para a presença do
LMV para todas as amostras comerciais e para 9 das linhagens avaliadas. Mas, foi positivo
para a linhagem C13 e para os controles positivos LMV CoFiKS 18/1998 e CoFiKS 20/1998.
A principal dificuldade, que constitui um fator decisivo na eficiência dos testes de
diagnose, é a sensibilidade da técnica empregada, uma vez que, além da baixa
concentração de partículas virais nas sementes, geralmente a porcentagem de sementes
infectadas varia entre 5 e 15%. A localização da partícula viral na semente também pode
interferir na eficiência da técnica diagnóstica. O TMV (Tobacco mosaic virus), por exemplo,
se localiza na parte externa das sementes, enquanto o LMV se localiza nos tecidos
embrionários, devido à infecção do óvulo ou do grão de pólen (GROGAN, 1980).
A taxa de transmissão do LMV pelas sementes de alface varia de 1,33 a 16,5%,
de acordo com o subgrupo e o cultivar utilizado (DINANT & LOT, 1992; JADÃO et al.,2002).
Em estudo realizado por FALK & PURCIFULL (1983), vários fatores como o tipo
de placa, a concentração da imunoglobulina e a preparação das amostras podem afetar a
confiabilidade do teste de PTA-ELISA para o LMV. Estes autores, verificaram ainda que não
houve diferença de detecção do LMV, ao indexar lotes de sementes de variedades
comerciais, simultaneamente, por teste biológico e por PTA-ELISA. Apesar de o PTA-ELISA
ser um teste mais rápido e fácil de ser executado.
25
A técnica de PTA-ELISA é amplamente utilizada na diagnose de fitoviroses,
porém, não é suficientemente sensível na diagnose de determinadas viroses podendo levar
a conclusões equivocadas a respeito da identidade de um vírus desconhecido. Embora a
sorologia seja amplamente utilizada, as técnicas moleculares vêm se tornando cada vez
mais comum, e a tendência é de que seu uso seja crescente (ZERBINI et al., 2001).
O papel da transmissão do LMV via semente na epidemiologia do mosaico da alface
é conhecido (GROGAN et al.,1952; GROGAN, 1980), sendo de extrema importância para o
controle do LMV em alface, o uso de sementes livres de vírus. Antes da adoção do uso de
sementes indexadas, havia muitas quebras de produção nos cultivos de alface (GROGAN,
1980).
Uma das medidas de controle do LMV é baseada na utilização de sementes
certificadas (KRAUSE-SAKATE, 2001). TOMLINSON (1992) observou que a porcentagem
de plantas com sintoma de mosaico no campo está diretamente relacionada com a
porcentagem de sementes infectadas com o LMV. Com os resultados obtidos, concluiu que
sementes apresentando porcentagens de infecção superiores a 0,1% não devem ser
consideradas aptas para a certificação, pois sementes com taxas de infecção entre 2,2 e
3,3% propiciaram no campo 25 a 96% de plantas com sintoma de mosaico.
Na América do Norte, onde a principal estratégia para controle do mosaico da
alface é o uso de sementes livres de vírus (GROGAN, 1980), a quebra da resistência por
isolados ainda não foram detectados (ZERBINI et al.,1995; ZERBINI & GILBERTSON,1995).
Assim, a pressão de seleção, devido ao uso de cultivares resistentes pode desempenhar um
papel no surgimento e seleção de novas cepas virais (ZERBINI et al., 1995).
5.3 Testes Moleculares
As reações de RT-PCR das amostras da Linhagem C13 e dos isolados LMV
CoFiKS 18/1998 e CoFiKS 20/1998, amplificaram produtos de aproximadamente 280 pb,
como esperado para o par de primers utilizado na reação. Isto confirma a presença do LMV
nas amostras testadas (Figura 5). Não foi observada a presença de produtos de
amplificação para o controle negativo.
Quando realizada a digestão dos produtos da RT-PCR, não foi visualizada a
digestão dos fragmentos de aproximadamente 280 pb. Este fato demonstra que os produtos
da RT-PCR não contêm em sua seqüência o sítio de restrição para a enzima EcoRI
(GAATTC), que é esperado para o subgrupo do LMV-Most (REVERS et al., 1999). O padrão
de bandas esperado para a digestão é de 194 pb e 84 pb. PEYPELUT et al., (2004)
analisaram 204 amostras de alface para a detecção do LMV e observaram que os isolados
do LMV-Most avaliados possuíam o sítio de restrição para a enzima Eco RI, demonstrando
que a técnica pode ser empregada para a diferenciação do subgrupo LMV-Most do
26
subgrupo LMV-Common. Portanto, a Linhagem C13 e os isolados de LMV CoFiKS 18/1998
e LMV CoFiKS 20/1998 analisados, podem ser classificados como pertencentes ao
subgrupo LMV-Common, baseando-se nesta metodologia.
Figura 6: Perfil eletroforético dos produtos da RT-PCR. Observou-se a presença de bandas
de aproximadamente 280pb nas colunas 1 (linhagem C13), 2 (isolado CoFiKS 20/1998) e 3
(isolado CoFiKS18/1998). Na coluna 4 (controle negativo) não se observou a presença de
bandas.
Pode-se observar que não foi diagnosticada a presença de LMV-Most em
qualquer das amostras analisadas. Este resultado está de acordo com levantamentos
realizados no estado de São Paulo (FIRMINO et al, 2005) em que se verificou prevalência
do subgrupo LMV-Common em relação ao LMV-Most. Apesar de este último ter adquirido a
capacidade de contornar a resistência dos genes recessivos mo11 e mo12, não parecem
estar tão adaptados quanto ao LMV-Common, de modo que em nossas condições onde
ainda predomina o cultivo de alfaces suscetíveis e existe baixa pressão de seleção para
contornar estes genes de resistência, faz com que o LMV-Common ocorra com maior
incidência no campo.
Considerando-se a identificação do LMV-Common na linhagem experimental C13
e nos isolados LMV CoFiKS 18/1998 e LMV CoFiKS 20/1998 pode-se inferir que a linhagem
experimental C13, a alface ‘Verônica’- isolado CoFiKS 18/1998 e a alface Americana isolado CoFiKS 20/1998, não possuam o gene Mo2 ou que a resistência por ele conferida
tenha sido contornada.
Os isolados do LMV pertencentes ao subgrupo LMV-Most e LMV-Common
podem ser detectados diferencialmente via RT-PCR com oligonucleotídeos específicos
(PEYPELUT et al., 2004). Utilizando essa estratégia, em levantamento realizado nas
principais regiões produtoras de alface do estado de São Paulo entre 2003 e 2005,
FIRMINO et al. (2005) verificaram a incidência de isolados do LMV pertencentes aos dois
27
subgrupos sendo 11% positivas para o LMV-Most, e 25% positivas para o LMV-Common
(FIRMINO et al., 2005).
Medidas de controle para o LMV seriam a obtenção e o emprego de plantas
resistentes (RYDER, 1968). De acordo com PAVAN & KUROZAWA (1997), as cultivares
‘Gallega de Inverno’ e ‘PI-251245’ apresentam tolerância ao mosaico causado por LMV-II,
regida por genes recessivos. Assim, tanto na Europa como no Brasil, o controle do LMV vem
sendo feito através da utilização de cultivares resistentes (ZERBINI, 1997), ou seja, plantio
de cultivares portadoras dos genes de resistência recessivos mo11 e mo12 (KRAUSESAKATE, 2001). No Brasil, se utiliza basicamente cultivares com o gene mo11, enquanto
que nos Estados Unidos e Europa adota-se a certificação de sementes juntamente com
cultivares de alface portadoras do gene mo12. O gene mo11 foi inicialmente incorporado nas
cultivares de série Brasil lançada pelo Instituto Agronômico de Campinas-IAC, e
posteriormente em outras cultivares como Elisa (lisa), Gisele e Wanda (crespa) (PAVAN, et
al., 2005).
Porém, no início da década de 1990, isolados de LMV capazes de contornar a
resistência conferida pelos genes mo11 e mo12 foram detectados, inicialmente na Europa e
no Oriente Médio (PINK et al., 1992) e mais recentemente no Brasil (STANGARLIN et al.,
2000).
Em experimentos de indexação de sementes, provenientes de plantas infectadas
pelo LMV-II (atual LMV-Common) e pelo LMV-IV (atual LMV-Most), realizados no Brasil, a
taxa de transmissão do isolado AF199 LMV- IV (atual LMV-Most) foi bastante elevada,
chegando a 16,5% em cultivares de alface onde os genes de resistência estão ausentes, e a
1,9% em genótipos contendo os alelos mo11 e mo12 (JADÃO et al., 2002). O subgrupo LMVCommon não infecta plantas contendo os alelos de resistência recessivos.
A capacidade de quebra de resistência aliada à transmissão pela semente torna
esses subgrupos uma séria ameaça para a cultura da alface, por facilitar sua disseminação
à longa distância do vírus por meio do comércio internacional de sementes. Até o presente
momento não foram identificadas fontes naturais de resistência ao subgrupo Most.
O papel da transmissão do LMV por sementes na epidemiologia do mosaico da
alface é de extrema importância, sendo o uso de sementes livres de vírus para o controle do
LMV em alface uma das medidas mais eficientes. Pois, antes da adoção do uso de
sementes indexadas, havia muitas quebras de produção nos cultivos de alface (GROGAN et
al.,1952; GROGAN, 1980). Inicialmente, as tentativas de controle do LMV eram realizadas
pelo uso de sementes com nível de tolerância inferior a 0,1%, porém o controle completo só
foi atingido pelo uso de sementes indexadas para a transmissão do LMV de 0 em 30.000
(GROGAN, 1983).
28
Pelos resultados negativos obtidos neste trabalho, para as cultivares comerciais
importadas da Europa, Estados Unidos e Japão, pode-se inferir que o programa de
indexação de sementes empregado pelas empresas esta sendo eficiente e esta
contornando a entrada de inóculo primário nos cultivos de alface, bem como os testes de
indexação realizados pelos laboratórios nacionais também tem se mostrado eficientes na
indexação dos materiais importados.
O LMV ocorre em todo o mundo, muito provavelmente devido ao intercâmbio
mundial de sementes. A porcentagem de infecção nas sementes colhidas a partir de plantas
infectadas pode atingir até 30% das sementes produzidas pela planta, o que mostra a
importância da utilização de um controle rigoroso na produção de sementes desta espécie.
O uso de cultivares com resistência ao LMV tende a reduzir significativamente a incidência
da doença. A produção de sementes de alface, assim como da própria alface oriunda de
sementes produzidas no Brasil, era praticamente inviável até a década de 1960, isto em
razão das primeiras fontes de resistência (alelo recessivo mo11, anteriormente denominado
g) ao LMV em alface, terem sido identificadas no final da década de 60, aliada a pressão de
inóculo no campo principalmente devido a presença de afídeos, plantas hospedeiras e
condições climáticas (BANNEROT et al.1969).
Por mais de 20 anos a resistência genética condicionada pelos alelos de
resistência mo11 e mo12, foi classificada como durável, sendo responsável pela baixa
incidência de mosaico. No entanto, estudo realizado com esses cultivares possibilitou a
identificação da ocorrência de uma nova variante do LMV, denominado patotipo IV (atual
LMV-Most), capaz de quebrar a resistência conferida pelos genes presentes nesses
materiais (STANGARLIN et al.,2000).
A introdução de germoplasma através de sementes é o meio mais empregado,
porém há um grande número de doenças transmissíveis pela semente e em alguns casos a
sua detecção é mais difícil do que em material de propagação vegetativa (ROCHA, 1985).
Portanto, métodos de diagnóstico com alta sensibilidade são de extrema importância para a
indexação de vírus em material vegetal com trânsito entre diferentes países.
29
6. CONCLUSÃO
•
Pelos resultados obtidos pode-se concluir que os métodos biológicos e
sorológicos possuem a mesma sensibilidade para avaliar a presença do LMV
em extrato bruto de sementes;
•
O tipo de placa, a concentração da imunoglobulina e a preparação dos
extratos das amostras podem ter afetado a confiabilidade do teste de PTAELISA para o LMV;
•
A identificação do subgrupo LMV-Common e LMV-Most pode ser realizada
pela RT-PCR seguida pela digestão enzimática com a EcoRI;
•
Nas amostras de sementes avaliadas foi detectado o LMV-Common somente
na linhagem experimental C13.
30
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABCSEM- Associação Brasileira de Sementes e Mudas, <www.abcsem.com.br>, acesso
em 2009.
AGRIANUAL. Anuário da agricultura brasileira. São Paulo: FNP consultoria e
agroinformativos. 2007. 491p.
ALVES, H.T. Campanhas Fitossanitárias Nacionais. In: Encontro nacional de
fitossanitaristas, 1., 1980, Campinas. Anais...Campinas:[s.n.], 1980.p. 15-27.
ALLISON, R.F.; JOHNSTON, R.E.; DOUGHERTY, W.G. The nucleotide sequence of the
coding region of tobacco etch virus genomic RNA: evidence for the syntesis of a single
polyprotein. Virol., 154: 9-20, 1986.
AUSUBEL, F.M., R. BRENT, R.E. KINGSTON, D.D. MOORE, J.A. SMITH & K. STRUHL.
1999 (eds). Short protocols in molecular biology. New York, John Wiley & Sons.
AZEVEDO FILHO, J. A.; NAGAI, H.; MELO, A .M. T.; YUKI, V.A . Melhoramento de
alface tipo manteiga visando resistência ao tospovírus do vira – cabeça In: 38º
Congresso Brasileiro de Olericultura, Petrolina – PE, 26-31 de julho de 1998.
BANNEROT, H., BOULIDARD, L., MARROU, J. E DUTEIL, M. Studies on the inheritance
of tolerance to Lettuce mosaic virus in the Lettuce variety Gallega de Invierno (in French).
Annals de Phytopathologie, v. 1, p.219-226. 1969.
BATISTA, M.F.; MARINHO, V.L.A. Vírus e Viróides transmitidos por sementes.
EMBRAPA. Brasília, 2002.
BERGER, P.H & PIRONE, T.P. The effect of helper component on uptake and
localization of potyvirus in Myzus persicae. Virology 153:256-261.1986.
BERGER, P.H.; ADAMS, M.J.; BARNETT, O.W.; BRUNT, A.A.; HAMMOND, J.; HILL,
J.H.; JORDAN, R.L.; KASHIWAZAKI, S.; RYBICKI, E.; SPENCE, N.; STENGER, D.C.;
OHKI, S.T.; UYEDA, I.; VAN ZAAYEN, A.; VALKONEN, J.P.& VETTEN, H.J. Family
Potyviridae, In:Virus Taxonomy. Report of the International Committed on Taxonomy of
Viruses. Springer-Verlag. 819-841. 2005.
BENNET, C.W. The relation of viruses to plant tissues. Bot. Rev. 6: 427-473.1940.
BENNET, C.W. Seed transmission of plant viruses. Adv. Vir. Rev. 14: 221-261. 1969.
BOCK, K.R.; CONTI, M. Cowpea aphid-borne mosaic virus. CMI/AAB Descriptions of
Plant Viruses, v.134. 1974.
BRASIL. Ministério da Agricultura. Delegacia Federal de Agricultura, Estado do Rio de
Janeiro. Manual de Inspeção Fitossanitária do Transito Internacional e Interestadual. Rio
de Janeiro, 1987. 332p.
CALDWELL, J. Seed transmission of viruses. Nature 193:457-459. 1962.
CARRINGTON, J.C. & DOUGHERTY, W.G. Small nuclear inclusion protein encoded by
a plant potyvirus genoma is a protease. J. Virol., 61: 2540-2548, 1987.
31
CARROLL, T.W. Seedborne viruses: Virus-host interactions. In Plant Diseases and
Vectors: Ecology and epidemiology, K. Maramorosch and K.F. Harris, eds(New York:
Academic Press, Inc.), pp. 293-317. 1981.
CARROLL, T.W., GOSSEL, P.L., AND HOCKETT, E.A. lnheritance of resistance to seed
transmission of barley stripe mosaic virus in barley. Phytopathology 69, 431-433. 1979.
CÁSSERES, E. Producción de hortalizas. São José: Instituto Interamericano de Ciências
Agrícolas, 1980. 387p.
CHAVES, A.L.R. Interações do Lettuce mosaic virus (lmv) x afídeos vetores nas regiões
produtoras de alface (Lactuca sativa L.) do cinturão verde de São Paulo, 2006.
Dissertação (Doutorado)-Faculdade de Ciências Agrárias, Universidade Estadual
Paulista, Botucatu, 2006.
CHAVES A. L. R., BRAUN M. R., EIRAS M., COLARICCIO A., GALLETI S. R. (2003)
Erigeron bonariensis: hospedeira alternativa do Lettuce mosaic virus no Brasil.
Fitopatologia brasileira, 28,3, 307-311, 2003.
CHAVES A. L. R., COLARICIO A., MORAES C. A. P., EIRAS M., AZEVEDO FILHO J.
A., PALAZZO S. R. L. (2002) Detecção do Tomato chlorotic spot virus e Lettuce mosaic
virus em infecções simples e mista em linhagens de alface. Arquivos do Instituto
Biológico, 69, 175-177.
CHOMCCZYNKI, P. & SACCHI, N. Single-step method of RNA isolation by acid
guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry,v. 162,
p.156-159, 1987.
CHUNG, R. M; AZEVEDO FILHO, J.A.de; COLARICCIO, A. Avaliação da reação de
genótipos de alface (Lactuca sativa L.) ao Lettuce mosaic virus (LMV). Bragantia,
Campinas, v.66, n.1, p.61-68, 2007.
CLARK, M.F., ADAMS, A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked
immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of General Virology,
v.34, p.475-483, 1977.
COLARICCIO A., EIRAS M., CHAVES A. L. R., ROGGERO P, CHAGAS C. M. (2001)
Diversidade de tospovírus em diferentes regiões produtoras de olerícolas do estado de
São Paulo. Summa Phytopathologica, 27, 2, 177-182.
COLARICCIO A, EIRAS M, CHAVES A L R, HARAKAVA R, CHAGAS C M (2002b)
Characterization of Tomato chlorotic spot virus from hydroponic grown lettuce in Brazil In:
Trips and Tospoviruses: Proceedings of the 7th International Symposium of
Thysanoptera, 99-104.
COSSA A. C., COLARICCIO A., EIRAS M., CHAVES A. L. R. (2000) Partial
characterization of Lettuce mosaic virus (LMV). Pathotype III in hidroponic lettuce. Virus
Reviews & Research, 5, 2, 195.
COSTA, C.L. Vetores de vírus de plantas-1. Insetos. In: LUZ, W. E. Revisão Anual de
patologia de plantas, v.6, p.103-171, 1998.
COSTA, L.H.M. Vigilância contra o cancro cítrico no Estado de Minas Gerais. Informe
Agropecuário, v.5, n.51, p. 27-29, 1979.
32
DAROS, J.A; CARRINGTON, J.C.; RNA binding activity of Nla proteinase of Tobacco
etch potyvirus. Virology, v.237, p.327-336.1997.
DINANT, S., & LOT, H. Lettuce mosaic virus: A review. Plant Pathology, 41:529-542,
1992.
DIPIERO, R.M.; REZENDE, J.M.A; YUKI, V.A.; PASCHOLATI, S.F.; DELFINO,M.A.
Transmissão do Passionfruit woodiness virus por Aphis gossypii (Glover)
(Hemiptera:Aphididae) e Colonização de maracujazeiro pelo vetor. Neotropical
Entomology, v.35, p.139-140, 2006.
DUGGAR, B.M. The problem of seed transmission of the typical mosaic of tobacco.
Phytopathology 20:133 (Abstr.). 1930.
EDWARDSON, J.R.; CHRISTIE, S.R. Lettuce mosaic virus. In: The Potyvirus Group.
Gainsville; University of Florida, v.2, p.272-588, 1991.
EDWARDSON, J. R., CHRISTIE, R.G.& KO, N.J. Potyvirus cylindrical inclusionsSubdivision-IV. Phytopathology 74(9):1111-1114.1984.
FAUQUET, C.M., MAYO, M.A., MANILLOFF, J., DESSELBERGER, U.& BALL, L.A.Virus
taxonomy. Eighth Report of International Committee on Taxonomy of Viruses, New York:
Academic Pres. 1259.2005.
FALK, B.W;PURCIFULL, D.E.Development and application of an enzyme-lined
immunosorbent assay (ELISA) test to index lettuce seeds for lettuce mosaic virus in
Florida.
FAO. Agricultural production, primary crops. Disponível em: <http://www.fao.org>.
Acesso em: 10 ago. 2009.
FRENCH, E.R.; HEBERT, T.T. Métodos de investigacíon fitopatólogica. San José-Costa
Rica: Editora IICA, 1980.
FILGUEIRA, A. R. Manejo de doenças viróticas. Curso de Pós-Graduação “Lato Sensu”
Especialização a Distância: Manejo de Doenças de Plantas. Lavras: UFLA/FAEPE.
2000. 95p.
FILGUEIRA, F.A. R. Cichoriáceas: alface, chicórea e almeirão. In: Manual de olericultura:
cultura e comercialização de hortaliças. 2º ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 1982. v. 2,
cap. 3, p. 77-93.
FIRMINO A. C., KRAUZE-SAKATE R., PAVAN M. A., SILVA N., HANAI S. M., ANBO R.
H., NIETZCHE T., LE GALL O. (2008) Prevalence of Lettuce mosaic virus – common
strain on three lettuce producing areas from São Paulo State. Summa Phytopathologica,
34, 2, 161-163.
FIRMINO, A. C. et al. Três anos de análise da incidência do Lettuce mosaic virus (LMV)
e Lettuce mottle virus (LeMoV) nos campos de produção de alface do estado de São
Paulo. In: XXXVII Congresso Brasileiro de Fitopatologia, Brasília. Fitopatologia
Brasileira, v.30. p.S192, 2005 (Suplemento).
GASPAR, J.O. Estudo ultraestrutural sobre a distribuição do vírus do anel do pimentão
durante a microsporogênese de tomateiro infectado, 1980. Dissertação (mestrado)Universidade Estadual de Campinas, Campinas, 1980.
33
GIACOMETTI, D.C.; FONSECA, J.N.L. Introdução, intercâmbio e quarentena de pósentrada de germoplasma. In: SIMPÓSIO DE RECURSOS GENÉTICOS VEGETAIS.
SESSÃO-BANCOS ATIVOS DE GERMOPLASMA, Brasília. Anais... Brasília: EMBRAPA
–CENARGEN, 1980. P.15-18.
GOTO, R.; TIVELLI, S.W. Produção de hortaliças em ambiente protegido: Condições
Subtropicais. São Paulo: Fundação Editora da UNESP, 1998. 319 p.p. 15 -104, 137-159.
GROGAN, R.G. Control of lettuce mosaic with virus-free seed. Plant disease, v.64 p.
446-449, 1980.
HULL, R. Matthew´s plant virology. Londres, Inglaterra: Academic Press. 2002. 1001p.
HUNTER, D.G. e BOWYER, J. W. Cytophatology of mature ovaries from lettuce plants
infected by lettuce mosaic potyvirus. Phytopathologische Zeitschrift, v. 140, p. 11-18.
1994.
IBGE. http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/tabela/protabl.asp, acesso em Jul.de 2009.
JADÃO, A. S., PAVAN, M.A. SILVA, N. & ZERBINI, F.M. Seed transmission of lettuce
mosaic virus (LMV) pathotype II and IV in different lettuce genotypes. Summa
Phytopathologica V. 28, p. 58-61, 2002.
KRAMER M., ORLANDO A., SILBERSCHMIDT K. M. (1945) Estudos sobre uma grave
doença responsável pelo deprecimento de nossas culturas de alface. O Biológico, 11,
121-134.
KRAUSE, S. R.; MELLO, R.N.; ZAMBOLIM, E.M.; PAVAN, M.A.; CARVALHO, M.G.; LE
GALL, O.; ZERBINI, F.M. Molecular characterization of two Brazilian isolates of Lettuce
mosaic virus (LMV) with distinct biological properties. Fitopatologia Brasileira, v.26,
p.153-157, 2001.
KRAUZE-SAKATE, R.; LE GALL, O.; FAKHFAKH, H.; PEYPELUT, M.; MARRAKCHI, M.;
VARVERI, C.; PAVAN,M.A.; SOUCHE, S.; HERVÉ LOT; ZERBINI, F.M.; CANDRESSE,
T. Molecular and biological characterization of Lettuce mosaic virus (LMV) isolates
reveals a distinct and widespread type of resistence-breaking isolates: LMV-Most.
Phytopathology, v. 92, n.5, p.563-571, 2002.
KRAUZE-SAKATE R., FIRMINO A. C., JADÃO A. S., PAVAN M. A., SILVA N., HANAI S.
M., ANBO R. H., NIETZSCHE (2008) Ocorrência generalizada do Lettuce mottle virus
em três regiões produtoras de alface comercial do estado de Sao Paulo. Summa
Phytopathologica, 34, 1, 88-89.
KRAUZE-SAKATE R., JADÃO A. S., FIRMINO A. C., PAVAN M. A., ZERBINI F. M.,
ROSALES M. I., BUSTAMANTE P., LE GALL O. (2005) First report of a lettuce infecting
Sequivirus in Chile. Plant Disease, 89, 10, 1129.
KRAUZE-SAKATE R., FAKHFAKH H., PEYPELUT M., PAVAN M. A., ZERBINI F. M.,
MARRAKCHI M., CANDRESSE T., LE GALL O. (2004) A natural occurring
recombinant isolate of Lettuce mosaic virus. Archives of Virology, v. 149, p.191-197.
KRAUZE-SAKATE R., LE GALL O., FAKHFAKH H., PEYPELUT, M., MARRAKCHI M.,
VARVERI C., PAVAN M. A., SOUCHE S., LOT H., ZERBINI F. M., CANDRESSE T.
(2002) Molecular and biological characterization of Lettuce mosaic virus (LMV) isolates
34
reveals a distinct and widespread type of resistence-breaking isolates: LMV-Most.
Phytopathology, 92, 5, 563-571.
KRAUSE- SAKATE R., MELLO, R.N.; PAVAN, M.A.; ZAMBOLIN, E.M.; CARVALHO,
M.G; LEGALL, O.; ZERBINI,.F. M (2001) Molecular characterization of two Brazilian
isolates of Lettuce mosaic virus with distinct biological properties. Fitopatologia Brasileira,
26, 2, 153-157.
KIMATI, H. Princípios gerais de controle de doenças de plantas. In: GALLI,F.(coord.)
Manual de Fitopatologia: princípios e conceitos. 2. Ed. São Paulo: Ed. Agronômica
Ceres, 1978. v. 1, p. 289-296.
KITAJIMA, E. W. Lista de publicações de viroses e enfermidades correlatas de plantas
no Brasil de 1911 a 1985 (Suplemento especial). Fitopatologia Brasileira,1986.
KITAJIMA, E. W. Lista de publicações de viroses e enfermidades correlatas de plantas
no Brasil de 1986 a 1993 (Suplemento especial). Fitopatologia Brasileira. p. 92, 1993.
LE GALL, O. Lettuce mosaic virus. In: JONES, A.T., ROBINSON, D.J., BOONHAM, N. E
MUMFORD, R. (Ed.). CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses. Wellesbourne, UK.:
Association of Applied Biologists, v.339,2003.
LIMA, T. T. Alface. In: Coordenadoria de Assistência Técnica e Integral. Manual técnico
das culturas. Campinas, SP: Coord. de Assist. Téc. e Integral, 1986. 518p. p. 7-10,
(Manual, 8).
LISBÃO, R. S., NAGAI, H., TRANI, P.E. Alface. In: Campinas, Instituto Agronômico.
Instruções agrícolas para o Estado de São Paulo. 5º ed. rev. atual. Campinas, SP:
Instituto Agronomico, 1990. 223 p. p. 11-12. (Boletim, 200).
LISTER, R.M. and MURANT, A.F. Seed-transmission of nematode-borne viruses. Ann.
Appl. Biol. 59: 49-62. 1967.
MARINHO, V.L.A.; MENDES, M.A.S.; TENENTE, R.C.V.; BATISTA, M.F.; GONZAGA, V.
Procedimentos e Métodos utilizados no Intercâmbio e Quarentena de Germoplasma
Vegetal. EMBRAPA. Brasília. 2003.
MAULE, A.J. e WANG, D. Seed transmission of plant viruses: a lesson in biological
complexity. Trends in Microbiology, v. 4, p.153-158. 1996.
MAULE, A.J. Virus movement in infected plants. Crit. Rev. Plant Sci. 9, 457-473.1991.
MALUF, L.E.J.; OKADA, A.T.; GOMES, L.A.A.; FIORINI, C.V.A.; MALUF, W.R.;
LICURSI, V. Reação de cultivares de alface à infecção por Meloidogyne incognita. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE OLERICULTURA, 43., 2003, Recife. Anais. Recife:
UFRPE, 2003. CD-ROOM.
MATTHEWS, R.E.F. Plant Virology, Third Edition (San Diego, CA: Academic Press, Inc.).
1991.
MARINHO, V.L. de A.; MARQUES, A.S. dos A.; BUSO, G.S.C.; PARENTE, P.M.G.
Importância da quarentena no controle de doenças transmitidas por sementes de
horatliças. In: ENCONTRO SOBRE PRODUÇÃO E QUALIDADE DE SEMENTES DE
HORTALIÇAS. Brasília. Palestras. Brasilia: EMBRAPA-CNPH, 1991. P. 107-112.
35
MEDINA, A.C. and GROGAN, R.G. Seed transmission of bean common mosaic virus.
Phytopathology 51: 452-456.1961.
MINK, G.I. Pollen- and seed-transmitted viruses and viroids. Annu. Rev. Phytopathol. 31,
375-402. 1993.
NAGAI, H. Alface tipo Manteiga In: FURLANI, A.M.C.; VIÉGAS, G.P. (Eds.) O
melhoramento de plantas no Instituto Agronômico - Campinas: Instituto Agronômico,
1993. p.204-221.
NASCIMENTO, S. M. O MERCADO BRASILEIRO DE SEMENTES DE HORTALIÇAS
uma rápida visão. V Curso sobre tecnologia de produção de sementes de hortaliças.
Brasília: Embrapa Hortaliças. nov. 2005.
NELSON, R. and DOWN, E.E. Influence of pollen and ovule infection in seed
transmission of bean mosaic. Phytopathology 23: 25 (Abstr.). 1933.
NEWBALL, A.G. Seed transmission of lettuce mosaic virus. Phytopathology, v.13, p.104106, 1923.
NOBLE, M.; RICHARDSON, M.J. An annotated list of seed-borne diseases. Proc.
Int.Seed Test. Ass., v.33, p.1-91, 1968.
OLIVEIRA, F. A. de. Identificação e Caracterização de um isolado do vírus do mosaico
da alface (Lettuce mosaic virus-LMV). Lavras-MG, 1999. 63 p. Dissertação (Mestrado em
Fitopatologia), Universidade Federal de Lavras.
PAVAN, M.A e KUROZAWA C.L.. Doenças da Alface. Manual de Fitopatologia, vol2 3a
edição, São Paulo: Ed. Ceres, 1997, 774 p.
PEYPELUT, M.; KRAUSE-SAKATE, R.; GUIRAUD, T.; PAVAN, M.A.; CANDRESSE, T.;
ZERBINI, F.M & LE GALL, O. Specific detection of Lettuce mosaic virus isolates
belonging to the “Most” type. Journal of Virological Methods, v.121, p. 119-124.2004.
PINK, D. A. C.; KOSTAVA, D. & WALKEY, D.G.A. Differentation of pathotypes of lettuce
mosaic virus. Plant Pathology, 41:5-12,1992a.
PINK, D.A .C.; LOT, H. & JOHNSON, R. Novel pathotypes of lettuce mosaic virus:
breakdown of a durable resistance. Euphytica, v.63, p.169-174. 1992b.
RESENDE, J.AM. & CUPERTINO, E.P. Doenças em hortaliças. Informe Agropec. 3. Belo
Horizonte, v. 18, n. 184, p. 18-27, 1995.
REVERS, F.; LOT, H; SOUCHE, S.;LEGALL,O;CANDRESSE,T.;DUNEZ,J.Biological and
molecular variability of lettuce mosaic virus isolates. Phytopathology, v.83, p.397-403,
1997.
REVERS, F.; YANG, S.; WALTER, J.;
SOUCHE,S.;LEGALL,O;CANDRESSE,T.;DUNEZ,J.Comparison of the complete
nucleotide sequences of two isolates of lettuce mosaic virus differing in their biological
properties. Virus Research v.47, p167-177, 1997a.
RIECHMANN, J.L.; LAIN, S.; GARCIA, J.A. Highlights and prospect of potyvirus
molecular biology. J. Gen. Virol.,73: 1-16, 1992.
36
RYDER, E. J. Transmission of common lettuce mosaic virus through the gametes of
lettuce plants. Plant Disease Reporter, v.48, p522-523, 1964.
RYDER, E. J. Inheritance of resistance to common lettuce mosaic. American Society for
Horticultural Sciences Journal., v .95, p. 378-9, 1970.
RYDER, E.J. Seed transmission of lettuce mosaic virus in mosaic resistant lettuce.
American Society for Horticultural Sciences Journal, v. 98, p. 610-614, 1973.
RYDER, E.J. Inheritance and interactions of necrotic, mottles and resistance reactions to
lettuce mosaic virus in lettuce. American Society for Horticultural Sciences Journal, v. 27,
n.2, p. 279-283, 2002.
ROCHA, M.H.CONTRIBUIÇÃO DO SERVIÇO DE QUARENTENA COMO LIMITANTE À
DISSEMINAÇÃO DE PATÓGENOS POR SEMENTES. Revista Brasileira de Sementes,
vol. 7, no 1, p. 175-182, 1985
RODRIGUES, S.R.; GOMES,
A.L.A.;MONTEIRO,B.A.;MALUF,R.W;SANDES,F.C.L.J;MASSAROTO,A.J. Linhagens de
alface crespa para o verão resistentes ao ao Meloidogyne javanica e ao vírus mosaicoda-alface. Pesq. agropec. bras. [online]. 2008, vol.43, n.10, pp. 1347-1356.
SAMBROOK, J.; FRITSCH, E.F.; MANIATIS, T. Molecular Cloning: a laboratory
manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Press, 1989.
SANGER, F.; NICLKEN, S. & COULSON, A.R. DNA sequencing with chain terminating
inhibitors. Proceedings National Academy of the Science.v.74, p.5463-5467, 1977.
SCHIPPERS, B. Transmission of bean common mosaic virus by seed of Phaseolus
vulgaris L. cultivar Beka. Acta botanica neerlandra v. 12, p. 433-497. 1963.
SHEPHERD, R.J. 1972. Transmission of viruses through seed and pollen. In: KADO,
C.I., AGRAWAL, H.O., Eds. Principles and techniques in plant virology. Van NostrandoReinhold Co., New York, 688p.
SHUKLA, D.D. WARD, C.W.; BRUNT, A.A. The Potyviridae. Cambridge, University
Press, p. 1-500, 1994.
STANGARLIN O., PAVAN M. A., SILVA N. (2000) Occurrence of a new pathotype of
lettuce mosaic virus on lettuce in Brazil. Plant Disease, v.84, n.4, p.490.
TOMLINSON, J. A. Lettuce mosaic virus. In: Comnionwealth Agricultural Bureaux
Association of Applied Biologists. Descriptions of plant viruses, n. 9, Kew, 1970.
TOMLINSON. J. A. _ Plant Pathology, v. 11, p.61, 1992.
URCUQUI-INCHIMA, S.; HAENNI, A.L. E BERNARDI, F. Potyvirus proteins: A welth of
functions. Vírus Research, v. 74, p.157-175. 2001.
VAN VUURDE J.W.L;MAAT,D.Z. Routine application of ELISA for the detection of lettuce
mosaic virus in lettuce seeds. Seed Science and Technology [SEED SCI. TECHNOL.].
Vol. 11, no. 3. 1983.
37
VEDOVELLO D., COLARICCIO A., CHAGAS C. M. (1999) Identificação de estirpes do
mosaico da alface (LMV) isolado de Lactuca sativa em cultivos hidropônicos de regiões
de São Paulo. Arquivos do Instituto Biológico, 66, 115.
WANG, D. e MAULE, A.J. A model for seed transmission of a plant virus: Genetic and
structural analyses of pea embryo invasion by Pea seed-borne mosaic virus. Plant Cell,
V. 6, p.777-787. 1994.
WIKISPECIES. Classificação taxonômica da cultura de alface. Disponível
em:<http://species.wikimedia.org/wiki/Lactuca>. Acesso em: Jul. 2009.
YANG, A.F. and HAMILTON, R.I. The mechanism of seed transmission of Tobacco
ringspot virus in soybean. Virology 62: 26-37. 1974.
ZATARIN, M. Comportamento de progênies de alface (Lactuca sativa L.) em diferentes
épocas de plantio Piracicaba, 1985. 90 p. Dissertação (Mestrado em Genética e
Melhoramento de Plantas) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”,
Universidade de São Paulo.
ZERBINI, F.M.; MACIEL-ZAMBOLIM, E. A família Potyviridae – Parte I. COSTA, C.L. In:
LUZ, W.C. (Eds). Revisão Anual de Patologia de Plantas (RAPP). Passo Fundo –
RS,p.1-66, 1999.
ZERBINI F. M., KOIKE S. T., GILBERTSON R. L. (1997) Gazania spp.: a New host of
Lettuce mosaic potyvirus, and a potencial inoculum source for recent outbreaks in the
Salinas Valley of California. Plant Disease, 81, 6, 641-646.
ZERBINI, F. M. Doenças causadas por vírus em alcachofra, alface, chicória, morango e
quiabo. Informe Agropecuário, Belo Horizonte, v. 17, n. 182, p.23-24, 1995.